CN113144187B

CN113144187B - 一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113144187B
Application number: CN202110118361.6A
Authority: CN
Inventors: 曾木圣; 孙聪; 康银峰; 冯国开
Original assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN113144187A

Abstract

本发明公开了一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。该自组装纳米颗粒，包含第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第二多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53‑50A1，所述第二载体亚基为I53‑50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接。该自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gHgLgp42蛋白展示在纳米颗粒表面，能够诱导更高的抗体滴度，可用于预防EB病毒感染及治疗EB病毒感染所引起的疾病。

Description

一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)在人群中感染率高达95％，它是许多恶性肿瘤比如鼻咽癌等的重要发病因素。然而至今仍未有上市的EBV预防性或治疗性疫苗。因此亟需研发EBV疫苗以改善EBV相关肿瘤的生存和预后。EBV是包膜病毒，通过自身暴露在外的膜蛋白完全与宿主细胞的膜融合过程以感染细胞。其中参与的膜蛋白不仅包括有融合特性的蛋白gB，也包括gp42、gp350、gHgL等直接或间接与宿主细胞受体相互作用的辅助蛋白。机体能针对这些膜蛋白产生相应的中和抗体，进而减少EBV对细胞的感染。

研究表明，gHgL通过gp42与B细胞的HLA II分子结合，并最终触发gB的构象转换，开始膜融合。因此，gHgL/gp42组合的纳米颗粒有望阻断B细胞的EBV感染。目前认为感染的B细胞可能是上皮细胞感染之前EBV的中转站或贮存点，若能消除EBV在B细胞的感染，极有可能利于减少甚至消除EBV从 B细胞到上皮细胞的扩散感染。

发明内容

为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒。

本发明的第二个方面的目的，在于提供一种含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。

本发明的第四个方面的目的，在于提供上述一种包含上述自组装纳米颗粒的疫苗。

本发明的第五方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒，包含第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第二多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gHgL蛋白，更好地激发机体的免疫反应。

优选的，所述铰链包含柔性序列和刚性接头，铰链用于gHgL蛋白与载体蛋白(载体蛋白由第一载体亚基和第二载体亚基组成)的连接，不影响gHgL蛋白的免疫原性以及蛋白的正确折叠。

优选的，所述柔性序列为含5～9个氨基酸的多肽；进一步为SEQ ID NO：12～SEQID NO：16中任一种的多肽；更进一步为如SEQ ID NO：15所示的多肽。

优选的，所述刚性接头的氨基酸序列为EKAAKAEEAA(SEQ ID NO：31)。

优选的，所述第一多肽与所述第二多肽通过非共价相互作用形成异源二聚体的稳定结构；进一步的，所述第一多肽中的gHgL蛋白与所述第二多肽中的gp42蛋白通过非共价相互作用形成异源二聚体的稳定结构。

优选的，所述第一多肽与所述第三多肽以非共价相互作用自组装形成纳米结构；进一步的，所述第一多肽中的第一载体亚基与所述第三多肽中的第二载体亚基以非共价相互作用自组装形成纳米结构；所述第一载体亚基包覆于所述第二载体亚基的表面，所述gHgLgp42异源二聚体展示在纳米结构表面。

优选的，所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白。

优选的，所述gH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，所述gL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO： 29所示。

优选的，所述gHgL蛋白还包含链接序列，所述链接序列用于连接gH蛋白和gL蛋白。

所述链接序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。

优选的，所述gp42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示。

优选的，所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。

优选的，所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。

优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。

优选的，所述稳定蛋白位于铰链与gHgL蛋白之间。

优选的，所述稳定蛋白为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：32)或GCN4肽段(SEQ ID NO：33)；进一步为T4噬菌体纤维蛋白原。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基为第一纳米颗粒亚基三聚体。

优选的，所述第二纳米颗粒亚基为第二纳米颗粒亚基五聚体。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基三聚体的拷贝数为18～22，所述第二纳米颗粒亚基五聚体的拷贝数为 10～14；进一步优选的，所述第一纳米颗粒亚基三聚体的拷贝数为20，所述第二纳米颗粒亚基五聚体的拷贝数为12。

优选的，所述含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒具有20面体对称性。

本发明的第二个方面，提供一种含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法，将第一纳米颗粒亚基与第二纳米颗粒亚基孵育，得到；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第二多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL 蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gHgL蛋白，更好地激发机体的免疫反应。

优选的，所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。

优选的，所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基的摩尔比为1:(3～6)；进一步为1:5。

优选的，所述孵育的条件为在组装缓冲液中孵育0.5～2h。

优选的，所述组装缓冲液的组成为250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油(质量分数)。

优选的，所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白。

优选的，所述链接序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。

优选的，所述gp42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示。

优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。

优选的，所述稳定蛋白位于铰链与gHgL蛋白之间。

所述稳定蛋白优选为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：32)或GCN4肽段(SEQ ID NO： 33)；更优选为T4噬菌体纤维蛋白原。

优选的，所述第一多肽、第二多肽和第三多肽还包含纯化标签。

所述纯化标签优选为组氨酸标签(His标签)，链霉亲和素标签(Strep标签)和麦芽糖结合蛋白(MBP) 中的至少一种；更优选为组氨酸标签(His标签)；最优选为氨基酸序列如SEQ ID NO：34或SEQ ID NO： 35所示的组氨酸标签。

