JP2023171398A - エプスタイン－バーウイルスワクチン - Google Patents

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Ciaramella Giuseppe
シヌ・ジョン
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エリザベス・ナラヤナン
Narayanan Elisabeth
ブルック・ボルマン
Bollman Brooke
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Abstract

【課題】本開示は、ＥＢＶリボ核酸ワクチンに加えて、ワクチンを使用する方法及びワクチンを含む組成物に関する。【解決手段】強力な中和抗体及び着実なＴ細胞応答を惹起する、ウイルス性免疫調節因子の産生を阻害する、及び／またはウイルス潜伏を予防する、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）（例えばｍＲＮＡ）ワクチン（例えば組み合わせワクチン）が、本明細書のいくつかの実施形態において提供される。【選択図】なし

Description

エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）（ヒトヘルペスウイルス４とも称される）は、世界中で最も一般的なヒトウイルスのうちの１つである。成人の９５パーセントはこのウイルスに感染する。ＥＢＶは、体液（主として唾液）を介して最も一般的には広がり、伝染性単核症（「モノ」）及び他の病気の主要な原因である。ＥＢＶの一次感染の有る大学生（１８～２２歳）のうちの７５パーセントは、モノを発症するだろう。ＥＢＶの症状としては、疲労、発熱、喉の炎症、首のリンパ節の腫れ、脾腫、肝臓の腫れ、及び発疹が挙げられ得る。多くの人々が小児期においてＥＢＶに感染するが、小児期の症状は他の軽症の短時間の小児期の病気とは区別されない。典型的には、ティーンエイジャー及び成人のみがＥＢＶ感染の特徴的な症状を提示し、回復は約２～４週間であるが、何人かの人々は数週間または数か月の間疲労を感じ得る。ＥＢＶ感染に続いて、ウイルスは潜伏するようになり、いくつかの事例において、再活性化され得る。免疫系が弱った人々は、ＥＢＶが再活性化されると症状を発症しやすい。現在のところ、一次感染または疾患を予防するワクチンはない。
強力な中和抗体及び着実なＴ細胞応答を惹起する、ウイルス性免疫調節因子の産生を阻害する、及び／またはウイルス潜伏を予防する、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）（例えばｍＲＮＡ）ワクチン（例えば組み合わせワクチン）が、本明細書のいくつかの実施形態において提供される。いくつかの態様において、ＥＢＶワクチンは、ＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するＲＮＡを含み、ワクチンの対象への治療的に有効な量の筋肉内（ＩＭ）投与は、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答）を対象において誘導する。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、例えばＥＢＶ ＲＮＡワクチンの単回用量（例えば１０μｇ～２００μｇの単回用量）の後に、少なくとも１００（例えば少なくとも５００または少なくとも１０００）ＮＴ５０である。いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンのブースター（第２の）用量の後に、少なくとも１００（例えば少なくとも５００または少なくとも１０００）ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、ワクチン接種をしていない対照対象の中和抗体力価に比べて、または生弱毒化ＥＢＶワクチン、不活性化ＥＢＶワクチンもしくはタンパク質サブユニットＥＢＶワクチンをワクチン接種した対象の中和抗体力価に比べて、Ｂ細胞のＥＢＶ感染を少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％）低減させるのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、ワクチンの３未満（１または２）の用量の後に対象において誘導される。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの単回用量は１０μｇ～１００μｇである。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答は、ワクチン接種をしていない対照対象の中和抗体力価に比べて、症候性の伝染性単核症の率を低減させるのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答は、ワクチン接種をしていない対照対象の中和抗体力価に比べて、無症候性のＥＢＶ感染の率を低減させるのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答は、対象においてＥＢＶ潜伏を予防するのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答は、対象において慢性疲労を低減させるのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、対象の上皮細胞及び／またはＢ細胞とＥＢＶの融合をブロックするのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、ワクチンの単回の１０～１００μｇの後に、２０日以内に誘導される。いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、ワクチンの第２の１０～１００μｇの用量の後に、４０日以内に誘導される。
いくつかの実施形態において、中和抗体応答を誘導する本開示のワクチンの能力は、ワクチンを動物（例えばマウスまたは非ヒト霊長動物）に注射すること、及び動物からの血清について、ウイルスがヒトＢ細胞に感染する能力を中和する能力を試験することによって、実証され得る。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の両方を含む。
いくつかの実施形態において、ワクチン接種後に、ＥＢＶ抗原は対象の細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態において、ワクチンが発現される能力は、モデル系（例えばマウスまたは非ヒト霊長類のモデル）において試験され得る。いくつかの実施形態において、ワクチンが発現される能力は、例えばヒト細胞を使用してインビトロで試験され得る。
いくつかの実施形態において、ワクチンの２μｇの単回用量は、約１００のＮＴ５０中和抗体力価をマウスにおいて誘導する。いくつかの実施形態において、ワクチンの２μｇのブースター用量は、約１０００のＮＴ５０中和抗体力価をマウスにおいて誘導する。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、２つのＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する１つのＲＮＡ、または各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、脂質ナノ粒子中に製剤化された、２つの（少なくとも２つの）ＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つの（少なくとも２つの）ＲＮＡを含み、２つのＲＮＡは単一の脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つのＲＮＡを含み、各々のＲＮＡは分離した脂質ナノ粒子中に製剤化される。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、少なくとも１つの（例えば２、３、４、５またはそれ以上の）追加のＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する、少なくとも１つの（例えば２、３、４、５またはそれ以上の）追加のＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原は、ｇｐ３５０、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇｐ４２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１及びＥＢＮＡ３からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原はｇＨ－ｇＬ融合物であり、ｇＨはリンカー（ＧＧＧＧＳリンカー等）を介してｇＬへ連結される。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＳリンカーは３つのＧＧＧＧＳモチーフ（配列番号：２２４）を含む。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＳリンカーは４つのＧＧＧＧＳモチーフ（配列番号：２２５）を含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡは、配列番号：２１８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡは、配列番号：２２１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原としては、ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原、ＥＢＶ ｇＨ抗原及びＥＢＶ ｇＬ抗原が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原としては、ＥＢＶ ｇｐ４２抗原及び／またはｇＢ抗原がさらに挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原は、野生型ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原、変異ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原、または短縮ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原は配列リスト中でリストされたＥＢＶ抗原から選択される。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数のＥＢＶ抗原）はスキャフォールド部分へ融合される。いくつかの実施形態において、スキャフォールド部分は、フェリチン、エンカプスリン、ルマジン合成酵素、Ｂ型肝炎表面抗原及びＢ型肝炎コア抗原からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは５’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号：１または配列番号：１０４によって同定される配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号：３または配列番号：１０６によって同定される配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原はシグナルペプチドへ融合される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、随意に配列番号：１１５を含む、ウシプロラクチンシグナルペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは非修飾である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のウラシルのうちの少なくとも８０％（例えば９０％または１００％）は、１－メチル－シュードウリジン修飾を含む。
治療的に有効な量で本開示のＥＢＶワクチンを対象へ投与して、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答を対象において誘導することを包含する方法も、本明細書のいくつかの態様において提供される。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンの有効性は、ワクチン接種をしていない対照対象に比べて少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）である。
いくつかの実施形態において、検出可能レベルのＥＢＶ抗原は、ワクチンの投与後１～７２時間で対象の血清中で産生される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１００（例えば少なくとも５００または少なくとも１０００）ＮＵ／ｍｌの中和抗体力価は、ワクチンの投与後１～７２時間で対象の血清中で産生される。
いくつかの実施形態において、治療的に有効な量は、２０μｇ～２００μｇ（例えば５０μｇ～１００μｇ）の全用量である。
Ａは、７２Ａ１抗体を使用する、ＨｅＬａ細胞におけるインデル無しのコドン最適化された糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）バリアントの表面発現のフローサイトメトリー分析からのデータを示す。Ｂ及びＣは、１μｇ（図１Ｂ）または０．５μｇ（図１Ｃ）のｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面上のｇｐ３５０バリアント発現のパーセント（７２Ａ１陽性のパーセント）を示す棒グラフである。 Ａは、２つの異なる５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列のうちの１つを有するｇｐ３５０ ｍＲＮＡの発現のフローサイトメトリー分析からのデータを示す（ＵＴＲ Ａ及びＵＴＲ Ｂを比較されたい）。Ｂは、０．５μｇの、２つの異なる５’ＵＴＲ配列のうちの１つを有するｇｐ３５０ ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面上のｇｐ３５０発現のパーセントを示す棒グラフである。 脂質ナノ粒子中に製剤化された、ＥＢＶ ｇｐ３５０バリアントをコードするｍＲＮＡによる筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて産生された中和抗体力価の幾何平均（９５％の信頼区間による）を示すグラフである。２μｇの用量を１日目及び再び２１日目に投与した。２１日目及び４３日目にマウスから採血した。ＮＴ５０力価は、５０％のウイルス侵入をブロックする血清希釈の逆数を表わす。すべてのｇｐ３５０バリアントは匹敵する中和力価を提示した。 Ａは、２Ｄ４抗体を使用する、ＨｅＬａ細胞における示されたＥＢＶ抗原（ＥＢＶ ｇｐ４２）及びＥＢＶ抗原複合体（示された５’ＵＴＲを備えたＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２、またはＥＢＶ ｇＨ／ｇｐ４２）の表面発現のフローサイトメトリー分析からのデータを示す。Ｂは、０．２５μｇのｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後２４時間の表面上の抗原発現のパーセント（２Ｄ４陽性のパーセント）を示す棒グラフである。 脂質ナノ粒子中に製剤化された、示されたＥＢＶ抗原（ＥＢＶ ｇｐ３５０）及びＥＢＶ抗原複合体（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２またはｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２／ｇｐ３５０）をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて産生された中和抗体力価の幾何平均（９５％の信頼区間による）を示すグラフである。様々な示された用量を、１日目及び次いで再び２９日目に投与した。２８日目及び５７日目にマウスから採血した。ＮＴ５０力価は、５０％のウイルス侵入をブロックする血清希釈の逆数を表わす。これらのデータは、ｇｐ３５０及びｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２が匹敵するＢ細胞の中和力価を惹起することを示す。１つのＬＮＰワクチン中でｍＲＮＡｓをすべて組み合わせることによって観察される干渉はない。 ２Ａ８抗体を使用する、ＨｅＬａ細胞におけるＥＢＶ ｇＨ抗原及びＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ抗原複合体の表面発現、または２Ｄ４抗体を使用する、ＨｅＬａ細胞におけるＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ抗原複合体の表面発現のフローサイトメトリー分析からのデータを示す。 ０．２５μｇの、２つの異なる５’ＵＴＲ配列のうちの１つを有するｇＨ ｍＲＮＡ及びｇＬ ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後２４時間の表面上のｇＨ／ｇＬ発現のパーセントを示す棒グラフである。 脂質ナノ粒子中に製剤化された、示されたＥＢＶ抗原複合体（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ、ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇＢ、ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ３５０、またはＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇＢ／ｇｐ３５０）をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて産生されたｇＨ／ｇＬ特異的結合抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフである。様々な示された用量を投与した。 脂質ナノ粒子中に製剤化された、示されたＥＢＶ抗原（ＥＢＶ ｇＢ）またはＥＢＶ抗原複合体（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇＢ、ＥＢＶ ｇＢ／ｇｐ３５０、またはＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇＢ／ｇｐ３５０）をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて産生されたｇＢ特異的結合抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフである。様々な示された用量を投与した。 脂質ナノ粒子中に製剤化された、示されたＥＢＶ抗原（ＥＢＶ ｇｐ３５０）またはＥＢＶ抗原複合体（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ３５０、ＥＢＶ ｇＢ／ｇｐ３５０、またはＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇＢ／ｇｐ３５０）をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて産生されたｇｐ３５０特異的結合抗体力価（ｌｏｇ１０）を示すグラフである。様々な示された用量を投与した。 ＬＭＰ１単独、またはＬＭＰ１及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。 ＬＭＰ２単独、またはＬＭＰ２及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。 ＥＢＮＡ１（ＥＢＡＮ１ｄ１－４００）単独、またはＥＢＮＡ１及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。 ＥＢＮＡ３Ａ単独、またはＥＢＮＡ３Ａ及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。 ＬＭＰ１単独、またはＬＭＰ１及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ＬＭＰ２単独、またはＬＭＰ２Ａ及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ＥＢＮＡ１（ＥＢＡＮ１ｄ１－４００）単独、またはＥＢＮＡ１及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 ＥＢＮＡ３Ａ単独、またはＥＢＮＡ３Ａ及びｇｐ３５０の組み合わせ（コンボ）のいずれかをコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、様々なＥＢＶ潜伏遺伝子への抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。 本開示のＥＢＶ ｇｐ３５０バリアントの概略図を示す。 ２Ａ８抗体を使用する、連結された糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）及び糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）コンストラクト（ｇＬ－ｇＨリンカーＡまたはｇＬ－ｇＨリンカーＢ）、またはコトランスフェクションされる個別のｇＨ及びｇＬのいずれかをコードするｍＲＮＡを、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における表面発現についてのフローサイトメトリー分析からのデータを示す。 示されたｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面上のｇＬ－ｇＨ発現のパーセント（２Ａ８陽性のパーセント及びＣＬ４０陽性のパーセント）を示す棒グラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）も示す。 ＥＢＶ抗原をコードする様々なｍＲＮＡ（ＵＴＲ１またはＵＴＲ２を備えた、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１、ｇＨ、ｇＬ及びｇｐ３５０）、またはＥＢＮＡ１抗原単独をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ＥＢＮＡ１に特異的なポリクローナルなＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の応答（例えばＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ－２分泌）を示す。 様々なＥＢＶ抗原をコードするｍＲＮＡ（ＵＴＲ１またはＵＴＲ２を備えた、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１、ｇＨ、ｇＬ及びｇｐ３５０）、またはＬＭＰ２抗原単独をコードするｍＲＮＡによるＩＭワクチン接種後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ＬＭＰ２に特異的なポリクローナルなＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の応答（例えばＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ－２分泌）を示す。 実験プロトコールの概略図（上部）ならびに組み合わせのＥＢＶ ｍＲＮＡのワクチン（ｇｐ３５０、ｇＨ、ｇＬ、ＬＭＰ２及びＥＢＮＡ１）または対照をワクチン接種した、非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）の免疫血清中の、もたらされたｇｐ３５０特異的ＩｇＧ力価（下部左側）及びｇＨ／ｇＬ特異的ＩｇＧ力価（下部右側）のグラフを示す。 示された用量及びコンストラクトによりワクチン接種したＮＨＰの免疫血清中のＲａｊｉ Ｂ細胞のＥＢＶ感染に対する中和力価、またはＥＢＶ＋ヒト血清中に存在する中和力価を示すグラフである。 異なる下流の精製プロセスを使用して生成されたＥＢＶワクチンコンストラクトによる細胞トランスフェクション後のｇｐ３５０特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。 異なる下流の精製プロセスを使用して生成されたＥＢＶワクチンコンストラクトによる細胞トランスフェクション後のｇＨ／ｇＬ特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。
エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）は、Ｂ細胞及び上皮細胞に感染し、伝染性単核症を引き起こし、インビボの両方の細胞タイプの悪性腫瘍（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫及び鼻咽頭癌等）へ関連づけられる、二本鎖ＤＮＡγ－ヘルペスウイルスである。集団のおよそ９５％は成体期までにＥＢＶに感染し、人生の全体にわたってＥＢＶ ＤＮＡを保有する。ＥＢＶは感染したＢリンパ球中で潜伏状態で維持され、溶菌性複製の周期的な再活性化が起こる。
ＥＢＶ（すべてのヒト集団中で広がっている）は、休止ヒトＢ細胞を永続的なリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）（ウイルスにコードされる抗原ＥＢＮＡ１、２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及びＬＰならびに潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ）１、２Ａ及び２Ｂを発現する）へと形質転換する能力を経由してインビトロで単離され得る。ＥＢＶ単離体は、ＥＢＮＡ２、３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ遺伝子内のマークされた対立遺伝子多型に基づいて１型または２型として、ならびに、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２及びＬＭＰ１遺伝子ならびにある特定の溶菌サイクル遺伝子のより微妙な配列変動に基づいて別個の株へと分類され得る。
ＥＢＶは、細胞の中へのウイルス侵入を媒介するコア膜融合装置を形成する、３つの糖タンパク質（糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ及びｇＬ）を有する。ｇＨタンパク質及びｇＬタンパク質は会合してヘテロダイマー複合体を形成し、それは効率的な膜融合のために必要であり、ウイルス侵入のために要求される上皮細胞受容体への直接的な結合にも関与する。ＥＢＶは異なる経路を上皮細胞及びＢリンパ球の感染のために使用する。両方の細胞タイプについて、膜融合を媒介する最少のウイルス糖タンパク質構成要素が同定された。他のヘルペスウイルスのように、ＥＢＶは、コアウイルス侵入糖タンパク質（糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及びｇＨ／ｇＬ複合体）を使用する。Ｂリンパ球の感染のために、ＥＢＶは、膜融合ステップの引き金となる追加のタンパク質（ｇｐ４２、それは宿主ＨＬＡクラスＩＩ分子へ結合する）を要求する。ｇｐ４２は、ｇＨ／ｇＬ、ＨＬＡクラスＩＩ、及び可能性として大きな表面に暴露された疎水性ポケットを介して係合され得る別の未知の結合リガンドとの相互作用のための複数の機能部位を有する。ｇｐ４２タンパク質はそのＮ末端領域を介してナノモーラーの親和性によりｇＨ／ｇＬ複合体へ結合し、この相互作用は約３５ａａ残基の合成ペプチドにより再現され得る。ＥＢＶの糖タンパク質媒介性の上皮細胞との膜融合はｇｐ４２を要求しないが、ｇＢ及びｇＨ／ｇＬのみを要求する。最近の観察は、ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬが上皮細胞上でインテグリンαｖβ６及び／またはαｖβ８を係合して、膜融合及び侵入の引き金となることを指摘する。
