CN116507344A

CN116507344A - 用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的组合物和方法

Info

Publication number: CN116507344A
Application number: CN202180052389.2A
Authority: CN
Inventors: 马丁·P·斯泰因巴克; 洛汉娜·M·西纳帕; 彼得·C·德穆斯; 克里斯托弗·M·哈克; 丽莎·麦克尼尔
Original assignee: Elocio Treatment Co ltd
Current assignee: Elocio Treatment Co ltd
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-07-28

Abstract

本文披露了用于在对象中诱导免疫应答的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白、其肽、或编码其的核酸序列)，以及施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白、其肽、冠状病毒核衣壳蛋白、其肽、或编码其的核酸序列)以在对象中诱导免疫应答的方法。

Description

用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的组合物和方法

优先权声明

本申请要求于2020年6月26日提交的美国临时申请号63/044,773、2020年8月12日提交的美国临时申请号63/064,836、2020年12月11日提交的美国临时申请号63/124,200和2021年2月3日提交的美国临时申请号63/145,200的申请日的权益，其中每一项申请均通过援引以其全文并入本文。

背景技术

冠状病毒是一个能够感染哺乳动物和鸟类的大型病毒家族。冠状病毒家族包括四个属：α-、β-、γ-和δ冠状病毒。人类感染冠状病毒通常会引起轻度至中度的上呼吸道疾病，如普通感冒。最近，由人畜共患传染病引起的冠状病毒爆发正在引起严重的疾病和全球传播的担忧。

截至2019年，已知有六种人类冠状病毒，包括α冠状病毒(例如人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63))和β冠状病毒(例如人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒-HKU1(HCoV-HKU1)、严重急性呼吸系统综合症(SARS)相关冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸系统综合征(MERS-CoV))。2019年新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)是被称为COVID-19的高度传染性疾病的病因，截至2020年6月14日已导致>7,690,708例确诊病例和>427,630例死亡。

根据住院患者数据，大多数COVID-19病例(约80％)表现为无症状或轻微症状，而其余病例则为严重或危重(Huang等人,Lancet[柳叶刀]395:497(2020)；Chan等人,Lancet[柳叶刀]395:514(2020))。尽管绝大多数患者仅经历轻度疾病，但约有15％的患者经历重度疾病，通常需要辅助通气和供氧。目前，COVID-19的严重程度和死亡率低于SARS-CoV-1和MERS，但在传染性方面表现出很高的效率。COVID-19的临床表现与SARS-CoV-1和MERS相似，最常见的症状是发热、疲劳和呼吸道症状，包括咳嗽、喉咙痛和呼吸急促。一项针对41名住院患者的研究表明，在COVID-19重症病例中观察到高水平的促炎细胞因子(Huang等人,Lancet[柳叶刀]395:497(2020))。这些发现与SARS和MERS一致，淋巴细胞减少和“细胞因子风暴”的存在在COVID-19的发病机制中起主要作用(参见，例如，Nicholls等人,Lancet[柳叶刀]361(9371):1773(2003)；Mahallawi等人,Cytokine[细胞因子]104:8(2018)；和Wong等人,Clin Exp Immunol.[临床与实验免疫学]136(1):95(2004))。这种所谓的“细胞因子风暴”可引发病毒性败血症和炎症引起的肺损伤，进而导致其他并发症，包括肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸衰竭、感染性休克、器官衰竭和死亡。因此，迫切需要产生针对冠状病毒感染(比如SARS-CoV-2和相关病毒)的免疫应答的安全且有效的方法。

发明内容

本文披露了用于在对象中诱导免疫应答的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列。此外，披露了施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码其的核酸序列)以在对象中诱导免疫应答的方法。

在一方面，本披露提供了一种在对象中诱导针对冠状病毒抗原的免疫应答的方法，该方法包括向对象施用(1)CpG两亲分子和(2)冠状病毒抗原或编码冠状病毒抗原的核酸序列。还提供了对应的组合物和试剂盒。

在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽或者编码冠状病毒刺突蛋白或肽的核酸序列。在一些实施例中，CpG两亲分子包括与脂质键合的CpG序列。在一些实施例中，CpG两亲分子包括通过接头与脂质连接的CpG序列。在一些实施例中，接头包括聚合物、氨基酸串、核酸串、多糖或它们的组合。在一些实施例中，接头包括核酸串。在一些实施例中，核酸串包括在1个与50个之间的(例如，2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个)核酸残基。在一些实施例中，核酸串包括在5个与30个之间的(例如，6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核酸残基。在一些实施例中，核酸串包括“N”个鸟嘌呤，其中N为1至10(例如，2、3、4、5、6、7、8或9)。在一些实施例中，接头包括连续的聚乙二醇单元。在一些实施例中，接头包括“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在20与80之间(例如，22、23、24、25、26、27、28、29、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80)。在一些实施例中，接头包括“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在30与70之间(例如，31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65或70)。在一些实施例中，接头包括“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在40与60之间(例如，41、42、43、44、45、50、55或60)。在一些实施例中，接头包括“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在45与55之间(例如，46、47、48、49、50、51、52、53、54或55)。在一些实施例中，接头包括48个连续的聚乙二醇单元。

在一些实施例中，脂质是二酰基脂质。在一些实施例中，二酰基脂质具有以下结构：

或其盐，其中X是O或S。在一些实施例中，CpG序列包括核苷酸序列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，CpG序列包括5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列。在一些实施例中，连接CpG序列中的核苷的所有核苷间基团均为硫代磷酸酯。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白或其肽是SARS-CoV-2刺突蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白的肽是特异性结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的受体结合结构域。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白的肽包括与以下具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白的肽包括以下多肽序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:3)。

在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白包括与以下具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID NO:68)。

在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白包括SEQ ID NO:68的序列。

在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白包括以下多肽序列：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAENLYFQGHHHHHH(SEQ ID NO:63)。

在一些实施例中，冠状病毒抗原包括一个或多个标签。在一些实施例中，标签是Avi标签。在一些实施例中，标签是组氨酸标签。在一些实施例中，冠状病毒抗原包括Avi标签和组氨酸标签。在一些实施例中，冠状病毒抗原包括在多肽序列与一个或多个标签之间的接头。在一些实施例中，冠状病毒抗原包括在多肽序列与一个或多个标签之间的蛋白酶切割位点。在一些实施例中，蛋白酶切割位点是用于烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶(例如，具有ENLYFQG序列；SEQ ID NO:64的蛋白酶)的切割位点。

在一些实施例中，施用冠状病毒刺突蛋白。在一些实施例中，施用冠状病毒刺突蛋白的三聚体。在一些实施例中，三聚体是包含与以下具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列的蛋白质构建体的三聚体：

VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRAAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGGGSGGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:66)。

在一些实施例中，三聚体包括SEQ ID NO:66的序列。

在一些实施例中，施用冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。在一些实施例中，施用包含与以下具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列的冠状病毒刺突蛋白构建体的三聚体：

VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRAAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGGGSGGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:66)

以及包含与以下具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的多肽序列的冠状病毒核衣壳蛋白构建体：

在一些实施例中，施用包含SEQ ID NO:66的多肽序列的冠状病毒刺突蛋白构建体的三聚体和包含SEQ ID NO:63的多肽序列的冠状病毒核衣壳蛋白构建体。

在一些实施例中，施用编码冠状病毒抗原的mRNA。在一些实施例中，同时施用CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码其的核酸。在一些实施例中，依次施用CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码其的核酸。在一些实施例中，首先施用CpG两亲分子，随后施用冠状病毒抗原或编码其的核酸。在一些实施例中，首先施用冠状病毒抗原或编码其的核酸，随后施用CpG两亲分子。

在一些实施例中，所述方法包括向对象施用第二佐剂。

在一些实施例中，所述方法包括向对象施用冠状病毒疫苗作为初免或加强。

在一些实施例中，皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用CpG两亲分子。在一个实施例中，皮下地施用CpG两亲分子。在一些实施例中，皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用冠状病毒抗原(例如，刺突蛋白、其肽、核衣壳蛋白或编码其的核酸)。在一些实施例中，对象是哺乳动物。在一些实施例中，对象是人。

在其他方面，本披露提供了使用针对上述方法描述的组分的组合物和试剂盒。

另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含CpG两亲分子和冠状病毒抗原，或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，以及药学上可接受的载剂。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽与冠状病毒核衣壳蛋白或其肽的组合。在一些实施例中，CpG两亲分子如上文和本文其他地方提供的实施例中更具体地描述且/或冠状病毒抗原如上文和本文其他地方提供的实施例中更具体地描述。

在一些实施例中，向对象施用约10μg至约1.0mg剂量的冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码其的核酸序列)。在其他实施例中，施用的冠状病毒抗原的剂量为约10μg至1mg、40μg至60μg、约50μg至70μg、约50μg至150μg、约70μg至150μg、约100μg至150μg、约100μg至200μg、约140μg至250μg、200μg至300μg、约250μg至500μg、约300μg至600μg、或约500μg至1.0mg。在其他实施例中，向对象施用的冠状病毒抗原的剂量为约10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、或1.0mg。

在一些实施例中，向对象施用剂量为约0.1mg至20mg的CpG两亲分子。在其他实施例中，施用的CpG两亲分子的剂量为约0.1mg至1.0mg、约0.5mg至3.0mg、约1.0mg至约5.0mg、约2.0mg至5.0mg、约3.0mg至5.0mg，约3.0mg至约10.0mg、约4.0mg至12.0mg、约5.0mg至15.0mg、或约50mg至20.0mg。在其他实施例中，向对象施用的CpG两亲分子的剂量为约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10.0mg、11.0mg、12.0mg、13.0mg、14.0mg、15.0mg、16.0mg、17.0mg、18.0mg、19.0mg、或20.0mg。

另一方面，本披露提供了一种试剂盒，其包含CpG两亲分子和冠状病毒抗原或编码冠状病毒抗原的核酸序列。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽与冠状病毒核衣壳蛋白或其肽的组合。

附图说明

图1A至图1C是示出通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定测量的在一定稀释范围内被施用了两剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(图1A)或CpG两亲分子(图1B)的C57Bl6小鼠、(从左到右)被施用了PBS(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)(图1C)的小鼠的血清IgG/IgM抗体的量的图表。

图2A至图2C是示出通过ELISA测定测量的被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG或CpG两亲分子的C57Bl6小鼠血清IgG/IgM抗体的量的图表。图2A是示出施用了可溶性CpG的小鼠血清的OD450的图表；图2B是示出施用了CpG两亲分子的小鼠血清的OD450的图表；以及图2C是示出被施用了(从左到右)作为对照的PBS(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)、或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)的小鼠的IgG/M滴度的量的图表。

图3A至图3D是示出被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(图3A)或CpG两亲分子(图3B)的C57Bl6小鼠与人恢复期血清(图3C)相比所产生的中和抗体浓度的图表，这些抗体阻断冠状病毒刺突蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体相互作用的能力。图3D显示了(从左到右)被施用了PBS作为对照(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)、或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)的小鼠与人恢复期血清相比所产生的中和抗体的量。

图4A至图4C是示出被施用了三剂(从左到右)作为对照的PBS(模拟物)、10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(可溶性CpG)、或10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子(AMP-CpG)的C57Bl6小鼠所产生的IFNγ(也称为IFNg)(图4A)、TNFa(也称为TNFα)(图4B)和IL6(图4C)的量的图表。

图5A和图5B是示出被施用了三剂(从左到右)作为对照的PBS(模拟物)、10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(可溶性CpG)、10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子(AMP-CpG)的C57Bl6小鼠(图5A)和Balb/C小鼠(图5B)所产生的IFNg浓度的图表。

图6A至图6C是示出通过ELISA测定测量的在一定稀释范围内被施用了两剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(图6A)或CpG两亲分子(图6B)的Balb/C小鼠、被施用了(从左到右)PBS对照(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)、或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)(图6C)的小鼠的血清IgG/IgM抗体的量的图表。

图7A至图7C是示出通过ELISA测定测量的被施用了三剂10μg冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG或CpG两亲分子的Balb/C小鼠血清IgG/IgM抗体的量的图表。图7A是示出施用了可溶性CpG的小鼠血清的OD450的图表；图7B是示出施用了CpG两亲分子的小鼠血清的OD450的图表；以及图7C是示出被施用了(从左到右)PBS对照(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)、或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)的小鼠的IgG/M滴度的量的图表。

图8A至图8D是示出被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(图8A)或CpG两亲分子(图8B)的Balb/C小鼠与人恢复期血清(图8C)相比所产生的中和抗体浓度的图表，这些抗体阻断冠状病毒刺突蛋白与ACE2受体相互作用的能力。图8D显示了被施用了(从左到右)PBS对照(模拟物)、冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG(可溶性CpG)、或冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG(AMP-CpG)的小鼠与人恢复期血清相比所产生的中和抗体的量。

图9A至图9C是示出由Balb/C小鼠产生的IFNγ(图9A)、TNFa(图9B)和IL6(图9C)的量的图表，这些小鼠被施用了三剂(从左到右)PBS对照(模拟物)、10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(可溶性CpG)、或10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子(AMP-CpG)。

图10是示出被施用了两剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG或CpG两亲分子的小鼠与被施用了明矾(alum)、IFA或对照的小鼠相比所产生的(每列从左到右)TNFa、IFNg、IL-6、IL-2和IL-4的量的图表。

图11是示出被施用了四剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子、可溶性CpG、或模拟物Tx的C57Bl6小鼠和Balb/C小鼠与阳性或阴性对照相比的脾细胞IFNγ共培养ELISpot应答的图表。

图12A至图12D是示出被施用了三剂(从左到右)PBS对照(模拟物)、明矾、IFA、10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的可溶性CpG(可溶性CpG)、或10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子(AMP-CpG)的C57Bl6小鼠的IgG1(图12A)、IgG2bc(图12B)、IgG3(图12C)和IgG2bc:IgG1比率(图12D)的图表。图12D中IgG2bc:IgG1的比率显示，对于Amp-CpG，免疫应答强烈偏向Th1而不是Th2。Th2应答可能对SARS-CoV-2不利。

图13A至图13D是示出被施用了两剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子、可溶性CpG、铝水凝胶(Alhydrogel)、IFA、或模拟物Tx的小鼠与阳性或阴性对照相比所产生的IFNγ(图13A)、TNFa(图13B)、IL-2(图13C)和IL-6(图13D)的量的图表。

图14A至图14D是示出被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子、可溶性CpG、铝水凝胶、IFA、或模拟物Tx的小鼠与阳性或阴性对照相比所产生的IFNγ(图14A)、TNFa(图14B)、IL-2(图14C)和IL-6(图14D)的量的图表。

图15是示出被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和8μg的CpG两亲分子、可溶性CpG、铝水凝胶、IFA、或模拟物Tx的小鼠与阳性或阴性对照相比的CD8 T细胞中IFNγ和TNFα两者、仅TNFα和仅IFNγ的百分比(在每列中从上到下)的图表。

图16A至图16B是示出被施用了四剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与1nmol可溶性CpG或AMP-CpG的组合的C57BI/6J小鼠(图16A)和BALB/c小鼠(图16B)(每组n＝5)与恢复期血清相比在半数最大抑制稀释度(pVNT₅₀)下的假病毒中和滴度的量的图表。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，ns＝不显著，通过双侧Mann-Whitney检验。假病毒LOD(由虚线表示)确定为针对模拟物治疗计算的平均值+90％ CI。

图16C至图16D是示出已经被施用了四剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与1nmol可溶性CpG或AMP-CpG的组合的C57BI/6J小鼠(图16C)或BALB/c小鼠(图16D)(每组n＝5)所产生的IFNγ量的图表。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过双侧Mann-Whitney检验。假病毒LOD(由虚线表示)确定为针对模拟物治疗计算的平均值+90％ CI。

图17A：是示出在接受了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合的C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的每1x 10⁶个脾细胞中IFNγ斑点形成细胞的数量的图表。描述的值是平均值±标准差。***P<0.001；****P<0.0001，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图17B至图17C是示出CD8⁺T细胞(图17B)或CD4⁺T细胞(图17C)中细胞内细胞因子(在每列中从上到下包括IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)产生频率的图表，这些细胞从C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的外周血细胞中分离出来，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图18A至图18B是示出CD8⁺T细胞(图18A)或CD4⁺T细胞(图18B)中细胞内细胞因子(在每列中从上到下包括IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)产生频率的图表，这些细胞从C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的灌注肺组织中分离出来，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率或细胞因子浓度的双侧Mann-Whitney检验。

图18C至图18D是示出在灌注肺组织的上清液中发现的细胞因子(包括IFNγ(图18C)、TFNα、IL-6、IL-4、IL-10和IL17(图18D))浓度的图表，肺组织在C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg的明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率或细胞因子浓度的双侧Mann-Whitney检验。

图19A至图19F是示出在从C57BL/6J小鼠(每组n＝10)的支气管肺泡灌洗中收集的细胞中的CD8⁺(图19A)和CD4⁺(图19D)T细胞计数、幼稚CD8⁺(图19B)和幼稚CD4⁺(图19E)T细胞的百分比、以及效应记忆CD8⁺(图19C)和CD4⁺(图19F)T细胞的百分比的图表，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与(从左到右)100μg明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图20A至图20G是示出C57B1/6J小鼠(每组n＝10)的体液应答的图表，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG、或1nmol AMP-CpG的组合。使用假病毒中和测定或ELISA测定评定血清中的中和滴度与恢复期血清(图20A)、IgM(图20B)、IgG(图20C)、IgG1(图20D)、IgG2bc(图20E)、IgG2bc与IgG19的比率(图20F)和IgG3(图20G)相比的体液应答。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，ns＝不显著，通过双侧Mann-Whitney检验。

图21A是示出用来自C57BL/6J小鼠(每组n＝10)的用重叠冠状病毒刺突肽再刺激的脾细胞中每1x 10⁶个脾细胞中IFNγ斑点形成细胞的频率的图表，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmolAMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图21B至图21C是示出在从C57BL/6J小鼠(每组n＝10)收集的外周血细胞中发现的CD8⁺T细胞(图21B)和CD4⁺T细胞(图21C)的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图21D至图21E是示出在从C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中收集的用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的灌注的肺组织细胞中发现的CD8⁺T细胞(图21D)和CD4⁺(图21E)的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmolAMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

图22A至图22G是示出使用假病毒中和测定或ELISA测定评定C57B1/6J小鼠(每组n＝10)血清中的中和滴度与恢复期血清(图22A)、IgM(图22B)、IgG(图22C)、IgG1(图22D)、IgG2bc(图22E)、IgG2bc与IgG19的比率(图22F)和IgG3(图22G)相比的体液应答的图表，这些小鼠被施用了三剂仅10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)的组合。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，通过双侧Mann-Whitney检验。

图23A至图23B是示出从37周龄C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中收集的外周血细胞中发现的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)(图23A)；以及从C57BL/6J小鼠中收集的外周血细胞中发现的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂(从左到右)100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)(图23B)。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；

**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双Mann-Whitney检验。

图23C至图23D是示出从37周龄C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中收集的灌注的肺组织细胞中发现的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂(从左到右)仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmolAMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ IDNO:3)(图23C)；以及从C57BL/6J小鼠中收集的灌注的肺组织细胞中发现的细胞因子(包括(在每列中从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂(从左到右)100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmolAMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)(图23D)。描述的值是平均值±标准差。**P<0.01；****P<0.0001；ns＝不显著，通过应用于细胞因子⁺T细胞频率的双Mann-Whitney检验。

