KR101964155B1

KR101964155B1 - 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101964155B1
Application number: KR1020170055544A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 김창섭; 신화희; 김경록; 반소영
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2019-04-02
Also published as: KR20170126794A

Abstract

본 발명은 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 융합 단백질로부터 생산된 3차원 바이러스 유사 입자를 이용한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체 및 실리카 형성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 바이러스 입자(viral particle)가 아닌 바이러스 유사 입자(virus like particle)만을 제조하는 바이러스 피막 단백질을 이용하여 생체 내에서 안전성을 가지는 물질로, 본 발명의 실리카 형성 방법에 의하여 제조된 실리카 입자의 크기가 일정하게 조절될 수 있다는 이점이 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 기존의 실리카 나노입자 제조 방법에 비하여 비교적 간단하게 실리카를 제조할 수 있으며, 제조된 복합체 표면에 자연적으로 작은 구멍(pore)이 형성되는 바, 운반체(carrier)로 활용될 수 있다. 따라서 본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 의약 분야, 생물학적 분야, 나노기술 분야 등을 포함한 다양한 분야에서 약물 전달체, 진단 물질 등으로 활용할 수 있다는 이점이 있다.

Description

바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질 및 이의 용도{A fusion protein comprising virus coat protein and silica forming peptide and its use}

본 발명은 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 이용한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체 및 실리카 형성 조성물에 관한 것이다.

바이러스는 유전자 치료등과 같은 분야에서 다양하게 활용된다. 유전자 치료란 유전자 결합에 의한 유전병은 정상적인 유전자를 삽입하여 결합이 있는 유전자를 대체하거나, 치료 단백질을 생산하도록 하여 질병을 치료할 수 있다. 다만, 유전자 치료는 바이러스를 운반체로 사용하기 때문에 삽입부위, 치료시기, 발현 장소가 제한되며, 관련 유전자 부위에서 비정상적으로 백혈구 수가 늘어나 백혈병 등과 같은 혈관질환이 발생하는 부작용이 존재한다. 이러한 제한 및 부작용에 의하여 의생명 분야에서 이론적인 분석에 비하여 실직적으로 활용되는 비중이 다소 낮다.

한편, 실리카 나노입자들은 약물 전달, 진단, 정제, 바이오분석, 포토닉스 등 다양한 응용분야에서 사용되는 흥미로운 물질이다. 현재 실리카 나노입자 합성은 암모니아를 이용한 테트라에톡시실란(tetraethoxysilane, TEOS)의 조절된 가수분해와 유기 또는 무기 양이온 존재 하에서 염기 용액에서 테트라에톡시실란의 가수분해를 포함하는 솔-젤(sol-gel) 방법에 의해 주로 이루어진다. 또한, 수용성 라이신(lysine) 용액에서 테트라에톡시실란의 가수분해를 통해 5~20 nm의 크기를 가지는 단순 분산 실리카 나노입자를 합성하는 기술이 존재한다. 다만, 현존하고 있는 실리카 합성 방법을 통해 제조된 실리카 나노입자들은 비교적 단순한 구조를 가지며 그 크기가 명확하게 조절되지 않고 불규칙한 입자 크기로만 제작된다는 한계가 존재한다. 이에 따라 생물학적 응용 분야에 적용하기에 적합하지 않다는 평가를 받고 있다.

또한, 바이러스 입자는 유기-무기 복합체를 형성하기 위한 좋은 기반으로 활용될 가능성이 존재하나, 바이러스 입자 자체를 이용하여 유기-무기 복합체를 합성하는 경우 바이러스 유전체, 바이러스 단백질을 포함하고 있어 생체 내에서 부작용을 일으킬 가능성이 높아 활발하게 연구가 이루어지지 못하고 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 효과적으로 생물학적 응용 분야에 활용할 수 있는 실리카를 제조하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 바이러스 피막 단백질을 활용하여 실리카 나노입자를 제조하는 경우 우수한 생체안정성 및 활용 가능성을 가질 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

KR 등록특허공보 제10-0565764호 KR 등록특허공보 제10-1395394호

본 발명의 목적은 바이러스 피막 단백질(virus coat protein) 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체, 및 이를 배양하여 수득한 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 형성 조성물 및 실리카 형성 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이러스 피막 단백질(virus coat protein) 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 수득한 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 바이러스유사 입자를 포함하는, 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 형성 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 실리카 전구체와 반응시키는 단계;를 포함하는, 실리카 형성 방법을 제공한다.

본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 바이러스 입자(viral particle)가 아닌 바이러스 유사 입자(virus like particle)만을 제조하는 바이러스 피막 단백질을 이용하여 생체 내에서 안전성을 가지는 물질로, 본 발명의 실리카 형성 방법에 의하여 제조된 실리카 입자의 크기가 일정하게 조절될 수 있다는 이점이 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 기존의 실리카 나노입자 제조 방법에 비하여 비교적 간단하게 실리카를 제조할 수 있으며, 제조된 복합체 표면에 자연적으로 작은 구멍(pore)이 형성되는 바, 운반체(carrier)로 활용될 수 있다. 따라서 본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 의약 분야, 생물학적 분야, 나노기술 분야 등을 포함한 다양한 분야에서 약물 전달체, 진단 물질 등으로 활용할 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합단백질 발현 벡터를 도식화하여 나타낸 도로, 구체적으로 도 2a는 HPV16 L1-R5 융합 단백질, 도 2b는 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질, 도 2c는 TMV CP-R5 융합 단백질, 도 2d는 TMV CP-R5-His 융합 단백질의 발현 벡터를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 3은 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도로, 구체적으로 도 3a는 HPV16 L1-R5 융합 단백질과 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질의 수용성 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 3b는 HPV16 L1-R5 융합 단백질을 두 가지의 크로마토그래피를 통해 정제하여 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 도이며, 도 3c는 SDS-PAGE를 이용하여 TMV CP-R5 융합 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합단백질 기반의 바이러스 유사 입자의 형성을 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 4a는 HPV16 L1-R5 융합 단백질에 대한 바이러스 유사 입자 형성을 확인한 결과를 나타내고, 도 4b는 TMV CP-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자 형성을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합단백질인 HPV16 L1-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 통한 실리카 입자 형성을 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 5a 및 5b는 SEM을 통한 실리카 입자 형성을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 5c는 에너지분산형 분광분석법을 통하여 상기 바이러스 유사입자의 구성을 분석한 결과를 나타내는 도이며, 도 5d는 동적 광 산란 기술을 이용하여 실리카 형성 전후의 융합 단백질의 입자 크기를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 SEM을 통하여 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합단백질인 HPV16 L1-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 통한 실리카 입자 형성을 확인한 결과를 나타내는 도이다.

