KR20240087590A - B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240087590A
KR20240087590A KR1020230177270A KR20230177270A KR20240087590A KR 20240087590 A KR20240087590 A KR 20240087590A KR 1020230177270 A KR1020230177270 A KR 1020230177270A KR 20230177270 A KR20230177270 A KR 20230177270A KR 20240087590 A KR20240087590 A KR 20240087590A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
mrna
conjugate
cells
nanoparticles
Prior art date
Application number
KR1020230177270A
Other languages
English (en)
Inventor
박윤정
정종평
이주연
윤국진
조범수
이동우
김도근
정혜숙
신은경
Original Assignee
서울대학교산학협력단
대한민국(질병관리청 국립보건연구원장)
주식회사 나이벡
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단, 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장), 주식회사 나이벡 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of KR20240087590A publication Critical patent/KR20240087590A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

본 발명은 기존 지질나노입자의 제한점을 극복하고, 안전하게 신변종 감염병에 즉각적인 대응이 가능한, mRNA 전달용 펩타이드 기반 결합체에 관한 것으로, 상기 결합체의 RNA 결합 펩타이드에 mRNA가 결합해 양친매성 폴리펩타이드 또는 고분자에 의해 자기조립이 진행되어 펩타이드 및 mRNA 복합체 나노입자를 형성한다. 상기 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 mRNA의 세포 내 전달을 효율적으로 증가시키며 mRNA에 의한 백신 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

Description

B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도{Nanoparticle Comprising Peptide-based Conjugate for Delivering mRNA into B cell and T cell and Uses Thereof}
본 발명은 기존 지질나노입자(Lipid Nanoparticle, LNP)의 제한점을 극복하고, 안전하게 신변종 감염병에 즉각적인 대응이 가능한 펩타이드 기반 mRNA 전달체에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드는 특히 siRNA, mRNA 등의 형태로 암, 감염성 질환을 유발하는 유전자를 제어하기 위한 치료제로서 많이 개발하고 있다. 최근에는 코로나19 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 mRNA 형태로 주입하여 면역반응을 일으키는 mRNA 백신이 FDA의 승인을 받으면서, mRNA의 응용이 주목을 받고 있다. mRNA는 체내의 mRNA를 인공적으로 합성하여 사용하기 때문에 독성이 없는 반면, 생체 내에서 뉴클레아제(nuclease)에 의해 빠르게 분해되며, 음전하를 띄고 있고, 특정 병소로의 타겟팅이 불가능하다. 또한, 세포질 내에서 작용해야 그 효과가 나타나나, 음전하 및 사이즈가 크기 때문에 그 자체로 세포막을 투과할 수 없다. 따라서 이런 한계점을 극복하기 위해, 세포 내로 안정하게 mRNA를 전달할 수 있는 전달체가 필요하다.
가장 많이 사용되고 있는 전달체는 지질나노입자이며, 다양한 양이온성 지질을 사용하여 올리고뉴클레오티드 전달체가 알려져 있다(US 2006/0083780, US 2006/0240554, US 2008/0020058, US2009/0263407 및 US 2009/0285881 및 WO 2009/086558, WO 2009/127060, WO 2009/132131, WO2010/042877, WO 2010/054384, WO 2010/054401, WO 2010/054405, WO 2010/054406 및 WO 2010/105209). CLinDMA 및 DLinDMA와 같은 전통적인 양이온성 지질은 간으로 올리고뉴클레오티드 전달을 위해 이용되어 왔으나, 고용량에서 간 독성과 함께 비-최적 전달 효율을 겪는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 안전하면서도 효과적으로 세포 내로 감염병 mRNA 백신을 전달할 수 있는 전달체 펩타이드로 구성된 나노입자를 제조하기 위하여, 타겟 세포 표면 인식을 위한 서열과 세포투과 기능성, 감염병 mRNA와 결합할 수 있는 서열로 구성된 펩타이드를 제조하고, 전달체 펩타이드로 구성된 나노입자를 이용하는 경우, 세포 내로 mRNA가 효과적으로 전달되는 것을 확인하였으며, 탑재된 mRNA에 의해 백신 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 안전하면서도 효과적으로 세포 내로 mRNA를 전달할 수 있는 펩타이드 기반 결합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 mRNA의 세포 내 전달용 나노입자 및 상기 나노입자를 포함하는 mRNA의 B 세포 또는 T 세포 내 전달용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 1을 기본단위로 하는 mRNA 전달용 펩타이드 기반 결합체를 제공한다:
[구조식 1]
A-B-D-E
여기서, A는 RNA 결합 펩타이드, B는 양친매성 폴리펩타이드 또는 양친매성 고분자, D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드, E는 B 세포 또는 T 세포 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자를 포함하는 mRNA의 B 세포 또는 T 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용을 제공한다.
본 발명에 따른 mRNA가 결합된 펩타이드 기반 결합체로 구성된 나노입자는 mRNA를 세포 내로 효과적으로 전달하며, mRNA에 의해 감염증 예방을 위한 백신으로 사용할 수 있다. 기존 지질나노입자보다 발현 효율, 안전성 등이 향상되어 mRNA의 백신 효과를 높일 수 있다.
