KR20220167770A - 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료용으로 사용하려는 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 전달하기 위한 전달체에 관한 것으로 세포 내에서 타겟 단백질의 억제하거나, 타겟 단백질의 발현을 촉진시키기 위해, 펩타이드-지질의 결합체를 제조하고, 올리고뉴클레오티드를 포함한 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자를 이용하여 세포 내로 올리고뉴클레오티드가 효과적으로 전달된 것을 확인하였다. 또한, 올리고뉴클레오티드에 의해 암을 유발하는 단백질의 발현을 감소시켰고, 암을 발생시킨 동물 모델에서 항암 효과가 있음을 확인함으로써, 상기 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자가 올리고뉴클레오티드의 전달에 효과적임을 확인할 수 있었다.

Description

타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물{Nanoparticle Comprising Peptide-Lipid Conjugate for Delivering Oligonucleotide into Target Cell and Pharmaceutical Composition Comprising Thereof}
본 발명은 세포 내에서 타겟 단백질을 억제하거나, 타겟 단백질의 발현을 촉진시키기 위한 올리고뉴클레오티드가 탑재된 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드는 특히 siRNA, mRNA 등의 형태로 암, 감염성 질환을 유발하는 유전자를 제어하기 위한 치료제로서 많이 개발하고 있다. 최근에는 코로나19 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 mRNA 형태로 주입하여 면역반응을 일으키는 mRNA 백신이 FDA의 승인은 받으면서, mRNA의 응용이 주목을 받고 있다. mRNA는 체내의 mRNA를 인공적으로 합성하여 사용하기 때문에 독성이 없다. 그러나, siRNA, mRNA는 생체 내에서 뉴클레아제(nuclease)에 의해 빠르게 분해되며, 음전하를 띄고 있고, 특정 병소로의 타겟팅이 불가능하다. 또한, 세포질 내에서 작용해야 그 효과가 나타나나, 음전하 및 사이즈가 크기 때문에 그 자체로 세포막을 투과할 수 없다. 따라서 이런 한계점을 극복하기 위해, 세포 내로 안정하게 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있는 전달체가 필요하다.
가장 많이 사용되고 있는 전달체는 지질나노입자이며, 다양한 양이온성 지질을 사용하여 올리고뉴클레오티드 전달체가 알려져 있다(US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US2009/0263407 및 US 2009/0285881 및 PCT 특허 출원: WO 2009/086558, WO 2009/127060, WO 2009/132131, WO2010/042877, WO 2010/054384, WO 2010/054401, WO 2010/054405, WO 2010/054406 및 WO 2010/105209). CLinDMA 및 DLinDMA와 같은 전통적인 양이온성 지질은 간으로 올리고뉴클레오티드 전달을 위해 이용되어 왔으나, 고용량에서 간 독성과 함께 비-최적 전달 효율을 겪는 것으로 알려져 있다.
지질나노입자는 양이온성 지질, 콜레스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하여 제조하고 있으며, 양이온성 지질은 올리고뉴클레오티드가 세포막을 통과하도록 하고, 콜레스테롤은 올리고뉴클레오티드의 형태를 유지하도록 하며, PEG는 생체내에서 지질나노입자가 long circulation을 할 수 있도록 한다. 그러나, PEG가 PEG에 대한 항체를 생성시켜 아나필락시스 반응을 유도한다는 보고들이 나오고 있다. 따라서, 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 안전하고 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 올리고뉴클레오티드 전달체 기술이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 안전하면서도 효과적으로 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있는 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자를 제조하기 위하여, 타겟 세포 표면 인식을 위한 서열과 세포투과 기능성, 엔도좀에서의 탈출 촉진, 올리고뉴클레오티드와 결합할 수 있는 서열로 구성된 펩타이드와 올리고뉴클레오티드를 보호할 수 있는 지질을 이용하여 펩타이드-지질 결합체를 제조하고, 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자를 이용하는 경우, 세포 내로 올리고뉴클레오티드가 효과적으로 전달되는 것을 확인하였으며, 탑재된 올리고뉴클레오티드에 의해 암을 유발하는 단백질의 발현이 감소되고, 암을 발생시킨 동물 모델에서 항암 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 안전하면서도 효과적으로 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있는 펩타이드-지질 결합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 올리고뉴클레오티드의 세포 내 전달용 나노입자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 펩타이드-지질의 결합체를 기본단위로 하는 펩타이드-지질 결합체를 제공한다:
[화학식 1]
A-B-C-D-E
여기서, A는 탄소수가 12~20개인 지방산 또는 양이온성 지질;
B는 엔도좀의 탈출을 촉진하는 펩타이드;
C는 RNA 결합 펩타이드;
D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드;
E는 타겟 세포 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용을 제공한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 결합된 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자는 치료용 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 효과적으로 전달하며, 올리고뉴클레오티드에 의해 타겟 단백질의 발현이 감소하거나, 발현을 증가시켜 치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 올리고뉴클레오티드가 펩타이드-지질의 결합체의 RNA 결합 펩타이드에 먼저 결합한 후에, 자기조립(self-assembly)에 의해서 나노입자를 형성하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 mRNA에 타겟 세포 표면 인식, 세포투과 기능 펩타이드를 화학적 가교제를 사용하여 연결한 모식도이다.