본 발명은 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 이용한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체 및 실리카 형성 조성물 등을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

일례로, 본 발명은 바이러스 피막 단백질(virus coat protein) 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어서, '바이러스'는 살아 있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 수백 μm 이하의 감염성 입자를 지칭하는 것으로, 에너지적으로 안정한 일부 바이러스만이 바이러스 유사 입자를 생성할 수 있다.

본 발명에 있어서, '바이러스 유사 입자(virus like particle)’는 바이러스와 유사하나, 바이러스 게놈 물질을 포함하지 않아 감염성이 존재하지 않는 물질로, 피막 단백질(capside protein, coat protein)의 자가 조립(self assambly)을 통하여 형성되는 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, 상기 피막 단백질의 유래가 되는 바이러스는 ‘바이러스 유사 입자를 생성할 수 있는 바이러스’라면 제한없이 포함될 수 있으며, 상기 바이러스 유사 입자를 생성할 수 있는 바이러스는 상기에 언급한 바와 같이 바이러스 게놈 없이도 피막 단백질의 자가 조립에 의해 형성되는 바이러스 유사 입자를 제조할 수 있는 바이러스로 에너지 차원에서 매우 안정한 바이러스이다.

본 발명에 있어서, 상기 ‘바이러스 유사 입자를 생성할 수 있는 바이러스’는 GMV(Johnsongrasee mosaic virus), SeMV(Sesbania mosaic virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 전염성 파브리우스 낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus), 로타 바이러스(Rotavirus), 감자 바이러스 Y(Potyvirus Y), 토티 바이러스(Totivirus), 인체 유두종 바이러스(HPV), 담배모자이크 바이러스(TMV), CCMV(Cowpea Chlorotic Mottle Virus), BMV(Brome Mosaic Virus), 박테리오파지 MS2, TYMV(Turnip yellow mosaic virus), CMV(Cucumber mosaic virus), HBV(Human hepatitis B virus) 또는 노로바이러스(Norovirus)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 HPV, TMV 또는 노로바이러스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 HPV, TMV일 수 있다.

본 발명에 있어서, '바이러스 피막 단백질'은 바이러스의 단백질 껍질(coat protein, capsid protein)을 형성하는 데 관여하는 단백질로, 바이러스 구조를 이루는 단백질이다. 본 발명의 바이러스 피막 단백질은 상기 바이러스 유사 입자를 생성할 수 있는 바이러스로부터 수득할 수 있는 피막 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 HPV L1, TMV CP 단백질일 수 있다. 상기 바이러스 피막 단백질은 N-말단의 일부 단백질이 결실된 형태, 예를 들어 N-말단의 1 내지 50 개의 아미노산이 결실된 형태를 포함하며, 예를 들어, HPV L1의 N-말단의 10개 아미노산이 결실된 HPV 16 L1 △N10 단백질이 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, TMV CP 피막 단백질을 이용할 경우, 바람직하게는 50 번째 글루타민산과 77 번째 아스파탐산이 각각 글루타민과 아스파라긴으로 변형된 피막 단백질일 수 있다.

상기와 같이, 피막 단백질의 종류 혹은 상기 단백질의 길이를 조절하는 경우, 이로부터 수득되는 바이러스 유사 입자가 다양한 크기로 제조될 수 있다. 따라서, 최종 제조된 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체의 크기를 각 활용 분야에 맞추어 조절할 수 있는 바, 이를 산업적으로 활용하는 경우 이점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스 피막 단백질을 이용하여 융합 단백질을 제조하는 경우, 상기 바이러스 피막 단백질의 펩타이드 서열 전체 또는 일부를 선택하여 사용할 수 있다. 이에 본 발명에 사용되는 바이러스 피막 단백질은 서열번호 19, 20 또는 21의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, '실리카 형성 펩타이드'는 실리카를 형성할 수 있는 펩타이드로, 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있는 펩타이드를 총징하는 것으로, 바람직하게는 미세조류 유래의 실리카 형성 펩타이드일 수 있으며, 보다 바람직하게는 실라핀(silaffin) 유래의 실리카 형성 펩타이드일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, '융합 단백질'은 2 이상의 단백질을 조합하여 인위적으로 합성한 단백질을 지칭한다.

상기 융합 단백질의 구조는 바람직하게는 실리카 형성 펩타이드가 바이러스 피막 단백질 유래 펩타이드의 중간 또는 C 말단에 삽입된 것을 특징으로 하며, 실리카 형성 펩타이드가 삽입되어 바이러스 피막 단백질 내 단량체 간의 상호작용을 방해하지 않고 각 단백질의 발현량에 영향이 없는 한 어떤 구조든 가능하다.