도 1은 펩타이드 기반 결합체의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 mRNA가 펩타이드 기반 결합체의 RNA 결합 펩타이드에 먼저 결합한 후에, 자기조립(self-assembly)에 의해서 나노입자를 형성하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3A는 mRNA와 펩타이드 기반 결합체로 구성된 나노입자를 각 반응 비율별로 아가로스 젤에 전기영동한 결과, 0.05% SDS로 해리시킨 후 전기영동한 결과이고, 도 3B는 TEM으로 형성된 나노입자를 관찰한 것이고, 도 3C는 Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer로 나노입자의 사이즈와 그 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 mRNA와 lipofectamine 결합체와 mRNA와 펩타이드 결합체로 구성된 나노입자를 세포에 처리했을 때, 세포 내에 투과한 정도를 관찰한 결과이다.
도 5는 mRNA와 펩타이드 결합체로 구성된 나노입자에 의한 세포 내 단백질의 발현량을 관찰한 웨스턴 블랏 결과와, mRNA와 펩타이드 결합체로 구성된 나노입자를 세포에 처리한 후, mRNA에서 발현된 단백질에 의해 active KRAS가 감소하는 것을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 6은 B cell/T cell target peptide의 B cell/T cell과의 결합을 Confocal microscopy로 관찰한 결과이다.
도 7은 B cell/T cell target peptide의 B cell/T cell과의 결합을 Flow cytometry로 관찰한 결과이다.
도 8은 COVID-19 백신 mRNA와 펩타이드 전달체로 제작한 나노입자의 TEM 관찰 결과이다.
도 9는 COVID-19 백신 mRNA와 펩타이드 전달체로 제작한 나노입자에 의해 형성된 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1에 대한 항체 분석 결과이다.
도 10은 COVID-19 백신 mRNA와 펩타이드 전달체로 제작한 나노입자에 의해 형성된 면역반응 분석 결과이다.
도 11은 COVID-19 백신 mRNA와 펩타이드 전달체로 제작한 나노입자에 의해 형성된 human ACE2 항체 분석 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 세포 내로 mRNA를 안전하고, 효율적으로 전달할 수 있는 펩타이드 기반 결합체로 구성된 나노입자를 제조하였다. 먼저, 타겟 세포 표면 인식을 위한 서열과 세포투과 기능성, 엔도좀에서의 탈출 촉진, 올리고뉴클레오티드와 결합할 수 있는 서열로 구성된 펩타이드와 mRNA를 보호할 수 있는 양친매성 폴리펩타이드를 이용하여, 펩타이드 기반 결합체를 제조하고, 상기 결합체에 mRNA를 결합시킨 나노입자를 제조하였다. 상기 결합체로 구성된 나노입자를 이용하는 경우, 세포 내로 mRNA가 효과적으로 전달되며, 탑재된 mRNA의 발현 의해 바이러스 감염에 대한 백신 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 구조식 1을 기본단위로 하는 mRNA 전달용 펩타이드 기반 결합체에 관한 것이다:
[구조식 1]
A-B-D-E
여기서, A는 RNA 결합 펩타이드,
B는 양친매성 폴리펩타이드 또는 양친매성 고분자,
D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드,
E는 B 세포(B cell) 또는 T 세포(T cell) 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 A는 RNA가 결합하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 A는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 1: LKKLLKLLKKLLKLAG
서열번호 2: IKKLIKIIKKLIKLAG
서열번호 3: LRRLLRLLRRLLRLAG
서열번호 4: LKKLLKLLOrnKLLDprLAG
서열번호 5: LRRLLRLLOrnRLLDprLAG
서열번호 6: LRKIIRLIOrnKLLDprLAG
서열번호 7: LKKLLKLLOrnKLLKLAG
서열번호 8: WKKLLKLLKKLLKLAG
서열번호 9: WRRLLRLLRRLLRLAG
서열번호 10: WRKLLRLLKKLLKLAG
서열번호 11: LKKLLDbuLLKKLLKWAG
서열번호 12: LRRLLDbuLLRRLLRWAG
서열번호 13: LKRLIDbuIIKKLIKWAG
서열번호 14: LKKLLKWLOrnKLLDprLAG
서열번호 15: LRRLLRWLOrnRLLDbuLAG
Orn = Ornithine, Dbu = 2,4-diaminobutyric acid, Dpr = 2,3-diaminopropionic acid.
본 발명에 있어서, 상기 A는 RNA가 결합할 수 있는 펩타이드라면 제한 없이 이용할 수 있으며, 예를 들어, US 2020/0207834 A1 등에 개시된 핵산 결합 펩타이드를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 B는 양친매성 폴리펩타이드 또는 양친매성 고분자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “양친매성(amphipathic)”이란 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 것을 의미한다.