도 3A는 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 각 반응 비율별로 아가로스 젤에 전기영동한 결과, TEM으로 형성된 나노입자 관찰, 나노입자의 사이즈 분포를 나타낸 결과이고, 도 3B는 siRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 각 반응 비율별로 아가로스 젤에 전기영동한 결과, TEM으로 형성된 나노입자 관찰, 나노입자의 사이즈 분포를 나타낸 결과이다.
도 4A는 mRNA 단독과 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 세포에 처리했을 때, 세포 내에 투과한 정도를 관찰한 결과이고, 도 4B는 siRNA 단독과 siRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 세포에 처리했을 때, 세포 내에 투과한 정도를 관찰한 결과이다.
도 5는 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자에 의한 세포 내 단백질의 발현량을 관찰한 웨스턴 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 세포에 처리한 후, mRNA에서 발현된 단백질에 의해 active KRAS가 감소하는 것과 하위 신호인 pERK가 감소하는 것을 확인한 웨스턴 결과이다.
도 7은 KRAS siRNA와 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자에 의한 변화된 세포 내 KRAS mRNA의 양을 측정한 그래프이다.
도 8은 H358에 의해 폐암을 유발한 Xenograft 모델에서 mRNA와 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자에 의한 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 세포 내로 기능성 올리고뉴클레오티드를 안전하고, 효율적으로 전달할 수 있는 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자를 제조하였다. 먼저, 타겟 세포 표면 인식을 위한 서열과 세포투과 기능성, 엔도좀에서의 탈출 촉진, 올리고뉴클레오티드와 결합할 수 있는 서열로 구성된 펩타이드와 올리고뉴클레오티드를 보호할 수 있는 지질을 이용하여, 펩타이드-지질 결합체를 제조하고, 상기 펩타이드-지질 결합체에 올리고뉴클레오티드를 결합시킨 나노입자를 제조하였다. 상기 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자를 이용하는 경우, 세포 내로 올리고뉴클레오티드가 효과적으로 전달되며, 탑재된 올리고뉴클레오티드에 의해 암을 유발하는 단백질의 발현이 감소되고, 암을 발생시킨 동물 모델에서 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1의 펩타이드-지질의 결합체를 기본단위로 하는 펩타이드-지질 결합체에 관한 것이다:
[화학식 1]
A-B-C-D-E
여기서, A는 탄소수가 12~20개인 지방산 또는 양이온성 지질;
B는 엔도좀의 탈출을 촉진하는 펩타이드;
C는 RNA 결합 펩타이드;
D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드;
E는 타겟 세포 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서,
상기 A는 지질로서 탄소수가 12에서 20개인 포화지방산 및 불포화지방산 또는 양이온성 지질인 것을 특징으로 할 수 있다. 양이온성 지질로는3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에탄 카바모일 콜레스테롤(DC-Chol); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 염(DDAB); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 클로라이드(DL-EPC); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N-N-N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N-N-N-디메틸암모늄 클로라이드(DODMA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 클로라이드(DOTMA); N,N-디옥타데실-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트(DOSPA); 1,2-디미리스틸 옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS); 양이온성 개질기에 접합된 중성 지질; 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 예컨대 리포펙틴(LIPOFECTIN, GIBCO), 리포펙타민(LIPOFECTAMINE, GIBCO), 트랜스펙탐(TRANSFECTAM, Promega)과 같이, 상업적으로 이용가능한 제제에서 다수의 양이온성 지질을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 부분은 화학식 1에서 0 내지 약 60.0 몰 퍼센트, 또는 제제 중 지질의 약 5.0 내지 약 50.0 몰 퍼센트 범위의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 B는 엔도좀의 탈출을 촉진하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 C는 RNA가 결합하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 E는 타겟 세포 표면을 인식하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 B는 히스티딘 4~12개로 구성된 펩타이드이며, 상기 D는 알지닌 4~12개, 라이신 4~12개, 시스테인 2개로 구성되는 군에서 선택되는 펩타이드 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 C는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 1: LKKLLKLLKKLLKLAG
서열번호 2: IKKILIKIIKKLIKLAG
서열번호 3: LRRLLRLLRRLLRLAG
서열번호 4: LKKLLKLLOrnKLLDapLAG
서열번호 5: LRRLLRLLOrnRLLDapLAG
서열번호 6: LRKIIRLIOrnKLLDapLAG
서열번호 7: LKKLLKLLOrnKLLKLAG
서열번호 8: WKKLLKLLKKLLKLAG
서열번호 9: WRRLLRLLRRLLRLAG
서열번호 10: WRKLLRLLKKLLKLAG
서열번호 11: LKKLLDabLLKKLLKWAG
서열번호 12: LRRLLDabLLRRLLRWAG
서열번호 13: LKRLIDabIIKKLIKWAG
서열번호 14: LKKLLKWLOrnKLLDapLAG
서열번호 15: LRRLLRWLOrnRLLDabLAG
Orn = Ornithine, Dab = 1,4-diaminobutyric acid, Dap = 1,3-diaminopropionic acid.
