TW202332771A - 轉基因免疫細胞及其構建方法和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及CART技術領域，尤其是涉及轉基因免疫細胞及其構建方法和應用。本發明提供了含有三個編碼區的基因。含有該基因的重組核酸、生物材料和轉基因免疫效應細胞能夠編碼三種功能蛋白，三種蛋白的表達使得免疫效應細胞具有多種功能，從而降低實體瘤微環境對免疫效應細胞抑制作用，延長免疫效應細胞的殺傷作用時間；同時增強免疫效應細胞抗腫瘤療效。

Description

轉基因免疫細胞及其構建方法和應用
本發明涉及CART技術領域，尤其是涉及轉基因免疫細胞及其構建方法和應用。
嵌合抗原受體T細胞免疫療法，簡稱CART技術，是通過體外改造病人的T細胞，使病人的T細胞具備識別腫瘤細胞的能力，體外擴大培養後回輸到病人體內進行治療的一種方法。目前，以CD19為靶點的CART在治療B細胞血液腫瘤方面取得了巨大的成果，但根據臨床研究結果來看，CD19 CART在治療B細胞淋巴瘤方面的療效遠遠不及在治療B細胞急性淋巴細胞白血病方面的療效，這可能是因為B細胞淋巴瘤是實體腫瘤，CART細胞難以大量到達並浸潤到腫瘤內部。對於浸潤到腫瘤內部的CART細胞，實體瘤細胞能夠通過表面過表達大量的PD-L1分子，從而逃避CART細胞的殺傷，同時，CART細胞與實體瘤細胞的不充分接觸還顯著影響了CART細胞的增殖和持久性，加快了CART細胞在體內的耗竭速度。
因此，與血液瘤的治療相比，使用實體瘤的治療對CART細胞提出了更高的要求，需要CART細胞具有抵抗，甚至破壞實體瘤微環境的能力，持續深入實體瘤內部發揮治療作用。
細胞因子是由免疫細胞（如單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，通過結合相應受體調節細胞生長、分化和效應，調控免疫應答。白細胞介素是其中重要分類之一，具有免疫調節、造血以及炎症調控等多種作用，目前已報導的白細胞介素已多達三十餘種，其中IL-21由CD4 T細胞和NKT細胞產生，刺激CD8 T細胞和NK細胞的成熟並增強其細胞毒性，同時具備促進記憶性CD8 T細胞的分化等功能。IL-21的諸多效能使其成為免疫治療的潛在靶點，但由於IL-21R廣泛表達包括T細胞、B細胞、NK細胞和骨髓細胞。
趨化因子(chemokines)，是一類由細胞分泌的小細胞因子或訊號蛋白。由於它們具有誘導附近反應細胞定向趨化的能力，因而命名為趨化細胞因子。趨化性細胞因子根據其氨基端（N端）半胱氨酸的排列方式，可分為CXC、CC、C和CX3C四個亞族，其中CC趨化因子亞族的CCL19和CCL21是CCR7的配體，T細胞表達CCR7蛋白，所以CCL19和CCL21趨化因子能夠趨化T細胞遷移。
上述細胞因子和趨化因子均有利於對抗和改善實體瘤微環境，為免疫細胞提供持久的殺傷環境。
[相關申請案的參考] 本申請要求申請日為2021年12月21日的中國專利申請（申請號：202111572804.5，發明名稱：轉基因免疫細胞及其構建方法和應用）的優先權，該中國專利申請的全文通過引用方式整體併入到本申請。
如何對在現有免疫細胞的基礎上，整合多種功能分子共同對抗實體瘤微環境，顯著有效地改善免疫細胞的治療效果是目前亟需解決的問題。
本發明的目的在於，針對實體瘤微環境提供一種多功能免疫細胞，期望不僅能夠對抗實體瘤在發展過程中逐漸形成的、對其穩定和擴散有利的微環境，同時還能夠趨化自身免疫細胞，更大限度啟動機體自身免疫系統，提高機體自身與實體瘤的對抗強度。
為了解決上述問題，實現上述目的，本發明提供了以下技術方案： 第一方面，本發明提供了含有三個編碼區的基因，其中，編碼區（Ⅰ）編碼嵌合抗原受體，嵌合抗原受體含有特異性識別腫瘤抗原的胞外區； 編碼區（Ⅱ）編碼融合蛋白，融合蛋白包括免疫檢查點抗體和細胞因子； 編碼區（Ⅲ）編碼趨化因子。
可選實施方式中，腫瘤抗原選自MSLN、GD2、GPC3、CD19、EGFR VIII、GUCY2C、HER2、MUC16或Claudin 18.2中的至少一種。
可選實施方式中，胞外區含有抗MSLN抗體。
可選實施方式中，胞外區含抗GUCY2C抗體；可選實施方式中，嵌合抗原受體包含抗GUCY2C單鏈抗體。
優選地，抗MSLN抗體的氨基酸序列為（a）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者（b）在（a）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編碼的蛋白質具有特異性識別MSLN抗原活性的衍生氨基酸序列。
可選實施方式中，免疫檢查點選自PD1、PD-L1、TIGIT、LAG3、CTLA4、BTLA或TIM3中至少一種。
可選實施方式中，免疫檢查點抗體為抗PD1抗體。
優選地，抗PD1抗體的氨基酸序列為（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者（d）在（c）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編輯的蛋白質具有靶向PD1功能的衍生氨基酸序列。
可選實施方式中，細胞因子為（A）或（B）； （A）選自IL-21、IL-23、IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15或IL-18中至少一種； （B）為具有調節免疫細胞活性的由（A）衍生的蛋白質。
可選實施方式中，細胞因子為IL-21。
優選地，IL-21具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
可選實施方式中，趨化因子為（c）或（d）； （c）選自CXC趨化因子、CC趨化因子、CX3C趨化因子或XC趨化因子中的至少一種； （d）為具有誘導免疫細胞定向遷移功能的由（c）衍生的蛋白質。
優選地，CXC趨化因子為CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16或CXCL17中的至少一種。
優選地，CC趨化因子為CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27或CCL28中的至少一種。
優選地，CX3C趨化因子為CX3CL1。
優選地，XC趨化因子為XCL1。
可選實施方式中，趨化因子為CCL19或CCL21。
優選地，CCL19具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
優選地，CCL21具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
第二方面，本發明提供了重組核酸，重組核酸包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，第一核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅰ），第二核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅱ），第三核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅲ）。
可選實施方式中，第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子之間通過2A肽的核酸序列相連。
優選地，2A肽選自P2A、T2A、F2A或E2A中的至少一種。
可選實施方式中，第一核酸分子通過2A肽的核酸序列與第二核酸分子相連，第二核酸分子通過2A肽的核酸序列和第三核酸分子相連。
第三方面，本發明提供了生物材料，生物材料包括以下任一項： （ⅰ）重組載體，重組載體含有前述任一實施方式基因，或者含有前述任一實施方式的重組核酸； （ⅱ）構建體，構建體包括非致病性病毒，非致病性病毒含有前述任一實施方式的基因、重組核酸或（ⅰ）重組載體。
可選實施方式中，非致病性病毒包括反轉錄病毒、慢病毒或腺病毒。
第四方面，本發明提供了轉基因免疫效應細胞，轉基因免疫效應細胞含有前述任一實施方式基因、重組核酸或生物材料。
可選實施方式中，轉基因免疫效應細胞的構建方法包括，將前述任一實施方式基因、重組核酸或生物材料導入免疫效應細胞中，獲得轉基因免疫效應細胞。
免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞或CIK細胞中的至少一種。
優選地，免疫效應細胞為T細胞。
第五方面，本發明提供了前述任一實施方式基因、重組核酸、生物材料、轉基因免疫效應細胞或構建方法構建得到的轉基因免疫效應細胞在製備抗腫瘤產品中的應用。
優選地，腫瘤包括實體瘤。
第六方面，本發明提供了抗腫瘤藥物，藥物包括前述任一實施方式基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種。
優選地，腫瘤包括實體瘤。
第七方面，本發明提供了治療腫瘤的方法，方法包括包括向受試者施用治療有效量的如前任一基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種。優選地，腫瘤包括實體瘤。
第八方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包括如前任一基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種，以及藥學上可接受的載體。
本發明提供的基因、重組核酸、生物材料和轉基因免疫效應細胞均能夠編碼三種蛋白，三種蛋白的表達使得免疫效應細胞同時具有了多種功能，包括特異性識別腫瘤抗原和靶向免疫檢查點，以及趨化並調節免疫細胞活性，從而在實現降低實體瘤微環境對免疫效應細胞抑制作用的同時，延長免疫效應細胞的殺傷作用時間；同時趨化因子的表達能夠招募和趨化機體自身的T細胞到達腫瘤部位，在細胞因子的調節作用下共同殺傷腫瘤細胞，增強免疫效應細胞抗腫瘤療效。
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。通常在此處附圖中描述和示出的本發明實施例的元件可以以各種不同的配置來佈置和設計。
