TWI633118B - 用於癌症標靶治療之包含基於重組血紅素蛋白或次單元之治療劑的醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種含有重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之醫藥組成物，其用於組織氧合及治療癌症。該基於重組血素紅蛋白或四聚體或二聚體或次單元之治療劑亦有效用於治療癌症。重組血紅素或四聚體或二聚體或其次單元部分可靶向癌細胞，且治療部分(亦即，活性劑/治療藥物)可有效殺死該等癌細胞。用於本發明中之基於重組血紅素或四聚體或二聚體或其次單元之治療劑可用於治療各種癌症，諸如胰腺癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌及腦癌。該組成物可單獨或與諸如化學治療劑、放射治療劑、抗癌蛋白藥物之其他治療劑組合使用以提供對癌症治療之協同效應，抑制癌轉移及/或減少復發。

Description

用於癌症標靶治療之包含基於重組血紅素蛋白或次單元之治療劑的醫藥組成物 【版權聲明/權限】
此專利文獻之揭示內容之一部分含有受版權保護之材料。版權所有者不反對任何人對專利與商標局(Patent and Trademark Office)專利檔案或記錄中出現之該專利文件或該專利揭示內容之傳真複製，但在其他任何情況下均保留所有版權。以下聲明適用於如下文及隨附圖式中所描述之方法、實驗及資料：版權©2014-15，保留所有權利。
【相關申請案之交叉參考】
本申請案主張2014年7月2日申請的美國臨時專利申請案第62/019,925號之優先權，且該專利申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血基質(heme)分子)之重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體及次單元，其具有氧攜載能力以替代自然血紅素蛋白。本發明亦提供使用重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體或次單元用於活體內及活體外組 織之氧合的方法。本發明進一步提供基於重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑，血紅素次單元中之至少一者已經化學修飾而產生能夠靶向及/或殺死癌細胞之材料。本發明額外提供一種用於構築及表現包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血基質分子)之不同重組血紅素及其二聚體及四聚體之次單元及用於其化學修飾或工程改造的方法。本發明進一步描述一種用於產生基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的化學工程改造之設計。本發明進一步係關於含基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的醫藥組成物，其用於在人類及其他動物中之癌症標靶治療，特定言之用於由各別祖細胞誘發或與各別祖細胞相關的肝癌、乳癌、胰腺癌及腫瘤。
基於血紅素之氧載劑(HBOC)最初作為血液替代物研發出。人類胎盤血紅素為一種尤其有前景的HBOC。由於其與人類紅血細胞相比之較高氧親和力、較低黏度及較小平均直徑，其允許輸送更多氧至缺氧組織。然而，由大規模使用胎盤血紅素造成之主要問題由自胎盤萃取血紅素且純化之條件引起。胎盤保持在冷凍儲存器中，且為了萃取血紅素，其必須在融化之前碾碎。隨後，藉由過濾移除組織及纖維蛋白原，且在所得濾液上進行層析、沈澱及透濾之若干步驟。另外，人類胎盤血紅素及人類血液之來源為有限的。因此，重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之構築及表現對解決此問題至關重要。
缺氧在癌症中為常見的。缺氧及貧血(其有助於腫瘤缺氧)可藉由剝奪腫瘤細胞的對於此等試劑之細胞毒素活性而言必需的氧而導致 電離輻射及化學療法耐藥性。經由包括蛋白組及基因組變化之一或多種間接機制，缺氧亦可降低對輻射療法及化學療法之腫瘤敏感度。因此，需要改良的癌症治療組成物，尤其有助於靶向癌細胞且增強細胞毒素劑功效之改良的癌症治療組成物。
因此，在本發明中，構築一種具有氧攜載能力之重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體及/或次單元。本發明提供包括α、β、γ1、γ2(具有或不具有血基質分子)單體之重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體及次單元，其具有氧攜載能力以替代自然血紅素蛋白。另外，提供一種基於本發明之重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體及/或次單元中之任一者，能夠靶向癌細胞以便藉由結合治療藥物(例如，化學治療劑、放射治療劑、抗癌蛋白藥物)有效殺死癌細胞之治療劑。然而，發現廣泛用於不同患者之常見化學治療劑、放射冶療劑及抗癌蛋白藥物具有許多副作用。此等問題可藉由化學修飾本發明之重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元中之任一者且將其連接至一或多種治療藥物來克服。因此，本發明進一步提供基於重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體或次單元，已經化學修飾而產生能夠靶向及/或殺死癌細胞之材料的治療劑。本發明額外提供一種用於構築及表現包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血基質分子)之不同重組血紅素及其二聚體及四聚體之次單元及用於其化學修飾或工程的方法。本發明進一步描述一種用於產生基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的化學工程設計。本發明進一步係關於含基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚 體、二聚體或次單元之治療劑的醫藥組成物，其用於在人類及其他動物中之癌症標靶治療，特定言之用於由各別祖細胞誘發或與各別祖細胞相關的肝癌、乳癌、胰腺癌及腫瘤。當單獨與用於治療癌症之習知治療藥物相比時(例如，化學治療藥物包括5-氟尿嘧啶、替莫唑胺(temozolomide)、順鉑(cisplatin))，本發明之基於重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元之治療劑不僅可靶向癌細胞，而且在癌症及/或腫瘤治療中更加有效，因為對癌細胞/腫瘤之殺死效應進一步增強。此外，由於基於癌症靶向之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑可以比其他已知基於血紅素之氧載劑相對低的劑量使用，因此極大減弱來自用於癌症之習知治療藥物之不利副作用。
大多數習知治療藥物為極昂貴的。若降低治療有效劑量，則可顯著減低各患者之治療成本。本發明之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素次單元之治療劑為用於降低治療有效劑量之良好候選物，因為修飾之重組血紅素蛋白或重組血紅素次單元可靶向癌細胞。在一個具體實例中，用於治療人類癌症之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑的治療有效劑量可為個體體重之0.0024mg/kg或以下(對於單劑)。其可以多劑(每週一次)用於治療癌症。本發明亦提供使用重組血紅素蛋白、重組血紅素四聚體、二聚體或次單元用於活體內及活體外組織之氧合的方法。