图23E至图23F是示出从37周龄C57BL/6J小鼠中(每组n＝10)收集的用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的灌注的肺组织细胞中发现的细胞因子(包括(从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂(从左到右)仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)和1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)(图23A)；以及从C57BL/6J小鼠中收集的用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的灌注的肺组织细胞中发现的细胞因子(包括(从上到下)IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)频率的图表，这些C57BL/6J小鼠被施用了三剂(从左到右)100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ IDNO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ IDNO:3)(图23F)。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；

图24A是示出37周龄C57BI/6J小鼠(每组n＝10)中在半数最大抑制稀释度(pVNT₅₀)下的假病毒中和滴度的量的图表，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)，与恢复期血清进行比较。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，通过双侧Mann-Whitney检验。

图24B是示出37周龄C57BI/6J小鼠(每组n＝10)中在半数最大抑制稀释度(pVNT₅₀)下的假病毒中和滴度的量的图表，这些小鼠被施用了三剂100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)，与恢复期血清进行比较。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；ns＝不显著，通过双侧Mann-Whitney检验。

图24C至图24G是示出37周龄C57B1/6J小鼠(每组n＝10)的体液应答的图表，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ IDNO:3)、以及1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。使用假病毒中和测定或ELISA测定评定血清中的IgG(图24C)、IgG1(图24D)、IgG2bc(图24E)、IgG2bc与IgG19的比率(图24F)和IgG3(图24G)的体液应答。描述的值是平均值±标准差。未检测到的值显示在基线上；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，ns＝不显著，通过双侧Mann-Whitney检验。

图25A至图25D是示出在老年小鼠中疫苗接种AMP-CpG能够在血液、脾脏和肺组织中产生持久的刺突RBD特异性T细胞的一系列图表。37周龄的C57Bl/6小鼠(每组n＝5-10)在第0天、第14天和第28天用混合有100ug明矾或1nmol可溶性CpG或AMP-CpG的10ug刺突RBD蛋白进行免疫。佐剂对照动物只给药AMP-CpG佐剂。在第35天、第49天和第70天，通过ELISA评定免疫动物血清中对刺突RBD具有特异性的体液应答。显示的是为IgG确定的终点滴度(图25A)。在第21天、第35天、第49天和第70天分析T细胞应答。在第21天、第35天、第49天和第70天(图25B)从外周血收集细胞，并用重叠的刺突RBD肽再刺激细胞，并测定细胞内细胞因子的产生以检测抗原特异性T细胞应答。显示的是外周血CD8⁺T细胞中IFNγ阳性细胞的频率(图25A)，并且从脾脏(图25C)和肺(图25D)收集细胞，并用重叠的刺突RBD肽再刺激细胞，并通过ELISPOT测定来测定IFNγ的产生。显示的是每1x 10⁶个细胞(每组n＝5只小鼠)的IFNγ斑点形成细胞(SFC)的频率。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，通过应用于细胞因子+T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。在图25A中，从左到右显示了(1)明矾、(2)可溶性CpG和(3)AMP-CpG的第35天、第49天和第70天的数据。在图25B中，图表中的数据从下到上显示(1)明矾、(2)可溶性CpG和(3)AMP-CpG。在图25C和图25D中，数据从左到右显示(1)佐剂对照、(2)明矾、(3)可溶性CpG和(4)AMP-CpG。

图26A至图26E是示出用AMP-CpG-7909进行两剂量疫苗接种在血液和肺中引发有效的刺突RBD特异性细胞免疫，以及在血液中引发体液免疫的一系列图表。C57Bl/6小鼠(每组n＝5)在第0天和第14天用混合有1.0nmol、2.5nmol或5.0nmol AMP-CpG的0.5ug、1.0ug或5.0ug刺突RBD蛋白免疫，并在第21天分析T细胞和IgG应答。用重叠的刺突RBD肽再刺激外周血细胞(图26A和图26B)或从灌注的肺收集的细胞(图26C和图26D)，并通过流式细胞术测定细胞内细胞因子的产生，以检测抗原特异性T细胞应答。显示的是CD8⁺(图26A和图26C)和CD4⁺(图26B和图26D)T细胞中的IFNγ、TNFα和双阳性T细胞的频率。通过ELISA评定免疫动物血清中对刺突RBD具有特异性的体液应答。显示的是在第35天IgG的终点滴度(每组n＝5只小鼠；图26E)。描述的值是平均值±标准差。在图26A至图26D中，对于每个条形，INFγ⁺和TNFα⁺位于条形的顶部，TNFα⁺位于条形的中部，以及INFγ⁺位于条形的底部。

图27是示出AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效多功能CD8 T细胞应答的一系列图表。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0％)、明矾(0％)、可溶性CpG(5％)和AMP-CpG(34％)。在显示CD8⁺T细胞的细胞因子阳性百分比的条形图中，每个条形的顶部显示IFNγ⁺和TNFα⁺，条形的中部显示TNFα⁺，以及条形的底部显示IFNγ⁺细胞。

图28是示出AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效多功能CD4 T细胞应答的一系列图表。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0.2％)、明矾(0.5％)、可溶性CpG(0.5％)和AMP-CpG(12％)。在显示CD4⁺T细胞的细胞因子阳性百分比的条形图中，每个条形的顶部显示IFNγ⁺和TNFα⁺，条形的中部显示TNFα⁺，以及条形的底部显示IFNγ⁺细胞。

图29是示出在C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的每1x 10⁶个脾细胞中IFNγ斑点形成细胞的数量的图表，这些小鼠已经接受模拟物疫苗或10μg的全长冠状病毒刺突蛋白构建体(SEQ ID NO:66)与10μg的冠状病毒核衣壳蛋白构建体(SEQ ID NO:63)与(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG、或(3)6μg AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。该图表显示AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效T细胞应答。

图30是示出AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效肺驻留多功能CD8⁺T细胞应答的一系列图表。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0％)、明矾(0％)、可溶性CpG(3％)和AMP-CpG(26％)。在显示CD8⁺T细胞的细胞因子阳性百分比的条形图中，每个条形的顶部显示IFNγ⁺和TNFα⁺，条形的中部显示TNFα⁺，以及条形的底部显示IFNγ⁺细胞。

图31是示出AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效肺驻留多功能CD4⁺T细胞应答的一系列图表。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0.2％)、明矾(0.2％)、可溶性CpG(1％)和AMP-CpG(7％)。在显示CD4⁺T细胞的细胞因子阳性百分比的条形图中，每个条形的顶部显示IFNγ⁺和TNFα⁺，条形的中部显示TNFα⁺、以及条形的底部显示IFNγ⁺细胞。

图32是示出AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2核衣壳蛋白的有效外周血多功能CD8⁺和CD4⁺T细胞应答的一系列图表。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μgAMP-CpG的疫苗。在示出CD8⁺T细胞的细胞因子阳性百分比或CD4⁺T细胞的细胞因子阳性百分比的条形图中，每个条形的顶部显示IFNγ⁺和TNFα⁺，条形的中部显示TNFα⁺，以及条形的底部显示IFNγ⁺细胞。

图33是示出在C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒核衣壳肽再刺激的每1x 10⁶个脾细胞中IFNγ斑点形成细胞的数量的图表，这些小鼠接受过模拟物疫苗或10μg的全长冠状病毒刺突蛋白构建体(SEQ ID NO:66)与10μg的冠状病毒核衣壳蛋白构建体(SEQ ID NO:63)以及(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的组合。描述的值是平均值±标准差。该图表显示AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2核衣壳蛋白的有效T细胞应答。

图34是示出重新配制的AMP-CpG疫苗在非人灵长类动物中诱导对金斯瑞公司(GenScript)RBD的强烈抗体应答的图表。虚线表示测定检测限(LOD)。

图35是示出重新配制的AMP-CpG疫苗诱导针对英国SARS-CoV-2变体的IgG抗体的图表(右列)。野生型SARS-CoV-2显示在左列中。虚线表示测定LOD。

图36A和图36B是示出重新配制的AMP-CPG疫苗诱导针对刺突RBD的CD8⁺T细胞应答的图表。

图37A和图37B是示出重新配制的AMP-CPG疫苗诱导针对刺突RBD的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的图表。在每一列中，％TNFα显示在顶部，％IL2显示在中部，以及％IFNγ显示在底部。

图38是示出C57BL/6J小鼠四聚体分析结果的图表，这些小鼠被施用了两剂佐剂对照(仅Adj)、重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗(每100μL注射具有5mg的WTRBD和B.1.351RBD抗原(双重Vax)中的每一种)、或重新配制的AMP-CPG B.1.351RBD疫苗(每100μL注射具有5mg的B.1.351RBD抗原(Amp Vax))。

图39A、图39B和图39C是示出C57BL/6J小鼠的细胞内染色(ICS)分析结果的图表，这些小鼠被施用了两剂佐剂对照(仅Adj)、重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗(每100μL注射具有5mg的WT RBD和B.1.351RBD抗原(双重Vax)中的每一种)、或重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗(每100μL注射具有5mg的B.1.351抗原(B.1.351))。图39A显示与仅有佐剂的疫苗相比，重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗和重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗在第2剂后诱导CD8⁺肺细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和TNFα。图39B显示与仅有佐剂的疫苗相比，重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗和重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗在第2剂后诱导CD4⁺肺细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和TNFα。图39C显示与仅有佐剂的疫苗相比，重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗和重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗在第2剂后诱导CD8⁺血细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和TNFα。在每一列中，％IFNγ+TNFα显示在顶部，％TNFα显示在中部，以及％IFNγ显示在底部。

图40是示出C57BL/6J小鼠ELISpot分析结果的图表，这些小鼠被施用了两剂佐剂对照(仅Adj)、重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗(每100μL注射具有5mg的WT RBD和B.1.351RBD抗原(双重Vax)中的每一种)或重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗(每100μL注射具有5mg的B.1.351RBD抗原(B.1.351))。

图41是示出通过ELISA分析测量的C57BL/6J小鼠的抗体血清量的图表，这些小鼠被施用了两剂佐剂对照(仅Adj)、重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗(每100μL注射具有5mg的WT RBD和B.1.351RBD抗原(双重Vax)中的每一种)或重新配制的AMP-CPGB.1.351疫苗(每100μL注射具有5mg的B.1.351RBD抗原(B.1.351))。

定义

除非另有说明，否则权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。

必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。

如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述的值10％以内的值。

如本文所用，术语“佐剂”是指与特定免疫原或抗原一起将增强或以其他方式改变或修饰所得免疫应答的化合物。免疫应答的修饰包括加强或扩大抗体和细胞免疫应答之一或两者的特异性。免疫应答的修饰也可能意味着减少或抑制某些抗原特异性免疫应答。在某些实施例中，佐剂是环状二核苷酸。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。术语“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三个字母符号或通过IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。

如本文所用，术语“两亲分子”和“两亲的”是指包含亲水性头基和疏水性尾部的缀合物，从而形成两亲缀合物。在一些实施例中，两亲分子缀合物包含CpG寡脱氧核苷酸(ODN)和一个或多个疏水性脂质尾部，在本文中称为“CpG两亲分子。”

如本文所用，“缀合的”是指CpG两亲分子与脂质的共价连接或交联。CpG两亲分子可以通过CpG两亲分子和脂质上的互补反应基团的反应通过共价连接与脂质键合。

如本文所用，术语“CpG寡脱氧核苷酸”和“CpG基序”是指短的单链DNA分子，其包括通过磷酸二酯核苷酸间键合或磷酸二酯衍生物核苷酸间键合与3'G核苷酸连接的5'C核苷酸。在一些实施例中，CpG基序包括磷酸二酯核苷酸间键合。在一些实施例中，CpG基序包括磷酸二酯衍生物核苷酸间键合。

如本文所用，术语“冠状病毒刺突蛋白”和“冠状病毒刺突肽”是指大型1型跨膜蛋白的全长或片段，该大型1型跨膜蛋白有时称为“S蛋白”，其包括S1和S2结构域。冠状病毒刺突蛋白被高度糖基化，并在病毒粒子表面(比如SAR-CoV-2病毒粒子的表面)组装成三聚体。在SARS-CoV-2的情况下，刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合以感染人体细胞，例如呼吸道上皮细胞(例如，II型肺泡细胞)以及许多其他组织和器官(包括例如，心脏、血管、肾脏、肝脏、胃肠道)和神经系统(例如，大脑和周围神经系统)中的细胞，例如，上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞和肠细胞。在一些实施例中，刺突蛋白肽可具有与SEQ ID NO:3具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白肽具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列。

如本文所用，“免疫应答”是指生物体的免疫系统对物质(包括但不限于外来或自身蛋白质)作出的应答。三种一般类型的“免疫应答”包括粘膜、体液和细胞免疫应答。免疫应答可能包括以下至少一项：抗体产生、炎症、发展免疫力、发展对抗原的超敏反应、抗原特异性淋巴细胞对抗原的应答以及移植或移植物排斥。

如本文所用，“免疫原性”是指药剂(例如，CpG两亲分子和冠状病毒刺突蛋白或肽)触发免疫应答的能力，例如，如通过抗体滴度测量。

如本文所用，术语“免疫原性量”是指在对象中诱导免疫应答的CpG两亲分子和冠状病毒刺突蛋白或肽的量(例如，通过如由比如酶联免疫吸附测定(ELISA)的常规技术确定的对象的抗体滴度的增加所反映)。

如本文所用，术语“传染原”是指引起感染和/或疾病的病原体。传染原包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。在一些实施例中，传染原是病毒(例如，冠状病毒，例如，SARS-CoV-2)。

“核酸”是指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列并且以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学期刊]260:2605-2608,1985)；和Cassol等人,1992；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子细胞探针]8:91-98,1994)。对于精氨酸和亮氨酸，在第二个碱基处的修饰也可以是保守的。术语核酸与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。

关于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。可以以本领域技术人员能力范围内的各种方式(例如，使用公开可用的计算机软件，比如BLAST、BLAST-2或Megalign软件)实现用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，序列同一性百分比值可以使用序列比较计算机程序BLAST产生。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A(也可以替代性地表述为与、同或相对给定核酸或氨基酸序列B具有一定的序列同一性百分比的给定核酸或氨基酸酸序列A)与、同或相对给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比计算如下：

100乘以(分数X/Y)

其中X是由序列比对程序(例如，BLAST)在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数量，并且其中Y是B中核酸的总数。可以理解的是，其中核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸的长度。

如本文通常使用的，“药学上可接受”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过多的毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症的，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指能够悬浮或溶解活性化合物并且具有对患者无毒和无炎性的特性的媒介物。此外，药学上可接受的载剂可以包括在药物配制品领域中已知或使用的、药学上可接受的添加剂，比如防腐剂、抗氧化剂、芳香剂、乳化剂、染料或赋形剂，并且其不会显著干扰活性药剂的生物活性的治疗效果，并且对患者无毒。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指具有对对象无毒且无炎性的特性的任何非活性成分。典型的赋形剂包括，例如：载剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其他常规赋形剂和添加剂和/或其他可增强稳定性、递送、吸收、半衰期、功效、药代动力学和/或药效学，减少不良副作用或提供用于药物用途的其他优点的添加剂。

本发明的多核苷酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA、为单链区域和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA以及为单链区域和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA(它们可以是单链的、或者更典型地是双链的、或者是单链区域和双链区域的混合物)的杂交分子组成。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域组成。多核苷酸还可以含有一个或多个经修饰的碱基或为稳定性或为其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“经修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不寻常的碱基，比如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本文披露的缀合物、寡核苷酸或肽的任何药学上可接受的盐。本文描述的任何化合物的药学上可接受的盐可包括在合理医学判断范围内的、适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏应答，并且与合理的益处/风险比率相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，药学上可接受的盐描述于：Berge等人,J.Pharmaceutical Sciences[药学科学期刊]66:1-19,1977并描述于Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐：特性、选择和使用](P.H.Stahl和C.G.Wermuth编辑),Wiley-VCH,2008中。盐可以在本文所述化合物的最终分离和纯化过程期间原位制备或通过使游离碱基与合适的酸反应单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。除非另有说明或不适用，否则提及缀合物、寡核苷酸或肽包括其药学上可接受的盐。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

如本文所用，术语“预防”或“降低获得风险”是指降低(例如，降低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或约100％)感染传染性疾病(例如，病毒感染，例如β冠状病毒(比如SARS-CoV-2)或相关病毒的感染)的风险。为了确定预防是否有效，可以在接受本发明组合物的对象与未接受所述组合物的情况相似的对象(例如，有病毒感染(比如SARS-CoV-2感染或相关病毒的感染)风险的对象)之间进行比较。也可以在接受组合物的对象与对照、基线或已知测量水平之间进行比较。

如本文所用，本文所用的术语“对象”或“哺乳动物”或“患者”包括人和非人两者，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

如本文所用，术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指治疗方法，其中目标是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症(例如COVID-19)相关的病况的进展或严重程度。这些术语包括减少或减轻病况、疾病或病症的至少一种不良反应或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，或者如果诱导了所需的应答(例如，特异性免疫应答)，则治疗通常是“有效的”。替代性地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。

如本文所用，术语“疫苗”或“免疫原性组合物”是指含有如本文所述的CpG两亲分子和/或冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白、其肽或编码它们的核酸序列)的配制品，任选地与佐剂组合，该配制品呈能够被施用于脊椎动物的形式并且诱导足以诱导免疫以预防和/或改善感染或疾病、和/或减少感染或疾病的至少一种症状的保护性或治疗性免疫应答。通常，疫苗或免疫原性组合物包含本文所述的组合物悬浮或溶解在其中的常规盐水或缓冲水溶液介质。以这种形式，本文所述的组合物用于预防、改善或以其他方式治疗感染或疾病。引入宿主后，疫苗或免疫原性组合物引发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生，和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、树突细胞的活化和/或其他细胞应答。

根据以下详细描述、附图和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

具体实施方式

本发明提供了可用于在对象中诱导免疫应答的组合物。组合物包括CpG寡脱氧核苷酸(ODN)(通过接头的方式或不使用接头(即直接键合)与脂质连接，形成CpG两亲分子)和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。当同时或单独施用时，本文所述的化合物一起在对象比如人对象中诱导免疫应答。CpG两亲分子可以用作佐剂在对象中引发免疫应答，比如针对冠状病毒抗原(例如，SARS-CoV-2抗原，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其肽或者SARS-CoV-2核衣壳蛋白或其肽)的免疫应答。

CpG

CpG寡脱氧核苷酸(ODN)是短的合成单链DNA分子，在具体序列环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸。CpG ODN拥有部分或完全硫代磷酸化(PS)的主链，这与DNA分子中的天然磷酸二酯(PO)主链相反。基于结构特征和对人外周血单核细胞(PBMC)，具体地B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)的活性，已经确认了三个主要类别的刺激性CpG ODN。这三个类别是A类(D型)、B类(K型)和C类。

在一些实施例中，CpG ODN可以是A类ODN。例如，A类ODN可以选自包括以下各项的组：CpG 1585，其具有GGGGTCAACGTTGAGGGGGG(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；CpG 2216，其具有GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；以及CpG 2336，其具有GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。