因此，以下對在附圖中提供的本發明的實施例的詳細描述並非旨在限制要求保護的本發明的範圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
應注意到：相似的標號和字母在下面的附圖中表示類似項，因此，一旦某一項在一個附圖中被定義，則在隨後的附圖中不需要對其進行進一步定義和解釋。
此外，術語“第一”、“第二”僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本發明的描述中，“多個”的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
在某個具體實施方式中，第一方面，本發明提供了含有三個編碼區的基因，其中，編碼區（Ⅰ）編碼嵌合抗原受體，嵌合抗原受體含有特異性識別腫瘤抗原的胞外區； 編碼區（Ⅱ）編碼融合蛋白，融合蛋白包括免疫檢查點抗體和細胞因子； 編碼區（Ⅲ）編碼趨化因子。
本發明基因應當理解為，包含上述三個編碼區的所有基因，至於除上述三個編碼區以外，是否還含有其他編碼區本發明並未進行限定，本領域技術人員可以根據實際需求選擇添加其他編碼區。
本發明上述三個編碼區以獨立表達為目的，因此，本發明上述基因中三個編碼區的連接順序可以根據實際需求進行選擇，並不需特殊限定。
本發明基因在不影響三個編碼區獨立表達的情況下，還可以包含適當的內含子。
上述嵌合抗原受體指的是嵌合抗原受體T細胞通過識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部與跨膜區和胞內區在體外偶聯為一個嵌合蛋白，通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體，使得患者的T細胞被“重編碼”後，能夠生成大量腫瘤特異性的CART細胞。重新編碼後的嵌合抗原受體T細胞加進患者身體後，所述嵌合抗原受體可以特異性地追蹤和識別並引導T細胞殺傷腫瘤細胞。本發明在現有CART細胞基礎上，將嵌合抗原受體的應用範圍擴展至其他免疫效應細胞，例如T細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞或CIK細胞等，所述的抗體的抗原結合部即為本發明所述的識別腫瘤抗原的胞外區，而跨膜區和胞內區則可根據實際需求通過常規選擇獲得。
優選地，跨膜區為CD8的跨膜段。
優選地，胞內區為免疫共刺激分子的胞內段和CD3 Zeta鏈。
優選地，免疫共刺激分子選自4-1BB、CD28、CD3、OX-40、CD40L、CD27、CD30、或他們的衍生物中的任一種或幾種。可選實施方式中，免疫共刺激分子選自4-1BB。
可選實施方式中，本發明腫瘤抗原選自MSLN、GD2、GPC3、CD19、EGFR VIII、GUCY2C、HER2、MUC16或Claudin 18.2中的至少一種。
可選實施方式中，胞外區含有抗MSLN抗體。
優選地，抗MSLN抗體的氨基酸序列為（a）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者（b）在（a）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編碼的蛋白質具有特異性識別MSLN抗原活性的衍生氨基酸序列。
抗MSLN抗體的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）： QVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGAGTKLEIK
術語“抗體”在最廣義上使用，其涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體/多克隆抗體，多特異性抗體（例如雙特異性抗體、三特異性抗體等），鼠源抗體/嵌合抗體，全長抗體或其抗原結合片段（例如scFv），只要它們展示出所期望的抗原結合活性。
術語“互補性決定區”、“CDR”或“CDRs”或“互補決定區”是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區，其是抗體可變結構域內主要促成與抗原特異性結合的區域。重鏈互補決定區用HCDR表示，重鏈可變區中含有的3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈互補決定區用LCDR表示，輕鏈可變區中含有的3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。可以通過各種公知方案來確定CDR的氨基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則（參見Kabat等（1991），“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD）、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則（參見Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001）和ImMunoGenTics（IMGT）編號規則（Lefranc， M.P.等，Dev. Comp. Immunol.， 27，55-77（2003））等；各種編號系統之間的對應關係是本領域技術人員熟知的。
可選實施方式中，嵌合抗原受體包含抗MSLN抗體。可選實施方式中，抗MSLN抗體為單鏈抗體（scFv，由抗體輕鏈可變區（VL）與重鏈可變區（VH）直接或通過肽接頭（L）連接而成，例如N端到C端：VH-L-VL或者VL-L-VH的scFv，連接子L可以選自（GxS）y連接子，其中，x選自1-5的整數，y選自0-6的整數，例如x為4，y為3）。可選實施方式中，抗MSLN抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區；抗MSLN抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:1中的重鏈可變區（SEQ ID NO:9）的HCDR1、HCDR2和HCDR3，抗MSLN抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:1中的輕鏈可變區（SEQ ID NO:10）的LCDR1、LCDR2和LCDR3；在一些實施方式中，HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT編號系統定義，或由Kabat編號系統定義，或由Chothia編號系統定義，或由Contact編號系統定義，或由AbM編號系統定義。在一些實施方式中，HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3由Kabat編號系統定義。可選實施方式中，抗MSLN抗體的CDRs（由Kabat編號系統定義）氨基酸序列如下：HCDR1：GYTMN（SEQ ID NO:11）；HCDR2：LITPYNGASSYNQKFRG（SEQ ID NO:12）；HCDR3：GGYDGRGFDY（SEQ ID NO:13）；LCDR1：SASSSVSYMH（SEQ ID NO:14）；LCDR2：DTSKLAS（SEQ ID NO:15）；LCDR3：QQWSKHPLT（SEQ ID NO:16）。在一些實施方式中，抗MSLN抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:1中的重鏈可變區，抗MSLN抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:1中的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗MSLN抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:9具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；在一些實施方式中，重鏈可變區和輕鏈可變區包括前面任一的抗MSLN抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；在一些實施方式中，抗MSLN抗體包含SEQ ID NO:9所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:10所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗MSLN抗體為單鏈抗體，其包括SEQ ID NO:1。在一些實施方式中，抗MSLN抗體為單鏈抗體，其包括SEQ ID NO:1衍生氨基酸序列，SEQ ID NO:1衍生氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得，其編輯的蛋白質具有靶向MSLN功能。
可選實施方式中，抗MSLN抗體重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:9）： QVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSS；
抗MSLN抗體輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:10）： DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGAGTKLEIK；