상기 양친매성 폴리펩타이드는 극성 아미노산과 비극성 아미노산을 포함하고, 상기 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 부분적으로 서로 밀집되어 극성 부분과 비극성 부분을 나타내는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 극성 아미노산으로는 시스테인, 글루타민, 트레오닌, 타이로신, 세린 또는 아스파라긴 등을 들 수 있고, 상기 비극성 아미노산으로는 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 프롤린, 발린, 이소류신, 류신, 글리신 또는 알라닌 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 양친매성 폴리펩타이드는 아미노산 서열상 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집된 형태일 수 있고, 아미노산 서열상 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집되어 있지는 않으나, 상기 아미노산을 포함하는 펩타이드가 3차원 구조를 형성할 때, 상기 3차원 구조에 의하여 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집되는 형태일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 양친매성 폴리펩타이드는 다수의 동일 또는 비동일 극성 아미노산과 다수의 동일 또는 비동일 비극성 아미노산이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 양친매성 폴리펩타이드는 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 16: PLVFNQER
상기 양친매성 고분자는 소수성 고분자와 친수성 고분자가 결합된 것으로, 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 이미 알려진 고분자이다. 상기 양친매성 고분자는 친수성-소수성의 형태로 결합되어 있는 고분자로, 폴록사머, 폴리(에틸렌옥사이드)(PEO)-폴리락트산(PLA) 공중합체, 소수성 고분자인 폴리에테르이미드(polyetherimide)(PEI)에 친수성 아미노산 RALA이 결합된 형태 중 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 자기회합성을 갖는 양친매성 고분자의 용도 및 목적에 맞게 선정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 양친매성 고분자는 소수성 고분자인 polyetherimide(PEI)에 친수성 아미노산 RALA가 결합된 형태인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 세포 투과 기능을 가진 펩타이드는 세포 내재화(endocytosis) 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 한국등록특허 제10-0951719호에 개시된 세포투과성 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 D는 알지닌 4~12개, 라이신 4~12개, 시스테인 2개로 구성되는 군에서 선택되는 펩타이드 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 세포막을 투과할 수 있다면 전술한 펩타이드 이외의 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 E는 B 세포(B cell) 또는 T 세포(T cell) 표면을 인식하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 B 세포 또는 T 세포는 상기 RNA 결합 펩타이드에 결합하여 세포 내로 전달시키고자 하는 mRNA가 타겟하는 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 E는 기존의 B 세포 또는 T 세포 표면에 결합하는 서열이며, 파지 디스플레이 기법을 통해, 신규로 발굴하여 적용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 E는 B 세포 및/또는 T 세포를 타겟하는 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 17: HTHGAARVPDHR
본 발명에 있어서, 상기 B와 D 사이에 엔도좀 탈출을 촉진하는 펩타이드인 C를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 C는 엔도좀 탈출을 촉진하는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 결합체의 엔도좀 탈출을 촉진하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 US 2020/0207834 A1에 개시된 엔도좀 분해 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 C는 히스티딘 4~12개로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 1의 A-B-D-E 또는 A-B-C-D-E는 화학적 합성기법 또는 재조합 발현기법으로 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA는 발현을 증가시키려는 타겟 단백질, 재조합 단백질, 바이러스 항원을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다. 3' cap과 5' poly A tail을 가진 천연 구조의 mRNA이거나, 5' 말단에 sulfhydryl group 또는 amine group을 결합시킨 후에 세포투과 및 B/T cell 인식 펩타이드에 있는 시스테인의 sulfhydryl group과 화학적 가교제를 사용하여 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 돌연변이 KRAS에 대한 mRNA를 사용하여, 돌연변이 KRAS의 발현을 억제하였다. KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열은 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열을 가지는 mRNA를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 18: KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열 1
5’ cap-5’UTR-