优选的，所述第一多肽的纯化标签位于稳定蛋白和铰链之间。

优选的，所述第一多肽还包含连接序列。

优选的，所述连接序列位于稳定蛋白和纯化标签之间。

优选的，所述连接序列如SEQ ID NO：40所示。

优选的，所述第二多肽的纯化标签位于gp42蛋白的末端。

优选的，所述第三多肽的纯化标签位于第二载体亚基的末端。

所述第一多肽还含有信号肽，使目的蛋白在表达后能够分泌至上清。

所述信号肽选自CD5信号肽(SEQ ID NO：36)。

所述第一纳米颗粒亚基优选通过如下方式获得：将表达第一多肽的核酸和表达第二多肽的核酸共同引入第一宿主细胞；孵育第一宿主细胞表达第一纳米颗粒亚基。

所述第一宿主细胞优选为真核细胞；更优选为人类胚胎肾293细胞(HEK293F)，犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)，非洲绿猴(Chlorocebussabaeus)肾细胞(VERO)，SF9(Spodoptera frugiperda 9)细胞，HighFive细胞、CHO(Chinese HamsterOvary，中国仓鼠卵巢)细胞和酵母细胞中的至少一种；最优选为人类胚胎肾293细胞。

所述第二纳米颗粒亚基优选通过如下方式获得：将表达第三多肽的核酸引入第二宿主细胞；孵育第二宿主细胞表达第二纳米颗粒亚基。

所述第二宿主细胞优选为原核细胞；更优选为大肠杆菌；最优选为Rosetta(DE3)。

本发明的第三个方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种包含第一方面的自组装纳米颗粒的疫苗。

一种疫苗，包含上述含gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒。

所述疫苗还包括佐剂。

所述佐剂优选为铝佐剂，油乳佐剂如水包油、油包水、双向型乳液，微生物来源类佐剂如肽聚糖(PG)、革兰氏阴性菌外膜脂多糖(Lipopolysccharide,LPS)、分枝杆菌及其组份、GpG寡核苷酸(GpG ODN)、霍乱毒素(Cholera toxin,CT))，微粒抗原递送体系如脂质体、聚合微球体、惰性纳米微球、纳米铝佐剂、免疫刺激复合物(Immunostimulatingcomples,IS-COM)、细胞因子，多糖类如菊粉(MPI)，天然来源类如蜂胶(propolis)、皂苷(Sapoin)中的至少一种；更优选为MF59佐剂。

本发明的第五方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。

所述疾病优选为传染性疾病、恶性肿瘤、慢性疾病和自身性免疫疾病中的至少一种；更优选为单核细胞增多症、鼻咽癌、胃癌、上皮细胞性肿瘤、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性疲劳综合征、多发性硬化和强直性脊髓炎中的至少一种。

所述药品还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果是：

本发明提供的自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gHgLgp42蛋白展示在纳米颗粒表面，其粒径较抗原 (gHgL、gp42)大，具有更好的抗原驻留体积，热稳定与抗原(gHgL、gp42)相当，同时其展示的gHgL gp42数量更多能够更强地刺激B细胞，并且能够诱导更高的抗体滴度，可用于预防EB病毒感染及治疗 EB病毒感染所引起的疾病。

本发明提供的自组装纳米颗粒，虽然引入了异源基因，但其由于是来源于细菌的蛋白，避免了引起自身免疫疾病，具有安全性高的优势，且不影响免疫效果。

附图说明

图1是gHgLgp42-I53-50A1、gHgLgp42-I53-50 NP的结构示意图：其中，A为gHgLgp42-I53-50A1 三聚体结构拟合图：可观察其并未发现蛋白链的显著冲突；B为gHgLgp42-I53-50 NP纳米颗粒的结构示意图：其是通过输出结构与I53-50ANP(PDB id:6P6F)进行蛋白结构拟合后的结果。

图2是自组装纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色图。

图3是gHgL、gp42、gHgLgp42-I53-50A1和gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒的分子筛色谱图。

图4是gHgL、gp42、gHgLgp42-I53-50A1和gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒的动态光散射结果图。

图5是gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒的负染电镜图：其中，A为gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒在200nm分辨率下的负染电镜图；B为gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒在100nm分辨率下的负染电镜图。

图6是gHgL、gp42、gHgLgp42-I53-50A1和gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒的内在荧光扫描结果图。

图7是小鼠免疫后血清gHgL和gp42的总抗滴度图：A为免疫二周后血清gHgL和gp42的总抗滴度图；B为免疫五周后血清gHgL和gp42的总抗滴度图；图中，**表示P<0.001；*表示P<0.005。

具体实施方式

以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本申请的纳米颗粒疫苗制备方法包括以下：

A.通过Rosetta等计算机辅助设计，确定gHgL与三聚体稳定蛋白融合相容性，并根据结果设计表达序列。

B.通过第一宿主细胞，利用瞬时转染技术将真核表达载体转入第一细胞中表达，获得gHgLgp42-I53-50A1的纳米颗粒亚基(第一纳米颗粒亚基)，同时利用第二宿主细胞，转化另一个 I53-50B.4PT1的表达质粒，在IPTG诱导后表达获得I53-50B.4PT1这另一纳米颗粒亚基(第二纳米颗粒亚基)，两种蛋白通过亲和层级以及分子排阻色谱进行进一步纯化后经过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定确定纯度。

C.在组装缓冲液中按一定比例加入gHgLgp42-I53-50A1及I53-50B.4PT1亚基，在室温下孵育，利用分子排阻色谱分离组装成功的纳米颗粒，并利用负染电镜、动态光散射和差示扫描荧光确定蛋白的粒径分布和稳定性。

D.将纳米颗粒与佐剂进行混匀，通过Balb/C小鼠进行免疫，验证小鼠产生针对gHgLgp42的抗体水平。

以下进一步具体阐述本申请的纳米颗粒疫苗的。

实施例1铰链(linker)设计

通过Rosetta等计算机软件辅助设计，利用rosetta remodel软件进行结构域插入设计(domain insertion design)，将三聚体稳定化蛋白与gHgL抗原(SEQ ID NO：1)进行结构对接，从而判断其是否需要插入铰链(linker)，最后利用PyMol进行结构可视化进行目测判断，最终选择如下铰链：铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表 1所示，刚性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。