可選實施方式中，本發明腫瘤抗原選自GUCY2C。可選實施方式中，嵌合抗原受體包含抗GUCY2C抗體。可選實施方式中，抗GUCY2C抗體為單鏈抗體（scFv）。可選實施方式中，抗GUCY2C抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗GUCY2C抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:17中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，抗GUCY2C抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；在一些實施方式中，HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT編號系統定義，或由Kabat編號系統定義，或由Chothia編號系統定義，或由Contact編號系統定義，或由AbM編號系統定義。可選實施方式中，抗GUCY2C抗體的CDRs（由IMGT編號系統定義）氨基酸序列如下：HCDR1：GYTFTEYT（SEQ ID NO:20）；HCDR2：INPNNGGA（SEQ ID NO:21）；HCDR3：ARAPYYYGSSYYAMDY（SEQ ID NO:22）；LCDR1：ESVDNYGISF（SEQ ID NO:23） ；LCDR2 ：AAS；LCDR3： QQSKEVPFT （SEQ ID NO:24）。在一些實施方式中，抗GUCY2C抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:17具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO:18具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；在一些實施方式中，重鏈可變區和輕鏈可變區包括前面任一述的抗GUCY2C抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方式中，抗GUCY2C抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:17，抗GUCY2C抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:18。在一些實施方式中，抗GUCY2C抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗GUCY2C抗體為單鏈抗體，其包括與SEQ ID NO:19具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；在一些實施方式中，抗體包含前面任一項述的抗GUCY2C抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗GUCY2C單鏈抗體包括SEQ ID NO:19。
抗GUCY2C抗體重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:17）： EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGNTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCGRSPFVHYYDYYAMDYWGQGTSVTVSS
抗GUCY2C抗體輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:18）： DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVYNSGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPFTFGSGTNLEIK
抗GUCY2C單鏈抗體氨基酸序列（SEQ ID NO:19）： EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGNTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCGRSPFVHYYDYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVYNSGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPFTFGSGTNLEIK
免疫檢查點（免疫檢查點分子）是免疫系統中的抑制性通路，由配體/受體的相互作用所調控。它對於維持自身免疫耐受、調節生理性免疫應答的持續時間和幅度起重要作用，從而避免免疫系統對正常組織造成損傷和破壞。而實體瘤微環境中的腫瘤細胞通過過表達免疫檢查點配體（例如PD-L1配體）與免疫細胞（例如T細胞）表達的免疫檢查站受體（例如PD1受體）結合，抑制免疫細胞活性，從而免於被免疫細胞殺傷，本發明為了阻止免疫細胞和腫瘤細胞表達的免疫檢查點配受體之間的結合，在融合蛋白中提供了上述免疫檢查點抗體，該抗體提前與免疫細胞表達的免疫檢查點相結合，從而遮罩腫瘤細胞表達的免疫檢查點配體，使免疫細胞保持持續殺傷活性。
可選實施方式中，本發明融合蛋白的免疫檢查點選自PD1、PD-L1、TIGIT、LAG3、CTLA4、BTLA或TIM3中至少一種。可選實施方式中，本發明融合蛋白的免疫檢查點選自PD1。
可選實施方式中，免疫檢查點抗體為抗PD1抗體。
優選地，抗PD1抗體的氨基酸序列為（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者（d）在（c）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編輯的蛋白質具有靶向PD1功能的衍生氨基酸序列。
抗PD1抗體的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）： MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
可選實施方式中，抗PD1抗體為單鏈抗體（scFv）。可選實施方式中，抗PD1抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區；在一些實施方式中，抗PD1抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:2中重鏈可變區（SEQ ID NO:25）的HCDR1、HCDR2和HCDR3，抗PD1抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:2中的輕鏈可變區（SEQ ID NO:26）的LCDR1、LCDR2和LCDR3；在一些實施方式中，HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT編號系統定義，或由Kabat編號系統定義，或由Chothia編號系統定義，或由Contact編號系統定義，或由AbM編號系統定義。可選實施方式中，抗PD1抗體的CDRs（由Kabat編號系統定義）氨基酸序列如下：HCDR1：NSGMH（SEQ ID NO:27）；HCDR2：VIWYDGSKRYYADSVKG（SEQ ID NO:28）；HCDR3：NDDY（SEQ ID NO:29）；LCDR1：RASQSVSSYLA（SEQ ID NO:30）；LCDR2：DASNRAT（SEQ ID NO:31）；LCDR3：QQSSNWPRT（SEQ ID NO:32）。在一些實施方式中，抗PD1抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:2中的重鏈可變區，抗PD1抗體的輕鏈可變區包括SEQ ID NO:2中的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗PD1抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:25具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO:26具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；在一些實施方式中，重鏈可變區和輕鏈可變區包括前面任一項的抗PD1抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方式中，抗PD1抗體的重鏈可變區包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列，輕鏈可變區包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些實施方式中，抗PD1抗體包含SEQ ID NO:25所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:26所示的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗PD1抗體為單鏈抗體，其包括SEQ ID NO:2。在一些實施方式中，抗PD1抗體為單鏈抗體，其包括SEQ ID NO:2衍生氨基酸序列，SEQ ID NO:2衍生氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得，其編輯的蛋白質具有靶向PD1功能。
可選實施方式中，抗PD1抗體重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:25）： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS；
抗PD1抗體輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:26）： MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK；