ＢＬＬＦ１によってコードされるＥＢＶ ｇｐ３５０糖タンパク質は、休止Ｂ細胞の効率的なＥＢＶ感染に重要である。ｇｐ３５０はウイルスエンベロープ中で最も豊富なウイルスタンパク質である。この大きなタンパク質は高度に糖鎖が付加し、複製細胞の様々な細胞内区画（細胞質、小胞体、ゴルジ及び原形質膜）に局在する。ＥＢＶは，ＣＤ２１（ｇｐ３５０経由の補体受容体２（ＣＲ２））との相互作用を介して一次Ｂ細胞へ結合する。複数のｇｐ３５０ドメインはＣＤ２１との安定的な複合体の形成に関与すると思われ、そのうちの１つは受容体結合部位（アミノ酸［ａａ］１４２～１６１）として同定された。このグリカン無しのドメインは、ｇｐ３５０特異的中和抗体７２Ａによっても認識される。
本開示はＥＢＶの特定の株に限定されていない。ワクチンにおいて使用されるＥＢＶの株はＥＢＶの任意の株であり得る。
本開示は、ＥＢＶ感染に対するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン（ＥＢＶ抗原に対する強力な中和抗体及び着実なＴ細胞応答を惹起する、ウイルス性免疫調節因子の産生を阻害する、及び／またはウイルス潜伏を予防する、ワクチン）を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるワクチンは、治療的に（すなわちＥＢＶによる感染後に）使用される（感染を治療するために）。いくつかの実施形態において、本開示のワクチンを使用して、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、胃癌、鼻咽頭癌、移植後のリンパ増殖性疾患、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、及び／またはＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫を予防するか、またはその頻度を低減させることができる。
本明細書において記載されるＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、複数の点で現在のワクチンより優れている。例えば、本明細書において使用される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系は、他の製剤（文献中で記載される、プロタミンベースのアプローチを包含する）に比較して、ＲＮＡワクチンの有効性を増加させる。このＬＮＰ送達系の使用は、治療結果の産生（例えば中和抗体力価及び／またはＴ細胞応答の産生）に追加のアジュバントを要求せずに、化学的に修飾されたＲＮＡワクチンまたは非修飾ＲＮＡワクチンの有効な送達を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）で投与された場合に、少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１，０００倍の係数で、従来のワクチンより優れている。これらの結果は、他のクラスの脂質ベースの製剤で使用されるＲＮＡ用量と比較して、有意により低い用量のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）が投与される場合でさえ、達成され得る。
本明細書において記載される研究で使用されるＬＮＰは、ヒトに加えて様々な動物モデルにおいてｓｉＲＮＡを送達するために以前に使用されている。ＬＮＰ製剤のｓｉＲＮＡ送達に付随して行われた観察を考慮して、ＥＢＶの事例でのように特に抗原への免疫の生成が困難であった場合に、ＬＮＰがワクチンに有用であるという事実はかなり意外である。ＬＮＰ中に製剤化されたｓｉＲＮＡの治療送達が、一過性ＩｇＭ応答に付随する所望されない炎症応答を引き起こすこと、典型的には抗原産生の低減及び免疫応答の侵害を導くことが観察された。ｓｉＲＮＡにより観察される所見とは対照的に、本開示のＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤は、促進されたＩｇＧレベル（一過性ＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法のために十分である）を生成することが本明細書において実証される。
例示的なエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）抗原
抗原とは、免疫応答を誘導する（例えば免疫系に抗原に対する抗体を産生させる）ことが可能なタンパク質である。本明細書において、抗原という用語の使用は、特別に明記しない限り、免疫原性タンパク質及び免疫原性断片（ＥＢＶへの免疫応答を誘導する（または誘導することが可能な）免疫原性断片）を網羅する。「タンパク質」という用語はペプチドを網羅し、「抗原」という用語は抗原性断片を網羅することを理解するべきである。
多くの異なる抗原はＥＢＶに付随する。本明細書において提供されるようなＥＢＶワクチンは、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つまたは複数の）リボ核酸（ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を含む。ＥＢＶ抗原の非限定例は、以下に提供される。
例示的なＥＢＶ抗原は、本明細書の他の箇所の配列リスト中で提供される。例えば、抗原は、配列番号：１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、及び／または２１０中で記載される配列のうちの任意の１つによってコードされ得る（したがってＲＮＡは、それを含み得るかまたはそれからなり得る）。いくつかの実施形態において、前記配列は、５’キャップ（例えば７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）、ポリＡテイル、または５’キャップ及びポリＡテイルをさらに含む。
本開示のＥＢＶワクチンが、ＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうちの任意のものを含み得るか、またはシグナル配列有りもしくは無しの本明細書において記載されるタンパク質ＯＲＦのうちの任意のものをコードし得ることを理解するべきである。本開示のＥＢＶワクチンが、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることも理解するべきである。例示的なＵＴＲ配列が、配列リスト（例えば配列番号：１、３、１０４及び１０６）中で提供されるが、他のＵＴＲ配列（例えば先行技術の）が使用され得るか、またはそれらは本明細書において記載されるＵＴＲ配列のうちの任意のものを交換し得る。ＵＴＲはまた、本明細書において提供されるワクチンコンストラクトから省かれ得る。
Ｂ細胞へのＥＢＶ侵入は、２型補体受容体（ＣＲ２）への糖タンパク質ｇｐ３５０の接着によって開始される。３つの糖タンパク質の複合体（ｇＨ、ｇＬ及びｇｐ４２）は、後続して、透過のために要求される。ｇｐ４２はＨＬＡクラスＩＩへ結合し、それは侵入メディエーターまたは共受容体として機能し、他のヘルペスウイルスとの類似によって、次いでｇＨはウイルス－細胞の融合に関与すると考えられる。上皮細胞の中へのウイルスの侵入は異なる。それは、ＣＲ２の非存在下において未知の糖タンパク質による接着によって開始され得る。ｇｐ４２とＨＬＡクラスＩＩとの間に相互作用はなく、代わりに、２つの糖タンパク質ｇＨ及びｇＬのみの別個の複合体は、新規侵入メディエーターと相互作用する。
ＥＢＶ ｇＨ－ｇＬ複合体は、３つの糖タンパク質、ｇｐ８５（ｇＨホモログ、それはＢＸＬＦ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の産物である）；ｇｐ２５（ｇＬホモログ、それはＢＫＲＦ２ ＯＲＦの産物である）；及びｇｐ４２（それはＢＺＬＦ２ ＯＲＦの産物である）を含む。複合体は、多くの点において、他のヘルペスウイルスにおけるそのカウンターパートと同様に作用する。糖タンパク質ｇＨは確実なプロセシング及び輸送についてｇＬに依存し、複合体は全体として、ウイルスが細胞膜と融合し細胞質の中へ透過する能力に重要であることが暗示された。
ＢＬＬＦ１によってコードされるｇｐ３５０糖タンパク質は、休止Ｂ細胞の効率的なエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）感染に重要である。
主要なＥＢＶ糖タンパク質ｇｐ３５０は、２型受容体（ＣＲ２）に結合することによってＢ細胞上でのＥＢＶのドッキングを媒介する（Ｎｅｍｅｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．（６１）：１４１６－１４２０（１９８７）；Ｓｚａｋｏｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１３）：９９６－１００１（２００６））。オルタナティブスプライシングに起因して、ＢＬＬＦ１はｇｐ３５０及びｇｐ２２０をコードし、それらは糖鎖付加され、それぞれ分子量でおよそ３５０キロダルトン及び２２０キロダルトンである（Ｂｅｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（５４）：６６５－６７４（１９８５）；Ｈｕｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（４９）：４１３－４１７（１９８４））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原は、配列番号：８１、２０４、１８５、１８２、２０７または２０８によって同定される配列を含む。
ＥＢＶのドッキング後に、ＥＢＶは、糖タンパク質の複合体を使用して宿主細胞の原形質膜と融合する。Ｂ細胞及び上皮細胞の中への侵入のためのコアＥＢＶ膜融合装置は、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）及び糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）を含む（Ｈｕｔｔ－Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（８１）：７８２５－７８３２（２００７））。
ｇＢはｇｐ１１０とも称される１回貫通１型膜タンパク質であり、ＢＡＬＦ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる（Ｈｅｒｒｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．（７０）：２０４９－２０５４（１９９６）；Ｈａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２９０）：１０６－１１４（２００１））；ＭｃＳｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１０１）：１７４７４－１７４７９（２００４））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇＢ抗原は、配列番号：２０９によって同定される配列を含む。
ｇＨ（ｇｐ８５とも称される）は、ＢＸＬＦ２遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる１型膜貫通タンパク質である（Ｈｅｉｎｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６２）：１１０１－１１０７（１９８８））；Ｏｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６２）：１１０８－１１１４（１９８８））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇＨ抗原は、配列番号：１８７によって同定される配列を含む。
ＢＫＲＦ２ ＯＲＦによってコードされるｇＬ（ｇｐ２５とも称される）は、ｇＨの適切な折りたたみ及び局在化のために要求される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６９）：３９８７－３９９４（１９９５）；Ｙａｓｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．（１９５）：３８７－３９６（１９９３））。したがって、ｇＨ及びｇＬは多くの場合複合体として機能してウイルス融合を媒介し、この複合体は結晶化されている（Ｍａｔｓｕｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１０７）：２２６４１－２２６４（２０１０））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇＬ抗原は、配列番号：１８８によって同定される配列を含む。
コア膜融合装置に加えて、Ｂ細胞の中へのＥＢＶ侵入はｇｐ４２を要求し、それはＢＺＬＦ２ ＯＲＦによってコードされる（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（８０）：９４４４－５４（２００６）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（７２）：５５５２－５５５８（１９９８）；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（７８）：５９４６－５９５６（２００４）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（６９）：３９８７－３９９４（１９９５））。ＥＢＶ ｇｐ４２は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによってＢ細胞とウイルスの融合を媒介する（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．（９）：３７５－３８５（２００２）；Ｈａａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７４）：２４５１－４（２０００））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ｇｐ４２抗原は、配列番号：１８９によって同定される配列を含む。
潜伏期膜タンパク質１（ＬＭＰ１）は休止Ｂ細胞の不死化を増進し、ＥＢＶ感染Ｂ細胞をアポトーシスから保護することを支援する６回膜貫通ドメインタンパク質である（Ｈｅｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．（８１）：７２０７－１１（１９８４）；Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（９０）：９１５０－９１５４（１９９３）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（６５）：１１０７－１１１５（１９９１））。多くのシグナル経路がＬＭＰ１によって活性化され、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのシグナリング及びＤＮＡ合成が挙げられる（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（７）：１７７５－１７８２；Ｍａｓｉａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．（８０）：３８９－３９９（１９９５）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．（１０）：４９０－５０４（２００３））。さらに、ＬＭＰ１シグナリングは、Ｂ細胞中の抗アポトーシスＢｃｌ－２がん遺伝子の発現をアップレギュレートし得る（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６８）：５６０２－１２（１９９４））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＬＭＰ１抗原は、配列番号：１７９によって同定される配列を含む。
ＬＭＰ１に類似して、潜伏期膜タンパク質２（ＬＭＰ２）は、多くの場合潜伏して感染した細胞において発現される、ＥＢＶにコードされる膜貫通タンパク質である。ＬＭＰ２の２つのアイソフォーム（ＬＭＰ２Ａ及びＬＭＰ２Ｂ）がある（Ｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（７）：７６９－７４（１９８８）；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６４）：２３１９－２６（１９９０））。ＬＭＰ２ＡはＥＢＶ潜伏の維持に関与する。例えば、ＬＭＰ２Ａは脂質ラフトからＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を除外して、溶菌誘導を防止することができる（Ｄｙｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．（１４）：５７－６７（２００１））。ＬＭＰ２Ａはホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３－Ｋ）／Ａｋｔ経路を活性化して、細胞生存を増進することもできる（Ｓｃｈｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７４）：１０６８１－１０６８９（２０００）；Ｓｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７４）：１０８３８－１０８４５（２０００）；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（７８）：１６９７－１６７０５（２００４））。ＬＭＰ２Ｂタンパク質は、一般的にはＬＭＰ２Ａに比較して、１１９のアミノ末端アミノ酸を欠損し、上皮細胞の伸展及び運動性に関与する（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７９）：１７８９－１８０２（２００５））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原は、配列番号：１８１によって同定される配列を含む。
潜伏感染を確立することを支援するエプスタイン－バー核抗原（ＥＮＢＡ）としてはＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ及びＥＢＮＡ３Ｃが挙げられる。ＢＫＲＦ１によってコードされるＥＢＮＡ１は、ウイルスＤＮＡ複製、エピソーム維持及びエピソーム分配を増進する（Ｒａｗｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（４２）：８５９－６８（１９８５）；Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ（９８）：１８６５－１８７０（２００１））。特に、ＥＢＮＡ１は、潜伏期複製起点ｏｒｉＰの反復ファミリー及び二回転対称エレメントに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＥＢＮＡ１抗原は、配列番号：１７８によって同定される配列を含む。
ＥＢＮＡ３ファミリーには３つのメンバー（ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ及びＥＢＮＡ３Ｃ）がある。ＥＢＮＡ３は、ＲＢＰＪ（それはノッチシグナリング経路における転写調節因子である）に結合することによって転写を調節する（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７０）：４２２８－４２３６（１９９６）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６９）：３１０８－３１１６（１９９５）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（７０）：３０６８－３０７４（１９９６））。特に、ＥＢＮＡ３Ａ及びＥＢＮＡ３Ｃは、Ｂ細胞のＥＢＶ媒介性形質転換のために要求されることが示された（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（６７）：２０１４－２５（１９９３））。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＥＢＮＡ３Ａ抗原は、配列番号：１７７によって同定される配列を含む。
核酸
本開示のＥＢＶワクチンは、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つまたは複数の）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡテイル及び／または５’キャップをさらに含む。
核酸は、ポリヌクレオチドとも称される、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む。核酸は、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸、（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオ異性体）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを包含する、ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはそのキメラ及び／またはその組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、または修飾されたアミノ酸のポリマー）をコードし、翻訳されて、コードされるタンパク質をインビトロ、インビボ、インサイチューまたはエクスビボで産生することができる、任意のリボ核酸である。当業者は、本出願において記載される核酸配列は、特別に指摘された場合を除いて、代表的なＤＮＡ配列中で「Ｔ」を列挙するだろうが、配列がＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を表わす場合には「Ｔ」は「Ｕ」に置換されるだろうことを認識するだろう。したがって、特定の配列識別番号によって本明細書において開示及び同定されたＤＮＡのうちの任意のものは、ＤＮＡへ相補的な対応するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）配列（ここで、ＤＮＡ配列の「Ｔ」は各々「Ｕ」に置換される）も開示する。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えばメチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））により開始し、終止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧもしくはＵＧＡ）により終了する、ＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは典型的にはタンパク質をコードする。本明細書において開示される配列は追加のエレメント（例えば５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）をさらに含み得るが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のワクチン中に必ずしも存在する必要がないことが理解されるだろう。
バリアント
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡはＥＢＶ抗原バリアントをコードする。抗原または他のポリペプチドバリアントは、野生型配列、生来の配列または参照配列からのアミノ酸配列で異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、生来の配列または参照配列に比較して、アミノ酸配列内の、ある特定の位置で置換、欠失及び／または挿入を保持し得る。通常、バリアントは、野生型配列、生来の配列または参照配列へ少なくとも５０％の同一性を保持する。いくつかの実施形態において、バリアントは、野生型配列、生来の配列または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、多くの所望される特性（例えばそれらの免疫原性を促進するもの、それらの発現を促進するもの、及び／または対象におけるそれらの安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善するもの）のうちの任意のものを付与するアミノ酸変化を含有し得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、ルーチンの突然変異誘発技法を使用して作製され、それらが所望される特性を保持するかどうかを決定するために必要に応じてアッセイされ得る。発現レベル及び免疫原性を決定するアッセイは当技術分野において周知であり、例示的なかかるアッセイは実施例セクション中で記載される。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当技術分野で認められている技法（例えばワクチン接種をした対象における経時的な抗原の発現の決定によって、及び／または誘導された免疫応答の耐久性を見ることによって）を使用して、測定され得る。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性に際しての安定性のアッセイによって測定され得るか、またはインシリコの予測を使用して測定され得る。かかる実験及びインシリコの決定のための方法は当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、本明細書において提供される配列（例えば配列リストを参照）のうちの任意の１つによって同定されるヌクレオチド配列を有するか、または本明細書において提供される配列のうちの任意の１つによって同定されるヌクレオチド配列へ、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ ＯＲＦを含む。
「同一性」という用語は、配列の比較によって決定されるような、２つ以上のポリペプチド（例えば抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列の間の関係性を指す。同一性は、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリングの間でのマッチ数によって決定されるような、配列の間のまたは配列の中の、配列相関性の程度も指す。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（例えば「アルゴリズム」）によって、ギャップアライメント（もしあれば）を用いて扱われる、２つ以上の配列のうちのより小さなものとの間の同一のマッチのパーセントを測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、公知の方法によって容易に計算され得る。「パーセント（％）同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列へ適用される時、配列をアライメントさせ、必要であるならばギャップを導入して最大パーセント同一性を達成した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である、候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは当技術分野において周知である。同一性はパーセント同一性の計算に依存するが、計算において導入されたギャップ及びペナルティに起因して値が異なり得ることが理解される。一般的に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば抗原）のバリアントは、本明細書において記載される当業者に公知の配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定されるように、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドへ、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、しかし１００％未満の配列同一性を有する。アライメントのためのかかるツールとしては、ＢＬＡＳＴパッケージプログラムのものが挙げられる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別の人気のあるローカルアライメント技法はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づく（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）。ダイナミックプログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技法はＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）。さらに最近では、おそらく他の最適なグローバルアライメント方法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが挙げられる）よりも速くヌクレオチド配列及びタンパク質配列のグローバルアライメントを産生する、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。