視情況，當前主張的基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑亦可連接至螢光探針以有助於活細胞成像。與螢光素結合之基於重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之治療劑 可由肝癌細胞吸收。藉由細胞之新螢光素結合之基於重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之治療劑的吸收藉由將該等治療劑立即用於如下文中所描述之一系列活細胞吸收研究中之細胞來驗證。在一個實施例中，展示螢光素結合之基於重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之治療劑將由肝癌細胞(例如，HepG2細胞系)吸收。
因此，在本發明之第一態樣中，提供不同重組血紅素蛋白、重組四聚體、重組二聚體及/或重組血紅素次單元(例如，α、β、γ1、γ2；具有或不具有血基質分子)及其形成的二聚體及四聚體，且亦提供該等重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體及次單元用於進一步化學工程或修飾。亦提供一種在宿主中構築且表現該等重組血紅素蛋白或次單元及其二聚體及四聚體之方法。
本發明之第二態樣為藉由一或多種官能基構築化學修飾重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元，該一或多種官能基可用作與至少一種類型用於靶向癌細胞之治療藥物連接的鍵或連接子(可斷裂或不可斷裂)。在一個具體實例中，涉及化學修飾本發明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之化學反應包括(但不限於)胺反應、硫醇反應、羧酸酯(carboxylate)反應、羥基反應、使用硫酯之天然化學連接、生物正交官能之併入、光化學反應及金屬介導反應。可化學修飾重組血紅素蛋白之一或多個血紅素次單元。
本發明之第三態樣為經由該可斷裂或不可斷裂鍵或連接子將本發明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元化學連接至至少一種類型治療藥物(活性劑)上以便殺死癌細胞。可連接至本發 明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療藥物或活性劑包括(但不限於)化學治療藥物(例如，5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑)；放射冶療藥物(例如，銠-105錯合物、釤-153錯合物及其他相關錯合物)；抗癌蛋白藥物(例如，精胺酸酶、精胺酸脫亞胺酶)；證實有效用於治療及/或緩解癌症且能夠容易連接至本發明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元，經由可斷裂或不可斷裂鍵或連接子連接至重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元，或連接至本發明之第二態樣中之化學修飾重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元的任何其他治療藥物及/或化合物。
本發明進一步係關於含基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑，用於人類及其他動物中之癌症靶向治療的醫藥組成物。組成物包括治療有效量之該治療劑及醫藥學上可接受之載劑、鹽、緩衝液、水或其組合以便靶向且治療癌症。在一個具體實例中，醫藥組成物之pH在5.5至9.5範圍內。在另一具體實例中，醫藥組成物之pH在7.2至8.0範圍內。
在本發明之第四態樣中，提供一種用於靶向及/或治療癌症之方法，其包含向罹患各種腫瘤及/或癌症之需要其之個體投予本發明之包含治療有效量之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的醫藥組成物。組成物可藉由各種途徑投予個體，包括(但不限於)靜脈內注射、腹膜內注射及皮下注射。可製備含諸如化學治療劑(例如，5-氟尿嘧啶，5FU)之活性劑的基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的可斷裂與不可斷裂形式以在本發明中用於 癌症靶向治療。
本發明之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑亦經化學修飾以有助於治療劑靶向癌細胞，以便更有效殺死癌細胞。重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元可經化學修飾且連接至不同治療劑(例如，5FU、替莫唑胺、順鉑等)上。重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元可靶向癌細胞。此靶向特性有助於經由誘發細胞之凋亡而有效殺死此等癌細胞、癌症幹細胞及/或癌症祖細胞。因而，可降低治療劑之劑量。
本發明中提供之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑可用於治療各種癌症，諸如胰腺癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸症、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。本發明係關於基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑，治療癌症之方法及治療及/或抑制癌組織轉移及癌組織(包括(但不限於)肝癌)復發之方法。
腫瘤內之細胞本質上為異質的。一般認為腫瘤由以下組成：(1)大部分具有有限分裂能力之癌細胞，及(2)少量癌症幹細胞樣細胞(CSC)，亦稱為祖細胞，其可形成新腫瘤細胞且本質上為高度轉移性的。由於CSC之化療耐藥性及轉移性之固有特性，已假設其造成患者之癌症復發。
由於本發明之基於重組血紅素蛋白或四聚體、二聚體或次單元之治療劑的重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元部分可將氧引入CSC或祖細胞中以有助於殺死癌症幹細胞或祖細胞，同時本發 明之基於重組血紅素蛋白或次單元之治療劑之活性劑部分可殺死癌細胞，因此本發明之基於本發明重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑在癌症治療中具有協同效應。
定義
術語「癌症幹細胞(cancer stem cell)」係指在贅生性選殖系內生物相異的細胞，其能夠在活體內起始且維持腫瘤生長(亦即，癌症起始細胞)。
術語「可斷裂結合物(cleavable conjugate)」係指具有至少一個可藉由水解或氧化還原反應容易釋放連接治療藥物/活性劑之可斷裂連接子或鍵的結合物。
術語「不可斷裂結合物」係指具有至少一個不可斷裂連接子或鍵之結合物且其無法藉由水解或氧化還原反應容易釋放連接治療藥物/活性劑。
術語「重組血紅素蛋白(recombinant hemoglobin protein)」係指分子尺寸為至少大致65KDa且藉由任何標準分子化學技術合成，且未自任何動物或人類來源分離或純化之血紅素分子。在本發明中，重組血紅素蛋白可包括(但不限於)本發明之重組血紅素四聚體、二聚體及次單元(單體)(具有或不具有血基質)或可與重組血紅素四聚體互換使用。
術語「重組血紅素四聚體(recombinant hemoglobin tetramer)」係指分子尺寸為至少大致64KDa且藉由任何標準分子化學技術合成，且未自任何動物或人類來源分離或純化之血紅素分子。在本發明中，重組血紅素四聚體可包含本文中所描述之任何四個重組血紅素次單元(具有或不具有血基質)，或藉由任何標準分子化學技術合成且未自任何動物或人類來源分離或純化之任何四個血紅素次單元。
