CN117529490A - 用于将药物递送至肝细胞的环状肽-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）缀合物 - Google Patents

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Abstract

一种缀合物，其包括环状肽支架以及一个或多个N‑乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。所述缀合物可以进一步携带诊断剂或治疗剂以将所述药剂递送至肝细胞。在一些实施例中，环状肽可以具有4‑10个氨基酸残基。所述GalNAc部分可以通过第一接头与所述环状肽支架共价结合，并且所述药剂可以通过第二接头与所述环状肽支架共价结合。

Description

用于将药物递送至肝细胞的环状肽-N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月23日提交的国际专利申请第PCT/CN2021/089305号的申请日的权益，所述国际专利申请的全部内容通过引用并入本文。
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背景技术
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)与在肝细胞上高度表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有高结合亲和力。因此，此部分通常用于将与GalNAc部分缀合的治疗剂或诊断剂递送至肝细胞。
GalNAc缀和是用于将基于寡核苷酸的治疗剂递送至肝细胞的主要方法之一。多种GalNAc-siRNA缀合物候选药物目前正在进行临床试验，以治疗各种疾病。因此，开发用于制备具有高肝细胞靶向效率和高内体逃逸效率的GalNAc药物缀合物的改进支架，使得GalNAc的药物缀合物可以进入细胞质以诱导强大的治疗作用具有重大意义。
发明内容
本公开至少部分基于用于使GalNAc部分与所关注药剂缀合的基于环状肽的支架的开发。使用此类支架结构制备的所得GalNAc缀合物显示出高肝细胞靶向效率和高内体逃逸效率。因此，基于环状肽的支架和由此制备的GalNAc缀合物将预期充当用于靶向肝细胞的有效药物递送平台。
因此，在一些方面，本公开提供了一种缀合物，其包括环状肽支架以及一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。所述环状肽支架可以含有4-10个氨基酸残基。在一些实施例中，所述环状肽支架可以含有4-8个氨基酸残基，例如，4-6个氨基酸残基。在一个实例中，所述环状肽由6个氨基酸残基组成。在一些情况下，所述环状肽含有Glu、Asp、Lys、Arg或其组合。例如，所述环状肽可以含有至少一个Glu残基和至少一个Lys残基。另外，所述环状肽可以进一步含有Gly、A1a或Val。所述环状肽中的所述氨基酸残基可以呈D形式。
在一些实例中，所述环状肽支架具有Lys-Glu-Lys-Gly-Lys-Gly(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列。可替代地，所述环状肽支架具有Lys-Glu-Lys-Ala-Lys-Ala(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列。所述环状肽支架中的一个或多个氨基酸残基可以呈D形式。在一个实例中，所述环状肽支架具有Lys-Glu-Lys-βAla-Lys-βAla(SEQ ID NO∶7)的氨基酸序列。其它示例性环状肽支架包含但不限于CPS-001、CPS-002、CPS-003和CPS-031。参见例如，表1和图13A-13D。在一些情况下，所述示例性环状肽支架可以是CPS-001、CPS-002、CPS-003和CPS-031中任一个的功能等效物，其含有相同的核心结构(例如，含有相同氨基酸残基或其异构体和相同接头的环状肽支架)。CPS-001、CPS-002、CPS-003和CPS-031中任一个的功能等效物(参考缀合物)可以是参考缀合物的立体异构体(例如，在一个或多个手性中心处的S-对映异构体到R-对映异构体的转换)。可替代地或另外，功能等效物可以含有与CPS-001、CPS-002、CPS-003和CPS-031中任一个中的Cbz基团不同的保护基团。
在本文所公开的缀合物中的任一种中，所述GalNAc部分中的每一个可以通过第一接头与所述环状肽支架共价结合。在一些情况下，环状肽支架包含一个或多个Lys残基，并且每个第一接头可以与Lys残基中的至少一个共价结合。在一些实例中，每个第一接头可以包括具有3-8个原子，例如，C、O或其组合的直链。所述第一接头的具体实例可以是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头。参见例如，表2。
本文所公开的缀合物中的任一种可以进一步包括药剂(例如，治疗剂或诊断剂)，所述药剂可以通过第二接头与所述环状肽支架共价结合。在一些情况下，所述环状肽支架包含一个或多个Glu残基，并且所述第二接头可以与Glu残基中的至少一个共价结合。在一些实例中，所述第二接头是脂质接头。在其它实例中，所述第二接头可以是聚乙二醇(PEG)接头。在又其它实例中，所述第二接头可以是烷基胺接头。
在一些实例中，本文所公开的缀合物可以具有式(I)的结构：
其中T是所述药剂；L1是所述第一接头，所述第一接头可以是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头；并且L2是所述第二接头。
在其它实例中，本文所公开的缀合物可以具有式(II)的结构：
其中T是所述药剂；L1是所述第一接头，所述第一接头可以是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头；并且L2是所述第二接头。
在一些实施例中，所述药剂是诊断剂。在其它实施例中，所述药剂可以是治疗剂。在一些实例中，所述药剂是小分子。可替代地，所述药剂是核酸，例如，小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)或核酸适体。
本文所公开的缀合物的具体示例包含5-FAM-CPMB-0011、5-FAM-CPMB-0012、5-FAM-CPMB-0013、5-FAM-CPMB-0014、5-FAM-CPMB-0015、5-FAM-CPMB-0021、5-FAM-CPMB-0023、5-FAM-CPMB-0025、5-FAM-CPMB-0031、5-FAM-CPMB-0033、5-FAM-CPMB-0034、5-FAM-CPMB-0035、5-FAM-CPMB-0311、5-FAM-CPMB-0313、CPMB-0013、CPMB-0023、CPMB-0013-DOTMr或CPMB-0023-DOTMr。
在其它方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括本文所公开的缀合物中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。
另外，本文提供了一种将药剂递送至肝细胞的方法，所述方法包括使肝细胞与如本文所公开的缀合物或包括此类缀合物的组合物接触。在一些实施例中，所述接触步骤包括向有需要的受试者施用所述缀合物或包括所述缀合物的所述组合物。在其它实施例中，所述接触步骤包括将所述缀合物或包括所述缀合物的所述组合物与肝细胞一起体外温育。在这种情况下，所述方法可以进一步包括在所述肝细胞与所述缀合物或所述组合物接触后，向有需要的受试者施用所述肝细胞。
也在本公开的范围内的是用于将诊断剂或治疗剂递送至肝细胞的缀合物或包括此类缀合物的组合物中的任一者，以及此类缀合物或包括此类缀合物的组合物用于制备用于诊断或治疗肝病的药物的用途。
在下文的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干实施例的详细说明以及还从所附权利要求中将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图与本文呈现的具体实施例的详细说明的组合可以更好地理解所述方面。
图1是展示用于产生CPMB-002的示例性合成方案的示意图。
图2A-2B包含展示用于产生5-FAM-CPMB-0013的示例性合成方案的示意图。图2A：用于产生CPMB-0013-A的示例性合成方案。图2B：用于由CPMB-0013-A产生5-FAM-CPMB-0013的示例性合成方案。
图3是展示用于产生CPMB-0013的示例性合成方案的示意图。
图4是展示用于产生CPMB-0013-DMTr的示例性合成方案的示意图。
图5A-5B包含展示用于产生CPG-PEG4-CPMB-0013-DMTr的示例性合成方案的示意图。图5A：用于产生CPG-PEG4的示例性合成方案。图5B：用于由CPG-PEG4产生CPG-PEG4-CPMB-0013-DMTr的示例性合成方案。
图6A-6B包含展示用于产生5-FAM-CPMB-0023的示例性合成方案的示意图。图6A：用于产生CPMB-0023-A的示例性合成方案。图6B：用于由CPMB-0023-A产生5-FAM-CPMB-0023的示例性合成方案。
图7是展示用于产生CPMB-0023的示例性合成方案的示意图。
图8是展示用于产生CPMB-0023-DMTr的示例性合成方案的示意图。
图9是展示用于产生CPG-PEG4-CPMB-0023-DMTr的示例性合成方案的示意图。
图10是示出与三-GalNAc相比环状肽三-GalNAc缀合物稳定性提高的图。
图11是示出与三-GalNAc相比环状肽三-GalNAc缀合物的内体逃逸的图。
图12是示出本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物的结构的示意图。
图13A-13D包含示出与接头连接的代表性环状肽支架的结构的图。图13A：CPS-001。图13B：CPS-002。图13C：CPS-003。图13D：CPS-031。
图14A-14T包含示出代表性环状肽-GalNAc药剂缀合物的结构的图。图14A：5-FAM-CPMB-0011。图14B：5-FAM-CPMB-0012。图14C：5-FAM-CPMB-0013。图14D：5-FAM-CPMB-0014。图14E：5-FAM-CPMB-0015。图14F：5-FAM-CPMB-0021。图14G：5-FAM-CPMB-0023。图14H：5-FAM-CPMB-0025。图14I：5-FAM-CPMB-0031。图14J：5-FAM-CPMB-0033。图14K：5-FAM-CPMB-0034。图14L：5-FAM-CPMB-0035。图14M：5-FAM-CPMB-0311。图14N：5-FAM-CPMB-0313。图14O：CPMB-0013。图14P：CPMB-0023。图14Q：5-FAM-三-GalNAc(阳性对照)。图14R：5-FAM-CPMB-0031-Ac(阴性对照)。图14S：CPMB-0013-DOTMr。图14T：CPMB-0023-DOTMr。
具体实施方式
本文提供了环状肽分子的开发，其可以充当用于使N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分的多个拷贝(例如，三个)与要递送至肝细胞的所关注药剂(例如，治疗剂或诊断剂)缀合的支架。所述GalNAc部分和/或所述所关注药剂可以通过柔性接头与环状肽支架缀合(例如，共价缀合)。所述柔性接头可以被设计为最小化各种GalNAc部分与所关注药剂之间的干扰，并且最大化GalNAc部分与肝细胞上的ASGPR的结合亲和力。本文所提供的示例性环状肽-GalNAc缀合物显示出对肝细胞的高结合活性和高内体逃逸率，这指示此类环状肽-GalNA缀合物可以在肝细胞内有效地递送所关注药剂(例如，基于核酸的药剂，如小干扰RNA、反义寡核苷酸或核酸适体)，以发挥预期的生物活性。
因此，本文提供了环状肽-GalNAc缀合物、包括此类环状肽-GalNAc缀合物的药物组合物以及使用此类缀合物将诊断剂或治疗剂递送到肝细胞中的方法。
I.环状肽支架-GalNAc缀合物
在一些方面，本公开提供了环状肽-GalNAc缀合物，所述环状肽-GalNAc缀合物中的每一种包括环状肽支架，一个或多个GalNAc部分(例如，3个)通过柔性接头(第一接头)与所述环状肽支架连接。所述缀合物可以通过柔性接头(第二接头)进一步包括所关注药剂。
根据本公开的化合物中的一些化合物可以作为立体异构体存在，即具有共价结合的原子的相同原子连接性，但原子的空间定向不同。例如，化合物可以是光学立体异构体，其含有一个或多个手性中心，并且因此可以以两种或更多种立体异构体形式(例如，对映异构体或非对映异构体)存在。因此，此类化合物可以作为单一立体异构体(即，基本上不含其它立体异构体)、外消旋体和/或对映异构体和/或者非对映异构体的混合物存在。作为另一个实例，立体异构体包含几何异构体，如双键的相邻碳上的取代基的顺式或反式定向。除非相反地规定，否则所有此类立体异构形式都包含在本文所提供的式中。
