JP2024509938A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２予防用ワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、SARS-CoV-2ウイルスのS変異抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物に関し、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチンは、優れた安定性とin vivoで高い免疫原性を示し、ワクチンの保管及び使用が簡便で、コロナ19に対する優れた予防効果が期待できる。
Description
本発明は、SARS-CoV-2予防用ワクチン組成物に関し、さらに詳しくは、SARS-CoV-2ウイルスのS変異抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物に関する。
コロナウイルス(coronavirus)は、RNAウイルスの一種で、遺伝情報がリボ核酸(RNA)からなるウイルスである。人や動物の呼吸器系や消化器系の感染を引き起こす。主に、粘膜伝染、飛沫伝播などで容易に感染し、人は一般的に軽度の呼吸器感染を引き起こすが、稀に致命的な感染を引き起こすこともある。
現在パンデミックを起こしているサス－コロナウイルス－2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)は、遺伝的配列(DNA sequencing)上、ポジティブセンス(Positive sense)の単一鎖RNA(single-stranded RNA)コロナウイルスであって、人間に伝染性があり、コロナウイルス感染症－19(coronavirus disease 2019, COVID-19)の原因である。SARS-CoV-2ウイルスは表面のスパイクタンパク質(Spike protein)を用いて、気道の上皮細胞(airway epithelial cells)、肺胞上皮細胞(alveolar epithelial cells)、血管内皮細胞(vascular endothelial cells)及び肺内のマクロファージ(macrophage)の表面に存在するACE2(angiotensin-converting enzyme 2)に結合して宿主細胞内に侵入する。SARS-CoV-2のゲノム塩基配列研究の結果、スパイクタンパク質内にSARS-CoVと3次構造がかなり類似した受容体結合ドメイン(receptor-binding domain, RBD)が確認され、SARS-CoV-2のRBDがSARS-CoVのRBDに比べてACE2に対する結合力が高く、SARS-CoV-2の伝染性がSARS-CoVより強いと推測された(Mattew Z T et al., Natrue reviews immunology, 20:363-374, 2020)。
スパイクタンパク質は、S1及びS2の2つのタンパク質で構成されており、そのうちS1タンパク質はアミノ－末端領域(amino-terminal domain)とRBDからなっている。RBDがACE2と結合すると、SARS-CoV-2ビリオン(viirion)が内胞作用(endocytosis)を通じて細胞のエンドソーム内に入り、その後、融合ペプチドが露出されて宿主細胞の膜に挿入される。S2タンパク質は融合ペプチド領域(fusion peptide region, FP region)とヘプタドリピート領域(heptad repeat regions: HR1, HR2)からなり、HR1とHR2が互いに接触する形でウイルス膜に融合し、SARS-CoV-2ビリオンを宿主細胞外に放出する。S1、S2は異なる分離サイト(cleavage site)を有し、それぞれのプロテアーゼによって分離されてSARS-CoV-2の感染が発生するため、S1、S2の分離(cleavage)を抑制したり、ACE2またはTMPRSS2(transmembrane serine protease 2)というタンパク質とウイルスとの間の結合を妨害する戦略を使用してSARS-CoV-2の治療剤及びワクチンを開発している(Mattew Z T et al., Natrue reviews immunology, 20:363-374, 2020)。
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は、タンパク質構造が不安定であるため、986(K)および987(V)に対するプロリン置換を通じてミスフォールディング(misfolding)またはトリガーリング(triggering)を防止し、prefusion stabilized viral glycoproteinがより優れた免疫原(immunogen)として作用するという特徴がMERS-CoV, SARS-CoVの先行研究により確認された(Jesper Pallesen et al. PNAS, 2017, DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.1707304114).
一方、SARS-CoV-2は武漢で始まった「D型(D614)」から「欧州型」またはglobal initiative on sharing avian influenza data(GISAID)の基準で「G型(G614)」に変異した状態で、G型変異はウイルス表面のスパイクタンパク質の614番アミノ酸がアスパラギン酸(GAT;Asp,D)からグリシン(GGT;Gly,G)に変異した特徴がある(図1)(Plante, J.A et al. Nature (2020).DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2895-3).
世界的なパンデミックにより、SARS-CoV-2ウイルス感染予防のためのワクチンが次々と開発され、接種が開始されているが、より安定的に効果が持続し、かつ高い免疫原性を示すワクチンの開発が依然として求められている。
一方、遺伝子治療法および遺伝子ワクチンは、医薬分野ですでに証明され、一般的に適用される技術であって、遺伝的疾患だけでなく、自己免疫疾患、感染性疾患、癌または腫瘍関連疾患、炎症性疾患なども治療対象になれる。
遺伝子ワクチンは、ターゲット遺伝子をコードするDNA及びRNAを直接動物に注入すると、ターゲット遺伝子が生きた動物で発現し、この発現により免疫が可能であることが報告されてから開発し始めた(Wolff JA et al. Science, 247:1465-8, 1990)。
遺伝子ワクチン接種は、細菌表面の特徴的な構成要素、ウイルス粒子、腫瘍抗原等のような選択された抗原に対して所望する免疫応答を引き起こすことができるようにする。一般に、ワクチン接種は現代医学の中枢的な成果の一つである。しかし、効果的なワクチンは、現在、限られた数の疾患にのみ用いられることができる。したがって、ワクチン接種で予防できない感染症は依然として毎年数百万人の人々に影響を与えている。
遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種において、DNAとDNAを遺伝子投与のための核酸分子として使用することができ、DNAがRNAに比べて比較的安定し、扱いやすいことが知られている。しかし、DNAの場合、患者のゲノム内に投与されたDNA－切片が所望しない位置に挿入され、遺伝子が損傷する場合、潜在的なリスクが発生する可能性がある。さらに、所望しない抗－DNA抗体が現れる可能性があり、もう一つの問題は、DNA投与およびその後の転写／翻訳によって発現されるペプチドまたはタンパク質の発現レベルが限定的であることである。DNA転写を調節する特定の転写因子の存在有無が投与されたDNAの発現レベルに主要な影響を及ぼし、特定の転写因子のない場合には、DNA転写によって十分な量のRNAが生成されず、結果的に翻訳されて生成されるペプチドまたはタンパク質のレベルも限定される。
一方、RNAを遺伝子投与のためのツールとして使用する場合、RNAは転写を必要とせず、DNAのように核に入る必要がなく、細胞質内で直接タンパク質を合成できるため、細胞染色体内に入り込んで所望しない遺伝子損傷を引き起こすおそれがない。また、DNAに比べて半減期が短く、長期的な遺伝子変形を誘導しない(Sayour EJ, et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015)。一般的なRNAワクチンは、細胞内に送達されると短期間だけ活性化されてターゲットタンパク質を発現するようになり、数日内に酵素学的反応により破壊され、発現したターゲット抗原(タンパク質)に対する特異的な免疫反応は残る。
また、遺伝子投与のためのツールとしてRNAを使用する場合、核膜を通過する必要がなく、細胞膜のみを通過すれば作用するため、DNAより少ない量を使用しても、DNAと同じ量のターゲットタンパク質を発現させることができる。また、RNAはそれ自体が免疫強化原性を有するため、DNAに比べて少量だけ投与しても同じ免疫効果が得られる。
遺伝子ワクチン接種のために、DNAの代わりにRNAを用いることで、所望しないゲノムへの統合及び抗－DNA抗体の生成のリスクを最小化又は防止することができる。しかし、RNAは遍在するRNaseによって容易に分解されるかなり不安定な分子種である。
過去数年間に多くの発展がなされてきたが、免疫反応を引き起こすことができるmRNAワクチン接種のための効率的な方法として、抗原の早期分解または細胞でのmRNAの非効率的な放出によるmRNAの非効率的な翻訳によって投与効果が損なわれない方法を提供する必要性が当該分野に未だ残っている。さらに、潜在的な安全性のおそれを減らし、ワクチンを第3世界でも接種できるようにするために、mRNAワクチンの容量を減少させる必要性も存在する。
生物学的システムで所望の反応を得るための核酸送達に関しては、まだ解決すべき課題が多い。核酸ベースの治療剤には大きな可能性があるが、この可能性を実現するためには、細胞または有機体内から適切な部位に核酸を効果的に送達する必要がある。
しかし、治療および予防目的での核酸の使用は、現在、2つの問題に直面している。第一に、遊離RNAは血漿中のヌクレアーゼによる分解に弱い。第二に、遊離RNAは、それを翻訳する翻訳機構が存在する細胞内の区画に接近する能力が限られている。中性脂質、コレステロール、PEG、ペグ化脂質及びオリゴヌクレオチドのような他の脂質構成要素とカチオン性脂質から形成された脂質ナノ粒子を導入することが、血漿中のRNAの分解を遮断し、核酸の細胞吸収を促進するために試みられている。