術語「重組血紅素二聚體(recombinant hemoglobin dimer)」係指分子尺寸為至少大致32KDa且藉由任何標準分子化學技術合成，且未自任何動物或人類來源分離或純化之血紅素分子。在本發明中，重組血紅素二聚體可包含本文中所描述之任何兩個重組血紅素次單元，或藉由任何標準分子化學技術合成且未自任何動物或人類來源分離或純化之任何兩個 血紅素次單元。
術語「重組血紅素次單元(recombinant hemoglobin subunit)」係指分子尺寸為大致16KDa或16KDa以下且藉由標準分子化學技術合成，且未自動物或人類來源分離或純化之血紅素次單元或其片段，其可經血基質基團修飾或可不經修飾。
301‧‧‧種培養物製備
302‧‧‧發酵與收穫
303‧‧‧粗蛋白分離
304‧‧‧親和力層析
305‧‧‧脫鹽/超濾
306‧‧‧離子交換層析
307‧‧‧內毒素移除
308‧‧‧純蛋白
圖1展示用於構築基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑的設計方法。一或多種治療藥物可連接至重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元(例如，α、β、γ1、γ2)上以形成基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元之治療劑。重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體、二聚體或次單元可經由可斷裂(A)或不可斷裂連接子/鍵(B)化學連接至治療劑。可斷裂連接子可為(但不限於)甲醇胺、二硫化物、脲、胺縮醛、碳酸酯、酯、胺基甲酸酯、磷酸酯、醯胺、縮醛、亞胺、醚及磺醯胺基團；不可斷裂連接子可(但不限於)烷基及芳基。
圖2描繪人源(智人(Homo sapiens))之不同血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)之胺基酸序列，及用於重組血紅素單體(亦即，單體α、單體β、單體γ1及單體γ2)；二聚體(亦即，二聚體αβ、二聚體αγ1、二聚體αγ2、二聚體βγ1及二聚體βγ2)；及四聚體(亦即，四聚體2αβ2、四聚體2αγ12、四聚體2αγ22、四聚體2βγ12、四聚體2βγ22)之設計。
圖3為描繪自細胞製備本發明之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之方法概述的流程圖，該等細胞藉由表現具有本文中所描述之胺基酸序列的不同血紅素四聚體、二聚體或次單元之蛋白的不同構 築體轉型。
圖4展示用於表現重組血紅素次單元γ-1(γ1)之大腸桿菌(E.coli)細胞JM109(DE3)之生長曲線。
圖5展示SDS-PAGE中之(A)經純化之重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)及(B)經純化之重組血紅素二聚體及四聚體的分子尺寸。
圖6展示具有或不具有血基質，標記有螢光染料之經純化之重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)。
圖7展示用於本發明之(A)重組血紅素四聚體中之一者(2αβ2)及重組血紅素四聚體中之另一者(2αγ12)的氧平衡曲線。
圖8描繪用於本發明之重組血紅素二聚體中之一者(αβ)之電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析。
圖9描繪用於本發明之重組血紅素四聚體中之一者(2αβ2)之電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析。
圖10說明具有血基質(+)或不具有血基質(-)之螢光標記重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)可成功進入肝癌細胞(HepG2)。
圖11展示用於(A)5FU連接之重組血紅素四聚體(2αβ2)及(B)5FU連接之重組血紅素四聚體(2αγ12)之液相層析-質譜分析(LC-MS)結果。
圖12展示(A)具有雙硫鍵之N-(2-巰基乙基)苯甲醯胺(模型化合物)在還原條件(亦即，GSH(0.4-1,000當量)；PBS(pH 7.4)；37℃，0-2小時)下之斷裂，及(B)不同GSH含量下模型化合物之轉化速率： GSH(1當量)類似於血流中之量，同時GSH(1,000當量)類似於細胞質中之量。
圖13展示具有或不具有吉西他濱(Gemcitabine；GEM)之天然牛交聯血紅素(Hb)四聚體及本發明之重組血紅素四聚體(2αβ2)在減小腫瘤尺寸中，在胰腺癌Capan-1動物模型相比於對照及僅用GEM治療之動物模型組之腫瘤重量(g)方面的功效；組1：PBS緩衝液(對照)；組2：吉西他濱(GEM)，100mg/kg；組3：天然牛交聯血紅素(Hb)四聚體，30mg/kg；組4：天然牛交聯血紅素四聚體+吉西他濱(Hb+GEM)；組5：重組血紅素四聚體(2αβ2)，30mg/kg；組6：重組血紅素四聚體(2αβ2)+吉西他濱。
圖14展示具有或不具有吉西他濱(GEM)之天然牛交聯血紅素(Hb)四聚體及本發明之重組血紅素四聚體(2αγ12)在減小腫瘤尺寸中，在胰腺癌Capan-1動物模型相比於對照及僅用GEM治療之動物模型組之腫瘤重量(g)方面的功效；組1：PBS緩衝液(對照)；組2：吉西他濱(GEM)，100mg/kg；組3：天然牛交聯血紅素(Hb)四聚體，30mg/kg；組4：天然牛交聯血紅素四聚體+吉西他濱(Hb+GEM)；組5：重組血紅素四聚體(2αγ12)，30mg/kg；組6：重組血紅素四聚體(2αγ12)+吉西他濱。
由於大多數癌組織(諸如癌腫瘤)為缺氧的，因此可變得對習知化學治療/放射治療劑具有耐藥性。本發明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元可用於緩解此缺氧病狀。由於其與人類紅血細胞相比之較高氧親和力、較低黏度及較小平均直徑，其允許輸送更多氧至缺氧組織，使得癌細胞中化學治療劑/放射治療劑/其他抗癌藥物耐藥性減小。
在本發明之一個具體實例中，產生重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元。重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元具有氧運輸特徵，且可靶向人類或動物體中之癌細胞或組織。作為氧載體之本發明之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元經化學修飾，且連接到至少一種類型能夠觸發受體介導機制且引導組合/結合化學治療劑與重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元在至少癌細胞之細胞質中定位在一起之治療藥物(例如化學治療劑)，以便增加重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元與化學治療劑在減小腫瘤尺寸中之功效，引起癌症之治療。較佳地，當單獨投予時，該癌症對諸如化學治療劑及/或放射冶療劑之習知治療藥物具有耐藥性。
