KR100565764B1 - 환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및 이를포함하는 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성꼬리 영역인 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드, 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 환경 스트레스에 내성을 가지는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질을 결합시켜 환경 스트레스에 대한 단백질의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 환경 스트레스에 불안정한 단백질의 고유 성질을 나타내면서 온도, pH, 금속이온, 동결과 해동의 반복, 교반, 또는 고농도 조건과 같은 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는다.

시누클레인, 환경 스트레스, 융합 단백질, 단백질 응집, 스트레스 내성 단백질

Description

환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 {Novel Peptides Conferring Environmental Stress Resistance And Fusion Proteins Including Said Peptides}

도 1A는 N-말단 양친매성 영역(잔기 1-60), 소수성 NAC 영역(잔기 61-95) 및 C-말단 산성 꼬리(ATSα, 잔기 96-140)로 이루어진 α-시누클레인의 구성도이다.

도 1B는 열 불안정성 단백질 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)의 C-말단에 α-시누클레인 전체, 양친매성 영역, NAC 영역, NAC와 산성 꼬리 영역 및 산성 꼬리 영역의 펩타이드가 각각 결합되어 형성된 융합 단백질 GST-Syn1-140, GST-Syn1-60, GST-Syn61-95, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140의 구성도이다.

도 2는 α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과이다(래인 1: 열처리하지 않은 α-시누클레인; 래인 2: 열처리하지 않은 GST; 래인 3: 열처리한 α-시누클레인; 래인 4: 열처리한 GST).

도 3은 GST-α-시누클레인 융합 단백질을 트롬빈으로 처리하여 생성된 α-시누클레인 결실 돌연변이체의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 4A는 GST-α-시누클레인 융합 단백질을 끓이기 전(왼쪽 패널)과 후(오른 쪽 패널)의 GST-α-시누클레인 융합 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다(래인 1: GST-Syn1-140; 래인 2: GST-Syn1-60; 래인 3: GST-Syn61-95; 래인 4: GST-Syn61-140; 래인 5: GST-Syn96-140).

도 4B는 GST-α-시누클레인 융합 단백질들의 열에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 5A는 GST-Syn1-140의 열에 의해 유도된 응집에 미치는 2가 양이온의 영향을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 5B는 GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140의 열에 의해 유도된 응집에 미치는 2가 양이온의 영향을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 6A는 GST와 GST-시누클레인 융합 단백질을 열처리하기 전과 열처리한 후의 GST 활성을 비교하기 위해 측정한 흡광도를 그래프로 나타낸 것이다(■: 열처리 전; □:열처리 후)

도 6B는 GST와 GST-시누클레인 융합 단백질의 온도 변화에 따른 GST활성 (좌측)과 단백질 응집 (우측)을 측정한 그래프이다(-●-: GST; -○-: GST-Syn96-140; 바는 표준편차를 나타냄).

도 7A는 GST의 극-UV CD 스펙트럼과 융점 곡선을 나타낸 그래프이다(삽입된 그래프는 222nm에서의 온도에 따른 GST 단백질의 몰농도 타원율의 평균을 나타낸 것이다).

도 7B는 GST-Syn96-140의 극-UV CD 스펙트럼과 융점 곡선을 나타낸 그래프이다(실선: 25℃에서 측정; 점선: 100℃에서 측정; 괘선: 100℃에서 25℃로 냉각 후 측정).

도 8A는 pH에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집을 나타낸 그래프이다.

도 8B는 금속에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집을 나타낸 그래프이다.

도 9는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈 (DHFR)와 DHFR-Syn96-140 융합 단백질을 열처리하기 전과 65℃와 100℃에서 각각 10분간 열처리한 후의 이들 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다 (마지막 레인은 크기 마커 단백질임).

도 10A는 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα) 영역 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 GST-(ATSα단편) 융합 단백질들의 모식도이다.

도 10B는 ATSα로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 GST-(ATSα단편) 융합 단백질들을 0.6mg/ml 농도에서 끓이기 전 (위 패널)과 끓인 후 (아래 패널)의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 10C는 GST-(ATSα단편) 융합 단백질들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-Syn103-115; 3: GST-Syn114-126; 4: GST-Syn130-140; 5: GST-Syn119-140).

도 10D는 GST-(ATSα단편) 융합 단백질들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-Syn103-115; 3: GST-Syn114-126; 4: GST-Syn130-140; 5: GST-Syn119-140; 6: GST-Syn96-140).

도 11A는 α-시누클레인, β-시누클레인 또는 γ-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역 (ATSα, ATSβ또는 ATSγ)을 포함하는 GST-ATS 융합 단백질들의 모식도이다.

도 11B는 GST-ATS 융합 단백질들(GST-ATSα, GST-ATSβ 및 GST-ATSγ)을 0.6mg/ml 농도에서 10분간 끓인 후의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 11C는 GST-ATS 융합 단백질들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-ATSα; 3: GST-ATSβ; 4: GST-ATSγ).

도 11D는 GST-ATS 융합 단백질들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-ATSα; 3: GST-ATSβ; 4: GST-ATSγ).

도 12A는 폴리글루타메이트 꼬리를 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들(GST-E5와 GST-E10)의 모식도이다.

도 12B는 정제된 GST-E5와 GST-E10 융합 단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.

도 12C는 GST-E5와 GST-E10 융합 단백질들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-E5; 3: GST-E10).

도 12D는 GST-E5와 GST-E10 융합 단백질들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이 다 (1: GST; 2: GST-E5; 3: GST-E10).

도 13은 hGH 자체, hGH N말단 및 C말단에 Syn119-140(Acidic tail of synuclein)가 각각 융합된 상태의 구성도이다.

도 14는 정제된 hGH, Syn119-140된 융합 hGH을 보여주는 SDS PAGE 한 결과이다(레인 1 : hGH, 레인 2 : ATS-hGH, 레인 3 : hGH-ATS).

도 15는 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 극 UV CD 스펙트럼을 보여준다(실선 : hGH, 점선 : Syn119-hGH, 괘선 : hGH-ATS).

도 16은 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 농도 변화에 따른 Nb2 세포증식 실험이다(●: hGH, ○: Syn119-140-hGH, ▼: hGH-Syn119-140, 바는 표준편차를 나타냄).

도 17은 STAT5 타이로신 인산화 인식 항체를 이용한 면역탁본 실험이다(레인 1, 5 :대조군, 레인 2, 6: hGH, 레인 3, 7 : Syn119-140-hGH, 및 레인 4, 8 : hGH-Syn119-140).

도 18은 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 교반 시간에 따라 유도된 응집을 흡광도로 나타낸 그래프이다(●: hGH, ○: Syn119-140-hGH, ▼: hGH-Syn119-140).

도 19는 90시간 교반후, hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 응집 시료사진이다.

도 20은 교반 전후의 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 HPLC 겔 여과 그래프이다(실선 : 교반전, 점선 : 실온에서 90시간 교반 후).

도 21은 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 동결/해동에 의해 유도된 응집을 흡광도로 나타낸 막대 그래프이다(검은 막대: hGH, 흰 막대: ATS-hGH, 회색막대: hGH-ATS).