设计采用的软件：

Rosetta remodel: https://www.rosettacommons.org/docs/latest/application_documentation/design/rosettaremodel；

Pymol open-source:https://github.com/schrodinger/pymol-open-source。

实施例2重组载体的构建和蛋白表达

1.实验材料

(1)表达载体：真核表达载体：pcDNA3.1(+)(ThermoFisher)，原核表达载体：pET28a(+)(ThermoFisher)，大肠杆菌感受态细胞DH5α(Tiangen)。

(2)表达系统：真核表达系统细胞HEK293F(ATCC)，改造大肠杆菌细胞Rosetta(DE3)(Tiangen)。

(3)试剂与耗材：PCR酶(GeneStar)，重组酶(Vazyme)，限制性核酸内切酶(NEB)，胶回收试剂 (GeneStar)，质粒中提试剂盒(MN)细胞转染试剂PEI(Polyscience),293F培养基(Union)，TB培养基 (翔博生物)，组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖珠(Roche)，等其他常规试剂以及耗材均为商品化购买所得。

(4)基因：EB病毒(M81毒株)的gH基因、gL基因、gp42基因以及基于细菌蛋白优化的I53-50A1/I53-50B颗粒亚单位基因均通过南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM密码子平台优化和合成。

2.铰链的筛选

我们尝试了不同铰链(linker)，铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，同样构建了表达载体转染表达后，通过最后纯化浓缩测定蛋白浓度，具体步骤如下：(1)通过PCR 扩增、酶切重组方法将EB病毒gH基因(SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQ ID NO：3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQID NO：6)及铰链(不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示)插入到载体pcDNA3.1(+) 中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，T4 fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ ID NO：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(SEQ ID NO： 20)，最终得到的表达载体表达的目的基因gHgL-I53-50A1；(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至 DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL)的TB 培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书；(3)将293F细胞置于293F培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*10⁶/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的 293F细胞中，在37℃、30％湿度、5％CO₂浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白gHgL-I53-50A1亚单位。结果如表1所示：铰链的柔性序列为GGSGGSGS(SEQ ID NO：15)时，gHgL-I53-50A1亚单位产量最高。

表1不同柔性序列的铰链(linker)的载体的蛋白产量

3.自组装纳米颗粒的制备步骤

(1)通过PCR扩增、酶切重组方法将EB病毒gH基因(SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQID NO： 3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQ ID NO：6)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQID NO：17所示)插入到载体pcDNA3.1(+)中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外， T4 fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ IDNO：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(SEQ ID NO：20)，最终得到的表达载体表达的目的基因gHgL-I53-50A1(SEQ ID NO：21)；同时，通过PCR扩增、酶切重组方法将EB病毒gp42基因(SEQ ID NO：37)插入到pcDNA3.1(+)载体中，其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，末端带有6个组氨酸的组氨酸(SEQ ID NO:23)标签便于纯化。而I53-50B.4PT1(SEQ ID NO:22)则在合成中直接插入到pET28a(+)载体中，并且其尾端带有6个组氨酸的组氨酸(SEQ ID NO:23)标签便于纯化，通过测序比对后选择成功构建的载体进行下一步的实验。

(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL)的TB培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书。

(3)将重组载体于pET28a(+)的基因转化至Rosetta(DE3)感受态细菌中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％卡那霉素(0.03g/mL)的TB培养基中扩大，随后利用锥形瓶进一步扩大到1L培养，并加入卡那霉素和氯霉素用于筛选阳性细胞，在18℃加入0.2mM化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，经过20h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的第二纳米颗粒亚基(I53-50B.4PT1亚单位 (SEQ ID NO：24))。

(4)将293F细胞置于293F培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*10⁶/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体(其中包括 0.75mg gHgL-I53-50A1表达载体以及0.25mg gp42表达载体)+5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293F细胞中，在37℃、80％湿度、5％CO₂浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的第一纳米颗粒亚基(包含带组氨酸标签的gHgL-I53-50A1亚单位(SEQ ID NO：25)和带组氨酸标签的gp42 蛋白亚单位(SEQ IDNO：38)，即gHgLgp42-I53-50A1)，gHgLgp42-I53-50A1的结构示意图如图1所示。

(5)将两带组氨酸标签的纳米颗粒亚基(gHgLgp42-I53-50A1和I53-50B.4PT1)按1：5的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油(质量分数)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)，gHgLgp42-I53-50 NP的结构示意图如图1所示。

4.结果

如图2、3所示，图2为纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色的结果：从左到右显示了gHgL 抗原蛋白(SEQ ID NO：41，制备方法同第3点中gHgLgp42-I53-50A1第一纳米颗粒亚基制备过程，区别在于：步骤(1)中载体pcDNA3.1(+)中不包含T4 fibritin(SEQ IDNO：5)、I53-50A1(SEQ ID NO：6)、连接序列(SEQ ID NO：20)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示)，同时也未导入gp42表达载体)、I53-50B.4PT1亚单位(制备方法同第3点中I53-50B.4PT1亚单位制备过程)、gp42抗原蛋白亚单位(SEQ ID NO：38)(制备方法同第3点中 gHgLgp42-I53-50A1第一纳米颗粒亚基制备过程，区别在于：未导入gHgL-I53-50A1表达载体))、第一纳米颗粒亚基(gHgLgp42-I53-50A1(制备方法同第3点中gHgLgp42-I53-50A1第一纳米颗粒亚基制备过程)) 以及第3点得到的gHgLgp42-I53-50 NP自组装纳米颗粒；图3为纳米颗粒的分子筛色谱图：可以看出，重组载体构建成功，并且能获得高纯度的纳米颗粒蛋白(gHgLgp42-I53-50NP)；gHgLgp42-I53-50A1比gHgL 和gp42分子质量要大。