そこで、本発明者らは、保管安定性に優れ、体内免疫原性に優れるSARS-CoV-2に対する予防用ワクチンを開発しようと鋭意努力した結果、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質(spike protein)に対する変異抗原をコードする核酸を特定の脂質組成を有する脂質ナノ粒子(LNP：Lipid nanoparticle)またはリポソーム(liposome)に搭載したmRNAワクチンを開発し、前記ワクチンが優れた安定性とin vivoで高い免疫原性を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、EG-COVIDと名付けられた優れた安定性と高い免疫原性を示すSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物を提供する。
本発明によるワクチン組成物は、リポソームまたは脂質ナノ粒子をさらに含むことができ、前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質およびコレステロールを含むことができる。
本発明はまた、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用組成物を投与する段階を含むSARS-CoV-2感染の予防方法を提供する。
本発明はまた、SARS-CoV-2感染の予防のための前記SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含む組成物の用途を提供する。
本発明はまた、SARS-CoV-2感染の予防用薬剤の製造のための前記SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用組成物の使用を提供する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当該技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
本発明は、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物に関する。
本発明において、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原は、野生型のS抗原および1つ以上のアミノ酸変異を含む変異(variant)S抗原を含む概念として使用される。
特に、本発明におけるSARS-CoV-2ウイルスのS抗原は、スパイクタンパク質の構造を安定化させるために、スパイクタンパク質の614G変異体をバックボーンとし、さらに986(K)及び987(V)がプロリン(Proline)に置換され、及び／又は682～685のアミノ酸配列であるRRARがQQAQに変異された配列(CV-SF-614Gm)が好ましいが、これに限定れない。
また、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNA内のグアニンとシトシンの含量を増加させ、mRNAの安定化及び人における翻訳効率を増加させる目的で配列最適化を行い、詳細にはRNA安定性を予測できる指標のうちRNA fold、RNA fold thermodynamic ensemble、RNA構造、cofoldの熱力学的エネルギーを確認し、その結果に基づいて△G値が最も低いCV-SF-WT-614D(SARS-CoV-2 spike proteinをコードするmRNA、配列番号1)及びCV-SF-614Gm(SARS-CoV-2 614G variantのspike proteinをコードするmRNA、配列番号2)を選択した(表1)。
本発明のワクチン組成物は、リポソームまたは脂質ナノ粒子(LNP, lipid nanoparicle)をさらに含有してもよく、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAは、リポソームまたは脂質ナノ粒子の外部に吸着(adsorption)または会合したり、内部にカプセル化または封入(encapsulation)された状態であってもよい。
本発明のワクチン組成物に含まれる前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含み、好ましくは中性脂質をさらに含んでもよい。
前記カチオン性脂質は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、C12-200、1,2－ジオレオイル－3－トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、3β－[N－(N′,N′－ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)carbamoyl cholesterol, DC-Chol)、1,2－ジオレオイルオキシ－3－ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、1,2－ジ－O－オクタデセニル－3－トリエチルアンモニウムプロパン(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2－ジミリストレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,14：1 Etyle PC)、1－パルミトイル－2－オレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16：0-18:1 Ethyl PC)、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC)、1,2－ジステアロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18：0 Ethyl PC)、1,2－ジパルミトイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16：0 Ethyl PC)、1,2－ジミリストイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC)、1,2－ジラウロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12：0 Ethyl PC)、N1－[2－((1S)－1－[(3－アミノプロピル)アミノ]－4－[ジ(3－アミノ－プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]－3,4－ジ[オレイルオキシ]－ベンズアミド(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5)、1,2－ジミリストイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane,14：0 DAP)、1,2－ジパルミトイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0DAP), 1,2－ジステアロイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18：0 DAP)、N－(4－カルボキシベンジル)－N,N－ジメチル－2,3－ビス(オレオイルオキシ)プロパン－1－アミニウム(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ)、1,2－ステアロイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP)、1,2－ジパルミトイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA)、1,2－ジミリストイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP)及びN4－コレステリル－スペルミン(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)からなる群から選択される1つ以上であることが好ましいが、これらに限定されず、最も好ましくはC12-200または1,2－ジオレオイル－3－トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)であってもよいが、これに限定されない。
カチオン性リポソームが一般的に毒性があると知られているが、本発明によるワクチン組成物の場合、mRNAの吸着によって毒性がなくなるという特徴がある(Filion, M. C., & Phillips, N. C., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1329(2), 345-356. 1997)。
本発明によるカチオン性脂質を含むリポソームまたは脂質ナノ粒子は、さらに中性脂質を含んでもよい。
前記中性脂質は、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホエタノールアミン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)、1,2－ジミリストイル－sn－グリセロ－3－ホスファチジルコリン(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine、DMPC)、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2－dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)、1,2－ジパルミトイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)、1,2－ジステアロイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)、1,2－ジリノレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスホエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスホリック酸(PA)、ホスファチジルコリン(PC)及びDOPI(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol))、DSPI(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol)からなる群から選択されてもよいが、これらに限定されず、最も好ましくは1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホエタノールアミン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DOPE)であってもよいが、これに限定されない。