도 22는 동결/해동 반복 후 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 HPLC 겔 여과 그래프이다(1: 동결/해동 전의 대조군, 2: 동결/해동 5회 반복 후, 3: 동결/해동 10회 반복 후, 4: 동결/해동 15회 반복 후)

도 23은 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140S의 pH에 의해 유도된 응집을 흡광도로 나타낸 막대 그래프이다(검은 막대: hGH, 흰 막대: Syn119-140-hGH, 회색막대: hGH-Syn119-140).

도 24는 25℃ 및 37℃에서 30일간 보관한 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 응집을 흡광도로 나타낸 막대 그래프이다(검은 막대: 37℃, 흰 막대: 25℃).

도 25은 보관 전의 신선한 대조군과 25℃, 및 37℃에서 30일간 보관한 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 SDS-PAGE 한 사진이다(레인 1, 4, 6: hGH, 레인 2, 5, 7: Syn119-140-hGH, 레인 3, 6, 9: hGH-Syn119-140).

도 26은 60℃에서 3일간 보관한 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 응집을 흡광도로 나타낸 막대 그래프이다.

도 27은 보관 전의 신선한 대조군과 60℃에서 3일간 보관한 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 SDS-PAGE한 사진이다 (레인 1, 4: hGH, 레인 2, 5: Syn119-140-hGH, 레인 3, 6: hGH-Syn119-140.

도 28은 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140 시료를 각각의 온도에서 10분간 열처리 (80℃, 100℃) 한 후 SDS-PAGE로 확인한 사진이다(레인 1, 4, 6: hGH, 레인 2, 5, 7: Syn119-140-hGH, 레인 3, 6, 9: hGH-Syn119-140).

도 29는 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 80℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 시간에 대한 흡광도로 나타낸 그래프이다(1: hGH, 2: Syn119-140-hGH, 3: hGH-Syn119-140).

도 30은 다양한 온도에서 10분간 열처리 후 hGH, Syn119-140-hGH, 및 hGH-Syn119-140의 HPLC 겔 여과 크로마토그래피한 그림이다(1: 25℃, 2: 65℃, 3: 70℃, 4: 75℃, 5: 80℃).

도 31은 온도 변화에 따른 단백질 잔기의 잉여타원율을 222nm에서 측정한 열변성 실험이다(실선 : hGH, 점선 : Syn119-140-hGH, 괘선 : hGH-Syn119-140).

도 32는 다양한 온도에서 열처리 후 상등액을 취하여 hGH의 생물학적 활성을 확인한 실험이다(검은막대: hGH, 흰색막대: Syn119-140-hGH, 회색막대: hGH-syn119-140).

도 33은 hGH와 Syn119-140-hGH, hGH-Syn119-140 융합 단백질들의 약물동역학 비교결과이다.

도 34A는 정제한 hGH, hGH-syn119-140 융합 단백질, 그리고 syn119-140 전체 그의 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드와 hGH의 융합 단백질들 (hGH-ATSw, hGH-ATSp)의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 34B는 hGH, hGH-Syn119-140, hGH-ATSw, 그리고 hGH-ATSp 단백질들을 100 ℃에서 열처리한 후 응집양상을 흡광도 측정을 통해 분석한 결과이다.

도 34C는 hGH, hGH-Syn119-140, hGH-ATSw, 그리고 hGH-ATSp 단백질들의 교반에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 34D는 hGH, hGH-Syn119-140, hGH-ATSw, 그리고 hGH-ATSp 단백질들의 동결과 해동 반복에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정으로 분석한 결과이다.

도 35A는 정제한 hGH, hGH-Syn119-140, 그리고 hGH-Syn119-140의 ATS 부위 점돌연변이체 단백질들의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 35B는 hGH, hGH-Syn119-140, 그리고 hGH-Syn119-140의 ATS 부위 점돌연변이체 단백질들을 100℃에서 열처리한 후 응집양상을 흡광도 측정을 통해 분석한 결과이다.

도 35C는 hGH, hGH-Syn119-140, 그리고 hGH-Syn119-140의 ATS 부위 점돌연변이체 단백질들의 교반에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 35D는 hGH, hGH-Syn119-140, 그리고 hGH-Syn119-140의 ATS 부위 점돌연변이체 단백질들의 동결과 해동의 반복에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정으로 분석한 결과이다.

도 36A는 정제한 hGH, hGH-Syn119-140, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 단백질들의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 36B는 hGH, hGH-ATS, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 단백질들을 열처리한 후 응집양상을 흡광도 측정을 통해 분석한 결과이다.

도 36C는 hGH, hGH-ATS, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 단백질들의 교반에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 36D는 hGH, hGH-ATS, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 단백질들의 동결과 해동의 반복에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정으로 분석한 결과이다.

도 37A는 정제한 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 37B는 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질을 40-60℃에서 열처리한 후 응집양상을 흡광도 측정을 통해 분석한 결과이다.

도 37C는 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질의 교반에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 37D는 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질의 동결과 해동의 반복에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정으로 분석한 결과이다.

도 38A는 정제한 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석결과이다.

도 38B는 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질을 40-70℃에서 열처리한 후 응집양상을 흡광도 측정을 통해 분석한 결과이다.

도 38C는 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 교반에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 38D는 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 동결과 해동의 반복에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정으로 분석한 결과이다.

본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성꼬리 영역인 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하고자 하는 단백질에 결합시켜 제조되는 환경 스트레스에 내성을 가지는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 상기 펩타이드를 결합시켜 환경 스트레스에 대한 단백질의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

"환경 스트레스 내성 단백질"은 예를 들면 온도, pH, 금속이온 등과 같은 외부 환경 요인에 대하여 물리적, 화학적 및 생물학적으로 안정성을 나타내는 단백질을 말한다. 이러한 단백질 부류 가운데 전형적인 것으로 물이 끓는 온도에서도 안정한 열안정성 단백질(heat stable protein)이 있다. 잘 알려진 열안정성 단백질의 예로는 고호열성(hyperthermophilic) 유기체로부터 유래된 단백질을 들 수 있다(Jaenicke R. and Bohm G., Curr. Opin. Struct. Biol., 8, 738-748 (1998); Rees D. C. and Adams M. W. W. Structure, 3, 251-254 (1995); Adams M. W. W., Ann. Rev. Microbiol. 47, 627-658 (1993)). 이들 단백질은 중온성 단백질들에 비하여 매우 높은(물의 끓는점 근처 또는 이상의) 융점(melting temperature; 이하, Tm이라 함)을 갖는다. 그러나, 온도가 Tm이상으로 증가하면, 대부분의 고호열성 단백질들도 변성되고 불용성 응집체가 된다(Klump et al., J. Biol. Chem., 267, 22681-22685 (1992); Klump et al., Pure. Appl. Chem., 66, 485-489 (1994); Cavagnero S et al., Biochemistry, 34, 9865-9873 (1995)).