实施例3检测纳米颗粒的结构特征和化学稳定性

1.实验材料

(1)Unchained Uncle高通量蛋白质稳定性分析仪(Unchained Labs)。

(2)120KV透射电镜(FEI)。

2.实验步骤

(1)检测纳米颗粒的粒径分布

首先将实施例2中gHgLgp42自组装纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)、第一纳米颗粒亚基 (gHgLgp42-I53-50A1)、抗原(gHgL和gp42)稀释至0.5mg/mL，加入200uL样品至Uncle专用的加样槽中，静置5min后，使用Unchained公司的Uncle仪器进行纳米颗粒粒径的检测。

(2)检测纳米颗粒的结构特征

稀释实施例2中gHgLgp42自组装纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)浓度为0.1mg/mL，将蛋白孵育在碳涂层铜网格上，然后与2％乙酸铀孵育染色2min，风干。随后利用120KV透射电镜观察颗粒的大小和形态。

(3)检测纳米颗粒的热稳定性

首先将实施例2中gHgLgp42自组装纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)、第一纳米颗粒亚基gHgLgp42-I53-50A1、抗原(gHgL和gp42)稀释至0.5mg/mL，随后我们使用Unchained公司的Uncle仪器从25℃到90℃进行升温扫描，记录其全波长广谱偏移(BCM)的变化。

3.实验结果

如图4所示，gHgLgp42自组装纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)具有较均一的粒径分布特征，且其粒径显著大于第一纳米颗粒亚基gHgLgp42-I53-50A1以及抗原(gHgL和gp42)，说明了已经组装成为纳米颗粒。

如图5所示，负染电镜下可以看到gHgLgp42-I53-50 NP具有较好的均一性，且gHgL-I53-50 NP的颗粒表面有明显的外部的突起，说明gHgLgp42成功展示在了纳米颗粒载体表面。

如图6所示，图6展示了gp42、gHgL、gHgLgp42-I53-50A1、gHgLgp42-I53-50 NP的差示荧光扫描结果，三者随着温度从25℃上升至95℃，其BCM偏移相近，证实了该改造对gHgLgp42本身蛋白的稳定性无显著影响，同时由于gHgLgp42-I53-50 NP具有纳米颗粒的特征，其发生荧光改变的斜率也较gHgL 和gp42小。

实施例4纳米颗粒蛋白的动物免疫原性

1.实验材料

(1)小鼠：雌性6～8周的BalB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

(2)佐剂：MF59佐剂{0.5％(v/v)Tween 80，0.5％(v/v)Span 85，4.3％(v/v)角鲨烯，10nM柠檬酸钠缓冲液}。

(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。

2.实验步骤

(1)将2ug空载的纳米载体(empty-NP，即I53-50A NP，制备方法同实施例2中第3点，区别仅在于：不含gH基因(SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQ ID NO：3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4 fibritin (SEQ ID NO：5)、)、铰链、连接序列(SEQ ID NO：20))、2ug EB病毒gp42蛋白(SEQ ID NO：38，制备方法同实施例2中第3点中gHgLgp42-I53-50A1亚基制备过程，区别在于：未导入gHgL-I53-50A1 表达载体)、2ug EB病毒gHgLgp42蛋白(制备方法同实施例2中第3点中gHgLgp42-I53-50A1亚基制备过程，区别在于：步骤(1)中载体pcDNA3.1(+)中不包含T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQ ID NO：6)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示))、以及含等摩尔质量gHgLgp42的gHgLgp42纳米颗粒(实施例2中的gHgLgp42-I53-50 NP)，分别与上述MF59佐剂混合，即将佐剂与抗原按质量比1：1的混合，在4℃摇晃孵育过夜，经皮下免疫的方式免疫小鼠。

(2)在免疫之后的第三周再进行一次免疫，在免疫后第二周以及第五周采集小鼠眼眶血分离收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清gHgL和gp42的总抗滴度。

3.实验结果

如图7所示，在第2周和第5周的血清抗体滴度检测中，gHgLgp42自组装纳米颗粒(gHgLgp42-I53-50 NP)诱导的血清总抗体滴度相对于单体gp42以及gHgLgp42来说均要更高，证实了gHgLgp42纳米颗粒能够诱导更强的抗体产生。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽智飞龙科马生物制药有限公司

<120> 一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用

<130>

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala

130 135 140

Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu

165 170 175

Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu

195 200 205

Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser

210 215 220

Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln

225 230 235 240

Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser

245 250 255

Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser

260 265 270

Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe

275 280 285

Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val

290 295 300

Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly

305 310 315 320

Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser

325 330 335

Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr

340 345 350

Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr

355 360 365

Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu

370 375 380

Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val

405 410 415

Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser

420 425 430

Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly

435 440 445

Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala

450 455 460

Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr

465 470 475 480

Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys

485 490 495

Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met

515 520 525

Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg

530 535 540

Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu

545 550 555 560

Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly

565 570 575

Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser

580 585 590

Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe

610 615 620

Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu

625 630 635 640

Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile

645 650 655

Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg

660 665 670

Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu

675 680 685

Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala

690 695 700

Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln

705 710 715 720

Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys

725 730 735

Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn

740 745 750

Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His

755 760 765

Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu

770 775 780

Tyr Glu Glu Arg Ala

785

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 2

tgggcatatc catgctgtca cgtgacccag ctgagggcac agcacctgct ggccctggag 60

aatatctctg acatctacct ggtgagcaac cagacatgcg atggcttctc tctggccagc 120

ctgaacagcc ccaagaacgg ctccaatcag ctggtcatct ctcgctgtgc caacggcctg 180

aatgtggtgt ctttctttat cagcatcctg aagcggagct cctctgccct gacctcccac 240

ctgagagagc tgctgaccac actggagtct ctgtacggca gcttttccgt ggaggacctg 300

ttcggcgcca acctgaatcg gtatgcctgg cacagaggag ga 342

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaggaggag gatctggagg aggaggcagc ggcggcggcg gcagc 45

