CN110981972A

CN110981972A - 一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN110981972A
Application number: CN201911353103.5A
Authority: CN
Inventors: 张坤
Original assignee: Sinoneural Shanghai Cell And Gene Engineering Holdings Co ltd
Current assignee: Sinoneural Shanghai Cell And Gene Engineering Holdings Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110981972B

Abstract

本发明公开了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、靶向CD20的单链抗体、靶向CD3的单链抗体和标签蛋白。该嵌合抗原受体为具备特异性靶向CD19阳性肿瘤细胞的同时还分泌靶向CD20和靶向CD3的双特异性抗体，这能够靶向和激活非传导的T细胞，从而靶向肿瘤抗原CD20，进而实现CAR‑T细胞在体内有效杀死B细胞系恶性血液肿瘤细胞的目的。同时，该嵌合抗原受体的T细胞能够避免低丰度表达的CD19阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了B细胞系恶性血液肿瘤的复发风险。

Description

一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例，其中，血液肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前，虽然在CD19 CAR-T细胞取得了很大的成功，但是接受CD19 CAR-T细胞治疗后的病患中，多达三分之二的患者会出现CD19表达丧失导致抗原逃逸、肿瘤细胞继续生长而表现癌症复发的情况。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、靶向CD20的单链抗体、靶向CD3的单链抗体和标签蛋白，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列

如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：7所示，所述靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。

具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

具体地，所述嵌合抗原受体还包括连接序列，所述连接序列连接在所述靶向CD20的单链抗体和靶向CD3的单链抗体之间，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：11所示。

具体地，所述标签蛋白为6×His、Fc、Myc、GST、Flag或HA。

进一步地，所述标签蛋白为6×His，且所述标签蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：12所示。

另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述的嵌合体抗原受体。

具体地，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。

又一方面，本发明提供了一种上述的表达载体的应用，所述应用包括：将所述表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。

具体地，所述抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、靶向CD20的单链抗体、靶向CD3的单链抗体和标签蛋白，该嵌合抗原受体为具备特异性靶向CD19阳性肿瘤细胞的同时还分泌靶向CD20和靶向CD3的双特异性抗体，这能够靶向和激活非传导的T细胞，从而靶向肿瘤抗原CD20，进而实现CAR-T细胞在体内有效杀死B细胞系恶性血液肿瘤细胞的目的。同时，该嵌合抗原受体的T细胞能够避免低丰度表达的CD19阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了B细胞系恶性血液肿瘤的复发风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的嵌合抗原受体的结构示意图；

图2是本发明实施例二提供双酶切鉴定图；

图3是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；

图4是本发明实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图5是本发明实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图6为本发明实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本发明实施例提供的嵌合抗原受体构建的CART-BiTEs细胞对Raji细胞的杀伤能力，B为传统CD19CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体，如图1所示，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽(人CD8α信号肽，CD8αleader)、靶向CD19的单链抗体(CD19 scFv)、加长的CD8α铰链区(人CD8α铰链区，CD8α Hinge)、跨膜区(人CD8α跨膜区，CD8α transmembrane)、共刺激因子、胞内信号肽(人CD3ζ胞内信号肽，CD3ζ signal)、P2A连接肽、IL2信号肽(IL2 leader)、靶向CD20的单链抗体(CD20 scFv)、靶向CD3的单链抗体(CD3scFv)和标签蛋白，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：9所示。

具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

在本实施例中，共刺激因子为4-1BB(4-1BB signal)，且共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

具体地，嵌合抗原受体还可以包括连接序列(L)，连接序列连接在靶向CD20的单链抗体和靶向CD3的单链抗体之间，连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

具体地，标签蛋白可以为6×His、Fc、Myc、GST、Flag或HA。

在本实施例中，标签蛋白为6×His，且标签蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：12所示。

从NCBI网站数据库搜索到人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB的胞内区、人CD3ζ胞内信号肽和IL2信号肽的基因序列信息，靶向CD19的单链抗体、CD20的单链抗体和CD3的单链抗体均包括重链和轻链可变区，将上述序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成嵌合抗原受体基因序列，结构为CD8α leader-CD19 scFv-CD8αHinge-CD8α transmembrane-(4-1BB signal)-CD3ζ signal-P2A-IL2 leader-CD20 scFv-L-CD3 scFv-(6×His)，标记为CART-BiTEs。