それゆえ、参照配列（特に本明細書において開示されるポリペプチド（例えば抗原）配列）に関して、置換、挿入及び／または付加、欠失ならびに共有結合性修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（１つまたは複数のリジン等）は、ペプチド配列へ（例えばＮ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在化のために使用され得る。リジンは、ペプチド可溶性を増加させるかまたはビオチン化を可能にするために使用され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に所在するアミノ酸残基は、随意に欠失され、短縮配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸（例えばＣ末端残基またはＮ末端残基）は、配列の用途（例として可溶性であるかまたは固体支持体へ連結される、より大きな配列の一部としての配列の発現）に依存して、欠失され得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列、終結配列、膜貫通ドメイン、リンカー、マルチマー化ドメイン（例えばフォールドン領域等）及び同種のもののための（またはそれらをコードする）配列は、同じかまたは類似する機能を達成する選択的配列により置換され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質のコア中の空洞は例えばより大きなアミノ酸の導入によって充填されて、安定性を改善することができる。他の実施形態において、埋没された水素結合ネットワークは、安定性を改善するために疎水性残基により置き換えられ得る。さらに他の実施形態において、糖鎖付加部位は除去され、適切な残基により置き換えられ得る。かかる配列は、当業者に容易に同定可能である。本明細書において提供される配列のうちのいくつかは、例えばＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの調製における使用の前に欠失され得る、配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えばＮ末端またはＣ末端で）含有することも、理解されるべきである。
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン及び相同タンパク質も、対象のＥＢＶ抗原の範囲内であると判断される。例えば、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照抗原配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一のポリペプチド配列を意味する）が、本明細書において提供され、但し、断片は免疫原性であり、ＥＢＶ病原体に対する保護的免疫応答を付与する。参照タンパク質に同一であるが短縮されたバリアントに加えて、いくつかの実施形態において、抗原は、本明細書において提供または参照される配列のうちの任意のものにおいて示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の突然変異を含む。抗原／抗原性ポリペプチドは、約４、６または８アミノ酸から全長タンパク質の長さの範囲であり得る。
安定化エレメント
天然に存在する真核生物ｍＲＮＡの分子は安定化エレメントを含有することができ、５’端部での非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’ＵＴＲ）及び／または３’端部でのＵＴＲ（３’ＵＴＲ）に加えて、他の構造上のフィーチャ（５’キャップ構造または３’ポリ（Ａ）テイル等）が挙げられるがこれらに限定されない。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方は、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造上のフィーチャ（５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）テイル等）は、通常ｍＲＮＡのプロセシングの間に、転写された（未成熟）ｍＲＮＡへ付加される。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、少なくとも１つの５’末端キャップを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、製造者プロトコールに従って以下の化学的ＲＮＡキャップアナログ：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して５’グアノシンキャップ構造を生成して、インビトロの転写反応の間に同時に完了させることができる。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、転写後にワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を生成して完了させることができる。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルが生成され得る。キャップ２構造は、キャップ１構造から生成され得、続いて、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’末端から３番目のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化される。キャップ３構造は、キャップ２構造から生成され得、続いて、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’末端から４番目のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化される。酵素は組換え源に由来し得る。
３’ポリ（Ａ）テイルは、典型的には転写されたｍＲＮＡの３’端部へ付加されたアデニンヌクレオチドのストレッチである。いくつかの事例において、それは最大約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、３’ポリ（Ａ）テイルの長さは個別のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは１つまたは複数の安定化エレメントを含み得る。安定化エレメントとしては例えばヒストンステムループが挙げられ得る。３２ｋＤａタンパク質のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が同定されている。ＳＬＢＰは、核及び細胞質の両方において、ヒストンメッセージの３’端部でヒストンステムループと会合する。ＳＬＢＰの発現レベルは細胞周期によって調節され、ヒストンｍＲＮＡのレベルも上昇する場合に、ＳＬＢＰの発現レベルはＳ期の間にピークに達する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’端部プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後にステムループと会合し続け、次いで細胞質中での成熟したヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは後生動物及び原生動物を通して保存され、ヒストンステムループへのその結合はループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して５’に少なくとも３ヌクレオチド及び３’に２ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び随意に、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、一般的にはコードされるタンパク質の発現レベルを促進するものである。コードされるタンパク質は、いくつかの実施形態において、ヒストンタンパク質、リポータータンパク質（例えばルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えばα－グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナル及び少なくとも１つのヒストンステムループの組み合わせは、たとえ両方が天然で代替の機構を表わしたとしても、個別のエレメントのいずれかにより観察されたレベルを超えてタンパク質発現を増加させるように、相乗的に作用する。ポリ（Ａ）及び少なくとも１つのヒストンステムループの組み合わせの相乗効果は、エレメントの順序またはポリ（Ａ）配列の長さに依存しない。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンはヒストンの下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント」（ＨＤＥ）としては、天然に存在するステムループの３’側のおよそ１５～２０のヌクレオチドのプリンリッチポリヌクレオチドストレッチが挙げられ、このストレッチはＵ７ ｓｎＲＮＡ（ヒストンプレｍＲＮＡの成熟したヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与する）のための結合部位を表わす。いくつかの実施形態において、核酸はイントロンを含まない。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、エンハンサー配列及び／またはプロモーター配列を含有するかまたは含有せず、それは修飾もしくは非修飾であり得るか、または活性化もしくは不活性化され得る。いくつかの実施形態において、ヒストンステムループは、一般的にはヒストン遺伝子に由来し、構造のループを形成するスペーサー（短い配列からなる）によって分離された、２つの隣り合った部分的または完全に逆方向の相補的な配列の分子内塩基対合を含む。非対合ループ領域は、典型的にはステムループエレメントのいずれかと塩基対になることができない。それは多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡ中でより頻繁に起こるが、一本鎖ＤＮＡにおいて同様に存在し得る。ステムループ構造の安定性は、一般的には長さ、ミスマッチまたは膨らみの数、及び対合領域の塩基組成物に依存する。いくつかの実施形態において、揺らぎ塩基対（非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対）が生じ得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５のヌクレオチド長を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数のＡＵリッチ配列を除去することができる。これらの配列（時にはＡＵＲＥＳと称される）は、３’ＵＴＲ中で見出される不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去され得る。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残ってもよい。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ＥＢＶ抗原へ融合されたシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するＲＮＡを含む。シグナルペプチド（タンパク質のＮ末端の１５～６０アミノ酸を含む）は、典型的には分泌経路上の膜を横切る移行のために必要とされ、したがって普遍的に真核生物及び原核生物の両方における大部分のタンパク質の分泌経路への侵入を制御する。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、粗面小胞体（ＥＲ）膜へリボソームを導き、プロセシングのためにＥＲ膜を横切って成長するペプチド鎖の輸送を開始する。ＥＲプロセシングは成熟したタンパク質を産生し、そこで、シグナルペプチドは、宿主細胞のＥＲ常在性シグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から典型的には切断されるか、または、それらは未切断のまま、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドは、細胞膜へのタンパク質の標的化も促進し得る。
シグナルペプチドは、１５～６０のアミノ酸長を有し得る。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０のアミノ酸長を有し得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５または１５～２０のアミノ酸長を有する。
異種遺伝子からのシグナルペプチド（それはＥＢＶ抗原以外の遺伝子の発現を天然で調節する）は当技術分野において公知であり、所望される特性のために試験され、次いで本開示の核酸の中へ取込まれ得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはウシプロラクチンシグナルペプチドである。例えば、ウシプロラクチンシグナルペプチドは、配列ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＰＱＧＶＶＧ（配列番号：１１５）を含み得る。他のシグナルペプチド配列も使用され得る。例えば、シグナルペプチドは、以下の配列のうちの１つを含み得る。ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号：１１６）；ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号：１１７）；ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ（配列番号：１１８）；ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ（配列番号：１１９）；ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ（配列番号：１２０）。
融合タンパク質
いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、抗原性融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。したがって、コードされる抗原（複数可）は、一緒に連結された２つ以上のタンパク質（例えばタンパク質及び／またはタンパク質断片）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合されるタンパク質は、それ自体への強い免疫応答を増進しないが、むしろＥＢＶ抗原への強い免疫応答を増進する。抗原性融合タンパク質は、いくつかの実施形態において、各々の元のタンパク質からの機能的特性を保持する。
スキャフォールド部分
本明細書において提供されるようなＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、いくつかの実施形態において、スキャフォールド部分へ連結されたＥＢＶ抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、かかるスキャフォールド部分は、本開示の核酸によってコードされる抗原へ所望される特性を付与する。例えば、スキャフォールドタンパク質は、例えば抗原の構造を変更すること、抗原の取込み及びプロセシングを変更すること、及び／または抗原を結合パートナーへ結合させることを引き起こすことによって、抗原の免疫原性を改善し得る。
いくつかの実施形態において、スキャフォールド部分は、高度に対称的で安定的で構造的に組織された１０～１５０ｎｍの直径（免疫系の様々な細胞との最適な相互作用に極めて好適なサイズ範囲）のタンパク質ナノ粒子へと自己集合することができる、タンパク質である。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して安定的なナノ粒子構造を形成することができる。かかるウイルスタンパク質の例は、当技術分野において公知である。例えば、いくつかの実施形態において、スキャフォールド部分はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは約２２ｎｍの平均直径を備えた球状粒子を形成し、それは核酸を欠損し、したがって非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態において、スキャフォールド部分はＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）であり、２４～３１ｎｍの直径の粒子へと自己集合し、それはＨＢＶ感染ヒト肝臓から得られたウイルスコアに似ていた。産生されたＨＢｃＡｇは、３００Å及び３６０Åの直径の２つのクラスの異なったサイズのナノ粒子（１８０または２４０のプロトマーに対応する）へと自己集合する。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原はＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧへ融合されて、ＥＢＶ抗原を提示するナノ粒子の自己集合を促進する。
別の実施形態において、細菌タンパク質のプラットフォームが使用され得る。これらの自己集合タンパク質の非限定例としては、フェリチン、ルマジン及びエンカプスリンが挙げられる。
フェリチンは、その主要機能が細胞内鉄貯蔵であるタンパク質である。フェリチンは２４のサブユニットからなり、各々は４つのαヘリックスバンドルから構成され、それらは八面体の対称性を備えた四次構造に自己集合する（Ｃｈｏ Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンの複数の高解像度構造が決定され、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのフェリチンは２４の同一のプロトマーから構成されることが確認されるが、動物においては、２４サブユニットの粒子へと単独で集合できるかまたは異なる比で組み合わせることができる、フェリチンの軽鎖及び重鎖がある（Ｇｒａｎｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；Ｌａｗｓｏｎ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、頑強な熱安定性及び化学的安定性を備えたナノ粒子へと自己集合する。したがって、フェリチンナノ粒子は抗原を保有し曝露することに良く適する。
ルマジン合成酵素（ＬＳ）も抗原提示のためのナノ粒子プラットフォームとして良く適する。ＬＳ（それはリボフラビンの生合成における最後から２番目の触媒ステップに関与する）は、幅広い様々な生物体（古細菌、細菌、真菌、植物及び真性細菌が挙げられる）に存在する酵素である（Ｗｅｂｅｒ Ｓ．Ｅ．Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＬＳモノマーは１５０のアミノ酸長であり、βシートと一緒にその両側に隣接するタンデムなαへリックスからなる。多数の異なる四次構造がＬＳについて報告されており、その形態的な多用途性（ホモペンタマーから１５０Åの直径のカプシドを形成する１２のペンタマーの対称的な集合まで）が例証される。１００を超えるサブユニットのＬＳケージでさえ記載されている（Ｚｈａｎｇ Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。
エンカプスリン（好熱性のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離された新規タンパク質ケージナノ粒子）も、プラットフォームとして使用されて、自己集合するナノ粒子の表面上で抗原を提示することができる。エンカプスリンは同一の３１ｋＤａのモノマーの６０コピーを集合し、それぞれ２０ｎｍ及び２４ｎｍの内部直径及び外部直径を備えた薄い２０面体（Ｔ＝１）の対称なケージ構造を有する（Ｓｕｔｔｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能はまだ明確に理解されていないが、結晶構造が最近解像され、その機能は、タンパク質（ＤｙＰ（色素脱色型ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）等、それらは酸化的ストレス応答に関与する）をカプセル化する細胞内区画として提唱された（Ｒａｈｍａｎｐｏｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。
リンカー及び切断可能ペプチド
いくつかの実施形態において、本開示のｍＲＮＡは２つ以上のポリペプチドをコードし、本明細書において融合タンパク質と称される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つまたは各々のドメインの間に所在するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば切断可能リンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー及びその組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当技術分野において記載されている（例えばＫｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照）。いくつかの実施形態において、リンカーはＦ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＧＧＳリンカーまたはＧＧＧＧＳリンカーであり、例えば１つまたは複数の（例えば１、２、３、４またはそれ以上の）ＧＧＧＳ（配列番号：２２６）またはＧＧＧＧＳ（配列番号：２２７）の反復配列（例えばＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号：２２４）及び／またはＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号：２２５））が挙げられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、介在リンカーと共に３つのドメインを含有し、構造：ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインを有する。
当技術分野において公知の切断可能リンカーは、本開示と関連して使用され得る。例示的なかかるリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えばＷＯ２０１７／１２７７５０を参照）。当業者は、当技術分野で認められている他のリンカーが、本開示のコンストラクト（例えば本開示の核酸によってコードされる）中での使用に好適であり得ることを認識するだろう。当業者は、他のポリシストロン性コンストラクト（同じ分子内に２つ以上の抗原／ポリペプチドを分離してコードするｍＲＮＡ）が、本明細書において提供されるような使用に好適であり得ることを同様に認識するだろう。
配列最適化
いくつかの実施形態において、本開示の抗原をコードするＯＲＦは最適化されたコドンである。コドン最適化法は当技術分野において公知である。例えば、本明細書において提供される配列のうちの任意の１つまたは複数のＯＲＦは、コドン最適化され得る。コドン最適化が、いくつかの実施形態において使用されて、適切な折りたたみを保証するために、標的生物及び宿主生物においてコドン頻度をマッチさせるか；ｍＲＮＡの安定性を増加させるかもしくは二次構造を低減させるために、ＧＣ含有量にバイアスをかけるか；遺伝子のコンストラクションもしくは発現を悪化させ得るタンデム反復コドンもしくは塩基ランを最小限にするか；転写領域及び翻訳調節領域をカスタマイズするか；タンパク質トラフィック配列を挿入もしくは除去するか；コードされるタンパク質（例えば糖鎖付加部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するか；タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルするか；制限部位を挿入もしくは欠失するか；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するか；タンパク質の様々なドメインが適切に折りたたまれることを可能にするために、翻訳速度を調整するか；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは消失させることができる。コドン最適化のツール、アルゴリズム及びサービスは当技術分野において公知であり、非限定例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）及び／または独自方法からのサービスが挙げられる。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列のＯＲＦ（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ６５％～８５％の間の（例えば約６７％～約８５％の間または約６７％～約８０％の間の）配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えばＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡの配列）へ６５％～７５％の間または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化された配列は、コドン最適化されない配列によってコードされるＥＢＶ抗原と同じくらい免疫原性であるか、またはそれよりも、より免疫原性（例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％または少なくとも２００％多く）である抗原をコードする。
哺乳動物宿主細胞の中へトランスフェクションされた場合に、修飾ｍＲＮＡは、１２～１８時間の間または１８時間以上（例えば２４、３６、４８、６０、７２または７２時間以上）で安定性を有し、哺乳動物宿主細胞によって発現され得る。
いくつかの実施形態において、コドン最適化されたＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが促進されたものであり得る。核酸分子（例えばｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含有量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。増加させた量のグアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基を有するＲＮＡは、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡよりも、機能的により安定的であり得る。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳される領域中の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示する。遺伝コードの縮重に起因して、この修飾は、結果として生じるアミノ酸を変化させずに、ＲＮＡ安定性をより増進するものに既存のコドンを置換することによって作動する。このアプローチはＲＮＡのコード領域に限定される。