<210> 4

<211> 1980

<212> DNA

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 4

tccctgagcg aggtgaagct gcacctggac atcgagggcc acgcctccca ctacacaatc 60

ccctggaccg agctgatggc caaggtgcca ggactgtccc cagaggccct gtggcgggag 120

gccaatgtga ccgaggatct ggcctctatg ctgaacagat acaagctgat ctataagaca 180

agcggcaccc tgggaatcgc cctggcagag cctgtggaca tcccagccgt gtctgagggc 240

agcatgcagg tggatgcctc caaggtgcac cctggcgtga tctccggcct gaactctcct 300

gcctgcatgc tgtctgcccc actggagaag cagctgtttt actatatcgg cacaatgctg 360

cccaatacca ggcctcacag ctacgtgttc tatcagctgc gctgtcacct gtcctacgtg 420

gccctgtcta tcaacggcga caagtttcag tatacaggcg ccatgaccag caagttcctg 480

atgggcacat acaagcgggt gaccgagaag ggcgatgagc acgtgctgtc cctgatcttt 540

ggcaagacaa aggacctgcc cgatctgaga ggcccattct cctacccctc tctgaccagc 600

gcccagtccg gcgactattc cctggtcatc gtgaccacat ttgtgcacta cgccaacttt 660

cacaattatt tcgtgcccaa tctgaaggat atgttcagca gggccgtgac aatgaccgca 720

gcatcctacg caagatatgt gctgcagaag ctggtgctgc tggagatgaa gggcggctgt 780

cgggagcctg agctggatac agagaccctg accacaatgt ttgaggtgag cgtggccttc 840

tttaaagtgg gacacgcagt gggagagaca ggaaacggct gcgtggacct gagatggctg 900

gccaagtctt tctttgagct gacagtgctg aaggatatca tcggcatctg ttacggcgcc 960

accgtgaagg gcatgcagag ctatggcctg gagaggctgg ccgccatgct gatggccacc 1020

gtgaagatgg aggagctggg ccacctgacc acagagaagc aggagtacgc actgaggctg 1080

gcaacagtgg gataccctaa ggcaggcgtg tattccggac tgatcggagg agccaccagc 1140

gtgctgctgt ccgcctataa tcggcaccct ctgtttcagc cactgcacac agtgatgaga 1200

gagaccctgt tcatcggaag ccacgtggtg ctgagggagc tgcgcctgaa tgtgaccaca 1260

cagggcccaa acctggccct gtaccagctg ctgagcaccg ccctgtgctc cgccctggag 1320

atcggagagg tgctgagggg actggccctg ggcacagagt ctggcctgtt tagcccatgt 1380

tatctgtccc tgaggttcga cctgactcgc gataagctgc tgtctatggc accacaggag 1440

gcaatgctgg accaggcagc cgtgagcaat gccgtggatg gcttcctggg caggctgtcc 1500

ctggagaggg aggacagaga tgcctggcac ctgcccgcct acaagtgcgt ggaccgcctg 1560

gataaggtgc tgatgatcat ccctctgatc aacgtgacct ttatcatctc tagcgacagg 1620

gaggtgcgcg gaagcgccct gtacgaggcc tccaccacat atctgtcctc tagcctgttc 1680

ctgtcccccg tgatcatgaa taagtgttct cagggagcag tggcaggaga gccaaggcag 1740

atccctaaga tccagaactt tacaagaacc cagaagtctt gcatcttttg tggcttcgcc 1800

ctgctgagct acgatgagaa ggagggcctg gagaccacaa cctatatcac atctcaggag 1860

gtgcagaaca gcatcctgtc ctctaattac ttcgactttg ataacctgca cgtgcactat 1920

ctgctgctga caaccaacgg caccgtgatg gagatcgccg gcctgtacga ggagagggca 1980

<210> 5

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatacatcc cagaggcacc aagggacgga caggcctatg tgcgcaagga tggcgagtgg 60

gtgctgctgt ctaccttcct g 81

<210> 6

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaagatgg aggagctgtt taagaagcac aagatcgtgg ccgtgctgag ggccaactcc 60

gtggaggagg ccatcgagaa ggcagtggcc gtgttcgcag gaggagtgca cctgatcgag 120

atcaccttta cagtgcctga cgccgataca gtgatcaagg ccctgagcgt gctgaaggag 180

aagggagcaa tcatcggagc aggaaccgtg acatccgtgg agcagtgcag gaaggcagtg 240

gagtccggag ccgagttcat cgtgtctccc cacctggacg aggagatctc tcagttctgt 300

aaggagaagg gcgtgtttta catgcctggc gtgatgaccc caacagagct ggtgaaggcc 360

atgaagctgg gccacgatat cctgaagctg ttcccaggag aggtggtggg acctcagttt 420

gtgaaggcca tgaagggccc cttccctaat gtgaagtttg tgccaaccgg cggcgtgaac 480

ctggacaacg tgtgcgagtg gttcaaggca ggcgtgctgg cagtgggagt gggcgatgcc 540

ctggtgaagg gcgaccccga tgaggtgagg gagaaggcca agaagtttgt ggagaagatc 600

cgcggctgta cagagggctc cctggag 627

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaggaagcg gaagc 15

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggaggaagcg gaggctct 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggaggaagcg gaggctctgg a 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggaggaagcg gaggctctgg aagc 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggaggaagcg gaggctctgg aggctct 27

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggaggaagcg gaggctctgg aagcgagaag gcagcaaagg cagaggaggc agcc 54