本発明によるリポソームまたは脂質ナノ粒子は、さらに、protamine、albumin、transferrin、PTD(protein transduction domains)、CPP(cell penetrating peptide)、Polyethylene glycol(PEG)、Pegylated lipid、金属イオンが結合した脂質およびMacrophage targeting moietyからなる群から選択される1つ以上の送達用因子をさらに含んでもよい。
本発明において、好ましいカチオン性脂質の例である「DOTAP(Dioleoyl-3-trimethylammonium propane)」は、化学式1の構造を有するカチオン性乳化剤であって、繊維柔軟剤として使用されており、近年、リポソームまたは脂質ナノ粒子を形成する核酸担体をはじめ、タンパク質、化合物、ペプチドなどの担体として使用されている。
また、本発明において、好ましい中性脂質の例である「DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)」は、化学式2の構造を有し、カチオン性リポソームまたは脂質ナノ粒子を形成するための補助脂質として使用される。
本発明によるリポソームまたは脂質ナノ粒子において、前記カチオン性脂質と中性脂質の重量比は、1：9～9.5：0.5、好ましくは2：8～9：1、より好ましくは3：7～8：2、最も好ましくは4：6～7：3であってもよい。
本発明において、前記本発明によるリポソームまたは脂質ナノ粒子は、コレステロールをさらに含んでもよい。本発明のリポソームまたは脂質ナノ粒子において、カチオン性脂質とコレステロールの重量比は、6：1～1：3、好ましくは4：1～1：2.5、より好ましくは3：1～1：2、最も好ましくは2.5：1～1：1.5であってもよいが、これらに限定されない。
また、本発明において、前記本発明によるリポソームまたは脂質ナノ粒子にカチオン性脂質、中性脂質およびコレステロールが全て含まれる場合、カチオン性脂質、中性脂質およびコレステロールの重量比は、1～9.5：0.5～9：0.05～3、好ましくは3～8：7～1：0.45～7.0、より好ましくは1～3.5：1～3.5：0.5～3であってもよいが、これらに限定されない。
本発明の一態様において、カチオン性脂質、中性脂質及びコレステロールの重量比は、2：2：1(40：40：20 w/w/w)を使用したが、これに限定されない。
コレステロールがさらに含まれる場合、例示的にDOTAP：DOPEを1：1の重量比で使用する場合、コレステロールをDOTAPに対して0.2～0.85、好ましくは0.4～0.6の重量比の比率で混合してリポソームまたは脂質ナノ粒子を製造することができる。
また、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物において、リポソームまたは脂質ナノ粒子とmRNAの混合比率はN：P ratioで表示することができ、N：P ratioによってmRNA発現及び組成物の安定性に影響を及ぼす。
本発明において、前記リポソームまたは脂質ナノ粒子とmRNAのN：P ratioは、0.2：1～1.4：1であることを特徴とすることができ、好ましくは0.23：1～1.0：1であることを特徴とすることができ、より好ましくは0.46：1～1.0：1であってもよく、本発明においては、例示的に0.6：1のN：P ratioを使用した。
本発明のワクチン組成物は、免疫増強剤をさらに含んでもよいが、必須ではなく、免疫増強剤が存在しなくても十分なワクチン効果を示す。本発明で使用可能な免疫増強剤は、病原体関連分子型(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)に該当してパターン認識受容体(Pathogen recognition receptor, PRR)に反応する物質群、CpG DNA、lipoprotein、flagella、poly I：C、サポニン、スクアレン(Squalene)、トリカプリン(tricaprin)、3D-MPL、非毒性リポオリゴ糖(detoxied lipooligosaccharide, dLOS)からなる群から選択された免疫増強剤であることを特徴とするが、これらに限定されない。
前記免疫増強剤において、前記非毒性リポオリゴ糖(detoxied lipooligosaccharide, dLOS)は、韓国登録特許第1509456号または韓国登録特許第2042993号に開示された物質であってもよいが、これらに限定されない。
本発明において、LNPとも呼ばれる用語「脂質ナノ粒子」は、1種以上の脂質を含む、おおよそナノメートル(例えば、1～1,000nm)の少なくとも1つの規模を有する粒子を指す。一部の実施態様では、これらの脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、荷電された脂質、ステロイド、およびポリマー接合脂質から選択される1種以上の賦形剤を含む。一部の実施態様では、mRNAまたはその部分は、脂質ナノ粒子の脂質部分に、または脂質ナノ粒子の一部またはすべての脂質部分によって囲まれた水性空間にカプセル化され、酵素的分解、あるいは宿主有機体または細胞のメカニズム、例えば、否定的な免疫反応によって誘導された他の所望しない効果からmRNAまたはその部分を保護する。一部の実施態様では、mRNAまたはその部分は、脂質ナノ粒子と会合する。
本発明の文脈において、脂質ナノ粒子は、任意の特定の形態に限定されず、例えば、水性環境および／または核酸化合物の存在下で、カチオン性脂質またはイオン性脂質、および選択的に1種以上の追加の脂質を組み合わせたときに生成される任意の形態を含むものと解釈されるべきである。例えば、リポソーム、脂質複合体、リポプレックス(lipoplex)などは、脂質ナノ粒子の範囲内にある。
様々な実施態様において、脂質ナノ粒子は、約30nm～約400nm、約50nm～約400nm、約70nm～約400nm、約90nm～約400nm、約110nm～約400nm、約130nm～約400nm、約150nm～約400nm、約200nm～約400nm、約250nm～約400nm、約300nm～約400nm、約350nm～約400nm、約70nm～約90nm、約80nm～約90nm、約70nm～約80nm、または約30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nmの平均直径を有し、実質的に無毒性である。一部の実施態様では、mRNAは、脂質ナノ粒子に存在する場合、水溶液中のヌクレアーゼによる分解に抵抗する。本明細書で使用されたように、平均直径は、動的光散乱によって決定したz－平均値で表すことができる。
LNPは、1つ以上の核酸分子が付着するか、1つ以上の核酸分子がカプセル化される粒子を形成できる任意の脂質を含んでもよい。用語「脂質」とは、脂肪酸の誘導体(例えば、エステル)であり、一般的に水には不溶性であるが、多数の有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物群を指す。脂質は通常、少なくとも3つの部類に分けられる：(1)脂肪や油だけでなくワックスも含む「単純脂質」; (2)リン脂質や糖脂質を含む「複合脂質」; 及び(3)ステロイドなどの「誘導脂質」。
mRNAを含むLNPは、本明細書に定義されたような1種以上のカチオン性脂質および1種以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は、中性脂質およびペグ化脂質を含む。
LNPはカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、好ましくはカチオン化できる特徴を有する。すなわち、カチオン性脂質は、pHがこの脂質のイオン化できる基のpKaの下に低下することによりプロトン化されるが、より高いpH値では徐々に中性である。正に帯電するとき、該脂質は負に帯電した核酸と会合することができる。一部の実施態様では、カチオン性脂質は、pH減少時に正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。LNPは、1つ以上の核酸分子が付着するか、1つ以上の核酸分子がカプセル化される粒子を形成することができる任意の脂質を含んでもよい。
一部の実施態様では、LNPは、任意の追加のカチオン性またはカチオン化できる脂質、すなわち、生理学的pHなどの選択的なpHで正味の正電荷を保有する複数の脂質種のいずれかを含んでもよい。
また、本発明は、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物の製造方法を提供する。
本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物の製造方法は、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAまたはこれを含む溶液またはバッファーに、リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む溶液またはバッファーを追加することを特徴とする。
SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAやリポソームまたは脂質ナノ粒子は、凍結乾燥された状態の粉末の形で提供されてもよく、適切な溶液またはバッファーに溶解された状態で提供されてもよい。SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAやリポソームまたは脂質ナノ粒子が凍結乾燥された状態で提供される場合、適切な溶液またはバッファーに溶解させた後、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAまたはこれを含む溶液またはバッファーに、リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む溶液またはバッファーを追加することにより、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物を製造することができる。
また、さらに本発明によるSARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするワクチン組成物にdLOSが含まれる場合、dLOSまたはこれを含む溶液またはバッファーに、ARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAまたはこれを含む溶液またはバッファーを追加し、リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む溶液またはバッファーを追加することにより、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物を製造することができる。