对映体可以表征为其不对称中心的绝对构型，并通过Cahn和Prelog的(R)和(S)测序规则来描述，或通过分子旋转偏振光平面并被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)-异构体)的方式来描述。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。含有等比例的对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。除非另有说明，否则本说明书旨在包含单独的立体异构体以及混合物。用于测定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域所熟知的(参见《高等有机化学(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY)》,第6版J.March,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons),纽约,2007的第4章中的讨论)，在一个或多个立体中心的手性方面不同。所有此类单一立体异构体、外消旋体和其混合物都旨在处于本公开的范围内。
A.环状肽支架
本文所公开的缀合物中的任一种中使用的环状肽支架可以含有4-10个氨基酸残基。在一些情况下，其可以含有4-8个氨基酸残基。在一个实例中，本文所公开的环状肽支架含有6个氨基酸残基。
本文所公开的环状肽支架可以含有一个或多个氨基酸残基，其侧链含有官能团(例如，-COOH、-NH2、-SH或-OH)。此类官能团可以用于GalNAc部分(例如，通过接头)和/或所关注药剂(例如，通过接头)的共价缀合的化学反应中。例如，本文所公开的环状肽支架可以含有至少一个Arg或Lys(例如，Lys)残基，其侧链中的-NH2官能团可以用于GalNAc部分或所关注药剂的共价缀合。在另一个实例中，本文所公开的环状肽支架可以含有至少一个Asp或Glu残基，其侧链中的-COOH官能团可以用于GalNAc部分或所关注药剂的共价缀合。
在一些实施例中，环状肽支架可以含有在侧链中具有不同官能团的至少两种不同类型的氨基酸残基(例如，Lys残基和Glu残基)，以促进GalNAc部分与所关注药剂的缀合。例如，环状肽支架可以含有多个Lys残基(例如，3个Lys残基)以及一个Asp或Glu氨基酸残基，所述Lys残基中的每一个可以充当用于缀合GalNAc部分的锚定物，所述一个Asp或Glu氨基酸残基可以充当用于缀合所关注药剂的锚定物。
本文所公开的环状肽支架中的任一种可以进一步含有一个或多个具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如，Gly、Ala、Val、Ile或Leu。在一些实例中，环状肽支架可以含有Gly、Ala或其组合。
环状肽支架中的氨基酸残基可以呈L形式、呈D形式或其混合物。在一些实例中，环状肽支架可以含有至少一个呈D形式的氨基酸残基，例如，一个或多个D-Lys或一个D-Glu。示例性环状肽支架在下表1中提供。关于其化学结构，也参见图13A-13D。
表1:示例性环状肽支架
B.GalNAc-接头部分
本文所公开的缀合物包括本文所公开的环状肽支架中的任一个以及可以通过柔性接头(第一接头)与所述环状肽支架共价缀合的一个或多个GalNAc部分。
任何柔性接头都可以用于制备本文所公开的缀合物。在一些实施例中，第一接头可以是含有3-8个原子的直链，所述原子可以是C、O、N或其组合。第一接头的此类长度可以最小化多个GalNAc部分之间的干扰，并实现对肝细胞的整体结合亲和力。
下表2提供了用于制备本文所公开的缀合物的示例性GalNAc-接头结构。表2中列出的Gal-1至Gal-5中的-COOH官能团可以用于与环状肽支架中的-NH2官能团反应，导致GalNAc接头部分共价缀合到环状肽支架上。
表2:示例性GalNAc-接头结构
C.所关注药剂
本文所公开的缀合物可以进一步包括可以通过第二柔性接头与环状肽支架缀合(例如，共价缀合)的所关注药剂。在一些实施例中，第二柔性接头不同于第一柔性接头。
任何柔性接头都可以用于使所关注药剂与本文所公开的环状肽支架缀合。实例包含但不限于脂质接头、聚乙二醇接头或脂肪族链接头。第二柔性接头可以在两端处含有两个官能团(例如，两个不同的官能团)，一个用于与所关注药剂反应，并且另一个用于与环状肽支架反应。例如，第二接头可以在一端处含有-NH2官能团，其可以与环状肽支架中的-COOH官能团(例如，在Asp或Glu残基中)反应。用于连接所关注药剂的官能团的选择将由药剂的类型来确定，例如，其中包含的官能团，所述官能团将在相关领域的技术人员的知识范围内。
药剂可以属于任何类型，例如，小分子、肽或多肽、寡糖、脂质或核酸(例如，双链或单链RNA或DNA)。在一些实施例中，所关注药剂可以是治疗剂，例如，用于治疗肝病的治疗剂。在其它实施例中，所关注药剂可以是诊断剂，其可以与能够直接或间接释放可检测信号的标记物进一步缀合。
在一些实施例中，与环状肽支架缀合的所关注药剂可以是核酸，例如，小干扰RNA、反义寡核苷酸(RNA或DNA)、信使RNA或基于核酸的适体。此类核酸中的任一种都可以含有非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(主链)。此类经修饰的寡核苷酸赋予期望的性质，例如，增强的细胞摄取、改善的对靶核酸的亲和力以及增加的体内稳定性。
在一个实例中，本文所描述的基于核酸的药剂(例如，siRNA)可以具有经修饰的主链，包含保留磷原子的那些主链(参见例如，美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第5,321,131号；第5,399,676号；以及第5,625,050号)以及不具有磷原子的那些主链(参见例如，美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；和第5,792,608号)。含磷的经修饰的主链的实例包含但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、磷酸甲酯和其它磷酸烷基酯，包含3'-磷酸亚烷酯、5'-磷酸亚烷酯和手性磷酸酯、亚磷酸酯、磷酸酰胺，包含3'-氨基磷酸酰胺和氨基烷基磷酸酰胺、硫羰基磷酸酰胺、硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和具有3'-5'键或2'-5'键的二羟硼基磷酸酯。此类主链还包含具有反向极性，即，3'至3'、5'至5'或2'至2'键的那些主链。不包含磷原子的经修饰的主链是通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的。这些主链包含具有吗啉键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
在另一个实例中，本文所描述的基于核酸的药剂(例如，siRNA)可以包含一个或多个经取代的糖部分。这种经取代的糖部分可以包含位于其2'位置处的以下基团之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其可以包含位于其2'位置处的杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌插剂(intercalator)、用于改进寡核苷酸的药代动力学特性的基团或用于改进寡核苷酸的药效学特性的基团。优选的经取代的糖部分包含具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基氨基氧基乙氧基和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基。参见Martin等人,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta》,1995,78,486-504。
可替代地或另外，本文所描述的基于核酸的药剂(例如，siRNA)可以包含一种或多种经修饰的天然核碱基(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基包含以下中所描述的那些：美国专利第3,687,808号；《聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering)》,第858-859页,Kroschwitz,J.I.编辑.约翰威利父子公司,1990；Englisch等人,《应用化学(AngewandteChemie)》,国际版,1991,30,613；以及Sanghvi,Y.S.,第15章,《反义研究与应用(AntisenseResearch and Applications)》,第289-302页,CRC出版社(CRC Press),1993。这些核碱基中的某些核碱基对于增加干扰RNA分子与其靶向位点的结合亲和力是特别有用的。这些包含5取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi等人编辑,《反义研究与应用》,CRC出版社,博卡拉顿,1993,第276-278页)。
可替代地或另外，本文所描述的基于核酸的药剂(例如，siRNA)可以包括一种或多种锁核酸(LNA)。LNA，通常被称为无法进入的RNA，是其中核糖部分被连接2′氧和4′碳的额外的桥修饰的经修饰的RNA核苷酸。此桥将核糖“锁定”在3′-内(北)构型中，所述构型通常存在于A型双链体中。
在一些实例中，药剂可以是用于进一步连接或合成基于核酸的治疗剂或诊断剂的中间体。例如，与环状肽支架缀合的药剂可以是固体支撑物(例如，控制孔玻璃或CPG)，其可以通过第二接头与环状肽支架缀合。第二接头可以通过核糖部分与环状肽支架连接，所述核糖部分可以携带DMTO保护部分。此缀合物可以用于使用核酸合成装置添加期望的核酸药剂，所述核酸合成装置通过常规核酸合成将核苷酸残基添加到核糖部分。在合成与环状肽支架共价缀合的核酸药剂剂后，可以从固体支撑物(例如，CPG)中释放最终环状肽-GalNAc-核酸缀合物。参见以下实例。
D.示例性GalNAc-环状肽缀合物
本文所公开的GalNAc-环状肽缀合物可以含有本文所公开的环状肽支架中的任一个以及通过本文所公开的第一接头中的任一个的一个或多个GalNAc部分(例如，3个)。缀合物可以进一步包括第二接头，例如，本文所公开的那些第二接头，本文所公开的所关注药剂中的任一种与所述第二接头连接(例如，共价连接)。
表3提供了本文所公开的GalNAc-环状肽缀合物的非限制性实例。关于其化学结构，也参见图14A-14P。
表3：示例性GalNAc-环状肽缀合物
在一些实例中，本文所公开的示例性GalNAc-环状肽缀合物含有本文所公开的CPS001环状肽支架或功能等效物以及Gal-3的GalNAc接头。在其它实例中，本文所公开的示例性GalNAc-环状肽缀合物含有本文所公开的CPS002环状肽支架或功能等效物以及Gal-3的GalNAc接头。在又其它实例中，本文所公开的示例性GalNAc-环状肽缀合物含有本文所公开的CPS003环状肽支架或功能等效物以及Gal-5的GalNAc接头。
E.GalNAc-环状肽缀合物的合成
上文所描述的缀合物可以通过本领域熟知的方法以及本文所公开的合成途径制备。合成途径中使用的化学品可以包含，例如，溶剂、试剂、催化剂以及保护基团和去保护基团试剂。本文所描述的方法还可以另外地包含在本文具体描述的步骤之前或之后的用于添加或去除合适的保护基团以便最终允许合成缀合物或其中间体的步骤。另外，不同合成步骤可以按替代性顺序或次序进行以给出期望的化合物。可用于合成适用的吲哚化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)是本领域已知的并且包含例如以下中描述的那些方法：R.Larock,《综合有机转化(Comprehensive Organic Transformations)》,VCH出版社(VCH Publishers)(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,《有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)》,第3版,约翰威利父子公司(1999)；L.Fieser和M.Fieser,《用于有机合成的费舍尔和费舍尔氏试剂(Fieser and Fieser'sReagents for Organic Synthesis)》,约翰威利父子公司(1994)；以及L.Paquette编辑,《用于有机合成的试剂百科全书(Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis)》,约翰威利父子公司(1995)以及其后续版本。
简言之，与如本文所公开的合适的接头偶联的GalNAc部分可以按照常规方法或本文所公开的方法合成。单独地，如本文所公开的环状肽支架可以按照常规方法或本文所公开的方法制备。GalNAc部分和环状肽支架可以在合适的条件下反应以形成共价键，由此使GalNAc部分缀合到环状肽支架上。类似的方法可以应用于按照常规方法或本文所公开的方法通过接头使所关注药剂与环状肽支架缀合。
作为GalNAc部分的合成的非限制性实例，可以使合适的内酯部分水解以制备末端羟基取代的羧酸。羧酸可以被保护，并且游离羟基取代过乙酰化N-葡糖胺的异头碳上的乙酰化羟基。然后可以对羧酸进行去保护以制备GalNAc偶联配偶体。
作为环状肽的合成的非限制性实例，可以使用已知的Fmoc保护的固相肽合成来合成肽，其中侧链根据需要被保护。肽合成之后可以进行衍生化、C端和N端的去保护以及肽的环化。衍生化包含将胺接头添加到合适的侧链，例如，谷氨酸。对适当的氨基酸(例如，赖氨酸)侧链进行去保护，并使用已知的肽键形成条件连接GalNAc偶联配偶体。然后根据需要将胺接头用于缀合药剂。
使药剂与胺接头偶联的实例可以是4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)，其可以用于合成寡核苷酸聚合物。通过将DMTr基团与上文所描述的GalNAc环状肽连接，所得缀合物可以用作使用寡核苷酸合成器合成寡核苷酸(例如，siRNA)的底物。