구체적으로는 입방 대칭 바이러스의 피막 단백질 유래 펩타이드에 대해서는 실리카 형성 펩타이드가 중간에 삽입되는 것이 바람직하며, 나선 대칭 형태의 바이러스 피막 단백질 유래 펩타이드에 대해서는 실리카 형성 펩타이드가 C 말단에 삽입되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, HPV L1 피막 단백질을 활용하여 본 발명을 실시하는 경우, 단백질 내 6개의 고리(B-C, C-D, D-E, E-F, F-G, H-I) 중 F-G 고리에 실리카 형성 펩타이드를 삽입할 수 있고, TMV CP 피막 단백질을 활용하여 본 발명을 실시하는 경우, 상기 단백질의 C-말단에 실리카 형성 펩타이드를 삽입할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 융합 단백질 중간에 링커 펩타이드(linker peptide)를 더 포함하거나 C 말단에 태그 펩타이드(tag peptide)를 더 포함할 수 있다.

상기 태그 펩타이드는 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 본 발명의 태그 펩타이드는 생성되는 단백질의 정제 효율을 높이기 위하여 사용될 수 있는 태그 펩타이드라면 제한없이 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광 분자를 암호화하는 펩타이드일 수도 있고, Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘(His) 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 보다 바람직하게는 히스티딘 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 이 기술 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성법, PCR 또는 공지된 방법으로 폴리펩타이드를 합성한 후 발현 벡터에 클로닝하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 발현 벡터를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 22, 23 또는 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 융합 단백질은 서열번호 22, 23 또는 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 22, 23 또는 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 22, 23 또는 24로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

종합적으로, 바이러스 내에 실리카 형성 펩타이드를 도입한 후 상기 바이러스로 숙주에 감염시켜 얻은 ‘바이러스 입자(viral particle, 바이러스 게놈 포함)’에 실리카가 코팅된 것을 특징으로 하는 종래 발명과는 달리, 본 발명은 바이러스 피막 단백질만을 분리하고 실리카 형성 펩타이드와의 융합을 통해 제조한 융합 단백질로부터 ‘바이러스 유사 입자(virus like particle, 바이러스 게놈 미포함)’에 실리카가 코팅된 것을 특징으로 한다. 이에 따라 감염성에 대한 염려 없이 일정 규격을 가지는 바이러스 유사 입자를 이용하여 크키가 조절된 본 발명의 ‘3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체’는 약품 전달체 또는 진단 물질 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, '폴리뉴클레오티드'는 뉴클레오티드(nucleotide) 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬모양으로 이루어진 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하는 것으로, 일정 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 지칭한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방식은 당업계에서 사용되는 방법을 사용할 수 있으며 바람직하게는 PCR, 화학적 방법을 통하여 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 오버랩 PCR(overlap PCR)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 11, 17 또는 18 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때 본 발명은 상기 염기서열의 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 본 발명의 바이러스 피막 단백질 유래 펩타이드 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 서열번호 8, 11, 17 또는 18의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, '발현 벡터'는 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 '작동가능하게 연결(operably linked)'이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, '형질전환'은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체의 통합 완성에 의하여 복제 가능하게 되는 것을 지칭하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 프로모터와 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 있고, 하기 언급한 바와 같이 GST와 같은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 항생제 내성 유전자 등을 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 도 2a 내지 2d에 개시한 도의 구조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 프로모터는 하기의 형질전환체 내에서 작동이 가능한 프로모터, 즉 형질전환체인 숙주에서 작동가능한 프로모터라면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명에 있어서 사용가능한 프로모터는 T7 프로모터 또는 tac 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터 내에는 상기 폴리뉴클레오티드의 N-말단에 글루타티온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase, GST), chitin binding protein (CBP) 또는 maltose binding protein (MBP)를 더 포함할 수 있으며, 이는 발현 벡터를 이용하여 수득할 수 있는 단백질의 수용성 및 정제 효율을 높일 수 있는 구성으로, 이에 본 발명의 발현 벡터의 구조가 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터의 백본(backbone)으로 사용할 수 있는 벡터는 융합단백질을 생산할 수 있는한 특별히 제한되지는 않으나, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pGEX-4T-1, pET, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 유래 플라스미드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 pGEX-4T-1 또는 pET일 수 있으나, 이는 실험에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, CaCl₂ 침전법에 효율을 높인 열충격법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 열충격법 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 열충격법이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주는 본 발명의 융합단백질을생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포, 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포, 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포, CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포, 또는 식물 세포를 이용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 대장균 세포를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스 유사 입자는 상온에서 자가조립(self-assembly)을 통하여 융합 단백질로부터 생성될 수 있으나, 이는 조건이 적절하게 주어지는 경우에 이루어지는 것이 특징이다.

또 다른 예로, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체를 제공한다.

본 발명에 있어서, '복합체'는 두 가지 이상의 물체가 모여서 된 물체를 지칭하는 것으로, 본 발명의 복합체는 유기-무기 복합체의 일종으로 유기 고분자와 무기물에 기초한 유기-무기 혼성 복합체로 유기성분과 무기성분을 결함함으로써 무기물의 경도, 안정성, 투명성, 유기 고분자의 저온공정특성, 유연성 및 인성 등을 동시에 얻을 수 있다는 특징이 있다.

본 발명에 있어서, '실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체'는 무기성분인 실리카와 유기성분인 바이러스 유사 입자가 결합되어 만들어진 복합체로, 바람직하게는 복합 쉘 내에 빈 구멍이 형성된 캡슐 구조 또는 코어-쉘(core-shell) 구조를 가지는 복합체인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 복합 셀 내 빈 구멍이 형성된 캡슐 구조인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 포어(pore)를 포함하는 바이러스 유사 입자 복합체 외부에 실리카가 코팅된 복합체를 지칭한다. 이에 따라 바이러스 유사 입자 내 포어에 약물이나 진단 시약 등을 포함시켜 다양한 약물 전달체 또는 진단 물질 등으로 활용할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 형성 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, '실리카 형성'은 실리카를 형성할 수 있는 공지의 물질을 1 이상 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 실리카 형성 조성물은 실리카 전구체를 더 포함할 수 있고, 상기 실리카 전구체는 테트라에틸오르토실리케이트, 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라메톡시실란, 테트라에톡시실란, 메틸트리에톡시실란, 페닐트리에톡시실란, 디메틸디메톡시실란, 에틸트리에톡시실란, 티타니아테트라이소프로폭사이드 또는 테트라에틸 게르마늄일 수 있으며, 바람직하게는 테트라메톡시실란 또는 테트라에톡시실란일 수 있고, 보다 바람직하게는 테트라메톡시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질 발현 벡터의 제작