上述細胞因子是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復等多種功能。按照功能不同，細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、以及生長因子等。眾多細胞因子在體內通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發揮作用，具有多效性、重疊性、拮抗性、協同性等多種生理特性，形成了十分複雜的細胞因子調節網路，參與人體多種重要的生理功能。不同細胞因子對不同免疫細胞的調節存在功能和程度上的差異，本發明提供的融合蛋白中的細胞因子可以根據選用的免疫效應細胞進行選擇，例如，白細胞介素能夠活化T淋巴細胞產生活性介質，因此，在對T細胞進行轉基因改造時，可以選擇白細胞介素作為融合蛋白中的細胞因子。
可選實施方式中，本發明細胞因子為（A）或（B）； （A）選自IL-21、IL-23、IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15或IL-18中至少一種； （B）為具有調節免疫細胞活性的由（A）衍生的蛋白質。
可選實施方式中，細胞因子為IL-21。
優選地，IL-21具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
IL-21的氨基酸序列（SEQ ID NO:3）： MHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS（SEQ ID NO:3）
上述趨化因子的主要功能是在炎症和體內平衡過程中管理白細胞向各自位置的遷移(歸巢)，具體包括（1）基礎歸巢作用趨化因子：在胸腺和淋巴組織中產生的基礎的穩態趨化因子。例如，趨化因子CCL19和CCL21(在淋巴結和淋巴管內皮細胞中表達)及其受體CCR7在細胞歸巢中起到穩態功能。（2）炎症歸巢作用趨化因子：炎症趨化因子在感染或損傷過程中產生高濃度，並決定炎症性白細胞向受損區域的遷移。典型的炎性趨化因子包括：CCL2、CCL3和CCL5、CXCL1、CXCL2和CXCL8。
可選實施方式中，本發明趨化因子為（c）或（d）； （c）選自CXC趨化因子、CC趨化因子、CX3C趨化因子或XC趨化因子中的至少一種； （d）為具有誘導免疫細胞定向遷移功能的由（c）衍生的蛋白質。
優選地，CXC趨化因子為CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16或CXCL17中的至少一種。
優選地，CC趨化因子為CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27或CCL28中的至少一種。
優選地，CX3C趨化因子為CX3CL1。
優選地，XC趨化因子為XCL1。
可選實施方式中，趨化因子為CCL19或CCL21。
優選地，CCL19具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； CCL19的氨基酸序列（SEQ ID NO:4）： MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS（SEQ ID NO:4）
優選地，CCL21具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。 CCL21的氨基酸序列（SEQ ID NO:5）： MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP（SEQ ID NO:5）
第二方面，本發明提供了重組核酸，重組核酸包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，第一核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅰ），第二核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅱ），第三核酸分子含有前述任一實施方式的編碼區（Ⅲ）。
可選實施方式中，第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子之間通過2A肽的核酸序列相連。
優選地，2A肽選自P2A、T2A、F2A或E2A中的至少一種。
可選實施方式中，第一核酸分子通過2A肽的核酸序列與第二核酸分子相連，第二核酸分子通過2A肽的核酸序列和第三核酸分子相連。
可選實施方式中，重組核酸的結構如附圖1中的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19或CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21所示，或者如附圖5中的CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19或CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21所示。
第三方面，本發明提供了生物材料，生物材料包括以下任一項： （ⅰ）重組載體，重組載體含有前述任一實施方式基因，或者含有前述任一實施方式的重組核酸；重組載體使用的原始質粒載體，本領域技術人員可以根據實際需求進行常規選擇。 （ⅱ）構建體，構建體包括非致病性病毒，非致病性病毒含有前述任一實施方式的基因、重組核酸或（ⅰ）重組載體。
可選實施方式中，非致病性病毒包括反轉錄病毒、慢病毒或腺病毒。
第四方面，本發明提供了轉基因免疫效應細胞，轉基因免疫效應細胞含有前述任一實施方式基因、重組核酸或生物材料。
可選實施方式中，構建方法包括，將前述任一實施方式基因、重組核酸或生物材料導入免疫效應細胞中，獲得轉基因免疫效應細胞；
免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞或CIK細胞中的至少一種。
優選地，免疫效應細胞為T細胞。
第五方面，本發明提供了前述任一實施方式基因、重組核酸、生物材料、轉基因免疫效應細胞或構建方法構建得到的轉基因免疫效應細胞在製備抗腫瘤產品中的應用。
優選地，腫瘤包括實體瘤。
第六方面，本發明提供了抗腫瘤藥物，藥物包括前述任一實施方式基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種。
優選地，腫瘤包括實體瘤。
第七方面，本發明提供了治療腫瘤的方法，方法包括包括向受試者施用治療有效量的如前任一基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種。優選地，腫瘤包括實體瘤。
第八方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包括如前任一基因、重組核酸、生物材料或轉基因免疫效應細胞中的至少一種，以及藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體是指製劑中用於遞送抗體等藥物的無活性物質。藥學上可接受的載體可以是抗粘附劑、粘合劑、包衣、崩解劑、充填劑、稀釋劑、防腐劑、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等等。在一些實施方式中，藥物組合物用於治療腫瘤。
下面結合附圖，對本發明的一些實施方式作詳細說明。在不衝突的情況下，下述的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。
實施例 1 ：構建表達 Anti PD1-IL-21 融合蛋白和 CCL19 的靶向 Mesothelin 的慢病毒
本實施例構建了表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL19的靶向Mesothelin的慢病毒，如下步驟：
（1）重組病毒載體製備
通過人工基因合成重組核酸CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19，如圖1第二條Schema Graph所示，重組核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，按照慢病毒載體酶切位元點，將核苷酸片段構建至慢病毒載體上，設計引物，通過測序結果驗證載體構建的正確性。
重組核酸CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19的核苷酸序列（SEQ ID NO:6）： ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAAGTCCAGCTCCAGCAGTCGGGCCCAGAGTTGGAGAAGCCTGGGGCGAGCGTGAAGCTTTCATGCAAAGCCTCAGGCTACTCCTTTACTGGATACACGATGAATTGGGTGAAACAGTCGCATGGAAAGTCACTGGAATGGATCGGTCTGATTACGCCCTACAACGGCGCCTCCAGCTACAACCAGAAGTTCAGGGGAAAGGCGACCCTTACTGTCGACAAGTCGTCAAGCACCGCCTACATGGACCTCCTGTCCCTGACCTCCGAAGATAGCGCGGTCTACTTTTGTGCACGCGGAGGTTACGATGGACGGGGATTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACTGTCACCGTGTCGAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATATCGAACTCACTCAGTCCCCAGCAATCATGTCCGCTTCACCGGGAGAAAAGGTGACCATGACTTGCTCGGCCTCCTCGTCCGTGTCATACATGCACTGGTACCAACAAAAATCGGGGACCTCCCCTAAGAGATGGATCTACGATACCAGCAAACTGGCTTCAGGCGTGCCGGGACGCTTCTCGGGTTCGGGGAGCGGAAATTCGTATTCGTTGACCATTTCGTCCGTGGAAGCCGAGGACGACGCAACTTATTACTGCCAACAGTGGTCAAAGCACCCGCTCACTTTCGGAGCCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGGGATGGTCTTGTATTATTCTGTTTCTGGTGGCAACTGCTACTGGGGTGCATAGTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCCTGTCTCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGAGCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGACGCCTCCAACAGAGCCACCGGCATCCCAGCCAGATTTTCTGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGAGCTCTAACTGGCCAAGAACATTCGGGCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAGAGGGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCAGGCAGATCTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAATTCCGGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTATGACGGCTCTAAGCGGTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAATACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCACCAACGACGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTATGCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAAAACCCAGGTCCAATGGCCCTGCTACTGGCCCTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACTTCCCCAGCCCCAACTCTGAGTGGCACCAATGATGCTGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGAAACCCATCCCTGGGTACATCGTGAGGAACTTCCACTACCTTCTCATCAAGGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTAGTGTTCACCACACTGAGGGGCCGCCAGCTCTGTGCACCCCCAGACCAGCCCTGGGTAGAACGCATCATCCAGAGACTGCAGAGGACCTCAGCCAAGATGAAGCGCCGCAGCAGTTAA（SEQ ID NO:6）
（2）包裝並濃縮慢病毒
將293t細胞按照8×10 6cells/150mm 2培養皿的密度接種，次日觀察細胞的狀態，用PEI轉染的方法將3代慢病毒包裝載體共轉至293t細胞，轉染完6小時後換液，按照15mL/150mm 2培養皿添加含有10%胎牛血清的DMEM培養基，轉染完48小時與72小時收集病毒上清，2000rpm 4℃ 10min離心，去除細胞碎片，之後0.45微米的濾器過濾雜質，過濾後的病毒懸液用25000rpm 4℃ 2小時濃縮慢病毒，濃縮後的病毒加入適量的培養基重懸，置於-80℃保存。
實施例 2 ：構建表達 Anti PD1-IL-21 融合蛋白和 CCL21 的靶向 Mesothelin 的慢病毒
本實施例與實施例1的區別在於，將CCL19替換為CCL21，如圖1第三條Schema Graph所示，其餘與實施例1一致，獲得表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL21的靶向Mesothelin的慢病毒。
實施例 3 ：生產 CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19 細胞
本實施例使用實施例1提供的慢病毒生產CART細胞，包括如下步驟：
抽血20mL，Ficall梯度離心分離PBMC，用Stemcell公司T細胞分選試劑盒（貨號：19051）分離T細胞，分離後的T細胞用添加5%人AB血清及300單位/mL IL-2 X-VIVO 15培養基重懸T細胞至1×10 6cells/mL，用含1% FBS X-VIVO 15清洗beads，按照磁珠:T細胞 =2:1體積比例加入預先清洗過的磁珠 (Cat#40203D, 10mL, Life technology)，2~3天后用新鮮的培養基重懸T細胞至3~5×10 6cells/mL，按照MOI=10值加入慢病毒，同時加入8ug/mL 的Polybrene，4~6小時之後，補加培養基稀釋細胞至1×10 6cells/mL,次日更換新鮮培養基,使細胞濃度維持在0.2~0.3×10 6PBMC/mL，之後每隔2~3天更換一次培養基，得到的CART細胞命名為CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組。
實施例 4 ：生產 CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21 細胞
本實施例使用實施例2提供的慢病毒，按照實施例3的方法生產CART細胞，命名為CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組。
實施例 5 ：構建表達 Anti PD1-IL-21 融合蛋白和 CCL19 或 CCL21 的靶向 GUCY2C 的慢病毒
本實施例構建了表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL19或CCL21的靶向GUCY2C的慢病毒，如下步驟：
（1）重組病毒載體製備
通過人工基因合成重組核酸CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19，如圖5第二條Schema Graph所示，重組核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；通過人工基因合成重組核酸CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21，如圖5第三條Schema Graph所示，重組核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，按照慢病毒載體酶切位元點，將核苷酸片段構建至慢病毒載體上，設計引物，通過測序結果驗證載體構建的正確性。
重組核酸CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19的核苷酸序列（SEQ ID NO:7）： ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTAATACTAACTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTCGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCGGTCTATTACTGTGGAAGATCCCCATTCGTTCATTACTACGACTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTTATAATTCTGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAACTTGGAAATAAAACGGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGGGATGGTCTTGTATTATTCTGTTTCTGGTGGCAACTGCTACTGGGGTGCATAGTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCCTGTCTCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGAGCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGACGCCTCCAACAGAGCCACCGGCATCCCAGCCAGATTTTCTGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGAGCTCTAACTGGCCAAGAACATTCGGGCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAGAGGGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCAGGCAGATCTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAATTCCGGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTATGACGGCTCTAAGCGGTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAATACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCACCAACGACGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTATGCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAAAACCCAGGTCCAATGGCCCTGCTACTGGCCCTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACTTCCCCAGCCCCAACTCTGAGTGGCACCAATGATGCTGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGAAACCCATCCCTGGGTACATCGTGAGGAACTTCCACTACCTTCTCATCAAGGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTAGTGTTCACCACACTGAGGGGCCGCCAGCTCTGTGCACCCCCAGACCAGCCCTGGGTAGAACGCATCATCCAGAGACTGCAGAGGACCTCAGCCAAGATGAAGCGCCGCAGCAGTTAATGA 