下文实例中提供了本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物或其中的任何中间体的示例性合成方案。
II.药物组合物
包括诊断剂或治疗剂(例如，基于核酸的药剂，如siRNA分子)的本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物中的任一种都可以被调配成合适的药物组合物。本文所描述的药物组合物可以进一步包括呈冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。《雷明顿：药学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)》第20版(2000),利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins),K.E.Hoover编辑。此类载体、赋形剂或稳定剂可以增强本文所描述的组合物中的活性成分的一种或多种特性，例如，生物活性、稳定性、生物利用度和其它药代动力学和/或生物活性。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯銨；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；苯甲酸酯、山梨酸酯和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM(聚山梨醇酯)、PLURONICSTM(非离子表面活性剂)或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文所描述的药物组合物可以被调配成缓释格式。缓释制剂的合适实例包含固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如，薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，乙酸异丁酸蔗糖酯和聚D-(-)-3-羟丁酸。
要用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗组合物放置在具有无菌进口端口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶或手动进入的密封容器中。
本文所描述的药物组合物可以呈单位剂型，如固体、溶液或悬浮液或栓剂，以用于通过吸入或吹入、鞘内、肺内或脑内途径、口服、肠胃外或直肠施用进行施用。
为了制备固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体，例如，常规压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它药物稀释剂，例如，水混合，以形成含有本发明化合物的均质混合物的固体预调配组合物或无毒的其药学上可接受的盐。在称这些预调配组合物为均质时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如粉末收集物、片剂、丸剂和胶囊剂。然后将此固体预调配组合物细分成以上所描述类型的单位剂型，所述单位剂型含有于所述组合物中的合适量的活性成分。
合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TWEEN 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，SPAN 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括介于0.05％与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1％与2.5％之间。应当理解，如果有必要的话，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。
可以使用如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常含有至多20％的油，例如，介于5％与20％之间。
用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物形式的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，这些组合物通过口服或鼻腔呼吸途径施用以产生局部或全身作用。在一些实施例中，组合物由大小介于10nm与100mm之间的颗粒构成。
优选地无菌的药学上可接受的溶剂形式的组合物可以通过使用气体来雾化。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷、气管插管和/或间歇正压呼吸机器(呼吸机)。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
在一些实施例中，本文的药物组合物中的任一种可以进一步包括基于组合物的预期治疗用途的第二治疗剂。
II.向肝细胞递送药剂
本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物中的任一种可以用于在体外或体内将由缀合物携带的所关注药剂(例如，诊断剂或治疗剂)递送到肝细胞中。因此，本文提供了一种用于将所关注药剂递送到肝细胞中的方法，所述方法包括使本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物中的任一种与肝细胞接触以允许将由缀合物携带的药剂递送到所述肝细胞中。
在一些实施例中，所述接触步骤可以在体外，例如，在细胞培养系统中进行。例如，如本文所公开的有效量的环状肽-GalNAc缀合物可以在合适的培养条件下与肝细胞一起温育合适的时间段，从而允许肝细胞通过GalNAc部分与肝细胞上的ASGPR受体之间的相互作用摄取缀合物。可以富集和/或扩增含有缀合物的肝细胞。可以向受试者施用此类肝细胞以治疗靶疾病，例如，本文公开的那些疾病。
可替代地，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者施用本文所公开的环状肽-GalNAc缀合物中的任一种或包括此类缀合物的药物组合物。
为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所描述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内施用(例如，推注或通过一定时间段内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、肿瘤内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于施用。液体调配物可以直接雾化，并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所描述的抗体可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。
要通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人类。哺乳动物包含但不限于农场动物、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、有风险罹患或怀疑患有靶疾病/病症，例如，肝病，如肝癌的人类患者。此类靶疾病/病症的实例包含急性肝性卟啉症、阿拉吉欧综合征(alagille syndrome)、酒精相关肝病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、良性肝脏肿瘤、胆道闭锁、肝硬化、克里格勒-纳贾尔综合征(crigler-najjar syndrome)、半乳糖血症、吉尔伯特综合征(gilbert syndrome)、血色素沉着症、肝性脑病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝肾综合征、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL-D)、肝囊肿、肝癌、新生儿黄疸、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)、瑞氏综合征(reye syndrome)、I型糖原贮积病、威尔逊病(wilson disease)。
可以通过常规医学检查，例如，实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波来鉴定患有靶疾病的受试者。在一些实施例中，通过本文所描述的方法待治疗的受试者可以是已经经历或正经受另一种疗法，例如，抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术)的人类癌症患者。
疑似患有任何此类靶疾病/病症的受试者可能显示出所述疾病/病症的一种或多种症状。有患有疾病/病症风险的受试者可以是具有所述疾病/病症的风险因素中的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所使用的，“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。确定缀合物的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量的变化取决于所治疗的具体病状、病状的严重程度、个体患者参数，包含年龄、身体病状、体型、性别和体重、治疗的持续时间、并行疗法(如果存在的话)的性质、特定的施用途径以及健康从业者知识和专长范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员熟知的，并且可以通过常规实验解决。通常优选的是使用单独的组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。例如，可以使用如人源化抗体或完全人抗体等与人免疫系统相容的抗体来延长缀合物的半衰期，尤其是其中所含的所关注药剂，并防止缀合物受到宿主的免疫系统的攻击。施用频率可以在疗法过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，如本文所公开的缀合物的持续缓释调配物可能是合适的。用于实现缓释的各种调配物和装置在本领域中是已知的。
在一个实例中，可以在已经给予了缀合物的一次或多次施用的个体中凭经验确定如本文所描述的缀合物的剂量。给予个体递增剂量的激动剂。为了评估激动剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
出于本公开的目的，如本文所描述的环状肽-GalNAc缀合物的适当剂量将取决于具体缀合物，尤其是由缀合物携带的具体所关注药剂、疾病/病症的类型和严重程度、是否出于预防或治疗目的而施用缀合物、先前疗法、患者的临床史和对激动剂的响应以及主治医生的判定。通常，临床医生将施用缀合物，直至达到实现期望结果的剂量为止。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。一种或多种缀合物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理病状、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。本文所公开的缀合物的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展靶疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。
如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者应用或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有靶疾病或病症、所述疾病/病症的症状或对所述疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
减轻靶疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度或延长存活期。减轻疾病或延长存活期不一定需要治愈结果。如本文所使用的，“延迟”靶疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这一延迟可以具有不同的时间长度，这取决于所治疗的疾病和/或个体的历史。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。
根据要治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的，术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有缀合物和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡聚糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。
在一个实施例中，可以通过位点特异性或靶向局部递送技术施用如本文所公开的缀合物。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包含缀合物的各种植入式贮库源或局部递送导管(例如，输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入装置)；位点特异性载体；直接注射或直接应用。参见例如，PCT公开第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568号。