1-1. HPV16 L1-R5 융합 단백질의 발현 벡터 제작

HPV 16 L1-R5 융합 단백질 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 Genescript 사로부터 공급받은 합성된 HPV16 L1(서열번호 1)을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 HPV16 L1-F 프라이머 및 HPV16 L1-R5-R 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR; polymerase chain reaction)을 수행하였다. 그 결과로 HPV16 L1의 6개 고리들(B-C, C-D, D-E, E-F, F-G, H-I) 중 F-G 고리에 실리카 형성 펩타이드인 R5 펩타이드(서열번호 25)가 도입된 유전자 단편 1(서열번호 4)을 얻었다.

이와 별개로, Genescript 사로부터 공급받은 합성된 HPV16 L1(서열번호 1)을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 HPV16 L1-R5-F 프라이머 및 HPV16 L1-R 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 방법을 수행하였다. 그 결과로 R5 펩타이드(서열번호 25)를 암호화하는 유전자가 도입된 또 다른 유전자 단편 2(서열번호 7)를 얻었다.

그리고 나서, 상기 단편 1 및 2를 주형으로 하여, 표 1의 HPV16 L1-F 프라이머 및 HPV16 L1-R 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR(overlap PCR)을 통해 F-G 고리에 R5 펩타이드를 암호화하는 유전자가 도입된 HPV16 L1 유전자(HPV16 L1-R5 유전자; 서열번호 8)를 얻었다. 이 후 상기 증폭된 HPV16 L1-R5 유전자를 pGEX-4T-1(GE Healthcare, 미국) 벡터의 BamHI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 pGEX-HPV16 L1-R5 벡터를 제조하였다. 상기 유전자 단편이 삽입된 벡터를 도식화하여 도 2a에 나타내었으며, 상기 벡터는 추후 생성되는 단백질의 수용성 증가, 분리 및 확인을 용이하게 하기 위하여 제한효소 삽입 자리 중 삽입 유전자의 N 말단 부위에 글루타티온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 암호화 유전자가 삽입되어 있다.

프라이머 명칭	서열번호	내용
HPV16 L1-F	서열번호 2	gcgcggatccagcctgtggctgccgagcgaagcg
HPV16 L1-R5-R	서열번호 3	cgccaaccagaatgcgacgtttagaacctttcgagcctgaataggagccagattttttgctgctggtacccgcacggttaaacagg
HPV16 L1-R5-F	서열번호 5	Gcgggtaccagcagcaaaaaatctggctcctattcaggctcgaaaggttctaaacgtcgcattctggttggcgaaaacgtgccggacg
HPV16 L1-R	서열번호 6	Gcgcctcgagttacagtttacgcttcttacgcttcgc
HPV16 L1 △N10-F	서열번호 9	gcgcggatccgtttatctgccgccggttccg

1-2. HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질의 발현 벡터 제작

HPV 16 L1 △N10은 HPV 16 L1 단백질의 N 말단의 10개의 아미노산이 결실된 단백질로 본 실시예에서는 HPV 16 L1 △N10-R5 융합 단백질 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 Genescript 사로부터 공급받은 합성된 (서열번호 1)을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 상기 표 1 에 개시된 HPV16 L1 △N10-F 프라이머 및 HPV16 L1-R5-R 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 그 결과로 HPV16 L1의 6개 고리들 (B-C, C-D, D-E, E-F, F-G, H-I) 중 F-G 고리에 실리카 형성 단백질인 R5 펩타이드(서열번호 25)를 암호화하는 유전자가 도입된 증폭된 유전자 단편 3(서열번호 10)을 얻었다.

이와 별개로, Genescript 사로부터 공급받은 합성된 (서열번호 1)을 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 상기 표 1에 개시된 HPV16 L1-R5-F 프라이머 및 HPV16 L1-R 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 방법을 수행하였다. 그 결과로 R5 펩타이드를 암호화하는 유전자가 도입된 또 다른 증폭된 단편 2(서열번호 7)를 얻었다.

그리고 나서, 상기 단편 3 및 2를 주형으로 하여, 표 1의 HPV16 L1 △N10-F 프라이머 및 HPV16 L1-R 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR을 통해 F-G 고리에 R5 펩타이드가 도입된 HPV16 L1 △N10 유전자(HPV16 L1 △N10-R5 유전자; 서열번호 11)를 얻었다. 이 후 증폭된 HPV16 L1 △N10-R5 유전자를 pGEX-4T-1 (GE Healthcare, 미국) 벡터의 BamHI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 pGEX-HPV16 L1 △N10-R5 벡터를 제조하였다. 상기 유전자 단편이 삽입된 벡터를 도식화하여 도 2b에 나타내었으며, 상기 벡터로부터 생성된 단백질의 수용성 증가, 상기 벡터는 추후 생성되는 단백질의 수용성 증가, 분리 및 확인을 용이하게 하기 위하여 제한효소 삽입 자리 중 삽입 유전자의 N 말단 부위에 글루타티온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 암호화 유전자가 삽입되어 있다.