본 발명에 있어서, 상기 E는 기존의 타겟 세포 표면에 결합하는 서열이며, 파지 디스플레이 기법을 통해, 신규로 발굴하여 적용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 E는 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 16: CAIYPRH
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 A-B는 아마이드 결합을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 A-B의 아마이드 결합은 화학적 합성방법으로 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 B-C-D-E는 화학적 합성기법 또는 재조합 발현기법으로 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 B-C-D-E는 고체상 펩타이드 합성방법에 의해 합성한 후, A를 화학적으로 아미이드 결합을 형성시킬 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, siRNA, miRNA 또는 mRNA일 수 있으며, 타겟 유전자의 발현을 억제시키거나 증가시키는 기능을 가지는 것이 바람직하다. 상기 siRNA는 종양유발 단백질, 질병을 유발하는 단백질을 코딩하는 염기서열에 대한 상보적인 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 돌연변이 KRAS에 대한 mRNA를 사용하여, 돌연변이 KRAS의 발현을 억제하였다. KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열은 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열을 가지는 mRNA를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 17: KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열 1
5’ cap-5’UTR-
AUGGAAGUCCAAUUGUUGGAAUCUGGGGGUGGGCUUGUCCAACCUGGUGGUUCACUCCGUCUGAGCUGCGCCGCUUCCGGAUUCACUUUCUCCACCUUUUCUAUGAAUUGGGUUCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACUUGAGUGGGUUAGCUAUAUCAGCAGGACCAGUAAAACCAUCUACUACGCCGACAGCGUUAAGGGAAGGUUCACUAUAUCCCGGGACAAUUCUAAGAAUACUUUGUACUUGCAAAUGAACUCUUUGCGGGCAGAAGAUACUGCUGUCUACUAUUGUGCACGAGGUAGGUUUUUUGAUUAUUGGGGUCAGGGGACCCUCGUAACCGUUUCCAGUGGGGGCAGCGAGGGUAAGAGCUCCGGUUCAGGGUCAGAAUCUAAAAGCACUGGUGGCUCCGAUAUACAAAUGACCCAGAGUCCAAGCUCUCUUUCAGCCAGCGUGGGAGACAGGGUGACCAUCACCUGUCGAGCAUCUCAAUCCAUUUCAUCAUACCUCAAUUGGUAUCAACAGAAGCCUGGGGAAGCACCAAAGUUGCUUAUUUAUUCUGCCAGCGUACUGCAAAGUGGCGUACCUUCCCGCUUCUCCGGGUCUGGGAGUGGCACUGAUUUUACCCUCACAAUUAGCAGCCUGCAACCCGAGGACUUCGCUACAUACUACUGCCAACAAAGUGUAAUGAUACCCAUGACAUUCGGGCAAGGCACAAAAGUCGAGAUAAAGGGAAGUGGAGGAGGUGGCUCUAUGCCCCGCCGCGCUGAGAACUGGGAUGAGGCCGAAGUUGGUGCUGAAGAGGCCGGAGUUGAAGAAUAUGGGCCAGAAGAAGAUGGCGGUGAGGAAAGCGGGGCUGAAGAGAGCGGUCCAGAGGAGUCUGGUCCAGAGGAACUUGGAGCUGAGGAGGAGAUGGAGGCCGGACGUCCACGUCCUGUCCUGCGAUCAGUUAACUCAAGGGAGCCCUCACAGGUUAUCUUUUGUAAUCGAAGCCCUCGCGUGGUUUUGCCCGUCUGGCUCAACUUCGAUGGUGAACCCCAACCAUACCCAACCCUCCCCCCUGGUACCGGGCGGAGGAUUCAUUCCUAUCGGGGACACCUUUGGCUCUUCCGAGACGCUGGGACUCACGAUGGCCUGUUGGUCAAUCAGACCGAACUGUUUGUGCCCAGCCUGAACGUAGACGGGCAGCCAAUUUUCGCAAACAUAACACUGCCCGUAUAUACAUUGAAAGAAAGGUGUCUUCAGGUGGUACGCAGUCUGGUUAAACCAGAAAACUAUAGGCGUCUGGAUAUCGUGCGCAGCCUCUAUGAGGACCUUGAAGACCACCCUAACGUGCAAAAGGACCUCGAGCGGCUCACUCAGGAGCGCAUAGCUCAUCAGCGCAUGGGAGAUGAAAACCUUUACUUUCAGGGUGGGAGCGGCGGCAGCGGCGGGAGUCAUCAUCACCAUCAUCAUCACCACUGA-3’ UTR- 3‘ poly A tail
서열번호 18: KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열 2
5’ cap-5’UTR-