可以通过本领域众所周知的方法对靶疾病/病症的治疗功效进行评估。
用于治疗疾病的试剂盒
本公开还提供了用于在体外或体内将所关注药剂(例如，诊断剂或治疗剂)递送至肝细胞和/或用于治疗或减轻靶疾病的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个包括环状肽-GalNAc缀合物的容器，例如本文所描述的容器中的任何容器。在一些情况下，如本文所公开的缀合物可以与第二治疗剂共同使用。
在一些实施例中，试剂盒可以包括用于根据本文所描述的方法中的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括对施用用于治疗如本文所描述的那些靶疾病的靶疾病、延迟其发作或使其减轻的缀合物以及任选地第二治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对选择适于治疗的个体的描述，所述选择基于例如应用如本文所描述的诊断方法鉴定所述个体是否患有靶疾病。在仍其它实施例中，说明书包括对向有患上靶疾病的风险的个体施用如本文所公开的缀合物的描述。
与环状肽-GalNAc缀合物的使用相关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
标签或包装插页指示组合物用于治疗疾病、延迟其发作和/或使其减轻，所述疾病如肝病，例如，肝癌。说明书可以被提供用于实践本文所描述的方法中的任何方法。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻部施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所描述的环状肽-GalNAc缀合物的环状肽-GalNAc缀合物。
试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和位于容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施例中，本发明提供了制品，所述制品包括上文所描述的试剂盒的内容物。
一般技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑1993-8)约翰·威利父子出版公司；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；《哺乳动物细胞基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑1987)；《PCR：聚合酶链式反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编辑1994)；《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑，1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司，1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch，1997)；《抗体：实用方法(Antibodies∶a practicalapproach)》(D.Catty.编辑，IRL出版社(IRL Press)，1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies∶a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies：alaboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，1999))；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑哈伍德学术出版社(HarwoodAcademic Publishers)，1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：Apractical Approach)》，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；《核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985))；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984))；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑，(1986))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes)》(lRL出版社，(1986))；以及B.Perbal，《分子克隆实用指南(Apractical GuideTo Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细阐述，据信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物出于本文引用的目的或主题通过引用并入。
实例1：L-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH和D-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH的合成
A：L-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH
步骤1：N2-(((9H-芴_9-基)甲氧基)羰基)-N5-(6-(((苄氧基)羰基)氨基)己基)-L-谷氨酸叔丁酯(化合物1)的合成
上文提供了化合物1的示例性合成方案。下文提供了简要说明。
向(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(10.0g，23.5mmol，1.0当量)于DMF(40mL)中的溶液中依次添加HATU(8.9g，23.5mmol，1.0当量)、DIPEA(12.3mL，70.5mmol，3.0当量)、HOAt(3.2g，23.5mmol，1.0当量)。将所得混合物在25℃下搅拌10分钟。一旦混合物变成匀浆溶液，添加(6-氨基己基)氨基甲酸苄酯盐酸盐(8.1g，28.2mmol，1.2当量)，并将所得溶液在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应过程。完成后，将溶液用EtOAc(100mL)稀释，并用盐水(3×40mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，并将粗产物直接用于下一步骤(黄色固体，15.5g)。
LCMS：(ESI)m/z＝658.2[M+H]+。
步骤2：N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-(6-(((苄氧基)羰基)氨基)己基)-L-谷氨酰胺(L-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH)
上文提供了L-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH的示例性合成方案。下文提供了简要说明。
向化合物1(15.5g，23.5mmol)于DCM(150mL)中的溶液中添加60mL TFA/TIS//H2O(10/1/1)，并将所得溶液在25℃下搅拌过夜并通过LCMS监测。完成后，将溶液在真空中浓缩，并将残余物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化。这得到7.0g(50％产率)呈白色固体的L-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH。
LCMS：(ESI)m/z＝602.3[M+H]+。
B：D-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH
在D-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH的合成中使用了上述相同的程序。还参见下文的示例性合成方案。从10.0g D-Fmoc-Glu-OtBu中获得了5.7g D-Fmoc-Glu(接头-Cbz)-OH，总产率为40％。LCMS：(ESI)m/z＝602.1[M+H]+。
实例2:CPMB-001的的合成
步骤1：N2-N2-(N5-(6-(((苄氧基)羰基)氨基)己基)-N2-(N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰基)-L-谷氨酰胺基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰基甘氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰基甘氨酸(CPMB-001-A)的合成
此化合物通过使用Fmoc策略的标准固相肽合成来合成。
将2-Cl-CTC树脂(5.0g，1.1mmol/g，吉尔生化公司(GL Biochem))在DMF中溶胀10分钟，然后将第一氨基酸Fmoc-Gly-OH(743mg，2.5mmol)用含DIPEA(1292mg，10mmol)的DMF(80mL)在室温下与树脂偶联4小时。将树脂用DCM和用MeOH/DCM(1/1，80mL)去活性的过量氯化物洗涤1小时。将树脂用DMF洗涤。将所得树脂用20％哌啶/DMF(50mL)处理20分钟以去除Fmoc基团。将所得树脂用DMF洗涤，并用Fmoc-Lys(Boc)-OH(1874mg，4.0mmol)、HBTU(1517mg，4.0mmol)、HOBt(540mg，4mmol)和DIPEA(1034mg，8.0mmol)于DMF(80mL)中的溶液在室温下处理1小时，由此引入Lys以得到Fmoc-Lys(Boc)-Gly-CTC树脂。以类似的方式，引入Gly、Lys(Boc)、Glu(tBu)和Lys(Boc)以得到NH2-Lys(Boc)-Glu(接头-Cbz)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-CTC树脂(SEQ ID NO:8)。使用冷HFIP/DCM(3/7，100mL)将线性肽从树脂上切割，向上述干燥树脂中添加此混合物溶液，并将混合物振荡1.0小时。滤出树脂并用DCM(10mL×3)洗涤。将滤液合并，并在真空下去除溶剂。将粗肽溶解于H2O/CH3CN中并冻干以去除剩余的溶剂。收集呈白色固体的线性肽CPMB-001-A(1200mg，粗品)。
LCMS：(ESI)m/z＝540.0[M+2H]/2+。
步骤2：(6-(3-((2S,5S,11S,17S)-5,11,17-三(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-3,6,9,12,15,18-六氧代-1,4,7,10,13,16-六氮杂环十八烷-2-基)丙酰胺基)己基)氨基甲酸苄酯(CPMB-001-B)的合成
上文提供了用于从CPMB-001-A产生CPMB-001-B的示例性合成方案。下文是合成程序的简要说明。
将HBTU(774mg，2.04mmol，2.0当量)溶解于DMF(20mL)中，并添加DIEA(168μL)。然后在室温下，将CPMB-001-A(1200mg，1.02mmol，1.0当量)和DIEA(506μL)于DMF(150mL)中的溶液在2小时时间段内逐滴添加到HBTU溶液中。获得棕色混合物，并且LCMS指示CPMB-001-A的完全转化。然后通过添加水(170mL)将反应淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。将有机层用NaCl溶液(盐水100mL，以及水100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩，以获得浅棕色油。将油在水(100mL)中研磨并过滤。将残余物在正己烷(100mL，含有5％乙酸乙酯)中再次研磨2小时，并过滤以获得呈浅黄色固体的靶环状肽(742mg，产率：62.7％)。
LCMS：(ESI)m/z＝1162.9[M+H]+。
步骤3：(6-(3-((2S,5S,11S,17S)-5,11,17-三(4-氨基丁基)-3,6,9,12,15,18-六氧代-1,4,7,10,13,16-六氮杂环十八烷-2-基)丙酰胺基)己基)氨基甲酸苄酯(CPMB-001)的合成
上文提供了用于从CPMB-001-B产生CPMB-001的示例性合成方案。下文是合成程序的简要说明。
将CPMB-001-B(742mg，0.64mmol)溶解于DCM(1mL)中，并冷却至-5℃，并且然后添加冷冻的TFA/DCM(2mL，V∶V＝1∶1)。将溶液在-5℃下搅拌1小时，并通过LCMS监测反应。在CPMB-001-B完全转化后，添加冷冻的MTBE(40mL)，并生成白色沉淀物。将悬浮液以3200转/分钟离心3分钟，并倒出上清液。将沉淀物用MTBE(40mL×2)洗涤并离心额外两次。将白色残余物在减压下干燥，以获得呈白色固体的靶化合物(CPMB-001)(760mg盐，产率：98.8％)。
LCMS：(ESI)m/z＝860.3[M+H]+。
