WO2003059394A2 - Compositions pour la vectorisation d'oligonucleotides a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisatin pour le traitement des maladies du systeme nerveux central - Google Patents
Compositions pour la vectorisation d'oligonucleotides a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisatin pour le traitement des maladies du systeme nerveux centralInfo
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Definitions
- the present invention relates to a compound consisting of at least one oligonucleotide linked to at least one peptide vector capable of transporting oligonucleotides across the blood-brain barrier (BBB).
- BBB blood-brain barrier
- the invention also relates to the preparation of these compounds and pharmaceutical compositions containing them useful for the treatment of diseases of the central nervous system.
- Antisense oligonucleotides are a new class of therapeutic agents that have generated interest in many diseases. Indeed, they have the ability to inhibit the expression of a gene associated with the disease, according to a mechanism specifically involving certain genetic sequences [Croo e, Exp. Opin. Invest. Drugs (1996) 14: 376-387; Temsamani, J. & Guinot, P., Biotechnol. Appl. Biochem (1997) 26, 65-71]. Gene expression is inhibited by hybridization of the oligonucleotide with base pairing target messenger RNA (mRNA) sequences, described by atson and Crick.
- mRNA target messenger RNA
- phosphorothioate oligonucleotides in which one of the oxygen atoms of the phosphodiester bond is replaced by a sulfur atom, are of particular interest [Agrawal, TIBTECH (1996) 14; 376-387]. This relatively simple modification has significantly improved the resistance of antisense to nucleases. In recent years, phosphorothioate oligonucleotides have been the most widely used analogues and many are in clinical trials [Agrawal, TIBTECH (1996) 14; 376-387; Temsamani, J. & Guinot, P., Biotechnol. Appl. Biochem (1997) 26, 65-71]. The knowledge gained from these trials led researchers to design chemically more elaborate oligonucleotides.
- oligonucleotide Another parameter that can influence the activity of the oligonucleotide is its internalization and its passage through cell membranes. Numerous internalisation studies have shown that these oligonucleotides pass very little through cell membranes (Lebleu, B. et al., Cijba Found Symp 1997; 209: 47-54; Stein, CA. & Narayanan., Curr Opin Oncol 1994 6: 587-94) and, in general, do not pass through the blood-brain barrier.
- oligonucleotides accumulate in most organs except the brain (Beng et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2001.11: 15-27, Agrawal et al., Proc Natl Acad Sci US 1991, -88: 7595-9). As a result, several strategies have been proposed to improve the properties of oligonucleotides:
- oligonucleotide Conjugation of the oligonucleotide to monoclonal antibodies such as OX26 (Boado, et al., J Pharm Sci 1998 87: 1308-1315) or polymers such as polylysine (Leonetti, et al., 1990; Bioconj. Chem 1: 149). Coupling of these macromolecules is complex and may in some cases lead to the development of immunogenicity in animals.
- linear peptide vectors such as linear peptides derived from natural peptides such as Protégrine and Tachyplesin carry active molecules through the BBB and improve the pharmacological properties of these molecules.
- the work and results concerning these linear peptides and their use as active molecule vectors have been described in French Patent Application Nos. 98/15074 filed on November 30, 1998 and in French Patent Application No. 99/02938 filed on May 26, 1998. November 1999.
- the present invention therefore relates to compounds consisting of at least one oligonucleotide linked to at least one linear peptide capable of vectorizing said oligonucleotide across the blood-brain barrier.
- these linear peptides are derivatives of protegrins or tachyplines.
- Protégrines and Tachyplesins are natural antibiotic peptides whose structure is of hairpin type maintained by disulfide bridges. These bridges play an important role in the cytolytic activity observed in human cells.
- a set of five peptides designated PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 and PG-5, the sequences of which are given below, closely related and isolated from porcine leucocytes, are referred to as proterins ( VN Kokryakov & Col. 1993, FEBS Lett, 327, 231-236):
- PG-4 RGGRLCYCRG ICFCVGR-NH2
- PG-5 RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2 6
- the invention particularly envisages as linear peptides derived from Protégrines, a peptide which corresponds to the following formula (I):
- B is chosen from arginine, lysine, diaminoacetic acid, diaminobutyric acid, diaminopropionic acid and ornithine.