AUGGAAGUGCAACUUCUCGAAUCUGGAGGGGGGUUGGUACAACCCGGCGGCAGCUUGCGCUUGUCCUGUGCUGCCAGUGGGUUCACAUUUUCUACAUUCUCUAUGAACUGGGUUAGACAAGCCCCUGGCAAAGGGCUGGAAUGGGUGAGCUAUAUAAGUCGCACCUCCAAAACUAUUUACUAUGCAGAUAGUGUCAAGGGACGAUUUACUAUCAGCAGAGAUAACUCUAAGAACACUCUGUAUCUCCAGAUGAAUUCCCUUCGAGCCGAAGACACCGCAGUAUAUUACUGUGCUAGAGGGCGCUUCUUCGACUACUGGGGGCAAGGCACUCUGGUAACUGUCAGUAGCGGGGGUUCUGAGGGCAAAAGUUCAGGAUCUGGGUCCGAGUCUAAGUCAACUGGCGGGAGCGACAUACAAAUGACUCAGAGCCCCAGUAGCCUGAGCGCCUCCGUUGGUGACAGAGUCACUAUUACAUGUCGGGCAUCUCAAUCUAUUUCCUCUUAUCUUAACUGGUAUCAGCAAAAGCCAGGCGAAGCCCCCAAACUCCUGAUAUACUCCGCUAGUGUUCUUCAGAGUGGCGUUCCUAGUCGCUUCAGCGGAUCCGGAAGUGGCACUGAUUUUACACUUACAAUUAGUUCCUUGCAGCCUGAAGAUUUUGCCACAUACUACUGUCAGCAAUCAGUCAUGAUUCCCAUGACCUUUGGGCAAGGGACCAAAGUUGAGAUCAAAGGCUCCGGAGGAGGAGGGUCUAUGGAAAACAGAUGGCAAGUUAUGAUCGUUUGGCAAGUAGAUCGUAUGCGAAUACGCACAUGGAAAUCACUGGUAAAGCACCACAUGUAUGUGUCAGGCAAAGCACGAGGAUGGUUUUAUCGUCAUCACUAUGAGUCACCACAUCCCCGCAUCAGCUCUGAGGUGCACAUACCACUCGGUGAUGCUCGUCUGGUCAUAACUACCUACUGGGGCCUCCACACUGGUGAAAGAGAUUGGCACCUCGGCCAAGGAGUAAGUAUAGAAUGGCGCAAAAAGCGUUAUUCAACCCAAGUGGAUCCUGAGUUGGCAGAUCAGUUGAUCCACUUGUAUUACUUUGACUGCUUCAGCGAUAGUGCUAUUCGGAAGGCCCUCCUCGGGCACAUUGUAAGCCCACGGUGCGAGUAUCAAGCUGGUCAUAACAAGGUUGGUAGCCUCCAGUACUUGGCUUUGGCUGCACUUAUAACACCCAAAAAGAUAAAACCUCCACUCCCCUCAGUGACUAAACUCACUGAGGAUCGUUGGAACAAACCCCAGAAAACCAAGGGGCACAGGGGUUCACACACCAUGAAUGGCCACGAGAAUUUGUAUUUCCAAGGGGGAUCCGGGGGCAGUGGAGGGUCUCACCAUCAUCACCACCACCACCAUUGA-3’ UTR-3’ poly A tail
본 발명의 일 실시예에서, siRNA를 사용하여 KRAS의 발현을 억제하였으며, 상기 siRNA는 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 19 및 서열번호 20: KRAS의 발현을 저해하는 siRNA 서열
서열번호 19(Sense): CAGCUAAUUCAGAAUCAUU
서열번호 20(AntiSense): AAUGAUUCUGAAUUAGCUG
본 발명에 있어서, 상기 siRNA는 천연 형태 또는 화학적으로 변형된 형태의 siRNA이거나, 5' 말단에 sulfhydryl group 또는 amine group으로 치환된 siRNA를 사용하여 세포투과 및 타겟 인식 펩타이드에 있는 시스테인의 sulfhydryl group과 화학적 가교제를 사용하여 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA는 발현을 증가시키려는 타겟 단백질, 재조합 키메라 단백질, 바이러스 항원을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다. 3' cap과 5' poly A tail을 가진 천연 구조의 mRNA이거나, 5' 말단에 sulfhydryl group 또는 amine group을 결합시킨 후에 세포투과 및 타겟 인식 펩타이드에 있는 시스테인의 sulfhydryl group과 화학적 가교제를 사용하여 결합시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1을 제조한 이후, 올리고뉴클레오티드를 화학식 1, 구체적으로는 화학식 1의 C에 결합시키고, 일정 시간 방치하면 자기조립에 의해 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 나노입자는 10~200nm의 크기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA 또는 mRNA와 펩타이드-지질 결합체의 분자량 비율은 1:1~1:100인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA, mRNA는 항암제 치료제로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 세포 내 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 암은 편평상피암, 기저세포암, 선암, 간세포암, 신세포암, 방광암, 장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁암, 결장암, 식도암, 두부암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 백혈병, 양성 및 악성 림프종, 특히 부키트 림프종 및 비-호지킨 림프종, 양성 및 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 에윙육종, 혈관육종, 카포시 육종, 지방육종, 근육종, 신경상피육종, 활막육종, 신경육종, 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 뇌질피복세포증, 교아세포종, 신경아세포종, 신경절세포종, 신경절교세포종, 수아종, 송과세포종, 수막종, 뇌막육종, 신경섬유종 및 신경초종을 포함하는 육종, 고환암, 갑상선암, 암육종, 호긴스병, 윌름 종양 또는 테라토칼시노마스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 천식, 자가면역 질환, 류마티스관절염, 다발성 경화증, 섬모질환, 구개열, 당뇨병, 심장 질환, 고혈압, 염증성장질환, 정신 지체, 기분 장애, 비만, 굴절 이상, 불임, 앵겔만 증후군, 카나반병, 만성 소화 장애증, 샤르코마리투드병, 낭포성 섬유증, 듀켄시근이영양증, 혈색소증, 혈우병, 클리네펠터 증후군, 신경섬유종증, 페닐케톤뇨증, 상염색체 우성 다낭성 신종(PKD1 또는 PKD2), 프라더-윌리 증후군, 겸상적혈구빈혈증, 테이삭스병, 터너증후군, HIV 감염 질환 또는 HCV 감염 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡술, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 제제는 당분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다. 