圖1A及圖1B中展示用於構築基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療藥物的設計。一或多種活性劑(或在本文中可與「治療藥物」互換使用)連接至重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元以形成當前主張的基於重組血紅素蛋白或次單元之治療劑。一或多種特定活性劑之選擇可視待靶向之癌症組織類型及所得化學修飾材料之所需分子尺寸而進行。此外，在一個以上活性劑之情況下，所選擇之活性劑可相同或不同。亦即活性劑(或「治療藥物」)等，只要所得分子保持功效且亦能夠與用於靶向癌細胞之本發明之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元連接。本發明之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元可經由可斷裂(圖1A)或不可斷裂鍵或連接(圖1B)化學連接至治療藥物/活性劑，或作為替代方案，可在該鍵或連接不存在下直接與活性劑結合。不同化學基團在本發明中可用於重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之化學修飾，且重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元可經由此等化學基團連接至治療藥物/活性劑。在一個具體實例中，可斷裂連接子可為(但不限於)甲醇胺、二硫化物、脲、胺縮醛、碳酸酯、酯、胺基甲酸酯、磷酸酯、醯胺、縮醛、亞胺、肟、醚及磺醯胺基團；不可斷裂連接子可為(但不限於)烷基及芳基。
圖2展示不同血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)之胺基酸序列比對及重組血紅素單體、二聚體及四聚體之設計。重組血紅素可使用來自各種物種(包含(但不限於)人類、牛、豬、馬及犬血紅素)之序列產生。在此實施例中，選擇具有約141-146個胺基酸之不同智人血紅素次單元胺基酸序列(即α、β、γ、1及γ2(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)) 以用於待嵌入表現載體中且視情況標記有在宿主(例如，細菌)中表現後用於分離及純化之His-相撲/聚-His序列之DNA構築體設計，該宿主藉由攜載相應DNA構築體之表現載體轉型。圖3之流程圖中概述產生重組血紅素蛋白/次單元之方法。任何兩個次單元(例如α及β次單元，或α及γ1次單元)可藉由使用攜載相應的表現α及β次單元或α及γ1次單元之DNA序列之另一表現載體表現。在圖3流程圖中所說明之方法之後的純化後，可分別形成二聚體αβ、αγ1、αγ2、βγ1及βγ2。兩個以上次單元(例如兩個α次單元及兩個β次單元，或兩個α次單元及兩個γ-1次單元，或兩個α次單元及兩個γ-2次單元以分別形成四聚體，亦即2αβ2、2αγ12、2αγ22、2βγ12、2βγ22)之進一步重組亦可使用類似方法形成。可在四聚體內之兩個血紅素次單元之間執行進一步修飾，諸如交聯。圖2A、圖2B及圖2C中分別展示重組血紅素次單元、二聚體及四聚體之胺基酸序列設計之示意圖。
圖3中描繪之方法基於在用攜載相應DNA構築體之表現載體設計轉型之宿主系統中表現重組蛋白之標準分子化學技術，以便表現相應的本發明之血紅素次單元、二聚體或四聚體。可表現重組蛋白之其他可能方法亦可用於表現本發明重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元。首先，製備具有表現相應血紅素次單元之攜載DNA構築體之轉型宿主細胞的種培養物(seed culture)(301)以用於醱酵(302)。藉由離心收穫細胞(302)。隨後，溶解所收穫細胞以分隔粗蛋白(303)。隨後使用親和層析純化粗蛋白(304)。藉由脫鹽管柱及/或超濾移除來自親和層析之洗提液中之鹽(305)。藉由離子交換管柱層析法進一步純化半純化之蛋白(306)以便移 除蛋白雜質及內毒素(307)。本發明之方法適用於重組單體、二聚及四聚血紅素之大規模工業產生。另外，重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體次單元與醫藥載劑(例如，水、生理緩衝液、膠囊)之組合適用於哺乳動物用途。
在大腸桿菌中進行不同重組血紅素蛋白或重組血紅素次單元之構築及表現。舉例而言，將用攜載表現γ-1(γ1)次單元之DNA構築體之表現載體轉型的大腸桿菌JM109(DE3)接種且培養約16個小時以便收穫用於細胞溶解及蛋白萃取之細胞。圖4中展示表現γ-1(γ1)次單元之大腸桿菌JM109(DE3)的生長曲線。隨後，藉由管柱層析法純化重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元。圖5A中展示根據本發明方法表現及純化之重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)，且圖5B中展示根據本發明方法表現及純化之重組血紅素二聚體及四聚體。圖6展示具有或不具有血基質之未純化但經螢光標記之次單元。
量測測試化合物之p50值(在本發明中意謂產生50%飽和度血紅素必需之氧分壓)且結果展示於圖7中。天然人類血紅素之p50值為大致約23-30mm Hg。圖7展示用於(A)重組血紅素四聚體(2αβ2)及(B)重組血紅素四聚體(2αγ12)之氧平衡曲線。如圖7中所展示，重組血紅素四聚體2αβ2之p50值為約15mm Hg，且重組血紅素四聚體2αγ12之p50值為約21mm Hg。與p50值為約23-30mm Hg之天然人類血紅素相比，形成具有相對較高氧親和力及小於大致23mm Hg之較低p50值的重組血紅素。當在由大量失血(例如，出血性休克)導致之組織缺氧之情況下需要快速氧合時，使用含基於血紅素之氧載體、具有較低氧親和力之組成物。較低氧親和力意謂材料可比具有較高氧親和力之材料更容易將氧「卸載」 至標靶。具有較高氧親和力之組成物在癌症治療中適用作氧合輔助治療劑，其中在彼情況下需要較慢的氧遞送速率。
用於治療缺氧病症及心臟保存，本發明之具有較低氧親和力之含基於血紅素之氧載體的醫藥組成物向標靶器官或個體提供氧。具有較低氧親和力之本發明重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元適用於需要快速組織氧合之應用(例如出血性休克及活體外器官保存)。
對於癌症治療中之應用，本發明之具有較高氧親和力之含基於血紅素之氧載體的醫藥組成物充當組織氧合試劑以改良腫瘤組織中之氧合，從而增強化療及輻射敏感度。具有相對較高氧親和力之本發明重組血紅素適用於需要較慢氧合速率之應用(例如，例如輔助療法)。
ESI-MS允許分析極大分子。其為藉由電離蛋白且隨後基於質量/電荷比分離電離蛋白來分析高分子量化合物之電離技術。因此，分子量及蛋白相互作用可經精確測定。電噴霧電離質譜分析(ESI-MS)用於分析且使本發明中之重組血紅素單體、二聚體及四聚體特性化。圖8描繪用於重組血紅素二聚體(αβ)之電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析。次單元之尺寸為15,189Da，且β次單元之尺寸為15,899Da。圖9描繪用於重組血紅素四聚體(2αβ2)之電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析。β次單元之尺寸為15,899Da且2α之尺寸為30,356Da。由此分析，2αβ2之估算總分子尺寸為約46KDa。ESI-MS亦針對重組血紅素四聚體(2αγ12)、其他重組血紅素二聚體及單體執行。
本發明之重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元用於產生醫藥品，該等醫藥品用於組織氧合、用於癌症治療、用於治療缺氧病症(諸 如出血性休克)及在較低氧含量環境(例如，心臟移植)下之心臟保存。以濃度範圍大致0.03g/kg之動物體重或以下或0.0024g/kg之人類體重或以下選擇本發明之重組血紅素四聚體之劑量(藉由根據FDA行業導引及綜述：Estimating the Safety Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers,November 18,2002之12.3係數，針對小鼠劃分劑量來確定人類劑量)。
對於適用於癌症治療之醫藥品，本發明之含基於血紅素之氧載體的醫藥組成物充當組織氧合試劑以改良腫瘤組織中之氧合，從而增強化療敏感度(例如，對化學療法之敏感度)及輻射敏感度。