<210> 18

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60

agctgcctgg ga 72

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

catcatcacc accaccacca ccac 24

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggaagcggat cc 12

<210> 21

<211> 3237

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60

agctgcctgg gatgggcata tccatgctgt cacgtgaccc agctgagggc acagcacctg 120

ctggccctgg agaatatctc tgacatctac ctggtgagca accagacatg cgatggcttc 180

tctctggcca gcctgaacag ccccaagaac ggctccaatc agctggtcat ctctcgctgt 240

gccaacggcc tgaatgtggt gtctttcttt atcagcatcc tgaagcggag ctcctctgcc 300

ctgacctccc acctgagaga gctgctgacc acactggagt ctctgtacgg cagcttttcc 360

gtggaggacc tgttcggcgc caacctgaat cggtatgcct ggcacagagg aggaggagga 420

ggaggatctg gaggaggagg cagcggcggc ggcggcagct ccctgagcga ggtgaagctg 480

cacctggaca tcgagggcca cgcctcccac tacacaatcc cctggaccga gctgatggcc 540

aaggtgccag gactgtcccc agaggccctg tggcgggagg ccaatgtgac cgaggatctg 600

gcctctatgc tgaacagata caagctgatc tataagacaa gcggcaccct gggaatcgcc 660

ctggcagagc ctgtggacat cccagccgtg tctgagggca gcatgcaggt ggatgcctcc 720

aaggtgcacc ctggcgtgat ctccggcctg aactctcctg cctgcatgct gtctgcccca 780

ctggagaagc agctgtttta ctatatcggc acaatgctgc ccaataccag gcctcacagc 840

tacgtgttct atcagctgcg ctgtcacctg tcctacgtgg ccctgtctat caacggcgac 900

aagtttcagt atacaggcgc catgaccagc aagttcctga tgggcacata caagcgggtg 960

accgagaagg gcgatgagca cgtgctgtcc ctgatctttg gcaagacaaa ggacctgccc 1020

gatctgagag gcccattctc ctacccctct ctgaccagcg cccagtccgg cgactattcc 1080

ctggtcatcg tgaccacatt tgtgcactac gccaactttc acaattattt cgtgcccaat 1140

ctgaaggata tgttcagcag ggccgtgaca atgaccgcag catcctacgc aagatatgtg 1200

ctgcagaagc tggtgctgct ggagatgaag ggcggctgtc gggagcctga gctggataca 1260

gagaccctga ccacaatgtt tgaggtgagc gtggccttct ttaaagtggg acacgcagtg 1320

ggagagacag gaaacggctg cgtggacctg agatggctgg ccaagtcttt ctttgagctg 1380

acagtgctga aggatatcat cggcatctgt tacggcgcca ccgtgaaggg catgcagagc 1440

tatggcctgg agaggctggc cgccatgctg atggccaccg tgaagatgga ggagctgggc 1500

cacctgacca cagagaagca ggagtacgca ctgaggctgg caacagtggg ataccctaag 1560

gcaggcgtgt attccggact gatcggagga gccaccagcg tgctgctgtc cgcctataat 1620

cggcaccctc tgtttcagcc actgcacaca gtgatgagag agaccctgtt catcggaagc 1680

cacgtggtgc tgagggagct gcgcctgaat gtgaccacac agggcccaaa cctggccctg 1740

taccagctgc tgagcaccgc cctgtgctcc gccctggaga tcggagaggt gctgagggga 1800

ctggccctgg gcacagagtc tggcctgttt agcccatgtt atctgtccct gaggttcgac 1860

ctgactcgcg ataagctgct gtctatggca ccacaggagg caatgctgga ccaggcagcc 1920

gtgagcaatg ccgtggatgg cttcctgggc aggctgtccc tggagaggga ggacagagat 1980

gcctggcacc tgcccgccta caagtgcgtg gaccgcctgg ataaggtgct gatgatcatc 2040

cctctgatca acgtgacctt tatcatctct agcgacaggg aggtgcgcgg aagcgccctg 2100

tacgaggcct ccaccacata tctgtcctct agcctgttcc tgtcccccgt gatcatgaat 2160

aagtgttctc agggagcagt ggcaggagag ccaaggcaga tccctaagat ccagaacttt 2220

acaagaaccc agaagtcttg catcttttgt ggcttcgccc tgctgagcta cgatgagaag 2280

gagggcctgg agaccacaac ctatatcaca tctcaggagg tgcagaacag catcctgtcc 2340

tctaattact tcgactttga taacctgcac gtgcactatc tgctgctgac aaccaacggc 2400

accgtgatgg agatcgccgg cctgtacgag gagagggcag gatacatccc agaggcacca 2460

agggacggac aggcctatgt gcgcaaggat ggcgagtggg tgctgctgtc taccttcctg 2520

ggaagcggat cccatcatca ccaccaccac caccacggag gaagcggagg ctctggaagc 2580

gagaaggcag caaaggcaga ggaggcagcc atgaagatgg aggagctgtt taagaagcac 2640

aagatcgtgg ccgtgctgag ggccaactcc gtggaggagg ccatcgagaa ggcagtggcc 2700

gtgttcgcag gaggagtgca cctgatcgag atcaccttta cagtgcctga cgccgataca 2760

gtgatcaagg ccctgagcgt gctgaaggag aagggagcaa tcatcggagc aggaaccgtg 2820

acatccgtgg agcagtgcag gaaggcagtg gagtccggag ccgagttcat cgtgtctccc 2880

cacctggacg aggagatctc tcagttctgt aaggagaagg gcgtgtttta catgcctggc 2940

gtgatgaccc caacagagct ggtgaaggcc atgaagctgg gccacgatat cctgaagctg 3000

ttcccaggag aggtggtggg acctcagttt gtgaaggcca tgaagggccc cttccctaat 3060

gtgaagtttg tgccaaccgg cggcgtgaac ctggacaacg tgtgcgagtg gttcaaggca 3120

ggcgtgctgg cagtgggagt gggcgatgcc ctggtgaagg gcgaccccga tgaggtgagg 3180

gagaaggcca agaagtttgt ggagaagatc cgcggctgta cagagggctc cctggag 3237

<210> 22

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atgaaccagc acagccacaa ggaccacgag accgtgcgta ttgcggtggt tcgtgcgcgt 60