化学的に修飾されないヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンの少なくとも１つのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されず、アデノシン、グアノシン、シトシン及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基（転写されたＲＮＡ中に存在するもの（例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＵ）等）を含む。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ中に存在するもの（例えばｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはｄＴ）等）を含む。
化学的修飾
本開示のＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの核酸（例えばＲＮＡ）を含み、そこで、核酸は、当技術分野において公知のように、標準的である（修飾されない）かまたは修飾された、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。かかる修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシド、または天然に存在しない修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドであり得る。当技術分野において認識されるように、かかる修飾としては、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格または核酸塩基部分でのものが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、本開示の天然に存在する修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当技術分野において一般的には公知または認識されるようなものである。かかる天然に存在する修飾されたヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定例は、広く認識されるＭＯＤＯＭＩＣＳデータベース中でとりわけ見出すことができる。
いくつかの実施形態において、本開示の天然に存在しない修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当技術分野において一般的には公知または認識されるようなものである。かかる天然に存在しない修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定例は、公開済みの米国出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１；またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７中でとりわけ見出すことができ、そのすべては参照することによって本明細書に援用される。
したがって、本開示の核酸（例えばＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡ核酸等））は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはその任意の組み合わせを含み得る。
本開示の核酸（例えばＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））は、いくつかの実施形態において、様々な（２つ以上の）異なるタイプの標準的な及び／または修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、核酸の特定の領域は、１つ、２つまたはそれ以上の（随意に異なる）タイプの標準的な及び／または修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドを含有する。
いくつかの実施形態において、細胞または生物体へ導入される修飾されたＲＮＡ核酸（例えば修飾されたｍＲＮＡの核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸に比べて、それぞれ細胞または生物体において分解の低減を示す。
いくつかの実施形態において、細胞または生物体の中に導入される修飾されたＲＮＡ核酸（例えば修飾されたｍＲＮＡの核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸に比べて、それぞれ細胞または生物体において免疫原性の低減（例えば先天性応答の低減）を示し得る。
核酸（例えばＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））は、いくつかの実施形態において、核酸の合成の間または合成後に導入される、非天然の修飾されたヌクレオチドを含んで、所望される機能または特性を達成する。修飾は、ヌクレオチド間リンケージ、プリン塩基もしくはピリミジン塩基または糖上に存在し得る。修飾は、鎖の末端または鎖中の他の部分で、化学合成またはポリメラーゼ酵素により導入され得る。核酸の領域のうちの任意のものが、化学的に修飾され得る。
本開示は、核酸（例えばＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えばプリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて、糖分子（例えばペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、任意の有用な方法によって（例えば化学的に、酵素により、または組換えにより等で）合成されて、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含めることができる。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は可変的な骨格リンケージを有し得る。リンケージは標準的なホスホジエステルリンケージであり、その事例において、核酸はヌクレオチドの領域を含むだろう。
修飾されたヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシンの塩基対だけではなく、ヌクレオチド及び／または標準的でない塩基もしくは修飾された塩基を含む修飾されたヌクレオチド間で形成される塩基対も網羅し、そこで、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターのアレンジは、標準的でない塩基と標準的な塩基との間、または２つの相補的な標準的でない塩基構造（例えば少なくとも１つの化学的修飾を有する核酸中のもの等）の間で、水素結合することを許容する。かかる標準的でない塩基対合の１つの例は、修飾されたヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは本開示の核酸の中へ取込まれ得る。
いくつかの実施形態において、核酸（例えばＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））中の修飾された核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸（例えばＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））中の修飾された核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、前記修飾された核酸塩基（化学的修飾が挙げられるがこれに限定されない）の任意のもののうちの少なくとも２つ（例えば２つ、３つ、４またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数またはすべてのウリジン位置での１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数またはすべてのウリジン位置での１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数またはすべてのシチジン位置での５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数またはすべてのウリジン位置でのシュードウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数またはすべてのウリジン位置でのシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数またはすべてのシチジン位置での５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数またはすべてのウリジン位置でウリジンを含む。
いくつかの実施形態において、核酸（例えばＲＮＡ核酸（ｍＲＮＡの核酸等））は、特定の修飾のために一様に修飾されている（例えば完全に修飾される、全体の配列にわたって修飾される）。例えば、核酸は１－メチル－シュードウリジンにより一様に修飾され得、ｍＲＮＡの配列中のすべてのウリジン残基が１－メチル－シュードウリジンにより置き換えられることを意味する。同様に、核酸は、修飾された残基（上で記載されるもの等）による置き換えによって、配列中に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について一様に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全体の長さに沿って部分的にまたは完全に修飾され得る。例えば、１つもしくは複数またはすべてまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えばプリンもしくはピリミジン、あるいはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちの任意の１つもしくは複数またはすべて）は、本開示の核酸中で、またはその既定の配列領域中で（例えばポリＡテイルを含むかまたは除外したｍＲＮＡ中で）、一様に修飾され得る。いくつかの実施形態において、本開示の核酸中の（またはその配列領域中の）すべてのヌクレオチドＸは、修飾されたヌクレオチドであり、そこで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちの任意の１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃの組み合わせのうちの任意の１つであり得る。
核酸は、約１％～約１００％、または任意の間に入るパーセンテージ（例えば１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾されたヌクレオチドを含有し得る（全体的なヌクレオチド含有量に関連して、または１つもしくは複数のタイプのヌクレオチド（すなわちＡ、Ｇ、ＵまたはＣのうちの任意の１つまたは複数）に関連してのいずれかで）。非修飾のＡ、Ｇ、ＵまたはＣの存在によって任意の残りのパーセンテージが占められることが理解されるだろう。
核酸は、最小１％及び最大１００％、または任意の間に入るパーセンテージで修飾されたヌクレオチドを含有し得る（少なくとも５％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾されたヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾されたヌクレオチド等）。例えば、核酸は修飾されたピリミジン（修飾されたウラシルまたはシトシン）を含有し得る。いくつかの実施形態において、核酸中のウラシルのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％は、修飾されたウラシル（例えば５－置換ウラシル）により置き換えられる。修飾されたウラシルは、単一のユニークな構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば２、３、４またはそれ以上のユニークな構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、核酸中のシトシンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％は、修飾されたシトシン（例えば５－置換シトシン）により置き換えられる。修飾されたシトシンは、単一のユニークな構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば２、３、４またはそれ以上のユニークな構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示の核酸は、非翻訳領域として作用または機能する１つまたは複数の領域または部分を含み得る。核酸が少なくとも１つの対象の抗原をコードするようにデザインされる場合に、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つまたは複数を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳されない。ｍＲＮＡ中で、５’ＵＴＲは転写開始部位で開始し、開始コドンへ継続するが、開始コドンを含まない。しかしながら、３’ＵＴＲは終止コドンに続いて直ちに開始し、転写終結シグナルまで継続する。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲによって果たされる調節性の役割についての多数の証拠が増大している。ＵＴＲの調節性フィーチャは、とりわけ分子の安定性を促進するために本開示のポリヌクレオチドの中へ取込まれ得る。所望されない器官の部位へ誤って導かれるという事例において、特異的なフィーチャを取込んで、転写物の制御されたダウンレギュレーションを保証することができる。多種多様な５’ＵＴＲ配列及び３’ＵＴＲ配列が公知であり、当技術分野において利用可能である。
５’ＵＴＲは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の第１のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コーディング）。天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たすフィーチャを有する。それらは、コザック配列のようなシグネチャー（それはリボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に公知である）を保有する。コザック配列はコンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号：１２１）を有し、配列中、Ｒはプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドン（ＡＵＧ）（もう１つの「Ｇ」が続く）の３塩基上流にある。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
本開示のいくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは異種ＵＴＲである（すなわち異なるＯＲＦと結び付けられる天然で見出されるＵＴＲである）。別の実施形態において、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲである（すなわち天然に存在しない）。合成ＵＴＲは、それらの特性を改善するために（例えばそれは遺伝子発現を増加させる）突然変異させたＵＴＲに加えて、完全に合成したものを包含する。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３；９０１２２１９）、ヒトチトクロームｂ－２４５ ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号：１２２）（ＷＯ２０１４／１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠損するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（例えばＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６８）である。リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）が、使用され得る。いくつかの実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が５’ＵＴＲの代わりに使用される。
いくつかの実施形態において、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号：１及び配列番号：１０４から選択される配列を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳の終了のシグナルであるｍＲＮＡ転写物のコドン）からすぐ下流（３’）のｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コーディング）。天然の３’ＵＴＲまたは野生型の３’ＵＴＲは、それら中にアデノシン及びウリジンのストレッチを組み込んでいることが公知である。これらのＡＵリッチシグネチャーは、ターンオーバー率が高い遺伝子中で特によく見られる。それらの配列フィーチャ及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は３つのクラスへと分割され得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）。クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの複数の分散したコピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップするＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号：１２３）ノナマーを保持する。このタイプのＡＲＥを含有する分子としてはＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩ ＡＲＥＳは十分に定義されていない。これらのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含有していない。ｃ－Ｊｕｎ及びマイオジェニンはこのクラスの２つのよく研究された例である。ＡＲＥへ結合する大部分のタンパク質はメッセンジャーを不安定化することが公知であるが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー（最も顕著にはＨｕＲ）はｍＲＮＡの安定性を増加させることが報告されている。ＨｕＲはすべての３つのクラスのＡＲＥへ結合する。核酸分子の３’ＵＴＲの中へＨｕＲの特異的な結合部位を操作することは、ＨｕＲの結合及びしたがってインビボのメッセージの安定化を導くだろう。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、本開示の核酸（例えばＲＮＡ）の安定性を調節することができる。具体的な核酸を操作する場合に、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して本開示の核酸をより不安定にし、それによって翻訳を抑え、結果として生ずるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去するかまたは突然変異させて細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生ずるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、妥当な細胞株において遂行され、タンパク質産生はトランスフェクション後の様々なタイムポイントでアッセイされ得る。例えば、細胞は、異なるＡＲＥ操作分子によりトランスフェクションされ、妥当なタンパク質に対するＥＬＩＳＡキットの使用によって、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間及び７日で産生されたタンパク質をアッセイする。
３’ＵＴＲは異種または合成であり得る。３’ＵＴＲに関して、グロビンＵＴＲ（Ｘｅｎｏｐｕｓβ－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲが挙げられる）が、当技術分野において公知である（８２７８０６３、９０１２２１９、ＵＳ２０１１００８６９０７）。２つの連続的なヒトβ－グロビンの３’ＵＴＲをヘッドツーテイルでクローン化することによって、いくつかの細胞タイプでの促進された安定性を備えた修飾されたβ－グロビンコンストラクトが開発されており、当技術分野において周知である（ＵＳ２０１２／０１９５９３６、ＷＯ２０１４／０７１９６３）。加えて、ａ２－グロビン、ａ１－グロビンのＵＴＲ及びその突然変異も当技術分野において公知である（ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０２４６６７）。非特許文献におけるｍＲＮＡのコンストラクト中で記載される他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒトの成長ホルモン（野生型または修飾された）（ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１４／１５２７７４）、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のものが挙げられ、α－グロビン３’ＵＴＲ及びウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列も公知である。いくつかの実施形態において、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（ＷＯ２０１４／１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態において、ヒト及びマウスのリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（ＷＯ２０１５／１０１４１４）、ＦＩＧ４（ＷＯ２０１５／１０１４１５）及びヒトアルブミン７（ＷＯ２０１５／１０１４１５）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号：３及び配列番号：１０６から選択される配列を含む。
当業者は、異種または合成の５’ＵＴＲが任意の所望される３’ＵＴＲ配列と共に使用され得ることを理解するだろう。例えば、異種５’ＵＴＲは、異種３’ＵＴＲを備えた合成３’ＵＴＲと共に使用され得る。
非ＵＴＲ配列も核酸内の領域または小区域として使用され得る。例えば、イントロンの配列またはイントロンの部分の配列は、本開示の核酸の領域の中へ取込まれ得る。イントロン性配列の取込みは、核酸レベルに加えてタンパク質産生も増加させ得る。
フィーチャの組み合わせは、隣接領域中に含まれ得るか、または他のフィーチャ内に含有され得る。例えば、ＯＲＦは、強いＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲ、及び／またはポリＡテイルの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲによって、隣接され得る。５’ＵＴＲは、第１のポリヌクレオチド断片ならびに同じ遺伝子及び／または異なる遺伝子からの第２のポリヌクレオチド断片（米国特許出願公報第２０１００２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５（その全体は参照することによって本明細書に援用される）中で記載される５’ＵＴＲ等）を含み得る。
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲも核酸の領域の中へ取込まれ得ることが理解されるべきである。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型領域のバリアントでない、人工的ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物中と同じ向きで置かれ得るか、または向きもしくは所在位置で変更され得る。したがって、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲは、１つまたは複数の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと共に、反転、短縮、延長され得る。本明細書において使用される時、「変更された」という用語は、それがＵＴＲ配列に関連する時、ＵＴＲが参照配列に関連して何らかのやり方で変化されることを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上で教示されるように、向きもしくは所在位置の変化によって野生型もしくは生来のＵＴＲに比べて変更され得るか、または追加ヌクレオチドの組み入れ、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって変更され得る。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’にかかわらず）を産生するこれらの変化のうちの任意のものは、バリアントＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、２重、３重または４重のＵＴＲ（５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ等）が使用され得る。本明細書において使用される時、「２重の」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続してまたは実質的に連続してコードされるものである。例えば、米国特許公報２０１００１２９８７７（その内容はその全体を参照することによって本明細書に援用される）中で記載されるように、２重のβ－グロビン３’ＵＴＲが使用され得る。
パターニングされたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書において使用される時、「パターニングされたＵＴＲ」は、反復パターンまたは交互パターン（ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回もしくは３回以上反復するそのバリアント等）を反映するＵＴＲである。これらのパターン中で、各々の文字（Ａ、ＢまたはＣ）は、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表わす。
いくつかの実施形態において、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、フィーチャまたは特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、対象のポリペプチドは、特定の細胞、組織中でまたは発生の間のある時間で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のうちの任意のものからのＵＴＲは、タンパク質の同じファミリーまたは異なるファミリーの他のＵＴＲにスワッピングされて、新規ポリヌクレオチドを生成することができる。本明細書において使用される時、「タンパク質のファミリー」は、少なくとも１つの機能、構造、フィーチャ、局在、起源、または発現パターンを共有する、２つ以上の対象のポリペプチドの群を指すように、最も広義の意味で使用される。
非翻訳領域は翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含み得る。非限定例として、ＴＥＥとしては、米国出願第２００９０２２６４７０号（その全体は参照することによって本明細書に援用される）中で記載されるもの及び当技術分野において公知のものが挙げられ得る。
ＲＮＡのインビトロ転写