AUGGAAGUCCAAUUGUUGGAAUCUGGGGGUGGGCUUGUCCAACCUGGUGGUUCACUCCGUCUGAGCUGCGCCGCUUCCGGAUUCACUUUCUCCACCUUUUCUAUGAAUUGGGUUCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACUUGAGUGGGUUAGCUAUAUCAGCAGGACCAGUAAAACCAUCUACUACGCCGACAGCGUUAAGGGAAGGUUCACUAUAUCCCGGGACAAUUCUAAGAAUACUUUGUACUUGCAAAUGAACUCUUUGCGGGCAGAAGAUACUGCUGUCUACUAUUGUGCACGAGGUAGGUUUUUUGAUUAUUGGGGUCAGGGGACCCUCGUAACCGUUUCCAGUGGGGGCAGCGAGGGUAAGAGCUCCGGUUCAGGGUCAGAAUCUAAAAGCACUGGUGGCUCCGAUAUACAAAUGACCCAGAGUCCAAGCUCUCUUUCAGCCAGCGUGGGAGACAGGGUGACCAUCACCUGUCGAGCAUCUCAAUCCAUUUCAUCAUACCUCAAUUGGUAUCAACAGAAGCCUGGGGAAGCACCAAAGUUGCUUAUUUAUUCUGCCAGCGUACUGCAAAGUGGCGUACCUUCCCGCUUCUCCGGGUCUGGGAGUGGCACUGAUUUUACCCUCACAAUUAGCAGCCUGCAACCCGAGGACUUCGCUACAUACUACUGCCAACAAAGUGUAAUGAUACCCAUGACAUUCGGGCAAGGCACAAAAGUCGAGAUAAAGGGAAGUGGAGGAGGUGGCUCUAUGCCCCGCCGCGCUGAGAACUGGGAUGAGGCCGAAGUUGGUGCUGAAGAGGCCGGAGUUGAAGAAUAUGGGCCAGAAGAAGAUGGCGGUGAGGAAAGCGGGGCUGAAGAGAGCGGUCCAGAGGAGUCUGGUCCAGAGGAACUUGGAGCUGAGGAGGAGAUGGAGGCCGGACGUCCACGUCCUGUCCUGCGAUCAGUUAACUCAAGGGAGCCCUCACAGGUUAUCUUUUGUAAUCGAAGCCCUCGCGUGGUUUUGCCCGUCUGGCUCAACUUCGAUGGUGAACCCCAACCAUACCCAACCCUCCCCCCUGGUACCGGGCGGAGGAUUCAUUCCUAUCGGGGACACCUUUGGCUCUUCCGAGACGCUGGGACUCACGAUGGCCUGUUGGUCAAUCAGACCGAACUGUUUGUGCCCAGCCUGAACGUAGACGGGCAGCCAAUUUUCGCAAACAUAACACUGCCCGUAUAUACAUUGAAAGAAAGGUGUCUUCAGGUGGUACGCAGUCUGGUUAAACCAGAAAACUAUAGGCGUCUGGAUAUCGUGCGCAGCCUCUAUGAGGACCUUGAAGACCACCCUAACGUGCAAAAGGACCUCGAGCGGCUCACUCAGGAGCGCAUAGCUCAUCAGCGCAUGGGAGAUGAAAACCUUUACUUUCAGGGUGGGAGCGGCGGCAGCGGCGGGAGUCAUCAUCACCAUCAUCAUCACCACUGA-3’ UTR-3’ poly A tail
서열번호 19: KRAS를 분해하는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열 2
5’ cap-5’UTR-
AUGGAAGUGCAACUUCUCGAAUCUGGAGGGGGGUUGGUACAACCCGGCGGCAGCUUGCGCUUGUCCUGUGCUGCCAGUGGGUUCACAUUUUCUACAUUCUCUAUGAACUGGGUUAGACAAGCCCCUGGCAAAGGGCUGGAAUGGGUGAGCUAUAUAAGUCGCACCUCCAAAACUAUUUACUAUGCAGAUAGUGUCAAGGGACGAUUUACUAUCAGCAGAGAUAACUCUAAGAACACUCUGUAUCUCCAGAUGAAUUCCCUUCGAGCCGAAGACACCGCAGUAUAUUACUGUGCUAGAGGGCGCUUCUUCGACUACUGGGGGCAAGGCACUCUGGUAACUGUCAGUAGCGGGGGUUCUGAGGGCAAAAGUUCAGGAUCUGGGUCCGAGUCUAAGUCAACUGGCGGGAGCGACAUACAAAUGACUCAGAGCCCCAGUAGCCUGAGCGCCUCCGUUGGUGACAGAGUCACUAUUACAUGUCGGGCAUCUCAAUCUAUUUCCUCUUAUCUUAACUGGUAUCAGCAAAAGCCAGGCGAAGCCCCCAAACUCCUGAUAUACUCCGCUAGUGUUCUUCAGAGUGGCGUUCCUAGUCGCUUCAGCGGAUCCGGAAGUGGCACUGAUUUUACACUUACAAUUAGUUCCUUGCAGCCUGAAGAUUUUGCCACAUACUACUGUCAGCAAUCAGUCAUGAUUCCCAUGACCUUUGGGCAAGGGACCAAAGUUGAGAUCAAAGGCUCCGGAGGAGGAGGGUCUAUGGAAAACAGAUGGCAAGUUAUGAUCGUUUGGCAAGUAGAUCGUAUGCGAAUACGCACAUGGAAAUCACUGGUAAAGCACCACAUGUAUGUGUCAGGCAAAGCACGAGGAUGGUUUUAUCGUCAUCACUAUGAGUCACCACAUCCCCGCAUCAGCUCUGAGGUGCACAUACCACUCGGUGAUGCUCGUCUGGUCAUAACUACCUACUGGGGCCUCCACACUGGUGAAAGAGAUUGGCACCUCGGCCAAGGAGUAAGUAUAGAAUGGCGCAAAAAGCGUUAUUCAACCCAAGUGGAUCCUGAGUUGGCAGAUCAGUUGAUCCACUUGUAUUACUUUGACUGCUUCAGCGAUAGUGCUAUUCGGAAGGCCCUCCUCGGGCACAUUGUAAGCCCACGGUGCGAGUAUCAAGCUGGUCAUAACAAGGUUGGUAGCCUCCAGUACUUGGCUUUGGCUGCACUUAUAACACCCAAAAAGAUAAAACCUCCACUCCCCUCAGUGACUAAACUCACUGAGGAUCGUUGGAACAAACCCCAGAAAACCAAGGGGCACAGGGGUUCACACACCAUGAAUGGCCACGAGAAUUUGUAUUUCCAAGGGGGAUCCGGGGGCAGUGGAGGGUCUCACCAUCAUCACCACCACCACCAUUGA-3’ UTR-3’ poly A tail
본 발명에 있어서, 상기 구조식 1을 제조한 이후, mRNA를 구조식 1, 구체적으로는 구조식 1의 A에 결합시키고, 일정 시간 방치하면 자기조립(self-assembly)에 의해 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 나노입자는 10~200nm의 크기인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA와 결합체의 분자량 비율은 1:1~1:100인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA는 mRNA 백신으로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자를 포함하는 mRNA의 B 세포(B cell) 또는 T 세포(T cell) 내 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 바이러스 감염증은 감기, 독감(인플루엔자), 감염성 단핵구증, 거대세포바이러스감염, 홍역, 소아마비(폴리오), 황열, 뎅기열, B형 간염, C형 간염, 에이즈 또는 코비드-19를 포함하는 바이러스 감염증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “예방”은, 상기 조성물의 투여로 질병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어 “치료”는, 상기 조성물의 투여로 질병의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡술, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 제제는 당분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다. 그러나, 상기 기재는 예시적인 것으로, 본 발명이 적용 가능한 제제는 상기 기재에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 허용가능한 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 보조제는 예컨대 담체일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 그러나, 상기 기재는 예시적인 것으로, 본 발명에서 사용 가능한 보조제나 담체는 상기 기재에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 나노입자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노입자의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 방법, 용도 및 사용은 본 발명에 따른 나노입자를 포함하며, 상기 나노입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상술한 나노입자 및 약학적 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 전달체 펩타이드의 합성