在一些实施例中，CpG ODN可以是B类ODN。B类CpG ODN包含带有一个或多个CpG二核苷酸的完整PS主链。它们强烈活化B细胞和TLR9依赖性NF-κB信号传导但微弱刺激IFN-α分泌。例如，B类ODN可以选自包括以下各项的组：CpG1668，其具有TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列；CpG7909，也称为CpG 2006，其具有TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；CpG 2007，其具有TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；CpG BW006，其具有TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；CpG D-SL01，其具有TCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；CpG 1018，其具有TGACTGTGAACGTTCGAGATGA(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列，以及CpG 1826，其具有TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。)。在一些实施例中，CpG ODN是CpG7909(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，CpG ODN是CpG1826(SEQ ID NO:2)。

在一些实施例中，CpG ODN可以是C类ODN。例如，C类ODN可以选自包括以下各项的组：CpG 2395，其具有TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；CpG M362，其具有TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；以及CpG D-SL03，其具有TCGCGAACGTTCGCCGCGTTCGAACGCGG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列。

在一些实施例中，连接CpG序列中的核苷的所有核苷间基团均为硫代磷酸酯

在一些实施例中，免疫原性组合物包括两亲缀合物。两亲缀合物是指包括与白蛋白结合结构域(例如，脂质)共价连接的CpG ODN的缀合物。在一些实施例中，两亲缀合物包括直接与白蛋白结合结构域(例如，脂质)共价连接的CpG ODN。在一些实施例中，两亲缀合物包括通过接头与白蛋白结合结构域(例如，脂质)共价连接的CpG ODN。对于包括直接或通过接头与白蛋白结合结构域缀合的CpG ODN的两亲缀合物，白蛋白结合结构域与内源性白蛋白结合，这阻止CpG两亲分子快速冲入血流，并且反而将它们重新靶向淋巴管和引流淋巴结，由于抗原呈递细胞过滤白蛋白，因此它们在此处积聚。

CpG ODN可以与脂质直接键合或通过接头与脂质连接，以形成CpG两亲分子。这些化合物可以使用本领域已知的普通亚磷酰胺化学来产生。在一些实例中，CpG ODN或CpGODN-GG可以与以下化合物反应：以产生中间体，其在用例如，本领域已知的亚磷酸酯氧化方法，例如硫化剂，比如3-((N,N-二甲氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮氧化和氰乙基的水解后可以产生本发明的化合物。

本文提及的CpG分子以及包括CpG分子的两亲分子应理解为包括其药学上可接受的盐。

脂质

本文披露的CpG两亲分子包括疏水性脂质，其可以是白蛋白结合结构域。脂质可以是直链的、支链的或环状的。脂质的长度优选为至少17个至18个碳，但如果它显示出良好的白蛋白结合和对淋巴结的充分靶向，则可以更短。在一些实施例中，活性部分地依赖于CpG两亲分子与对象血液中的白蛋白缔合的能力。因此，靶向淋巴结的CpG两亲分子通常包括在生理条件下可以与白蛋白结合的脂质。适用于靶向淋巴结的脂质可以基于脂质或与CpGODN缀合的脂质与白蛋白结合的能力来选择。用于测试脂质或与CpG ODN缀合的脂质与白蛋白结合的能力的合适方法是本领域已知的。

用于CpG两亲分子靶向淋巴结的优选脂质的实例包括但不限于：具有8-30个碳的脂肪族尾部的脂肪酸，包括但不限于直链饱和和不饱和的脂肪酸、支链饱和和不饱和的脂肪酸和脂肪酸衍生物(比如脂肪酸酯、脂肪酸酰胺和脂肪酸硫酯)、二酰基脂质、胆固醇、胆固醇衍生物和类固醇酸(比如胆汁酸)；脂质A或它们的组合。

在一些实施例中，脂质是二酰基脂质或双尾脂质。在一些实施例中，二酰基脂质中的尾部包含约8个至约30个碳并且可以是饱和的、不饱和的或它们的组合。在一些实施例中，二酰基脂质具有以下结构：

或其盐，其中X是O或S。脂质的尾部可以经由酯键键合、酰胺键键合、硫酯键键合或它们的组合与头部基团偶联。在一个具体实施例中，二酰基脂质是磷酸脂、糖脂、鞘脂或它们的组合。

靶向淋巴结的缀合物通常包括长度为8个或更多个碳单位的脂质。增加脂质单位的数量可以减少脂质插入细胞的质膜，使得脂质缀合物保持自由以与白蛋白结合并运输至淋巴结。例如，脂质可以是由两个C18烃尾组成的二酰基脂质。在一些实施例中，用于制备靶向淋巴结的脂质缀合物的脂质不是单链烃(例如，C18)或胆固醇。已探索胆固醇缀合以增强分子佐剂(比如CpG)的免疫调节和肽的免疫原性。

本文提及的脂质以及包括脂质的两亲分子应理解为包括其药学上可接受的盐。

接头

为了将CpG两亲分子有效地运输到淋巴结，CpG ODN应保持可溶性。因此，极性嵌段接头可以包含在CpG ODN与它所缀合的脂质之间，以增加CpG ODN的溶解度。在一些实施例中，CpG两亲分子包括通过接头与脂质连接的CpG序列。接头可以降低或阻止脂质插入细胞(比如注射部位附近组织中的细胞)质膜的能力。接头还可以降低或阻止CpG ODN在施用部位与细胞外基质蛋白非特异性缔合的能力。接头可以增加CpG ODN的溶解度而不阻止其与白蛋白结合的能力。这种特征性的组合可以允许CpG ODN与存在于血清或间质液中的白蛋白结合并保持在循环中直到白蛋白被运输到并保留在淋巴结中。

接头的长度和组成可以基于所选的脂质和CpG ODN进行调整。例如，对于一些CpGODN，寡核苷酸本身可能具有足够的极性以确保溶解度；例如，长度为10个、15个、20个或更多个核苷酸的寡核苷酸。因此，在一些实施例中，不需要另外的接头。然而，取决于氨基酸序列，某些脂化肽可能基本上不可溶。在这些情况下，可能需要包括模拟极性寡核苷酸的作用的接头。接头可用作本文所述的任何脂质缀合物的一部分，例如脂质-寡核苷酸缀合物和脂质-肽缀合物，这些脂质缀合物减少细胞膜插入/优先分配到白蛋白上。

合适的接头包括但不限于比如上文讨论的那些的寡核苷酸，包括核酸串、亲水性聚合物(包括但不限于聚乙二醇(MW：500Da至20,000Da)、聚丙烯酰胺(MW：500Da至20,000Da)、聚丙烯酸)；亲水性氨基酸串(比如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或它们的组合)；多糖，包括但不限于葡聚糖(MW：1,000Da至2,000,000Da)或其组合。疏水性脂质和接头/CpG ODN共价连接。共价键可以是不可切割的键合或可切割的键合。不可切割的键合可包括酰胺键或磷酸酯键，并且可切割的键合可包括二硫键、酸可切割的键合、酯键、酸酐键、可生物降解的键或酶可切割的键合。

在一些实施例中，接头是一个或多个乙二醇(EG)单元、更优选两个或更多个EG单元(即，聚乙二醇(PEG))。例如，在一些实施例中，CpG两亲分子包括通过聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物或类似物连接的CpG和疏水性脂质。

在一些实施例中，本文所述的CpG两亲分子包含与PEG连接的CpG ODN，PEG又与疏水性脂质或脂质-Gn-ON缀合物共价连接或通过形成与寡核苷酸胶束杂交的蛋白质-寡核苷酸缀合物连接。PEG单元的精确数量取决于脂质和货物，然而，通常，接头可具有在约1个与约100个之间、在约20个与约80个之间、在约30个与约70个之间、或在约个40个与约60个之间的PEG单位。在一些实施例中，接头具有在约45个与55个之间的PEG单元。例如，在一些实施例中，接头具有48个PEG单元。

如上所述，在一些实施例中，接头是包括核酸串的寡核苷酸。在一些实施例中，本文所述的CpG两亲分子包括与核酸串连接的CpG ODN，该核酸串又与疏水性脂质连接。接头可以具有任何序列，例如，寡核苷酸的序列可以是随机序列，或针对其分子或生化特性(例如，高极性)而特异性选择的序列。在一些实施例中，接头包括20个一个或多个系列的连续的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或它们的类似物。在一些实施例中，接头由一系列连续的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或它们的类似物组成。

在一些实施例中，核酸串包括在1个与50个之间的核酸残基。在一些实施例中，核酸串包括在5个与30个之间的核酸残基。在一些实施例中，接头包括一个或多个鸟嘌呤，例如在1个至10个之间的鸟嘌呤。已经发现，改变CpG ODN与脂质尾部之间的鸟嘌呤的数量会控制血清蛋白存在下的胶束稳定性。因此，可以基于CpG ODN对比如白蛋白等血清蛋白的所需亲和力来选择接头中鸟嘌呤的数量。

在一些实施例中，接头是包括氨基酸串的寡核苷酸。在一些实施例中，CpG两亲分子包括与氨基酸串连接的CpG ODN，该氨基酸串又与疏水性脂质连接。接头可以具有任何氨基酸序列，例如，寡核苷酸的序列可以是随机序列，或针对其分子或生化特性(例如，高柔性)选择的序列。在一些实施例中，接头包含一系列甘氨酸残基以形成聚甘氨酸接头。在一些实施例中，接头包括(Gly)_n的氨基酸序列，其中n可以是在2个与20个之间的残基。聚甘氨酸接头的实例包括但不限于GGG、GGGA(SEQ ID NO:18)、GGGG(SEQ ID NO:19)、GGGAG(SEQID NO:20)、GGGAGG(SEQ ID NO:21)、GGGAGGG(SEQ ID NO:22)、GGAG(SEQ ID NO:23)、GGSG(SEQ ID NO:24)、AGGG(SEQ ID NO:25)、SGGG(SEQ ID NO:26)、GGAGGA(SEQ ID NO:27)、GGSGGS(SEQ ID NO:28)、GGAGGAGGA(SEQ ID NO:29)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:30)、GGAGGAGGAGGA(SEQ ID NO:31)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:32)、GGAGGGAG(SEQ ID NO:33)、GGSGGGSG(SEQ ID NO:34)、GGAGGGAGGGAG(SEQ ID NO:35)、GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:36)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:38)和GGGSGGGS(SEQ IDNO:62)。

本文描述的接头(例如，聚甘氨酸接头)也可用于将多肽序列(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽)与标签(例如，组氨酸标签和/或Avi标签)连接。

冠状病毒抗原

在一方面，本披露提供了SARS-CoV-2刺突糖蛋白的全长或片段，其已被确认为具有免疫原性或该刺突蛋白的多聚体(例如三聚体)(Grifoni等人,Cell Host Microbe.[细胞宿主微生物]2020；27(4):671-80；Ou等人,Nat Commun.[自然·通讯]2020,11(1):1620；Walls等人,Cell.[细胞]2020；181(2):281-92)。另外，抗原可以对应于SARS-CoV-2核衣壳蛋白、膜蛋白等，或它们的肽。抗原也可对应于冠状病毒刺突蛋白的特定功能区域(即，蛋白质亚基)。例如，抗原可对应于或包含SARS-CoV-2刺突糖蛋白或S蛋白的S1、S2或受体结合结构域(RBD)区域。

一种或多种抗原也可以是对应于目标传染原中的免疫原性序列的肽(或几种肽)。这些肽表现为可以引发各种免疫应答的表位。例如，这些肽可以代表SARS-CoV-2刺突糖蛋白的不同位置，这些位置在细胞和体液免疫原性方面均有预测(Fast等人,bioRxiv.[生物学预印版平台]2020:2020.02.19.955484)。对于由几种肽组成的抗原，一种或多种抗原可以是包含整个蛋白质或其功能区域的重叠肽的混合物，或者它可以是对应于不同蛋白质的免疫原性区域的肽的混合物。例如，一种或多种抗原可以是肽的混合，包括SARS-CoV-2刺突蛋白、核衣壳蛋白和膜蛋白。SARS-CoV-2刺突蛋白可以具有以下氨基酸序列：

MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白可以

具有以下氨基酸序列：

MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHAGQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:16)。

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白构建体包括与以下至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列：

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白构建体包括以下序列：VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRAAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGGGSGGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:66)。该蛋白质构建体包括通过GGGSGGGS(SEQ ID NO:62)接头与刺突蛋白序列连接的十组氨酸标签(HHHHHHHHHH；SEQ ID NO:67)。刺突蛋白具有以下突变以稳定三聚体：R683A、R685A。该构建体可从百普赛斯公司(ACROBiosystems)以产品编号SPN-C52H2获得。

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白的肽对应于特异性结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域。已知与ACE2受体相互作用的SARS-CoV-2刺突蛋白区域对应于1255氨基酸蛋白(SEQ ID NO:14)上的氨基酸323-502(其具有CPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFE(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列)，并因此用作区域结合结构域(RBD)。

在一些实施例中，本文所述的本发明的冠状病毒刺突蛋白或肽具有与SARS-CoV-2刺突蛋白RBD片段相同的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的本发明的冠状病毒刺突蛋白或肽具有与以下至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同的氨基酸序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ IDNO:3)。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白或刺突RBD包含一个或多个突变。突变可以是在英国(202012/01)的变体中检测到的N501Y突变，在英国和尼日利亚的变体(20A/S:484K变体)中检测到的A67V、69del、70del、144del、E484K、D614G、Q677H和F888L突变，在英国的变体(B.1.1.7变体，也称为α变体，或20I/501Y.V1变体)中检测到的69del、70del、144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H突变，在美国的变体中检测到的T95I、D253G和D614G突变，在美国的变体(20C变体)中检测到的D80G、144del、F157S、L452R、D614G和D950H突变，在美国(B.1.472变体，也称为20C/S:452R变体)发现的L452R和D614G突变，在美国的变体(B.1.429变体，也称为20C/S:452R变体)中检测到的S13I、W152C、L452R、D614G突变，在巴西的变体(P.1变体，也称为γ变体，或20J/501Y.V3变体)中检测到的L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y和T1027I突变，在巴西的变体(20J变体)中检测到的E484K、D614G和V1176F突变，在印度的变体(20A变体)中发现的L18F、L452R、E484Q和D614G突变，在印度的变体(20A/S:154K变体)中发现的G142D、E154K、L452R、E484Q、D614G、P681R和Q1071H突变，在印度的变体(B.1.617.2变体，也称为δ变体、20A/S:478K变体或20J变体)中发现的T19R、G142D、L452R、E484Q、D614G、P681R和D950N突变，或在南非的变体(B.1.351变体，也称为β变体，501.V2变体、或501.V2、20H/501Y.V2)中检测到的N501&、K417N和E484K突变的组合(有或没有D80A、D215G、241del、242del、243del、D614G和A701V突变)。变体突变的编号是相对于全长刺突蛋白的。

刺突RBD可包含SARS-CoV2变体突变中的任何一种。在一些实施例中，刺突RBD与前述SARS-CoV2变体中的任何一种的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的序列同一性。在一个实施例中，刺突RBD与B.1.351变体的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的序列同一性。

在一些实施例中，刺突RBD含有N501Y突变并包括如下所示的序列：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(SEQ ID NO:69)。

在一些实施例中，组氨酸标签被添加到SEQ ID NO:69序列的C末端。在一些实施例中，组氨酸标签序列是：AHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:70)。

在一些实施例中，冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白包括与以下氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同的序列：

在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列。

在一些实施例中，冠状病毒核衣壳蛋白构建体包括以下序列：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAENLYFQGHHHHHH(SEQ ID NO:63)。该构建体包括在核衣壳蛋白序列与六组氨酸标签(HHHHHH；SEQ ID NO:65)之间的烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶(ENLYFQG；SEQ ID NO:64)的切割位点，并且可从百普赛斯公司(ACROBiosystems)以产品编号NUN-C5227获得。

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白或其肽或者冠状病毒核衣壳蛋白或其肽包括一个或多个标签(例如，组氨酸标签或Avi标签)。

标签可用于例如蛋白质纯化(例如，亲和标签)、增加蛋白质的溶解度、改变色谱特性、给出荧光读出或其他目的。蛋白质标签包括但不限于几丁质结合蛋白(CBP)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、Strep-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、组氨酸标签、Avi标签、C-标签、钙调蛋白标签、E-标签、FLAG标签、人流感血凝素(HA)标签、Myc、S-标签和NE-标签。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白或肽具有组氨酸标签。在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白具有Avi标签。在其他实施例中，冠状病毒刺突蛋白或肽具有组氨酸和Avi标签。

在一些实施例中，冠状病毒刺突蛋白或其肽或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽包括蛋白酶切割位点。在一些实施例中，蛋白酶切割位点位于冠状病毒刺突蛋白、冠状病毒核衣壳蛋白或肽序列与标签之间。在一些实施例中，蛋白酶切割位点用于TEV。在一些实施例中，TEV切割位点具有氨基酸序列ENLYFQG(SEQ ID NO:64)。

可以在整个文献中找到预测的可能引起免疫应答的免疫原性表位的其他实例(Grifoni等人,Cell Host Microbe.[细胞·宿主·微生物]2020；27(4):671-80；Prachar等人,bioRxiv.[生物学预印版平台]2020:2020.03.20.000794；Chour等人,medRxiv.[医学预印版平台]2020；2020.05.04.20085779)和SARS-CoV-2抗原供应商的网站，例如义翘神州(Sino Biological)、创新诊断(Creative Diagnostics)、Sengenics、爱博泰克生物(ABclonal Technology)。用于基于MHC结合能力确认免疫原性区域的预测工具也可广泛获得。

替代性地，可以施用编码冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽或者冠状病毒核衣壳蛋白或其肽)的核酸，比如信使RNA(mRNA)。一旦注射，mRNA就会进入细胞的细胞质，在那里它被翻译成所需的蛋白质或肽，该蛋白质或肽最终可以活化细胞和体液免疫应答。为了有效表达冠状病毒刺突蛋白或肽，将合成mRNA以包含以下各项：5'帽-5'非翻译区域(UTR)-抗原编码序列-3'非翻译区域(UTR)-poly A尾。5'UTR和3'UTR的设计对于mRNA稳定性、翻译、蛋白质产生和结构很重要；有几种基于目标mRNA优化5'UTR和3'UTR的设计的在线工具。冠状病毒刺突蛋白或肽编码序列可以是编码特定蛋白质或蛋白质亚基的任何mRNA序列；例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白、刺突RBD结构域、刺突S1结构域等的mRNA。mRNA也可以是未修饰的、核苷修饰的或自扩增的。为了提高效力、稳定性和蛋白质产量，mRNA可以经过密码子优化和使用经修饰的核苷。例如，可以掺入经修饰的尿苷或经修饰的胞苷以避免先天免疫分子过早识别并提高翻译效率。

在一些实施例中，编码冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽或者冠状病毒核衣壳蛋白或其肽)的mRNA被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离的阳离子脂质、非阳离子脂质、甾醇和PEG脂质组分以及目标mRNA(例如，编码冠状病毒抗原(比如冠状病毒刺突蛋白或其肽)的mRNA)。脂质纳米颗粒可以使用本领域公知的组分、组合物和方法产生，参见例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/52117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575；和PCT/US2016/069491；所有这些专利都通过援引以其整体并入本文。编码冠状病毒抗原的mRNA可以配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包括至少一种可电离的阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种甾醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。