그러나, 상기 기재는 예시적인 것으로, 본 발명이 적용 가능한 제제는 상기 기재에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 허용가능한 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 보조제는 예컨대 담체일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 그러나, 상기 기재는 예시적인 것으로, 본 발명에서 사용 가능한 보조제나 담체는 상기 기재에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 질병은 암, 염증성 질환, 천식, 자가면역 질환, 류마티스관절염, 다발성 경화증, 섬모질환, 구개열, 당뇨병, 심장 질환, 고혈압, 염증성장질환, 정신 지체, 기분 장애, 비만, 굴절 이상, 불임, 앵겔만 증후군, 카나반병, 만성 소화 장애증, 샤르코마리투드병, 낭포성 섬유증, 듀켄시근이영양증, 혈색소증, 혈우병, 클리네펠터 증후군, 신경섬유종증, 페닐케톤뇨증, 상염색체 우성 다낭성 신종(PKD1 또는 PKD2), 프라더-윌리 증후군, 겸상적혈구빈혈증, 테이삭스병, 터너증후군, HIV 감염 질환 또는 HCV 감염 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법, 용도 및 사용은 본 발명에 따른 나노입자를 포함하며, 상기 나노입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상술한 나노입자 및 약학적 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 펩타이드 및 펩타이드 -지질 결합체의 합성
아미노산 및 합성에 필요한 시약은 GL biochem과 Sigma-Aldirich에서 구입하였다. 펩타이드 합성장치를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 펩타이드를 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 링크 레진(Rink resin) (0.075mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50mg의 링크 레진을 넣은 뒤 DMF로 레진을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M 아미노산 용액(용매: 디메틸포름아마이드, DMF), 1.0M DIPEA(용매: 디메틸포름아마이드&엔메틸피롤리돈, DMF&NMP), 0.5M HBTU(용매: 디메틸포름아마이드, DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 이소프로판올(Isopropanol)으로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다. N 말단의 마지막 아미노산의 F-moc 보호기를 제거한 후, DMF 존재하에 DIPEA(10 당량), HBTU(5 당량), 그리고 palmitic acid(5 당량)를 첨가하여 합성을 진행하였다. 반응시간은 Kaiser test solution을 사용 하여 음성의 결과가 나올 때까지 반응을 진행하였으며, 반응 종결후 DMF 및 MeOH로 resin을 세척하고 진공 오븐에 건조 하였다. 트리플루오로아세트산(TFA) 절단 칵테일(cleavage cocktail)을 레진 1g 당 20ml의 비율로 넣어 3시간 혼합(shaking) 시킨 후 필터링을 통해 레진과 펩타이드가 녹아 있는 칵테일을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드-지질의 결합체가 녹아있는 TFA 칵테일 용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드-지질의 결합체를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리해 내었다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA 칵테일을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드-지질의 결합체는 증류수에 녹여 동결건조하였다. 동결건조 완료후, 고성능 액체크로마토그래피(Shimadzu, Japan)에 의해 분리, 정제하였다. 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min으로 0.1% TFA/H2O와 0.092% TFA/아세토나이트릴(acetonitrile)을 0~60%의 변화를 주면서 30분간 흘려주는 방법으로 분석하였으며, 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였다. 정제는 직경 2.2cm의 컬럼을 이용하여 유속 20ml/min으로 용매와 검출파장을 같은 조건으로 실시하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 질량분석법(Mass spectrometry)을 통해 확인하였다.