- X is selected from glycine, alanine, valine, norleucine, isoleucine, leucine, cystem, cysteme.cm, penicillam, methionme, serine, threonine, asparagine, glutamine, phenyalanine, histidine, tryptophan, tyrosine, proline, Abu, amino-1-cyclohexane carboxylic acid, Aib, 2-aminotetralin carboxylic acid, 4-bromophenylalanine , tert-Leucine, 4-chlorophenylalanine, beta-cyclohexylalanine, 3,4-dichlorophenylalanine, 4-fluorophenylalanine, 1 homoleucine, beta-homoleucine, 1 homophen
- T1, T2 and T3 polyphemusins
- PI and P2 polyphemusins
- PI and P2 whose sequences are given below, are homologous peptides isolated from the haemolymph of two crabs, Tachyplesus tridentatus for tachyplines Tl, T2 and T3 and Limmulus polyphemus for PI polyphemusins and P2:
- the invention particularly envisages as linear peptides derived from Protégrines, a peptide which corresponds to the following formula (I):
- BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), wherein: the groups B, which are identical or different, represent an amino acid residue whose side chain carries a basic group, and the groups X, which are identical or different, represent an aliphatic amino acid residue or aromatic, or said peptides of formulas (I) or (II), in retro form, consisting of amino acids of configuration D and / or L, or a fragment thereof consisting of a sequence of at least 5 and preferably at least 7 successive amino acids of the peptides of formulas (I) or (II).
- oligonucleotides used in the context of the compounds of the invention, mention may be made of oligonucleotides phosphodiesters, phosphorothioates, methylphosphonates, hybrids comprising an RNA part and a DNA part, PNA (Peptide Nucleic acids), etc. It is advantageously antisense oligonucleotides as defined above.
- the bond between the oligonucleotide and the linear peptide in the compounds of the invention is selected from a covalent bond, a hydrophobic bond, an ionic bond, a cleavable bond or a non-cleavable bond in physiological media or within the cells.
- This binding may be direct or indirect via a linker and carried out by means of a functional group naturally present or introduced either on the peptide, or on the oligonucleotide, or both.
- This linker if present, must be acceptable in view of the chemical nature and the size of both the peptide and the oligonucleotide.
- linkers mention may be made of molecules containing amide, ester, carbamate, carbonate, disulfide, anhydride, hydrazone, hydrazine, imine, ether or amine linkages, an alkyl, aryl linker, alkylaryl and their various unsaturated or polyunsaturated derivatives.
- This linker can be branched and carry various functionalized or unsubstituted substituents such as alcohol, amine, carboxyl or sulfhydryl.
- the oligonucleotide or oligonucleotides may be linked by covalent bonds at the N-terminal or C-terminal ends or at the level of the side chains of the peptide.
- the linear peptide (s) may be linked to the oligonucleotide, at its 3 '-OH and / or 5' OH functions, or at another site such as the base or the sugar.
- a preferred type of bond between the oligonucleotide (s) and the linear peptide (s) involves at least one disulfide bridge.
- this type of binding is characterized by its stability in the plasma after injection of the compound, and once the compounds of the invention have crossed the blood-brain barrier, said disulfide bridge is reduced by releasing the oligonucleotide.
- the binding may be carried out at any site of the peptide as previously indicated.
- the present invention also relates to a method of treating diseases of the central nervous system (CNS), such as brain cancer or neurodegenerative diseases of administering to a subject suffering from such a disease an effective amount of a compound described previously.
- CNS central nervous system
- the invention therefore relates to a pharmaceutical composition for the treatment of diseases of the central nervous system comprising as active agent at least one compound described above.
- targets genes protein kinase for cancer, amyloid beta protein for Alzheimer's disease, TNF-alpha for neuroprotection, dopamine receptor for Parkinson's disease.
- a particular embodiment of the invention consists in associating in the composition the compound described above with one or more substances that are useful for the treatment of CNS diseases.
- a pharmaceutical composition according to the invention is in a form suitable for intravenous, subcutaneous, intramuscular, oral, rectal, nasal, transdermal, pulmonary administration.