其中配制有编码冠状病毒抗原的mRNA的脂质纳米颗粒组合物的脂质组合物可以包括一种或多种磷脂，例如一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或它们的组合。通常，磷脂包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

磷脂部分可以选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。

其中配制有编码冠状病毒抗原的mRNA的脂质组合物可以包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语结构脂质是指甾醇并且还指含有甾醇部分的脂质。

在脂质纳米颗粒中掺入结构脂质可以有助于减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可以选自包括但不限于以下项的组：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚、藿烷类化合物(hopanoids)、植物甾醇、类固醇以及它们的混合物。在一些实施例中，结构脂质是甾醇。

其中配制有编码冠状病毒抗原的mRNA的脂质组合物可以包括一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。在一些实施例中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基咪唑二酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。

编码冠状病毒抗原的mRNA可以在重组载体内编码。载体可用于递送编码冠状病毒抗原的mRNA。载体可以是哺乳动物、病毒或细菌表达载体。

载体可以是例如质粒、人工染色体(例如，BAG、PAC或YAC)或病毒或噬菌体载体，并且可以任选地包括用于表达多核苷酸的启动子、增强子或调节子。载体还可以含有一种或多种可选择标记基因，例如在细菌质粒的情况下的氨苄青霉素、新霉素和/或卡那霉素抗性基因或真菌载体的抗性基因。载体可以在体外使用，例如，用于产生DNA或RNA或用于转染或转化宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)，例如，用于产生由载体编码的蛋白质。载体也可以适于在体内使用，例如在DNA疫苗接种、RNA疫苗接种或基因治疗的方法中。

病毒基因组提供了丰富的载体来源，该载体可用于将编码冠状病毒抗原的mRNA有效递送到细胞(例如，真核或原核细胞)的基因组中。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含在此类基因组内的多核苷酸通常通过普遍或专门的转导掺入靶细胞的基因组中。这些过程作为自然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。可用于递送编码冠状病毒抗原的mRNA的病毒载体的实例包括逆转录病毒、腺病毒(例如，Ad2、Ad5、Ad11、Ad12、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad40、Ad48、Ad49、Ad50、Ad52(例如，RhAd52)、Ad59(例如，RhAd59)和Pan9(也称为AdC68))、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒，比如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(比如小核糖核酸病毒和甲病毒)，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，痘苗、改良痘苗安卡拉(MVA)、鸡痘和金丝雀痘)。用于递送编码免疫原(例如，多肽)的多核苷酸的其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝性DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication[逆转录病毒：病毒及其复制],In Fundamental Virology[基础病毒学],第三版,B.N.Fields等人,编辑,Lippincott-Raven Publishers[利平科特—雷文出版公司],费城,1996)。这些腺病毒载体可来源于例如人、黑猩猩或恒河猴腺病毒。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、梅森辉瑞猴病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳氏肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例描述于例如，McVey等人，(美国专利第5,801,030号)；其通过援引以其全文并入本文。病毒载体的核酸材料(例如，包括核酸分子)可以被封装在例如脂质膜中或被结构蛋白(例如，衣壳蛋白)封装，该结构蛋白可以包括一种或多种病毒多肽(例如，糖蛋白)。病毒载体可用于感染对象的细胞，这反过来又促进病毒载体的一个或多个异源基因翻译成免疫原。

国际专利申请公布WO 2006/040330和WO 2007/104792(各自通过援引并入本文)中披露的腺病毒载体作为载体特别有用。这些腺病毒载体可以编码和/或递送免疫原(例如，SARS-CoV-2多肽)中的一种或多种以治疗患有与病毒感染(例如，SARS-CoV-2感染)相关的病理病况的对象。在一些实施例中，可以将一种或多种重组腺病毒载体施用于对象以表达多于一种类型的免疫原(例如，SARS-CoV-2多肽)。除腺病毒载体外，其他病毒载体和技术是本领域已知的，其可用于促进免疫原中的一种或多种在对象(例如，人)中的递送和/或表达。这些病毒包括痘病毒(例如，痘苗病毒和改良痘苗病毒安卡拉(MVA)；参见例如，美国专利第4,603,112号和第5,762,938号，各自通过援引并入本文)、疱疹病毒、披膜病毒(例如，委内瑞拉马脑炎病毒；参见例如，美国专利号第5,643,576号，通过援引并入本文)、小核糖核酸病毒(例如，脊髓灰质炎病毒；参见例如，美国专利第5,639,649号，通过援引并入本文)、杆状病毒和Wattanapitayakul和Bauer描述的其他病毒(Biomed.Pharmacother.[生物医学药物疗法]54:487(2000)，通过援引并入本文)。

在一些实施例中，将编码冠状病毒抗原的mRNA掺入重组AAV(rAAV)载体和/或病毒粒子中，以促进将它们引入细胞中。在本文所述的组合物和方法中有用的rAAV载体是重组多核苷酸构建体，其包括(1)待表达的异源序列(例如，编码待表达的冠状病毒抗原的多核苷酸)和(2)促进异源基因稳定性和表达的病毒序列。病毒序列可以包括将DNA顺式复制和包装到病毒粒子中所需的那些AAV序列(例如，功能性ITR)。此类rAAV载体也可以包含标记或报告基因。有用的rAAV载体，其AAV WT基因中的一个或多个被全部或部分删除，但保留功能性侧翼ITR序列。AAV ITR可以是适用于具体应用的任何血清型。使用rAAV载体的方法记载于例如Tal等人,J.Biomed.Sci.[生物医学科学期刊]7:279(2000)，以及Monahan和Samulski,Gene Delivery[基因递送]7:24(2000)，由于它们与用于基因递送的AAV载体有关，因此每篇的披露内容均通过援引并入本文。

可以将编码冠状病毒抗原的mRNA掺入rAAV病毒粒子中，以促进将编码冠状病毒抗原的mRNA引入细胞中。AAV的衣壳蛋白构成病毒粒子的外部非核酸部分，并且由AAV帽基因编码。帽基因编码病毒粒子组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3。rAAV病毒粒子的构建已在例如以下各项中进行了描述：US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz等人,J.Virol.[病毒学期刊]76:791(2002)和Bowles等人,J.Virol.[病毒学期刊]77:423(2003)，因为它们与用于基因递送的AAV载体有关，因此每篇的披露内容均通过援引并入本文。

有用的rAAV病毒粒子包括衍生自各种AAV血清型的病毒粒子，所述AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 rh10、rh39、rh43、rh74和Anc80。不同血清型的AAV载体和AAV蛋白的构建和使用记载于例如以下各项中：Chao等人,Mol.Ther.[分子治疗]2:619(2000)；Davidson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97:3428(2000)；Xiao等人,J.Virol.[病毒学期刊]72:2224(1998)；Halbert等人,J.Virol.[病毒学期刊]74:1524(2000)；Halbert等人,J.Virol.[病毒学期刊]75:6615(2001)；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.[人类分子遗传学]10:3075(2001)，由于它们与用于基因递送的AAV载体有关，因此每篇的披露内容均通过援引并入本文。

AAV载体可以是假型载体。假型载体包括给定血清型(例如，AAV9)的AAV载体，该AAV载体用衍生自给定血清型以外的血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等)的衣壳基因假型化。涉及构建和使用假型rAAV病毒粒子的技术是本领域已知的并且记载于例如以下各项中：在Duan等人,J.Virol.[病毒学期刊]75:7662(2001)；Halbert等人,J.Virol.[病毒学期刊]74:1524(2000)；Zolotukhin等人,Methods[方法],28:158(2002)；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.[人类分子遗传学]10:3075(2001)。

在病毒粒子衣壳内具有突变的AAV病毒粒子可比未突变的衣壳病毒粒子更有效地用于感染具体细胞类型。例如，合适的AAV突变体可具有配体插入突变，用于促进将AAV靶向特定细胞类型。AAV衣壳突变体(包括插入突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体)的构建和表征记载于Wu等人,J.Virol[病毒学期刊]74:8635(2000)中。可用于本文所述方法中的其他rAAV病毒粒子包括通过病毒的分子育种以及通过外显子改组产生的那些衣壳杂合体。参见，例如，Soong等人,Nat.Genet.[自然遗传学],25:436(2000)和Kolman和Stemmer,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]19:423(2001)。

使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。例如逆转录病毒载体可用于将多核苷酸稳定整合到宿主基因组中，尽管这种重组不是优选的。相比之下，复制缺陷型腺病毒载体保持附加型，因此允许瞬时表达。

可以采用能够在昆虫细胞(例如杆状病毒载体)、在人类细胞、在酵母或在细菌中驱动表达的载体，以产生大量由mRNA编码的冠状病毒抗原，例如，用作亚单位疫苗或用于免疫测定。

佐剂

在一些实施例中，本文所述的免疫原性组合物可包括一种或多种佐剂。佐剂是指引起对免疫系统的刺激的物质。在本上下文中，佐剂用于增强对一种或多种抗原(例如，冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列))的免疫应答。可以在施用抗原(例如，冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列))之前、与该抗原组合或施用该抗原之后向对象施用佐剂。在一些实施例中，将另外的佐剂与本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)组合向对象施用。在一些实施例中，佐剂可以与脂质缀合。佐剂可以是但不限于脂质(例如，单磷酰脂质A(MPLA))、明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；弗氏佐剂；从皂树的树皮中纯化的皂苷，比如QS21(用HPLC分馏在第21个峰中洗脱的糖脂；Antigenics,Inc.[抗原公司]，伍斯特，马萨诸塞州)；聚[二(羧基苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；病毒研究所，美国)、Flt3配体、利什曼原虫延伸因子(纯化的利什曼原虫蛋白；Corixa公司，西雅图，华盛顿州)、ISCOMS(免疫刺激复合物，其含有混合皂苷、脂质并形成带有可以容纳抗原的孔隙的、病毒大小的颗粒；CSL公司，墨尔本，澳大利亚)、Pam3Cys、SB-AS4(史克必成公司(SmithKline Beecham)佐剂系统#4，其含有明矾和MPL；SBB公司，比利时)、形成胶束的非离子嵌段共聚物比如CRL 1005(这些含有侧接聚氧乙烯链的疏水性聚氧丙烯的直链，Vaxcel公司，诺克罗斯，佐治亚州)和Montanide IMS(例如，IMS1312，结合有可溶性免疫刺激剂的水基纳米粒子，赛比克公司(Seppic))和CDN(环状二核苷酸)。

佐剂可以是toll样受体(TLR)配体。通过TLR3起作用的佐剂包括但不限于双链RNA。通过TLR4起作用的佐剂包括但不限于脂多糖的衍生物，比如单磷酰脂质A(MPLA；利比免疫化学研究公司(Ribi ImmunoChem Research，Inc.)，汉密尔顿，蒙特利尔)和胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏氨酰胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；瑞士欧姆制药有限公司(OM Pharma SA)，梅林，瑞士)。通过TLR5起作用的佐剂包括但不限于鞭毛蛋白。通过TLR7和/或TLR8起作用的佐剂包括单链RNA、寡核糖核苷酸(ORN)、合成的低分子量化合物，比如咪唑并喹啉胺(例如，咪喹莫特(R-837)、雷西莫特(R-848))。通过TLR9起作用的佐剂5包括病毒或细菌来源的DNA，或合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，比如CpG ODN。另一类佐剂是含有硫代磷酸酯的分子，比如硫代磷酸酯核苷酸类似物和含有硫代磷酸酯主链键合的核酸。

药物组合物和制剂

本文描述的是本发明的药物组合物，其包括CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。除了治疗量的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)以外，药物组合物可以包含药学上可接受的载剂或赋形剂，该载剂或赋形剂可以通过本领域技术人员已知的方法配制。在其他实施例中，本发明的药物组合物可以包含编码本文所述的一种或多种冠状病毒抗原(例如冠状病毒刺突蛋白或其肽，和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽)的核酸分子(例如，在载体中，比如病毒载体)。编码本文所述的冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽，和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽)的核酸分子可以被克隆到合适的表达载体中，该载体可以经由基因治疗中众所周知的方法递送。

CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的药物组合物中的可接受的载剂和赋形剂在采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施例中，一种或多种配制品材料用于皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)施用。在一些实施例中，施用是通过吸入或鼻内施用。在一些实施例中，一种或多种配制品材料用于气管内施用。在一些实施例中，一种或多种配制品材料用于通过在机械通气期间吸入施用。在一些实施例中，药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗量、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制品材料。在一些实施例中，合适的配制品材料包括但不限于氨基酸(比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(比如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(比如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、HEPES、TAE、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(比如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(比如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β环糊精或羟丙基-β环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(比如葡萄糖、蔗糖、甘露糖或葡聚糖)；蛋白质(比如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(比如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(比如钠)；防腐剂(比如氯化六甲铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(比如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(比如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(比如普朗尼克、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯比如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕(tyloxapal))；稳定性增强剂(比如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(比如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack出版公司(1995))。在一些实施例中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，同上。在一些实施例中，此类组合物可影响两亲缀合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在一些实施例中，药物组合物(包括CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列))中的主要媒介物或载剂在性质上可以是水性的或非水性的。例如，在一些实施例中，合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。在一些实施例中，盐水包括等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施例中，中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在一些实施例中，药物组合物包括pH约7.0-8.5的Tris缓冲液或pH约4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，这些缓冲液可进一步包括山梨糖醇或其合适的替代物。在一些实施例中，包括CpG两亲分子或冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物可以通过将具有所需纯度的选定组合物与任选的以冻干饼或水溶液形式的配制品试剂(Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，同上)混合来制备，以供储存。此外，在一些实施例中，包括CpG两亲分子或冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物可以使用合适的赋形剂(比如蔗糖)配制为冻干物。

在一些实施例中，药物组合物可以经选择用于肠胃外递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。

在一些实施例中，配制品组分以施用部位可接受的浓度存在。在一些实施例中，缓冲液用于将组合物维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

在一些实施例中，当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可以呈无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，包括在药学上可接受的媒介物中的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。在一些实施例中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中CpG两亲分子或冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)被配制为无菌、等渗溶液，并妥善保存。在一些实施例中，制剂可以涉及所需分子与试剂(比如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)的配制品，该试剂可以提供产品的受控或持续释放，然后该产品可以经由积存注射递送。在一些实施例中，还可以使用透明质酸，并且其可以具有促进在循环中的持续时间的作用。在一些实施例中，可植入药物递送装置可用于引入所需分子。

药物组合物可以以治疗有效量施用以便诱导免疫应答。包含在药物制剂中的CpG两亲分子和冠状病毒蛋白或肽的治疗有效量可由本领域技术人员确定，使得剂量(例如，在0.01-100mg/kg体重范围内的剂量)在对象中诱导免疫应答。

可用作体内核酸递送媒介物的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒载体，比如改良痘苗安卡拉(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体。在一些实施例中，载体可包括内核糖体进入位点(IRES)，其允许表达本文所述的多种冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白、其肽、或编码它们的核酸序列)。用于核酸递送的其他媒介物和方法记载于美国专利第5,972,707、5,697,901和6,261,554号中，每篇专利均通过援引以其全文并入本文。制备药物组合物的其他方法记载于例如美国专利第5,478,925、8,603,778、7,662,367和7,892,558号中，所有这些专利都通过援引以其全文并入本文。

施用途径、剂量和时机

包含本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的本发明的药物组合物作为治疗剂可以配制用于肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、鼻内施用、吸入、气管内施用或通过在机械通气期间吸入施用。施用治疗性蛋白质的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利第6,174,529、6,613,332、8,518,869、7,402,155和6,591,129号，以及美国专利申请公布第US 20140051634、WO 1993000077和US 20110184145号，这些公布的披露内容通过援引以其全文并入。

这些方法中的一种或多种可用于施用本发明的药物组合物，该组合物包含本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。对于可注射配制品，各种有效的药物载剂是本领域已知的。参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice[药剂学和药学实践],J.B.利平科特公司(J.B.Lippincott Company),费城,宾夕法尼亚州,Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982),和ASHP Handbook on Injectable Drugs[注射用药物手册],Toissel,第4版,第622-630页(1986)。本发明药物组合物的剂量取决于多种因素，包括施用途径和对象的身体特征，例如,年龄、体重、一般健康状况。通常，单次剂量内含有的本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的量可以是在对象中有效诱导免疫应答而不诱导显著毒性的量。本发明的药物组合物可以包括以下剂量的本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)：范围为0.001mg至500mg(例如，0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.5mg、0.7mg、0.8mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、50mg、100mg、250mg或500mg)，并且在更具体的实施例中，为约0.1mg至约100mg。临床医生可根据对象的不同参数调整剂量。

在具体实施例中，对象接受约10μg至约1.0mg剂量的冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。具体而言，施用的冠状病毒抗原的剂量为约40μg至60μg、约50μg至70μg、约50μg至150μg、约70μg至150μg、约100μg至150μg、约100μg至200μg、约140μg至250μg、约200μg至300μg、约250μg至500μg、约300μg至600μg、或约500μg至1.0mg。具体而言，向对象施用的冠状病毒抗原的剂量可以是约10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、或1mg。对象还可以接受在冠状病毒抗原的这些具体剂量中的任何两个之间的范围内的剂量。

在具体实施例中，CpG两亲分子的剂量为约0.1mg至20mg。具体而言，施用的CpG两亲分子的剂量为约0.1mg至1.0mg、约0.5mg至3.0mg、约1.0mg至5.0mg、约2.0mg至5.0mg、约3.0mg至5.0mg、约3.0mg至10.0mg、约4.0mg至12.0mg、约5.0mg至15.0mg或约5.0mg至20mg。向对象施用的CpG两亲分子的具体剂量可以是约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10.0mg、11.0mg、12.0mg、13.0mg、14.0mg、15.0mg、16.0mg、17.0mg、18.0mg、19.0mg、或20.0mg。对象也可以接受在CpG两亲分子的这些具体剂量中的任何两个之间的范围内的剂量。

含有本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的本发明的药物组合物可以例如每天、每周、每月、每半年、每年一次或多次(例如，1次至10次或更多次)或按照医学需要向需要该组合物的对象施用。

在一些实施例中，向对象施用冠状病毒刺突蛋白或肽的三聚体。在一些实施例中，向对象施用编码冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的mRNA。在一些实施例中，向对象同时或基本上同时施用冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)和CpG两亲分子。CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)可以是共配制的，或者它们可以作为两种单独的配制品施用。在一些实施例中，依次施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。例如，可以首先施用CpG两亲分子，并且然后施用冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)；或者在一些实施例中，可以首先施用冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)，并且然后施用CpG两亲分子。在一些实施例中，CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)与第二佐剂一起施用。

诱导免疫应答的方法

本发明提供了通过向对象施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)在对象中诱导免疫应答的方法。对象可以是哺乳动物(例如，人、狗或猫)。在一些实施例中，对象是人对象。通过向对象施用治疗有效量的本文所述的免疫原性组合物或药物组合物来在对象中诱导免疫应答。免疫原性组合物或药物组合物包括本文所述的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或其冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。在一些实施例中，CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)可以与一种或多种另外的佐剂一起施用。在一些实施例中，CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)可以在没有一种或多种另外的佐剂的情况下施用。在一些实施例中，所述方法包括向对象施用1)治疗有效量的本文所述的CpG两亲分子，和2)冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。在一些实施例中，基本上同步施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。在一些实施例中，单独施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。在一些实施例中，首先施用CpG两亲分子，随后施用冠状病毒刺突蛋白或肽。在一些实施例中，首先施用冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)，随后施用CpG两亲分子。