아미노산 및 합성에 필요한 시약은 GL biochem과 Sigma-Aldirich에서 구입하였다. 펩타이드 합성장치를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 펩타이드를 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 링크 레진(Rink resin) (0.075mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50mg의 링크 레진을 넣은 뒤 DMF로 레진을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M 아미노산 용액(용매: 디메틸포름아마이드, DMF), 1.0M DIPEA(용매: 디메틸포름아마이드&엔메틸피롤리돈, DMF&NMP), 0.5M HBTU(용매: 디메틸포름아마이드, DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 이소프로판올(Isopropanol)으로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다. 반응 종결 후 DMF 및 MeOH로 resin을 세척하고 진공 오븐에 건조하였다. 트리플루오로아세트산(TFA) 절단 칵테일(cleavage cocktail)을 레진 1g 당 20ml의 비율로 넣어 3시간 혼합(shaking) 시킨 후 필터링을 통해 레진과 펩타이드가 녹아 있는 칵테일을 분리하였다. 필터로 걸러진 펩타이드가 녹아 있는 TFA 칵테일 용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리해 내었다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA 칵테일을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결건조하였다. 동결건조 완료 후, 고성능 액체크로마토그래피(Shimadzu, Japan)에 의해 분리, 정제하였다. 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min으로 0.1% TFA/H2O와 0.092% TFA/아세토나이트릴(acetonitrile)을 0~60%의 변화를 주면서 30분간 흘려주는 방법으로 분석하였으며, 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였다. 정제는 직경 2.2cm의 컬럼을 이용하여 유속 20ml/min으로 용매와 검출파장을 같은 조건으로 실시하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 질량분석법(Mass spectrometry)을 통해 확인하였다.
실시예 2: 전달체 펩타이드와 mRNA의 결합을 통한 나노입자 제조
실시예 1에서 제조된 전달체 펩타이드에 His tag 단백질 또는 eGFP(enhanced green fluorescent protein) 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA를 각각 결합시켜 나노입자를 제조하였다.
전달체 펩타이드는 5mg을 nuclease-free water(Invitrogen, AM9938) 1ml에 혼합하여 용해하였다. mRNA를 1mg을 nuclease-free water(Invitrogen, AM9938) 1ml에 용해하였다. 전달체 펩타이드 용액과 mRNA 용액을 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1의 N/P(nitrogen/phosphate)비율로 천천히 소량씩 혼합하였다.
형성된 나노입자는 gel retardation test를 통해 확인하였다. 2%(w/v) agarose gel에 0.1μg에 해당하는 mRNA의 양으로 mRNA와 전달체 펩타이드를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1의 비율로 로딩하고 전기영동을 실시하였다. 단일 mRNA는 (+) 전하인 아래쪽으로 내려가는 것이 관찰되었으나(도 3), 나노입자를 형성했을 때는, 10:1의 비율부터 아래쪽으로 내려가지 않는 것을 알 수 있었다. 이는 전달체 펩타이드에 의해 입자 표면이 중성으로 바뀐 것을 뜻한다. 또한 형성된 나노입자를 0.05% SDS로 해리시켰을 때 mRNA가 다시 gel에 내려오는 것을 확인할 수 있다(도 3). 또한, 투과전자현미경(transmission, electron microscope, TEM, JEM-1230, JEOL)을 이용하여 mRNA와 전달체 펩타이드의 결합체로 구성된 나노입자를 확인하였다. 입자 사이즈와 제타전위는 Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer(ELS Z-1000, Otsuka Portal, Japan)을 이용하여 측정하였다(도 3). 제조된 나노입자는 100~150nm의 직경을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 나노입자의 세포 내로 전달 및 발현 확인
실시예 2에서 제작된 나노입자를 Raw264.7 세포의 배양액에 투여하여, 세포 내에서 발현되는 것을 확인하였다. eGFP를 발현하는 mRNA를 사용하여 전달체 펩타이드와의 나노입자를 형성시켰으며, 컨포칼 현미경으로 세포 내로 나노입자가 전달되어 eGFP 단백질이 발현된 것을 확인하였다(도 4).
mRNA와 전달체 펩타이드의 결합체를 포함하는 나노입자의 세포투과능을 시험하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로 나노입자를 제작하였다. Raw264.7(쥐 마크로파지 세포, TIB-71, ATCC)를 각각 1X104으로 분주하고, 24시간 후에 배양 배지에 mRNA와 전달체 펩타이드의 결합체 20μg(mRNA의 양)을 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 10% 중성 포르말린 용액으로 세포를 고정하고 공초점시차주사 현미경으로 측정하였다.
그 결과, Raw264.7 세포의 세포질에서 현저히 증가된 양으로 관찰되었다(도 4). 따라서, mRNA가 탑재된 전달체 펩타이드의 결합체를 포함하는 나노입자는 효과적으로 세포투과가 가능한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 세포 내로 전달된 mRNA에 의한 KARS 분해 단백질의 발현 및 KRAS의 감소 확인
아울러, mRNA와 전달체 펩타이드 결합체로 구성된 나노입자에 의한 세포 내 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 5).