- Figure 1 shows schematically the chemical synthesis of a vectorized compound of the oligonucleotide.
- Figure 2 illustrates the cell penetration results comparing the internalization between compound 1 (oligonucleotide alone) and compound 2 (vectorized oligonucleotide).
- FIG. 3 illustrates the passage through the blood-brain barrier of compound 1
- oligonucleotide oligonucleotide
- compound 2 vectorized oligonucleotide
- the peptide SynB3 of formula SEQ ID NO. 1: RRLSYSRRRF is assembled on solid phase according to a Fmoc / tu strategy, cleaved and deprotected with trifluoroacetic acid, and then purified by preparative high-pressure chromatography in reverse phase and freeze-dried. Its purity (> 95%) and its identity are confirmed by analytical HPLC and mass spectrometry.
- the phosphodiester oligonucleotide (1 equivalent) is solubilized in PBS buffer (500 ⁇ l) and the SynB3 vector (2 equivalents) is solubilized in DMF (100 ⁇ l).
- the vector peptide is added slowly to the oligonucleotide solution and the mixture is incubated for about
- K562 cells obtained from ATCC
- RPMI medium with 10% fetal calf serum.
- the cells are diluted to 0.3 x 10 6 cells per ml, 24 hours before the experiment.
- Cell penetration was measured by flow cytometry using a FACScan (Becton Dickinson, USA).
- Fluorescent compounds final concentration 5 ⁇ M are incubated with K562 cells (5 ⁇ 10 5 cells per ml) in Optimem medium at 37 ° C. for varying times.
- the final volume was 0.5 ml.
- the cells are washed twice and then resuspended in 0.5 ml of cold PBS.
- the penetration was then analyzed by FACS.
- the fluorophores are excited at 488 nm and the fluorescence is measured at 525 nm.
- a histogram of the fluorescence intensity (for 1 ⁇ 10 4 cells) is obtained and the mean of distribution is considered representative of the amount of peptide associated with the cells. The results are represented as a percentage of cells that incorporated fluorescence.
- the free or vectorized oligonucleotide was labeled at its 3 '-OH terminal with the enzyme terminal transferase (Promega) following the protocol described by the provider. Briefly, about 10 pmoles of compound are incubated with the transferase terminal at 37 ° C in the presence of phosphorus 32-radiolabeled dideoxyadenosine triphosphate ( 32 P-ddATP). After 30 minutes of incubation, the reaction is stopped by heating at 65 ° C. The radiolabelled product is then separated from the free labeled nucleotide through a spin column, Qiagen.
- the right external carotid artery is linked at the level of the bifurcation with the internal carotid and the common carotid is linked between the heart and the site of implantation of the catheter (polyethylene catheter, ID: 0.76).
- the latter previously filled with a heparin solution (100 units / ml), is inserted into the common carotid artery.
- mice are perfused with the infusion buffer (128 mM NaCl, 24 mM NaHCO 3 , 4.2 mM KCl, 2.4 mM NaH 2 PO 4 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.9 mM MgSO 4 , and 9 mM D-glucose. ).
- This buffer is filtered then bubble with a mixture containing 95%
- mice are perfused with the buffer containing the free oligonucleotide or the vectorized oligonucleotide.
- the oligonucleotide is radiolabelled with 32 P.
- the heart is stopped by section of the ventricles, this to avoid during the infusion reflux of perfusate.
- the right hemisphere is then perfused at a rate of 10 ml / min for 60 seconds after which the mouse is decapitated.
- the amount of radioactivity in the right hemisphere is then measured and brain penetration (Kin) is calculated. IV - Results.
Abstract
La présente invention a pour objet un composé constitué d'au moins un oligonucléotide lié à au moins un peptide vecteur capable de permettre son transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les 10 compositions pharmaceutiques les contenant utiles pour le prévention et/ou le traitement des maladies du système nerveux central.
Description
COMPOSITIONS POUR LA VECTORISATION D'OLIGONUCLEOTIDES A TRAVERS LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE ET LEUR UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES DU SYSTÈME NERVEUX CENTRAL.