在一些实施例中，免疫应答对SARS-CoV-2感染起保护作用。

在一些实施例中，免疫应答对Covid-19疾病起保护作用。

在一些实施例中，免疫应答对需要辅助通气和氧合的严重Covid-19疾病起保护作用。这些患者患有急性呼吸窘迫综合征。一些患者会发展严重的心血管损害。其他并发症包括，例如，急性心脏损伤、急性肾损伤、感染性休克、多器官衰竭和死亡风险增加。

在一些实施例中，免疫应答对选自由以下各项组成的组的一种或多种COVID-19疾病症状的发展起保护作用：发热、喉咙痛、流鼻涕、打喷嚏、鼻塞、打鼾、咳嗽、干咳、呼吸急促、呼吸困难、胸部持续性疼痛或压迫、呼吸困难、肺炎、急性呼吸系统综合征、紫绀、肌痛、头痛、脑病、心肌损伤、心力衰竭、心律失常、凝血功能障碍、急性肾损伤、意识模糊或无法唤醒、疲劳和胃肠道症状。

在一些实施例中，免疫应答降低了选自由以下各项组成的组的一种或多种COVID-19疾病症状的发生率：发热、喉咙痛、流鼻涕、打喷嚏、鼻塞、打鼾、咳嗽、干咳、呼吸急促、呼吸困难、胸部持续性疼痛或压迫、呼吸困难、肺炎、急性呼吸系统综合征、紫绀、肌痛、头痛、脑病、心肌损伤、心力衰竭、心律失常、凝血功能障碍、急性肾损伤、意识模糊或无法唤醒、疲劳和胃肠道症状。

在一些实施例中，免疫应答对选自由以下各项组成的组的一种或多种COVID-19疾病症状起治疗作用：发热、喉咙痛、流鼻涕、打喷嚏、鼻塞、打鼾、咳嗽、干咳、呼吸急促、呼吸困难、胸部持续性疼痛或压迫、呼吸困难、肺炎、急性呼吸系统综合征、紫绀、肌痛、头痛、脑病、心肌损伤、心力衰竭、心律失常、凝血功能障碍、急性肾损伤、意识模糊或无法唤醒、疲劳和胃肠道症状。如果免疫应答逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止COVID-19疾病症状的进展或严重性，则该免疫应答起治疗作用。

在一些实施例中，免疫应答会降低COVID-19复发或SARS-CoV-2再感染的可能性。

在一些实施例中，免疫应答会降低SARS-CoV-2传播的可能性。

在一些实施例中，对象是SARS-CoV-2的无症状携带者。

在一些实施例中，对象具有选自由以下各项组成的组的COVID-19的一种或多种症状：发热、喉咙痛、流鼻涕、打喷嚏、鼻塞、打鼾、咳嗽、干咳、呼吸急促、呼吸困难、胸部持续性疼痛或压迫、呼吸困难、肺炎、急性呼吸系统综合征、紫绀、肌痛、头痛、脑病、心肌损伤、心力衰竭、心律失常、凝血功能障碍、急性肾损伤、意识模糊或无法唤醒、疲劳和胃肠道症状。

在一些实施例中，对象已被诊断患有SARS-CoV-2感染。

在一些实施例中，对象处于SARS-CoV-2感染的高风险中(例如，医务人员和/或第一急救者)。

在一些实施例中，将本文所述的免疫原性组合物或药物组合物施用于与已被诊断患有冠状病毒感染(例如，COVID-19)的人接触过的对象，或近期去过或正计划去正在经历COVID-19或其他冠状病毒感染爆发的地区旅行的对象。

在一些实施例中，刺突蛋白或其肽包含在灭活或被杀死的病毒疫苗的制剂内。

在一些实施例中，刺突蛋白或其片段呈亚单位形式。

在一些实施例中，编码冠状病毒刺突蛋白的核酸编码预融合稳定形式的刺突蛋白。

在一些实施例中，编码冠状病毒刺突蛋白或其肽的核酸包含在腺病毒载体内。

组合疗法

本文所述的发明还提供了通过将CpG两亲分子和冠状病毒抗原与一种或多种另外的治疗剂组合来在对象中诱导免疫应答的方法。组合方案中可采用的治疗剂的具体组合将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及待实现的所需治疗效果。还应当理解，所采用的疗法可以针对相同的病症实现所需效果，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制一种或多种副作用)。CpG两亲分子和冠状病毒抗原可以与以下物质组合施用：抗病毒剂(例如，瑞德西韦)、抗病毒疫苗(例如，冠状病毒疫苗，比如针对SARS-CoV-2的疫苗)、抗生素剂、抗真菌剂、抗炎剂、抗寄生虫剂和免疫治疗剂。

在一些实施例中，抗病毒剂可以是瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、巴瑞替尼、洛匹那韦/利托那韦、干扰素β、阿比朵尔、法维拉韦、托珠单抗、利巴韦林或其他药物。在一些实施例中，抗病毒剂是瑞德西韦。

在一些实施例中，抗病毒疫苗包括在对象中引发针对冠状病毒的免疫应答的任何组合物，比如HCoV-NL3疫苗、SARS-CoV-1疫苗、SARS-CoV-2疫苗或MERS疫苗。在一些实施例中，抗病毒疫苗包括灭活或被杀死的病毒，比如HCoV-NL3病毒、SARS-CoV-1病毒、SARS-CoV-2病毒或MERS病毒。在一些实施例中，抗病毒疫苗作为异源初免或加强施用或与包括本文所述的CpG两亲分子的免疫原性组合物组合施用。

在一些实施例中，抗生素剂可以选自阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、大观霉素、格尔德霉素、除锈霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多立培南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢罗膦、头孢比普、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、达巴凡星、奥古霉素、克林霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泊西唑利德、雷德唑胺、妥利唑胺、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素g、青霉素v、哌拉西林、替莫西林、替卡西林、阿莫西林克拉维酸盐、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、替卡西林/克拉维酸盐、杆菌肽、多粘菌素、多粘菌素b、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地托辛、磺胺甲二唑、磺胺甲基异噁唑、对氨基苯磺酰胺、柳氮磺胺吡、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(tmp-smx)、磺胺缩甲苷、地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇(bs)、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁/达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑和甲氧苄啶。

在一些实施例中，抗真菌剂可以选自两性霉素B、克念菌素、非律平、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂霉素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、三唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、噻唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素、托萘酯和十一碳烯酸。在一些实施例中，抗寄生虫剂可以是氯喹或羟氯喹。

在一些实施例中，抗炎剂可以为地塞米松。在一些实施例中，抗炎剂可以选自塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、二甲双胍和地塞米松。

在一些实施例中，免疫治疗剂可以选自贝沙罗汀、干扰素α、干扰素β、氯贝他索、聚乙二醇干扰素(例如，)、泼尼松、罗米地新、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、醋酸曲安奈德乳膏、抗趋化因子、伏力诺他、加巴喷丁、淋巴样细胞表面受体和/或淋巴因子抗体、表面癌蛋白抗体和/或小分子疗法，如伏力诺他。在一些实施例中，免疫治疗剂是干扰素β、托珠单抗或巴瑞替尼。在一些实施例中，免疫治疗剂可包括抗体。在一些实施例中，免疫治疗剂可以是恢复期血浆(例如，人恢复期血浆)。

CpG两亲分子和冠状病毒抗原以及一种或多种另外的治疗剂可以依次施用(例如，相隔1天、相隔2天、相隔3天、相隔1周、相隔1个月、相隔6个月或更长)或基本上同步(例如，在1天内)施用。CpG两亲分子和冠状病毒抗原以及一种或多种另外的治疗剂可以配制在单一药物组合物中或可以作为单独的药物组合物施用。CpG两亲分子和冠状病毒抗原以及一种或多种另外的治疗剂可以通过相同的施用途径或不同的施用途径施用。两种或更多种药剂可以以相同频率或不同频率施用。

另外的治疗剂可以口服地、局部地、静脉内地、肌内地、经皮地、皮内地、动脉内地、颅内地、皮下地、眼眶内地、心室内地、脊柱内地、腹膜内地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用。在具体实施例中，另外的治疗剂通过静脉内施用或者另外的治疗剂可以以其监管批准的形式施用。另外的治疗剂或其药学上可接受的盐可以在包含一种或多种药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物中施用。合适的载剂、赋形剂或稀释剂的实例包括例如盐水、无菌水、聚亚烷基二醇、植物来源的油、氢化萘、合适的缓冲液、1,3-丁二醇、林格氏溶液和/或氯化钠溶液。用于肠胃外施用的示例性配制品可以包括在水中适当地与表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)混合而制备的溶液。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、DMSO以及它们有醇或无醇的混合物中，以及在油中制备。在一般的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以阻止微生物的生长。其他示例性载剂、赋形剂或稀释剂记载于Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用辅料手册],第6版,Rowe等人编辑,Pharmaceutical Press[医药出版社](2009)，在此通过援引以其全文并入本文。另外的治疗剂可以在用于本发明方法的药物组合物中施用并且可以呈现片剂、软胶囊、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、无菌溶液或混悬剂、和/或缓释配制品的形式。

试剂盒

试剂盒可包括如本文所披露的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)，和使用说明。试剂盒可以在一个或多个合适的容器中包括CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)、一种或多种对照以及本领域熟知的各种缓冲液、试剂、酶和其他标准成分。在一些实施例中，试剂盒进一步包括佐剂。

容器可以包括一个或多个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，CpG两亲分子或冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)可以放置到，并且在某些情况下适当地等分到这些容器中。当提供另外的组分时，试剂盒可以包含该化合物可放置到其中的另外的容器。试剂盒还可以包括用于包含CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的装置，以及任何其他密封用于商业销售的试剂容器。此类容器可以包括注射或吹塑成型的塑料容器，其中保留了所需的小瓶。容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明和/或警告的标签。

在一些实施例中，本披露提供了包括一个或多个容器的试剂盒，这些容器含有包括CpG两亲分子的组合物和包括冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物、任选的药学上可接受的载剂、和包装插页，(包括用于诱导免疫应答的组合物的施用说明)。在一些实施例中，试剂盒进一步包括另外的佐剂和佐剂的施用说明。

在一些实施例中，本披露提供了包括药物的试剂盒，该药物包含包括CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物、任选的药学上可接受的载剂、和包装插页，包括只施用药物、或与包括另外的佐剂和任选的药学上可接受的载剂的组合物组合施用药物以诱导免疫应答的说明)。

在一些实施例中，本披露提供了包括容器的试剂盒，该容器含有包括CpG两亲分子的组合物和包括冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物、任选的药学上可接受的载剂、和包装插页(包括用于在对象中诱导免疫应答的组合物疫苗的施用说明)。在一些实施例中，试剂盒进一步包括另外的佐剂和用于在对象中诱导免疫应答的佐剂的施用说明。

除了本文所述的组合物之外，试剂盒可以包括其他组分或成分，比如溶剂或缓冲液、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如，苦味拮抗剂或甜味剂)、芳香剂、染料或着色剂(例如用于给试剂盒中的一种或多种组分染色或着色)的一种或多种容器。试剂盒还可包括用于治疗本文所述病况或病症(例如，冠状病毒感染)的第二药剂。替代性地，试剂盒中可以包括其他一种或多种组分，但它们处于不同于CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)的组合物的不同组合物或容器中。在此类实施例中，试剂盒可以包括针对混合本文所述的化合物和其他一种或多种组分的说明，或针对与其他一种或多种组分一起使用本文所述的化合物(例如，CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列))的说明。

本文所述的组合物可以以任何形式(例如，液体、干燥或冻干形式)提供。优选本文所述的化合物是基本上纯的和/或无菌的。当本文所述的化合物以液体溶液形式提供时，该液体溶液优选为水溶液，其中优选为无菌水溶液。当本文所述的化合物以干燥形式提供时，重构通常是通过添加合适的溶剂来进行的。试剂盒中可以任选地提供溶剂，例如，无菌水或缓冲液。

试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，对于水分或蒸发的变化不可渗透)和/或不透光的。

试剂盒任选地包括适用于递送组合物的装置，例如注射器。

编号的实施例

本文所述的技术的一些实施例可以根据以下编号的实施例中的任何一个来定义。还包括组合物和试剂盒，其包括本文所述方法中使用的组分。

1.一种在对象中诱导针对冠状病毒抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用(1)CpG两亲分子以及(2)冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列。

2.用于在对象中诱导针对冠状病毒抗原的免疫应答的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中所述CpG两亲分子以及所述冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列被配制用于向对象施用。

3.如实施例1的方法，其中冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽或者编码所述冠状病毒刺突蛋白或肽的核酸序列。

4.如实施例1或3的方法，其中CpG两亲分子包含与脂质键合的CpG序列。

5.如实施例1或3的方法，CpG两亲分子包含通过接头与脂质连接的CpG序列。

6.如实施例5的方法，其中接头包括聚合物、氨基酸串、核酸串、多糖或它们的组合。

7.如实施例6的方法，其中接头包含核酸串。

8.如实施例7的方法，其中核酸串包含在1个与50个之间的核酸残基。

9.如实施例8的方法，其中核酸串包含在5个与30个之间的核酸残基。

10.如实施例5-9中任一项的方法，其中核酸串包含“N”个鸟嘌呤，其中N为1至10。

11.如实施例6的方法，其中接头包含连续的聚乙二醇单元。

12.如实施例11的方法，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在20与80之间。

13.如实施例12的方法，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在30与70之间。

14.如实施例13的方法，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在40与60之间。

15.如实施例14的方法，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在45与55之间。

16.如实施例15的方法，其中接头包含48个连续的聚乙二醇单元。

17.如实施例1和3-16中任一项的方法，其中脂质是二酰基脂质。

18.如实施例17的方法，其中二酰基脂质具有以下结构：

或其盐，

其中X是O或S。

19.如实施例1和3-18中任一项的方法，其中CpG序列包含核苷酸序列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'(SEQ ID NO:1)。

20.如实施例1和3-18中任一项的方法，其中CpG序列包含核苷酸序列5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:2)。

21.如实施例19或实施例20的方法，其中连接CpG序列中的核苷的所有核苷间基团均为硫代磷酸酯。

22.如实施例1和3-21中任一项的方法，其中冠状病毒刺突蛋白或其肽是SARS-CoV-2刺突蛋白或其肽。

23.如实施例1和3-22中任一项的方法，其中冠状病毒刺突蛋白的肽是特异性结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的受体结合结构域。

24.如实施例1和3-23中任一项的方法，其中冠状病毒刺突蛋白的肽包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:3)。

25.如实施例24的方法，其中冠状病毒刺突蛋白的肽包含以下的多肽序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:3)。

26.如实施例1和4-22中任一项的方法，其中冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

27.如实施例26的方法，其中冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

28.如实施例26的方法，其中冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含以下的多肽序列：

29.如实施例1和3-28中任一项的方法，其中冠状病毒抗原包含一个或多个标签。

30.如实施例29的方法，其中标签是Avi标签。

31.如实施例29的方法，其中标签是组氨酸标签。

32.如实施例29-31中任一项的方法，其中冠状病毒抗原包含Avi标签和组氨酸标签。

33.如实施例29-32中任一项的方法，其中冠状病毒抗原包含在多肽序列与一个或多个标签之间的接头。

34.如实施例1、3-25和29-32中任一项的方法，其中施用冠状病毒刺突蛋白。

35.如实施例34的方法，其中施用冠状病毒刺突蛋白的三聚体。

36.如实施例35的方法，其中三聚体是包含以下序列的蛋白质构建体的三聚体：

37.如实施例1和3-36中任一项的方法，其中施用冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

38.如实施例37的方法，其中施用包含以下序列的冠状病毒刺突蛋白构建体的三聚体：

以及具有以下的多肽序列的冠状病毒核衣壳蛋白构建体：

39.如实施例1、3-26、29-32和37中任一项的方法，其中施用编码冠状病毒抗原的mRNA。

40.如实施例1和3-39中任一项的方法，其中同时施用CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

41.如实施例1和3-39中任一项的方法，其中依次施用CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

42.如实施例41的方法，其中首先施用CpG两亲分子，随后施用冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

43.如实施例41的方法，其中首先施用冠状病毒抗原或编码其的核酸序列，随后施用CpG两亲分子。

44.如实施例1和3-43中任一项的方法，其中所述方法包括向对象施用第二佐剂。

45.如实施例1和3-44中任一项的方法，其中所述方法包括向对象施用冠状病毒疫苗作为初免或加强。

46.如实施例1和3-45中任一项的方法，其中皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用所述CpG两亲分子。

47.如实施例46的方法，其中CpG两亲分子是皮下施用的。

48.如实施例1和3-47中任一项的方法，其中皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用冠状病毒抗原。

49.如实施例1和3-48中任一项的方法，其中对象是哺乳动物。

50.如实施例49的方法，其中对象是人。

51.一种药物组合物，其包含CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，以及药学上可接受的载剂。

52.如实施例51的药物组合物，其中冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。

53.如实施例51的药物组合物，其中冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

54.如实施例51的药物组合物，其中冠状病毒抗原包括冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

55.一种试剂盒，其包含CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列。

56.如实施例55的试剂盒，其中冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。

57.如实施例55的试剂盒，其中冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

58.如实施例55的试剂盒，其中冠状病毒抗原包括冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

59.如实施例2使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽或者编码所述冠状病毒刺突蛋白或肽的核酸序列。

60.如实施例2或59使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中所述CpG两亲分子包含与脂质键合的CpG序列。

61.如实施例2或59使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，所述CpG两亲分子包含通过接头与脂质连接的CpG序列。

62.如实施例61使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包括聚合物、氨基酸串、核酸串、多糖或它们的组合。

63.如实施例62使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含核酸串。

64.如实施例63使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中核酸串包含在1个与50个之间的核酸残基。

65.如实施例64使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中核酸串包含在5个与30个之间的核酸残基。

66.如实施例61-65中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中核酸串包含“N”个鸟嘌呤，其中N为1-10。

67.如实施例63使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含连续的聚乙二醇单元。

68.如实施例67使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在20与80之间。

69.如实施例68使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在30与70之间。

70.如实施例69使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在40与60之间。

71.如实施例70使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在45与55之间。

72.如实施例71使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中接头包含48个连续的聚乙二醇单元。

73.如实施例2或59-72中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中脂质是二酰基脂质。

74.如实施例73使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中二酰基脂质具有以下结构：

或其盐，

其中X是O或S。

75.如实施例2或59-74中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中CpG序列包含核苷酸序列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'(SEQ ID NO:1)。

76.如实施例2或59-75中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中CpG序列包含核苷酸序列5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:2)。

77.如实施例75或实施例76使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中连接CpG序列中的核苷的所有核苷间基团均为硫代磷酸酯。

78.如实施例2或59-77中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒刺突蛋白或其肽是SARS-CoV-2刺突蛋白或其肽。

79.如实施例2或59-78中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒刺突蛋白的肽是特异性结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的受体结合结构域。