실시예 2: 펩타이드 -지질 결합체와 mRNA의 결합을 통한 나노입자 제조
실시예 1에서 제조된 펩타이드-지질 결합체에 돌연변이 KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA(서열번호 17 또는 서열번호 18)와 KRAS 발현을 저해하는 siRNA(서열번호 19 및 서열번호 20)를 각각 결합시켜 나노입자를 제조하였다.
공유결합은 mRNA의 5' 말단에 sulfhydryl group 또는 amine group으로 치환된 siRNA를 사용하여 세포투과 및 타겟 인식 펩타이드에 있는 시스테인의 sulfhydryl group과 화학적 가교제를 사용하여 결합하고, 자기조립에 의하여 나노입자를 제조하였다.
펩타이드-지질 결합체는 100μg을 90% EtOH 및 10% 10mM sodium citrate buffer를 혼합하여 용매 100μL에 용해하였다. mRNA와 siRNA 각각 100μg을 10mM sodium citrate buffer(RNase, Dnase Free & PCR certified Water(Tech&Innovation, BWA-8000) 사용) 100μL에 용해하였다. mRNA 또는 siRNA 용액과 펩타이드-지질의 결합체를 1:10, 1:20, 1:50, 1:100의 비율로 천천히 소량씩 혼합하였다.
형성된 나노입자는 gel retardation test를 통해 확인하였다. 2%(w/v) agarose gel에 0.1μg에 해당하는 RNA의 양으로 RNA와 펩타이드-지질의 결합체를 1:10, 1:20, 1:50, 1:100의 비율로 로딩하고 전기영동을 실시하였다. 단일 mRNA, siRNA는 (+) 전하인 아래쪽으로 내려가는 것이 관찰되었으나(도 3), 펩타이드-지질 나노입자를 형성했을 때는, 1:10의 비율부터 아래쪽으로 내려가지 않는 것을 알 수 있었다. 이는 펩타이드-지질에 의해 입자 표면이 중성으로 바뀐 것을 뜻한다. 또한, 투과전자현미경(transmission, electron microscope, TEM, JEM-1230, JEOL)을 이용하여 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체(1:10)로 구성된 나노입자를 확인하였다. 입자 사이즈는 dynamic light scattering(DLS, Malvern Instruments, Ltd., UK)을 이용하여 측정하였다(도 3). mRNA의 경우, 사이즈가 100nm 이상인 입자들이 더 많았고, siRNA의 경우, 사이즈가 100nm 정도의 입자가 형성된 것을 확인하였다.
실시예 3: 나노입자의 세포 내로 전달 확인
실시예 2에서 제작된 나노입자를 H358 세포의 배양액에 투여하여, 세포 내로 전달되는 것을 확인하였다. 형광(Cy5.5)이 표지된 KRAS 분해 단백질의 mRNA와 형광(Cy5.5)이 표지된 KRAS의 siRNA를 사용하여 펩타이드-지질의 결합체를 형성시켰으며, 컨포칼 현미경으로 세포 내로 나노입자가 전달된 것을 확인하였다(도 4).
mRNA와 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자의 세포투과능을 시험하기 위해, mRNA 또는 siRNA에 Cy5.5(Invitrogen)를 표지하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 나노입자를 제작하였다. H358(인간 폐암 세포, CRL-5807, ATCC)를 각각 1X104으로 분주하고, 24시간 후에 배양 배지에 Cy5.5-mRNA와 펩타이드-지질의 결합체 또는 Cy5.5-siRNA와 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 100nM를 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 10% 중성 포르말린 용액으로 세포를 고정하고 공초점시차주사 현미경으로 측정하였다.
그 결과, H358 세포의 세포질에서 현저히 증가된 양으로 관찰되었다(도 4). 따라서, mRNA 또는 siRNA가 탑재된 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자는 효과적으로 세포투과가 가능한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 세포 내로 전달된 mRNA에 의한 KARS 분해 단백질의 발현 확인
아울러, mRNA와 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자에 의한 세포 내 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 5).