최근에 알려진 열에 안정한 또 다른 그룹의 단백질들에는 고유 비구조성 단백질(intrinsically unstructured proteins)들이 있다(Plaxco, K. W. and Groβ M, Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H. J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999)). 고유 비구조성 단백질들이 열에 안정한 이유는 이들 구조가 열 처리에 의해 크게 변하지 않기 때문이다. 열역학적으로 말해, 고유 비구조성 단백질들은 실온에서도 그 형태가 거의 풀어져 있고 고온에서는 약간의 구조 변화를 겪기 때문에, 엄격한 의미에서 열에 "안정한" 단백질이라기 보다는 "내열성 단백질(heat resistant proteins; 이하 HRPs라 함)"이라는 용어가 더 적절하다(Kim T. D. et al, Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). 따라서, HRPs는 열처리에 의해 응집되지 않는 단백질로서 고호열성 단백질 및 비구조성 단백질을 포함한다.

단백질의 열반응성은 Jurkat T 세포와 사람 혈청으로부터 열처리에 의해 응집되지 않는 HRPs를 정제하고 성상확인하는 과정을 통해 체계적으로 연구되었다 (Kim T. D. et al, Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). Jurkat 세포 용해물과 사람 혈청으로부터 기원하는 단백질들의 내열성 연구로부터 다음 4가지 형태의 HRPs가 밝혀졌다. HRPs 그룹 I은 α-시누클레인과 α_s-카제인과 같은 비구조성 단백질을 말하며 이들 단백질은 온도에 관계없이 거의 풀어진(semi-unfolded) 형태를 지니고 있다. HRPs 그룹 Ⅱ는 사람 혈청 페투인(fetuin)과 알부민이 대표적인데, 이들은 열처리하에서 비가역적인 형태변화를 나타내는 특성이 있다. HRPs 그룹 Ⅲ는 트랜스티레틴(transthyretin)과 소혈청 페투인(fetuin)이 대표적이며 가역적인 형태변화를 나타낸다. HRPs 그룹 Ⅳ는 고호열성 단백질과 같이 통상의 열안정성 단백질을 말하며 열에 의해 단백질 형태가 별로 변화되지 않음을 특징으로 한다.

대부분의 단백질은 온도가 증가됨에 따라 구조가 풀어지고(unfolded) 침전하는데 그러한 과정은 통상 비가역적이다(Bull, H. B and Breese, K, Arch. Biochem. Biophys, 156, 604-612 (1973)). 따라서, 의학이나 공업 분야에서 널리 이용되는 호르몬이나 사이토카인 및 효소와 같은 대부분의 단백질은 열안정성을 비롯한 환경 스트레스에 대한 내성을 개선하는 것이 큰 과제중 하나이다. 환경 스트레스에 대한 내성이 향상되면 제품 수명이 길어지는 것은 물론 새로운 의약품이나 산업용 효소, 식품, 화학제품의 개발로 이어질 확률이 높다. 따라서, 새로운 환경 스트레스 내성 단백질에 관한 본 발명은 매우 유용할 것이다.

본 발명자들은 온도, pH, 금속 등과 같은 환경 스트레스에 대한 단백질의 성질을 연구하던 중 HRP 그룹 I인 시누클레인 족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 펩타이드가 환경 스트레스에 대해 내성을 제공하며, 상기 펩타이드를 단백질에 결합시켜 제조한 융합 단백질이 융합전 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하고자 하는 단백질과 결합시켜 제조되는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 결합시켜 환경 스트레스에 대한 단백질의 내성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것이다.

발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 내성을 가지는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드에 관한 것이다.

보다 구체적인 양태에서, 본 발명은 (i) α-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지 140 잔기에 해당하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체, (ii) β-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역인 85 내지 134 잔기에 해당하는 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체, (iii) γ-시누클렌인 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지127 잔기에 해당하는 서열번호 3의 아미 노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체, 또는 (ⅳ) 시노레틴 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지127 잔기에 해당하는 서열번호 4의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "환경 스트레스"는 천연 또는 비천연 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 물리적 또는 화학적 작용을 의미한다. 이와 관련하여, "단백질의 변성"은 단백질의 고차구조가 가열, 동결, 건조 등을 비롯한 물리적 작용이나 산, 알카리, 금속이온, 산화/환원제 또는 유기용매와 같은 화학적 작용 등에 의해서 불가역적으로 변한 것으로 일반적으로 생물학적 기능의 상실, 용해도의 감소, 반응성의 증감, 분해효소에 의한 분해 용이성, 결정성의 상실, 이화학적 성질의 변화, 변성 청색 이동 등을 수반하는 현상을 의미하는 것으로 이해한다. 본 발명에서 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 환경 스트레스에는 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제 등의 화학적 요인이 포함된다.

구체적으로, 본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질을 변성시키는 온도, 수분, pH, 금속이온, 전해질 및 환원당이 포함된다. 대개의 단백질의 경우 60℃ 내지 70℃에서 변성되며 온도가 높아질수록 그 변성속도는 빨라진다. 예를 들어, 온도가 10℃ 상승할 때 알부민은 20배, 헤모글로빈은 13배 변성 반응속도가 상 승한다. 그러나, 갑자기 온도를 급상승시키는 경우에는 응고 온도가 더 높아질 수 있다. 단백질의 열변성에는 물이 필요한데 물은 폴리펩타이드 사슬이 풀어지거나 재결합할 때에 사슬의 움직임을 도와주게 되므로 물이 많으면 일반적으로 더 낮은 온도에서도 열변성이 일어난다. 단백질의 열변성은 pH와도 관계가 있는데 일반적으로 등전점쪽의 산성 pH에서 열변성이 더 빨리 일어난다. 생선조림을 할 때 식초를 조금 넣으면 빨리 살이 단단해 지는 것도 산성의 pH를 이용한 것이다. 또한, 단백질 변성은 전해질(염류)의 첨가에 의해서도 일어나며, 전해질의 첨가는 단백질이 가지고 있는 음전하를, 염화합물, 황산염 등의 전해질중의 양이온이 중화시켜 단백용액의 pH를 등전점으로 만들기 때문이다. 단백질에 열을 가할 때 환원당이 존재하면 비효소적 갈변인 마일라드(Maillard) 반응이 일어나 필수아미노산이 파괴된다.

또한, 본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 가압 및 건조한 환경이 포함된다. 단백질은 일반적으로 5,000에서 10,000기압의 고압력을 가하거나 초음파를 쬐는 경우 변성된다. 특히, 가용성 단백질은 건조에 의해서도 변성하는데 건조가 진행되면서 폴리펩타이드 사슬사이의 수분이 소실되고 다시 인접한 펩타이드 사슬의 재결합이 일어나 견고한 상태가 되는 것이다.

본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 동결 환경이 포함된다. 예를 들어, 육류를 동결하면 물이 결합력이 약하여 먼저 얼음결정으로 석출되므로 나머지 액 중의 염류농도가 높아져 염석이 되어 단백질이 변성한다. 동결과 해동을 반복할수록 단백질은 변성하게 된다. 본 발명의 추가의 환 경 스트레스 중에는 단백질을 변성시키는 계면장력이 포함된다. 단백질의 계면에 단일분자막의 상태로 얇은 막으로 퍼질 때 변성하여 응고하게 된다. 나아가, 본 발명의 환경 스트레스에는 단백질을 변성시킬 수 있는 광선의 조사가 포함된다. 단백질에 광선이 조사되면, 단백질 3차구조의 결합이 절단되어 변성이 일어나게 된다. 산·알칼리, 중성염, 알코올이나 아세톤 같은 유기용매 및 금속이온들도 본 발명의 정의상 환경 스트레스에 포함된다. 단백질 용액에 산·알칼리를 가하면 (+), (-)전하가 변하기 때문에 고차구조와 관계가 깊은 이온결합에 변화를 일으켜 단백질이 변성된다.