80.如实施例2或59-79中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒刺突蛋白的肽包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

81.如实施例80使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒刺突蛋白的肽包含以下的多肽序列：

82.如实施例2或61-79中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

83.如实施例82使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

84.如实施例82使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含以下的多肽序列：

85.如实施例2或59-83中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒抗原包含一个或多个标签。

86.如实施例85使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中标签是Avi标签。

87.如实施例85使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中标签是组氨酸标签。

88.如实施例85-86中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒抗原包含Avi标签和组氨酸标签。

89.如实施例85-88中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中冠状病毒抗原包含在多肽序列与一个或多个标签之间的接头。

90.如实施例2和59-89中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将施用冠状病毒刺突蛋白。

91.如实施例90使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将施用冠状病毒刺突蛋白的三聚体。

92.如实施例91使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中三聚体是包含以下序列的蛋白质构建体的三聚体：

93.如实施例2和59-92中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将施用冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

94.如实施例93使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将施用包含以下序列的冠状病毒刺突蛋白构建体的三聚体：

VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRAAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGGGSGGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:66)以及具有以下的多肽序列的冠状病毒核衣壳蛋白构建体：

95.如实施例2和59-94中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中施用编码所述冠状病毒抗原的mRNA。

96.如实施例2和59-95中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将同时施用所述CpG两亲分子以及所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

97.如实施例2和59-96中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将依次施用所述CpG两亲分子以及所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

98.如实施例97使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将首先施用所述CpG两亲分子，随后施用所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

98.如实施例97使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将首先施用所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列，随后施用所述CpG两亲分子。

99.如实施例2和59-99中任一项使用的所述CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将向对象施用第二佐剂。

100.如实施例2和59-99中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将向对象施用冠状病毒疫苗作为初免或加强。

101.如实施例2和59-100中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用所述CpG两亲分子。

102.如实施例101使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将皮下施用所述CpG两亲分子。

103.如实施例2和59-102中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中将皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用所述冠状病毒抗原。

104.如实施例2和59-103中任一项使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中对象是哺乳动物。

105.如实施例104使用的CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，其中对象是人。

实例

以下实例旨在说明而非限制本披露，并且旨在为本领域普通技术人员提供对如何使用、制备和评估本文所述的组合物和方法的描述。这些实例旨在纯粹是本披露的示例，并不旨在限制发明人认为是他们的发明的范围。

实例1：在小鼠中诱导免疫应答

通过将CpG两亲分子重悬于鲎变形细胞裂解物(limulus amebocyte lysate，LAL)H₂O中制得游离的CpG(CpG 1826)、CpG两亲分子(aCpG 1826)的储备溶液。用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释最终注射液，使得CpG的最终浓度为1nmol/100μL注射液。将SARS-CoV2刺突S1 RBD蛋白(SEQ ID NO:3)(表1)储备溶液以1.2mg/ml的浓度溶解在PBS中。最终注射液用1x PBS稀释至10μg/100μL注射液。

使用悬浮在PBS中的50μL抗原和50μL IFA的1:1混合，随后用力向上和向下移液30秒来制得IFA(不完全弗氏佐剂)溶液。使用悬浮在PBS中的10μg抗原和100μg明矾(相当于10μL)的1:9混合来制得铝水凝胶2％(10mg/ml)溶液。向该溶液添加用PBS制成100μL的抗原。通过用力移液5分钟来混合所述溶液。

将免疫皮下(SC)施用到雌性C57Bl6小鼠的双侧尾巴根部中，其中每侧50μL。每隔大约2周注射加强剂。

皮下注射确保疫苗经由自然淋巴引流以最佳方式递送到淋巴结中。在之前的小鼠研究中，双周注射被确定为产生免疫应答的最佳方法。

表1：疫苗组分

给药7天后，对外周血单核细胞(PBMC)进行TNFα和IFNγ的细胞内染色(ICS)测定。针对CD4和CD8以及有时CD3对细胞表面染色。对于ICS#1，在第一剂后，对于ICS#2，在第二剂后，用1μg/孔的肽活化PBMC 5小时(在布雷菲德菌素A存在下为4小时)(表2)。用对Db/Kb具有计算亲和力的肽再刺激C57Bl6细胞。用对Dd/Kd具有计算亲和力的肽再刺激Balb/c细胞

表2：再刺激肽

在剂量施用7天后对脾细胞进行IL2、IL4、IL6、IL10、IL17、TNFα和IFNγ的细胞计数珠阵列(CBA)分析。对于CBA#1，在第一剂后，用5μg/孔的肽活化PBMC过夜(表2)。对于CBA#2，在第二剂后，用0.42μg/孔的PepMix^TM SARS-CoV-2刺突糖蛋白(315种肽，每种0.42μg/孔)(表3)活化PBMC过夜。对于CBA#3，在第三剂后，用1μg/孔的PepMix^TM SARS-CoV-2刺突糖蛋白(315种肽，每种1μg/孔)(表3)活化PBMC过夜。

表3：再刺激PepMix

每次给药7天后，对小鼠血清进行SARS-CoV2特异性血清抗体酶联免疫吸附测定(ELISA)，以检测任何RBD特异性抗体应答。使用Ser-gel管(NC9436363，赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific))将全血旋转离心。血清或新鲜使用，或储存在-80℃下直至使用。96孔板在4℃下用200ng/100μl(2μg/ml)的CoV2 RBD蛋白(Z03483，金斯瑞公司(GenScript))包被过夜。然后在室温下用PBS+2％ BSA预封闭板2小时。小鼠血清以1:10稀释，并且然后在虚拟板中连续稀释(1:4，→8个浓度)。将样品转移到ELISA板并在室温下温育2小时。作为阳性对照，使用了两种抗体：Creative Diagnostics(CABT-CS035；克隆211184)：小鼠αRBD Mab和MyBioSource(MBS434247)：小鼠αRBD Mab。用洗涤缓冲液(BioLegend 4211601)洗涤板4次。作为二次检测抗体，以下以1:2000用于PBS+中并在室温(RT)下温育1小时：在最初的实验中，使用了AffiniPure兔抗小鼠IgG+IgM(H+L)HRP(315-035-048，杰克逊免疫研究所(Jackson ImmunoResearch))，但在后续的实验中，使用了AffiniPure兔抗小鼠IgM(μ链)HRP(315-035-049，杰克逊免疫研究所(JacksonImmunoResearch))和AffiniPure兔抗小鼠IgG(Fcγ)HRP(315-035-046，杰克逊免疫研究所(Jackson ImmunoResearch))。用洗涤缓冲液洗涤板4次。通过在室温下添加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)10分钟使反应可视化并通过H2SO4(1N)终止所述反应。通过ELISA酶标仪测量450nm处的吸光度。

进行抗His标签ELISA测定以确定在用RBD-His蛋白质构建体免疫后产生的免疫应答中的一些是否针对His标签而不是刺突RBD本身。板用带有His标签(PDL1-His)的不相关的蛋白质包被。血清仅以未稀释的浓度进行测试。使用兔抗小鼠IgG(Fcγ)HRP(315-035-046)作为二抗。使用His标签抗体[HRP](A00612，金斯瑞公司(GenScript))作为阳性对照。否则，如上所述进行ELISA。

使用来自金斯瑞公司(GenScript)的SARS-CoV-2替代病毒中和测试试剂盒(目录号L00847)进行中和抗体测定。通过将RBD 1:1000与HRP稀释缓冲液缀合制备辣根过氧化物酶(HRP)-RBD。为了制备整个板，使用5994μl缓冲液+6μl HRP缀合的RBD。将55μl稀释的HRP-RBD转移到新鲜的板(称为“血清温育板”)中。将连续稀释的样品血清置于单独的V形底板(称为“连续稀释板”)中。向第一行添加20μl未稀释的血清。然后将8μl未稀释的血清转移到含有24μl的PBS的后续孔中(1:4连续稀释)。稀释的样品血清(以及阳性和阴性对照)用样品稀释缓冲液稀释为1:10。这通过将54μl缓冲液添加到新鲜的板(称为“最终血清稀释板”)并将6μl连续稀释的血清转移到该板来完成。将55μL最终稀释的血清(和对照)转移到血清温育板(该板已经包含55μl的HRP缀合的RBD，这导致RBD和血清的1:1混合)，以获得1:20的最终稀释度，后续进行1:4连续稀释。

将血清温育板在37℃下温育30分钟。将100μL温育的血清-RBD混合物转移到ACE2预包被测定板。用提供的密封物覆盖板并在37℃下温育15分钟。然后用200μl的1x洗涤液洗涤板4次，该洗涤液由用去离子水稀释的20x洗涤缓冲液组成。向每个孔添加100μl的TMB溶液，并在室温下温育10分钟。为了猝灭反应，向每个孔添加50μl终止液。在450nm处立即读取吸光度。

在施用第四剂9天后，对脾细胞进行IFNγ的ELI斑点分析。用5μg/孔的肽(表2或表4)或0.84μg/孔的PepMix(表3)活化脾细胞(0.5x 10⁶个细胞/孔)。刺激IFNy板过夜。

表4：再刺激肽(第2批次)

假病毒中和测定由金斯瑞公司(GenScript)根据其程序和方案(SC1993-8)进行。所有60份第4剂后血清的小鼠样品与22份人类样品一起在干冰上送到金斯瑞公司(GenScript)。

为了诱导免疫应答，向C57Bl6小鼠或Balb/C小鼠施用为疫苗配制的药物组合物，包括10μg冠状病毒刺突蛋白肽(SEQ ID NO:3)和8μg等量的可溶性CpG或CpG两亲分子。小鼠在第0天施用第一剂，并在第14天施用第二剂。在第21天，使用血清ELISA测定测量血清IgG/IgM抗体的量(图1A至图1C和图6A至图6C)。在第28天施用另一剂量的CpG两亲分子和冠状病毒刺突蛋白肽。35天后使用血清ELISA测定测量施用了可溶性CpG或CpG两亲分子的小鼠的IgG/IgM抗体的量(图2A至图2C和图7A至图7C)，与对照进行比较。此外，在35天和三剂后，进行外周血单核细胞细胞因子测定，以确认存在的中和抗体的量，这些中和抗体阻断了C57Bl6小鼠(图3A和图3B)和Balb/C小鼠(图8A和图8B)的冠状病毒刺突蛋白与ACE2受体之间的相互作用，与来自已患有COVID-19感染的患者的人恢复期血清中的中和抗体浓度进行比较(图3C和图3D以及图8C和图8D)。另外，在第35天，测量了C57Bl6小鼠(图4A至图4C)和Balb/C小鼠(图9A至图9C)的IFNγ、TNFa和IL6的多功能细胞因子分泌T细胞应答。此外，在第35天，评估了C57Bl6小鼠和Balb/C小鼠在接受三剂冠状病毒刺突蛋白和CpG后存在的IFNg量(图5A和图5B)。21天后和接受两剂后存在的TNFa、IFNg、IL-6、IL-2和IL-4的浓度总结在图10中。在施用四剂后，对C57Bl6小鼠和Balb/C小鼠进行ELISpot测定，以评定脾细胞IFNγ的量，其中最高量在那些给药CpG两亲分子的小鼠中，如图11所示。分析施用三剂的C57Bl6小鼠的IgG1(图12A)、IgG2bc(图12B)、IgG3(图12C)的量和IgG2bc:IgG1比率(图12D)，以了解Th1和Th2应答的量。图12D中IgG2bc:IgG1的比率显示，对于施用CpG两亲分子的小鼠，免疫应答强烈偏向Th1而不是Th2。这是有利的，因为Th2应答可能对SARS-CoV-2有害。

为了比较CpG两亲分子与其他佐剂相比如何，由施用两剂(图13A至图13D)或三剂(图14A至图14D)的10μg的冠状病毒刺突蛋白和8μg的CpG两亲分子、可溶性CpG、铝水凝胶、IFA或模拟物Tx的小鼠产生的IFNγ、TNFa、IL-2和IL-6的量与阳性或阴性对照进行比较。结果表明，CpG两亲分子产生了相对于其他测试佐剂更好的免疫应答(图15)。

进一步地，对购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(巴尔港，缅因州)的6周龄至8周龄雌性C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠注射1nmol CpG(可溶性CpG)、1nmol脂质缀合的CpG(AMP-CpG)、或100μg仅与磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合的明矾(佐剂对照)、或1-10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)(义翘神州(Sino Biological)，目录号：40592-V08H或金斯瑞公司(GenScript)，目录号:Z03483)。“模拟物”组只接受PBS。在实验的第0天、第14天和第28天，在尾巴根部皮下施用注射液(100μL)(双侧50μL)。在第7天、第21天和第35天采集血液样品。在第35天处死小鼠以获得肺并收集支气管肺泡灌洗(BAL)液。仅一组小鼠(图16A至图16D)在第42天接受第四剂，并在第49天收集样品。

使用ACE2-HEK293重组细胞系(BPS Bioscience公司，目录号：79951)或对照HEK293细胞系(ATCC)和含有荧光素酶报告基因和SARS-CoV2刺突包膜糖蛋白的SARS-CoV2刺突假型慢病毒(BPS Bioscience公司，目录号：79942)进行假病毒中和测定，从而特异性转导表达ACE2的细胞。在96孔白色透明底发光板(康宁公司(Corning)，目录号：3610)中，在解冻培养基1(BPS Bioscience公司，目录号：60187)中进行小鼠或人血清稀释，并且然后与10μL病毒在室温下预温育30分钟。然后将含有10,000个细胞的ACE2-HEK293或对照HEK293细胞(40μL)添加到孔，并在37℃下温育48小时。对照孔包括带有病毒的ACE2-HEK293细胞或对照HEK293细胞，但不含血清，并分别提供最大转导水平和背景。通过添加70μL新鲜制备的ONE-Step荧光素酶试剂(BPS Bioscience公司，目录号：60690)在室温下保持15分钟来检测荧光素酶活性，并使用Synergy H1 Hybrid读数器(美国伯腾仪器有限公司(BioTek))测量发光。实验的假病毒中和数据由金斯瑞公司(GenScript)(南京，中国)按照相同的方案，但使用内部ACE2-HEK293细胞和刺突RBD-HRP重组蛋白进行。半数最大抑制稀释度(pVNT₅₀)下的假病毒中和滴度被计算为血清稀释度，在该血清稀释度下，RLU与C57BI/6J小鼠(图16A)和BALB/c小鼠(图16C)的病毒对照孔中的RLU相比减少了50％，与恢复期血清相比，这些小鼠已经被施用四剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与1nmol可溶性CpG或AMP-CpG的组合。恢复期血清样品(n＝7)和血浆样品(n＝15)获取自已经从SARS-CoV-2感染(COVID-19)中恢复的患者，并分别获取自美国生物实验室(罗克维尔，马里兰州)和ALLCELLS(阿拉米达，加利福尼亚州)。

另外，通过在补充有10％ FBS和青霉素、链霉素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基(完全培养基)中单独收集小鼠脾脏，然后加工成单细胞悬浮液并通过70μm尼龙过滤器来分析由C57BI/6J小鼠(图16C)或BALB/c小鼠(图16D)产生的IFNγ的量。将细胞沉淀重悬于3mL的ACK裂解缓冲液(质量生物有限公司(Quality Biological,Inc.),目录号：118156101)中，在冰上放置5分钟；然后添加PBS以终止反应。样品在4℃下以400×g离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。使用小鼠IFN-γELISpot组(BD，目录号：BD551083)进行ELISpot测定。将在4℃下用捕获抗体预包被过夜的96孔ELISpot板在室温下用完全培养基封闭2小时。将500,000个小鼠脾细胞置于每个孔中，并用每孔1μg/肽的刺突衍生的重叠肽刺激过夜。斑点是基于制造商的说明产生的。PMA(50ng/mL)和离子霉素(1μM)用作阳性对照，并且完全培养基仅用作阴性对照。斑点由ImmunoSpot CTL读数器扫描和量化。在接受含有AMP-CpG的免疫的C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠中进行的的初步评定产生的假病毒中和滴度比人恢复期血清(获取自恢复的COVID-19患者；图16A和图16C)中存在的天然抗体应答高10倍至30倍，表明AMP-CpG有可能产生比天然免疫更有效的中和抗体应答。相比之下，用含有未修饰(可溶性)的CpG的剂量匹配方案免疫的动物产生的中和滴度与在人类康复患者中观察到的滴度相当。脾细胞ELISpot测定的结果表明，与可溶性CpG相比，用混合有AMP-CpG的冠状病毒刺突蛋白免疫的小鼠引起的抗原特异性功能性T细胞的频率高出约4倍，在用冠状病毒刺突蛋白衍生的重叠肽再刺激后产生IFNγ(图16B和图16D)。

以相同的方式，确定了来自C57BL/6J小鼠的脾细胞和外周血中的产生细胞因子的细胞。分析C57BL/6J小鼠(每组n＝10)中用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的每1x10⁶个脾细胞中IFNγ斑点形成细胞的数量，这些小鼠接受了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ IDNO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG或1nmol AMP-CpG的组合(图17A)。与给药冠状病毒刺突蛋白与可溶性CpG、明矾或模拟物(PBS)的组合的小鼠相比，用冠状病毒刺突蛋白与AMP-CpG的组合免疫的小鼠具有明显更高的IFNγ斑点形成细胞。

实例2：在小鼠中诱导体液免疫应答

针对C57B1/6J小鼠测定在小鼠中诱导的体液免疫应答，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG、或1nmol AMP-CpG的组合。使用假病毒中和测定或ELISA测定评估中和滴度与恢复期血清(图20A)、IgM(图20B)、IgG(图20C)、IgG1(图20D)、IgG2bc(图20E)、IgG2bc与IgG19的比率(图20F)和IgG3(图20G)相比的体液应答。

在基于ELISA的替代测定中，通过抑制冠状病毒刺突蛋白-ACE2相互作用来测量对冠状病毒刺突蛋白的中和抗体应答。在第35天为免疫的C57BL/6J小鼠队列收集的血清的结果显示在图20A中。在用AMP-CpG、可溶性CpG和明矾免疫的动物中诱导了相当水平的中和活性。与获取自康复期人类队列的样品的对比表明，疫苗诱导的应答显著高于通过对自然感染的应答产生的应答。

初次免疫7天后，除了接受模拟物免疫的对照外，所有队列均表现出强烈的冠状病毒刺突蛋白特异性IgM应答(图20B)；在后续的加强免疫后，其经历了同种型转换以产生具有相似滴度的IgG应答(图20C)。

为了评定通过免疫引起的冠状病毒刺突蛋白特异性IgG应答中的Th1/Th2偏倚，对存在的IgG亚类进行了评估，结果表明用AMP-CpG或可溶性CpG免疫的小鼠具有比用明矾免疫的小鼠(图20D)显著更低的Th2相关IgG1滴度(大约10倍)。Th1相关的IgG2bc则相反：对于用AMP-CpG或可溶性CpG免疫的小鼠，滴度显著更高(大约50倍)(图20E)。IgG2bc:IgG1滴度比率表明，AMP-CpG免疫动物强烈向Th1偏倚，而可溶性CpG和明矾分别产生平衡的Th1/Th2谱或Th2主导的应答(图20F)。另外的分析表明，AMP-CpG免疫动物产生的IgG3滴度显著高于可溶性CpG(大约3倍)或明矾(>800倍)治疗组，这与观察到的由AMP-CpG免疫引起的Th1偏倚一致(图20G)。