1-3. TMV CP-R5 융합 단백질의 발현 벡터 제작

TMV CP-R5 융합 단백질 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 Genescript로부터 합성된 TMV CP(서열번호 12)를 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 2에 개시된 3개의 프라이머, 즉 TMV CP-F 프라이머, TMV CP-R5-R1 프라이머 및 TMV CP-R5-R2 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR을 수행하였다. 그 결과로 상기 TMV CP 유전자의 C-말단에 실리카 형성 단백질인 R5 펩타이드(서열번호 25)를 암호화하는 유전자가 도입된 증폭된 유전자 단편인 TMV CP-R5(서열 번호 17)를 얻었다. 한편, 상기 서열번호 12의 TMV CP 유전자는 공지된 유전자로부터 발현되는 단백질 내 아미노산과 2개가 상이해지도록 발현되는 서열(50 번째 글루타민산과 77 번째 아스파탐산이 각각 글루타민과 아스파라긴으로 변형)이다. 상기 아미노산 2개가 상이해지는 경우 RNA의 존재 여부에 무관하게 3차원의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다는 특징이 있다.

이와 별개로, Genescript로부터 합성된 TMV CP(서열번호 12)를 암호화하는 유전자가 포함된 벡터를 주형으로 하여, 표 2에 개시된 TMV CP-R5-His-R 프라이머 및 TMV CP-R5-R2 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR을 수행하였다. 그 결과로 상기 TMV CP에 실리카 형성 단백질인 R5 펩타이드를 암호화하는 유전자가 도입된 증폭된 유전자 단편인 TMV CP-R5-His(서열 번호 18)를 얻었다. 상기 His-tag은 추후 상기 유전자가 단백질로 발현되는 경우, 발현된 단백질의 C-말단에 부착되어 단백질의 정제 및 확인이 가능하게 하는 특징이 있다.

이 후 각 증폭된 서열번호 17 및 18의 유전자 단편을 각각 pET 22b(+) (Novagen, 미국) 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 각각 pET-TMV CP-R5 벡터 및 pET-TMV CP-R5-His를 제조하였다. 상기 유전자 단편이 삽입된 벡터 중 전자를 도식화한 것은 도 2c에, 후자를 도식화한 것은 도 2d에 나타내었다.

프라이머 명칭	서열번호	내용
TMV CP-F	서열번호 13	CATATGTCGTATAGCATTACCACCCC
TMV CP-R5-R1	서열번호 14	CTCGAGTCACAGAATGCGACGTTTAGAACCTTTCGAGCCTGAATAGGAGCCAGATTTTTTGCTG
TMV CP-R5-R2	서열번호 15	CTCTGGTCCGGCAACCGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGAGGCAGTAGCAGCAAAAAATCTGG
TMV CP-R5-His-R	서열번호 16	CTCGAGCAGAATGCGACGTTTAGAACCTTTCGAGCCTGAATAGGAGCCAGATTTTTTGCTG

실시예 2. 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

2-1. HPV16 L1-R5 융합 단백질의 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질인 HPV16 L1-R5 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체를 제조하기 위하여, 먼저 대장균 TOP 10(Novagen 사) 및 대장균 BL21(Novagen 사) 또는 대장균 BL21(DE3, Novagen 사)에 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 수용(competent) 세포를 만들었다. 이 후, 42 °C에서 2분간 방치하는 열충격 방법을 이용하여 상기 수용 세포를 실시예 1-1에서 제조한 벡터로 형질전환하였다. 그리고 나서 벡터 내 포함되어 있던 암피실린 내성 유전자를 이용하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 추가적으로 벡터 내 tac 프로모터 또는 T7 프로모터의 반응을 이용하여 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)을 통한 단백질의 발현을 유도하였다.

2-2. HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

3차원 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질인 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체의 제조는 실시예 1-1에서 제조한 벡터 대신 실시예 1-2에서 제조한 벡터를 사용한 것 외에는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

2-3. TMV CP-R5(His) 융합 단백질의 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

3차원 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질인 TMV CP-R5 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체의 제조는 실시예 1-1에서 제조한 벡터 대신 실시예 1-3에서 제조한 벡터를 사용한 것 외에는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

2-4. SDS-PAGE를 통한 형질전환체로부터 단백질 발현 확인 및 정제

SDS-PAGE 수행을 통하여, 상기 실시예 2-1 내지 2-3에서 제조한 형질전환체로부터 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드의 융합 단백질이 발현되는 지 여부, 즉 형질전환이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.8~0.9 정도가 되었을 때 tac 프로모터 또는 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다.

2-4-1. HPV16 L1-R5 및 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질의 발현 확인 및 정제

HPV16 L1-R5 융합 단백질과 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질을 발현시키기 위해 실시예 2-1 및 2-2에서 제조한 형질전환체를 12시간 동안 30°C 배양기에서 배양하였다. 이 후 상기 배양된 형질전환체를 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 7.3 결합 용액(140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)에 부유시킨 다음 초음파 해체기(sonicator)를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플의 일부는 전세포 파쇄액(whole cell lysate), 수용성 분액(soluble fraction) 그리고 불용성 분액(insoluble fraction)으로 나누었으며, HPV16 L1-R5 융합 단백질과 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질의 수용액 분액의 존재 여부를 확인하기 위해 수용성 분액을 SDS-PAGE용 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue)에 희석한 후 100°C에서 15분간 끊여 변형시켰으며, 이 후 15% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 3a에 나타내었다. 나머지 파쇄된 샘플은 10,000 g에서 15분간 원심분리하여 상등액만을 회수하였다.

그리고 나서 GST(Glutathione) 컬럼을 이용한 친화력 크로마토그래피(Affinity chromatography) 및 젤 여과 크로마토그래피(gel-permeation chromatography)를 통해 HPV16 L1-R5 융합 단백질이 발현된 세포 파쇄물의 상등액으로부터 수용액으로 발현되는 HPV16 L1-R5 융합 단백질(서열번호 22, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)을 분리 정제하였다.

이 후, 상기 수용성 분액과 크로마토그래피로 정제한 단백질을 SDS-PAGE용 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue)에 희석한 후 100°C에서 15분간 끊여 변형시켰으며, 이 후 15% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 3b에 나타내었으며, 1 레인(lane)은 HPV16 L1-R5 융합 단백질에 대한 결과, 2 레인은 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질에 대한 결과를 나타낸 것이다.