实例3：CPMB-002和CPMB-003的合成
在CPMB-002的合成中使用了相同的程序。参见图1中的示例性合成方案。
从5.0g(1.1mmol)CTC树脂中获得700mg CPMB-002，总产率为50％。LCMS：(ESI)m/z＝860.3[M+H]+。
从5.0g(1.1mmol)CTC树脂中获得781mg CPMB-003，总产率为65.0％。LCMS：(ESI)m/z＝860.3[M+H]+。
实例4：Gal-1的合成
Gal-1：5-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(Gal-1)。
上文提供了Gal-1的示例性合成方案。
步骤1和2：5-羟基戊酸钠(化合物3)和5-羟基戊酸苄酯(化合物4)的合成
将四氢-2H-吡喃-2-酮(10.0g，99.9mmol，1.0当量)和NaOH(4.0g，99.9mmol，1.0当量)的混合物溶解于H2O(100mL)中。将溶液在100C下回流过夜，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液在真空中浓缩。将所得白色固体溶于丙酮(200mL)中，并依次添加nBu4NI(1.8g，5.0mmol，5mol％)和苄基溴(14.2mL，119.9mmol，1.2当量)。将混合物在60℃下回流过夜，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液在真空中浓缩。将随后的残余物溶解于EtOAc(150mL)中，并用NaHSO4水溶液(10.0g于150mL H2O中)洗涤。然后将水层用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液(100mL)、盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱用PE/EtOAc(8/2)洗脱进行纯化。由此得到17.9g(86％产率)呈无色油的5-羟基戊酸苄酯(化合物4)。LCMS：(ESI)m/z＝209.1[M+H]+。
步骤3：(2R，3R，4R，5R，6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-(苄氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3，4-二乙酸二酯(化合物5)的合成
向(2S，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2，4，5-三乙酸三酯(10.0g，25.7mmol，1.0当量)于干燥DCE(200mL)中的悬浮液中添加三氟甲磺酸三甲基硅酯(7.0mL，38.5mmol，1.5当量)。将混合物在25℃下搅拌2小时，随后是化合物4(7.5g，36.0mmol，1.4当量)和分子筛(5.0g)。将混合物在25C下搅拌过夜，并通过LCMS进行监测。一旦反应完成，将混合物过滤以去除/>分子筛。向滤液中添加饱和NaHCo3水溶液(50mL)，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将随后的黄色油直接用于下一步骤。LCMS：(ESI)m/z＝538.0[M+H]+。
步骤4：5-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(Gal-1)的合成
向化合物5于MeOH/EtOAc(10.0mL/30.0mL)中的溶液中添加Pd/C(1.0g，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将悬浮液在25℃下搅拌过夜，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液过滤并在真空中浓缩。将残余物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化。这得到7.4g(64％产率)呈白色泡沫的Gal.1。
LCMS：(ESI)m/z＝448.0[M+H]+。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.02(br，1H)，7.82(d，J＝9.2Hz，1H)，5.21(d，J＝3.4Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.2，3.4Hz，1H)，4.48(d，J＝8.5Hz，1H)，4.03(s，3H)，3.88(dt，J＝11.2，8.9Hz，1H)，3.73-3.66(m，1H)，3.46-3.37(m，1H)，2.20(t，J＝7.1Hz，2H)，2.11(s，3H)，2.00(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.54-1.43(m，4H)。
实例5：Gal-2的合成
Gal-2：3-(2-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)丙酸(Gal-2)的合成
在Gal-1的合成中使用了相同的程序。下文提供了示例性合成方案。从5.1g(43.9mmol)1，4-二氧杂环庚烷-5-酮中获得0.8g Gal-2，总产率为4.1％。
LCMS：(ESI)m/z＝464.4[M+H]+。
实例6：Gal-3的合成
Gal-3：4-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酸(Gal-3)的合成
在Gal-1的合成中使用了相同的程序。下文提供了合成方案。从15.0g(174.2mmol)二氢呋喃-2(3H)-酮中获得3.9g呈白色泡沫的Gal-3，总产率为5.2％。
LCMS：(ESI)m/z＝434.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.03(br，1H)，7.83(d，J＝9.2Hz，1H)，5.75(s，1H)，5.21(d，J＝3.4Hz，1H)，4.95(dd，J＝11.3，3.4Hz，1H)，4.47(d，J＝8.5Hz，1H)，4.07-3.98(m，3H)，3.87(dt，J＝11.3，8.9Hz，1H)，3.70(dt，J＝10.0，6.1Hz，1H)，2.23(t，J＝7.4Hz，2H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.72-1.64(m，2H)。
实例7：Gal-4的合成
Gal-4：6-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)己酸(Gal-4)的合成
在Gal-1的合成中使用了相同的程序。下文提供了示例性合成方案。从11.4g(99.9mmol)氧杂环庚烷-2-酮中获得10.6g呈白色泡沫的Gal-4，总产率为23％。
LCMS：(ESI)m/z＝462.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.07(br，1H)，7.82(d，J＝9.2Hz，1H)，5.21(d，J＝3.4Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.2，3.4Hz，1H)，4.48(d，J＝8.5Hz，1H)，4.05-4.01(m，3H)，3.87(dt，J＝11.2，8.9Hz，1H)，3.69(dt，J＝9.9，6.4Hz，1H)，3.41(dt，J＝9.9，6.4Hz，1H)，2.18(t，J＝7.4Hz，2H)，2.11(s，3H)，2.00(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)，1.54-1.41(m，4H)，1.30-1.24(m，2H)。
实例8：Gal-5的合成
GaL-5：3-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙酸(Gal-5)的合成
在Gal-1的合成中使用了相同的程序。下文提供了示例性合成方案。从6.5g(36mmol)3-羟基丙酸苄酯中获得4.3g呈白色泡沫的Gal-5，总产率为28.5％。
LCMS：(ESI)m/z＝420.0[M+H]+。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.27(br，1H)，7.77(d，J＝9.2Hz，1H)，5.21(d，J＝3.4Hz，1H)，4.96(dd，J＝11.2，3.4Hz，1H)，4.53(d，J＝8.5Hz，1H)，4.08-3.98(m，3H)，3.92-3.80(m，2H)，3.68(dt，J＝10.3，6.4Hz，1H)，2.46(t，J＝6.4Hz，2H)，2.10(s，3H)，2.00(s，3H)，1.89(s，3H)，1.77(s，3H)。
实例9：5-Fam-CPMB-0013的合成
步骤1：CPMB-0013-A的合成
在图2A中提供了用于产生CPMB-0013A的示例性合成方案。
向(6-(3-((2S,5S,11S,17S)-5,11,17-三(4-氨基丁基)-3,6,9,12,15,18-六氧代-1,4,7,10,13,16-六氮杂环十八烷-2-基)丙酰胺基)己基)氨基甲酸苄酯(CPMB-001)(898mg，747μmol，1.0当量)于DMF(5mL)中的溶液中依次添加EDCI·HCl(859mg，4.48mmol，6.0当量)、HOAt(610mg，4.48mmol，6.0当量)、DIPEA(1.17mL，6.72mmol，9.0当量)、4-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酸(Gal-3)(1.07g，2.47mmol，3.3当量)。将所得溶液在25℃下搅拌过夜，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液用H2O(15mL)稀释，用DCM(3×20mL)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化，以得到呈白色泡沫的化合物CPMB-0013-A(1.22g，78％产率)。
纯化方法：
流动相：A：0.05％ TFA的水溶液；B：含0.05％ TFA的乙腈
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝71/29-61/39的线性密度梯度上洗脱(20分钟)
LCMS：(ESI)m/z＝1053.3[M/2+H]+。
步骤2：5-Fam-CPMB-0013的合成
在图2B中提供了用于产生5-Fam-CPMB-0013的示例性合成方案。
向CPMB-0013-A(14.3mg，6.8μmol，1.0当量)于MeOH(2.0mL)中的溶液中添加Pd/C(4.0mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，通过配备有滤膜(0.5μm，)的注射器过滤混合物。向滤液中添加NaOMe于MeOH中的溶液(100μL，30.0wt％，5.4M)。将所得溶液在25℃下搅拌20分钟，并通过LCMS进行监测。完成后，通过添加乙酸(31.0μL)将溶液中和。将溶液在真空中浓缩，并将残余物溶解于饱和NaHCO3水溶液(1mL)中，用H2O(1.0mL)稀释，然后添加3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5FAM-OSu，4.8mg，10.2μmol，1.5当量)。将烧瓶用铝箔覆盖，以防止溶液受到光照。将所得溶液在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液用MeCN(2.0mL)稀释，并通过制备型HPLC纯化，以得到呈橙色固体的5-Fam-CPMB-0013(5.0mg，38％产率)。
纯化方法：
流动相：A：0.05％TFA的水溶液；B：含0.05％TFA的乙腈
柱：Phenomenex Gemini C18，21.2×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝84/16-74/26的线性密度梯度上洗脱(20分钟)
LCMS：(ESI)m/z＝976.2[M+2H]/2+。
HPLC：97.57％(214nm)，保留时间＝12.776分钟
流动相：A：水(0.05％TFA)；B：ACN(0.05％TFA)
梯度：5％B，持续3分钟，在20分钟内增加至65％B，在2分钟内增加至95％，保持5分钟，在0.1分钟内回到5％B。
流速：1.0毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH柱C18，4.6×150mm，3.5μm，
柱温：20℃
实例10：CPMB-0013的合成
在图3中提供了用于产生CPMB-0013的示例性合成方案。
向CPMB-0013-A(695mg，0.33mmol，1.0当量)于MeOH(20.0mL)中的溶液中添加Pd/C(0.18g，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将混合物过滤并浓缩。将残余物溶解于10mL DMF中，并依次添加EDCI·HCl(94.8mg，0.49mmol，1.5当量)、HOAt(67.3mg，0.49mmol，1.5当量)、DIPEA(173μL，1mmol，3.0当量)和4-((2S，4R)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-基)-4-氧代丁酸(4-((2S，4R)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-基)-4-氧代丁酸：119.2mg，0.39mmol，1.2当量)。将反应在室温下搅拌3小时，并通过LCMS进行监测。反应完成后，将混合物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱直接进行纯化，以得到呈白色粉末的化合物CPMB-0013-D(0.65g，87％产率)。