本实施例中，该嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：13所示。相应地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。

实施例二

本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和实施例一提供的嵌合抗原受体。具体地，载体可以为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。在本实施例中，载体为慢病毒载体。

下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得CART-BiTEs基因序列，在CART-BiTEs基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CART-BiTEs的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buffer；回收的待酶切物的DNA；2μL的Xba I酶；2μL的EcoR I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有CART-BiTEs的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CART-BiTEs的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CART-BiTEs酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到的CART-BiTEs酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-(CART-BiTEs)-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CART-BiTEs酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffer。

将连接产物转入Stbl3感受态细胞(购买于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入700μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，结果如图2所示，由图2可知获得了大小约为3000bp的目标片段。经测序鉴定可确定该目标序列为CART-BiTEs基因序列。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。

采用无内毒素质粒大提试剂盒(购买于天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72ug质粒(target plasmid)、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm离心5min后保留上清液，收集合慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μL PBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒(嵌合抗原受体的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×10⁵个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLv^TM Lentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为5.8×10⁸TU/mL。

制备嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：

PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.5×10⁷个。

慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到含抗人CD3抗体和CD28抗体的激活剂中(购买于STEMCELL TECHNOLOGIES)，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI＝10的感染系数进行转染，并添加终浓度为8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的CAR-T细胞。

慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CART-BiTEs细胞，于1500rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用生理盐水洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图3所示。

CART-BiTEs细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过慢病毒转染后的CART-BiTEs细胞是否被有效激活，本实施例采用CART-BiTEs细胞和不表达CAR的T细胞分别与靶细胞共培养，然后通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分为2组：第一组，将每孔1×10⁶个效应细胞(表达CART-BiTEs的T细胞)和每孔1×10⁵个靶细胞(含CD19和CD20靶蛋白的Raji细胞)接种至6孔板中共培养，做3个重复；第二组，每孔1×10⁶个效应细胞(不表达CAR的T细胞)和每孔1×10⁵个靶细胞(含CD19和CD20靶蛋白的Raji细胞)接种至6孔板中共培养，做3个重复；将第一组和第二组分别于37℃、浓度为5％的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1500rpm离心5min去除细胞沉淀，收获上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图4和图5所示，图4为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图5为细胞因子IFNγ分泌量的对比图。结合图4和图5可知，该经过CART-BiTEs慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。

体外抗肿瘤效果比较，具体操作如下：

将本发明实施例提供的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞记作CART-BiTEs，将传统靶向CD19构建的CAR-T细胞记作CD19 CART，其中，CD19 CART的序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个靶细胞(记作Ack)，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数：靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数：靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作As，效应细胞个数：靶细胞个数＝10∶1)。①组靶细胞为Raji细胞，效应细胞为本实施例构建的CART-BiTEs细胞。

②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为含Raji细胞，效应细胞为传统的CD19CART。

将96孔板孵育过夜后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2～3h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Acn为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不含细胞的培养基和CCK-8溶液)。图6为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图6所示，本发明实施例提供的可分泌抗CD20和CD19分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体构建的CART-BiTEs细胞对Raji细胞杀伤能力明显优于传统的CD19 CART细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有更强的抗肿瘤活性。

又一方面，本发明实施例提供了本发明实施例一提供的嵌合抗原受体的应用，该应用包括：将嵌合体抗原受体作为抗CD19和/或CD20阳性肿瘤药物。

优选地，作为抗B细胞系恶性血液肿瘤药物，B细胞系恶性血液肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病。

本发明实施例提供了一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、靶向CD20的单链抗体、靶向CD3的单链抗体和标签蛋白，该嵌合抗原受体为具备特异性靶向CD19阳性肿瘤细胞的同时还分泌靶向CD20和靶向CD3的双特异性抗体，这能够靶向和激活非传导的T细胞，从而靶向肿瘤抗原CD20，进而实现CAR-T细胞在体内有效杀死B细胞系恶性血液肿瘤细胞的目的。同时，该嵌合抗原受体的T细胞能够避免低丰度表达的CD19阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了B细胞系恶性血液肿瘤的复发风险。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360

ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420

cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480

tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540

accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660

gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

gtcaccgtct cctca 735

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcg 189

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60

cacaggaac 69

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

<210> 8

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccaggt 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaagg cggtggcggt tctggtggcg gtggctccgg cggtggcggt 360

tctgaggtgc agctgcagca gtctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag 420

atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaagcag 480

acacctggac agggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc 540

tacaatcaga agttcaaagg caaggccaca ttgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 600

tacatgcagc tcagcagcct gacatctgag gactctgcgg actattactg tgcaagatct 660

aattattacg gtagtagcta ctggttcttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 720

gtctcctca 729

<210> 9

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60

tcctgtgcag cttctggcta ctcctttacc ggctacacta tgaactgggt gcgtcaggcc 120

ccaggtaagg gcctggaatg ggttgcactg attaatcctt ataaaggtgt tagtacctat 180

aaccagaagt tcaaggaccg tttcactata agcgtagata aatccaaaaa cacagcctac 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgtgc tagaagcgga 300

tactacggcg atagtgactg gtattttgac gtctggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctcgggcg gcgggggttc tggtggcggc ggcagcggcg gtggaggatc agatatccag 420

atgacccagt ccccgagctc cctgtccgcc tctgtgggcg atagggtcac catcacctgc 480

cgtgccagtc aggacatccg taattatctg aactggtatc aacagaaacc aggaaaagct 540

ccgaaactac tgatttacta tacctcccgc ctggagtctg gagtcccttc tcgcttctct 600

ggttctggtt ctgggacgga ttacactctg accatcagca gtctgcaacc ggaagacttc 660

gcaacttatt actgtcagca aggtaatact ctgccgtgga cgttcggaca gggcaccaag 720

gtggagatca aacgaact 738

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcggtggcg gttct 15

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caccaccacc accatcac 18

<210> 13

<211> 3144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacta agttggaaat aacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420

gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780

tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 840

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 900

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 960

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1020

tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaacaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgcgg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 1560

gacgtggagg agaaccctgg acctatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta 1620

agtcttgcac ttgtcacaaa cagtgacatt gtgctgaccc aatctccagc tatcctgtct 1680

gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gctcaagtgt aaattacatg 1740

gactggtacc agaagaagcc aggttcctcc cccaaaccct ggatttatgc cacatccaac 1800

ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 1860

acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccagca gtggagtttt 1920

aatccaccca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa aaggcggtgg cggttctggt 1980

ggcggtggct ccggcggtgg cggttctgag gtgcagctgc agcagtctgg ggctgagctg 2040

gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt 2100

tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct ggacagggcc tggaatggat tggagctatt 2160

tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat cagaagttca aaggcaaggc cacattgact 2220

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgaggactct 2280

gcggactatt actgtgcaag atctaattat tacggtagta gctactggtt cttcgatgtc 2340

tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcggtg gcggttctga ggttcagctg 2400

gtggagtctg gcggtggcct ggtgcagcca gggggctcac tccgtttgtc ctgtgcagct 2460

tctggctact cctttaccgg ctacactatg aactgggtgc gtcaggcccc aggtaagggc 2520

ctggaatggg ttgcactgat taatccttat aaaggtgtta gtacctataa ccagaagttc 2580

aaggaccgtt tcactataag cgtagataaa tccaaaaaca cagcctacct gcaaatgaac 2640

agcctgcgtg ctgaggacac tgccgtctat tattgtgcta gaagcggata ctacggcgat 2700

agtgactggt attttgacgt ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcgggcggc 2760

gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt ggaggatcag atatccagat gacccagtcc 2820

ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag 2880

gacatccgta attatctgaa ctggtatcaa cagaaaccag gaaaagctcc gaaactactg 2940

atttactata cctcccgcct ggagtctgga gtcccttctc gcttctctgg ttctggttct 3000

gggacggatt acactctgac catcagcagt ctgcaaccgg aagacttcgc aacttattac 3060

tgtcagcaag gtaatactct gccgtggacg ttcggacagg gcaccaaggt ggagatcaaa 3120

cgaactcacc accaccacca tcac 3144

<210> 14

<211> 1048

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr

50 55 60

Val Leu Leu Leu Ile Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly

100 105 110

Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr

130 135 140

Leu Gly Gly Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro

165 170 175

Ala Thr Gly Val Ser Thr Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly

180 185 190

Thr Leu Gly Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala

195 200 205

Leu Leu Ser Ala Leu Thr Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val

210 215 220

Pro Leu Leu Met Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr

225 230 235 240

Cys Ala Leu His Thr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Pro Val Pro

260 265 270

Val Pro Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro

275 280 285

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly

290 295 300

Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala

305 310 315 320

Pro Ala Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

325 330 335

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Ala His Ala Ala

340 345 350

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

355 360 365

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

370 375 380

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala

405 410 415

Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala

420 425 430

Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala

450 455 460

Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His

465 470 475 480

Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala

485 490 495

Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly Ser Gly Ala Thr Ala

500 505 510

Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro

515 520 525

Met Thr Ala Met Gly Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

530 535 540

Val Thr Ala Ser Ala Ile Val Leu Thr Gly Ser Pro Ala Ile Leu Ser

545 550 555 560

Ala Ser Pro Gly Gly Leu Val Thr Met Thr Cys Ala Ala Ser Ser Ser

565 570 575

Val Ala Thr Met Ala Thr Thr Gly Leu Leu Pro Gly Ser Ser Pro Leu

580 585 590

Pro Thr Ile Thr Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Ala

595 600 605

Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile Ser Ala

610 615 620

Val Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Thr Ser Pro

625 630 635 640

Ala Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu Gly Gly

645 650 655

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly

660 665 670

Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Leu Val Leu Pro Gly Ala Ser Val Leu

675 680 685

Met Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr Ser Thr Ala Met His

690 695 700

Thr Val Leu Gly Thr Pro Gly Gly Gly Leu Gly Thr Ile Gly Ala Ile

705 710 715 720

Thr Pro Gly Ala Gly Ala Thr Ser Thr Ala Gly Leu Pro Leu Gly Leu

725 730 735

Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Ser Ser Thr Ala Thr Met Gly Leu

740 745 750

Ser Ser Leu Thr Ser Gly Ala Ser Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ser

755 760 765

Ala Thr Thr Gly Ser Ser Thr Thr Pro Pro Ala Val Thr Gly Ala Gly

770 775 780

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu

785 790 795 800

Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Gly Ser Leu Ala Leu

805 810 815

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ser Pro Thr Gly Thr Thr Met Ala Thr

820 825 830

Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val Ala Leu Ile Ala

835 840 845

Pro Thr Leu Gly Val Ser Thr Thr Ala Gly Leu Pro Leu Ala Ala Pro

850 855 860

Thr Ile Ser Val Ala Leu Ser Leu Ala Thr Ala Thr Leu Gly Met Ala

865 870 875 880

Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys Ala Ala Ser Gly

885 890 895

Thr Thr Gly Ala Ser Ala Thr Thr Pro Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr

900 905 910

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

915 920 925

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu

930 935 940

Ser Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly

945 950 955 960

Ala Ile Ala Ala Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala

965 970 975

Pro Leu Leu Leu Ile Thr Thr Thr Ser Ala Leu Gly Ser Gly Val Pro

980 985 990

Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Thr Leu Thr Ile

995 1000 1005

Ser Ser Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly

1010 1015 1020

Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu

1025 1030 1035 1040

Ala Thr His His His His His His

1045

<210> 15

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacta agttggaaat aacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420

gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780

tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 840

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 900

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 960

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1020

tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaacaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgc 1518

Claims

1.一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、靶向CD20的单链抗体、靶向CD3的单链抗体和标签蛋白，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述靶向CD3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括连接序列，所述连接序列连接在所述靶向CD20的单链抗体和靶向CD3的单链抗体之间，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述标签蛋白为6×His、Fc、Myc、GST、Flag或HA。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述标签蛋白为6×His，且所述标签蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：12所示。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括载体和如权利要求1～6任一项所述的嵌合体抗原受体。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。

9.一种如权利要求7或8所述的表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病。