6-well plate에 70%의 density로 H358 cells을 분주한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 overnight 동안 cell starvation 하였다. mRNA와 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자를 10nM, 20nM 농도로 포함한 배지를 16시간 동안 처리하였다. 대조군으로 리포펙타민과 혼합한 mRNA 10nM을 사용하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer(25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 융해(lysis)하였다. BCA protein assay(23227, Thermo scientific)를 통해 단백질을 정량하고, western blot으로 KRAS 분해 단백질과 actin 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 8% SDS PAGE gel 에 size marker와 함께 샘플을 동량 로딩하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer한 membrane은 5% skim milk로 1시간 블로킹하고, 1st antibody(GST, abcam, ab19256)를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척하고 HRP가 부착된 2nd antibody(anti-Rabbit, A90-116P, BETHYL Lab.; anti-Mouse, A120-101P, BETHYL Lab.)로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 리포펙타민과 같은 지질나노입자를 사용하는 것보다, 본 발명의 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자의 경우, 세포 내에서 mRNA에 의해 발현되는 KRAS 분해 단백질의 양이 훨씬 높았으며, 그 중에 1:10인 경우가 가장 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다(*p<0.5, **p<0.01).
실시예 5: 세포 내로 전달된 KRAS 분해 단백질 mRNA에 의한 활성 KARS의 감소 확인
실시예 4에서 mRNA와 펩타이드-지질 결합체로 구성된 나노입자가 투여된 세포에서 활성 KRAS가 감소하는 것과 KRAS의 하위 신호인 pMEK가 감소하는 것을 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 6).
6-well plate에 70%의 density로 H358 cells을 분주한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 overnight 동안 cell starvation 하였다. mRNA와 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자를 10nM, 20nM 농도로 포함한 배지를 16시간 동안 처리하였다. 대조군으로 리포펙타민과 혼합한 mRNA 10nM을 사용하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer(25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 융해(lysis)하였다. BCA protein assay(23227, Thermo scientific)를 통해 단백질을 정량하고, western blot으로 FER tyrosine kinase와 actin 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 8% SDS PAGE gel에 size marker와 함께 샘플을 동량 로딩하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer한 membrane은 5% skim milk로 1시간 블로킹하고, 1st antibody(GST (abcam, ab19256), Active KRAS(Santa cruz, sc-30), pMEK1/2(s221)(Cell signaling, 2338s), GAPDH(Cell signaling, 2118s))를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척 하고 HRP가 부착된 2nd antibody(anti-Rabbit, A90-116P, BETHYL Lab.; anti-Mouse, A120-101P, BETHYL Lab.)로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 리포펙타민과 같은 지질나노입자를 사용하는 것보다, 본 발명의 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자의 경우, 활성 KRAS와 하위 신호인 pMEK가 효과적으로 감소하는 것을 알 수 있었다.
실시예 6: 세포 내로 전달된 KRAS siRNA에 의한 messenger KARS의 감소 확인
6-well plate에 70%의 density로 H358 cells을 분주한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 overnight 동안 cell starvation 하였다. KRAS siRNA와 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자를 100nM 농도로 포함한 배지를 16시간 동안 처리하였다. 대조군으로 리포펙타민과 혼합한 siRNA 100nM을 사용하였다.
Quantitative real-time PCR은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. mRNA 정량을 위해, total RNA를 Qiagen RNeasy kit를 사용하여 분리하였다. 500ng RNA를 사용하여 Verso cDNA kit(Thermo Scientific)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. mRNA 값은 SYBR Green에 기반하여 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)으로 측정하였다.
사용한 프라이머는 다음과 같다.
KRAS:
F- TGACCTGCTGTGTCGAGAAT(서열번호 21),
R- TTGTGGACGAATATGATCCAA(서열번호 22);
18S:
F- CGCCGCTAGAGGTGAAATTC(서열번호 23),
R- TTGGCAAATGCTTTCGCTC(서열번호 24)
18S rRNA는 housekeeping gene(대조 유전자)으로 사용하였다. reverse-transcribed RNA를 사용하여 PCR을 하고, 100 ng/μL of sense와 antisense primers(total volume 20 μL)를 사용하였다. 각 사이클은 95℃에서 15초의 denaturation과 1분의 annealing, 60℃에서 extension, 40 사이클을 실시하고, 그 결과를 도 7에 나타냈다. KRAS siRNA와 펩타이드-지질의 결합체(Peptide-lipid NC)를 처리했을 때, KRAS mRNA의 값이 가장 많이 감소하는 결과를 얻었으며, siRNA 단독 또는 control siRNA는 효과가 없는 것으로 나타났다.