tggcatgcgg agattgtgga tgcgtgcgtt agcgcgttcg aagcggcgat gcgtgacatc 120

ggtggcgatc gtttcgcggt ggacgttttt gatgtgccgg gtgcgtacga gattccgctg 180

catgcgcgta ccctggcgga aaccggtcgt tatggcgcgg ttctgggcac cgcgttcgtg 240

gttaacggtg gcatctaccg tcacgaattt gtggcgagcg cggttattaa cggtatgatg 300

aacgtgcaac tgaacaccgg cgtgccggtt ctgagcgcgg ttctgacccc gcacaactat 360

gacaagagca aagcgcacac cctgctgttc ctggcgctgt ttgcggtgaa gggtatggaa 420

gcggcgcgtg cgtgcgttga gatcctggcg gcgcgtgaaa aaattgcggc gggcagcctg 480

gaa 483

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catcatcacc accaccac 18

<210> 24

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu

145 150 155 160

Glu His His His His His His

165

<210> 25

<211> 1055

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala

130 135 140

Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu

165 170 175

Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu

195 200 205

Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser

210 215 220

Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln

225 230 235 240

Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser

245 250 255

Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser

260 265 270

Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe

275 280 285

Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val

290 295 300

Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly

305 310 315 320

Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser

325 330 335

Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr

340 345 350

Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr

355 360 365

Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu

370 375 380

Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val

405 410 415

Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser

420 425 430

Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly

435 440 445

Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala

450 455 460

Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr

465 470 475 480

Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys

485 490 495

Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met

515 520 525

Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg

530 535 540

Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu

545 550 555 560

Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly

565 570 575

Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser

580 585 590

Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe

610 615 620

Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu

625 630 635 640

Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile

645 650 655

Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg

660 665 670

Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu

675 680 685

Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala

690 695 700

Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln

705 710 715 720

Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys

725 730 735

Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn

740 745 750

Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His

755 760 765

Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu

770 775 780

Tyr Glu Glu Arg Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln

785 790 795 800

Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

805 810 815

Gly Ser Gly Ser His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly

820 825 830

Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Met Lys

835 840 845

Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala

850 855 860

Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly

865 870 875 880

Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr

885 890 895

Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly

900 905 910

Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser

915 920 925

Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln

930 935 940

Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro

945 950 955 960

Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu

965 970 975

Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly

980 985 990

Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp

995 1000 1005

Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val

1010 1015 1020

Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

1025 1030 1035

Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser

1040 1045 1050

Leu Glu

1055

<210> 26

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu

195 200 205

Glu

<210> 27

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu

145 150 155 160

Glu

<210> 28

<211> 114

<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 28

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly

<210> 29

<211> 660

<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 29

Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala Ser

1 5 10 15

His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly Leu

20 25 30

Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu Ala

35 40 45

Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr Leu

50 55 60

Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu Gly

65 70 75 80

Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser Gly

85 90 95

Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln Leu

100 105 110

Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser Tyr

115 120 125

Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser Ile

130 135 140

Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe Leu

145 150 155 160

Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val Leu

165 170 175

Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly Pro

180 185 190

Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Leu

195 200 205

Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr Phe

210 215 220

Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr Ala

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu Met

245 250 255

Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr Thr

260 265 270

Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val Gly

275 280 285

Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser Phe

290 295 300

Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly Ala

305 310 315 320

Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala Met

325 330 335

Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr Glu

340 345 350

Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys Ala

355 360 365

Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Ser

370 375 380

Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met Arg

385 390 395 400

Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg Leu

405 410 415

Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu Ser

420 425 430

Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly Leu

435 440 445

Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser Leu

450 455 460

Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln Glu

465 470 475 480

Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe Leu

485 490 495

Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu Pro

500 505 510

Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile Pro

515 520 525

Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg Gly

530 535 540

Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu Phe

545 550 555 560

Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala Gly

565 570 575

Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln Lys

580 585 590

Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys Glu

595 600 605

Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn Ser

610 615 620

Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His Tyr

625 630 635 640

Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu Tyr

645 650 655

Glu Glu Arg Ala

660

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala

1 5 10

<210> 32

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr

1 5 10 15

His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val

20 25 30

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

His His His His His His His His

1 5

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 35

His His His His His His

1 5

<210> 36

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly

20

<210> 37

<211> 570

<212> DNA

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 37

ggagggcggg tggcagccgc ggccatcacc tgggttccca aaccaaatgt agaggtctgg 60

ccggtggatc ctccaccgcc ggttaacttt aacaagacag ccgagcagga gtatggggac 120

aaagaggtaa aactgccaca ttggacaccc accctgcaca catttcaggt accccaaaac 180

tataccaaag ctaactgtac atactgcaac accagagaat acacattttc atataaagga 240

tgctgttttt atttcaccaa aaagaagcac acctggaatg ggtgtttcca agcctgtgca 300

gagctatatc catgcactta tttttatggg ccaacgcccg atattctacc tgtggtaact 360

agaaatctga atgccattga gtccctttgg gtcggggtgt acagggtggg agaagggaac 420

tggacatcat tagatggggg gacttttaag gtttatcaaa tttttggctc tcattgtaca 480

tatgtcagca aatttagtac agttccagtc tcacaccatg agtgttcatt ccttaaacca 540

tgtttatgtg tcagtcaaag atcaaatagc 570

<210> 38

<211> 196

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Gly Gly Arg Val Ala Ala Ala Ala Ile Thr Trp Val Pro Lys Pro Asn