重組核酸CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21的核苷酸序列（SEQ ID NO:8）： ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTAATACTAACTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTCGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCGGTCTATTACTGTGGAAGATCCCCATTCGTTCATTACTACGACTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTTATAATTCTGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAACTTGGAAATAAAACGGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGGGATGGTCTTGTATTATTCTGTTTCTGGTGGCAACTGCTACTGGGGTGCATAGTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCCTGTCTCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGAGCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGACGCCTCCAACAGAGCCACCGGCATCCCAGCCAGATTTTCTGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCTCTGGAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGAGCTCTAACTGGCCAAGAACATTCGGGCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAGAGGGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCAGGCAGATCTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAATTCCGGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTATGACGGCTCTAAGCGGTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAATACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCACCAACGACGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTATGCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAAAACCCAGGTCCAATGGCTCAGTCACTGGCTCTGAGCCTCCTTATCCTGGTTCTGGCCTTTGGCATCCCCAGGACCCAAGGCAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTGCCTCAAGTACAGCCAAAGGAAGATTCCCGCCAAGGTTGTCCGCAGCTACCGGAAGCAGGAACCAAGCTTAGGCTGCTCCATCCCAGCTATCCTGTTCTTGCCCCGCAAGCGCTCTCAGGCAGAGCTATGTGCAGACCCAAAGGAGCTCTGGGTGCAGCAGCTGATGCAGCATCTGGACAAGACACCATCCCCACAGAAACCAGCCCAGGGCTGCAGGAAGGACAGGGGGGCCTCCAAGACTGGCAAGAAAGGAAAGGGCTCCAAAGGCTGCAAGAGGACTGAGCGGTCACAGACCCCTAAAGGGCCATAATGA
（2）包裝並濃縮慢病毒
將293t細胞按照8×10 6cells/150mm 2培養皿的密度接種，次日觀察細胞的狀態，用PEI轉染的方法將3代慢病毒包裝載體共轉至293t細胞，轉染完6小時後換液，按照15mL/150mm 2培養皿添加含有10%胎牛血清的DMEM培養基，轉染完48小時與72小時收集病毒上清，2000rpm 4℃ 10min離心，去除細胞碎片，之後0.45微米的濾器過濾雜質，過濾後的病毒懸液用25000rpm 4℃ 2小時濃縮慢病毒，濃縮後的病毒加入適量的培養基重懸，置於-80℃保存。
實施例 6 ：生產 CART 細胞： CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19 和 CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21
使用實施例5構建的表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL19的靶向GUCY2C的慢病毒、以及表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL21的靶向GUCY2C的慢病毒，分別按照實施例3的方法生產CART細胞，分別命名為CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19和CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21。
對比例 1
本對比例構建了一種慢病毒，與實施例1的區別在於，省略了CCL19編碼區，其餘與實施例1一致，如圖1第一條Schema Graph所示，然後，使用該慢病毒，按照實施例3的方法生產CART細胞，命名為CAR-Mesothelin&PD1-IL21組。
對比例 2
本對比例構建了CART細胞：CAR-GUCY2C&PD1-IL21 。首先構建表達Anti PD1-IL-21融合蛋白的靶向GUCY2C的慢病毒（構建方法與實施例5中表達Anti PD1-IL-21融合蛋白和CCL19的靶向GUCY2C的慢病毒的構建方法的區別僅在於，核酸省略了CCL19編碼區，其餘與實施例5一致），該慢病毒結構如圖5中第一條Schema Graph所示；然後使用該慢病毒，按照實施例3的方法生產CART細胞，獲得的CART細胞命名為CAR-GUCY2C&PD1-IL21。
實驗例 1
在實施例3的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組、實施例4的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組和對比例1的CAR-Mesothelin&PD1 -IL21組中，病毒侵染完72小時後，使用流式分析各自得到的CART細胞的細胞陽性率。
如圖2所示，T細胞侵染後D6（第6天）的CAR陽性率檢測結果顯示，CAR-Mesothelin&PD1-IL21組的CAR陽性率為47.00%、CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組的CAR陽性率為35.50%、CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組的CAR陽性率為29.87%；由結果可以看出：本發明成功製備得到了CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19和CAR-Mesothelin&PD1 -IL21&CCL21。
實驗例 2
對實施例3的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組、實施例4的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組和對比例1的CAR-Mesothelin&PD1 -IL21組中侵染後D6的各組細胞，使用流式細胞術檢測其T、B、NK細胞分群，同時檢測T細胞中CD4、CD8、PD1、PD-L1的分群。
結果如表1所示，可以看出：表達PD1-IL21組的PD1分子表達水準降低，提示PD1-IL21融合蛋白可能會調控T細胞表面分子PD1的表達，大大降低了T細胞表面PD1表達的比例。 表 1流式細胞術對三組CART細胞的表徵結果
實驗例 3