另外，使用假病毒中和测定或ELISA测定评定C57B1/6J小鼠血清中的中和滴度与恢复期血清(图22A)、IgM(图22B)、IgG(图22C)、IgG1(图22D)、IgG2bc(图22E)、IgG2bc与IgG19的比率(图22F)和IgG3(图22G)相比的体液应答，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmolAMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)的组合。在重复剂量免疫后的第35天，评定了在每个指定的冠状病毒刺突蛋白剂量水平下AMP-CpG免疫动物中冠状病毒特异性抗体应答的诱导，并与用10μg剂量的可溶性CpG或明矾免疫产生的应答进行比较。如实例1中所述，通过测量在半数最大抑制稀释度(pVNT₅₀)下的假病毒中和滴度来评定中和活性。对于所有治疗组，观察到类似水平的假病毒中和滴度，其水平分别比AMP-CpG、可溶性CpG和明矾免疫小鼠的恢复期人类样品中观察到的水平高265倍、230倍或94倍(图22A)。这些水平在用AMP-CpG免疫的动物中维持持在较低的冠状病毒刺突蛋白剂量水平，其中平均pVNT₅₀比在恢复的COVID-19患者中测量的水平高至少115倍(图22B)。

总IgG滴度在施用AMP-CpG的组中相似，并且与给药可溶性CpG或明矾佐剂疫苗的组中测得的滴度相比，这些总IgG滴度减少了大约2倍(图22C)。同种型分析表明，与最初在10μg剂量水平下比较观察到的趋势相似(图22C)。与所有与AMP-CpG混合的冠状病毒刺突蛋白剂量水平相比，明矾和可溶性CpG免疫产生显著更高的Th2相关IgG1滴度(大约100倍)(图22D)。与可溶性CpG和明矾免疫组相比，所有AMP-CpG免疫动物的Th1相关IgG2bc水平升高大约20倍，但冠状病毒刺突蛋白剂量水平降低时未观察到显著差异。这些趋势在IgG2bc:IgG1滴度比率的比较中进一步明显(图22F)，其中与分别接种可溶性CpG(IgG2bc:IgG1为大约2)和明矾(IgG2bc:IgG1<1)的动物中更加平衡和Th2偏向的应答相比，含有AMP-CpG的方案诱导高度Th1主导的同种型谱(IgG2bc:IgG1>10)。最后，仅用AMP-CpG免疫的动物显示出冠状病毒刺突蛋白特异性IgG3滴度的迹象，其中在所有的冠状病毒刺突蛋白剂量水平中检测到的水平相当(大约为背景的500倍)。另外的分析表明，AMP-CpG免疫动物产生的IgG3滴度显著高于可溶性CpG(大约40倍)或明矾(>20倍)治疗组，这与观察到的由AMP-CpG免疫引起的Th1偏倚一致(图22G)。这些数据共同支持AMP-CpG能够至少节省10倍剂量的冠状病毒刺突蛋白抗原，以诱导针对冠状病毒刺突蛋白的中和、高滴度和最佳Th1谱抗体应答。虽然可溶性CpG和明矾诱导略微更高的总IgG应答，但与AMP-CpG免疫相比，这些并没有导致中和活性的显著差异。明矾和在较小程度上，可溶性CpG应答由Th2相关IgG1同种型主导，根据SARS和MERS疫苗开发的先前结果，提高了人类翻译中毒性风险的可能性。

实例3：在小鼠中诱导细胞免疫应答

进行了细胞内细胞因子染色实验，以评定小鼠的细胞免疫应答，该小鼠施用了冠状病毒刺突蛋白与佐剂(包括明矾、可溶性CpG和AMP-CpG)的组合。如实例1中所述，在布雷菲德菌素A(英杰公司(Invitrogen)，目录号：00-4506-15)和莫能菌素(BioLegend，目录号：420701)的存在下，在37℃、5％ CO₂下，用每孔1μg的重叠冠状病毒刺突肽过夜刺激每次加强剂量后7天收集的外周血细胞和最终加强剂量后收集的肺驻留白细胞。用以下抗体来对细胞染色：PE抗小鼠IFNγ(BD，目录号：554412)、FITC抗小鼠TNFα(BD，目录号：554418)、APC-Cy^TM7抗小鼠CD3(BD，目录号：560590)、PE-Cy7抗小鼠CD4⁺(英杰公司(Invitrogen)，目录号：25-0041-82)和APC抗小鼠CD8a(eBioscience，目录号：17-0081-83)。PMA(50ng/mL)和离子霉素(1μM)用作阳性对照，并且完全培养基仅用作阴性对照。细胞被透化和固定(英杰公司(Invitrogen)，目录号：00-5523-00)。LIVE/DEAD可固定(aqua)死细胞染色试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，目录号：L34966)用于评估流式细胞术期间细胞的活力。在FACSCanto II(BD)上进行样品采集，并使用FlowJo V10软件(TreeStar)分析数据。

分析来自C57BL/6J小鼠的外周血细胞中的CD8⁺T细胞(图17B)或CD4⁺T细胞(图17C)中的IFNγ和TNFα(双阳性T细胞)、仅TNFα和仅IFNγ的频率，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾，1nmol可溶性CpG、或1nmol AMP-CpG的组合。在AMP-CpG免疫小鼠中，大约43％的来源于外周血的CD8⁺T细胞产生细胞因子(IFNγ、TNFα或双阳性T细胞)；相比之下，对于可溶性CpG免疫小鼠和明矾免疫小鼠，分别大约13％和<2％的CD8⁺T细胞产生细胞因子(图17B)。对于CD4⁺T细胞观察到类似的趋势，尽管百分比相对较小：与CpG免疫小鼠中<1％，并且明矾免疫小鼠和模拟物免疫小鼠中<0.5％相比，来自AMP-CpG免疫小鼠的外周血中大约1.5％的T细胞产生细胞因子(图17C)。

同样，为了确定免疫是否可以在可能SARS-CoV-2暴露的部位诱导组织驻留T细胞应答，在C57BL/6J小鼠中分析在在CD8⁺T细胞(图18A)或CD4⁺T细胞(图18B)灌注肺组织中发现的IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ的频率，该组织用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG、或1nmol AMP-CpG的组合。肺组织中的T细胞产生细胞因子的细胞比例高于在外周血中观察到的细胞。对AMP-CpG免疫小鼠的观察表明，大约73％的来自灌注的肺组织的CD8⁺T细胞产生细胞因子，其中大约40％表现出Th1细胞因子IFNγ和TNFα两者的多功能分泌。相比之下，用可溶性CpG或明矾的免疫分别诱导了>5倍和>25倍的较低应答。CD4⁺T细胞的类似评定表明，仅AMP-CpG免疫动物产生高于背景的应答，其中大约6％的CD4⁺T细胞产生IFNγ和/或TNFα，再次表现出强大的多功能效应物功能，其中这些细胞中的大多数能够在抗原再刺激后产生IFNγ和TNFα。这些结果支持AMP-CpG更有效的淋巴结作用诱导具有潜在有益组织归巢特性的抗原特异性T细胞的增强扩增，在初始病毒暴露的主要部位建立保护性组织驻留细胞。

为了更全面地了解引发的T细胞应答的Th1/Th2/Th17谱，使用了多重细胞因子测定来评定在用冠状病毒刺突重叠肽再刺激后从灌注的肺收集的细胞上清液中的各种细胞因子浓度。具体而言，进行细胞计数珠阵列流式细胞术以确定C57BL/6J小鼠的细胞因子的产生，该细胞因子包括IFNγ(图18C)、TFNα、IL-6、IL-4、IL-10和IL17(图18D)，这些小鼠被施用三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG、或1nmolAMP-CpG的组合。肺驻留白细胞(在最后一次加强剂量后收集)用每孔1μg/肽的重叠冠状病毒刺突肽(由315种肽组成，来自肽扫描，产生具有11个氨基酸重叠的15聚体)(JPT，目录号：PM-WCPV-5或金斯瑞公司(GenScript)，目录号：RP30020)活化过夜。佛波肉豆蔻醋酸(Phorbol Myristate Acetate，PMA，50ng/mL)和离子霉素(1μM)用作阳性对照，并且完全培养基仅用作阴性对照。获得培养物上清液并测量Th1/Th2细胞因子的产生(CBA小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒：BD，目录号：BDB560485)。简而言之，将具有不同荧光强度的珠群与培养物上清液一起温育，这些珠群包被有对各种细胞因子(包括IFNγ、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10和IL-17)具有特异性的捕获抗体。样品中的不同细胞因子被它们对应的珠捕获。然后将细胞因子捕获的珠与藻红蛋白(PE)缀合的检测抗体混合。温育后，洗涤样品，并通过流式细胞术(BD FACSCanto II)测量和分析珠上的PE的荧光强度。使用FACSDiva软件(BD)计算平均荧光强度(MFI)，并使用Microsoft Excel推断蛋白质浓度。AMP-CpG免疫小鼠表现出与之前通过流式细胞术的评定一致的Th1效应物谱，IFNγ和TNFα浓度显著高于用其他佐剂(比如可溶性CpG和明矾)或模拟物免疫的队列。IFNγ浓度比用其他佐剂或模拟物观察到的浓度高至少200倍，并且TNFα浓度比其他佐剂或模拟物高至少7倍(图18C)。所有队列均检测不到常见的Th2或Th17相关细胞因子IL-4、IL-6、IL-10和IL-17的浓度(图18D)。这些结果进一步证明，与可溶性CpG或明矾相比，通过使用AMP-CpG免疫引起的T细胞的效力和Th1偏倚大大增强。

为了进一步评估免疫诱导的肺驻留T细胞应答是否可以定位到肺分泌物中，从C57BL/6J小鼠中收集支气管肺泡灌洗(BAL)液，这些小鼠被施用了三剂10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)与100μg明矾、1nmol可溶性CpG、或1nmol AMP-CpG的组合。确定了CD8⁺(图19A)和CD4⁺(图19D)T细胞计数，以及幼稚CD8⁺(图19B)和幼稚CD4⁺(图19E)T细胞的百分比，以及效应记忆CD8⁺(图19C)和CD4⁺(图19F)T细胞的百分比。在AMP-CpG免疫小鼠的BAL液中发现比其他治疗组显著更多的CD8⁺T细胞(图19A)。另外，从AMP-CpG免疫动物收集的BAL中检测到的细胞比例显著较低，表现出幼稚表型(CD44^-，CD62L⁺；图19B)效应记忆表型(T_EM；CD44⁺，CD62L-；图19C)的频率对应增加。CD4⁺T细胞计数相对于模拟物治疗有所增强，并且在所有治疗组中大体相似(图19D)，但是AMP-CpG队列显示以下迹象：BAL驻留CD4⁺T细胞已从幼稚分化为T_EM表型的比例显著高于其他治疗组(图19F)。AMP-CpG免疫动物中存在的BAL驻留T细胞的数量和表型的改善证明在病毒暴露点进行早期免疫检测和控制的较大可能性。

评估第35天脾脏、外周血和肺组织中的T细胞应答。结果表明，从AMP-CpG免疫的C57BL/6J小鼠中收集的脾细胞中产生IFNγ的细胞的数量往往随着抗原浓度的增加而增加，但是，即使在与AMP-CpG混合的最低抗原剂量下，产生IFNγ的细胞的数量显著高于接受最高抗原剂量(10μg)和可溶性CpG(大约4倍)或明矾(>30倍)的队列中观察到的数量(图21A)。另外，测定从C57BL/6J小鼠收集的外周血细胞中发现的CD8⁺T细胞(图21B)和CD4⁺T细胞(图21C)的细胞因子(包括IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ)的频率，这些小鼠被施用了三剂(从左至右)仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmolAMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。同样，测定从C57BL/6J小鼠收集的用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激的灌注的肺组织细胞中发现的CD8⁺T细胞(图21D)和CD4⁺T细胞(图21E)的IFNγ和TNFα、仅TNFα和仅IFNγ的频率，这些小鼠被施用了三剂(从左至右)仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、以及1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。在外周血(图21B和图21C)和肺组织(图21D和图21E)两者中，与测试的其他佐剂相比，在任何抗原浓度下，AMP-CpG治疗的小鼠产生细胞因子的CD8⁺和CD4⁺T细胞的百分比显著更高。值得注意的是，在用10μg、5μg或1μg剂量水平的与抗原混合的AMP-CpG免疫动物的外周血中，没有观察到产生细胞因子的CD8⁺或CD4⁺T细胞的频率显著降低，因为这频率保持在大约40-50％的CD8⁺T细胞和2-4％的CD4⁺T细胞。虽然在AMP-CpG免疫动物中观察到肺驻留产生细胞因子的CD8⁺T细胞的频率呈下降趋势，但即使是1μg剂量水平也会产生比用可溶性CpG或明矾免疫的动物分别高>3倍或>18倍的频率。这支持AMP-CpG能够节省至少10倍的冠状病毒刺突蛋白剂量。

用AMP-CpG-7909进行两剂免疫接种会在血液和肺中引发有效的刺突RBD特异性细胞免疫，并在血液中引发体液免疫。C57Bl/6小鼠(每组n＝5)在第0天和第14天用混合有1.0nmol、2.5nmol或5.0nmol AMP-CpG的0.5ug、1.0ug或5.0ug刺突RBD蛋白免疫，并在第21天分析T细胞和IgG应答。用重叠的刺突RBD肽再刺激外周血细胞(图26A和图26B)或从灌注的肺收集的细胞(图26C和图26D)，并通过流式细胞术测定细胞内细胞因子的产生，以检测抗原特异性T细胞应答。显示的是CD8⁺(图26A和图26C)和CD4⁺(图26B和图26D)T细胞中的IFNγ、TNFα和双阳性T细胞的频率。通过ELISA评定免疫动物血清中对刺突RBD具有特异性的体液应答。显示的是在第35天IgG的终点滴度(图26E；每组n＝5只小鼠)。描述的值是平均值±标准差。

这些结果表明，用AMP-CpG的两剂方案会在血液和肺中诱导有效的多功能CD8和CD4 T细胞应答。

实例4：在老年小鼠中诱导免疫应答

在第21天和第35天评估37周龄C57BL/6J老年小鼠中的T细胞应答，这些小鼠被施用了三剂仅100μg明矾、仅1nmol可溶性CpG、仅1nmol AMP-CpG、100μg明矾和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol可溶性CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和10μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、1nmol AMP-CpG和5μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)、或1nmol AMP-CpG和1μg的冠状病毒刺突蛋白(SEQ ID NO:3)。在刺突衍生的重叠肽再刺激后，在第21天对外周血中产生细胞因子的CD8⁺T细胞进行的评定表明，AMP-CpG会诱导有效应答(大约15％的CD8⁺T细胞)，大大优于可溶性CpG(大约2.5％的CD8⁺T细胞)和明矾(<0.5％的CD8⁺T细胞)(图23A)。尽管与在年轻健康小鼠中观察到的应答相比，这些应答减少了大约2倍，但它们仍然分别超过可溶性CpG和明矾比较物产生的应答7倍和30倍。AMP-CpG免疫进一步实现了在10μg和5μg冠状病毒刺突蛋白剂量下的相当的应答，并且尽管在1μg下的应答有所降低，但这些应答仍然超过针对明矾观察到的应答(20倍)，并且与通过用10μg剂量水平的可溶性CpG免疫产生的应答相似(图23B)。

在第35天对老年小鼠肺组织中CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的分析显示出相似的趋势，其中AMP-CpG免疫动物产生高频率的细胞因子产生CD8⁺T细胞和CD4+T细胞。具体而言，AMP-CpG免疫在大约60％的肺驻留CD8⁺T细胞中引发Th1细胞因子的产生，比可溶性CpG和明矾免疫高大约7倍和>120倍(图23C)。如在之前的研究中观察到的那样，引发的T细胞具有高度多功能性，其中超过一半的诱导细胞表现出同步产生IFNγ和TNFα。与在外周血中的应答不同，在AMP-CpG免疫后，相对于年轻健康动物的应答，在老年小鼠中肺驻留细胞因子产生CD8⁺T细胞的频率没有下降，并且在5μg和1μg冠状病毒刺突蛋白给药组中保持在统计学上相当的水平(图23D)。与可溶性CpG(大约0.6％的CD4⁺T细胞)和明矾(<0.5％的CD4⁺T细胞)相比，肺驻留CD4⁺T细胞应答表现出类似的模式，其中AMP-CpG诱导Th1细胞因子产生细胞的频率更高(大约10％的CD4⁺T细胞)(图23E)。同样，这些应答水平与在年轻健康小鼠中观察到的应答水平相当，表明AMP-CpG免疫可以在年轻和老年小鼠中提高相当的肺驻留T细胞应答。最后，在所有测试的冠状病毒刺突蛋白剂量水平中，肺驻留CD4⁺T细胞应答保持在相当的水平，并且在最低浓度(1μg)的冠状病毒刺突蛋白下的AMP-CpG免疫优于在10倍高的抗原剂量(10μg)下的可溶性CpG和明矾(图23F)。

在用比较物疫苗在老年小鼠中重复剂量免疫后的第35天，评估了冠状病毒刺突蛋白特异性抗体应答。假病毒中和表明，10μg抗原剂量水平的AMP-CpG免疫引起增强的中和滴度，比可溶性CpG和明矾比较物观察到的高至少5倍，并且比在人恢复期血清/血浆中观察到的高>50倍(图24A)。冠状病毒刺突蛋白与AMP-CpG的剂量减少产生了与可溶性CpG和明矾相当的较低中和滴度(图24B)。特别感兴趣的是，相对于接受较低剂量的1μg冠状病毒刺突蛋白和AMP-CpG的动物，用10μg冠状病毒刺突蛋白和可溶性CpG或明矾免疫的动物的滴度相当。总IgG的评定显示AMP-CpG和明矾产生了相当的冠状病毒刺突蛋白特异性IgG滴度，均超过了可溶性CpG免疫动物中产生的滴度(图24C)。尽管在AMP-CpG免疫动物中观察到IgG滴度随着冠状病毒刺突蛋白剂量的降低而显著下降，但在给予10μg冠状病毒刺突蛋白的AMP-CpG与明矾之间没有统计学差异。同种型分析产生了与年轻健康小鼠相似的观察结果，与可溶性CpG或明矾相比，AMP-CpG驱动更多的Th1、IgG2bc主导应答，可溶性CpG或明矾产生更加平衡或Th1、IgG1偏向的谱(图24D至图24G)。在不同剂量水平的冠状病毒刺突蛋白下，在AMP-CpG免疫的动物中没有观察到显著差异(图24F)，尽管相对于年轻的健康小鼠，在老年小鼠中观察到的AMP-CpG免疫小鼠的Th1偏倚强度降低。如之前在年轻健康小鼠中观察到的，与可溶性CpG或明矾相比，IgG3滴度在AMP-CpG免疫动物中得到增强(图24G)。总之，这些结果支持AMP-CpG能够在老年小鼠中引发有效和功能性的冠状病毒刺突蛋白特异性体液免疫，超过可溶性CpG或明矾疫苗比较物所观察到的免疫，同时产生最佳的Th1偏倚同种型谱并能够节省至少10倍剂量的抗原。