本明細書において記載されるポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写され得る。ＲＮＡのインビトロ転写は当技術分野において公知であり、国際公開ＷＯ／２０１４／１５２０２７（それはその全体を参照することによって本明細書に援用される）中で記載される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、インビトロ転写反応において非増幅直線化ＤＮＡ鋳型を使用して生成されて、ＲＮＡ転写物を生成する。いくつかの実施形態において、鋳型ＤＮＡは単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態において、鋳型ＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写によって形成されるが、例えばＥＢＶ ＲＮＡ（例えばＥＢＶ ｍＲＮＡ）に限定されない。いくつかの実施形態において、細胞（例えば細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、例えばＤＨ－１細胞）は、プラスミドＤＮＡ鋳型によりトランスフェクションされる。いくつかの実施形態において、トランスフェクションされた細胞を培養してプラスミドＤＮＡを複製させ、次いでそれは単離及び精製される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、５’に所在し対象の遺伝子へ作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７プロモーター）を含む。
いくつかの実施形態において、インビトロ転写鋳型は５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３’ＵＴＲ及びポリＡテイルをコードする。インビトロ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存するだろう。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、開始コドン（すなわちリボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の第１のコドン）からすぐ上流（すなわち５’）にある、ポリペプチドをコードしないｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写物が生成されている場合に、５’ＵＴＲはプロモーター配列を含み得る。かかるプロモーター配列は当技術分野において公知である。かかるプロモーター配列が本開示のワクチン中に存在しないであろうことが理解されるべきである。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、終止コドン（すなわち翻訳の終了のシグナルであるｍＲＮＡ転写物のコドン）からすぐ下流（すなわち３’）にある、ポリペプチドをコードしないｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えばメチオニン（ＡＴＧ））により開始し、終止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）により終了し、ポリペプチドをコードする、ＤＮＡの連続的なストレッチである。
「ポリＡテイル」は、複数の一続きのアデノシン一リン酸を含有する、３’ＵＴＲから下流（例えばすぐ下流（すなわち３’））にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリＡテイルは、１０～３００のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリＡテイルは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリＡテイルは、５０～２５０のアデノシン一リン酸を含有する。妥当な生物学的設定において（例えばインビボの細胞において）、ポリ（Ａ）テイルは、例えば細胞質中の酵素による分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結及び／または核からのｍＲＮＡのエクスポート及び翻訳を支援する。
いくつかの実施形態において、核酸は２００～３，０００のヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００のヌクレオチドを含み得る。
インビトロ転写系は、典型的には転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸塩（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害物質及びポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは、インハウスで製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書において記載されるように合成され得る。ＮＴＰは、本明細書において記載されるものから選択され得るがこれらに限定されず、天然のＮＴＰ及び非天然の（修飾された）ＮＴＰを包含する。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが本開示の方法において使用され得る。ポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、及び／または突然変異ポリメラーゼ（修飾された核酸及び／または修飾されたヌクレオチド（化学的に修飾された核酸及び／またはヌクレオチドが挙げられる）を取込むことが可能なポリメラーゼ等であるがこれらに限定されない）から選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は酵素によるキャッピング経由でキャッピングされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、５’末端キャップ（例えば７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は固体相技法を使用して、全体でまたは部分的に製造され得る。核酸の固相化学合成は自動化方法であり、そこで、分子は固体支持体上に固定化され、反応物溶液中で段階的に合成される。固相合成は、核酸配列中の化学修飾の部位特異的導入において有用である。
液相化学合成。本開示の核酸の合成は、モノマービルディングブロックの連続的な添加によって液相において実行され得る。
合成方法の組み合わせ。上で検討された合成方法の各々は、それ自体の利点及び限定を有する。この限定を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが遂行された。かかる方法の組み合わせは本開示の範囲内である。酵素によるライゲーションと組み合わせた固相化学合成または液相化学合成の使用は、化学合成単独によって得ることができない長さの鎖核酸を生成する、効率的な手法を提供する。
核酸の領域または小区域のライゲーション
リガーゼによる核酸のアセンブルも使用され得る。ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通してポリヌクレオチド鎖の５’末端及び３’末端の分子間ライゲーションを増進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸等の核酸は、１つまたは複数の領域またはサブ領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡ断片をリガーゼ触媒反応によって繋いで、異なる機能を備えた組換えＤＮＡを生成することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を備えたもの及び遊離３’ヒドロキシル基を備えた別のもの）が、ＤＮＡリガーゼのための基質として供される。
精製
本明細書において記載される核酸の精製は、核酸クリーンアップ、品質保証及び品質管理を包含し得るがこれらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野における公知の方法（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）等であるがこれらに限定されない）またはＨＰＬＣベースの精製方法（強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等であるがこれらに限定されない）によって遂行され得る。「精製された」という用語は、核酸（「精製核酸」等）に関連して使用される場合に、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」は、別の物質を不適当であるか、不純であるか、または粗悪にする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然で見出されるものとは異なる形態もしくは設定、または処理もしくは精製方法をそれに行う前に存在したものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理のチェックは、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度または分析ＨＰＬＣ等であるがこれらに限定されない方法を使用して遂行され得る。
いくつかの実施形態において、核酸は、逆転写酵素－ＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない方法によってシーケンスされ得る。
定量化
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の体液に由来する場合に、本発明の核酸はエクソソームで定量化され得る。体液としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、関節液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または先走り液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸水及び腹水、心嚢液、リンパ、糜汁、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞空洞体液、ならびに臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、大腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
アッセイは、コンストラクト特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析またはその組み合わせを使用して遂行され得る一方で、エクソソームは、免疫組織化学法（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法等）を使用して単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノメンブレン限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはその組み合わせによっても単離され得る。
これらの方法は、残存するかまたは送達された核酸のレベルをリアルタイムでモニタリングする能力を治験担当医師に与える。本開示の核酸が、いくつかの実施形態において、構造的修飾または化学修飾に起因して内在性形態とは異なるので、これは可能である。
いくつかの実施形態において、核酸は、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等であるがこれらに限定されない方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであるかを決定し、核酸の分解が起こっていないことをチェックするために、分析され得る。核酸の分解は、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法（強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等であるがこれらに限定されない）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等であるがこれらに限定されない方法によってチェックされ得る。
医薬製剤
例えばヒト及び他の哺乳動物におけるＥＢＶの予防または治療のための、組成物（例えば医薬組成物）、方法、キット及び試薬が本明細書において提供される。ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは治療剤または予防剤として使用され得る。それらを医薬品中で使用して、感染性疾患を予防及び／または治療することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるようなＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＥＢＶワクチンは、対象（例えばヒト対象等の哺乳動物対象）へ投与することができ、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて抗原性ポリペプチド（抗原）を産生する。
ＥＢＶワクチンの「有効量」は、標的組織、標的細胞タイプ、投与の手段、ＲＮＡの物理的特徴（例えば長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾されたヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、及び他の決定要素（対象の年齢、体重、身長、性別、及び一般的な健康等）に少なくとも部分的に基づく。典型的には、ＥＢＶワクチンの有効量は、対象の細胞における抗原産生の関数として誘導またはブーストされた免疫応答を提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも、より効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（ＲＮＡワクチンをトランスフェクションした細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増加、核酸分解の減少（例えば修飾されたポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の継続期間の増加によって実証されるように）、あるいは宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変更によって実証され得る。
「医薬組成物」という用語は、活性のある薬剤と、その組成物をインビボまたはエクスビボでの診断用または治療用の使用に特に好適にする不活性または活性のある担体との組み合わせを指す。「薬学的に許容される担体」は、対象へまたは対象上に投与された後に、所望されない生理的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、担体が活性成分と適合性があり、活性成分を安定化することが可能であるという意味でも、「許容され」なくてはならない。１つまたは複数の可溶化剤は、活性のある薬剤の送達のための医薬用担体として利用され得る。薬学的に許容される担体の例としては、投薬形態として使用可能な組成物を達成する、生体適合性のあるベヒクル、アジュバント、添加物及び希釈剤が挙げられるがこれらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用の担体及び希釈剤に加えてそれらの使用のための医薬用必需品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中で記載される。
いくつかの実施形態において、本開示に従うＲＮＡワクチン（ポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを包含する）は、ＥＢＶの治療または予防のために使用され得る。ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、健康な個体への能動免疫スキームの一部として、またはインキュベーション相の間の感染の初期、または症状の開始後の活動性感染の間に、予防的にまたは治療的に投与され得る。いくつかの実施形態において、細胞、組織または対象への提供された本開示のＲＮＡワクチンの量は、免疫予防のために有効な量であり得る。
ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与され得る。非限定例として、予防化合物または治療化合物はアジュバントまたはブースターであり得る。本明細書において使用される時、予防組成物（ワクチン等）を指す場合に、「ブースター」という用語は、予防（ワクチン）組成物の余剰の投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の初期投与後に与えられ得る。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与の時間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１８か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年以上であり得るがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与の時間は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月または１年であり得るがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、当技術分野において公知の不活性化ワクチンの投与に類似して、筋肉内、鼻内または皮内で投与され得る。
ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、感染の罹患率、または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに依存して、様々な設定において利用され得る。非限定例として、ＲＮＡワクチンを利用して、様々な感染性疾患を治療及び／または予防することができる。ＲＮＡワクチンは、それらが商業的に入手可能なワクチンよりも、はるかに高い抗体力価を産生する、より良好な中和免疫、より持続性の免疫応答を産生する、及び／または、応答をより早く産生するという点で優れた特性を有する。
ＥＢＶ ＲＮＡワクチン及びＲＮＡワクチン組成物及び／または複合体を、随意に、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物が本明細書において提供される。
ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、単独でまたは１つもしくは複数の他の構成要素と併用して、製剤化または投与され得る。例えば、ＥＢＶ ＲＮＡワクチン（ワクチン組成物）は、他の構成要素（アジュバントが挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンはアジュバントを含まない（それらはアジュバント不含有である）。
ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、製剤化または投与され得る。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質（例えば治療活性のある物質、予防活性のある物質、または両方の組み合わせ等）を含む。ワクチン組成物は、滅菌され得るか、発熱性物質不含有であり得るか、または滅菌され且つ発熱性物質不含有の両方であり得る。医薬用薬剤（ワクチン組成物等）の製剤化及び／または製造における一般的な考慮は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体は参照することによって本明細書に援用される）中で見出され得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、ヒト、ヒト患者または対象へ投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般的にはＲＮＡワクチンまたはその中に含有されるポリヌクレオチド（例えば抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡポリヌクレオチド））を指す。
本明細書において記載されるワクチン組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分（例えばｍＲＮＡのポリヌクレオチド）を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の補助成分と一緒にし、次いで必要であるならば及び／または所望されるならば、産物を所望される単回用量単位または多用量単位へと、分割、成形及び／またはパッケージングするステップを含む。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または条件に依存して、ならびに組成物が投与される経路にさらに依存して、変動するだろう。一例として、組成物は、０．１％～１００％の間（例えば０．５～５０％の間、１～３０％の間、５～８０％の間、少なくとも８０％）（ｗ／ｗ）で、活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションを増加させる；（３）継続放出もしくは遅延放出を可能にする（例えばデポー製剤からの）；（４）生体内分布を変更する（例えば特異的な組織または細胞のタイプへ標的化する）；（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させる；及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロフィールをインビボで変更する。従来の賦形剤（任意の及びすべての溶媒、分散溶媒、希釈剤または他の液体ベヒクル、分散または懸濁の補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、防腐剤等）に加えて、賦形剤としては、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンによりトランスフェクションされる細胞（例えば対象の中への移植のための）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びその組み合わせが、限定されずに挙げられ得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には対象の核酸カーゴと一緒に、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びＰＥＧ脂質構成要素を含む。本開示の脂質ナノ粒子は、一般的に当技術分野において公知であるような、構成要素、組成物及び方法を使用して生成され得、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい（そのすべてはその全体を参照することによって本明細書に援用される）。
本開示のワクチンは、典型的には脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、モル比で、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％または５０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２０％、３０％、４０％、５０または６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、５～２５％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、モル比で、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％または２０～２５％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、５％、１０％、１５％、２０％または２５％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２５～５５％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、モル比で、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％または５０～５５％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５５％のステロールを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、モル比で、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％または１０～１５％を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のイオン化可能なカチオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各々のｎは、１、２、３、４及び５から独立して選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、以下の通りであるもの包含し、式中、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合に、そのとき、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５である場合にＱは－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または、（ｉｉ）ｎが１もしくは２である場合にＱは５員、６員もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下の通りであるもの、またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノアルキルアミノまたはジアルキルアミノ及びＣ１－３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基により置換される、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各々のｎは、１、２、３、４及び５から独立して選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下の通りであるもの、またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各々のｎは、１、２、３、４及び５から独立して選択され；Ｑが５員～１４員のヘテロ環であって、且つ（ｉ）Ｒ４は（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは１または２）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４は（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、ｎは１）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４はＣＨＱＲ及びＣＱ（Ｒ）２である場合に、そのとき、Ｑは、５員～１４員のヘテロアリールまたは８員～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下の通りであるもの、またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各々のｎは、１、２、３、４及び５から独立して選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下の通りであるもの、またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは３、４及び５から選択される）であり；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下の通りであるもの、またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、または、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２（式中、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは１、２、３、４及び５から選択される）からなる群から選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３－６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの：
またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱ（式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである）であり；Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの：
またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、ｌは、１、２、３、４及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは、２、３または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである）であり；Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル及びＣ２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）のもの：
またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、Ｒ４は本明細書において記載される通りである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）のもの：
またはその塩もしくは異性体を包含し、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”及びＲ２～Ｒ６は本明細書において記載される通りである。例えば、各々のＲ２及びＲ３は、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のイオン化可能なカチオン性脂質は、以下の構造を有する化合物：
を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のイオン化可能なカチオン性脂質は、以下の構造を有する化合物：
を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン，１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びその混合物を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びその混合物を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態において、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びその混合物を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なカチオン性脂質を含み、そこで、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、その構造的脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧである。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のイオン化可能なカチオン性脂質構成要素対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約２０：１のイオン化可能なカチオン性脂質構成要素対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約１０：１のイオン化可能なカチオン性脂質構成要素対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。
いくつかの実施形態において、本開示のＬＮＰは、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。
多価ワクチン
本明細書において提供されるＥＢＶワクチンは、同じまたは異なるＥＢＶ種の２つ以上の抗原をコードする、１つのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）または複数のＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＢ抗原、ｇｐ４２抗原、ＬＭＰ１抗原、ＬＭＰ２抗原、ＥＢＮＡ１抗原及びＥＢＮＡ３抗原から選択される２つ以上の抗原をコードする、１つのＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンのＲＮＡ（少なくとも１つのＲＮＡ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びｇＨ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びｇＬ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びｇＢ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原及びｇＬ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原及びｇＢ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＨ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＬ抗原及びｇＢ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＬ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＬ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＬ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＢ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＢ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇＢ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇｐ４２抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ｇｐ４２抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ３５０抗原、ＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＨ抗原及びｇＬ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＨ抗原及びｇＢ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＨ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＨ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＨ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＬ抗原及びｇＢ抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＬ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＬ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＬ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＢ抗原及びｇｐ４２抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＢ抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇＢ抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ４２抗原及びＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ｇｐ４２抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、ＬＭＰ（例えばＬＭＰ１及び／またはＬＭＰ２）抗原及びＥＢＮＡ（例えばＥＢＮＡ１及び／またはＥＢＮＡ３）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、同じ脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。他の実施形態において、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡは、分離した脂質ナノ粒子中に製剤化され得る（各々のＲＮＡは単一の脂質ナノ粒子中に製剤化される）。次いで、脂質ナノ粒子は、単一ワクチン組成物（例えば複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含む）として組み合わせられて投与され得るか、または分離して投与され得る。
組み合わせワクチン
本明細書において提供されるＥＢＶワクチンは、同じまたは異なるＥＢＶ株の２つ以上の抗原をコードする、１つのＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。１つまたは複数のＥＢＶ抗原（複数可）及び異なる生物体（例えば細菌生物体及び／またはウイルス生物体）の１つまたは複数の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む組み合わせワクチンも、本明細書において提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つもしくは複数の抗原または異なる株／種の１つもしくは複数の抗原（例えば同じ地理的領域（そこではＥＢＶ感染のリスクが高い）中で見出される生物体、またはＥＢＶへ曝露された場合に個体がおそらく曝露される生物体に対する免疫を誘導する抗原）を標的化する、組み合わせワクチンであり得る。
投薬／投与
ヒト及び他の哺乳動物におけるＥＢＶの予防及び／または治療のための、組成物（例えば医薬組成物）、方法、キット及び試薬が本明細書において提供される。ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは治療剤または予防剤として使用され得る。いくつかの態様において、本開示のＲＮＡワクチンを使用して、ＥＢＶからの予防保護を提供する。いくつかの態様において、本開示のＲＮＡワクチンを使用して、ＥＢＶ感染を治療する。いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンを免疫エフェクター細胞のプライミング中に使用して、例えば末梢血中単核細胞（ＰＢＭＣ）をエクスビボで活性化し、次いでそれは対象の中へ点滴される（再点滴される）。
対象は、任意の哺乳動物（非ヒト霊長動物及びヒト対象が挙げられる）であり得る。典型的には、対象はヒト対象である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンは、抗原特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で、対象（例えばヒト対象等の哺乳動物対象）へ投与される。ＥＢＶ抗原をコードするＲＮＡは、インビボで発現及び翻訳されて、抗原を産生し、次いでそれは対象において免疫応答を刺激する。
ＥＢＶからの予防保護は、本開示のＥＢＶ ＲＮＡワクチンの投与に続いて達成され得る。ワクチンは１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与され得るが、ワクチンを１回投与すること（随意に、続いて単回のブースター）でおそらく十分である。あまり所望されるものではないが、感染した個体へワクチンを投与して治療応答を達成することが可能である。投薬は、応じて調整される必要があり得る。
ＥＢＶに対する対象の免疫応答を惹起する方法は、本開示の態様において提供される。本方法は、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含むＥＢＶ ＲＮＡワクチンを対象へ投与すること、それによって、対象においてＥＢＶ抗原へ特異的な免疫応答を誘導することを包含し、そこで、対象における抗抗原抗体の力価は、予防的有効用量の、ＥＢＶに対する従来のワクチンによりワクチン接種した対象における抗抗原抗体の力価に比べて、ワクチン接種後に増加される。「抗抗原抗体」は、抗原へ特異的に結合する血清抗体である。
予防的に有効な用量は、臨床的に許容されるレベルでウイルスによる感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態において、有効用量は、パッケージ挿入物中で、ワクチンのためにリストされる用量である。従来のワクチンは、本明細書において使用される時、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、生微生物ワクチン、殺菌微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン等が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、従来のワクチンとは、国立の薬物規制団体（例えば米国におけるＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＭＡ））によって規制認可された及び／または登録されたワクチンである。
いくつかの実施形態において、対象における抗抗原抗体の力価は、予防的に有効な用量の、ＥＢＶに対する従来のワクチンによりワクチン接種した対象、またはワクチン接種をしていない対象における抗抗原抗体の力価に比べて、ワクチン接種後に１ ｌｏｇ～１０ ｌｏｇで増加される。いくつかの実施形態において、対象における抗抗原抗体の力価は、予防的に有効な用量の、ＥＢＶに対する従来のワクチンによりワクチン接種した対象、またはワクチン接種をしていない対象における抗抗原抗体の力価に比べて、ワクチン接種後に１ ｌｏｇ、２ ｌｏｇ、３ ｌｏｇ、４ ｌｏｇ、５ ｌｏｇまたは１０ ｌｏｇで増加される。
ＥＢＶに対する対象の免疫応答を惹起する方法は、本開示の他の態様において提供される。本方法は、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＥＢＶ ＲＮＡワクチンを対象へ投与すること、それによって、対象においてＥＢＶ抗原へ特異的な免疫応答を誘導することを包含し、そこで、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンに比べて２倍～１００倍の投薬量レベルでＥＢＶに対する従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンに比べて２倍の投薬量レベルで従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンに比べて３倍の投薬量レベルで従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンに比べて４倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンに比べて１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンに比べて１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンによりワクチン接種した対象における免疫応答に同等である。
他の実施形態において、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価の決定によって査定される。他の実施形態において、免疫された対象からの血清または抗体の能力は、ウイルス取込みを中和するかまたはヒトＢリンパ球のＥＢＶ形質転換を低減させる、能力について試験される。他の実施形態において、着実なＴ細胞応答（複数可）を増進する能力は、当技術分野で認められている技法を使用して測定される。
他の態様において、本開示は、少なくとも１つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＥＢＶ ＲＮＡワクチンを対象へ投与すること、それによって、対象においてＥＢＶ抗原へ特異的な免疫応答を誘導することによって、対象においてＥＢＶに対する免疫応答を惹起する方法を提供し、そこで、対象における免疫応答は、予防的に有効な用量の、ＥＢＶに対する従来のワクチンによりワクチン接種した対象において誘導された免疫応答に比べて、２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンに比べて２倍～１００倍の投薬量レベルでの予防的に有効な用量の従来のワクチンによりワクチン接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防的に有効な用量の従来のワクチンによりワクチン接種した対象において誘導された免疫応答に比べて、２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間または１０週間早く誘導される。
第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＥＢＶ ＲＮＡワクチンを対象へ投与することによって、ＥＢＶに対する対象における免疫応答を惹起する方法も、本明細書において提供され、そこで、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化エレメントを含まず、アジュバントはワクチンと共製剤化または共投与されない。
ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、治療的に有効なアウトカムをもたらす任意の経路によって投与され得る。これらは、皮内投与、筋肉内投与、鼻内投与、及び／または皮下投与を包含するがこれらに限定されない。本開示は、ＲＮＡワクチンをそれを必要とする対象へ投与することを含む方法を提供する。要求される正確な量は、対象の種、年齢及び一般的な条件、その疾患の重症度、特定の組成物、投与様式、活性様式、ならびに同種のものに依存して、対象間で変動するだろう。ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、投与の容易性及び投薬量の均一性のために、典型的には投薬量単位形態で製剤化される。しかしながら、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物の合計の１日の使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定され得ることは理解されるだろう。任意の特定の患者のための具体的な治療的に有効な用量レベル、予防的に有効な用量レベル、または適切な画像化用量レベルは、治療されている障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食餌；用いられる具体的な化合物の投与時間、投与経路及び排泄率；治療の継続時間；用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野において周知の同種の因子を包含する様々な因子に依存するだろう。
本明細書において提供されるＥＢＶワクチンの有効量は、例えば単回用量として２０μｇ程でまたは２回の１０μｇ用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、有効量は２０μｇ～２００μｇの全用量である。例えば、有効量は、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇまたは２００μｇの全用量であり得る。いくつかの実施形態において、有効量は２５μｇ～２００μｇの全用量である。いくつかの実施形態において、有効量は５０μｇ～２００μｇの全用量である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、１日当たり、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの対象体重の投薬量を送達するのに十分なレベルで、１日につき、１週間あたり、１か月あたり等で１回または複数回投与されて、所望される治療有効性、診断有効性、予防有効性または画像化有効性を得ることができる（例えば国際公開ＷＯ２０１３０７８１９９（その全体は参照することによって本明細書に援用される）中で記載される単位用量の範囲を参照）。所望される投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日ごとに、毎週、２週間ごとに、３週間ごとに、４週間ごとに、２か月ごとに、３か月ごとに、６か月ごとに等で、送達されるだろう。ある特定の実施形態において、所望される投薬量は、複数の投与（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数の投与が用いられる場合に、分割投薬レジメン（本明細書において記載されるもの等）が使用され得る。例示的な実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇ）の投薬量を送達するのに十分なレベルで投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの投薬量を送達するのに十分なレベルで１回または２回（またはそれ以上）投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、２回（例えば０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３か月後、０日目及び６か月後、０日目及び９か月後、０日目及び１２か月後、０日目及び１８か月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇの全用量で、またはそれらの全用量を送達するのに十分な投薬量レベルで、投与され得る。より高い投薬量及び投与の頻度ならびにより低い投薬量及び投与の頻度は、本開示によって網羅される。例えば、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、３回または４回投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、２回（例えば０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３か月後、０日目及び６か月後、０日目及び９か月後、０日目及び１２か月後、０日目及び１８か月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後、または０日目及び１０年後）、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇまたは０．４００ｍｇの全用量で、またはそれらの全用量を送達するのに十分な投薬量レベルで、投与され得る。
いくつかの実施形態において、対象をワクチン接種する方法における使用のためのＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの間の核酸ワクチンの単回投薬量の、対象をワクチン接種するのに有効な量で、対象へ投与される。いくつかの実施形態において、対象をワクチン接種する方法における使用のためのＲＮＡワクチンは、１０μｇ～４００μｇの間の核酸ワクチンの単回投薬量の、対象をワクチン接種するのに有効な量で、対象へ投与される。いくつかの実施形態において、対象をワクチン接種する方法における使用のためのＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、２５～１０００μｇの単回投薬量（例えばＥＢＶ抗原をコードするｍＲＮＡの単回投薬量）として、対象へ投与される。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇの単回投薬量として、対象へ投与される。例えば、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、２５～１００、２５～５００、５０～１００、５０～５００、５０～１０００、１００～５００、１００～１０００、２５０～５００、２５０～１０００または５００～１０００μｇの単回用量として、対象へ投与され得る。いくつかの実施形態において、対象をワクチン接種する方法における使用のためのＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンは、２回の投薬量として対象へ投与され、その組み合わせは、２５～１０００μｇのＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンと等しい。
本明細書において記載されるＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、本明細書において記載される投薬形態（鼻内、気管内、または注射可能（例えば静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内及び皮下）等）へと製剤化することができる。
ワクチン有効性（ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）
本開示のいくつかの態様は、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの製剤化を提供し、そこで、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンは、対象における抗原特異的免疫応答を産生する（例えば抗ＥＢＶ抗原への特異的な抗体の産生）有効量で製剤化される。「有効量」は、抗原特異的免疫応答を産生するのに有効なＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの用量である。対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書において提供される。
本明細書において使用される時、本発明のワクチンまたはＬＮＰへの免疫応答は、ワクチン中に存在する（１つまたは複数の）ＥＢＶタンパク質（複数可）への液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答の対象における発達である。本発明の目的のために、「液性」免疫応答は、抗体分子（例えば分泌性（ＩｇＡ）分子またはＩｇＧ分子を包含する）によって媒介される免疫応答を指す一方で、「細胞性」免疫応答は、Ｔリンパ球（例えばＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えばＣＴＬ））及び／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を包含する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされ細胞の表面上で発現されるタンパク質と会合して提示されるペプチド抗原についての特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊またはかかる微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び増進することを支援する。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、表面上でＭＨＣ分子と会合してペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激及び活性の集中を支援するように作用する。細胞性免疫応答は、サイトカイン、ケモカイン、及び活性化されたＴ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に由来するものが挙げられる）によって産生される他のかかる分子の産生も導く。