dLOSは凍結乾燥された状態の粉末の形で提供されてもよく、適切な溶液またはバッファーに溶解した状態で提供されてもよい。dLOSが凍結乾燥された状態で提供される場合、適切な溶液またはバッファーに溶解させて使用されてもよい。
本発明の一態様では、本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチンであるEG-COVIDの凍結乾燥剤形であるF-EG-COVIDが－2～8度で8週間の保管期間を経た後も優れた免疫原性を示すことを確認した(図7)。
本発明で使用されるカチオン性リポソームは、倉庫効果(depot effect)を有すると知られており(Therapeutic Advances in Vaccines 2(6)：159-82)、本発明の他の態様では、カチオン性リポソームを送達体として使用したSARS-CoV-2予防用ワクチンであるEG-COVIDをラットの左側大腿部筋肉に投与し、時間の経過に伴うラットの血清及び各組織におけるCV-SF-614G mRNAの発現を確認し、時間が経過しても投与された部位のみでCV-SF-614G mRNAが発現することを確認した(図8)。
本発明の他の態様では、SARS-CoV-2予防用ワクチンであるEG-COVIDを投与したマウスの血清を用いてVero 76細胞におけるSARS-CoV-2感染抑制効果を確認した結果、EG-COVIDのmRNA含量が増加するにつれて感染抑制効果が増加することを確認した(図9A)。
本発明の他の態様では、本発明のEG-COVIDがSARS-CoV-2変異株であるアルファ変異株及びベータ変異株に対しても優れた交差免疫効果を示すことを確認した(図9B)。
他の観点から、本発明は、SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用組成物を投与する段階を含むSARS-CoV-2感染の予防方法に関する。
他の観点から、本発明は、SARS-CoV-2感染の予防のための前記SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含む組成物の用途に関する。
他の観点から、本発明は、SARS-CoV-2感染の予防用薬剤の製造のための前記SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用組成物の使用に関する。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従い、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であるといえる。
実施例1：mRNA配列の選定
mRNAの配列は、スパイクタンパク質の構造を安定化させるために、986(K)及び987(V)をプロリン(Proline)に置換し、682～685のアミノ酸配列であるRRARをQQAQに変異させた配列(CV-SF-614Gm)をコードするものを使用した。
mRNAの配列は、スパイクタンパク質の構造を安定化させるために、986(K)及び987(V)をプロリン(Proline)に置換し、682～685のアミノ酸配列であるRRARをQQAQに変異させた配列(CV-SF-614Gm)をコードするものを使用した。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びSARS-CoV-2 614G変異体のスパイクタンパク質配列に対して、mRNA内のグアニンとシトシンの含量を増加させてmRNAの安定化および人における翻訳効率を増加させる目的で、下記3種のプログラムを用いて配列最適化を行った。
Program1: GenSmart codon optimization program (Genscript)
Program2: Integrated DNA technologies codon optimization program (IDT, Integrated DNA Technologies)
Program3: GenArt codon optimization program (Thermo Fisher)
Program1: GenSmart codon optimization program (Genscript)
Program2: Integrated DNA technologies codon optimization program (IDT, Integrated DNA Technologies)
Program3: GenArt codon optimization program (Thermo Fisher)
細部的にRNA安定性を予測できる指標のうち、RNA fold、RNA fold thermodynamic ensemble、RNA構造、cofoldの熱力学的エネルギーを確認し、一般的に△Gが低いほど熱力学的に安定であると知られているため、△G値が最も低いProgram3で導き出された配列として、CV-SF-WT-614D(SARS-CoV-2 spike proteinをコードするmRNA、配列番号1)及びCV-SF-614Gm(SARS-CoV-2 614G variantのspike proteinをコードするmRNA、配列番号2)を選択した。
選定されたmRNA配列はTriLink BioTechnologies社に依頼し、インビトロ転写により合成した。
CV-SF-WT-614D及びCV-SF-614GmのDNA配列をそれぞれ配列番号3及び配列番号4に示し、CV-SF-WT-614D及びCV-SF-614Gmのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号5及び配列番号6に示した。
実施例2：Film methodを用いたリポソーム送達体の製造
DOTAP(Merck & Cie/CH2900014)、DOPE(Avanti Polar Lipid)及びコレステロール(Avanti Polar Lipid)にクロロホルムをそれぞれ混合して40：40：20の比率になるようにし、37℃で10分間完全に溶解して液状溶液に調製した。
DOTAP(Merck & Cie/CH2900014)、DOPE(Avanti Polar Lipid)及びコレステロール(Avanti Polar Lipid)にクロロホルムをそれぞれ混合して40：40：20の比率になるようにし、37℃で10分間完全に溶解して液状溶液に調製した。
丸底フラスコに前記液状溶液を一定の重量比で混合して脂質混合物(lipid mixture)を作製し、Rotary evaporator(Buchi/B491_R200)でDOTAPを含有する脂質混合物を60℃で30分間揮発させてクロロホルムを飛ばし、フラスコ壁面に脂質膜フィルムを製作した。
フラスコに4%(w/v)のスクロースを含む20mM HEPESバッファー(pH7.4)を入れ、60℃で脂質膜を溶解してリポソームを形成した。形成されたリポソームは動的光散乱分析装備で粒子サイズ、ゼータ電位、分散度を測定した。製造された残りのリポソームは試験まで4℃の冷蔵庫に保管した。
実施例3：リポソームの脂質組成によるin vitro発現の確認
リポソームに対してPhosphatidylcholine(以下、「PC」)系の脂質をPhosphoethanolamine(以下、「PE」)系の脂質に変更する場合、Erythropoietin(以下、「EPO」)タンパク質の発現量が約7倍増加するという研究結果が報告された(Dowhan W et al., New Comprehensive Biochemistry, 36(4)：1-35, 2002; Leung A-KK et al., The journal of physical chemistry B, 119(28)：8698-8706, 2015; Kauffman KJ et al., Nano letters, 15(11):7300-7306, 2015)。
リポソームに対してPhosphatidylcholine(以下、「PC」)系の脂質をPhosphoethanolamine(以下、「PE」)系の脂質に変更する場合、Erythropoietin(以下、「EPO」)タンパク質の発現量が約7倍増加するという研究結果が報告された(Dowhan W et al., New Comprehensive Biochemistry, 36(4)：1-35, 2002; Leung A-KK et al., The journal of physical chemistry B, 119(28)：8698-8706, 2015; Kauffman KJ et al., Nano letters, 15(11):7300-7306, 2015)。
そこで、mRNAの送達効率を高めるための最適のリポソームの組成を探索するために、従来の帯状疱疹ワクチン(EG-HZ)に適用されたカチオン性リポソームの構成脂質であるDOTAP/DMPCにコレステロール(Chol)を追加したり、DMPCを1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(以下、「DOPE」)に置き換えるなど、下記4つの組成のリポソームを用いてin vivo内でmRNAの送達効率を高めることができる最適の条件を探求しようとした。
第1グループ：DOTAP/DMPC (50：50, w/w)
第2グループ：DOTAP/DMPC/Chol(40：40：20, w/w/w)
第3グループ：DOTAP/DOPE(50：50, w/w)
第4グループ：DOTAP/DOPE/Chol(40：40：20, w/w/w)
第1グループ：DOTAP/DMPC (50：50, w/w)
第2グループ：DOTAP/DMPC/Chol(40：40：20, w/w/w)
第3グループ：DOTAP/DOPE(50：50, w/w)
第4グループ：DOTAP/DOPE/Chol(40：40：20, w/w/w)
前記互いに異なる脂質からなるリポソームを調製し、これに20μgのRenilla luciferase(TriLink BioTechnologies)及び80μgのリポソームを混合した後、6週齢、雌C57BL/6Nマウス[Japan SLC](中央実験動物)に総100μLずつ筋肉内投与した(n=4～5/group)。投与6時間後、Avertin working solutionを250mg/kgで腹腔内投与してマウスを麻酔し、Renilla luciferase substrate stock solution (0.37mg/vial)に1X PBS 2.4mLを入れて0.15mg/mLにした後、1mg/kgで尾静脈内投与した。基質投与の直後、In vivo imaging system(IVIS)(Ami HTX)にマウスを入れ、露出時間を60秒に設定して撮影し、投与部位のRegion of interest(以下、「ROI」)値を比較した。