상기의 환경 스트레스에 대해 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역은 내성을 가진다.

본원에서 사용된 용어, "시누클레인 족(synuclein family)"은 비구조성의 가용성 (unstructured soluble) 단백질로서 주로 신경 조직에서 발현되는 단백질로서, 어류 이상의 고등동물에 존재하는 단백질이며, 사람, 마우스, 새, 소 등에 존재함이 보고된 바 있다(Clayton and Geroge, Trends in Neurosicence 21, 249-254 (1998)). 그 종류로는 α-시누클레인, β-시누클레인, γ-시누클레인 및 시노레틴(synoretin)이 알려져 있다. α-시누클레인, β-시누클레인 단백질은 주로 뇌조직, 특히 시납스전 터미널(presynaptic terminal)에서 발현되고, γ-시누클레인은 말초 신경계(peripheral nervous system)에서 주로 발현된다. α-시누클레인 및 β-시누클레인은 아미노산 서열 상동성이 높고 단백질의 분포가 많이 겹치므로, 기능이 유사할 것으로 생각된다. 시노레틴(synoretin)은 γ-시누클레인과 상동성이 높고, 레티나(retina)에서 주로 발현된다.

시누클레인 족은 공통적으로 3개의 독립적인 영역, 아미노-말단 양친매성 영역, 소수성 NAC 영역 및 카복실-말단 산성 꼬리로 구성되는 구조상의 특징을 가진다. N-말단 영역은 N-말단 양친매성 영역은 가오리(Torpedo)에서부터 사람에게까지 시누클레인 계열의 일원간에 그 서열이 강하게 보존되어 있으며 C-말단 영역은 그 크기와 서열에 있어서 상당히 가변성을 지니고 있다(Lucking C. B. and Brice A., Cell Mol. Life Sci., 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochem. Biophys. Acta 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol., 9, 707-720 (1999); Lavedan C. Genome Res. 8, 871-880 (1998)).

본원에서 사용된 "시누클레인 족의 C-말단 산성꼬리 (C-terminal acidic tail of synuclein family)"는 기술상의 간단명료성을 위해 필요에 따라 "ATS"로 약칭하기로 한다. "α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리"는 같은 이유로 필요에 따라 "ATSα", "Synα96-140" 또는 "Syn96-140"으로 약칭하기로 하며, "β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리"는 "ATSβ" 또는 Synβ85-134로 약칭하기로 하며, "γ-시누클레인의 C-말단 산성꼬리"는 "ATSγ" 또는 Synγ96-127로 약칭하기로 한다.

아직 시누클레인의 정확한 기능은 아직 알려지지 않았으나, 시누클레인은 α-시누클레인 및 β-시누클레인이 포유류 포스포리파제 D2의 선택적 억제제로 작용하고 (Jenco et al., Biochemistry 37, 4901-4909 (1998)), γ-시누클레인은 신경 세포골격(neuronal cytoskeleton)의 대사를 바꾸는 것으로 알려져 있다(Buchman et al., Nat. Neurosci. 1, 101-103 (1998)).

특히, α-시누클레인은 다음과 같은 특징을 가진다. α-시누클레인은 천연의 상태에서는 본질적으로 비구조화되어 있기 때문에 많은 다른 종류의 단백질 또는 리간드와 반응할 수 있다(Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996)). α-시누클레인은 작은 산성 인지질 소포체(vesicle), 계면활성제(detergent), 유기용매 및 일부 금속이온과 결합하여 2차 구조가 증가된다 (Eliezer D. et al., J. Mol. Biol., 307, 1061-1073 (2001); Kim T. D. et al., Protein Science, 9, 2489-2496 (2000); Davidson WS et al., J. Biol. Chem., 273-9443-9 (1998); Weinreb P. H. et al., Biochemisty, 35, 13709-13715 (1996); Paik SR et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999)). α-시누클레인은 비정상적인 1차 및 3차 구조 특성으로 인하여 높은 내열성을 지닌다.

또한, α-시누클레인 존재하에 온도, 화학적 변성된 단백질의 응집이 억제되는 것으로, α-시누클레인이 샤페론 같은 활성을 가짐을 알 수 있다(Thomas et al., protein science, 9, 2489-2496 (2000); Jose M et al., FEBS Letter, 474, 116-119 (2000)). 그러나, α-시누클레인 각 영역의 독립적인 기능과 활성에 대한 연구는 진행되지 않았으며, 특히 ATSα 영역 단독만으로도 환경 스트레스에 내성을 가진다는 점은 전혀 밝혀지지 않은 상태에서, 본 발명자는 이전 연구에서, 시누클레인 유래의 펩타이드, 보다 구체적으로 ATSα 유래의 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, ATSβ에 해당하는 서열번호 2, ATSγ에 해당하는 서열번호 3, 및 시노레틴의 C 말단 산성꼬리에 해당하는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 환경 스트레스에 내성을 가짐을 밝히고, 이에 대한 특허를 출원한 바 있다 (특허출원번호 제10-20020047342호).

상기 출원은 환경 스트레스에 대해 ATS 영역을 단독으로 사용하여도 전체 시누클레인과 동일한 활성의 내성을 가진다는 것을 밝혔다는 데에 의의가 있다. 전체 시누클레인보다 환경 스트레스에 내성을 가지는 ATS 영역을 단독으로 사용하는 것이 산업적 이용면에서 보다 유리하다. 이는 시누클레인의 경우, 고유의 활성이 유지할 것이므로 생체내에 반복 혹은 과량 투여시 예측할 수 없는 심각한 부작용 및 독성을 유발할 수 있기 때문이다. 더구나, 시누클레인의 생체내 기능은 정확하게 알려지지 않았으므로, 이에 대한 정확한 부작용을 예측하고 대비할 수 없다. 시누클레인 족간에 서열이 강하게 보존되어 고유의 기능을 담당하는 아미노 말단-양친매성 및 소수성 NAC 영역을 제거하고 ATS 영역만을 단독으로 사용할 경우, 환경 스트레스에 내성을 유지하지만 시누클레인 고유 활성은 제거되었으므로, 매우 바람직하다.

상기 연구에서 한 걸음 더 나아가, 본원 발명자들은 시누클레인 족에서 잘 보존되어 있는 아미노-말단 양친매성 영역 및 소수성 NAC 영역과 달리, C-말단 산성꼬리 영역은 아미노산 서열 및 크기에 있어서 상당한 가변성을 가짐에도 불구하고, 환경 스트레스에 내성을 가지게 하는 아미노산 서열상의 특징이 무엇인지 밝히기 위하여 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적을 위하여, ATS 유래 펩타이드의 환경 스트레스에 대한 내성을 가지는 활성과 펩타이드의 길이와의 상관관계를 살펴보았다.