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、本明細書において提供されるＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンを接種された対象において産生される抗ＥＢＶ抗原抗体力価の測定によって特徴づけられる。抗体力価とは、対象内の抗体（例えば特定の抗原（例えば抗ＥＢＶ抗原）または抗原のエピトープへ特異的な抗体）の量の測定値である。抗体力価は、典型的には陽性の結果を提供する最も大きな希釈の逆数として表現される。例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、抗体力価の決定のための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態において、抗体力価を使用して、対象が感染を有するかどうかを査定するか、または免疫が要求されるかどうかを決定する。いくつかの実施形態において、抗体力価を使用して、自己免疫応答の強さを決定する、追加免疫が必要かどうかを決定する、以前のワクチンが有効だったかどうかを決定する、及び任意の最近または以前の感染を同定する。本開示によれば、抗体力価を使用して、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンによって対象において誘導された免疫応答の強さを決定することができる。
いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも１ ｌｏｇ分増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５または少なくとも３ ｌｏｇ分増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、１、１．５、２、２．５または３ ｌｏｇ分増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、１～３ ｌｏｇ分増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３または２．５～３ ｌｏｇ分増加し得る。
いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、２～１０倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９または９～１０倍増加する。
対照は、いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンを接種されていない対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価である。いくつかの実施形態において、対照は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンを投与した対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、典型的には異種発現系（例えば細菌または酵母）において産生されたかまたは多量の病原体から精製された、タンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンが有効である能力は、マウスモデルにおいて測定される。例えば、ＥＢＶワクチンはマウスモデルへ投与され、そのマウスモデルは中和抗体力価の誘導についてアッセイされ得る。ウイルス攻撃投与研究も、本開示のワクチンの有効性を査定するために使用され得る。例えば、ＥＢＶワクチンはマウスモデルへ投与され、そのマウスモデルはＥＢＶにより攻撃投与され、そのマウスモデルは生存及び／または免疫応答（例えば中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えばサイトカイン応答））についてアッセイされ得る。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量に比較して、低減された用量である。本明細書において提供される「標準治療」は、医学的または心理学的な治療のガイドラインを指し、一般的または特異的であり得る。「標準治療」は、所与の病態の治療に関与する科学的証拠及び医療専門家間の共同研究に基づいて、適切な治療を規定する。これは、医師／臨床医が、ある特定のタイプの患者、病気または臨床的な状況について従うべき診断プロセス及び治療プロセスである。本明細書において提供される「標準治療用量」は、組換えもしくは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンの用量を指し、医師／臨床医または他の医療専門家は、ＥＢＶ（またはＥＢＶ関連病態）を治療または予防するために、ＥＢＶ（またはＥＢＶ関連病態）の治療または予防のための標準治療ガイドラインに従いながら、これらを対象へ投与するだろう。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量が投与された対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、標準治療用量の組換えもしくは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチン、生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンが投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価に同等である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の少なくとも２分の１への低減に同等な用量である。例えば、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１または少なくとも１０分の１への低減に同等な用量であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１または少なくとも１０００分の１への低減に同等な用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２５０、５００、または１０００分の１への低減に同等な用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡワクチンの有効量が投与された対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、標準治療用量の組換えもしくはタンパク質のＥＢＶタンパク質ワクチン、生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンが投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価に同等である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えまたは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の２分の１～１０００分の１（例えば２分の１～１００分の１、１０分の１～１０００分の１）への低減に同等な用量であり、そこで、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、標準治療用量の組換えもしくは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチン、生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンを投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価に同等である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の２～１０００、２～９００、２～８００、２～７００、２～６００、２～５００、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００、２～９０、２～８０、２～７０、２～６０、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０００、３～９００、３～８００、３～７００、３～６００、３～５００、３～４００、３～３００、３～２００、３～１００、３～９０、３～８０、３～７０、３～６０、３～５０、３～４０、３～３０、３～２０、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０００、４～９００、４～８００、４～７００、４～６００、４～５００、４～４００、４～３００、４～２００、４～１００、４～９０、４～８０、４～７０、４～６０、４～５０、４～４０、４～３０、４～２０、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、４～４、５～１０００、５～９００、５～８００、５～７００、５～６００、５～５００、５～４００、５～３００、５～２００、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４０、５～３０、５～２０、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０００、６～９００、６～８００、６～７００、６～６００、６～５００、６～４００、６～３００、６～２００、６～１００、６～９０、６～８０、６～７０、６～６０、６～５０、６～４０、６～３０、６～２０、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０００、７～９００、７～８００、７～７００、７～６００、７～５００、７～４００、７～３００、７～２００、７～１００、７～９０、７～８０、７～７０、７～６０、７～５０、７～４０、７～３０、７～２０、７～１０、７～９、７～８、８～１０００、８～９００、８～８００、８～７００、８～６００、８～５００、８～４００、８～３００、８～２００、８～１００、８～９０、８～８０、８～７０、８～６０、８～５０、８～４０、８～３０、８～２０、８～１０、８～９、９～１０００、９～９００、９～８００、９～７００、９～６００、９～５００、９～４００、９～３００、９～２００、９～１００、９～９０、９～８０、９～７０、９～６０、９～５０、９～４０、９～３０、９～２０、９～１０、１０～１０００、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～６００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～１０００、２０～９００、２０～８００、２０～７００、２０～６００、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、３０～１０００、３０～９００、３０～８００、３０～７００、３０～６００、３０～５００、３０～４００、３０～３００、３０～２００、３０～１００、３０～９０、３０～８０、３０～７０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～１０００、４０～９００、４０～８００、４０～７００、４０～６００、４０～５００、４０～４００、４０～３００、４０～２００、４０～１００、４０～９０、４０～８０、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～１０００、６０～９００、６０～８００、６０～７００、６０～６００、６０～５００、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～１０００、７０～９００、７０～８００、７０～７００、７０～６００、７０～５００、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～１０００、８０～９００、８０～８００、８０～７００、８０～６００、８０～５００、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００、８０～９０、９０～１０００、９０～９００、９０～８００、９０～７００、９０～６００、９０～５００、９０～４００、９０～３００、９０～２００、９０～１００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００、４００～１０００、４００～９００、４００～８００、４００～７００、４００～６００、４００～５００、５００～１０００、５００～９００、５００～８００、５００～７００、５００～６００、６００～１０００、６００～９００、６００～８００、６００～７００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～１０００、８００～９００、または９００～１０００分の１への低減に同等な用量である。いくつかの実施形態（前述のもの等）において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、標準治療用量の組換えもしくは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチン、生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンを投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価に同等である。いくつかの実施形態において、有効量は、組換えＥＢＶタンパク質ワクチンの標準治療用量の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１２８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００分の１への低減に同等な（または少なくともそれらに同等な）用量である。いくつかの実施形態（前述のもの等）において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、標準治療用量の組換えもしくは精製されたＥＢＶタンパク質ワクチン、生弱毒化もしくは不活性化ＥＢＶワクチン、またはＥＢＶ ＶＬＰワクチンを投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価に同等である。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０～１０００μｇの全用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～１０００、６０～９００、６０～８００、６０～７００、６０～６００、６０～５００、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～１０００、７０～９００、７０～８００、７０～７００、７０～６００、７０～５００、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～１０００、８０～９００、８０～８００、８０～７００、８０～６００、８０～５００、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００、８０～９０、９０～１０００、９０～９００、９０～８００、９０～７００、９０～６００、９０～５００、９０～４００、９０～３００、９０～２００、９０～１００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００、４００～１０００、４００～９００、４００～８００、４００～７００、４００～６００、４００～５００、５００～１０００、５００～９００、５００～８００、５００～７００、５００～６００、６００～１０００、６００～９００、６００～９００、６００～７００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～１０００、８００～９００、または９００～１０００μｇの全用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇの全用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、合計で２回対象へ投与される、２５～５００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、合計で２回対象へ投与される、２５～５００、２５～４００、２５～３００、２５～２００、２５～１００、２５～５０、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、１５０～５００、１５０～４００、１５０～３００、１５０～２００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、２５０～５００、２５０～４００、２５０～３００、３００～５００、３００～４００、３５０～５００、３５０～４００、４００～５００または４５０～５００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、合計で２回対象へ投与される、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇの全用量である。
ワクチン有効性はスタンダードの分析を使用して査定され得る（例えばＷｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検無作為化対照臨床試験によって測定され得る。ワクチン有効性は、ワクチン接種無しの（ＡＲＵ）研究コホートとワクチン接種した（ＡＲＶ）研究コホートとの間の疾患発生率（ＡＲ）における比例的な低減として表現され、以下の式の使用により、ワクチン接種した群の中での疾患の相対リスク（ＲＲ）から計算することができる。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００；及び
有効性＝（１－ＲＲ）×１００。
同様に、ワクチン効果（ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）はスタンダードの分析を使用して査定され得る（例えばＷｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。ワクチン効果は、ワクチン（それは高いワクチン有効性を有することが既に証明されているかもしれない）が、どのように集団中の疾患を低減させるかの査定である。この測定は、対照臨床試験においてではなく天然の現場条件下で、ワクチンそれ自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益及び副作用の正味のバランスを査定することができる。ワクチン効果は、ワクチン有効性（効力）に比例するが、集団中の標的群がどのくらい十分に免疫されるかによって、それに加えて、入院、外来通院または費用の「現実世界の」アウトカムに影響を及ぼす他のワクチン非関連の因子によって、影響を受ける。例えば、レトロスペクティブな症例対照分析が使用され、そこで感染症例及び適切な対照のセットの中のワクチン接種の率が比較される。ワクチン効果は、ワクチン接種にもかかわらず感染を発症することについてのオッズ比（ＯＲ）を使用して、率差として表現され得る。
効果＝（１－ＯＲ）×１００。
いくつかの実施形態において、ＥＢＶワクチンの有効性は、ワクチン接種をしていない対照対象に比べて、少なくとも６０％である。例えば、ＥＢＶワクチンの有効性は、ワクチン接種をしていない対照対象に比べて、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％であり得る。
殺菌免疫。殺菌免疫は、宿主の中へ有効な病原体感染を予防するユニークな免疫状態を指す。いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンの有効量は、少なくとも１年間の対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、本開示のＥＢＶワクチンの有効量は、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年または少なくとも５年間の対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンの有効量は、対照と比較して、少なくとも５分の１の低い用量で対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、有効量は、対照と比較して、少なくとも１０分の１、１５分の１または２０分の１の低い用量で対象における殺菌免疫を提供するのに十分であり得る。
検出可能抗原。いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンの有効量は、投与後１～７２時間で対象の血清において測定される時、検出可能レベルのＥＢＶ抗原を産生するのに十分である。
力価。抗体力価とは、対象内の抗体（例えば特定の抗原（例えば抗ＥＢＶ抗原）へ特異的な抗体）の量の測定である。抗体力価は、典型的には陽性の結果を提供する最も大きな希釈の逆数として表現される。例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、抗体力価の決定のための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態において、本開示のＥＢＶワクチンの有効量は、投与後１～７２時間で対象の血清において測定される時、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生された、１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態において、有効量は、投与後１～７２時間で対象の血清において測定される時、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生された、１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態において、有効量は、投与後１～７２時間で対象の血清において測定される時、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生された、５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は少なくとも１００ＮＴ５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ＮＴ５０であり得る。いくつかの実施形態において、中和抗体力価は少なくとも１０，０００ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、１ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）あたり少なくとも１００の中和単位である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも１ ｌｏｇ分増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ ｌｏｇ分増加し得る。
いくつかの実施形態において、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照に比べて、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０倍増加する。
いくつかの実施形態において、幾何平均（それはｎ個の数の積のｎ乗根である）は、比例増加を記載するために一般的には使用される。幾何平均は、いくつかの実施形態において、対象で産生された抗体力価を特徴づけるために使用される。
対照は、例えばワクチン接種をしていない対象、または生弱毒化ＥＢＶワクチン、不活性化ＥＢＶワクチンもしくはタンパク質サブユニットＥＢＶワクチンが投与された対象であり得る。
実施例１
ＥＢＶ糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）バリアントを産生し、それらの発現をＨｅＬａ細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞に、ＥＢＶ糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）バリアントの各々をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５、１８２、２０７及び２０８）を２４時間一過性にトランスフェクションした。ｇｐ３５０中の立体配座的エピトープに結合するＥＢＶ中和抗体（「７２Ａ１」）を使用する、フローサイトメトリー分析（図１Ａ、１μｇ用量のｍＲＮＡ）及び免疫アッセイ（図１Ｂ、１μｇ用量のｍＲＮＡ；図１Ｃ、０．５μｇ用量のｍＲＮＡ）は、試験されたすべてのＥＢＶ ｇｐ３５０バリアントが、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面で同等な発現を示すことを実証する。特別に述べられない限り、すべてのｍＲＮＡのワクチンは、化合物１脂質、例えば２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む、脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
実施例２
２つの異なる５’ＵＴＲ配列を備えたＥＢＶ ｇｐ３５０ ｍＲＮＡの配列（配列番号：８１及び２０４）を産生し、それらの発現をＨｅＬａ細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞に、０．５μｇ用量の、ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原をコードするｍＲＮＡを、２４時間一過性にトランスフェクションした。抗７２Ａ１の抗体を使用するフローサイトメトリー分析（図２Ａ）及び免疫アッセイ（図２Ｂ）は、試験された両方のＥＢＶ ｇｐ３５０ ｍＲＮＡのコンストラクトが、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面で同等な発現を示すことを実証する。
実施例３
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、脂質ナノ粒子中に製剤化された、ＥＢＶ ｇｐ３５０バリアントをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５、１８２、２０７及び２０８）を含むＥＢＶワクチンを、筋肉内にワクチン接種した。２μｇの用量を１日目及び再び２２日目に投与した。２１日目及び４３日目にマウスから採血した。結果は、ワクチン接種後２１日目（プライム後３週間）及び４３日目（ブースト後３週間）で、試験されたすべてのＥＢＶ ｇｐ３５０ワクチンが、血清でｇｐ３５０特異的ＩｇＧ抗体力価を誘導したことを実証する（図３）。
実施例４
追加のＥＢＶ抗原及び抗原複合体を産生し、それらの発現をＨｅＬａ細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞に、０．２５μｇの（１）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）及びＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８９）（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＵＴＲ Ａ）；（２）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０１）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０２）及びＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０３）（ＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＵＴＲ Ｂ）；（３）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）及びｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８９）；または（４）ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８９）を２４時間一過性にトランスフェクションした。抗ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２（２Ｄ４）抗体を使用するフローサイトメトリー分析（図４Ａ）及び免疫アッセイ（図４Ｂ）は、試験されたすべてのＥＢＶ ｍＲＮＡのコンストラクトが、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の表面で同等な発現を示すことを実証する。
実施例５