その結果、図2に示すように、DOTAP/DOPE/Cholが40:40:20(w/w/w)の比率で混合されたカチオン性リポソームが体内送達効率が最も高いことを確認し、これをCV-LP-b1と名付け、EG-COVIDのmRNA送達体システムとして使用した。
実施例4：リポソーム特性の分析
SARS-CoV-2ウイルス感染予防用ワクチンであるEG-COVIDの開発のために、実施例3で確認したmRNA送達体であるCV-LP-b1の各3倍値について物理的特性を分析した。
SARS-CoV-2ウイルス感染予防用ワクチンであるEG-COVIDの開発のために、実施例3で確認したmRNA送達体であるCV-LP-b1の各3倍値について物理的特性を分析した。
4%のスクロースを含む20mM HEPES buffer(pH 7.4)に混合したリポソームCV-LP-b1に対してMalvern/ZSPを用いてdynamic light scattering(DLS)分析を行い、粒子サイズ、分散度、ゼータ電位の平均と標準偏差を導き出した。
その結果、CV-LP-b1の平均的な粒子サイズは80.3±3.0d. nm、分散度は0.194±0.010、ゼータ電位は50.7±3.0mVと測定された。
一般的なリポソームのサイズが50-250d.nmであることを考慮すると(韓国公開特許第2014-0097215号)、前記リポソームのサイズは適切なレベルであり、リポソームのゼータ電位が正電荷である場合、30mV以上のときにはaggregationが発生せず、構造が安定的に維持されることが知られているが(Antisense drug technology; Principles, Strategy, and Application, CRC press, second edition, 253, 2007)、リポソームのゼータ電位はそれ以上に分析されたため、静電気的に安定していることが推測できる。それと共に、リポソームのPDIがすべて0.25以下に示されたため、リポソームは安定した状態の単分散に近い粒子分布を有することも確認できた(Appl. Chem.Eng., 28 (2)：177-185, 2017)。
実施例5．NP ratioの確認
4%のスクロースを含む20mM HEPES (pH 7.4)に実施例1、2で製造したリポソーム(liposome、以下、「LP」)及びmRNAを主成分として混合して吸着させることにより、mRNAリポソーム複合体を製造した。
4%のスクロースを含む20mM HEPES (pH 7.4)に実施例1、2で製造したリポソーム(liposome、以下、「LP」)及びmRNAを主成分として混合して吸着させることにより、mRNAリポソーム複合体を製造した。
リポソームとmRNAの混合比率であるN/P比率は次の計算式で計算し、製造された複合体は配列番号8のEGFP mRNA－リポソーム複合体、配列番号7のRLuc mRNA－リポソーム複合体、及び配列番号2のCV-SF-614GmのmRNA－リポソーム複合体であり、それぞれDLS、in vivo発現および免疫原性実験に使用した。
リポソームと複合体を形成するmRNAに対するNP比率を異にしてmRNA－リポソーム複合体を調製し、mRNA－リポソーム複合体に対するin vivo発現確認をマウスを用いて行った。
6週齢の雌マウス(C57BL/6N、ORIENT BIO、中央実験動物)にRlucを発現するmRNA複合体を100μLの用量で大腿部の三頭筋に筋肉内投与(intramuscular injection)した。
試験物質の投与6時間後、Avertin working solutionを250mg/kgで腹腔内投与して麻酔し、Renilla luciferase substrate stock solution(0.37mg/vial, Promega)に1X PBS 2.4mLを加えて0.15mg/mLにした後、1mg/kgで尾静脈内投与(intravenous injection)した。投与直後、Ami-HTX(Spectral Instruments Imaging, USA)を用いて露出時間を60秒に設定してマウスを撮影し(xenogen IVIS-200)、Aura Imaging Software(Spectral Instruments Imaging, USA)を用いて投与部位の発現程度を数値化した。
その結果、図3に示すように、NP比率が0.23以上でマウスにおいてmRNA発現効率が上昇し、0.46：1～1.0：1で発現が最も高いことが分かった。下記実験では、mRNAとリポソームの混合比率をNP比率=0.6に設定して実験を行った。
実施例6．選別されたリポソームによるin vitro Expression
CV-LP-b1にCV-SF-614Gmを混合した剤形(以下、「EG-COVID」)に対してin vitro発現を確認し、正常に発現するかどうかを確認した。
CV-LP-b1にCV-SF-614Gmを混合した剤形(以下、「EG-COVID」)に対してin vitro発現を確認し、正常に発現するかどうかを確認した。
HEK293T細胞(Homo sapiens embryonic kidney 293T cell, CRL-3216/ATCC)を100mm dishに2 X 106細胞/dishでseedingした後、37℃, CO2培養器で一晩培養し、細胞のconfluency 60～70%のとき、転入(transfection)を行った。
CV-SF-614Gmの転入(transfection)のために、lipofectamine 3000(Thermo Fisher)及びCV-LP-b1を混合して細胞に37℃、CO2培養器で24時間処理した。
24時間後、細胞培養液を全て除去し、D-PBSで洗浄した後、氷上でcell lysis solution 1Xを100mm培養皿に400μL分注した後、スクレーパーを使用して1.7mLチューブに細胞を集め、ボルテックスした後、15000rpm、4℃、15分遠心分離して上層液のタンパク質を回収した。回収されたタンパク質は定量した後、20ug/wellのタンパク質に対してSDS-PAGEを行い、ウエスタンブロットを行った。
ウエスタンブロットに使用した抗体は次の通りである。
SARS-CoV-2 antibody [NB100-56578/Novus biologicals/ab092903c-15, (immunogen; SARS-CoV-2, amino acid 1124-1140 from S2 protein)]
SARS-CoV-2 antibody [MBS434243/Mybiosource/T1218EL, (immunogen; SARS-CoV-2 S-full protein)]
SARS-CoV-2 antibody [40591-MM42/Sino biological/HA14AP3001, (immunogen; SARS-CoV-2 S1-mFC protein)]
β-actin rabbit mAb HRP conjugate [5125/Cell signaling/6]
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP [G21234/Thermo/2087715]
Goat anti-mouse IgG secondary antibody, HRP [SSA007/Sino biological/HO21OC1101]
ウエスタンブロットに使用した抗体は次の通りである。
SARS-CoV-2 antibody [NB100-56578/Novus biologicals/ab092903c-15, (immunogen; SARS-CoV-2, amino acid 1124-1140 from S2 protein)]
SARS-CoV-2 antibody [MBS434243/Mybiosource/T1218EL, (immunogen; SARS-CoV-2 S-full protein)]
SARS-CoV-2 antibody [40591-MM42/Sino biological/HA14AP3001, (immunogen; SARS-CoV-2 S1-mFC protein)]
β-actin rabbit mAb HRP conjugate [5125/Cell signaling/6]
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP [G21234/Thermo/2087715]
Goat anti-mouse IgG secondary antibody, HRP [SSA007/Sino biological/HO21OC1101]
その結果、図4Aに示すように、lipofectamine 3000(Thermo Fisher)を用いたCV-SF-614Gm濃度による発現が濃度依存的に示されることを確認し、さらに、図4Bに示すように、互いに異なるCV-SF-614Gm量で構成されたEG-COVIDによる発現を観察した結果、S proteinが正常に発現されることを確認した。
実施例8．mRNA(CV-SF-614Gm)用量による免疫原性の確認
6週齢、female、B6C3F1/slc mouse(中央実験動物)に互いに異なるmRNA用量をCV-LP-b1に混合し、0.1HD(human dose)でマウスに3週間隔で2回投与した後、最終免疫化2週間後にマウスを犠牲にして血清を分離し、indirect ELISA法でSARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain、以下「RBD」)のタンパク質特異的total IgG抗体価(log10)を分析してend-point titerを導き出した。
6週齢、female、B6C3F1/slc mouse(中央実験動物)に互いに異なるmRNA用量をCV-LP-b1に混合し、0.1HD(human dose)でマウスに3週間隔で2回投与した後、最終免疫化2週間後にマウスを犠牲にして血清を分離し、indirect ELISA法でSARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain、以下「RBD」)のタンパク質特異的total IgG抗体価(log10)を分析してend-point titerを導き出した。
mRNA－リポソーム複合体の免疫原性を確認するために、6週齢の雌B6C3F1/slcマウス(Japan SLC)を対象動物として選定し、互いに異なるmRNA用量をCV-LP-b1に混合して0.1HD(human dose)でマウスに3週間隔で2回投与した後、最終免疫化2週間後にマウスを犠牲にして血清を分離し、indirect ELISA法でSARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain、以下「RBD」)のタンパク質特異的total IgG抗体価(log10)を分析してend-point titerを導き出した。