특허번호 제10-20020047342호에서는 ATSα의 다양한 지점에 해당하는 다양한 길이의 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질을 제작하였다. GST에 ATSα 단편이 결합된 융합 단백질로, ATSα의 앞부분에 해당하는 아미노산 잔기 103-115(서열번호 5)을 포함하는 GST-Syn103-115, ATSα의 중간부분에 해당하는 아미노산 잔기 114-126(서열번호 6)을 포함하는 GST-Syn114-126, ATSα의 중간 및 말단 부위에 해당하는 아미노산 잔기 119-140(서열번호 7)을 포함하는 GST-Syn119-140, 및 ATSα의 말단 부위에 해당하는 아미노산 잔기 130-140(서열번호 8)을 포함하는 GST-Syn130-140을 각각 제조하였다. 그 결과, 100℃에서 10분간 열처리했을 때, ATSα의 전체 길이에 해당하는 45개의 아미노산을 포함하는 GST-Syn96-140과 22개의 아미노산을 포함하는 GST-Syn119-140은 열처리 후에도 전혀 침전되지 않았으나, ATSα의 11-13개의 아미노산을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 대부분 응집되었다. 65℃에 열처리하면, GST 단백질의 응집은 2분 후 극도로 증가하였고 3분이 지난 후에는 모두 응집되었으나 상기의 GST-ATSα 단편들은 전혀 응집되지 않았다. GST-(ATSα단편)의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 분석한 결과, ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산 부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 농도에 관계없이 열처리 후에 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11-13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 농도가 높아질수록 응집이 증가하였다. ATS 영역의 특정 위치에 상관없이 펩타이드의 길이를 증가하면 환경 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 알 수 있다.

본 발명에서는, 시누클레인 유래 펩타이드의 길이가 활성에 미치는 영향을 확실하게 살펴보기 위하여 syn119-140의 길이보다 긴 단편 및 짧은 단편을 제작하였다. ATSα의 아미노산 잔기 113-140(서열번호 9)에 해당하는 펩타이드를 포함하는 hGH-Syn113-140(hGH-ATSw), ATSα의 아미노산 잔기 119-135(서열번호 10)에 해당하는 펩타이드를 포함하는 hGH-Syn119-135(hGH-ATSp)를 각각 제조하고, ATSα 아미노산 잔기 119-140을 포함하는 hGH-Syn119-140과 환경적 스트레스인 열처리, 교반, 냉동과 해동의 반복에 대한 내성을 각각 비교하여 보았다. 그 결과, 전체적으로 환경적 스트레스에 대해 자연형 성장호르몬보다 안정화 펩타이드를 포함한 hGH-Syn119-140, hGH-Syn-113-140, hGH-Syn119-135의 단백질들이 안정하였으며 미세하나마 교반에 대한 안정성 실험에 있어 안정화 펩타이드의 짧은 단편이 포함된 hGH-ATSp보다 긴 단편이 포함된 hGH-ATSw가 약간의 안정성을 더 유지하였다. 결과적으로 융합 파트너의 안정화에는 안정화 펩타이드의 특이한 아미노산 서열과 이를 포함한 단편의 길이가 길수록 안정성을 유지하는 것임을 알 수 있다(도 34). 또한, ATSα 유래 펩타이드 단편뿐만 아니라 ATSβ, ATSγ 유래 단편도 활성을 가짐을 알 수 있었다.

ATS 영역은 음전하를 가지는 산성 아미노산 잔기를 다량으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 이에 폴리글루타메이트로 구성된 산성 꼬리를 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질의 열에 대한 내성을 살펴보았다. 5개의 글루타메이트 잔기로 이루어진 펩타이드와 융합된 융합 단백질 GST-E5와 10개의 글루타메이트로 이루어진 펩타이드와 융합된 융합 단백질 GST-E10 모두 100℃의 열처리 후에 응집 되었다. 65℃에서는, GST는 2-3분 후 모두 응집되었고, GST-E5 융합 단백질들도 상당량이 응집된 반면, GST-E10 융합 단백질은 거의 응집되지 않았다. 단백질들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리하면서 응집정도를 살펴보면 GST 단백질에 비하여 GST-E5 응집정도는 낮았으며, GST-E10은 매우 낮게 나타났다. (-)전하가 증가할수록 환경 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것을 알 수 있다(도 12).

GST-Syn130-140이 같은 숫자의 (-) 전하를 가지는 GST-E5보다 월등히 높은 내열성을 보이고 있고, 두 배나 많은 숫자의 (-) 전하를 가지는 GST-E10보다도 약간 낮은 내열성을 보임을 알 수 있다 (도 10D와 도 12D 비교).

이상을 종합하여 볼 때, ATS 영역의 산성 아미노산을 많이 포함하는 독특한 아미노산 서열에 기반한 음전하를 가지는 산성 아미노산의 수 및 펩타이드 길이가 환경 스트레스에 내성을 제공한다는 점을 알 수 있다. 임의의 단백질에 본 발명의 펩타이드를 결합시켜 단백질의 내성을 부여하고자 하는 본 발명의 목적상, 결합하는 단백질에 따라 펩타이드가 다양하게 선택될 수 있어야 바람직하다. 그런 점에서, 본 발명은 환경 스트레스에 내성을 가지게 하는 시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 유래 펩타이드의 최소 활성 단위를 규명하였으므로, 펩타이드와 결합시켜 내성을 부여하고자 하는 임의의 단백질에 따라, 적절한 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 따라서, 환경 스트레스에 내성을 가지기 위해서는 ATS 유래 펩타이드 단편은 4 또는 5개 이상의 산성 아미노산을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가져야 한다. 당 분야의 전문가는 상기 사실에 기반 한, 환경 스트레스에 내성을 가지는 ATS 영역 유래의 다양한 펩타이드 단편을 제작할 수 있다.

본 발명의 ATS는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 다양한 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간 기원이다. 본 발명의 ATS는 모든 시누클레인 족, 바람직하게는 α-시누클레인, β-시누클레인, γ-시누클레인, 또는 시노렉틴의 C-말단 산성꼬리 영역이다.

인간 α-시누클레인 C 말단 산성 꼬리 영역은 아미노산 서열 96 내지 140에 해당하고 서열번호 1로 기재되었으며, 인간 β-시누클레인의 C 말단 산성 꼬리 영역은 아미노산 서열 85 내지 134 잔기에 해당하고 서열번호 2로 기재되었으며, 인간 γ-시누클레인의 C 말단 산성 꼬리 영역은 아미노산 서열 96 내지 127 에 해당하고 서열번호 3으로 기재되었으며, 인간 시노레틴의 산성꼬리 영역은 아미노산 서열 96 내지 127 잔기에 해당하고 서열번호 4로 기재되었다.

환경 스트레스에 대하여 내성을 가지도록 하는 펩타이드는 바람직하게는, ATSα 영역에 해당하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편을 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드이다. 또한, ATSβ 영역에 해당하는 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편을 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드이다. 또한, ATSγ 영역에 해당하는 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편을 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드이다. 또한, 시노레틴의 산성 꼬리 영역에 해당하는 서열번호 4의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편을 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드이다.