도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1 및 2-2를 통해 제조한 형질전환체 각각으로부터 100%의 순도로 HPV16 L1-R5가 제조됨을 확인하였으며, HPV16 L1-R5 융합 단백질과 HPV16 L1 △N10-R5 융합 단백질은 수용성 분액으로 발현됨을 확인하였다.

2-4-2. TMV CP-R5(His) 융합 단백질의 발현 확인 및 정제

TMV CP-R5 융합 단백질을 발현시키기 위해 실시예 2-3에서 제조한 형질전환체를 12시간 동안 TMV CP-R5 융합 단백질을 최대로 발현시키는 온도인 25 °C 조건의 배양기에서 배양하였다. 이 후, 상기 배양된 형질전환체를 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8 결합 용액(140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)에 부유시킨 다음 초음파 해체기(sonicator)를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플의 일부는 전세포 파쇄액(whole cell lysate), 수용성 분액(soluble fraction) 그리고 불용성 분액(insoluble fraction)으로 나누었으며, 상기 TMV CP-R5 융합 단백질이 발현된 세포 파쇄물의 상등액을 Ni-NTA 컬럼을 이용한 친화력 크로마토그래피(Affinity chromatography)를 통해 수용액으로 발현된 TMV CP-R5 융합 단백질을 분리 정제하였다.

이 후, 상기 수용성 분액과 크로마토그래피로 정제한 단백질을 SDS-PAGE용 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue)에 희석한 후 100°C에서 15분간 끊여 변형시켰으며, 이 후 15% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 3c에 나타내었으며, 1 레인(lane)은 TMV 단백질에 대한 결과, 2레인은 TMV CP-R5 융합 단백질(서열번호 24)에 대한 결과, 3 레인은 TMV CP-R5-His 융합 단백질에 대한 결과를 나타낸 것이다. 동일한 방법으로 배양 및 정제하여 얻은 TMV 단백질은 대조군으로 실험하였다.

종합적으로, 상기 융합 단백질은 실리카 형성 펩타이드가 바이러스 피막 단백질 유래 펩타이드의 중간 또는 C 말단에 삽입된 것을 특징으로 하며, 벡터에 의해 정상적으로 발현됨을 확인하였다.

실시예 3. 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질 기반의 3차원 바이러스 유사 입자(virus like particle) 형성 및 확인

3-1. HPV16 L1-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자 형성 및 확인

실리카 형성 단백질인 R5 펩타이드가 도입되지 않은 HPV16 L1 단백질의 조립 조건을 이용하여 세포 외(in vitro)에서 HPV16 L1-R5 융합 단백질의 조립에 의한 바이러스 유사 입자 형성(virus like particle)을 유도하였다.

구체적으로, 100 μg/ml의 HPV16 L1-R5 융합 단백질(50 mM Tris-HCl, pH 8.0)을 조립 버퍼(40 mM sodium acetate, 1 M NaCl, pH 5.4)에 1시간 30분 동안 투석하여 버퍼 교환을 유도하였으며, 1시간 30분이 경과한 후 HPV16 L1-R5 융합 단백질은 글로우 방전 탄소 코팅된 그리드(glow-discharged, carbon-coated grid)에 코팅하고 2% (w/v) 아세트산 우라늄으로 염색하였다. 상기 과정을 통해 유도된 바이러스 유사 입자 형성 결과는 투과형 전자 현미경(TEM)을 이용하여 관찰하였다. 관찰 결과는 도 4a에 나타내었다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 일부 15~20 nm 크기의 HPV16 L1 오량체(pentamer)와 함께 50~70 nm 크기의 HPV16 L1-R5 융합 단백질에 의한 바이러스 유사 입자가 형성되는 것을 확인하였다.

3-2. TMV CP-R5(His) 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자 형성 및 확인

실시예 2-3을 통해 TMV CP-R5 융합 단백질 형성과 함께 세포 내(in vivo) 에서 TMV CP-R5 융합 단백질의 조립에 의한 바이러스 유사 입자 형성(virus like particle)이 가능한지 여부를 확인하였다. 구체적으로. 세포 내에서 조립(assembly)이 이루어져 TMV CP-R5 융합 단백질이 발현된 세포에 2% 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 세포 고정을 하고 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide) 및 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하였다. 염색한 세포는 투과형 전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다. 그 결과는 도 4b에 나타내었다.

도 4b 내 붉은색 박스 내에 나타낸 바와 같이, 세포 내에서 약 100 nm 길이 및 20 nm 크기의 직경을 가지는 막대 형태로 바이러스 유사 입자가 형성됨을 확인할 수 있다.

실시예 4. 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질 기반의 3차원 바이러스 유사 입자를 통한 실리카(silica) 입자 형성 및 확인

본 발명의 궁극적인 목표인, 바이러스 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 단백질로부터 실리카 입자를 형성할 수 있는 지 여부를 확인하였다.

4-1. HPV16 L1-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 통한 실리카 입자 형성 및 확인

실시예 3-1에서 형성한 바이러스 유사 입자에 50%의 글리세롤이 포함된 바이러스 유사 입자 용액(50%의 글리세롤, 40 mM sodium acetate, 1 M NaCl, pH 5.4)을 제조하고, 이 후 테트라메톡시실란(Tetramethoxysilane; TMS)을 더 첨가하여 최종 농도가 100 mM이 되도록 하였다. 상기 용액을 25 °C에서 12 시간 동안 반응시킨 후, 12,000 g에서 30분 동안 원심분리를 수행하였으며, 수행 결과 분리된 상등액과 펠렛(pellet)을 분리하였다. 상기 펠렛은 조립 버퍼(40 mM sodium acetate, 1 M NaCl, pH 5.4)를 첨가하여 재부유시켰다. 이 후에 상기 상등액과 재부유시킨 펠렛을 포함하는 용액을 한 번에 폴리스티렌(polystyrene)으로 코팅하였다. 코팅된 물질을 주사형 전자 현미경(SEM)을 통해 관찰하였다. 그 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.