La présente invention a pour objet un composé constitué d'au moins un oligonucleotide lié à au moins un peptide vecteur capable de transporter les oligonucléotides à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) . L'invention concerne aussi la préparation de ces composés et les compositions pharmaceutiques les contenant utiles pour le traitement des maladies du système nerveux central .
Les oligonucléotides antisens constituent une nouvelle catégorie d'agents thérapeutiques qui ont suscité l'intérêt pour lutter contre de nombreuses maladies. En effet, ils présentent la capacité d'inhiber l'expression d'un gène associé à la maladie, selon un mécanisme impliquant spécifiquement certaines séquences génétiques [Croo e, Exp . Opin. Invest . Drugs (1996) 14 :376-387 ; Temsamani, J. & Guinot, P., Biotechnol . Appl . Biochem (1997) 26, 65-71]. L'expression génétique est inhibée par l'hybridation de l' oligonucleotide avec des séquences de l 'ARN messager (ARNm) cible par appariement de base, mécanisme décrit par atson et Crick. Ces règles d' appariement de bases simples gouvernent l'interaction entre l' oligonucleotide antisens et la cible, ce qui permet de concevoir des oligonucléotides capables de cibler tout gène dont la séquence est connue. Un avantage majeur de cette stratégie sur les médicaments conventionnels tient à la spécificité potentielle de l'action des oligonucléotides antisens. En principe, un oligonucleotide d'une séquence spécifique de 17 nucléotides ou plus peut être conçu pour reconnaître spécifiquement tout gène isolé du génome humain. De plus, les chercheurs pensent qu'une inhibition au niveau génétique est potentiellement beaucoup plus
efficace qu'au niveau protéique pour lutter contre une maladie.
Or, les oligonucléotides phosphodiester qui existent à l'état naturel sont susceptibles d'être dégradés par des nucléases présentes dans les milieux biologiques et à l'intérieur des cellules, ce qui limite leur utilisation comme agents thérapeutiques. Plusieurs structures modifiées des oligonucléotides phosphodiesters ont donc été synthétisées et testées aussi bien in vi tro qu' in vivo . L'objectif de ces travaux était d'augmenter la demi-vie de l' oligonucleotide tout en conservant sa capacité à se lier avec un degré d'affinité et de sélectivité élevés à sa cible d'ARN. Bien qu'en principe chacun des trois composants d'un oligonucleotide, la base, le sucre et la liaison phosphodiester, puisse être modifié, les modifications les plus importantes ont été effectuées sur la liaison. Les oligonucléotides phosphorothioates, dans lesquels l'un des atomes d'oxygène de la liaison phosphodiester est remplacé par un atome de soufre, présentent un intérêt tout particulier [Agrawal, TIBTECH (1996) 14 ; 376-387] . Cette modification relativement simple a considérablement amélioré la résistance de l' antisens aux nucléases. Durant ces dernières années, les oligonucléotides phosphorothioates ont été les analogues les plus largement utilisés et nombre d'entre eux font l'objet d'essais cliniques [Agrawal, TIBTECH (1996) 14 ; 376-387 ; Temsamani, J. & Guinot, P., Biotechnol . Appl . Biochem (1997) 26, 65-71]. Les connaissances acquises lors de ces essais ont conduit les chercheurs à concevoir des oligonucléotides chimiquement plus élaborés.
Un autre paramètre pouvant influencer l'activité de l' oligonucleotide est son internalisation et son passage à travers les membranes cellulaires. De nombreuses études d' internalisation ont montré que ces oligonucléotides traversent très peu les membranes cellulaires (Lebleu, B.