환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드는 보다 바람직하게는, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 17 또는 서열번호 18이다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 “변이체”란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 치환, 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 의미하고 자연적으로 발생하거나 인위적으로 발생시킬 수 있다. 환경 스트레스에 대한 내성을 가지는 한, 펩타이드 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다.

단백질 구조상의 이해를 기반으로, 목적에 적합한 변이체를 제작할 수 있다. 본 발명에서 환경 스트레스에 내성을 제공하는 시누클레인 산성 꼬리 영역의 독특한 아미노산 서열상의 특징을 밝혔으므로, 이에 대한 이해를 기반으로 활성을 가지는 다양한 변이체를 손쉽게 제작할 수 있음을 당 분야의 전문가는 쉽게 이해할 수 있다. 변이체는 동일한 활성을 가지는 기능적 등가물이거나 또는 야생형보다 활성이 증가한 단백질이다.

α-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역, β-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 및 시노레틴 C-말단 산성꼬리 영역에서 1 개 이상의 아미노산이 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로 대체될 수 있으며 아미노산이 대체되는 위치는 특별히 제한되지 않는다. ATSα의 경우에는 제122, 123, 124, 127, 133 및 140번 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산을 대응하는 원 ATSα의 아미노산과 상이한 임의의 아미노산으로 치환할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, Syn119-140의 다양한 위치에서의 아미노산 잔기가 변이된 펩타이드, E123A(서열번호 11), Y133A(서열번호 12), A124E(서열번호 13), N122V(서열번호 14), M127S(서열번호 15) 및 A140S(서열번호 16)를 제조하였다. 상기 변이체들은 Syn119-140과 동일한 22개의 아미노산 길이를 가지나 잔기 하나가 돌연변이된 변이체들이다. 산성 아미노산 잔기를 하나 제거한 E123A 및 산성 아미노산 잔기를 하나 추가한 A124E는 모두 열, 교반, 동결/해동 등의 환경 스트레스에 Syn119-140와 유사한 활성을 보였다. 마찬가지로 소수성 잔기를 감소 시킨 변이체 Y133A 및 소수성 잔기를 증가시킨 변이체 N122V도 유사한 활성을 보였다. 또한 시누클레인 족에서 보존되지 않는 잔기를 치환시킨 변이체(M127S 및 A140S)의 경우도 거의 동일한 활성을 보였다. 즉, 치환시키는 아미노산 잔기의 위치, 치환되는 아미노산 잔기의 종류에 특별한 제한 없이 제작한 변이체 모두 활성을 유지하였다(도 35).

상기 결과는, 본 발명에 따른 환경 스트레스에 내성을 가지는 시누클레인 C- 말단 산성 꼬리 영역의 일정 길이 이상의 펩타이드 단편이, 그 펩타이드 내 하나 이상의 아미노산을 아미노산 위치나 수, 그리고 치환되는 아미노산 종류에 특별한 제한이 없이 치환되는 경우에도, 변이체가 상기에서 살펴본 환경 스트레스에 내성을 제공하는 시누클레인 산성 꼬리 영역의 독특한 아미노산 서열상의 특징을 가지는 한, 본 발명에 따른 환경 스트레스에 내성을 가지는 펩타이드 단편으로서의 활성이 그대로 유지된다는 사실을 충분히 뒷받침하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 5개 이상의 산성 아미노산 잔기를 포함하고 10개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 시누클레인 C-말단 산성 꼬리 영역의 펩타이드 단편이라면, 그 내에 최소한 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환한 상기 펩타이드 단편의 변이체도 본 발명의 범위에 속한다는 것을 충분히 이해할 수 있다. 아미노산 서열상의 변이체에 의해 펩타이드 단편의 기능 및/또는 안정성이 증가될 경우 더욱 바람직하다.

상기 변이체는 자연발생 변이체의 경우 천연에서 추출하거나, 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 이용한다.

야생형 펩타이드의 아미노산 서열에서 변이를 유발하는 방법은 야생형 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변이시킴으로써 변경하고자 하는 아미노산 서열에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖도록 제조될 수 있다. 이런 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 본 발명에서는 위치-지향성 돌연변이 유발 (Site-directed mutagenesis)을 이용하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합하여 형성된 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 목적상 융합 단백질은, 상기 펩타이드가 융합 파트너 단백질에 결합되어 형성된 모든 융합 단백질을 의미한다. 융합 단백질과 펩타이드가 결합하는 위치는 특별히 제한되지 않는다. 융합 단백질의 하나의 예는 펩타이드와 파트너 단백질이 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 형태이며, 유전자 수준에서의 재조합으로 하나의 폴리펩타이드로 번역되게 하는 방법으로 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 펩타이드는 융합 파트너 단백질의 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 결합할 수 있다. 융합 파트너 단백질의 N-말단과 C-말단 양쪽에서 동시에 결합하는 펩타이드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

융합 파트너 단백질의 크기 및 성질에 따라 결합하는 ATS 유래 펩타이드의 종류 및 길이는 다양하게 선택될 수 있다.

융합 파트너와 펩타이드는 링커를 매개로 결합할 수 있다. 링커는 펩타이드 성 링커 또는 비펩타이드성 링커 모두를 포함하나, 펩타이드성 링커가 바람직하다. 펩타이드성 링커란 아미노산, 바람직하게는 펩타이드 결합으로 연결된 1 내지 20개의 아미노산을 의미하며, 면역학적으로 불활성인 펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다.

본원에서 사용된 용어, "융합 파트너 단백질"이란 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것이 바람직한 임의의 단백질을 말하며, 특히 바람직하게는 그 자체로서 환경 스트레스에 불안정한 단백질이다. 본원에 사용된 용어 "환경 스트레스에 불안정한 단백질"이란 환경 스트레스에 의해 변성되는 단백질을 가리킨다. 변성의 정의는 위에 설명한 바와 같다. 환경 스트레스에 불안정한 단백질은 변성 요인에 따라 잘 알려져 있다.

상기 펩타이드와 결합되어 사용될 수 있는 융합 파트너 단백질로는 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 필요가 있는 것이면 어느 것이나 특별한 제한이 없이 사용할 수 있다. 파트너 단백질은 상업적 또는 의학적 목적의 단백질 예를 들어, 싸이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체들을 예시할 수 있다.

융합 파트너 단백질의 구체적인 예로는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕테이즈, 성장호르몬, 렙틴, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘 -유사 펩타이드류 (GLP-1등), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 양태에서는, ATSα, ATSβ, ATSγ의 펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 GST, DHFR, GH, 렙틴과의 융합 단백질로, GST-Syn96-140(서열번호 80), DHFR-Syn96-140(서열번호 81), GST-Syn103-115(서열번호 82), GST-Syn114-126(서열번호 83), GST-Syn119-140(서열번호 84), GST-Syn130-140(서열번호 85), GST-Synβ(서열번호 86), GST-Synγ(서열번호 87), hGH-Syn119-140(서열번호 91), Syn119-140-hGH(서열번호 93), hGH-Syn113-140(서열번호 94), hGH-Syn119-135(서열번호 95), hGH-SynE123A(서열번호 96), hGH-SynY133A(서열번호 97), hGH-SynA124E(서열번호 98), hGH-SynN122V(서열번호 99), hGH-SynM127S(서열번호 100), hGH-SynA140S(서열번호 101), hGH-Synβ113-134(서열번호 102), hGH-Synγ106-127(서열번호 103), GCSF-Syn119-140(서열번호 104) 및 hLeptin-Syn119-140(서열번호 105)을 제조하였다.