8-1：血液の採取
最後投与の2週間後にAvertin working solutionを250mg/kgで腹腔内投与してマウスを麻酔し、心臓採血により得られた全血を採取した。前記採取した全血をマイクロチューブに移し、常温で3時間静置した後、4℃、15,000rpmの条件で10分間遠心分離し、上層液を新しいマイクロチューブに移し、血清を確保して分析するまで－20℃で保管した。
最後投与の2週間後にAvertin working solutionを250mg/kgで腹腔内投与してマウスを麻酔し、心臓採血により得られた全血を採取した。前記採取した全血をマイクロチューブに移し、常温で3時間静置した後、4℃、15,000rpmの条件で10分間遠心分離し、上層液を新しいマイクロチューブに移し、血清を確保して分析するまで－20℃で保管した。
8-2：脾臓細胞の再刺激(Splenocyte restimulation)
頸椎脱臼でマウスを犠牲にして脾臓を摘出した後、各グループの脾臓をプーリング(pooling)し、1%のペニシリンストレプトマイシン溶液が添加されたPBS(以下、「PBS w/antibiotics」)が分注された24ウェルプレートに移した。使用した培地は表3及び表4に示した。
頸椎脱臼でマウスを犠牲にして脾臓を摘出した後、各グループの脾臓をプーリング(pooling)し、1%のペニシリンストレプトマイシン溶液が添加されたPBS(以下、「PBS w/antibiotics」)が分注された24ウェルプレートに移した。使用した培地は表3及び表4に示した。
脾臓組織をクリーンベンチ内で抗生物質を含むPBSで洗浄した後、3mLの基本培地(basal media)が入った60mm皿に移し、40μmのセルストレーナー(cell strainer)で組織を粉砕して脾臓細胞(splenocyte)を分離した。分離された脾臓細胞を15mLチューブに移した後、4℃、3,000rpmの条件で5分間遠心分離し、上層液を除去し、脾臓細胞を3mLのRBC溶解バッファー(Thermo Fisher)を処理して常温で3分間静置した後、4℃、3,000rpmの条件で5分間遠心分離した。
上層液を除去し、細胞を3mLの抗生物質を含むPBSで懸濁し、4℃、3,000rpmの条件で5分間遠心分離し、上層液を除去した後、細胞を10mLの完全培地(complete media, Gibco)に懸濁した。
前記細胞懸濁液を完全培地を用いて2 X 107 cells/mLになるように希釈した後、96ウェル細胞培養プレートに100μL/wellで分注した。
PepMix SARS-CoV-2-S1ペプチドプール(JPT Peptide Technologies)及びS2ペプチドプール(JPT Peptide Technologies)を各1バイアルに50μLのDMSOを入れて溶解した後、最終濃度2.5μg/mLになるように完全培地と混合してSARS CoV-2スパイクペプチド刺激剤(stimulant)を製造した。
前記細胞懸濁液が入った96ウェルに前記刺激剤(stimulant)を40μg/well及び完全培地を60μL/wellずつ添加し、37℃、5%CO2の条件で72時間反応させた。
8-3：抗体価の分析
1X PBSを用いてRBD抗原(Mybiosource, USA)を1μg/mLに希釈した後、イムノプレート(immunoplate)に100μLずつ分注し、シーリングフィルムを覆って4℃の冷蔵庫で一晩静置した。20X PBSを精製水で希釈して1Lの1X PBSを準備し、500μLのtween20を入れて洗浄バッファーを調製した。ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して5回洗浄した。
1X PBSを用いてRBD抗原(Mybiosource, USA)を1μg/mLに希釈した後、イムノプレート(immunoplate)に100μLずつ分注し、シーリングフィルムを覆って4℃の冷蔵庫で一晩静置した。20X PBSを精製水で希釈して1Lの1X PBSを準備し、500μLのtween20を入れて洗浄バッファーを調製した。ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して5回洗浄した。
1gのBSAを100mLのPBSに溶解して試薬希釈剤(reagent diluent, 1%BSA)を調製した後、前記イムノプレートに200μL/wellずつ分注し、シーリングフィルムを覆って37℃の反応器で1時間静置した。ELISA washerで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して5回洗浄した。試薬希釈剤をイムノプレートに100μL/wellずつ分注した。試薬希釈剤を用いて6-1の方法で得られた血清試料を1：50に希釈した後、イムノプレートのB～Gの1列に100μLで分注し、ウェル内で数回ピペッティングして試料を混合した後、1列から100μLを取り2列に入れる方法でELISAプレート上で試料を12列まで1/2順次希釈(serial dilution)した。
試験の適合性の評価のために、試薬希釈剤を用いて高血清(hyperserum)を1：200に希釈した後、各イミノプレートHの1列に100μLで分注し、前記と同じ方法で1/2順次希釈した。
イムノプレートをシーリングフィルムで覆い、37℃の反応器で2時間反応させた。ELISA washerで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して5回洗浄した。
試薬希釈剤を用いてgoat anti-mouse IgG抗体(Jackson Laboratory)を1：5,000に希釈した後、イムノプレートに100μLずつ分注し、シーリングフィルムを覆って37℃の反応器で1時間反応させた。
ELISA washerで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して5回洗浄した。常温と平衡化させたTMB基質溶液をイムノプレートに100μLずつ分注し、常温の雌牛で5分間反応させた。1N H2SO4溶液をイムノプレートに100μLずつ分注して反応を停止し、ELISA reader(Biotek/Epoch)を使用して450nmで吸光度を測定した。
8-4：Cytokineの分析(ELISA)
IFN-γ ELISA kit(Mouse IFN-γDuoset ELISA, R&D systems)を用いて次の実験を行った。
IFN-γ ELISA kit(Mouse IFN-γDuoset ELISA, R&D systems)を用いて次の実験を行った。
前記6-2の脾臓細胞再刺激法で刺激した脾臓細胞の培養液を試薬希釈剤で1/5希釈し、抗マウスIFN-γ捕捉抗体(Jackson)がコーティングされたマイクロプレートに100μL/wellで分注し、シーリングフィルムを覆って常温で2時間静置した後、ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して3回洗浄した。
試薬希釈剤を用いてキット内のStreptavidin-HRPを1/40に希釈した後、イムノプレートに100μL/wellずつ分注し、シーリングフィルムで覆い、常温で20分間静置した後、ELISA washerで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファーを使用して3回洗浄した。
kit内のanti-mouse IFN-γdetection antibodyをReagent diluentを用いて200ng/mLに希釈した後、immunoplateに100μL/wellずつ分注し、シーリングフィルムを覆って常温で1時間静置した後、ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)で各ウェルの溶液を除去し、wash bufferを使用して3回洗浄した。
TMB基質(KPL sureblue TMB microwell peroxidase substrate, Seracare)溶液をイムノプレートに100μLずつ分注し、常温の雌牛で15分間反応させた後、1N H2SO4溶液をイムノプレートに100μLずつ分注して反応を停止し、ELISA readerを使用して450nmで吸光度を測定した。
8-5：中和抗体形成能(Neutralization)の確認
本発明のEG-COVIDワクチンを投与して得られた血清サンプルに対して、SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test(sVNT) Kit(Genscript)を用いて、前記ワクチンによりウイルス感染が効果的に抑制されるかを確認しようとした。
本発明のEG-COVIDワクチンを投与して得られた血清サンプルに対して、SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test(sVNT) Kit(Genscript)を用いて、前記ワクチンによりウイルス感染が効果的に抑制されるかを確認しようとした。
1.5mL microtubeに前記negative control、positive control、血清サンプル60μL及び1:1000 diluted-HRP conjugated RBD 60μLを混合した後、37℃ incubatorで30分間反応させ、Microtiter test strip plateに100μLを分注した後、シーリングフィルムを覆って37℃のincubatorで15分間反応させた。
ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)で各ウェルの溶液を除去し、1X wash solutionを用いて4回洗浄した。
TMB solution(Thermo Fisher)を100μL/wellずつ分注し、シーリングフィルムを覆って常温の雌牛で15分間反応させた後、stop solutionを50μL/wellずつ分注して反応を停止させた後、ELISA reader(Thermo Scientific)を使用して405nmでoptical densityを測定した後、下記のように中和抗体形成能(Neutralization%)を数値化した。
図5Aは、CV-LP-b1にCV-SF-614Gmを混合したmRNA複合体を投与したマウスの血清をELISAで分析したRBD特異的IgGの抗体価を示し、30μg mRNAまで吸着による伝達力に優れていることが確認され、図5Bは、CV-LP-b1にCV-SF-614Gmを混合したmRNA複合体を投与したマウスの血清をELISAで分析したIFN-γ濃度を示し、5μg及び10μg mRNAで高いIFN-γ濃度が示され、図5Cは前記得られた血清をSARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test(sVNT) Kitを用いて分析した中和抗体形成能を示し、5μg以上のmRNAで高い免疫誘導能を示した。