et al., Cijba Found Symp 1997;209:47-54 ; Stein, CA. & Narayanan., Curr Opin Oncol 1994 6:587-94) et, en général, ne passent pas à travers la barrière hémato-encéphalique. En effet, plusieurs études de pharmacocinétique et de biodistribution ont montré que les oligonucléotides s'accumulent dans la plupart des organes sauf le cerveau (Beng et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2001.11:15- 27 ; Agrawal et al., Proc Natl Acad Sci U S 1991 ,-88:7595-9) . En conséquence, plusieurs stratégies ont été proposées pour améliorer le propriétés des oligonucléotides :
Synthèse d' oligonucléotides modifiés pour améliorer les propriétés physico-chimiques de la molécule (Hughes, et al., In Delivery Stratégies for Antisense Oligonucléotides Therapeutics, Edited by S. Akhtar ; 1995, CRC Press) . La plupart de ces modifications se sont révélées toxiques et/ou diminuent l'affinité de l' oligonucleotide à sa cible ARN. - Utilisation de particules telles que les liposomes ou les nanoparticules (Juliano & Akhtar (1992) Antisense Res Dev 2 :165 ; Chavany et al 1992 ; Pharm Res 9 :441) . Bien que des résultats intéressants aient été obtenus in vitro, les résultats in vivo ont été décevants. - Conjugaison de l' oligonucleotide à des anticorps monoclonaux tels que le 0X26 (Boado, et al . , J Pharm Sci 1998 87 :1308-1315) ou à des polymères tels que la polylysine (Leonetti, et al., 1990 ; Bioconj . Chem 1 :149). Le couplage de ces macromolécules est complexe et peut engendrer dans certains cas le développement d'une immunogénicitë chez l'animal.
La Demanderesse a mis en évidence que des vecteurs peptidiques linéaires, tels que les peptides linéaires dérivés de peptides naturels comme la Protégrine et la Tachyplésine transportent des molécules actives à travers
la BHE et améliorent les propriétés pharmacologiques de ces molécules. Les travaux et résultats concernant ces peptides linéaires et leur utilisation comme vecteurs de molécules actives ont été décrits dans les demandes de brevet français N° 98/15074 déposée le 30 Novembre 1998 et dans la demande de brevet français N° 99/02938 déposée le 26 Novembre 1999.
La Demanderesse a maintenant mis en évidence que ces peptides linéaires sont capables d'augmenter très significativement la pénétration d' oligonucléotides à travers la barrière hémato-encéphalique.
La présente invention a donc pour objet des composés constitués d'au moins un oligonucleotide lié à au moins un peptide linéaire capable de vectoriser ledit oligonucleotide à travers la barrière hémato-encéphalique.
Plus particulièrement ces peptides linéaires sont des dérivés de protégrines ou de tachyplésines . Les Protégrines et Tachyplésines sont des peptides antibiotiques naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines. On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V.N. Kokryakov & col. 1993, FEBS lett . 327, 231-236) :
PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV-NH2
PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-4 : RGGRLCYCRG ICFCVGR-NH2 PG-5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
6
ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
Dans une seconde forme de mise en œuvre, l'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante : BXXXBXXXBXXXXBBXB (II) , dans lesquelles :
- B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique , l'acide diaminopropionique, l'ornithine. - X est choisi parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, 1 ' isoleucine, la leucine, la cystem • e, la cysteme.Α.cm, la penicillamme, la methionme, le serine, la thréonine, 1 ' asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2 -aminotétraline carboxylique, la 4- bromophényalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la béta-cyclohexyalanine, la 3 , 4-dichlorophényalanine, la 4-fluorophényalanine, 1 ' homoleucine, la bêta-homoleucine, 1 ' homophényalanine, la 4-méthylphényalanine , la 1- naphtyalanine, la 2- naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3- pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine,
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul . Tokyo 41, 978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym. 186, 160-174), désignées PI et P2 , dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de 1' hémolymphe de deux crabes, Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines Tl, T2 et T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines PI et P2 :
PI : RR CFRVCYRGFCYRKCR-NH2 P2 : RR CFRVCYKGFCYRKCR-NH2
Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques
(lysines et arginines) et possèdent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures parallèles. Ces trois familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993, Febs
Let. 327, 231-236) .
Dans une première forme de mise en œuvre, l'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante :
BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante :
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique,
ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
A titre d'exemples d' oligonucléotides mis en œuvre dans le cadre des composés de l'invention, on peut citer des oligonucléotides phosphodiesters, phosphorothioates, methylphosphonates, hybrides comprenant une partie ARN et une partie ADN, les PNA (Peptide Nucleic acids) , etc. Il s'agit avantageusement d' oligonucléotides antisens comme défini précédemment.