실시예 7: 폐암 동물모델에서의 항암효과 확인
H358 세포주에 의해 폐암을 유발한 Xenograft 마우스 모델에 실시예 2에서 제작한 mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 투여하여 항암효과를 확인하였다. 5-6주령의 암컷 Balb/c nude mouse(5-6 weeks old; Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan)의 대퇴부에 H358 세포 1X106와 Matrigel(BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 100μL에 혼합한 것을 이식하고, 100mm3크기의 종양이 형성되게 하였다. mRNA와 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자와 mRNA와 리포펙타민으로 제조한 지질입자(lipid nanoparticle, LNP)를 각각 복강에 일주일에 2회 간격으로 1μg/kg의 용량으로 30일간 주사하였다. 3~4일 간격으로 종양의 크기를 버니어 캘리퍼로 측정하였고, 30일째에 마우스를 희생시켜 종양을 적출하여 적출된 종양을 사진 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자를 투여한 실험군에서 종양 크기가 증가하지 않는 것을 확인하였고, 리포펙타민으로 제조한 지질입자는 종양 크기가 계속 증가하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> NIBEC Co., Ltd. Seoul National University R&DB Foundation <120> Nanoparticle Comprising Peptide-Lipid Conjugate for Delivering Oligonucleotide into Target Cell and Pharmaceutical Composition Comprising Thereof <130> P22-B102 <150> KR 2021-0075838 <151> 2021-06-11 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 1 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 2 Ile Lys Lys Ile Leu Ile Lys Ile Ile Lys Lys Leu Ile Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 3 Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 4 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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peptide <400> 11 Leu Lys Lys Leu Leu Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 12 Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 13 Leu Lys Arg Leu Ile Ile Ile Lys Lys Leu Ile Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 14 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA binding peptide <400> 15 Leu Arg Arg Leu Leu Arg Trp Leu Arg Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide thatt bind to target cell surface <400> 16 Cys Ala Ile Tyr Pro Arg His 1 5 <210> 17 <211> 1461 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS mRNA <400> 17 auggaagucc aauuguugga aucugggggu 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Claims (22)

  1. 하기 화학식 1의 펩타이드-지질의 결합체를 기본단위로 하는 펩타이드-지질 결합체:
    [화학식 1]
    A-B-C-D-E
    여기서, A는 탄소수가 12~20개인 지방산 또는 양이온성 지질;
    B는 엔도좀의 탈출을 촉진하는 펩타이드;
    C는 RNA 결합 펩타이드;
    D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드;
    E는 타겟 세포 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B는 4~12개의 히스티딘으로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 D는 4~12개 알지닌, 4~12개 라이신 및 2개의 시스테인으로 구성되는 군에서 선택되는 펩타이드 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 C는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 E는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 기본단위의 상기 A-B는 아마이드 결합을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 A-B의 아마이드 결합은 화학적 합성방법으로 결합되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 B-C-D-E는 화학적 합성기법 또는 재조합 발현기법으로 제조하는 것을 특징으로 하는 펩타이드-지질 결합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, siRNA, miRNA 및 mRNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 억제시키거나 증가시키는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제10항에 있어서, 상기 siRNA는 종양유발 단백질, 질병을 유발하는 단백질을 코딩하는 염기서열에 대한 상보적인 염기서열을 가지는 siRNA인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 siRNA는 천연 형태 또는 화학적으로 변형된 형태의 siRNA이거나, 5' 말단에 sulfhydryl group 또는 amine group으로 치환된 siRNA를 사용하여 세포투과 및 타겟 인식 펩타이드에 있는 시스테인의 sulfhydryl group과 화학적 가교제를 사용하여 결합한 것을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제10항에 있어서, 상기 mRNA는 발현을 증가시키려는 타겟 단백질, 재조합 키메라 단백질 또는 바이러스 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  15. 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 화학식 1의 C에 결합한 후, 펩타이드-지질 결합체가 자기조립을 통해 형성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  16. 제15항에 있어서, 10~200nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  17. 제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA 또는 mRNA이고, 상기 siRNA 또는 mRNA와 펩타이드-지질 결합체의 분자량 비가 1:1~1:100인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  18. 제9항의 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 세포 내 전달용 조성물.
  19. 제9항의 펩타이드-지질 결합체와 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노입자를 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 암 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암은 편평상피암, 기저세포암, 선암, 간세포암, 신세포암, 방광암, 장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁암, 결장암, 식도암, 두부암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 백혈병, 양성 및 악성 림프종, 양성 및 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 에윙육종, 혈관육종, 카포시 육종, 지방육종, 근육종, 신경상피육종, 활막육종, 신경육종, 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 뇌질피복세포증, 교아세포종, 신경아세포종, 신경절세포종, 신경절교세포종, 수아종, 송과세포종, 수막종, 뇌막육종, 신경섬유종 및 신경초종을 포함하는 육종, 고환암, 갑상선암, 암육종, 호긴스병, 윌름 종양 및 테라토칼시노마스로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 천식, 자가면역 질환, 류마티스관절염, 다발성 경화증, 섬모질환, 구개열, 당뇨병, 심장 질환, 고혈압, 염증성장질환, 정신 지체, 기분 장애, 비만, 굴절 이상, 불임, 앵겔만 증후군, 카나반병, 만성 소화 장애증, 샤르코마리투드병, 낭포성 섬유증, 듀켄시근이영양증, 혈색소증, 혈우병, 클리네펠터 증후군, 신경섬유종증, 페닐케톤뇨증, 상염색체 우성 다낭성 신종(PKD1 또는 PKD2), 프라더-윌리 증후군, 겸상적혈구빈혈증, 테이삭스병, 터너증후군, HIV 감염 질환 및 HCV 감염 질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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