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、（１）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）及びＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８９）；（２）ＥＢＶ ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）；または（３）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８９）及びＥＢＶ ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）を含むＥＢＶワクチンを、筋肉内にワクチン接種した。２μｇの用量を１日目及び再び２９日目に投与した。２８日目及び５７日目にマウスから採血した。結果は、ワクチン接種後２８日目（プライム後４週間）及び５７日目（ブースト後４週間）で、試験されたすべてのＥＢＶワクチンが、中和抗体力価を誘導したことを実証する（図５）。
実施例６
ＨｅＬａ細胞に、０．５μｇの（１）ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０１）及びＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０２）；または（２）ＥＢＶ ｇＨをのみコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０１）を２４時間一過性にトランスフェクションした。抗ｇＨ／ｇＬ（２Ａ８）抗体または抗ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２（２Ｄ４）抗体を使用するフローサイトメトリー分析（図６Ａ）は、ＨｅＬａ細胞の表面上で発現されたＥＢＶ ｇＬへ２Ａ８抗体が特異的に結合することを実証する（実施例４において提示されたデータに比較して）。０．２５μｇの（１）ＥＢＶ ｇＨをコードするＥＢＶ ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）及びＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）；または（２）ＥＢＶ ｇＨをコードするＥＢＶ ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０１）及びＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０２）のいずれかによる２４時間のトランスフェクション後の免疫アッセイは、ＨｅＬａ細胞の表面で両方のＥＢＶ抗原複合体の匹敵する発現を示す。
実施例７
３つの追加の免疫原性の研究を、本開示の様々なｍＲＮＡのワクチン（脂質ナノ粒子中に製剤化された）及び様々な抗原特異的抗体を使用して遂行した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、（１）５μｇ用量もしくは１μｇ用量のＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）及びＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）；（２）７．５μｇ用量もしくは１．５μｇ用量のＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）及びＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０９）；（３）７．５μｇ用量もしくは１．５μｇ用量のＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）及びＥＢＶ ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）；または（４）１０μｇ用量もしくは２μｇ用量のＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２０９）及びＥＢＶ ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）を、筋肉内にワクチン接種した。５７日目にマウスから採血した。抗ｇＨ／ｇＬ抗体（図７）、抗ｇＢ抗体（図８）または抗ｇｐ３５０抗体（図９）による検出に続く結果は、ＥＢＶ抗原特異的中和抗体の誘導を実証する。
実施例８
マウスに、２μｇ用量の４つのＥＢＶ潜伏遺伝子のうちの１つをコードするｍＲＮＡ（ＬＭＰ１（配列番号：１７９）、ＬＭＰ２（配列番号：１８１）、ＥＢＮＡ１Δ１－４００（配列番号：１７８）またはＥＢＮＡ３Ａ（配列番号：１７７））または４つのｍＲＮＡのワクチンすべての組み合わせ（ＬＭＰ１（配列番号：１７９）、ＬＭＰ２（配列番号：１８１）、ＥＢＮＡ１Δ１－４００（配列番号：１７８）及びＥＢＮＡ３Ａ（配列番号：１７７））を、ワクチン接種した。細胞をワクチン接種したマウスから収穫し、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１またはＥＢＮＡ３Ａペプチドにより刺激した。すべてのペプチドライブラリーは、１１アミノ酸でオーバーラップする１５ｍｅｒのペプチドを含む。ＣＤ８ Ｔ細胞応答を図１０Ａ～１０Ｄ中に示し、ＣＤ４ Ｔ細胞応答を図１１Ａ～１１Ｄ中に示す。
実施例９
ＥＢＶ糖タンパク質Ｈ－糖タンパク質ＬをコードするｍＲＮＡ（ｇＨ－ｇＬ）連結コンストラクト（配列番号：２１８または２２１）を産生し、それらの発現をＨｅＬａ細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞に、異なるリンカーと共に２つのＥＢＶ ｇＨ－ｇＬバリアントをコードするｍＲＮＡ（配列番号：２１８または配列番号：２２１）、またはＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（ＥＢＶ ｇＨ ｍＲＮＡ；配列番号：２２８）及びＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（ＥＢＶ ｇＬ ｍＲＮＡ；配列番号：２２９）を２４時間一過性にトランスフェクションした。ｇＨ中の立体配座的エピトープに結合するＥＢＶ中和抗体の２Ａ８及びＣＬ４０を使用する、フローサイトメトリー分析（図１３Ａ、０．５μｇ用量のＥＢＶ ｇＨ－ｇＬ連結ｍＲＮＡ、または０．２５μｇ用量のＥＢＶ ｇＨ ｍＲＮＡ及びＥＢＶ ｇＬ ｍＲＮＡの各々）及び免疫アッセイ（図１３Ｂ；０．５μｇ用量のｇＨ－ｇＬ連結コンストラクト、または０．２５μｇ用量のｇＨ及びｇＬの各々）は、試験された両方のＥＢＶ ｇＨ－ｇＬコンストラクト（配列番号：２１８及び２２１）がトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の表面で発現を示すことを実証する。
実施例１０
異なる非翻訳領域（ＵＴＲ）の効果を試験するさらなる免疫原性研究において、マウスに、（１）１０μｇの、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）、ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＬＭＰ２抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８１）及びＥＢＮＡ１抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１７８）（転写物の各々はＵＴＲＡを含む）；（２）１０μｇの、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）、ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＬＭＰ２抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８１）及びＥＢＮＡ１抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１７８）（転写物の各々はＵＴＲＢを含む）；（３）２μｇのＵＴＲＢを備えたＥＢＮＡ１抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１７８）；（４）２μｇのＵＴＲＢを備えたＬＭＰ２抗原をコードするｍＲＮＡ；または（５）空の脂質ナノ粒子を含む、脂質ナノ粒子（化合物１脂質、例えば２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む）を、筋肉内にワクチン接種した。マウスに、１日目に１つの用量及び２９日目に第２の用量を投与した。血液サンプルを投薬の直前に及び５７日目に採取した。脾臓を３６日目に動物のサブセットから収集した。細胞をワクチン接種したマウスから収穫し、ＥＢＮＡ１ペプチドライブラリー（図１４）またはＬＭＰ２ライブラリー（図１５）からのペプチドにより刺激した。ペプチドライブラリーライブラリーは、１１アミノ酸でオーバーラップする１５ｍｅｒのペプチドを含んでいた。ＥＢＶ製剤（群１及び２）、ＥＢＮＡ１製剤（群３）及び対照（空のナノ粒子；群５）についてのＣＤ４ Ｔ細胞のサイトカイン応答を、図１４の上部の列において示す。図１４の下部の列はＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。図１５は、ＥＢＶ製剤（群１及び２）、ＬＭＰ２製剤（群４）及び対照（空のナノ粒子；群５）についてのＣＤ４ Ｔ細胞応答（上部の列）及びＣＤ８ Ｔ細胞サイトカイン応答（下部の列）を示す。類似するＴ細胞応答が、使用されるＵＴＲにかかわらず群間で見出された。
実施例１１
コンストラクトを、非ヒト霊長動物（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）モデルにおいて試験した。対象に、（１）２００μｇの、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）、ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＬＭＰ２抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８１）、及びＥＢＮＡ１抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１７８）；（２）５０μｇの、ｇｐ３５０をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８５）、ｇＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８７）、ｇＬをコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８８）、ＬＭＰ２抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１８１）及びＥＢＮＡ１抗原をコードするｍＲＮＡ（配列番号：１７８）；または（３）２００μｇの対照をコードするｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を、筋肉内にワクチン接種した。図１６中で示されるように、対象に、１日目に１つの用量及び２８日目に第２の用量を投与した。血液サンプルを、０、２７、２８、６０、９０、１２０、１５０及び１８０日目に採取した。抗ｇｐ３５０の力価及び抗ｇＨ／ｇＬ抗体の検出後の結果は、増加し持続性の抗ｇｐ３５０抗体及び抗ｇＨ／ｇＬ抗体の力価を、選択した製剤によるワクチン接種がもたらすことを実証する（図１６）。中和抗体力価は高用量で持続性であることが見出されたが、ＥＢＶワクチンの低用量での中和抗体力価の有意な下降が観察された（図１７）。
実施例１２
ＥＢＶワクチン免疫原性に対する様々な下流のプロセスの効果を検討した。ｇｐ３５０（配列番号：１８５）、ｇＨ（配列番号：１８７）及びｇＬ（配列番号：１８８）を含むＥＢＶワクチンを、異なる下流の精製プロセスを使用して合成した。
もたらされたｍＲＮＡを使用して用量を形成し（４つの群の各々について１０μｇ、３μｇ及び１μｇの用量；ＰＢＳを対照群として使用した；ｎ＝８／群）、それらを１日目及び２２日目にマウスへ投与した。血液サンプルを、１、２１、２２、３６、８２及び１４２日目に収集した。ｇｐ２５０（図１８）及びｇＨ／ｇＬ（図１９）についての抗体力価を測定した。
均等物
本明細書において開示されるすべての参照文献、特許及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照することによって援用され、それらは、いくつかの事例において、文書の全体を網羅し得る。
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、相反することが明らかに指摘されない限り、明細書及び請求項中で本明細書において使用される時、「少なくとも１つの」を意味することを理解するべきである。相反することが明らかに指摘されない限り、２つ以上のステップまたは作用を含む本明細書において請求される任意の方法において、方法のステップまたは作用の順序は、必ずしも方法のステップまたは作用が列挙される順序に限定されないことも理解するべきである。
請求項中で、それに加えて上の明細書中で、すべての移行句（「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有すること（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含すること（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持すること（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「で構成されること（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」及び同種のもの等）は、非限定的であること（すなわち、～を包含するがこれらに限定されないこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）を意味すること）が理解される。「～からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「～から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（セクション２１１１．０３）中で記載されるように、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。
数値に先行する「約」及び「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供されるところでは、その範囲の上限と下限との間の各々の値は、本明細書において具体的に企図及び記載される。
国際出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３４８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８２９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１９及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４の全体の内容は、参照することによって本明細書に援用される。
配列リスト
本明細書において記載されるｍＲＮＡの配列のうちの任意のものは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることを理解するべきである。ＵＴＲ配列は以下の配列から選択され得るか、または他の公知のＵＴＲ配列が使用され得る。本明細書において記載されるｍＲＮＡのコンストラクトのうちの任意のものは、ポリＡテイル及び／またはキャップ（例えば７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）をさらに含み得ることも理解するべきである。さらに、本明細書において記載されるｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列の多くがシグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えばＣ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換され得ること、またはシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省かれ得ることを理解するべきである。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号：１）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号：１０４）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号：３）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号：１０６）

Claims (49)

  1. ＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するリボ核酸（ＲＮＡ）を含むエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ワクチンであって、前記ワクチンの対象への治療的に有効な量の筋肉内（ＩＭ）投与が、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答を前記対象において誘導する、前記ワクチン。
  2. 前記中和抗体力価が、１ミリリットルあたり少なくとも１００中和単位（ＮＵ／ｍＬ）である、請求項１に記載のワクチン。
  3. 前記中和抗体力価が少なくとも５００ＮＵ／ｍＬである、請求項２に記載のワクチン。
  4. 前記中和抗体力価が少なくとも１０００ＮＵ／ｍＬである、請求項３に記載のワクチン。
  5. 前記中和抗体力価が、ワクチン接種をしていない対照対象の中和抗体力価に比べて、または生弱毒化ＥＢＶワクチン、不活性化ＥＢＶワクチンもしくはタンパク質サブユニットＥＢＶワクチンをワクチン接種した対象の中和抗体力価に比べて、Ｂ細胞のＥＢＶ感染を少なくとも５０％低減させるのに十分である、請求項１～４のいずれか１項に記載のワクチン。
  6. 前記中和抗体力価が、前記ワクチンの３未満の用量の後に前記対象において誘導される、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン。
  7. 単回用量が１０μｇ～１００μｇである、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン。
  8. 前記中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答が、ワクチン接種をしていない対照対象の前記中和抗体力価に比べて、症候性の伝染性単核症の率を低減させるのに十分である、請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン。
  9. 前記中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答が、ワクチン接種をしていない対照対象の前記中和抗体力価に比べて、無症候性のＥＢＶ感染の率を低減させるのに十分である、請求項１～８のいずれか１項に記載のワクチン。
  10. 前記中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答が、前記対象においてＥＢＶ潜伏を防止するのに十分である、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン。
  11. 前記中和抗体力価が、前記対象の上皮細胞及び／またはＢ細胞とＥＢＶの融合をブロックするのに十分である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のワクチン。
  12. 前記中和抗体力価が、前記ワクチンの１０～１００μｇの単回用量の後に、２０日以内に誘導される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のワクチン。
  13. 前記中和抗体力価が、前記ワクチンの第２の１０～１００μｇの用量の後に、４０日以内に誘導される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のワクチン。
  14. 前記Ｔ細胞免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のワクチン。
  15. 前記Ｔ細胞免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のワクチン。
  16. 前記ＥＢＶ抗原が前記対象の細胞の表面上で発現される、請求項１～１５のいずれか１項に記載のワクチン。
  17. 前記ワクチンの２μｇの単回用量が、約１００のＮＴ５０中和抗体力価をマウスにおいて誘導する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のワクチン。
  18. 前記ワクチンの２μｇのブースター用量が、ＮＴ５０中和抗体力価をマウスにおいて誘導する、請求項１７に記載のワクチン。
  19. 前記ＥＢＶワクチンが、
    （ａ）２つのＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する１つのリボ核酸（ＲＮＡ）、または
    （ｂ）各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つのＲＮＡ
    を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のワクチン。
  20. 前記ワクチンが、脂質ナノ粒子中に製剤化された、２つのＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する１つのＲＮＡを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載のワクチン。
  21. 前記ワクチンが、各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つのＲＮＡを含み、前記２つのＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のワクチン。
  22. 前記ワクチンが、各々がＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する２つのＲＮＡを含み、前記ＲＮＡの各々が単一の脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のワクチン。
  23. 少なくとも１つの追加のＥＢＶ抗原をコードするＯＲＦを有する、少なくとも１つの追加のＲＮＡをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のワクチン。
  24. 前記脂質ナノ粒子が、モル比で、２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２０～２３のいずれか１項に記載のワクチン。
  25. 前記ＥＢＶ抗原が、ｇｐ３５０、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇｐ４２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１及びＥＢＮＡ３からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか１項に記載のワクチン。
  26. 前記ＥＢＶ抗原がＥＢＶ ｇｐ３５０抗原、ＥＢＶ ｇＨ抗原及びＥＢＶ ｇＬ抗原を含み、随意に、前記ＥＢＶ ｇＨ抗原が前記ＥＢＶ ｇＬ抗原へ連結され、随意に、前記リンカーがＧＧＧＧＳモチーフを含み、随意に、前記リンカーが配列番号：２２４または配列番号：２２５のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のワクチン。
  27. 前記ＥＢＶ抗原が、ＥＢＶ ｇｐ４２抗原及び／またはｇＢ抗原をさらに含む、請求項２６に記載のワクチン。
  28. 前記ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原が、野生型ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原、変異ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原または短縮ＥＢＶ ｇｐ３５０抗原である、請求項２５～２７のいずれか１項に記載のワクチン。
  29. 前記ＲＮＡが、配列番号：２０１、２０２、２０３、２０４、２０７、２０８、１７７、１７８、１７９、１８１、１８２、１８５、１８７、１８８、１８９、２０９、２１８及び２２１からなる群から選択される配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１～２８のいずれか１項に記載のワクチン。
  30. 前記ＥＢＶ抗原がスキャフォールド部分へ融合される、請求項１～２９のいずれか１項に記載のワクチン。
  31. 前記スキャフォールド部分が、フェリチン、エンカプスリン、ルマジン合成酵素、Ｂ型肝炎表面抗原及びＢ型肝炎コア抗原からなる群から選択される、請求項３０に記載のワクチン。
  32. 前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のワクチン。
  33. 前記ＲＮＡが５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載のワクチン。
  34. 前記５’ＵＴＲが、配列番号：１または配列番号：１０４によって同定される配列を含む、請求項３３に記載のワクチン。
  35. 前記ＲＮＡが３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載のワクチン。
  36. 前記３’ＵＴＲが、配列番号：３または配列番号：１０６によって同定される配列を含む、請求項３５に記載のワクチン。
  37. 前記ＥＢＶ抗原がシグナルペプチドへ融合される、請求項１～３６のいずれか１項に記載のワクチン。
  38. 前記シグナルペプチドが、随意に配列番号：１１５を含む、ウシプロラクチンシグナルペプチドである、請求項３７に記載のワクチン。
  39. 前記ＲＮＡが非修飾である、請求項１～３８のいずれか１項に記載のワクチン。
  40. 前記ＲＮＡが少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載のワクチン。
  41. 前記ＯＲＦ中のウラシルのうちの少なくとも８０％が１－メチル－シュードウリジン修飾を含む、請求項４０に記載のワクチン。
  42. 治療的に有効な量で請求項１～４１のいずれか１項に記載のＥＢＶワクチンを対象へ投与して、中和抗体力価及び／またはＴ細胞免疫応答を前記対象においてを誘導することを含む方法。
  43. 前記ＥＢＶワクチンの有効性が、ワクチン接種をしていない対照対象に比べて、少なくとも８０％である、請求項４２に記載の方法。
  44. 検出可能レベルのＥＢＶ抗原が、前記ワクチンの投与後１～７２時間で前記対象の血清中で産生される、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 少なくとも１００ＮＵ／ｍｌの中和抗体力価が、前記ワクチンの投与後１～７２時間で前記対象の血清中で産生される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 少なくとも５００ＮＵ／ｍｌの中和抗体力価が、前記ワクチンの投与後１～７２時間で前記対象の血清中で産生される、請求項４５に記載の方法。
  47. 少なくとも１０００ＮＵ／ｍｌの中和抗体力価が、前記ワクチンの投与後１～７２時間で前記対象の血清中で産生される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記治療的に有効な量が、２０μｇ～２００μｇの全用量である、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記治療的に有効な量が、５０μｇ～１００μｇの全用量である、請求項４８に記載の方法。
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