La liaison entre 1 ' oligonucleotide et le peptide linéaire dans les composés de l'invention est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules .
Cette liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur l'oligonucléotide, soit sur les deux. Ce bras de liaison s'il est présent doit être acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement tant du peptide que de l'oligonucléotide. On peut citer à titre d'exemple non exhaustif de tels linkers des molécules contenant des liaisons de type amide, ester, carbamate, carbonate, disulfure, anhydride, hydrazone, hydrazine, imine, éther, aminé, un bras de liaison alkyle, aryle, alkylaryle ainsi que leurs divers dérivés insaturés ou polyinsaturés . Ce linker peut être ramifié et porter
divers substituants fonctionnalisés ou non tels que alcool, aminé, carboxyle, sulfhydrile.
Comme groupes fonctionnels, on peut citer : -OH, -
SH, -COOH, ou -NH2. Ainsi, le ou les oligonucléotides peuvent être liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide.
Le ou les peptides linéaires peuvent être liés à l'oligonucléotide, au niveau de ses fonction 3' -OH et/ou 5' OH ou bien sur un autre site tel que la base ou le sucre.
Un type de liaison préféré entre le ou les oligonucléotides et le ou les peptides linéaires implique au moins un pont disulfure. En effet, ce type de liaison se caractérise par sa stabilité dans le plasma après injection du composé, puis une fois que les composés de l'invention ont traversé la barrière hémato-encéphalique, ledit pont disulfure est réduit en libérant l'oligonucléotide. La liaison peut être effectuée en n'importe quel site du peptide comme indiqué précédemment.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement des maladies du système nerveux central (SNC) , comme le cancer du cerveau ou les maladies neurodégênératives consistant à administrer à un sujet souffrant d'une telle maladie une quantité efficace d'un composé décrit précédemment. L'invention concerne donc une composition pharmaceutique pour le traitement des maladies du système nerveux central comprenant à titre d'agent actif au moins un composé décrit précédemment . Pour le traitement de ces maladies, on peut citer les gènes cibles suivants : protéine kinase pour le cancer, protéine bêta amyloïde pour la maladie d'Alzheimer, le TNF- alpha pour la neuroprotection, le récepteur dopamine pour la maladie de Parkinson.
Une forme de réalisation particulière de l'invention consiste à associer dans la composition le composé décrit précédemment avec une ou plusieurs substances utiles pour le traitement des maladies du SNC. A titre d'exemples de telles substances, on peut citer un agent anticancéreux, comme la carmustine pour le traitement du cancer du cerveau, le L-Dopa pour le traitement de la maladie de Parkinson, ou la galantamine pour le traitement de la maladie d'Alzheimer. Une composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie intraveineuse, par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voie orale, par voie rectale, par voie nasale, par voie transdermique, par voie pulmonaire.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la préparation d'un composé constitué d'un oligonucleotide et d'un peptide linéaire, sa pénétration et son activité. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de 1 ' oligonucleotide . - La figure 2 illustre les résultats de pénétration cellulaire comparant l' internalisation entre le composé 1 (oligonucleotide seul) et le composé 2 (oligonucleotide vectorisé) .
- La figure 3 illustre le passage à travers la barrière hémato - encéphal ique du composé 1
(oligonucleotide) , le composé 2 (oligonucleotide vectorisé) .
I - Synthèse Chimique de l'oligonucléotide vectorisé.
1) Synthèse du peptide vecteur.
Le peptide SynB3 de formule SEQ ID NO. 1 : RRLSYSRRRF est assemblé sur phase solide selon une stratégie Fmoc/tu, clivé et déprotégé par l'acide trifluoroacétique, puis purifié par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté (>95%) et son identité sont confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse.
2) Synthèse de l'oligonucléotide. L'oligonucléotide phosphodiester complémentaire à l'ARN c-myc a été assemblé sur phase solide (Biosearch 8700, Milligen) . Après déprotection, l'oligonucléotide a été purifié par HPLC echangeuse d' ions et désalé par une colonne SepPak C18. Dans le cas des expériences de pénétration cellulaire, un groupe fluorescent (Fluorescine) a été rajouté à l'oligonucléotide.