前記結果をHD(human dose)に換算すると、CV-LP-b1は300μg mRNAまでは吸着による伝達力に優れていることが確認され、50μg以上のmRNAが免疫誘導能に適したことと判断した。ただし、IFN-gamma濃度に照らした細胞性免疫においては、5～10μgでかなり優れることがわかった。
実施例9：投与回数による免疫原性の差異
CV-LP-b1に200μgのCV-SF-614GmをNP ratio=0.6：1で混合し、これを凍結乾燥した後、その0.1HDを用いた単回投与と2回投与による免疫原性の差異を確認した。
CV-LP-b1に200μgのCV-SF-614GmをNP ratio=0.6：1で混合し、これを凍結乾燥した後、その0.1HDを用いた単回投与と2回投与による免疫原性の差異を確認した。
B6C3F1/slc, female(中央実験動物)、6週に対し3週間隔で2回免疫化した後、2週間後に犠牲にするか、単回投与の2週後に犠牲にしてから、得られた血清とSplenocyteを用いて免疫原性を確認した(n=6/group)。
実験方法は実施例8と同様に行い、結果を図6に示し、単回投与より、2回投与の方が体液性及び細胞性を含む免疫原性に優れることを確認した。
実験方法は実施例8と同様に行い、結果を図6に示し、単回投与より、2回投与の方が体液性及び細胞性を含む免疫原性に優れることを確認した。
実施例10．凍結乾燥剤形の安定性の確認
現在開発されたmRNAベースのワクチンであるファイザーとモデルナのCOVID-19予防用ワクチンは、mRNA送達体としてlipid nanoparticle(以下、「LNP」)を用いるため、冷蔵保管の安定性が悪く、超低温保管(－20℃～－80℃)状態での流通が求められる。
現在開発されたmRNAベースのワクチンであるファイザーとモデルナのCOVID-19予防用ワクチンは、mRNA送達体としてlipid nanoparticle(以下、「LNP」)を用いるため、冷蔵保管の安定性が悪く、超低温保管(－20℃～－80℃)状態での流通が求められる。
一方、EG-COVIDはカチオン性リポソームを使用して、本実施例ではカチオン性リポソームであるCV-LP-b1とCV-SF-614Gm複合体(EG-COVID)の8週間冷蔵保管した液状剤形であるL-EG-COVIDと凍結乾燥剤形であるF-EG-COVIDのin vivo効能を確認し、0週及び4週間冷蔵保管した完製の免疫原性と比較分析することにより、剤形別の冷蔵保管期間によるin vivo効能の安定性を実施例8と同じ方法で比較した。
本実施例におけるEG-COVIDは100μgのCV-SF-614Gmを含むように製造し、その液状剤形または凍結乾燥剤形に対して一定の期間－2～8℃で保管期間を経た後に、凍結乾燥剤形は再水和してこれに対する免疫原性試験を行い、効能が維持されることを確認しようとした。
実施例2によって製造された液状剤形について、次の方法で凍結乾燥剤形を製造した。
滅菌した2mlのガラスバイアルに液状のEG-COVID剤形を0.65mlずつ分注した後、ゴム栓を半分だけ閉め、凍結乾燥機(ILSHINBIOBASE)に移し、－40度(50mTorr)、10時間、－20度(50mTorr)で10時間、および20度(50mTorr)で20時間の順に凍結乾燥を行った。
凍結乾燥が完了したバイアルは、ゴム栓を完全に閉じて密封し、2～8℃で保管した。
その結果、図7に示すように、液状剤形は4週間保管後は安定性が深刻に低下して免疫原性を誘導できないことが示されたが、凍結乾燥剤形は8週までも安定的に免疫原性を維持することが示され、EG-COVIDの凍結乾燥剤形の保管安定性が非常に優れていることが確認された。
実施例11．生体内分布度の確認(Biodistribution)
本発明によるCOVID-19予防用ワクチンEG-COVIDは、CV-SF-614Gmを体内に効率よく送達するために、mRNA送達体としてカチオン性リポソームを使用している。本発明者らの先行研究でRenilla luciferaseを暗号化するmRNAとCV-LP-b1を混合してマウスに筋肉内投与した後、時間による体内luciferaseタンパク質の発現様相を確認した結果、投与6時間から24時間まで投与部位のみでタンパク質が発現し、他の臓器では発現しないことを確認した。
本発明によるCOVID-19予防用ワクチンEG-COVIDは、CV-SF-614Gmを体内に効率よく送達するために、mRNA送達体としてカチオン性リポソームを使用している。本発明者らの先行研究でRenilla luciferaseを暗号化するmRNAとCV-LP-b1を混合してマウスに筋肉内投与した後、時間による体内luciferaseタンパク質の発現様相を確認した結果、投与6時間から24時間まで投与部位のみでタンパク質が発現し、他の臓器では発現しないことを確認した。
本実施例では、EG-COVIDをラット(rat)に筋肉内投与した後、時間別に投与部位及び投与部位以外の主要臓器におけるCV-SF-614Gmの分布を観察しようとした。そのために、RT-qPCR法を用いてラットのハウスキーピング遺伝子であるGAPDHに対するCV-SF-614Gmの相対値を測定し、EG-COVID投与後、CV-SF-615Gmの体内分布様相を確認した。
本実施例では、時間経過によるCV-SF-614Gmの体内分布様相を確認するために、ラットの左側大腿部筋肉にEG-COVIDを投与した後、それぞれ0、2、6、24、48、72及び120時間後にCV-SF-614Gmが体内に存在するかどうかをRT-qPCRを通じて確認した。
実験動物としては、6週齢、雄SDラット105匹(ORIENT BIO)を使用し、試験群を表5に示した。
試験群ラットの血清及び各組織サンプルを得て、血清及び組織に対してRNeasy Micro kit(QIAGEN/74004)を用いて製造社が推奨する試験方法に従って、Total RNAを抽出し、Nanodrop(Thermo Fisher)を用いてtotal RNAの濃度及び収率を確認した。
ラットのGAPDHをリファレンス遺伝子としてGAPDHプライマー及びプローブセット(Thermo Fisher)を使用し、プライマーの5'末端にはVIC dyeをタグ付けした。
96well(Invitrogen/A28138)または384well plate(Invitrogen/A28140)に下記表9および表10のように、sample1(組織由来RNA)、TaqPath 1-step multiplex master mix(以下、「master mix」、(Thermo Fisher/A28523)), primer & probe, GAPDH assay mix及びnuclease-free waterをMulti-channel pipetteを用いてそれぞれ分注し、最終容量15μLになるようにし、qRT-PCR反応を行った。
各検体に対する反応結果は、GAPDHに対するCV-SF-614Gmの量を確認するために次のように計算した。
GAPDH対CV-SF-614Gm Ct(△R) = CV-SF-614Gmの平均Ct-GAPDHの平均Ct
GAPDH対CV-SF-614Gm Ct(△R) = CV-SF-614Gmの平均Ct-GAPDHの平均Ct
そして、正確な比較のために△Rを指数に換算した。
その後、Group及び時間別、組織別にグラフを作成し、CV-SF-614Gmの体内分布様相を分析した。
その結果、投与部位を含む12種の主要臓器および血清でGAPDHに対するCV-SF-614Gm量を確認した結果、投与部位である左側大腿部筋肉(ISL)のみでCV-SF-614Gmが検出された。
EG-COVID投与2時間後、ISLでGAPDHに対するCV-SF-614Gmの指数相対値が最大57%、6時間後には最大70%と観察された。CV-SF-614Gmは6時間で最も高く検出され、6時間後に徐々に減少し、72時間後には検出されなかった。観察期間中、投与部位以外の主要臓器ではCV-SF-614Gmは確認されなかった(図8a及び図8b参照)。
実施例12．中和抗体力価の評価(Plaque Reduction Neutralization test)
EG-COVIDの中和抗体力価の評価のために、SARS-CoV-2(NCCP 43326、武漢由来ウイルス)の防御能を確認するために以下の実験を行った。
EG-COVIDの中和抗体力価の評価のために、SARS-CoV-2(NCCP 43326、武漢由来ウイルス)の防御能を確認するために以下の実験を行った。
実験動物として6週齢の雌のB6C3F1/slcマウス(n=6/group)(ORIENT BIO)を使用し、陰性対照群及び試験群としてCV-SF-614Gmを含むEG-COVIDをそれぞれ前記動物に3週間隔で2回投与後、2週間後に採血した。
ウイルス実験はBL3施設を保有している国立馬山病院でPRNTを行った。
6 well plateにVero76細胞株(ATCC CRL-1587TM)を8 X 105 cells/wellずつシードした後、24時間培養してsub-confluenceになるように準備した。EG-COVID投与群由来の血清と陰性対照群由来の血清をそれぞれserum free DMEMに1/10倍に希釈した後、1/20480倍まで2-fold連続希釈し、希釈した血清105μLを400pfu/105μLのウイルス(SARS-CoV-2(NCCP 43326))液と1:1で混合した後、37℃で1時間培養した。
Vero76細胞株の培養液を除去し、PBSで洗浄した後、前記血清とウイルス混合溶液200μLを入れた後、15分間隔で振盪し、90分間37℃で培養して感染させた。その後、培養液を除去し、PBSで洗浄して感染していないウイルスを除去した後、2%FBS、1%agaroseを含むDMEM培地(Gibco)で細胞を覆い、3日間37℃のインキュベーターで培養した。培養が終了すると、4%Formaldehyde溶液をagarose上に入れて常温で1時間固定し、agaroseを慎重に除去した後、固定された細胞層を0.5%クリスタルバイオレット(in 20% methanol)溶液で染色した。PBSで3回洗浄した後、plateを完全に乾燥させた。クリスタルバイオレットに染色された感染細胞(以下、「Plaque」)を計数して中和していない対照群と比較してウイルス感染抑制率を導き出し、数式は次の通りである。
(対照群はウイルスを中和していない群)
中和抗体力価は、ウイルス感染抑制率に基づいて、GraphPad Prismsoftwareのnonlinear regressionを用いて減少率が50%になる希釈倍数を算出し、IC50 titer(log10)で導き出した。