또한, 이 기술분야에서 통상적으로 사용되는 에너지분산형 분광분석법(energy dispersive spectrometry, EDS)을 통하여 SEM으로 관찰한 물질의 구성을 분석하여 도 5c에 나타내었으며, 동적 광 산란(dynamic light scattering)기술을 이용하여 실리카 형성 전후의 융합 단백질의 입자 크기를 측정하여 도 5d에 나타내었다.

도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 실리카가 코팅된 바이러스 유사 입자를 확인할 수 있다. 또한, 도 5c 및 도 5d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이러스 유사 입자가 존재하는 상등액에서는 실리카(SiO₂)의 구성요소인 규소 및 산소 입자가 모두 존재함을 확인하였다. 더욱이 상기 바이러스 유사 입자는 실리카 형성으로 인하여 입자의 크기가 증가하였음을 확인하였다. 이는 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 구성으로 하는 HPV16 L1-R5 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 이용하여 실리카가 코팅된 바이러스 유사 입자를 만들 수 있음을 나타낸다.

4-2. TMV CP-R5(His) 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 통한 실리카 입자 형성 및 확인

실시예 3-2에서 형성한 바이러스 유사 입자에 테트라메톡시실란(Tetramethoxysilane; TMS)를 첨가하여 최종 농도가 100 nM이 되도록 하였다. 상기 용액을 25 ℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 12,000 g에서 1분 동안 원심분리를 수행하였으며, 수행 결과 분리된 상등액과 펠렛(pellet)을 분리하였다. 상기 펠렛은 정제수(water)로 2회 반복 세척한 후 정제수에 재부유시켰다. 이 후에 상기 상등액과 상기 재부유시킨 펠렛을 폴리스티렌(polystyrene)으로 코팅하였다. 코팅된 물질을 주사형 전자 현미경(SEM)을 통해 관찰하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 막대 모양의 실리카가 코팅된 바이러스 유사 입자를 확인할 수 있다. 즉, 피막 단백질 및 실리카 형성 펩타이드를 구성으로 하는 TMV CP-R5(His) 융합 단백질 기반의 바이러스 유사 입자를 이용하여 실리카 입자를 형성할 수 있음을 확인하였다.