3) Couplage de l'oligonucléotide sur SynB3.
L'oligonucléotide phosphodiester (1. équivalent) est solubilisé dans du tampon PBS (500 ul) et le vecteur SynB3 (2 équivalents) est solubilisé dans du DMF (100 ul) . Le peptide vecteur est rajouté lentement à la solution d' oligonucleotide et le mélange est incubé pendant environ
8 heures à 55 °C. Le rendement de la réaction est mesurée par une analyse d'une aliquote par spectroscopie de masse.
Le produit est ensuite purifié par HPLC semi-préparative
(colonne C18 10mm/250mm) en contrôlant l'absorbance à 215 nm, 280 nm et 480 nm et 525 nm (pour la fluorescence) . Le gradient utilisé est de 0 à 60% acétonitrile en 60 min.
II - Composés testés .
Les composés testés sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
11
Tableau 1
III - Essais utilisés.
1) Pénétration Cellulaire.
La pénétration cellulaire des composés a été étudiée par cytometrie de flux. Les cellules K562 (obtenues de l'ATCC) sont cultivées dans du milieu RPMI avec 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules sont diluées à 0,3 x 106 cellules par ml, 24 heures avant l'expérience. La pénétration cellulaire a été mesurée par cytometrie de flux en utilisant un FACScan (Becton Dickinson, USA) . Les composés fluorescents (concentration finale 5 μM) sont incubés avec les cellules K562 (5 x 105 cellules par ml) dans un milieu Optimem à 37°C pendant des temps variables
(Le volume final était de 0.5 ml). Après l'incubation, les cellules sont lavées deux fois et ensuite re-suspendues dans 0,5 ml de PBS froid. La pénétration a été ensuite analysée par FACS. Les fluorophores sont excités à 488 nm et la fluorescence est mesurée à 525 nm. Un histogramme de l'intensité de fluorescence (pour lxlO4 cellules) est obtenu et la moyenne de distribution était considérée comme représentative de la quantité de peptide associé aux cellules. Les résultats sont représentés en pourcentage de cellules qui ont incorporé la fluorescence.
2) Marquage au 3 '-terminal.
L'oligonucléotide libre ou vectorisé a été marqué à son 3' -OH terminal grâce à l'enzyme terminal transferase (Promega) en suivant le protocole décrit par le
fournisseur. Brièvement, environ 10 pmoles de composé sont inbubés avec la terminal transférase à 37°C en présence de dideoxyadenosine triphosphate radiomarquée au phosphore 32 (32P-ddATP) . Après 30 min d'incubation, la réaction est arrêtée par chauffage à 65°C. Le produit radiomarque est ensuite séparé du nucléotide marqué libre grâce à une colonne de gel exclusion (spin column, Qiagen) .
3) Test de Perfusion Cérébrale in situ. Des souris (20-25 g, Iffa-Credo ; l'Arbresle,
France) sont anesthésiées . Après exposition de la carotide commune, l'artère carotide externe droite est liée au niveau de la bifurcation avec la carotide interne et la carotide commune est liée entre le cœur et le site d'implantation du cathéter (cathéter polyéthylène , ID :0.76). Celui-ci, préalablement rempli par une solution d'héparine (100 unités/ml) est inséré dans la carotide commune. Les souris sont perfusées avec le tampon de perfusion (128 mM NaCl, 24 mM NaHC03, 4,2 mM KC1, 2,4 mM NaH2P04, 1.5 mM CaCl2, 0.9 mM MgS04, et 9 mM D-glucose) . Ce tampon est filtré puis bulle par un mélange contenant 95%
02/5% C02 afin de maintenir le pH proche de 7,4 et d'alimenter le cerveau en oxygène au cours de la perfusion.