본 발명의 융합 단백질은, 상기의 펩타이드 결합에 의해 파트너 단백질의 변성이 억제되는 것을 특징으로 한다. 펩타이드와 결합하는 파트너 단백질의 종류, 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase: GST), 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(Dihydrofolate reductase: DHFR), 성장호르몬(GH), 백혈구 콜로니 자극 인자(Granulocyte colony stimulating factor: GCSF), 렙틴(leptin)에 상관없이 온도, 교반, 반복되는 동결 및 해동 등의 환경 스트레스에 대하여 단백질의 변성이 억제되었다. 인. 비트로 뿐만 아니라 인. 비보에서도 융합 단백질의 혈중 농도가 융합되지 않은 단백질에 비하여 높게 유지되었다. 이를 통하여 본 발명의 펩타이드는 파트너 단백질의 변성을 억제시켜 안정성을 유지시키는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 융합 단백질은, 상기의 펩타이드 결합에 의해 파트너 단백질의 활성이 감소되지 않는 것을 특징으로 한다. 단백질의 생리학적 기능체로서의 활성은 구조에 의해 결정되므로, 대부분의 융합 단백질 활성은 급격하게 감소하게 된다. 따라서, 융합 단백질의 형태로 단백질의 안정성을 증대시켰다 하더라도 활성의 감소로 인해 실제적인 생체내 이용률 면에서 별 효과가 없는 것이 대부분이다. 그러나 본 발명의 펩타이드를 결합시켜 제조한 융합 단백질의 생리적 활성은 융합되지 않은 단백질과 동일하게 유지되었다.

또한, 본 발명의 융합 단백질은, 상기의 펩타이드 결합에 의해 파트너 단백질의 용해도가 증가하는 것을 특징으로 한다. ATS의 아미노산 서열은 Glu나 Asp와 같이 음전하를 띤 아미노산이 많이 있어 pI 값이 매우 낮다. 일반적으로 단백질의 용해도는 각 단백질의 순전하 (net charge)의 제곱에 비례하므로 (Tanford, 1961, in Physical Chemistry of macromolecules), ATS 융합 단백질은 야생형에 비해 단백질의 용해도가 증가할 것으로 예상된다. 이를 실시예에서 살펴본 결과, ATS 융합 단백질이 야생형 단백질에 비해 용해도가 훨씬 높게 나타났다. GST의 경우 ATS 펩타이드 융합으로 단백질의 용해도가 20% 이상 증가하였고, hGH은 약 2배, 렙틴은 약 5배 이상 증가하였다. 따라서, ATS 유래 펩타이드를 단백질의 안정도를 증가시키기 위한 용도뿐만 아니라 단백질의 농축 등에 사용할 수 있다.

또한, 응집체 형태로 발현되는 융합 파트너 단백질이, 상기의 ATS 유래 펩타이드 결합에 의해 수용체 형태로 발현되기도 한다. 또한, 응집체로 발현되는 융합 파트너 단백질의 리폴딩 효율이 펩타이드 결합에 의해 증가하기도 한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 결합에 의해 융합 파트너 단백질의 분리 및 정제가 용이할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질을 결합시켜 환경 스트레스에 대한 단백질의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

상기 ATS 유래 펩타이드를 융합 파트너 단백질과 결합시킬 경우, 환경 스트레스에 대한 내성이 증가할 뿐만 아니라, 파트너 단백질의 활성이 감소되지 않으므로 실제 생체내 이용률은 더 높다.

펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합된 융합 단백질의 제조법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유전자 재조합 기술에 기반하여, 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열과 융합 파트너 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 일반적인 제한효소를 이용하여 절단하고 리가제 등의 효소로 결합시켜서 하나의 폴리펩타이드로 번역되게 하는 방법으로 용이하게 제작될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 화학적 합성, 무세포 단백질 합성법 또는 유전자 재조합적인 방법으로 가능하다.

구체적인 예로, 단백질에 결합하여 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 본 발명의 펩타이드는 화학적 합성에 의해 쉽게 제조될 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)).

본 발명에 따른 펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로 C-말단으로부터 시작하여 제1의 아미노산, 제2의 아미노산, 제3의 아미노산과 같이 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 문헌에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

본 발명에 따른 펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 생화학 분야에서 통상 사용되는 담체로서 대표적으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 수지(polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 수지, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 수지, 펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아 미드 수지 등이 포함된다.

최초 보호 아미노산의 보호기들은 통상의 펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체 예로는 포르밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-)클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-)브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠슬포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일 수도 있다.

보호기 및 담체로부터 펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger)하에 무수 하이드로플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-)크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

또 다른 구체적인 예로서, 본 발명에 따른 펩타이드는 유전공학적 방법에 의 하여 제조할 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라, 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제한다. 다르게는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988))에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유공 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)).

작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키며, 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스 에 대해 내성을 부여하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

보다 구체적인 양태에서, 본 발명은 (i) α-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지 140 잔기에 해당하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체, (ii) β-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역인 85 내지 134 잔기에 해당하는 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체, (iii) γ-시누클렌인 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지127 잔기에 해당하는 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체, 또는 (ⅳ) 시노레틴 C-말단 산성꼬리 영역인 96 내지127 잔기에 해당하는 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

상기 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중에서 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함하고 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 환경 스트레스 에 대해 내성을 부여하는 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합하여 형성된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 상기의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열과 융합 파트너 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 통상적인 유전적 재조합 방법을 통하여 결합함으로써 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모 터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 내성을 가지는 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

숙주세포의 배양은 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.

융합 단백질은 통상의 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 세포를 원심분리하여 수집하고 초음파 파쇄기를 이용하여 분쇄하고, 세포 잔여물을 원심분리로 제거하여 상등액을 얻는다. 배양액으로 단백질이 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집하면 된다. 응집된 형태로 발현되는 경우에는, 적절한 용액에서 단백 질을 용해 및 변성시키고 재접힘시켜서 얻을 수 있다(Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195, 1990). 글루타티온, 디티오트레이톨, β -머캅토에탄올, β -머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템이 사용하고 우레아, 구아니딘, 아르기닌 등의 재접힘 첨가제 등을 이용한다. 재접힘 첨가제와 함께 염의 일부를 사용할 수 있다.