6-well plate에 60%의 density로 H358 cells을 분주한 후 48시간 뒤에 serum free RPMI-1640 배지로 overnight 동안 cell starvation 하였다. mRNA와 전달체 펩타이드의 결합체를 포함하는 나노입자를 20μg(mRNA의 양)을 포함하는 배지를 24시간 동안 처리하였다. 대조군으로 리포펙타민과 혼합한 mRNA 20μg을 사용하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer(25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 융해(lysis)하였다. BCA protein assay(23227, Thermo scientific)를 통해 단백질을 정량하고, western blot으로 His tag 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 12% SDS PAGE gel에 size marker와 함께 샘플을 동량 로딩하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer한 membrane은 5% skim milk로 1시간 블로킹하고, 1st antibody(His tag, abcam, ab18184)를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척하고 HRP가 부착된 2nd antibody(anti-Mouse, A120-101P, BETHYL Lab.)로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 리포펙타민과 같은 지질나노입자를 사용하는 것보다, 본 발명의 펩타이드-지질의 결합체로 구성된 나노입자의 경우, 세포 내에서 mRNA에 의해 발현되는 단백질의 양이 N/P ratio가 높을수록 발현이 되었다.
또한 GTP bound KRAS(active KRAS)의 발현을 확인하기 위하여 세포 lysate를 RBD-RAF-GST(RAS binding domain RAF GST)와 beads를 1시간 동안 반응시켰다. Beads를 lysis buffer로 3회 세척 후 2x loading buffer로 beads에서 단백질을 해리시켰다. Western blot의 경우, 12% SDS PAGE gel에 size marker와 함께 샘플을 동량 로딩하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer한 membrane은 5% skim milk로 1시간 블로킹하고, 1st antibody(GST(abcam, ab19256), KRAS(Santa cruz, sc-30))를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척하고 HRP가 부착된 2nd antibody(anti-Rabbit, A90-116P, BETHYL Lab.; anti-Mouse, A120-101P, BETHYL Lab.)로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 단백질이 발현되는 나노입자에서 active KRAS의 발현이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.
실시예 5: B cell/T cell target peptide의 B cell/T cell로 타겟능 확인
B cell/T cell target peptide(BTBP, 서열번호 17)에 Cy5.5를 레이블링하여 B cell(Primary CD19+ B cells, PCS-800-018, ATCC)과 T cell(Primary CD8+ Cytotoxic T cells, PCS-800-017, ATCC)에 각각 100 μM로 1시간 처리하였다. 그 후 4% 중성 포르말린 용액으로 세포를 고정하고 공초점시차주사 현미경(LSM980 with Airyscan2, Carl Zeiss)으로 측정하였다. 그 결과, B cell과 T cell의 세포막에서 형광 강도가 현저히 증가한 것으로 관찰되었다(도 6). 따라서, BTBP는 효과적으로 B cell과 T cell을 동시에 타겟하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 세포를 5% FBS가 함유된 DPBS로 3번 세척 후 Flow cytometry를 이용하여 Cy5.5가 레이블링된 BTBP와 결합되어 있는 세포를 분석하였다(도 7). 그 결과, 서열번호 17의 펩타이드는 B cell과 T cell에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 나노입자 제작
COVID-19 백신 mRNA와 RNA 결합 펩타이드(서열번호 1 또는 3)의 부피비를 1:1로 하여 Nanoassemblr Ignite(Precision Nanosystems)에 cartridge를 연결한 후 1.3 ml/min으로 반응을 진행하였다. 1차 complexation 후, 상온에서 30분 incubation하였다. 그 이후 1차 complexation 샘플 2 ml와 양친매성 폴리펩타이드(서열번호 16) 1 ml를 Nanoassemblr Ignite에 cartridge를 연결하고 부피비 2:1, 최종 부피 3 ml, 1.3 ml/min으로 설정하여 반응시켰다. 2차 complexation 후, 상온에서 30분 동안 incubation하였다. 이후 2차 complexation에 의해 얻은 샘플 3 ml와 B cell/T cell binding peptide(서열번호 17) 1 ml를 Nanoassemblr Ignite에 cartridge를 연결하고, 부피비 3:1, 최종 부피 4 ml, 1.3 ml/min으로 설정하여 반응을 진행하였다. 최종적으로, Cellulose acetate filter(0.2μm)를 사용하여 최종 샘플을 필터링 후 질소 가스로 농축하여 200 μl까지 부피를 농축하였다. 나노입자 구성성분인 mRNA : RNA 결합 펩타이드 : 양친매성 폴리펩타이드 : B cell/T cell binding peptide의 중량비는 아래와 같이 두 가지로 제조하였다.
sample 1 = 1 : 2 : 2 : 5
sample 2 = 1 : 3 : 3 : 5
대조군으로 사용된 LNP는 mRNA 대비 일정량의 중량비가 되도록 유기상 및 수성상을 혼합하여 LNP를 제조하였다. 유기상은 이온화 지질(SM-102, Moderna), 인지질(DSPC; Avanti, 816-94-4), 콜레스테롤(Cholesterol; Avanti 700100P), 및 PEG 지질(DMG-PEG; Avanti 880151P)을 이용하여 이온화지질 : 인지질 : 콜레스테롤 : PEG 지질 = 50(6.25mM) : 10(1.25mM) : 38.5(4.8125mM) : 1.5(1.875mM)를 에탄올(Sigma E7023)에 혼합하여 제작하였다. mRNA를 사이트레이트(Sigma 854)와 DPBS(Cytiva SH30028.02)에 혼합하여 수성상을 제작하였다. 유기상과 수성상의 부피비가 1:3이 되도록 맞추고, 12 ml/min의 유속으로 혼합하여, LNP를 제조하였다. 제조된 LNP는 에탄올 제거 및 체내의 pH와 LNP의 pH를 맞추기 위해 투석 카세트(Merk, UFC901024)를 사용하여 16시간 동안 PBS에서 투석하였다. 제작한 나노입자를 TEM(JEM-1400, JEOL)을 사용하여 크기와 성상을 관찰하였다(도 8). 그 결과, sample 1, sample 2는 모두 129~155 nm 사이즈의 분포를 보였으며, 모두 구형의 성상을 가지고 있었다.