本發明之醫藥組成物包含能夠靶向且殺死癌細胞之基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑。圖6展示具有或不具有血基質，標記有螢光染料之經純化之重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)。螢光標記之重組血紅素次單元亦可進入癌細胞(例如，肝癌細胞，HepG2)中且定位於此處，且結果說明於圖10中。預期基於化學修飾之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元之治療劑亦可有效殺死癌細胞及祖細胞/癌症幹細胞。
一些習知治療藥物(例如，化學治療藥物，5FU)由於高毒性而無法以高劑量使用。在本發明中，化學治療劑(例如5FU)化學連接至重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或其次單元或重組血紅素次單元本身中之任一者上。連接至當前主張的重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或其次單元之化學治療劑可比用於癌症投予單獨之其他習知方法/劑之劑量低，因為當前主張的重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元有 助於化學治療劑定位於癌細胞之細胞質中以便增加本發明之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元與化學治療劑之功效。本發明之重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或次單元亦可改良放射治療劑及/或其他抗癌藥物在癌細胞或腫瘤中，尤其在缺氧、對此等用於癌症治療之習知治療藥物更具耐藥性之彼等病症中之功效。圖11展示用於(A)5FU連接之重組血紅素四聚體(2αβ2)及(B)5FU連接之重組血紅素四聚體(2αγ12)之液相層析-質譜分析(LC-MS)結果。5FU成功地化學連接至重組血紅素四聚體。其亦適用於另一化學連接之重組血紅素二聚體及重組血紅素次單元(或單體)。
重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或其次單元可藉由不同官能基來化學修飾，隨後連接至治療藥物。重組血紅素蛋白或四聚體或二聚體或其次單元可藉由以下化合物或反應中之一或多者修飾：(1)對於胺反應：酐、乙烯酮、NHS酯、異硫氰酸酯(isothiocyanates)、異氰酸酯(isocyanates)、包括氟苯基酯及羰基疊氮化合物之活化酯、磺醯氯、之後接續還原胺化的羰基、環氧化物、碳酸酯(carbonates)、氟苯、亞胺基酯、羥甲基膦衍生物、曼尼希縮合(mannich condensation)、重氮(diazonium)衍生物、4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯酚、羰基二咪唑、磺酸基-NHS及藉由基於吡哆醛-5-磷酸之仿生轉胺作用之N端修飾；(2)對於硫醇反應：順丁烯二醯亞胺、烷基鹵化物、鹵乙醯胺、二硫化物、硫代硫酸酯(thiosulfates)、含吖之劑、丙烯醯基衍生物、芳化劑及乙烯基碸衍生物；(3)對於羧酸酯反應：重氮烷及重氮乙醯基化合物、羰基二咪唑及碳二醯亞胺；(4)對於羥基反應：環氧化物及氧、羰基二咪唑、碳酸酯、氯甲酸酯、化學及酶氧 化、烷基鹵素及異氰酸酯；(5)使用硫酯之天然化學連接；(6)對於N端修飾，使用N端絲胺酸或蘇胺酸之過碘酸鹽氧化以產生與羥胺、肼或醯肼、碳二醯亞胺偶合之醛；(7)對於生物正交官能之併入：包括炔烴及疊氮化合物，後續生物正交結合反應，包括炔烴及疊氮化合物之偶極加成胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶極加成、疊氮化合物及三芳基膦之施陶丁格連接(Staudinger ligation)、烯烴及四之狄爾斯-阿德反應(Diels-alder reaction)及烯烴及四唑之偶合；(8)對於光化學反應：光親和標記劑、二吖吮衍生物、二苯基酮及蒽醌；(9)對於金屬介導反應：金屬類碳烯及鈀活化之烯丙基試劑。
當與血液流中之麩胱甘肽含量(約1當量)相比時，癌細胞之細胞質中之麩胱甘肽(GSH)含量(約1000當量)高得多。具有雙硫鍵之治療藥物在具有高濃度GSH之癌細胞之細胞質中可能容易斷裂。圖12中展示具有雙硫鍵之模型化合物(N-(2-巰基乙基)苯甲醯胺)在還原條件下之斷裂之高效液相層析(HPLC)分析。在PBS緩衝液(pH 7.4)中，在37℃下藉由不同濃度麩胱甘肽(GSH)(0.4-1000當量)，觀察到模型化合物之斷裂。模型化合物之斷裂在高濃度GSH(>50當量)下更好。在本發明中，製備藉由雙硫鍵與治療藥物(例如，化學治療劑、放射治療劑、抗癌蛋白藥物)連接之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元以用於癌症治療。
在市場中未能獲得基於重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑。本發明中提供之含基於化學修飾之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑的醫藥組成物可 以治療效應靶向癌細胞。至於在癌症治療中之用途，本發明之含基於化學修飾之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑的醫藥組成物充當殺死癌細胞之抗癌劑。基於化學修飾之重組血紅素蛋白或重組血紅素四聚體或二聚體或次單元之治療劑為以較低劑量使用之良好候選物，且可與其他分子標靶或細胞毒素劑組合。
實施例
藉助於描述本發明之特定具體實例提供以下實施例，不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
實施例1
(a)用重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或其次單元構築表現載體
在PUC 57載體中合成且選殖人源之α/β/γ1/γ2鏈之DNA序列。藉由PCR方法擴增α/β/γ1/γ2鏈。基於α/β/γ1/γ2鏈兩者設計用於PCR之引子。在梯度熱循環器(Life sci)中執行PCR。在含有Taq緩衝液、10mM dNTP、25mM MgCl2、10μM引子、2.5U Taq DNA聚合酶及100ng模板DNA之25μl反應混合物中執行反應。梯度PCR條件由以下構成：在95℃下3min之初始變性步驟，之後為由在95℃下變性30s、在50-55℃下引子黏合30s及在72℃下延伸45s，隨後在72℃下最終延伸5min組成的25週期擴增。藉由1.5%瓊脂糖凝膠電泳以及標準標記物分離PCR產物且用凝膠紅染色。切除預期尺寸之產物帶，且遵循製造商之說明書，用PCR清除凝膠萃取套組萃取DNA片段。將經純化之DNA片段選殖入pSumo載體或PUC 19載體中。將連接混合物轉移至大腸桿菌DH5a菌株中，且在 含100ng/ml安比西林(ampicillin)之LB瓊脂上選擇轉移體。藉由核苷酸定序驗證假定選殖系。使用BLAST演算法程式執行cDNA序列之分析。
(b)不同重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或子單元
如圖2及表1中所展示，產生七個重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元。圖2中展示α/β/γ1/γ2鏈之蛋白序列。對於重組血紅素單體，將α/β/γ1/γ2鏈選殖入pSumo載體中，且藉由T7啟動子控制融合蛋白表現。對於重組血紅素雜二聚體，α鏈及β/γ1鏈在pUC19載體中且在pTac啟動子控制下共表現。對於重組血紅素四聚體，兩個α鏈藉由甘胺酸連接子連接，且在pUC19載體中及在pTac啟動子控制下與β/γ1鏈共表現。
實施例2
重組蛋白表現