以T細胞為對照，實施例3的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組、實施例4的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組中侵染後D6的各組細胞的體外殺傷功能進行評估，採用xCELLigence即時、細胞介導的細胞毒性系統（Acea Biosciences Inc.）評估CART細胞介導的細胞毒性。將1×10 4OVCAR3細胞培養於E-Plate 16 (Acea Biosciences)的每個孔中的150 μL生長培養基中，並在37°C培養箱中培養過夜，使用RTCA DP Analyzer系統每15分鐘量化一次電阻抗和RTCA 軟體版本2.0（Acea Biosciences Inc.）。大約24小時後，加入50 μL CART細胞（E:T比例為3:1）或50μL培養基作為陰性，在接下來的24小時內量化細胞介導的殺傷，每15分鐘讀取一次電阻抗。
結果如圖3所示，可以看出，在體外與靶細胞共培養時，與T細胞相比，CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組和CAR-Mesothelin&PD1-IL21& CCL21組細胞都具有非常明顯的殺瘤能力。
實驗例 4
以T細胞為對照，對實施例3的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組、實施例4的CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組和對比例1的CAR-Mesothelin&PD1 -IL21組共3組細胞開展趨化實驗。T Cell、CAR-Mesothelin&PD1-IL21組細胞、CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組細胞和CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL21組細胞培養第8天，各取細胞培養上清2mL，300g，5min，RT離心，再取上清分別加入transwell孔板(Corning, 3422)的下室中，每組設置三個複孔，每孔加入0.6mL上清。取T-Cell，計數離心，用X-vivo培養基重懸至2E6/mL，上室加入100uL細胞懸液，放置培養箱中培養6h後，收集下室中的細胞懸液並計數，計算遷移到下室中的細胞數。
實驗結果如圖4所示，可以看出，與T細胞和對比例1相比，CAR-Mesothelin&PD1-IL21&CCL19組細胞和CAR-Mesothelin&PD1-IL21& CCL21組細胞上清中分泌的CCL19和CCL21對T細胞具有非常顯著的趨化作用。
實驗例 5
在實施例6生產CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19、CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21以及在對比例2生產CAR-GUCY2C&PD1-IL21中，病毒侵染完72小時後，使用流式分析各自得到的CART細胞的細胞陽性率。
實驗結果如圖6所示，T細胞侵染後D6的CAR陽性率檢測結果顯示，CAR-GUCY2C&PD1-IL21組的CAR陽性率為59.77%、CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19組的CAR陽性率為66.62%、CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21組的CAR陽性率為50.10%；由結果可以看出：本發明成功製備得到了CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19和CAR-GUCY2C&PD1 -IL21&CCL21。
實驗例 6
以T細胞和CART細胞CAR-GUCY2C&PD1-IL21為對照，對實施例6的CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19和CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL21侵染後D6的各組細胞的體外殺傷功能進行評估，採用xCELLigence即時、細胞介導的細胞毒性系統（Acea Biosciences Inc.）評估CART細胞介導的細胞毒性。將1×10 4OVCAR3細胞培養於E-Plate 16 (Acea Biosciences)的每個孔中的150 μL生長培養基中，並在37°C培養箱中培養過夜，使用RTCA DP Analyzer系統每15分鐘量化一次電阻抗和RTCA 軟體版本2.0（Acea Biosciences Inc.）。大約24小時後，加入50 μL T細胞或50 μL CART細胞（E:T比例為3:1）或50μL培養基作為陰性，在接下來的24小時內量化細胞介導的殺傷，每15分鐘讀取一次電阻抗。
實驗結果如圖7所示，實驗結果表明，在體外與靶細胞共培養時，與T細胞和CAR-GUCY2C&PD1-IL21細胞相比，CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19組和CAR-GUCY2C&PD1-IL21& CCL21組細胞都具有非常明顯的殺瘤能力。
實驗例 7
小鼠體內抑制腫瘤能力實驗：
採用LS1034（人結直腸癌細胞）腫瘤模型，皮下接種至NPG小鼠（北京維通達生物科技有限公司），一共25只小鼠，分5組，每組5只小鼠，待腫瘤生長12天時，採用尾靜脈給藥的方式，每只小鼠注射5.0E+06個CAR+細胞或者T細胞或者PBS，給藥一次，隨後每週測量兩次腫瘤體積。實驗結果見附圖8，結果顯示，與T細胞和CAR-GUCY2C&PD1-IL21細胞相比，CAR-GUCY2C&PD1-IL21&CCL19組和CAR-GUCY2C&PD1-IL21& CCL21組細胞在NPG小鼠體內對LS1034腫瘤都具有非常明顯的抑制腫瘤生長的能力。
由上述實施例和實驗例可以看出，在CART細胞中將PD1抗體與IL-21融合是一種理想途徑，PD1表達在T細胞表面，主要是CD8+ T細胞，這樣形成的PD1抗體與IL-21融合蛋白會選擇性的結合在T細胞和CART細胞表面，行使其雙重功能；與此同時，融合蛋白由於分子量變大，也大大的提高了藥物的半衰期。
本發明通過分子構建，將CCL19或者CCL21構建到CAR結構中，讓CART細胞同時表達CAR和CCL19或者CCL21趨化因子，當CART殺傷腫瘤時，同時表達分泌的CCL19或者CCL21能夠招募和趨化機體天然的T細胞到達腫瘤部位，幫助CART細胞殺傷腫瘤。
最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。
圖1為本發明實施例1、實施例2和對比例1採用的重組核酸序列構成示意圖（Schema graph of lentiviral vector coding gene，亦即慢病毒載體編碼基因示意圖）； 圖2為本發明實施例3、實施例4和對比例1提供CART細胞陽性率檢測結果； 圖3為本發明實施例3、實施例4和對比例1提供CART細胞體外殺瘤能力對比結果； 圖4為本發明實施例3、實施例4和對比例1提供CART細胞趨化能力對比結果； 圖5為本發明實施例5和對比例2採用的重組核酸構成示意圖（Schema graph of lentiviral vector coding gene，亦即慢病毒載體編碼基因示意圖）； 圖6為本發明實驗例5的CART細胞陽性率檢測結果圖； 圖7為本發明實驗例6的CART細胞體外殺瘤能力對比結果圖； 圖8為本發明實驗例7的體內抑制腫瘤實驗結果圖。
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Claims (16)

  1. 一種含有三個編碼區的基因，其特徵在於， 編碼區（Ⅰ）編碼嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體含有特異性識別腫瘤抗原的胞外區； 編碼區（Ⅱ）編碼融合蛋白，所述融合蛋白包括免疫檢查點抗體和細胞因子； 編碼區（Ⅲ）編碼趨化因子。
  2. 如請求項1所述的基因，其中，所述腫瘤抗原選自MSLN、GD2、GPC3、CD19、EGFR VIII、GUCY2C、HER2、MUC16或Claudin 18.2中的至少一種；可選地，所述腫瘤抗原為MSLN或GUCY2C。
  3. 如請求項2所述的基因，其中，所述胞外區含有抗MSLN抗體；可選地，所述抗MSLN抗體為單鏈抗體； 可選地， （a）所述抗MSLN抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； （b）所述抗MSLN抗體的氨基酸序列為在（a）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編碼的蛋白質具有特異性識別MSLN抗原活性的SEQ ID NO:1的衍生氨基酸序列； （c）所述抗MSLN抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括SEQ ID NO:9中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包括SEQ ID NO:10中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由Kabat、IMGT、Chothia、Contact或AbM編號系統定義； （d）所述抗MSLN抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；所述輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；或者 （e）所述抗MSLN抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:9具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；可選地，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包括（c）或（d）所述的抗MSLN抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述抗MSLN抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區。