在老年小鼠中疫苗接种AMP-CpG能够在血液、脾脏和肺组织中产生持久的刺突RBD特异性T细胞。37周龄的C57Bl/6小鼠(每组n＝5-10)在第0天、第14天和第28天用混合有100ug明矾或1nmol可溶性CpG或AMP-CpG的10ug刺突RBD蛋白进行免疫。佐剂对照动物只给药AMP-CpG佐剂。在第35天、第49天和第70天，通过ELISA评定免疫动物血清中对刺突RBD具有特异性的体液应答。显示的是为IgG确定的终点滴度(图25A)。在第21天、第35天、第49天和第70天分析T细胞应答。在第21天、第35天、第49天和第70天(图25B)从外周血收集细胞，并用重叠的刺突RBD肽再刺激细胞，并测定细胞内细胞因子的产生以检测抗原特异性T细胞应答。显示的是外周血CD8⁺T细胞中IFNγ阳性细胞的频率(图25A)，从脾脏(图25C)和肺(图25D)收集细胞，并用重叠的刺突RBD肽再刺激细胞，并通过ELISPOT测定来测定IFNγ的产生。显示的是每1x 10⁶个细胞(每组n＝5只小鼠)的IFNγ斑点形成细胞(SFC)的频率。描述的值是平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，通过应用于细胞因子+T细胞频率的双侧Mann-Whitney检验。

这些结果表明，在老年小鼠中，AMP-CpG诱导高频率T细胞应答，该应答在给药后持续数月。

实例5：使用全长刺突蛋白抗原和核衣壳蛋白抗原诱导免疫应答

SARS-CoV-2刺突蛋白具有大约138kDa的分子量，并且SARS-CoV-2核衣壳蛋白具有大约50kDa的分子量。基于这些大小，预计刺突蛋白和核衣壳蛋白两者都适用于淋巴结靶向。

以下核衣壳蛋白构建体被用于产生图27至图33中所示的数据：

该蛋白质可从百普赛斯公司(ACROBiosystems)以产品编号NUN-C5227获得。其包括在核衣壳蛋白序列与六组氨酸标签(HHHHHH；SEQ ID NO:65)之间的烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶(ENLYFQG；SEQ ID NO:64)的切割位点。

以下全长刺突蛋白构建体用于生成图27至图33中所示的数据：

VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRAAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGGGSGGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:66)。该蛋白质可从百普赛斯公司(ACROBiosystems)以产品编号SPN-C52H2获得。十组氨酸标签(HHHHHHHHHH；SEQ ID NO:67)通过GGGSGGGS(SEQ ID NO:62)接头与刺突蛋白序列连接。刺突蛋白具有以下突变以稳定三聚体：R683A、R685A。

如图27所示，AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效多功能CD8 T细胞应答。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0％)、明矾(0％)、可溶性CpG(5％)和AMP-CpG(34％)。

如图28所示，AMP-CpG还诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效多功能CD4 T细胞应答。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0.2％)、明矾(0.5％)、可溶性CpG(0.5％)和AMP-CpG(12％)。

用重叠的冠状病毒刺突肽再刺激小鼠(C57BL/6J小鼠；每组n＝10)导致针对SARSCoV-2刺突蛋白的有效T细胞应答(图29)，这些小鼠已接受10μg的全长冠状病毒刺突蛋白构建体(SEQ ID NO:66)与10μg的冠状病毒核衣壳蛋白构建体(SEQ ID NO:63)和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG、或(3)6μg AMP-CpG的组合。

AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效肺驻留多功能CD8⁺T细胞应答(图30)。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0％)、明矾(0％)、可溶性CpG(3％)和AMP-CpG(26％)。

AMP-CpG还诱导靶向SARS CoV-2刺突蛋白的有效肺驻留多功能CD4⁺T细胞应答(图31)。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。观察到的细胞因子阳性细胞百分比为：模拟物(0.2％)、明矾(0.2％)、可溶性CpG(1％)和AMP-CpG(7％)。

AMP-CpG诱导靶向SARS CoV-2核衣壳蛋白的有效外周血多功能CD8⁺和CD4⁺T细胞应答(图32)。施用模拟物疫苗或含有10μg冠状病毒刺突蛋白、10μg冠状病毒核衣壳蛋白和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG或(3)6μg AMP-CpG的疫苗。

用重叠的冠状病毒核衣壳肽再刺激小鼠(C57BL/6J小鼠；每组n＝10)诱导靶向SARS CoV-2核衣壳蛋白的有效T细胞应答(图33)，这些小鼠已接受10μg的全长冠状病毒刺突蛋白构建体(SEQ ID NO:66)与10μg的冠状病毒核衣壳蛋白构建体(SEQ ID NO:63)和(1)100μg明矾、(2)6μg可溶性CpG、或(3)6μg AMP-CpG的组合。

实例6：在非人类灵长类动物中诱导免疫应答

在非人类灵长类动物(NHP)中启动了一项研究，以测试疫苗中的刺突RBD和AMP-CpG。将RBD+明矾与RBD+AMP-CpG在疫苗中的使用进行比较。在皮下免疫的两剂方案(第0周和第4周)中测试了500μg的AMP-CpG的初始剂量。评定包括每次给药后的每周临床检查、CBC(全血细胞计数)组以及用于免疫原性的血液和血清的收集。在这些测试中，AMP-CpG没有诱导抗体或T细胞对BioE刺突RBD的应答。由于在2剂后未观察到对AMP-CpG的应答，因此用新的疫苗配制品对相同的动物进行免疫。这里使用了3,000μg的AMP-CpG和140μg的金斯瑞公司(GenScript)RBD。(不同批次和更高浓度的AMP-CpG以及新来源和更高浓度的RBD。)对照组保持不变(1.5mg明矾+70μg BioE RBD)。

重新配制的AMP-CpG疫苗诱导了对金斯瑞RBD的强烈抗体应答(图34)。重新配制的AMP-CpG疫苗还诱导针对具有N501Y突变(SEQ ID NO:69)的英国SARS-CoV-2变体的IgG抗体(图35)。进一步地，重新配制的AMP-CPG疫苗诱导CD8⁺T细胞对刺突RBD的应答(图36A和图36B)，以及CD4⁺和CD8⁺T细胞对刺突RBD的应答(图37A和图37B)。

对于重新配制的RBD和AMP-CpG疫苗，未观察到不利的安全信号(温度、反应原性、化学和血液学)。

实例7：诱导对B.1.351变体的免疫应答

COVID的B.1.351或南非变体是SARS-CoV2的一种毒株。在小鼠中启动了一项研究，以确定如果将抗原更改为B.1.351RBD变体或与WT RBD抗原联合使用，疫苗中刺突RBD和AMP-CpG的免疫原性。还针对重新配制的AMP-CPG双重RBG和B.1.351疫苗以及重新配制的AMP-CPG B.1.351疫苗确定了针对不同变体的免疫应答的交叉反应性。

制备了对照、WT RBG、B.1.351RGB和双重WT RBG和B.1.351储备溶液。将对照佐剂储备溶液重悬于鲎变形细胞裂解物(LAL)水中。最终注射液用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。将包含WT和B.1.351抗原的SARS-CoV2刺突S1 RBD蛋白储备溶液分别以0.88mg/ml和0.95mg/ml的浓度溶解在PBS中，每100μl注射液具有5μg抗原。最终注射液用1x PBS稀释。还制备了双重WT和B.1.351SARS-CoV2刺突S1 RBD蛋白储备溶液，其中每100μl注射液含5μg的每种抗原。

表5：实验设计

使用每组5只C57BL/6J小鼠的5组。将免疫皮下(SC)施用到雌性B6小鼠的双侧尾巴根部中，其中每侧50μL。每隔大约2周注射加强剂。皮下注射可能有助于经由自然淋巴引流将疫苗递送到淋巴结中。基于之前的小鼠研究，每两周注射可能有助于小鼠产生最佳应答。

表6：疫苗组分

进行了四聚体分析，并且结果如图38所示。在给药后7天对PBMC进行TNFα和IFNγ的细胞内染色(ICS)测定。还在第2剂后7天对肺样品进行ICS。对CD4、CD8和CD3进行细胞表面染色。抗体信息参见表7。ICS样品用每孔1mg的SARS-CoV-2刺突糖蛋白肽池混合液(315种肽，每孔1mg)活化过夜(在布雷菲德菌素A和莫能菌素的存在下)。第2剂后，CD8⁺肺细胞、CD4⁺肺细胞和CD8⁺肺细胞的结果分别显示在图39A、图39B和图39C中。肽信息参见表8。

表7：用于ICS的抗体

表8：再刺激肽

在第3剂施用后对脾细胞进行IFNγ的ELISpot分析。用每孔1μg PepMix活化脾细胞(0.2x 106个细胞/孔)。肽信息参见表8。过夜刺激IFNγ板。结果示于图40中。

每次给药7天后，对小鼠血清进行SARS-CoV2特异性血清ELISA(酶联免疫吸附测定)，以检测任何RBD特异性抗体应答。使用Ser-gel管(NC9436363，赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific))将全血离心。血清或新鲜使用，或储存在-80℃下直至使用。96孔板在4℃下用200ng/100μl(2μg/ml)的CoV2 RBD蛋白(WT，B.1.351和B.1.1.7)包被过夜。然后在室温下用2％ BSA预封闭板2小时。小鼠血清以1:20稀释，并且在虚拟板中连续稀释(以1:5稀释至8个浓度)。用ELISA洗涤缓冲液(BioLegend 4211601)洗涤ELISA板1次。将样品转移到ELISA板并在室温下温育2小时。用洗涤缓冲液洗涤板4次。对于血清抗体检测，表9中的HRP缀合二抗以1:2000在PBS+中使用，并在室温下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤板4次。通过在室温下添加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)10分钟使反应可视化并通过H2SO4(1N)终止所述反应。通过ELISA酶标仪测量450nm处的吸光度。结果显示图41中。

表9：HRP缀合二抗

重新配制的AMP-CPG双重WT RBD和B.1.351RBD疫苗以及重新配制的AMP-CPGB.1.351RBD疫苗引起与先前实验中看到的仅使用WT RBD抗原的疫苗相似的免疫应答。T细胞以及抗体应答针对所有测试的SARS-CoV2 RBD变体同样具有交叉反应。

实例8：在人类对象中诱导免疫应答

根据本文披露的方法，可以向对象(比如人类对象)施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)以在对象中诱导免疫应答。为此，向患者施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。CpG两亲分子或其药物组合物以疫苗的形式向对象皮下施用。也可以鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用CpG两亲分子或其药物组合物。对象还被皮下施用以疫苗形式的冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)或其药物组合物。还可以鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用冠状病毒抗原或其药物组合物。可以向双侧大腿内侧施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)两者。可以单独或同时向对象施用CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。对象可以在第0周、第4周和第10周或第0周和第4周接受一定剂量的CpG两亲分子和冠状病毒抗原(例如，冠状病毒刺突蛋白或其肽(例如，RBD肽)、和/或冠状病毒核衣壳蛋白或其肽、或编码它们的核酸序列)。对象可以接受约0.1mg至20.0mg的剂量。具体而言，施用的剂量可以在约0.1mg至1.0mg、约0.5mg至3.0mg、约1.0mg至5.0mg、约2.0mg至5.0mg、约3.0mg至5.0mg、约3.0mg至10.0mg、约4.0mg至12.0mg、约5.0mg至15.0mg或约5.0mg至20.0mg范围内。向对象施用的具体剂量可以是约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10.0mg、11.0mg、12.0mg、13.0mg、14.0mg、15.0mg、16.0mg、17.0mg、18.0mg、19.0mg或20.0mg的CpG两亲分子。对象也可以接受在CpG两亲分子的这些具体剂量中的任何两个之间的范围内的剂量。对象可以接受约10μg至约1.0mg的剂量的冠状病毒抗原。具体而言，对象可以接受约40μg至60μg、约50μg至70μg、约50μg至150μg、约70μg至150μg、约100μg至150μg、约100μg至200μg、约140μg至250μg、约200μg至300μg、约250μg至500μg、约300μg至600μg、或约500μg至1.0mg的剂量的冠状病毒抗原。具体而言，向对象施用的剂量可以是约10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1.0mg的冠状病毒抗原(例如，刺突蛋白或刺突蛋白RBD)。对象还可以接受在冠状病毒抗原的这些具体剂量中的任何两个之间的范围内的剂量。

其他实施例

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定实施例描述了本发明，但是应当理解所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类特定实施例。实际上，对本领域技术人员显而易见的用于实施本发明所述的模式的各种修改旨在落入本发明的范围内。

所有出版物、专利和专利申请都通过援引以其全文并入本文，其程度如同每一项独立的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过援引以其全文并入一样。

序列表

<110> 伊莱西奥治疗有限公司（Elicio Therapeutics, Inc.）

<120> 用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的组合物和方法

<130> 51026-039WO5

<140> PCT/US2021/039134

<141> 2021-06-25

<150> US 63/145,200

<151> 2021-02-03

<150> US 63/124,200

<151> 2020-12-11

<150> US 63/064,836

<151> 2020-08-12

<150> US 63/044,773

<151> 2020-06-26

<160> 71

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 3

<211> 273

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser

<210> 4

<400> 4

000

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

gggggacgat cgtcgggggg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 41

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 42

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 43

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 44

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

1 5

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 45

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu

1 5 10

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 46

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

1 5 10

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 47

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 48

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 49

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu

1 5

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 50

Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

1 5 10

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 51

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 52

Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 53

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

1 5

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 54

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

1 5 10

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 55

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 56

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 57

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 58

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 59

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 60

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 61

Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 62

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 63

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 63

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His

420 425 430

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 64

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 65

His His His His His His

1 5

<210> 66

<211> 1216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 66

Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val

20 25 30

Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr

35 40 45

Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe

50 55 60

Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr

65 70 75 80

Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp

85 90 95

Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val

100 105 110

Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val

115 120 125

Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe

145 150 155 160

Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu

195 200 205

Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln

210 215 220

Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser

225 230 235 240

Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln

245 250 255

Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp

260 265 270

Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu

275 280 285

Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg

290 295 300

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

325 330 335

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

370 375 380

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

385 390 395 400

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

405 410 415

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

420 425 430

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

435 440 445

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

450 455 460

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

465 470 475 480

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

485 490 495

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

500 505 510

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

515 520 525

Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe

530 535 540

Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala

545 550 555 560

Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

565 570 575

Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln

580 585 590

Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala

595 600 605

Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly

610 615 620

Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His

625 630 635 640

Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys

645 650 655

Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Ala Ala Ala Ser Val

660 665 670

Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn

675 680 685

Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr

690 695 700

Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser

705 710 715 720

Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn

725 730 735

Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu

740 745 750

Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala

755 760 765

Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly

770 775 780

Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg

785 790 795 800

Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala

805 810 815

Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg

820 825 830

Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro

835 840 845

Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala

850 855 860

Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln

865 870 875 880

Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val

885 890 895

Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe

900 905 910

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

915 920 925

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

930 935 940

Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

945 950 955 960

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val

965 970 975

Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr

980 985 990

Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

995 1000 1005

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1010 1015 1020

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1025 1030 1035

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1040 1045 1050

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1055 1060 1065

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1070 1075 1080

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1085 1090 1095

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1100 1105 1110

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1115 1120 1125

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1130 1135 1140

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1145 1150 1155

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1160 1165 1170

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1175 1180 1185

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Gly Gly Gly Ser Gly

1190 1195 1200

Gly Gly Ser His His His His His His His His His His

1205 1210 1215

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 67

His His His His His His His His His His

1 5 10

<210> 68

<211> 419

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2

<400> 68

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 69

<211> 223

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2

<400> 69

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 70

Ala His His His His His His His His His His

1 5 10

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 71

tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims

1.一种在对象中诱导针对冠状病毒抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用(1)CpG两亲分子和(2)冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽或者编码所述冠状病毒刺突蛋白或肽的核酸序列。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述CpG两亲分子包含与脂质键合的CpG序列。

4.如权利要求1或2所述的方法，所述CpG两亲分子包含通过接头与脂质连接的CpG序列。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述接头包括聚合物、氨基酸串、核酸串、多糖或它们的组合。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述接头包括核酸串。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸串包含在1个与50个之间的核酸残基。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸串包含在5个与30个之间的核酸残基。

9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述核酸串包含“N”个鸟嘌呤，其中N为1-10。

10.如权利要求5所述的方法，其中所述接头包含连续的聚乙二醇单元。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在20与80之间。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在30与70之间。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在40与60之间。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述接头包含“N”个连续的聚乙二醇单元，其中N在45与55之间。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述接头包含48个连续的聚乙二醇单元。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述脂质是二酰基脂质。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述二酰基脂质具有以下结构：

或其盐，

其中X是O或S。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述CpG序列包含核苷酸序列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'(SEQ ID NO:1)。

19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述CpG序列包含5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列。

20.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其中连接所述CpG序列中的核苷的所有核苷间基团均为硫代磷酸酯。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白或其肽是SARS-CoV-2刺突蛋白或其肽。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白的肽是特异性结合血管紧张素转化酶2ACE2的受体结合结构域。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白的肽包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ IDNO:3)。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白的肽包含以下的多肽序列：

25.如权利要求1和3-21中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含与以下具有至少90％序列同一性的多肽序列：

27.如权利要求25所述的方法，其中所述冠状病毒核衣壳蛋白抗原包含以下的多肽序列：

28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒抗原包含一个或多个标签。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述标签是Avi标签。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述标签是组氨酸标签。

31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒抗原包含Avi标签和组氨酸标签。

32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒抗原包含在所述多肽序列与所述一个或多个标签之间的接头。

33.如权利要求1-24和28-31中任一项所述的方法，其中施用所述冠状病毒刺突蛋白。

34.如权利要求33所述的方法，其中施用所述冠状病毒刺突蛋白的三聚体。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述三聚体是包含以下序列的蛋白质构建体的三聚体：

36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中施用冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

37.如权利要求36所述的方法，其中施用包含以下序列的冠状病毒刺突蛋白构建体的三聚体：

38.如权利要求1-25、28-31和36中任一项所述的方法，其中施用编码所述冠状病毒抗原的mRNA。

39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中同时施用所述CpG两亲分子以及所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

40.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中依次施用所述CpG两亲分子以及所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

41.如权利要求40所述的方法，其中首先施用所述CpG两亲分子，随后施用所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列。

42.如权利要求40所述的方法，其中首先施用所述冠状病毒抗原或编码其的核酸序列，随后施用CpG两亲分子。

43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用第二佐剂。

44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用冠状病毒疫苗作为初免或加强。

45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用所述CpG两亲分子。

46.如权利要求45所述的方法，其中皮下施用所述CpG两亲分子。

47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中皮下地、鼻内地、气管内地或通过在机械通气期间吸入来施用所述冠状病毒抗原。

48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述对象是人。

50.一种药物组合物，其包含CpG两亲分子和冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列，以及药学上可接受的载剂。

51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。

52.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

53.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述冠状病毒抗原包括冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

54.一种试剂盒，其包含CpG两亲分子以及冠状病毒抗原或编码所述冠状病毒抗原的核酸序列。

55.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒刺突蛋白或其肽。

56.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述冠状病毒抗原是冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。

57.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述冠状病毒抗原包括冠状病毒刺突蛋白或其肽以及冠状病毒核衣壳蛋白或其肽。