将化合物CPMB-0013-D(0.65g，0.29mmol，1.0当量)溶解于20mL MeOH中，并添加NaOMe于MeOH中的溶液(30wt％，500μL)。将溶液在室温下搅拌20分钟，并且LCMS指示脱乙酰过程已完成。然后将乙酸(155μL)添加到混合物中以中和溶液。将混合物用水(15mL)稀释，并用制备型HPLC用H2O(10mmol NH4OAc)/MeCN洗脱进行纯化，以得到280mg期望的呈白色泡沫的化合物CPMB-0013(54％产率)。
纯化方法：
流动相：A：10mmol NH4OAc；B：ACN
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝95/5-85/15的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集20.92分钟时的级分并冻干。
LCMS：(ESI)m/z＝795.7[(M-GalNAc)/2+H]+
HPLC：90.04％(214nm)，保留时间＝12.28分钟
流动相：A：水(0.01％ TFA)；B：ACN(0.01％ TFA)
梯度：2％ B，持续4分钟，在15分钟内增加至32％ B，在3分钟内增加至95％ B，保持5分钟，在0.1分钟内回到5％ B。
流速：1毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH C18，4.6×150mm，3.5μm，
柱温：40℃
实例11:CPMB-0013-DMTr的合成
在图4中提供了用于产生CPMB-0013-DMTr的示例性合成方案。
步骤1：CPMB-0013-F的合成
向CPMB-0013-A(210mg，0.10mmol，1.0当量)于MeOH(20.0mL)中的溶液中添加Pd/C(50mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，通过配备有滤膜(0.5μm，)的注射器过滤混合物。将残余物溶解于1mL DMF中，并依次添加EDCI·HCl(28.6mg，0.15mmol，1.5当量)、HOAt(20.3mg，0.15mmol，1.5当量)、DIPEA(52μL，0.30mmol，3.0当量)和Int-DMTr(84.6mg，0.12mmol，1.2当量)。将反应在室温下搅拌3小时，并通过LCMS进行监测。反应完成后，将混合物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/vNH4HCO3)/MeCN(95/5至5/95)洗脱直接进行纯化，以得到呈白色粉末的化合物CPMB-0013-F(177mg，67％产率)。
纯化方法：
流动相：A：10mmol NH4OAc；B：ACN
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，/>
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝56/44-46/54的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集19.52分钟处的100％的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝1181.4[(M-DMTr)/2+H]+
步骤2：CPMB-0013-DMTr的合成
向CPMB-0013-F于MeOH/EtOAc(20.0mL，1：1)中的溶液中添加Pd/C(40mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将悬浮液在25℃下搅拌6小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液过滤并在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC用H2O(0.01％v/vNH4HCO3)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化，以得到33mg期望的呈白色粉末的化合物CPMB-0013-DMTr(19％产率)。
纯化方法：
流动相：A：10mmol NH4OAc；B：ACN
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝68/32-58/42的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集15.65分钟处的98.4％的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝1285.6[M/2-H]-。
HPLC：＞99％(214nm)，保留时间＝10.58分钟
流动相：A：水(10mM NH4HCO3)；B：ACN
梯度：5％B，持续1分钟，在20分钟内增加至95％B，在5分钟内增加至95％B，在0.1分钟内回到5％B。
流速：1毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH C18，4.6×150mm，3.5μm，
柱温：40℃
实例12：CPMB-0013-DTMr-PEG4-CPG树脂的合成
步骤l：CPG-PEG4的合成
在图5A中提供了用于产生CPG-PEG4的示例性合成方案。
将CPG树脂(488mg，35-50μmol/g)、1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2，7,10，13，16-五氧杂-4-氮杂十九烷-18-酸(FmocNH-PEG4-CH2COOH)(23mg，48.8μmol，2.0当量)、DIPEA(17μL，97.6μmol，4.0当量)、HOBt(6.6mg，48.8μmol，2.0当量)和HBTU(18.5mg，48.8μmol，2.0当量)在室温下在DMF(2mL)中振荡24小时。然后将树脂用DMF(3mL×3)洗涤。凯泽测试(Kaisertest)呈阴性。然后将树脂用MTBE(5mL×3)洗涤并在真空中干燥。上样测试：在3个EP管中分别取6.1mg、8.0mg、12.0mg CPG树脂(mCPG)，并在每个管中添加1mL DBU(2％于DMF中)，30分钟后，在25mL容量瓶中转移800μL上清液，并用MeCN填充烧瓶。分光光度法允许测定Fmoc基团的吸光度(平均值304nm)：0.069、0.091、0.138。因此，上样为平均值*4.1/mCPG＝47μmol/g，＞99％产率。
步骤2：CPG-PEG4-CPMB-0013-DMTr的合成
在图5B中提供了用于产生CPG-PEG4-CPMB-0013-DMTr的示例性合成方案。
将CPG-PEG4树脂(150mg，47μmol/g)在3mL DBU(2％于DMF中)中振荡1小时。凯泽测试指示脱Fmoc过程已完成，然后将树脂用DMF(3mL×3)洗涤。将树脂与CPMB-0013-DMTr(27mg，10.5μmol，1.5当量)、DIPEA(3.6μL，10.5μmol，3.0当量)、HOBt(1.4mg，10.5μmol，1.5当量)和HBTU(4mg，10.5μmol，1.5当量)在室温下在DMF(2mL)中振荡24小时。然后将树脂用DMF(3mL×3)洗涤。向树脂中装入吡啶/Ac2O(1mL/20μL)并振荡1小时。然后将树脂用DMF(3mL×3)和MTBE(5mL×3)洗涤并在真空中干燥。上样测试：取2.7mg CPG-PEG4-CPMB-0013-DMTr树脂，添加200μL 1N HCl和200μL MeCN，LCMS：S(DMTr+)＝691.54mAU，上样＝32μmol/g，51.6mg。
实例13.：5-Fam-CPMB-0023的合成
步骤1：CPMB-0023-A的合成
在图6A中提供了用于产生CPMB-0023-A的示例性合成方案。
向(6-(3-((2R，5R，11R，17R)-5，11，17-三(4-氨基丁基)-3，6，9，12，15，18-六氧代-1，4，7，10，13，16-六氮杂环十八烷-2-基)丙酰胺基)己基)氨基甲酸苄酯(CPMB-002)(904mg，752μmol，1.0当量)于DMF(5mL)中的溶液中依次添加EDCI·HCl(865mg，4.51mmol，6.0当量)、HOAt(614mg，4.51mmol，6.0当量)、DIPEA(1.18mL，6.76mmol，9.0当量)、4-(((2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰胺基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酸(Gal-3)(1.07g，2.48mmol，3.3当量)。将所得溶液在25℃下搅拌过夜，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液用H2O(15mL)稀释，用DCM(3×20mL)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化，以得到呈白色泡沫的化合物CPMB-0023-A(1.49g，94％产率)。
纯化方法：
流动相：A：0.05％TFA的水溶液；B：含0.05％TFA的乙腈
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝71/29-61/39的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集18.35分钟处的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝1053.3[M/2+H]+。
步骤2：5-Fam-CPMB-0023的合成
在图6B中提供了用于产生5-Fam-CPMB-0023的示例性合成方案。
向CPMB-0023-A(17.0mg，8.1μmol，1.0当量)于MeOH(2.0mL)中的溶液中添加Pd/C(4.0mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，通过配备有滤膜(0.5μm，)的注射器过滤混合物。向滤液中添加NaOMe于MeOH中的溶液(100μL，30.0wt％，5.4M)。将所得溶液在25℃下搅拌20分钟，并通过LCMS进行监测。完成后，通过添加乙酸(31.0μL)将溶液中和。将溶液在真空中浓缩，并将残余物溶解于饱和NaHCO3水溶液中(1mL)，用H2O(1.0mL)稀释，然后添加3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.7mg，12.1μmol，1.5当量)。将烧瓶用铝箔覆盖，以防止溶液受到光照。将所得溶液在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液用MeCN(2.0mL)稀释，并通过制备型HPLC纯化，以得到呈橙色固体的5-Fam-CPMB-0023(8.5mg，54％产率)。
纯化方法：
使用TFA缓冲液：A：0.05％ TFA的水溶液；B：含0.05％ TFA的乙腈
柱：Phenomenex Gemini C18，21.2×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝83/17-73/27的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集17.85分钟处的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝976.7[M/2+H]+。
HPLC：98.15％(214nm)，保留时间＝12.866分钟
流动相：A：水(0.01％ TFA)；B：ACN(0.01％ TFA)
梯度：5％ B，持续3分钟，在20分钟内增加至65％ B，在2分钟内增加至95％，保持5分钟，在0.1分钟内回到5％ B。
流速：1.0毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH柱C18，4.6×150mm，3.5μm，
柱温：20℃
实例14:CPMB-0023的合成
在图7中提供了用于产生CPMB-0023的示例性合成方案。
步骤1：CPMB-0023-D的合成
向CPMB-0023-A(294mg，0.14mmol，1.0当量)于MeOH(10.0mL)中的溶液中添加Pd/C(60mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将混合物过滤并浓缩。将残余物溶解于2mL DMF中，并依次添加EDCI·HCl(38.8mg，0.20mmol，1.5当量)、HOAt(27.2mg，0.20mmol，1.5当量)、DIPEA(70μL，0.41mmol，3.0当量)和4-((2S，4R)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-基)-4-氧代丁酸(48.8mg，0.16mmol，1.2当量)。将反应在室温下搅拌3小时，并通过LCMS进行监测。反应完成后，将混合物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/v TFA)/MeCN(95/5至5/95)洗脱直接进行纯化，以得到呈白色粉末的化合物CPMB-0023-D(303mg，96％产率)。LCMS：(ESI)m/z＝1128.2[M/2+H]+。