  4. 如請求項2所述的基因，其特徵在於，所述嵌合抗原受體包含抗GUCY2C抗體；可選地，所述抗GUCY2C抗體為單鏈抗體； 可選地， （a）所述抗GUCY2C抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括SEQ ID NO:17中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包括SEQ ID NO:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由Kabat、IMGT、Chothia、Contact或AbM編號系統定義； （b）所述抗GUCY2C抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；所述輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列：AAS，和LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列； （c）所述抗GUCY2C抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:17具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO:18具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；可選地，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包括（a）或（b）所述的抗GUCY2C抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述抗GUCY2C抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區；或 （d）所述抗GUCY2C抗體為單鏈抗體，其包括與SEQ ID NO:19具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；可選地，所述抗體包含（c）所述的抗GUCY2C抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區；可選地，所述抗GUCY2C單鏈抗體包括SEQ ID NO:19。
  5. 如請求項1~4任一項所述的基因，其中，所述免疫檢查點選自PD1、PD-L1、TIGIT、LAG3、CTLA4、BTLA或TIM3中至少一種；可選地，所述免疫檢查點選自PD1。
  6. 如請求項5所述的基因，其中，所述免疫檢查點抗體為抗PD1抗體；可選地，所述抗PD1抗體為單鏈抗體； 可選地， （a）所述抗PD1抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括SEQ ID NO:25中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包括SEQ ID NO:26中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由Kabat、IMGT、Chothia、Contact或AbM編號系統定義； （b）所述抗PD1抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；所述輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列； （c）所述抗PD1抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； （d）在（c）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且編輯的蛋白質具有靶向PD1功能的SEQ ID NO:2的衍生氨基酸序列；或者 （e）所述抗PD1抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO:25具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO:26具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；可選地，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包括（a）或（b）所述的抗PD1抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；可選地，所述抗PD1抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區。
  7. 如請求項1~6任一項所述的基因，其中，所述細胞因子為（A）或（B）； 所述（A）選自IL-21、IL-23、IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15或IL-18中至少一種； 所述（B）為具有調節免疫細胞活性的由（A）衍生的蛋白質； 可選地，所述細胞因子為IL-21； 可選地，所述IL-21具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  8. 如請求項1~7任一項所述的基因，其中，所述趨化因子為（c）或（d）； 所述（c）選自CXC趨化因子、CC趨化因子、CX3C趨化因子或XC趨化因子中的至少一種； 所述（d）為具有誘導免疫細胞定向遷移功能的由（c）衍生的蛋白質； 優選地，所述CXC趨化因子為選自CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16或CXCL17中的至少一種； 優選地，所述CC趨化因子為選自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27或CCL28中的至少一種； 優選地，所述CX3C趨化因子為CX3CL1； 優選地，所述XC趨化因子為XCL1； 可選地，所述趨化因子為CCL19或CCL21；優選地，所述CCL19具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；優選地，所述CCL21具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
  9. 一種重組核酸，其特徵在於，所述重組核酸包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述第一核酸分子含有請求項1~8任一項所述的編碼區（Ⅰ），所述第二核酸分子含有請求項1~8任一項所述的編碼區（Ⅱ），所述第三核酸分子含有請求項1~8任一項所述的編碼區（Ⅲ）。
  10. 如請求項9所述的重組核酸，其中，所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子之間通過2A肽的核酸序列相連；優選地，所述2A肽選自P2A、T2A、F2A或E2A中的至少一種； 可選地，所述第一核酸分子通過2A肽的核酸序列與第二核酸分子相連，所述第二核酸分子通過2A肽的核酸序列和第三核酸分子相連。
  11. 一種生物材料，其特徵在於，所述生物材料包括以下（ⅰ）或（ⅱ）： （ⅰ）重組載體，所述重組載體含有請求項1~8任一項所述基因，或者含有請求項9~10任一項所述的重組核酸； （ⅱ）構建體，所述構建體包括非致病性病毒，所述非致病性病毒含有請求項1~8任一項所述基因、請求項9或10所述的重組核酸或所述（ⅰ）重組載體； 可選地，所述非致病性病毒包括反轉錄病毒、慢病毒或腺病毒。
  12. 一種轉基因免疫效應細胞，其特徵在於，所述轉基因免疫效應細胞含有請求項1~8任一項所述基因、請求項9或10所述的重組核酸或請求項11所述生物材料； 可選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞或CIK細胞中的至少一種； 可選地，所述免疫效應細胞為T細胞。
  13. 如請求項12所述的轉基因免疫效應細胞，其中，所述轉基因免疫效應細胞含有跨膜區和/或胞內區； 可選地，所述跨膜區含CD8的跨膜段； 可選地，所述胞內區含免疫共刺激分子的胞內段和/或CD3 Zeta鏈； 可選地，所述免疫共刺激分子選自4-1BB、CD28、CD3、OX-40、CD40L、CD27、CD30、或他們的衍生物中的任一種或幾種；可選地，所述免疫共刺激分子選自4-1BB。
  14. 一種請求項12或13所述轉基因免疫效應細胞的構建方法，其特徵在於，所述構建方法包括，將請求項1~8任一項所述基因、請求項9或10所述的重組核酸或請求項11所述生物材料導入免疫效應細胞中，獲得所述轉基因免疫效應細胞； 可選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞、NKT細胞、巨噬細胞或CIK細胞中的至少一種； 可選地，所述免疫效應細胞為T細胞。
  15. 一種藥物組合物，其中，包括：請求項1~8任一項所述基因、請求項9或10所述重組核酸、請求項11所述生物材料、請求項12或13所述的轉基因免疫效應細胞或請求項14所述的構建方法構建得到的轉基因免疫效應細胞，以及藥學上可接受的載體。
  16. 如請求項1~8任一項所述基因、請求項9或10所述重組核酸、請求項11所述生物材料、請求項12或13所述的轉基因免疫效應細胞、請求項14所述的構建方法構建得到的轉基因免疫效應細胞或請求項15所述的藥物組合物在製備抗腫瘤產品中的應用；可選地，所述腫瘤包括實體瘤。
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