將用於表現重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元之質體轉移至大腸桿菌JM109(DE3)或大腸桿菌BL21(DE3)中。在37℃下，使大腸桿菌細胞在補充有安比西林(100mg/ml)之LB培養基中生長。對於搖瓶表現，以1：100將隔夜培養物添加入含100mg/ml安比西林之LB培養基中。細胞在37℃下在搖瓶中生長直至600nm處之光學密度達至0.6。藉由將異丙基b-硫代半乳糖苷添加至0.4mM來誘發重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元之表現。隨後，用血晶素(20mg/L)補充培養物，且在28℃下持續生長至少16h。對於醱酵槽培養，用於表現重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元之培養基含有1.28%細菌胰蛋白腖(bactotryptone)、0.8%細菌酵母萃取物(bactoyeast extract)、1%丙三醇、25mM KH2PO4、25mM Na2HPO4、45mM NH4Cl、5mM(NH4)2SO4及100mg/L安比西林。使細胞在30℃下在2L醱酵槽(Sartorius，BIOSTAT® B)中生長直至600nm處之光學密度達至8。藉由將異丙基b-硫代半乳糖苷(Sigma)添加至mM來誘發重組血紅素蛋白/四聚體/二聚體/次單元之表現。隨後，用血晶素(50mg/L)補充培養物，且在25℃下持續生長至少16h。藉由離心收穫細胞，且將其冷凍儲存於-80℃下直至需要純化。
實施例3
搖瓶及醱酵槽中之重組血紅素之蛋白產率
表2中概括重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元之蛋白產率。來自醱酵方法之蛋白產率高得多，可高達180mg/L。
實施例4
用於癌細胞系之培養物及試劑
在37℃下，在具有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素之DMEM(Invitrogen)中培養癌細胞(HepG2)。對於常氧條件，在環境O2濃度及5% CO2之情況下培育細胞；對於缺氧條件，在0.1%-0.5% O2(Quorum FC-7自動CO2/O2/N2氣體混合器)及5% CO2之情況下培育細胞。
實施例5
癌細胞中之活細胞延時顯微法
將癌細胞(例如，HepG2肝癌細胞)接種至玻璃底部微孔碟(MatTek公司)上。使用裝備有常壓/溫控腔室及用於多位置獲取之機動台的Zeiss Observer Z1寬場顯微鏡獲取既定縮放(63×，20×)下之活細胞。在用0.1% O2及5% CO2(預混合)淨化之封閉活細胞成像系統中執行培育。使細胞暴露於螢光標記之重組血紅素次單元(α、β、γ1、γ2)；持續15min，隨後在2h之時間段中每隔3min獲取影像。使用MetaMorph軟體(Molecular Device)，使影像去捲積(deconvolved)且壓縮至延時影片中。影像展示於圖10中。
實施例6
(a)重組血紅素四聚體(2αβ 2 )對癌細胞異種移植物之活體內功效
裸Balb/c小鼠(5-7週)用於此實施例，且在實驗之前允許其適應一週。用含2×106個癌細胞之100μl新製培養基皮下接種小鼠。十天後，將小鼠隨機分成對照組及治療組。對照組接收100μl PBS，且治療組(組2-6)每週一次腹膜內接收藥物(每週兩次，持續4週)。吉西他濱為抗癌(「抗腫瘤」或「細胞毒素」)化學療法藥物，且其用於組2、組4及組6。藉由卡尺量測腫瘤尺寸，且使用式：(長度×寬度2)/2計算腫瘤體積。圖13中展示結果。結果展示重組血紅素四聚體(2αβ2)可抑制腫瘤細胞生長。
(b)重組血紅素四聚體(2αγ1 2 )對癌細胞異種移植物之活體內功效
裸Balb/c小鼠(5-7週)用於此實施例，且在實驗之前允許其適應一週。用含2×106個癌細胞之100μl新製培養基皮下接種小鼠。十天後，將小鼠隨機分成對照組及治療組。對照組接收100μl PBS，且治療組(組2-6)每週一次腹膜內接收藥物(每週兩次，持續4週)。吉西他濱為抗癌(「抗腫瘤」或「細胞毒素」)化學療法藥物，且其用於組2、組4及組6。藉由卡尺量測腫瘤尺寸，且使用式：(長度×寬度2)/2計算腫瘤體積。圖14中展示結果。結果展示重組血紅素四聚體(2αγ12)可抑制腫瘤細胞 生長。當與另一化學療法藥物(吉西他濱)組合時，其亦提供較好結果。觀測到對癌症治療之協同效應，抑制癌轉移及/或減少復發。
工業適用性
本發明之重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元適用於在可能對用於癌症之習知治療藥物具有耐藥性的靶向癌細胞或組織或腫瘤中之氧合。本發明之化學修飾之重組血紅素蛋白四聚體及/或二聚體及/或次單元亦能夠在活體內斷裂或可降解，使得不對投予個體產生細胞毒素效應。經組態以與習知治療藥物中之一或多者連接的重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元可在一些類型癌症中或在患者之癌症的某些階段克服耐藥性問題。重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元易用於調配成醫藥組成物，且該包含治療有效量之連接或不連接至一或多種治療藥物之重組血紅素蛋白及/或四聚體及/或二聚體及/或次單元的醫藥組成物可用於各種應用，包括氧合組織、治療出血性休克及缺氧疾病及/或靶向抗藥性癌細胞/組織。
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<211> 146
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 146
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4

Claims (51)

  1. 一種具有或不具有血基質(heme)之重組血紅素蛋白，其包含重組血紅素四聚體、二聚體及/或次單元作為取代自動物或人類來源分離及/或純化之天然或原生血紅素分子的氧載體及供應源。
  2. 如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素次單元為重組血紅素單體，其基於來源於智人(Homo sapiens)之141-146個胺基酸之序列構築及表現。
  3. 如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素二聚體包含任何兩個該等重組血紅素次單元，該等重組血紅素次單元中之每一者為重組血紅素單體且具有來源於智人之141-146個胺基酸之序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素四聚體包含任何四個該等重組血紅素次單元，該等重組血紅素次單元中之每一者為重組血紅素單體且具有來源於智人之141-146個胺基酸之序列。
  5. 如申請專利範圍第2項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素次單元包含分別具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的α次單元、β次單元、γ-1次單元及γ-2次單元。
  6. 如申請專利範圍第3項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素二聚體包含α-β雜二聚體、α-γ-1雜二聚體、α-γ-2雜二聚體、β-γ-1雜二聚體及β-γ-2雜二聚體，該等重組血紅素次單元中之每一者具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中之任一者之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第4項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素四聚體包含2αβ2、2αγ12、2αγ22、2βγ12及2βγ22四聚體，該等重組血紅素次單元中之每一者具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中之任一者之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白，其中該重組血紅素次單元包含或不具有聚-N或His標記物中之至少一者。