步骤2：CPMB-0023的合成
将化合物CPMB-0023-D(303mg，0.13mmol，1.0当量)溶解于5mL MeOH中，并添加NaOMe于MeOH中的溶液(30wt％，200μL)。将溶液在室温下搅拌20分钟，并且LCMS指示脱乙酰过程已完成。然后将乙酸(62μL)添加到混合物中以中和溶液。将混合物用水(15mL)稀释，并用制备型HPLC用H2o(10mmol NH4OAc)/MeCN洗脱进行纯化，以得到98mg期望的呈白色泡沫的化合物CPMB-0023(42％产率)。
纯化方法：
使用TFA缓冲液：A：0.05％TFA的水溶液；B：含0.05％TFA的乙腈
柱：Welch Topsil C18，21.1×250mm，5μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝95/5-85/15的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集20.77分钟处的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝795.6[(M-GalNAc)/2+H]+。
HPLC：93.66％(214nm)，保留时间＝14.31分钟
流动相：A：0.05％TFA的水溶液；B：含0.05％TFA的ACN
梯度：2％B，持续3分钟，在20分钟内增加至32％B，在1分钟内增加至95％，保持6分钟，在0.1分钟内回到2％B。
流速：1.0毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH柱C8，4.6×50mm，3.5μm，
柱温：45℃
实例15:CPMB-0023-DMTr[的合成
在图8中提供了用于产生CPMB-0023-DMTr的示例性合成方案。
步骤1：CPMB-0023-F的合成
向CPMB-0023-A(206mg，0.10mmol，1.0当量)于MeOH(20.0mL)中的溶液中添加Pd/C(50mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将所得混合物在25℃下搅拌16小时，并通过LCMS进行监测。完成后，通过配备有滤膜(0.5μm，)的注射器过滤混合物。将残余物溶解于1mL DMF中，并依次添加EDCI·HCl(28.1mg，0.15mmol，1.5当量)、HOAt(20.0mg，0.15mmol，1.5当量)、DIPEA(52μL，0.30mmol，3.0当量)和Int-DMTr(83.4mg，0.12mmol，1.2当量)。将反应在室温下搅拌3小时，并通过LCMS进行监测。反应完成后，将混合物通过反相色谱法用H2O(0.01％v/vNH4HCO3)/MeCN(95/5至5/95)洗脱直接进行纯化，以得到呈白色粉末的化合物CPMB-0023-F(114mg，44％产率)。
纯化方法：
流动相：A：10mmol NH4OAc；B：ACN
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝56/44-46/54的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集19.22分钟处的100％的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝1181.4[(M-DMTr)/2+H]+。
步骤2：CPMB-0023-DMTr的合成
向CPMB-0023-F(114mg，0.043mmol，1.0当量)于MeOH/EtOAc(20.0mL，1:1)中的溶液中添加Pd/C(30mg，10.0％)。将烧瓶排空并用H2冲洗3次。将悬浮液在25℃下搅拌6小时，并通过LCMS进行监测。完成后，将溶液过滤并在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC用H2O(0.01％v/v NH4HCO3)/MeCN(95/5至5/95)洗脱进行纯化，以得到79mg期望的呈白色粉末的化合物CPMB-0023-DMTr(72％产率)。
纯化方法：
流动相：A：10mmol NH4OAc；B：ACN
柱：Waters XBridge制备型C18，19×250mm，10μm，
流速：25毫升/分钟
洗脱液：在A/B＝70/30-60/40的线性密度梯度上洗脱(20分钟)，收集19.22分钟处的99.1％的级分并冻干
LCMS：(ESI)m/z＝1285.3[M/2-H]-。
HPLC：＞99％(214nm)，保留时间＝10.56分钟
流动相：A：水(10mM NH4HCO3)；B：ACN
梯度：5％B，持续1分钟，在20分钟内增加至95％B，在5分钟内增加至95％B，在0.1分钟内回到5％B。
流速：1毫升/分钟
柱：XBridge肽BEH C18，4.6×150mm，3.5μm，
柱温：45℃
实例例16.：CPMB-0023-DTMr-PEG4-CPG树脂的合成
在图9中提供了用于产生CPMB-0023-DTMr-PEG4-CPG树脂的示例性合成方案。
将CPG-PEG4树脂(100mg，47μmol/g)在3mL DBU(2％于DMF中)中振荡1小时。凯泽测试指示脱Fmoc过程完成，然后将树脂用DMF(3mL×3)洗涤。将树脂与CPMB-0023-DMTr(18mg，7μmol，1.5当量)、DIPEA(2.4μL，7μmol，3.0当量)、HOBt(0.9mg，7μmol，1.5当量)和HBTU(2.7mg，7μmol，1.5当量)在室温下在DMF(2mL)中振荡24小时。然后将树脂用DMF(3mL×3)洗涤。向树脂中装入吡啶/Ac2O(1mL/20μL)并振荡1小时。然后将树脂用DMF(3mL×3)和MTBE(5mL×3)洗涤并在真空中干燥。上样测试：取1.5mg CPG-PEG4-CPMB-0023-DMTr树脂，添加100μL 1N HCl和100μL MeCN，LCMS：S(DMTr+)＝785.43mAU，上样＝31μmol/g，69mg。
实例17.：与三GalNAc缀合的环状肽的细胞摄取
人肝细胞癌(HepG2)细胞系购自上海中乔新舟生物科技有限公司(ShanghaiZhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.，Ltd.)，并在含有10％胎牛血清(吉博科(Gibco)，美国赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，USA))、200单位/mL青霉素加200单位/mL链霉素的最低必需培养基(吉博科、美国赛默飞世尔科技公司)中在37℃和5％CO2下维持。
将细胞接种在24孔板中，密度为每孔1.5×105个细胞，并在37℃、5％CO2下温育。温育18小时后，将培养基替换为含有2％FBS的MEM，并添加最终浓度为1.6nM、8nM、40nM或200nM的FAM标记的配体。温育24小时后，将细胞用1倍PBS洗涤两次，并通过LSRFortessa(美国新泽西州的BD生物科学公司(BD Biosciences，NJ，USA))进行分析。通过FAM阳性细胞的比例来评估结合效率。
下表4示出了配体结合的HepG2细胞的百分比。将HepG2细胞用具有1.6nM、8nM、40nM或200nM的连续稀释浓度的14个环状肽-三-GalNAc配体变体处理。Givosirna中使用的商业化的三-GalNAc用作阳性对照，并且不含三-GalNA的环状肽为阴性对照。在14种变体中，与其它变体和商业化的三-GalNAc相比，5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)和5-FAM-CPMB-0035(ID035)具有相对更高的结合能力。5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)、5-FAM-CPMB-0035(ID035)和商业化的三-GalNAC的平衡离解常数(kd)分别为7.0nM、8.6nM、5.7nM和18nM。
表4：环状肽-三-GaINAc缀合物的细胞摄取效率
实例18：与三-GalNAc缀合的环状肽的稳定性测定
用HepG2细胞的活力评估环状肽-三-GalNAc的细胞毒性作用，并通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(日本同仁化学研究所(Dojindo Laboratories，Japan))进行分析。根据制造商的方案进行测定。简言之，将HepG2接种在96孔板中，密度为每孔6×104个细胞，并在37℃和5％CO2下温育。当细胞达到70％汇合时，将培养基改为含有2％FBS的MEM，并处理最终浓度为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和1.5625μM的连续稀释的环状肽-三-GalNAc。处理24小时后，向每个孔中添加10μL CCK-8溶液，并在37℃下温育1～4小时。通过微孔板读取器(美国马萨诸塞州的赛默飞世尔科技公司的Multiskan sky(Thermo scientific，Multiskan sky，MA，USA))测量450nm处的吸光度。用ID013、ID023和商业化的三-GalNAC处理的细胞的存活率为97％～100％。
用最终浓度为200nM的无菌水制备FAM标记的三-GalNAc配体。将10μl配体与90μl人血浆混合，并在37℃下温育0小时、24小时、48小时、72小时。温育结束时，向每种混合物中添加300μl甲醇以淬灭反应。将淬灭的样品以20,000×g离心5分钟，并用0.45μm过滤器(默克密理博公司(Merck Millipore))进一步过滤上清液以去除碎屑。通过UPLC-FLR检测器(美国马塞诸塞州的沃特世公司(Waters，MA，USA))测量经过滤的样品。
图10示出了5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)和商业化的三-GalNAC的稳定性测定结果。将5-FAM-CPMB-0013(ID13)、5-FAM-CPMB-0023(ID23)和商业化的三GalNAC与90％人血浆一起温育，持续不同的时间点。通过UPLC系统对每个配体的量进行分析和定量。根据数据，5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)和商业化的三-GalNAC在6小时内均高度稳定，并且然后逐渐降低。温育72小时后，5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)和商业化的三-GalNAC的剩余量分别为92.7％、85.8％和79.1％。
实例19：与三-GalNAc缀合的环状肽的内体逃逸测定
将HepG2接种在100mm培养皿中，密度为1×107个细胞/10ml，并在37℃和5％CO2下温育。温育18小时后，将培养基改为含有2％FBS的MEM，其中含有1μM最终浓度的FAM标记的配体。处理3天后，根据制造商的方案，通过内体分离和细胞分级试剂盒(ED-028，美国英文特生物技术股份有限公司(Invent Biotechnologies，USA))分离内体和胞质溶胶级分。简言之，收集1.5×105个细胞并在冷PBS中洗涤。离心后，完全去除上清液，并用500μl缓冲液A重悬沉淀物。然后，将细胞悬浮液转移到滤筒中，以16,000×g离心30秒。通过10秒涡旋将滤液和沉淀物充分混合，并以700×g离心3分钟，以沉淀不期望的细胞核和完整细胞。将上清液转移到新鲜管中，并在4℃下以16,000×g进一步离心1小时，以沉淀出沉淀物中的不希望的较大细胞器和细胞质膜。将上清液转移到新管中，以1∶1的比率与缓冲液B混合，并在4℃下温育过夜。将混合物在4℃下以10,000×g离心30分钟。上清液为胞质溶胶级分，并且沉淀物作为内体级分溶解于缓冲液中。通过Synergy H1微孔板读取器(美国佛蒙特州的伯腾公司(BioTek，VT，USA))在激发490nm和发射520nm处测定胞质溶胶和内体级分的荧光强度。
将细胞与5-FAM-CPMB-0013(ID013)、5-FAM-CPMB-0023(ID023)和商业化的三-GalNAC一起温育，并进一步划分到内体级分和胞质溶胶级分中。在胞质溶胶级分中，5-FAM-CPMB-0013(ID013)和5-FAM-CPMB-0023(ID023)的荧光强度是商业化的三-GalNAC的荧光强度的1.2倍和1.6倍。在内体级分中，ID013和ID023的荧光强度是商业化的三GalNAC的荧光强度的0.7倍和0.5倍，支持有更多的5-FAM-CPMB-0013(ID13)或5-FAM-CPMB-0023(ID23)从内体释放到胞质溶胶中(参见图11)。因此，新开发的环状肽-三-GalNAc具有更好的内体逃逸能力。
其它实施例
本说明书中公开的特征中的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用系列的等效或类似特征的实例。
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求范围内。
等效形式
尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文所描述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每个变型和/或修改被视为处于本文所描述的本发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和构型意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导所使用的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所描述的具体本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅通过实例的方式呈现，并且在所附权利要求以及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合并不相互矛盾，则此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法被包含在本公开的本发明范围内。
如本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而通过引用并入，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应被理解为意指“至少一个(种)”。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素中的“任一个或两个”，即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个要素”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与如“包括(comprising)”等开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其它要素)；等。
如本文在本说明书和权利要求中使用的，“或”应当理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅明确指出相反的术语如“仅一个”或“恰好一个”或当在权利要求中使用时，“由...组成”指包含许多元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、“...之一”、“...中的仅一个”、或“...中的恰好一个”时，本文中使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由...组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在本说明书和权利要求中使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当理解为是指选自要素列表中的任一个或多个要素中的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。此定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素，而无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指任选地包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除了B之外的要素)的至少一个；在另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)的至少一个；在又另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个A的至少一个，以及任选地包含多于一个B(以及任选地包含其它元素)的至少一个；等。
还应当理解，除非明确指出相反，否则在本文所要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述的方法的步骤或动作的顺序。
序列表
<110> 中天（上海）生物科技有限公司（MICROBIO (SHANGHAI) CO., LTD.）
<120> 用于将药物递送至肝细胞的环状肽-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）缀合物
<130> 112319-0026-70002WO2
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> PCT/CN2021/089305
<151> 2021-04-23
<160> 8
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 用Cbz-接头2修饰
<400> 1
Lys Glu Lys Gly Lys Gly
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> (1), (3), (5)
<223> D-Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> D-Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 用Cbz-接头2修饰
<400> 2
Lys Glu Lys Gly Lys Gly
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> D-Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 用Cbz-接头2修饰
<400> 3
Lys Glu Lys Gly Lys Gly
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 用Cbz-接头2修饰
<220>
<221> VARIANT
<222> (4), (6)
<223> B-Ala
<400> 4
Lys Glu Lys Ala Lys Ala
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Lys Glu Lys Gly Lys Gly
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Lys Glu Lys Ala Lys Ala
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> (4), (6)
<223> B-Ala
<400> 7
Lys Glu Lys Ala Lys Ala
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1), (3), (5)
<223> 用叔丁氧基羰基修饰
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 用接头-CBZ修饰
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 用CTC树脂修饰
<400> 8
Lys Glu Lys Gly Lys Gly
1 5

Claims (26)

1.一种缀合物，其包括环状肽支架以及一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分，
其中所述环状肽支架具有4-10个，任选地4-8个氨基酸残基，所述氨基酸残基包括Glu、Asp、Lys、Arg或其组合；并且
其中所述GalNAc部分中的每一个通过第一接头与所述环状肽支架共价结合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其进一步包括药剂，其中所述药剂通过第二接头与所述环状肽支架共价结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中所述环状肽支架具有6个氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中所述环状肽支架包括至少一个Glu残基和至少一个Lys残基。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中每个第一接头与所述至少一个Lys残基共价结合。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的缀合物，其中所述第二接头与所述至少一个Glu残基共价结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中所述环状肽支架进一步包括Gly、Ala和/或Val。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述环状肽支架具有以下的氨基酸序列：
(a)Lys-Glu-Lys-Gly-Lys-Gly(SEQ ID NO:5)；或
(b)Lys-Glu-Lys-Ala-Lys-Ala(SEQ ID NO:6)。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述环状肽支架中的一个或多个氨基酸残基呈D形式。
10.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述环状肽支架选自由以下组成的组：CPS-001、CPS-002、CPS-003和CPS-031或其功能等效物；任选地其中所述环状肽支架是CPS-001、CPS-002、CPS-003或CPS-031。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中每个第一接头包括具有3-8个原子的直链。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述3-8个原子包括C、O或其组合。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述第一接头是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的缀合物，其中所述第二接头是脂质接头、聚乙二醇(PEG)接头或烷基胺接头。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的缀合物，其具有式(I)的结构：
其中：
T是所述药剂；
L1是所述第一接头，其中所述第一接头是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头；并且
L2是所述第二接头。
16.根据权利要求2至14中任一项所述的缀合物，其具有式(II)的结构：
其中：
T是所述药剂；
L1是所述第一接头，其中所述第一接头是Gal-1、Gal-2、Gal-3、Gal-4或Gal-5中的接头；并且
L2是所述第二接头。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其中所述环状肽支架具有Lys-Glu-Lys-βAla-Lys-βAla(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。
18.根据权利要求2所述的缀合物，其选自由以下组成的组：5-FAM-CPMB-0011、5-FAM-CPMB-0012、5-FAM-CPMB-0013、5-FAM-CPMB-0014、5-FAM-CPMB-0015、5-FAM-CPMB-0021、5-FAM-CPMB-0023、5-FAM-CPMB-0025、5-FAM-CPMB-0031、5-FAM-CPMB-0033、5-FAM-CPMB-0034、5-FAM-CPMB-0035、5-FAM-CPMB-0311、5-FAM-CPMB-0313、CPMB-0013、CPMB-0023、CPMB-0013-DOTMr和CPMB-0023-DOTMr。
19.根据权利要求2至18中任一项所述的缀合物，其中所述药剂是诊断剂或治疗剂。
20.根据权利要求2至19中任一项所述的缀合物，其中所述药剂是小分子或核酸。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述药剂是所述核酸，所述核酸是siRNA或核酸适体。
22.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至21中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的赋形剂。
23.一种将药剂递送至肝细胞的方法，所述方法包括使肝细胞与根据权利要求2至21中任一项所述的缀合物或根据权利要求22所述的组合物接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述接触步骤包括向有需要的受试者施用所述缀合物或所述组合物。
25.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括在所述肝细胞与所述缀合物或所述组合物接触后，向有需要的受试者施用所述肝细胞。
26.一种用于治疗肝病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求2至21中任一项所述的缀合物或根据权利要求22所述的组合物。
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