その結果、図9Aに示すように、SARS-CoV-2 wild type virus(NCCP43326, The National Culture Collection for Pathogens in Korea)の感染に対して、EG-COVID投与群1(2.5μg/mouse), EG-COVID投与群2(5μg/mouse)及びEG-COVID投与群3(10μg/mouse)でIC50 titer(log10)がそれぞれ3.569±0.418、4.039±0.357及び4.375±0.443(平均±標準偏差)でmRNA含量が増加するにつれて中和抗体力価が増加する傾向を確認した。
また、図9Bに示すように、SARS-CoV-2変異株であるアルファ変異ウイルス(alpha variant)及びベータ変異ウイルス(beta variant)に対しても優れた交差免疫が示されることを確認した。
本発明によるSARS-CoV-2予防用ワクチンは、優れた安定性と追加の免疫増強剤がなくてもin vivoで高い免疫原性を示し、優れたワクチン効果を示すだけでなく、凍結乾燥剤形で製造してもワクチン効果が維持されるため、ワクチンの保管及び使用が簡便で、コロナ19に対する優れた予防効果が期待できる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されないことは明らかであるといえる。従って、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
Claims (16)
- SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAを含むSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記S抗原をコードするmRNAは、配列番号1または配列番号2の塩基配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- リポソームまたは脂質ナノ粒子をさらに含有することを特徴とする、請求項1又は2に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含むことを特徴とする、請求項3に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、さらに中性脂質を含むことを特徴とする、請求項4に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、コレステロールをさらに含むことを特徴とする、請求項4又は5に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記カチオン性脂質は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、C12-200、1,2－ジオレオイル－3－トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、3β－[N－(N′,N′－ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)carbamoyl cholesterol, DC-Chol)、1,2－ジオレオイルオキシ－3－ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、1,2－ジ－O－オクタデセニル－3－トリエチルアンモニウムプロパン(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA)、1,2－ジミリストレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,14：1 Etyle PC)、1－パルミトイル－2－オレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16：0-18:1 Ethyl PC)、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC)、1,2－ジステアロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18：0 Ethyl PC)、1,2－ジパルミトイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16：0 Ethyl PC)、1,2－ジミリストイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC)、1,2－ジラウロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12：0 Ethyl PC)、N1－[2－((1S)－1－[(3－アミノプロピル)アミノ]－4－[ジ(3－アミノ－プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]－3,4－ジ[オレイルオキシ] － ベンズアミド (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5)、1,2－ジミリストイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane,14：0 DAP)、1,2－ジパルミトイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0DAP)、1,2－ジステアロイル－3－ジメチルアンモニウム－プロパン(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18：0 DAP)、N－(4－カルボキシベンジル)－N,N－ジメチル－2,3－ビス(オレオイルオキシ)プロパン－1－アミニウム(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ)、1,2－ステアロイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP)、1,2－ジパルミトイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA)、1,2－ジミリストイル－3－トリメチルアンモニウム－プロパン(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP)及びN4－コレステリル－スペルミン(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項4～6のいずれか1項に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記中性脂質は、1,2－ジミリストイル－sn－グリセロ－3－ホスファチジルコリン(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine、DMPC)、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2－dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)、1,2－ジオレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホエタノールアミン(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)、1,2－ジパルミトイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)、1,2－ジステアロイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)、1,2－ジリノレオイル－sn－グリセロ－3－ホスホコリン(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスホエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスホリック酸(PA)、ホスファチジルコリン(PC)及びDOPI(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol))、DSPI(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol)からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項5に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記カチオン性脂質と中性脂質の重量比は1：9～9.5：0.5であることを特徴とする、請求項5～8のいずれか1項に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記カチオン性脂質とコレステロールの重量比は6：1～1：3であることを特徴とする、請求項6に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記カチオン性脂質、中性脂質及びコレステロールの重量比は1～9.5：0.5～9：0.05～3であることを特徴とする、請求項10に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子とmRNAのN：P ratioは0.2：1～1.4：1であることを特徴とする、請求項3に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 免疫増強剤をさらに含むことを特徴とする、請求項1～12のいずれか1項に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 前記免疫増強剤は、PAMP、サポニン、CpG DNA、リポタンパク質（lipoprotein）、フラジェラ（flagella）、poly I:C、スクアレン(Squalene)、トリカプリン(tricaprin)、3D-MPL、および非毒性リポオリゴ糖(detoxied lipooligosaccharide, dLOS)からなる群から選択される1つ以上の免疫増強剤を含むことを特徴とする、請求項13に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- 凍結乾燥された剤形形態であることを特徴とする、請求項1～14のいずれか1項に記載のSARS-CoV-2予防用ワクチン組成物。
- SARS-CoV-2ウイルスのS抗原をコードするmRNAまたはそれを含む溶液またはバッファーに、リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む溶液またはバッファーを追加することを特徴とする、SARS-CoV-2予防用ワクチン組成物の製造方法。
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