  9. 一種製造如申請專利範圍第1項之重組血紅素分子之方法，其包含構築編碼重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體及/或次單元之融合基因，將該融合基因插入載體中，將該載體插入宿主生物體中且表現如申請專利範圍第1項之該蛋白、四聚體、二聚體或次單元。
  10. 一種醫藥組成物，其在醫藥學上可接受之載劑中包含如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白。
  11. 一種基於重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元之治療劑，其包含如申請專利範圍第1項之重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體及/或次單元及活性劑，該活性劑選自化學治療劑、放射治療劑、細胞標記劑或螢光標記劑中之一或多者，該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體及/或次單元直接結合至該活性劑或經由可斷裂或不可斷裂連接子間接結合至該活性劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素次單元為基於來源於智人之141-146個胺基酸之序列而構築及表現的重組血紅素單體。
  13. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素二聚體包含任何兩個該等重組血紅素次單元，該等重組血紅素次單元中之每一者為重組血紅素單體且具有來源於智人之141-146個胺基酸之序列。
  14. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素四聚體包含任何四個該等重組血紅素次單元，該等重組血紅素次單元中之每一者為重組血紅素單體且具有來源於智人之141-146個胺基酸之序列。
  15. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素蛋白在該重組血紅素蛋白之一或多個次單元處與該(等)連接子分子中之一或多者連接。
  16. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素蛋白包含或不具有聚-N或His標記物中之至少一者。
  17. 如申請專利範圍第12項之治療劑，其中該重組血紅素次單元包含分別具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4之α次單元、β次單元、γ-1次單元及γ-2次單元。
  18. 如申請專利範圍第13項之治療劑，其中該重組血紅素二聚體包含α-β雜二聚體、α-γ-1雜二聚體、α-γ-2雜二聚體、β-γ-1雜二聚體及β-γ-2雜二聚體，該等重組血紅素次單元中之每一者具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中之任一者之胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第14項之治療劑，其中該重組血紅素四聚體包含2αβ2、2αγ12、2αγ22、2βγ12及2βγ22四聚體，該等重組血紅素次單元中之每一者具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中之任一者之胺基酸序列。
  20. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元在結合至該活性劑之前藉由一或多個官能基化學修飾，該化學修飾包含使重組血紅素分子與關於該化學修飾之不同化學反應的以下化合物中之一或多者反應：a)對於胺反應，涉及之該等化合物包含酐、乙烯酮、NHS酯、異硫氰酸酯(isothiocyanates)、異氰酸酯(isocyanates)、包括氟苯基酯及羰基疊氮化合物之活化酯、磺醯氯、之後接續還原胺化的羰基、環氧化物、碳酸酯(carbonates)、氟苯、亞胺基酯、羥甲基膦衍生物、曼尼希縮合(mannich condensation)、重氮(diazoniun)衍生物、4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯酚、羰基二咪唑、磺酸基-NHS及藉由基於吡哆醛-5-磷酸之仿生轉胺作用進行之N端修飾；b)對於硫醇反應，涉及之該等化合物包含順丁烯二醯亞胺、烷基鹵化物、鹵乙醯胺、二硫化物、硫代硫酸酯(thiosulfates)、含吖
    Figure TWI633118B_C0001
    之劑、丙烯醯基衍生物、芳化劑及乙烯基碸衍生物；c)對於羧酸酯(carboxylate)反應，涉及之該等化合物包含重氮烷及重氮乙醯基化合物、羰基二咪唑及碳二醯亞胺；d)對於羥基反應，涉及之該等化合物包含環氧化物及氧
    Figure TWI633118B_C0002
    、羰基二咪唑、碳酸酯、氯甲酸酯、化學及酶氧化、烷基鹵素及異氰酸酯；e)對於原生化學連接(native chemical ligations)，涉及之該等化合物包含硫酯；f)對於N端修飾，涉及之該等化合物包含N端絲胺酸或蘇胺酸，使用其之過碘酸鹽氧化以產生用於與羥胺、肼或醯肼、碳二醯亞胺偶合之醛；g)對於生物正交官能(bioorthogonal functionalities)之併入，涉及之該等化合物包含炔烴及疊氮化合物與後續生物正交結合反應，其包括炔烴及疊氮化合物之偶極加成胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶極加成、疊氮化合物及三芳基膦之施陶丁格連接(Staudinger ligation)、烯烴及四
    Figure TWI633118B_C0003
    之狄爾斯-阿德反應(Diels-alder reaction)及烯烴及四唑之偶合；h)對於光化學反應，涉及之該等化合物包含光親和性標記劑、二吖吮衍生物、二苯基酮及蒽醌；i)對於金屬介導之反應，涉及之該等化合物包含金屬類碳烯及鈀活化烯丙基試劑。
  21. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該可斷裂連接子包含甲醇胺、二硫化物、脲、胺縮醛、碳酸酯、酯、胺基甲酸酯、磷酸酯、醯胺、縮醛、亞胺、肟、醚及磺醯胺基團連接子。
  22. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該不可斷裂連接子包含烷基及芳基連接子。
  23. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該化學治療劑包含5-氟尿嘧啶、替莫唑胺(temozolomide)、順鉑(cisplatin)及其他抗癌藥物。
  24. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該放射治療劑包含銠-105錯合物、釤-153錯合物及其他相關錯合物。
  25. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該細胞或螢光標記劑包含一或多種螢光蛋白、非蛋白有機螢光團、螢光奈米粒子及基於金屬之發光染料。