실시예 7: ELISA를 이용한 SARS- CoV -2 Spike Glycoprotein S1의 항체 형성 평가
실시예 6에서 제작한 나노입자를 C57BL/6 마우스의 대퇴부 근육주사하고, 2주 후 희생하였다. 채혈하여 얻은 혈액을 원심분리하여 혈청을 분리하였다. ELISA coating buffer를 이용하여 Recombinant Human coronavirus SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1(ab275927)를 100ng/50μl로 well에 첨가하고 4℃에서 18시간 동안 well을 코팅하였다. Plate의 coating buffer를 털어내고, washing buffer(PBST, PBS+0.05% Tween20)를 이용해 2번 세척하였다. PBS+1% BSA buffer를 100μl/well로 넣어 주고 37℃ 2시간 반응하여 blocking하였다. Washing buffer를 이용해 2번 세척 후 분리하여 얻은 혈청을 PBS+1% BSA buffer로 희석하여 개체별로 1:40부터 2-fold serial dilution하고, 100μl/well로 첨가하고 37℃ incubator에서 1시간 동안 반응시켰다. Washing buffer를 이용해 3번 세척 후 Horseradish peroxidase(HRP) 표지된 2차 항체를 1:5000으로 희석 후 50μl/well로 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. Washing buffer를 이용해 5번 세척 후 TMB solution을 50μl/well로 첨가하고 RT에서 10분 반응한 뒤 stop solution(2M H2SO4)을 50μl/well로 넣어 반응을 중지시켰다. Microplate reader를 이용해 450nm 파장에서 측정하였다(도 9). 그 결과, sample 1과 sample 2를 주입한 실험군에서 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1에 대한 항체가 형성되어 ELISA 분석을 통해 발광하는 것을 확인하였다. 따라서, 주입한 나노입자는 체내에 COVID-19 백신 mRNA를 전달하여 효과적으로 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1을 발현시켜 면역반응을 유도하는 것이 증명되었다.
실시예 8: ELISPOT를 이용한 면역 반응 평가
실시예 6에서 제작한 나노입자를 C57BL/6 마우스의 대퇴부 근육주사하고, 2주 후 희생하였다. 마우스의 비장(spleen)을 적출하여 1x HBSS media 5 ml로 40μm pore Strainer를 이용하여 spleen을 갈아준 후 50ml conical tube로 옮겨 2000rpm, 5분 동안 원심분리하였다. 배지 제거 후 ACK buffer를 5ml 넣어 상온에서 5분 동안 반응하여 적혈구를 제거하고 비장세포(splenocyte)를 얻었다. IFN-γ 항체가 코팅된 microplate에 후보물질로 면역된 마우스의 비장에서 얻은 splenocyte를 분주한 후, negative control은 세포배양 배지, positive control은 cell stimulation cocktail, 실험군은 SARS-CoV-2 Spike 펩타이드(Genscript RP30020 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-crude, 2 vials(25μg/peptide))를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 18시간 배양하였다. Biotinylated IFN-γ 단클론 항체를 각 well에 첨가하여 상온에서 1시간 반응 후, Streptavidin-alkaline phosphatase를 각 well에 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium(BCIP/NBT) 용액을 첨가하여 상온에서 10분 반응시키고 세척 후 발색된 spot을 계산하여 분석하였다(도 10). 그 결과, sample 1과 sample 2를 주입한 마우스에서 분리한 비장세포에서 SARS-CoV-2 Spike 펩타이드에 의해 면역 반응을 일으키는 것을 확인하였다. 따라서, 주입한 나노입자는 체내에 COVID-19 백신 mRNA를 전달하여 효과적으로 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1을 발현시켜 면역반응을 유도하는 것이 증명되었다.