종합적으로, 본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 바이러스 입자(viral particle)가 아닌 바이러스 유사 입자(virus like particle)만을 제조하는 바이러스 피막 단백질을 이용하여 생체 내에서 안전성을 가지는 물질로, 본 발명의 실리카 형성 방법에 의하여 제조된 실리카 입자의 크기가 일정하게 조절될 수 있다는 이점이 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 기존의 실리카 나노입자 제조 방법에 비하여 비교적 간단하게 실리카를 제조할 수 있으며, 제조된 복합체 표면에 자연적으로 작은 구멍(pore)이 형성되는 바, 운반체(carrier)로 활용될 수 있다. 따라서 본 발명의 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 활용하여 제조한 3차원 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체는 의약 분야, 생물학적 분야, 나노기술 분야 등을 포함한 다양한 분야에서 약물 전달체, 진단 물질 등으로 활용할 수 있다는 이점이 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> A fusion protein comprising virus coat protein and silica forming peptide and its use <130> POSTECH1-29P-1 <140> 10-2017-0055544 <141> 2017-04-28 <150> KR 10-2016-0056971 <151> 2016-05-10 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 protein coding gene <400> 1 atgagcctgt ggctgccgag cgaagcgacc gtttatctgc cgccggttcc ggttagcaaa 60 gttgttagca ccgacgagta tgttgcgcgt accaacatct actatcatgc gggtaccagc 120 cgtctgctgg cggttggtca cccgtacttc ccgatcaaga aaccgaacaa caacaaaatt 180 ctggttccga aagtgagcgg cctgcagtat cgtgtgttcc gtattcacct gccggacccg 240 aacaaattcg gttttccgga caccagcttt tacaacccgg atacccaacg tctggtttgg 300 gcgtgcgtgg gcgttgaggt gggtcgtggt caaccgctgg gtgtgggtat cagcggtcac 360 ccgctgctga acaaactgga cgataccgaa aacgcgagcg cgtacgcggc gaacgcgggt 420 gttgacaacc gtgaatgcat tagcatggat tataagcaga cccaactgtg cctgatcggc 480 tgcaaaccgc cgattggcga gcactggggc aagggcagcc cgtgcaccaa cgttgcggtg 540 aacccgggtg actgcccgcc gctggaactg atcaacaccg ttattcagga cggtgatatg 600 gtggacaccg gtttcggcgc gatggatttt accaccctgc aagcgaacaa gagcgaggtt 660 ccgctggaca tctgcaccag catttgcaaa tacccggatt atatcaagat ggttagcgag 720 ccgtacggcg atagcctgtt cttttatctg cgtcgtgaac agatgttcgt gcgtcacctg 780 tttaaccgtg cgggtaccgt tggcgaaaac gtgccggacg atctgtacat taaaggtagc 840 ggtagcaccg cgaacctggc gagcagcaac tatttcccga ccccgagcgg tagcatggtt 900 accagcgacg cgcagatctt taacaagccg tactggctgc agcgtgcgca aggtcacaac 960 aacggcattt gctggggtaa ccaactgttc gtgaccgtgg ttgataccac ccgtagcacc 1020 aacatgagcc tgtgcgcggc gatcagcacc agcgagacca cctataaaaa caccaacttt 1080 aaggaatacc tgcgtcacgg cgaggaatat gacctgcagt tcatctttca actgtgcaaa 1140 attaccctga ccgcggatgt tatgacctac atccacagca tgaacagcac cattctggag 1200 gattggaact ttggtctgca gccgccgccg ggtggtaccc tggaagatac ctatcgtttt 1260 gttaccagcc aggcgattgc gtgccaaaaa cataccccgc cggcgccgaa ggaagacccg 1320 ctgaagaaat acaccttctg ggaagtgaac ctgaaggaaa aatttagcgc ggacctggat 1380 cagttcccgc tgggtcgtaa atttctgctg caagcgggtc tgaaggcgaa accgaagttc 1440 accctgggca agcgtaacgc gaccccgacc accagcagca ccagcaccac cgcgaagcgt 1500 aagaagcgta aactgtaa 1518 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1-F primer <400> 2 gcgcggatcc agcctgtggc tgccgagcga agcg 34 <210> 3 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1-R5-R primer <400> 3 cgccaaccag aatgcgacgt ttagaacctt tcgagcctga ataggagcca gattttttgc 60 tgctggtacc cgcacggtta aacagg 86 <210> 4 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 1 <400> 4 gcgccatatg agcctgtggc tgccgagcga agcgaccgtt tatctgccgc cggttccggt 60 tagcaaagtt gttagcaccg acgagtatgt tgcgcgtacc aacatctact atcatgcggg 120 taccagccgt ctgctggcgg ttggtcaccc gtacttcccg atcaagaaac cgaacaacaa 180 caaaattctg gttccgaaag tgagcggcct gcagtatcgt gtgttccgta ttcacctgcc 240 ggacccgaac aaattcggtt ttccggacac cagcttttac aacccggata cccaacgtct 300 ggtttgggcg tgcgtgggcg 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ccggtttcgg cgcgatggat 600 tttaccaccc tgcaagcgaa caagagcgag gttccgctgg acatctgcac cagcatttgc 660 aaatacccgg attatatcaa gatggttagc gagccgtacg gcgatagcct gttcttttat 720 ctgcgtcgtg aacagatgtt cgtgcgtcac ctgtttaacc gtgcgggtac cagcagcaaa 780 aaatctggct cctattcagg ctcgaaaggt tctaaacgtc gcattctggt tggcgaaaac 840 gtgccggacg atctgtacat taaaggtagc ggtagcaccg cgaacctggc gagcagcaac 900 tatttcccga ccccgagcgg tagcatggtt accagcgacg cgcagatctt taacaagccg 960 tactggctgc agcgtgcgca aggtcacaac aacggcattt gctggggtaa ccaactgttc 1020 gtgaccgtgg ttgataccac ccgtagcacc aacatgagcc tgtgcgcggc gatcagcacc 1080 agcgagacca cctataaaaa caccaacttt aaggaatacc tgcgtcacgg cgaggaatat 1140 gacctgcagt tcatctttca actgtgcaaa attaccctga ccgcggatgt tatgacctac 1200 atccacagca tgaacagcac cattctggag gattggaact ttggtctgca gccgccgccg 1260 ggtggtaccc tggaagatac ctatcgtttt gttaccagcc aggcgattgc gtgccaaaaa 1320 cataccccgc cggcgccgaa ggaagacccg ctgaagaaat acaccttctg ggaagtgaac 1380 ctgaaggaaa aatttagcgc ggacctggat cagttcccgc tgggtcgtaa 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caacaatctg attgttgaac tgatccgcgg cacgggttcc 420 tataatcgtt cttcgtttga atcgtcgtcg ggcctggtgt ggacctctgg tccggcaacc 480 ggcggaggtg gcagcggcgg tggaggcagt agcagcaaaa aatctggctc ctattcaggc 540 tcgaaaggtt ctaaacgtcg cattctgtga ctcgag 576 <210> 18 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMV CP-R5-His fusion protein coding gene <400> 18 catatgtcgt atagcattac caccccgtcg caatttgtgt ttctgtcgag cgcctgggct 60 gacccgattg aactgattaa cctgtgtacc aacgctctgg gcaatcagtt tcaaacccag 120 caagcgcgta cggtggttca gcgccaattc agccaggtct ggaaaccgtc tccgcaagtc 180 accgtgcgtt ttccggatag cgacttcaaa gtttatcgct acaacgccgt tctgaatccg 240 ctggtcaccg cactgctggg tgcttttgat acgcgtaacc gcattatcga agtggaaaac 300 caggcgaatc cgaccaccgc ggaaaccctg gatgcaaccc gtcgcgtgga tgacgcgacc 360 gttgccattc gtagtgcgat caacaatctg attgttgaac tgatccgcgg cacgggttcc 420 tataatcgtt cttcgtttga atcgtcgtcg ggcctggtgt ggacctctgg tccggcaacc 480 ggcggaggtg gcagcggcgg tggaggcagt agcagcaaaa aatctggctc ctattcaggc 540 tcgaaaggtt ctaaacgtcg cattctgctc gag 573 <210> 19 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1 peptide sequence <400> 19 Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu 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Claims

바이러스 피막 단백질(virus coat protein) 유래 펩타이드 및 실리카 형성 펩타이드를 포함하며, 서열번호 22 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 피막 단백질의 유래가 되는 바이러스는 바이러스 유사 입자(virus like particle)를 생성할 수 있는 바이러스인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 실리카 형성 펩타이드가 바이러스 피막 단백질 유래 펩타이드의 중간 또는 C 말단에 삽입된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 C 말단에 태그(tag) 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
삭제
제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제11항의 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체.
제12항의 형질전환체를 배양하여 수득한 융합 단백질로부터 생산된 바이러스 유사 입자(virus like particle).
제13항의 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 및 바이러스 유사 입자 복합체.
제13항의 바이러스 유사 입자를 포함하는, 실리카 형성 조성물.
제13항의 바이러스 유사 입자를 실리카 전구체와 반응시키는 단계;를 포함하는, 실리카 형성 방법.
제16항에 있어서,
상기 실리카 전구체는 테트라에틸오르토실리케이트, 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라메톡시실란, 테트라에톡시실란, 메틸트리에톡시실란, 페닐트리에톡시실란, 디메틸디메톡시실란, 에틸트리에톡시실란, 티타니아테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 실리카 형성 방법.