1 5 10 15

Val Glu Val Trp Pro Val Asp Pro Pro Pro Pro Val Asn Phe Asn Lys

20 25 30

Thr Ala Glu Gln Glu Tyr Gly Asp Lys Glu Val Lys Leu Pro His Trp

35 40 45

Thr Pro Thr Leu His Thr Phe Gln Val Pro Gln Asn Tyr Thr Lys Ala

50 55 60

Asn Cys Thr Tyr Cys Asn Thr Arg Glu Tyr Thr Phe Ser Tyr Lys Gly

65 70 75 80

Cys Cys Phe Tyr Phe Thr Lys Lys Lys His Thr Trp Asn Gly Cys Phe

85 90 95

Gln Ala Cys Ala Glu Leu Tyr Pro Cys Thr Tyr Phe Tyr Gly Pro Thr

100 105 110

Pro Asp Ile Leu Pro Val Val Thr Arg Asn Leu Asn Ala Ile Glu Ser

115 120 125

Leu Trp Val Gly Val Tyr Arg Val Gly Glu Gly Asn Trp Thr Ser Leu

130 135 140

Asp Gly Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gln Ile Phe Gly Ser His Cys Thr

145 150 155 160

Tyr Val Ser Lys Phe Ser Thr Val Pro Val Ser His His Glu Cys Ser

165 170 175

Phe Leu Lys Pro Cys Leu Cys Val Ser Gln Arg Ser Asn Ser His His

180 185 190

His His His His

195

<210> 39

<211> 190

<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 39

Gly Gly Arg Val Ala Ala Ala Ala Ile Thr Trp Val Pro Lys Pro Asn

1 5 10 15

Val Glu Val Trp Pro Val Asp Pro Pro Pro Pro Val Asn Phe Asn Lys

20 25 30

Thr Ala Glu Gln Glu Tyr Gly Asp Lys Glu Val Lys Leu Pro His Trp

35 40 45

Thr Pro Thr Leu His Thr Phe Gln Val Pro Gln Asn Tyr Thr Lys Ala

50 55 60

Asn Cys Thr Tyr Cys Asn Thr Arg Glu Tyr Thr Phe Ser Tyr Lys Gly

65 70 75 80

Cys Cys Phe Tyr Phe Thr Lys Lys Lys His Thr Trp Asn Gly Cys Phe

85 90 95

Gln Ala Cys Ala Glu Leu Tyr Pro Cys Thr Tyr Phe Tyr Gly Pro Thr

100 105 110

Pro Asp Ile Leu Pro Val Val Thr Arg Asn Leu Asn Ala Ile Glu Ser

115 120 125

Leu Trp Val Gly Val Tyr Arg Val Gly Glu Gly Asn Trp Thr Ser Leu

130 135 140

Asp Gly Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gln Ile Phe Gly Ser His Cys Thr

145 150 155 160

Tyr Val Ser Lys Phe Ser Thr Val Pro Val Ser His His Glu Cys Ser

165 170 175

Phe Leu Lys Pro Cys Leu Cys Val Ser Gln Arg Ser Asn Ser

180 185 190

<210> 40

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Gly Ser Gly Ser

1

<210> 41

<211> 797

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 41

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala

130 135 140

Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu

165 170 175

Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu

195 200 205

Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser

210 215 220

Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln

225 230 235 240

Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser

245 250 255

Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser

260 265 270

Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe

275 280 285

Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val

290 295 300

Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly

305 310 315 320

Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser

325 330 335

Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr

340 345 350

Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr

355 360 365

Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu

370 375 380

Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val

405 410 415

Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser

420 425 430

Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly

435 440 445

Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala

450 455 460

Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr

465 470 475 480

Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys

485 490 495

Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met

515 520 525

Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg

530 535 540

Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu

545 550 555 560

Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly

565 570 575

Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser

580 585 590

Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe

610 615 620

Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu

625 630 635 640

Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile

645 650 655

Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg

660 665 670

Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu

675 680 685

Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala

690 695 700

Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln

705 710 715 720

Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys

725 730 735

Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn

740 745 750

Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His

755 760 765

Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu

770 775 780

Tyr Glu Glu Arg Ala His His His His His His His His

785 790 795

Claims

1.一种自组装纳米颗粒，其特征在于：所述自组装纳米颗粒包含第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第三多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接；

所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；

所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；

所述铰链包含柔性序列和刚性接头；

所述柔性序列如SEQ ID NO：15所示；

所述刚性接头的氨基酸序列为EKAAKAEEAA；

所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白；

所述gHgL蛋白还包含链接序列；

所述gH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；

所述gL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；

所述gp42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示。

2.根据权利要求1所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：所述第一多肽还包含稳定蛋白；

所述稳定蛋白位于铰链与gHgL蛋白之间。

3.根据权利要求2所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：所述稳定蛋白为T4噬菌体纤维蛋白原或GCN4肽段；

所述T4噬菌体纤维蛋白原的序列如SEQ ID NO：32所示；

所述GCN4肽段的序列如SEQ ID NO：33所示。

4.根据权利要求3所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：

所述第一纳米颗粒亚基为第一纳米颗粒亚基三聚体，所述第二纳米颗粒亚基为第二纳米颗粒亚基五聚体。

5.根据权利要求4所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：

所述第一纳米颗粒亚基三聚体的拷贝数为18～22，所述第二纳米颗粒亚基五聚体的拷贝数为10～14。

6.权利要求1～5中任一项所述的自组装纳米颗粒的制备方法，其特征在于：将第一纳米颗粒亚基与第二纳米颗粒亚基孵育，得到。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基的摩尔比为1:（3～6）。

8.权利要求1～5中任一项所述的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。

9.一种疫苗，其特征在于：所述疫苗包含权利要求1～5中任一项所述的自组装纳米颗粒。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括佐剂。

11.权利要求1～5中任一项所述的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。