실시예 9: hACE2 immunoassay를 이용한 human ACE2에 대한 항체 형성 평가
실시예 6에서 제작한 나노입자를 C57BL/6 마우스의 대퇴부 근육주사하고, 2주 후 희생하였다. 채혈하여 얻은 혈액을 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 분리 후 56℃, 30분 동안 heat inactivation을 진행하였다. 본 실험은 Promega사의 Lumit™ SARS-CoV-2 Spike RBD: hACE2 Immunoassay kit를 사용하여 진행하였다. 먼저 1X 면역분석 반응 완충액에 혈청을 희석하여 10X 샘플 믹스를 준비한 후, 96well 흰색 플레이트에 5μl씩 분주하였다. 그리고 각 well에 III.B.2의 rFc-RBD 시약 10μl를 추가하였다. 다음으로 III.B.2의 mFc-ACE2 시약 10μl를 추가하였다. 그 다음, III.B.3의 Lumit™ Antibody Mix 시약 25μl를 모든 웰에 첨가하고 플레이트 shaker에서 시약을 실온에서 2분간 혼합하고 60분 동안 배양하였다. 마지막으로 12.5μl의 Lumit™ 검출 시약을 첨가 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그리고 평판 판독형 발광계로 발광성을 측정하였다(도 11). 그 결과, sample 1과 sample 2를 주입한 마우스의 혈청에서 human ACE2에 대한 항체가 형성된 것을 확인하였다. 따라서, 주입한 나노입자는 체내에 COVID-19 백신 mRNA를 전달하여 효과적으로 SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein S1을 발현시켜 면역반응을 생성하는 것이 증명되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 하기 구조식 1을 기본단위로 하는 펩타이드 기반 결합체:
    [구조식 1]
    A-B-D-E
    여기서, A는 RNA 결합 펩타이드,
    B는 양친매성 폴리펩타이드 또는 양친매성 고분자,
    D는 세포 투과 기능을 가진 펩타이드,
    E는 B 세포(B cell) 또는 T 세포(T cell) 표면을 인식하는 펩타이드인 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 A는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 D는 4~12개 알지닌, 4~12개 라이신 및 2개의 시스테인으로 구성되는 군에서 선택되는 펩타이드 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 E는 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 B와 D 사이에 엔도좀 탈출을 촉진하는 펩타이드인 C를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 C는 4~12개의 히스티딘으로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 결합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 A-B-D-E 또는 A-B-C-D-E는 화학적 합성기법 또는 재조합 발현기법으로 제조하는 것을 특징으로 하는 결합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드 기반 결합체와 mRNA가 결합된 나노입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 mRNA는 발현을 증가시키려는 타겟 단백질, 재조합 단백질 또는 바이러스 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제8항에 있어서, 상기 mRNA가 구조식 1의 A에 결합한 후, 펩타이드 기반 결합체의 자기조립을 통해 형성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제10항에 있어서, 10~200nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제8항에 있어서, 상기 mRNA와 결합체의 분자량 비가 1:1~1:100인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제8항의 나노입자를 포함하는 mRNA의 B 세포(B cell) 또는 T 세포(T cell) 내 전달용 조성물.
  14. 제8항의 나노입자를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바이러스 감염증은 감기, 독감(인플루엔자), 감염성 단핵구증, 거대세포바이러스감염, 홍역, 소아마비(폴리오), 황열, 뎅기열, B형 간염, C형 간염, 에이즈 또는 코비드-19인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
KR1020230177270A 2022-12-09 2023-12-08 B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도 KR20240087590A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220171768 2022-12-09
KR1020220171768 2022-12-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240087590A true KR20240087590A (ko) 2024-06-19

Family

ID=91379800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230177270A KR20240087590A (ko) 2022-12-09 2023-12-08 B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240087590A (ko)
WO (1) WO2024123134A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100951719B1 (ko) * 2007-10-02 2010-04-07 재단법인서울대학교산학협력재단 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및그 용도
US20110053829A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
KR101559974B1 (ko) * 2013-10-01 2015-10-15 한국과학기술연구원 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물
EP4121104A2 (en) * 2020-03-20 2023-01-25 BioNTech SE Coronavirus vaccines and methods of use
KR20220139079A (ko) * 2021-04-07 2022-10-14 (주)스템메디텍 세포 투과성 펩타이드 변이체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024123134A1 (ko) 2024-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220273792A1 (en) A method of eliciting an immune response by administering a population of polymersomes having an associated antigen together with a population of polymersomes having an associated adjuvant as well as compositions comprising the two populations of polymersomes
US20180179253A1 (en) Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
RU2743431C2 (ru) Липосомы, содержащие проникающие в клетки пептиды и тетраэфирные липиды, для пероральной доставки макромолекул
US20160145299A1 (en) Cell Penetrating Peptides for Intracellular Delivery of Molecules
JP2014532071A (ja) カーゴの経皮送達を含む標的送達用の多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）及びその方法
WO2013004716A1 (en) Peptide beads
US11191724B2 (en) Branched peptides for enzymatic assembly and mitochondria drug delivery
RU2751192C2 (ru) Липосомальные композиции и содержащие их твердые пероральные лекарственные формы
CN112739329A (zh) 制备口服剂型的方法
Aneja et al. Pharmacokinetic stability of macrocyclic peptide triazole HIV‐1 inactivators alone and in liposomes
JP2024509938A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２予防用ワクチン組成物
US20230256082A1 (en) Vaccine against human-pathogenic coronaviruses
US20100261876A1 (en) Novel methods of synthesis for therapeutic antiviral peptides
CN109069577B (zh) Hiv进入的d-肽抑制剂以及使用方法
KR20220167770A (ko) 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20240087590A (ko) B 세포 및 T 세포 내로 mRNA를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도
JP7068711B2 (ja) 細胞質送達ペプチド
KR20240087591A (ko) 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드 기반 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물
Jung et al. Modulating Lipid Nanoparticles with Histidinamide‐Conjugated Cholesterol for Improved Intracellular Delivery of mRNA
US11998609B2 (en) Self-assembling antiviral prodrugs
US20230398207A1 (en) Modulating th1/th2 immune response by administering two populations of polymersomes having an associated antigen and an associated adjuvant
Alasmari Hybrid Cyclic/Linear Peptides in a Multi-Component Lipid Structure as a siRNA Delivery System
EP4157859A1 (en) Isolated peptide for a peptide coacervate, and methods of use thereof