  26. 如申請專利範圍第11項之治療劑，其中該癌症包含胰腺癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌及腦癌。
  27. 一種醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第11項之基於重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元之治療劑，該組成物向罹患癌症之需要其之個體投予。
  28. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該治療劑之治療有效量為
    Figure TWI633118B_C0004
    0.0024g/kg該個體，且該個體為人類。
  29. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該治療劑之治療有效量為
    Figure TWI633118B_C0005
    0.03g/kg該個體，且該個體為動物。
  30. 如申請專利範圍第27項之組成物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、鹽、緩衝液、水或其組合。
  31. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該投予之途徑包含靜脈內注射、腹膜內注射及皮下注射，且該組成物之投予可以一週一次之單劑或多劑進行。
  32. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該癌症包含胰腺癌、白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌或腦癌。
  33. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該癌症為包含肝細胞癌之腫瘤、肝癌祖細胞誘發腫瘤、神經膠母細胞瘤或三陰性祖細胞誘發腫瘤。
  34. 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該組成物之pH值在5.5至9.5範圍內。
  35. 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該組成物之pH值為7.2至8.0。
  36. 一種製備如申請專利範圍第11項之治療劑之方法，該方法包含：a)提供重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元；b)使用不同管柱層析法純化該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元；c)藉由交聯劑使該重組血紅素蛋白或四聚體穩定化以形成交聯重組血紅素蛋白或四聚體；d)化學修飾該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元，其包含與一或多種官能基之反應，隨後使該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元與活性劑結合，或使活性劑與可斷裂或不可斷裂連接子結合以形成連接子-活性劑結合物，隨後將該結合物連接至該重組血紅素蛋白、四聚體、二聚體或次單元。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該化學修飾包含以下反應或修飾中之一或多者：a)胺反應，其中涉及之該等化合物包含酐、乙烯酮、NHS酯、異硫氰酸酯、異氰酸酯、包括氟苯基酯及羰基疊氮化合物之活化酯、磺醯氯、之後接續還原胺化的羰基、環氧化物、碳酸酯、氟苯、亞胺基酯、羥甲基膦衍生物、曼尼希縮合、重氮衍生物、4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯酚、羰基二咪唑、磺酸基-NHS及藉由基於吡哆醛-5-磷酸之仿生轉胺作用進行之N端修飾；b)硫醇反應，其中涉及之該等化合物包含順丁烯二醯亞胺、烷基鹵化物、鹵乙醯胺、二硫化物、硫代硫酸酯、含吖
    Figure TWI633118B_C0006
    之劑、丙烯醯基衍生物、芳化劑及乙烯基碸衍生物；c)羧酸酯反應，其中涉及之該等化合物包含重氮烷及重氮乙醯基化合物、羰基二咪唑及碳二醯亞胺；d)羥基反應，其中涉及之該等化合物包含環氧化物及氧
    Figure TWI633118B_C0007
    、羰基二咪唑、碳酸酯、氯甲酸酯、化學及酶氧化、烷基鹵素及異氰酸酯；e)原生化學連接，其中涉及之該等化合物包含硫酯；f)N端修飾，其中涉及之該等化合物包含N端絲胺酸或蘇胺酸，使用其之過碘酸鹽氧化以產生用於與羥胺、肼或醯肼、碳二醯亞胺偶合之醛；g)生物正交官能之併入，其中涉及之該等化合物包含炔烴及疊氮化合物與後續生物正交結合反應，其包括炔烴及疊氮化合物之偶極加成胡伊斯根1,3-偶極加成、疊氮化合物及三芳基膦之施陶丁格連接、烯烴及四
    Figure TWI633118B_C0008
    之狄爾斯-阿德反應及烯烴及四唑之偶合；h)光化學反應，其中涉及之該等化合物包含光親和性標記劑、二吖吮衍生物、二苯基酮及蒽醌；i)金屬介導之反應，其中涉及之該等化合物包含金屬類碳烯及鈀活化烯丙基試劑。
  38. 如申請專利範圍第36項之方法，，其中該可斷裂連接子包含甲醇胺、二硫化物、脲、胺縮醛、碳酸酯、酯、胺基甲酸酯、磷酸酯、醯胺、縮醛、亞胺、肟、醚或磺醯胺基團連接子。
  39. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該不可斷裂連接子包含烷基或芳基連接子。
  40. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該活性劑為包含5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑及其他抗癌藥物之化學治療劑。
  41. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該活性劑為包含一或多種螢光蛋白、非蛋白有機螢光團、螢光奈米粒子及基於金屬之發光染料的細胞/螢光標記劑。
  42. 一種如申請專利範圍第10項之組成物之用途，其用於局部氧合來自動物或人類個體或在動物或人類個體中之組織。
  43. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該組織為癌腫瘤組織。
  44. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該組織為缺氧的。
  45. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該組織在活體外。
  46. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該組織為正常器官組織。
  47. 一種如申請專利範圍第10項之組成物之用途，其用於製造用以治療有需要之動物或人類個體中之缺氧病症之醫藥品。
  48. 一種如申請專利範圍第10項之組成物之用途，其用於製造用以治療有需要之動物或人類個體中之出血性休克之醫藥品。
  49. 一種如申請專利範圍第11項之治療劑之用途，其用於製造靶向且誘發有需要之個體中之癌細胞之凋亡的醫藥品，其中該醫藥品包含治療有效量之如申請專利範圍第11項之治療劑。
  50. 一種如申請專利範圍第11項之治療劑之用途，其用於製造在有需要之個體中抑制腫瘤轉移且減少復發之醫藥品，其中該醫藥品包含治療有效量之如申請專利範圍第11項之治療劑。
  51. 一種如申請專利範圍第11項之治療劑之用途，其用於活細胞成像及癌細胞或腫瘤細胞或祖細胞或癌症幹細胞之診斷成像。
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