Les souris sont perfusées avec le tampon contenant l'oligonucléotide libre ou l'oligonucléotide vectorisé. Dans chaque produit l'oligonucléotide est radiomarque au 32P . Juste avant le début de la perfusion, le cœur est arrêté par section des ventricules, ceci afin d'éviter au cours de la perfusion un reflux du perfusât. L'hémisphère droit est alors perfusé à une vitesse de 10 ml/min pendant 60 secondes après quoi la souris est décapitée. La quantité de radioactivité dans l'hémisphère droit est alors mesurée et la pénétration cérébrale (Kin) est calculée.
IV - Résultats.
1) Pénétration cellulaire
Nous avons d'abord comparé l' internalisation de l'oligo libre (composé 1) par rapport à celle de l'oligonucléotide vectorisé (composé 2). Les deux produits étaient marqués à la fluorescine au 3' -OH de 1 ' oligonucleotide . Les résultats représentés dans la Figure 2 montrent les cinétiques d' internalisation des deux produits. L'oligonucléotide libre a une pénétration très faible. Ainsi, après 90 min d'incubation, seulement 3% des cellules sont fluorescentes. Par contre, pour l'oligonucléotide vectorisé, environ 60% des cellules ont incorporé l'oligonucléotide. Ceci indique que la vectorisation permet d'améliorer de façon significative 1 ' internalisation de 1 ' oligonucleotide .
2) Pénétration dans le cerveau. Dans cette étude, nous avons comparé la pénétration dans la BHE de l'oligonucléotide libre avec celle de l'oligonucléotide vectorisé. Les deux produits ont été perfusés dans le cerveau de la souris. Après 60 secondes de perfusion dans le tampon, la pénétration des produits est estimée par la constante d'influx ou Kin en ul/sec/g. La figure 3 montre que la vectorisation de l'oligonucléotide par le vecteur SynB3 augmente son passage dans le cerveau d'environ 3 fois après une perfusion de 60 secondes dans du tampon.
Claims
REVENDICATIONS
1) Un composé constitué d'au moins un oligonucleotide lié à au moins un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines.
2) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire est choisi parmi ceux de formules (I) ou (II) suivantes : BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I)
BXXXBXXXBXXXXBBXB (II) , dans lesquelles : les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
3) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide linéaire est choisi parmi ceux de formules (I) ou (II) suivantes :
BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) BXXXBXXXBXXXXBBXB (II) , dans lesquelles :
B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, l'ornithine,
X est choisi parmi glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l' isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystem • e -Δ.CTΩ , la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, 1 ' asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2 -aminotétraline carboxylique, la 4-bromophényalanine, tert -Leucine , la 4 - chlorophénylalanine , la béta- cyclohexyalanine , la 3 , 4 -dichlorophényalanine, la 4- f luorophényalanine, l' homoleucine, la béta-homoleucine, 1 ' homophényalanine , la 4-méthylphényalanine, la 1- naphtyalanine, la 2- naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3- pyridyalanine, la [2-thiënyl] alanine, ou lesdits peptides de formules (I) ou (II) , sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II) .
4) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est choisi parmi les oligonucléotides phosphodiesters, phosphorothioates, methylphosphonates, hybrides comprenant une partie ARN et une partie ADN, les PNAs.
5) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est un antisens.
6) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre l'oligonucléotide et le peptide linéaire est
choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules.
7) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre l'oligonucléotide et le peptide linéaire est une liaison directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
8) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison entre l'oligonucléotide et le peptide linéaire est réalisée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur l'oligonucléotide, soit sur les deux.
9) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ou les oligonucléotides sont liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du ou des peptides.
10) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ou les peptides linéaires sont liés à l'oligonucléotide, au niveau de ses fonctions 3' -OH et/ou 5 'OH ou bien sur un autre site tel que la base ou le sucre .
11 ) Une composition pharmaceutique pour le traitement des maladies du système nerveux central , caractérisée en ce qu' elle comprend à titre d' agent actif au moins un composé selon l ' une quelconque des revendications 1 à 10 .
12) Une composition pharmaceutique pour le traitement des maladies du système nerveux central selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une ou plusieurs autres substances utiles pour le traitement des maladies du système nerveux central .
13) Utilisation d'un peptide linéaire comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies du système nerveux central, ledit peptide étant lié à au moins un oligonucleotide pour vectoriser celui-ci à travers la BHE.
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