그리고 숙주세포로부터 획득한 단백질을 포함하는 용액을 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 한외여과법, 겔 여과, 이온 교환, 친화성, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 융합 단백질을 정제할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1: GST-시누클레인 융합 작제물 및 발현벡터의 제조

α-시누클레인은 N-말단 양친매성 영역(잔기1-60aa), 소수성 NAC 영역(잔기 61-95aa) 및 C-말단 산성 꼬리 영역(잔기 96-140aa)의 3개의 독립적인 영역으로 구성되어 있다(도 1A). 상기 α-시누클레인의 각 영역과 열에 불안정한 단백질인 글루타치온 에스-트랜스퍼라제(glutathion S-transferase; GST)의 융합 단백질을 제 조하기 위하여 α-시누클레인의 전체 영역과 GST를 융합한 GST-Syn1-140(서열번호 76), 양친매성 영역과 GST를 융합한 GST-Syn1-60(서열번호 77), NAC 영역과 GST를 융합한 GST-Syn61-95(서열번호 78), NAC 및 산성 꼬리 영역과 GST를 융합한 GST-Syn61-140(서열번호 79) 및 산성 꼬리 영역과 GST를 융합한 GST-Syn96-140(서열번호 80) 융합 단백질을 코딩하는 5개의 GST-시누클레인 융합 작제물을 각각 합성하였다(도 1B).

GST-α-시누클레인 융합 작제물은 하기의 특정 프라이머로 α-시누클레인 유전자를 PCR 증폭하여 pGEX 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)의 GST 유전자 뒤에 삽입함으로써 제조하였다. 전체 길이 α-시누클레인의 단백질 코딩 영역(잔기 1-140)은 밑줄친 Bg1II 제한 부위를 가진 프라이머 1(서열번호 19)과 밑줄친 Sa1I 제한 부위를 가진 프라이머 2(서열번호 20)를 사용하여 PCR 증폭하였으며 아미노-말단 양친매성 영역(잔기 1-60)은 프라이머 1(서열번호 19)과 Sa1I 제한 부위를 가진 프라이머 3(서열번호 21)으로 PCR 증폭하였다. NAC의 단백질 코딩영역(잔기 61-95)은 밑줄친 Bg1II 제한 부위를 포함하는 프라이머 4(서열번호 22)와 밑줄친 SaqII 제한 부위를 포함하는 프라이머 5(서열번호 23)를 사용하여 PCR 증폭하였으며, NAC 플러스 산성 꼬리(잔기 61-140)의 단백질 코딩영역은 프라이머 4(서열번호 22)와 프라이머 2(서열번호 20)를 사용하여 PCR 증폭하였다. C-말단 산성 꼬리(잔기 96-140)의 단백질 코딩영역은 밑줄친 KpnI 제한부위를 포함하는 프라이머 6(서열번호 24)과 밑줄친 Sa1I 제한부위를 포함하는 프라이머 7(서열번호 25)로 PCR 증폭하였다. 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.

GST-시누클레인 융합 작제물의 제조를 위해 사용된 프라이머

프라이머		핵산 서열	서열번호
1	센스	5'-GCGCTCGAGCCAGATCTGCCATGGATGTATTCATGA-3'	19
2	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACTTAGGCTTCAGGTTCGTAGT-3'	20
3	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACCTATTTGGTCTTCTCAGCCAC-3'	21
4	센스	5'-GCGCAGATCTCATATGGAGCAAGTGACA-3'	22
5	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACCTAGACTTAGCCAGTGGC-3'	23
6	센스	5'-GCGCGGTACCGAGATCTGGATGAAAAAGGACCAGTTGGGC-3'	24
7	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACTTAGGCTTCAGGTTCGTAGT-3'	25

각각의 증폭된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동 방법으로 정제하고 제한효소로 절단한 다음 pGEX 벡터(Pharmacia Biotech. Buckingamshire, UK)의 제한효소 부위에 연결하여 발현벡터를 작제하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

실시예 2: GST-시누클레인 융합 단백질의 박테리아 발현 및 정제

GST-시누클레인 융합 단백질을 발현시키기 위해 실시예 1에서 작제한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)plysS(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 0.1mg/ml 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 배지에 접종하여 37℃에서 흡광도가 600nm에서 0.8이 될 때까지 배양한 다음 0.5mM IPTG로 유도한 후에 4시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산 완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파 처리(ultrasonication)하여 파괴시켰다. 세포 잔해를 제거한 후 상등액을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 정제하였다. 즉, 상기 상등액을 PBS로 평형된 글루타치온-세파로스 4B 컬럼(Peptron, Taejeon, Korea)에 통과시키고 PBS로 세척한 후 융합 단백질을 10mM GSH(Sigma, St. Louis, Mo)로 용출하였다. 용출된 GST-시누클레인 융합 단백질을 FPLC 겔 여과 컬럼(FPLC gel-filtration column)으로 추가로 정제한 다음 센트리콘 농축기(Amicon, Beverly, MA)로 단백질을 농축하였다.

실시예 3: α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성

α-시누클레인은 규칙적인 2차 구조가 결여되어 있고 아주 상당한 부분의 불규칙 코일(random-coil)을 포함하고 있는 '고유 비구조성 단백질' (Plaxco K. W. and Groβ M., Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H. J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999); Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996))이다. 이전의 연구들은 α-시누클레인과 α_s-카제인과 같은 고유 비구조성 단백질이 온도에 관계없이 풀어진 유사한 형태를 갖고 있으며 그들의 풀어진 형태는 실온에서처럼 고온에서도 안정하기 때문에 내열성을 지닌다고 보고하였다 (Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). 따라서, 이를 확인하고자 α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성을 열에 의해 유도된 단백질 응집을 정성 분석하여 비교하였다. 실험에 사용된 GST와 α-시누클레인 단백질은 각각의 유전자를 포함하고 있는 pGEX 벡터와 pRK172 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 재조합 단백질을 제조하였다(Jakes et al., FEBS Letters 345, 27-32 (1994)). 재조합 GST 단백질은 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하고 재조합 α-시누클레인은 공지된 바와 같이 정제하였다 (Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Paik S. R. et al., Arch. Biochem. Biophys., 344, 325-334 (1997)).

GST와 α-시누클레인 단백질의 열에 의해 유도된 응집을 분석하기 위하여 각 시료를 열처리한 후 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 정성 분석하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, α-시누클레인 단백질의 경우에는 열처리하지 않은 경우와 열처리한 경우에도 모두 단백질 밴드가 나타났으나, GST 단백질의 경우에는 열처리하지 않은 경우에는 단백질 밴드를 확인할 수 있었으나 열처리한 후에는 단백질 밴드가 나타나지 않았다(도 2). 이는 예상한 바와 같이, α-시누클레인은 열처리에 의해 침전되지 않은 반면, GST 단백질은 침전되었기 때문이다. 따라서, α-시누클레인 단백질은 열에 안정한 단백질이고 GST는 열에 불안정한 단백질임을 알 수 있었다. 이와 같은 실험 결과는 pH 및 완충용액의 염농도와 단백질 농도를 고려하지 않아도 동일한 결과를 얻었다(데이터 생략).

실시예 4: α-시누클레인 결실 돌연변이체의 열반응성

다음으로 α-시누클레인의 내열성을 유도하는 영역이 어디인지를 일련의 결실 돌연변이를 통하여 조사하였다. 실시예 2에서 제조한 GST-시누클레인 융합 단백질들을 1mg당 1unit의 트롬빈으로 상온에서 두시간 처리한 후 GST 단백질 부위와 α-시누클레인 부위로 절단하여 α-시누클레인 결돌연변이체(deletion mutants)를 수득한 다음 각각의 결실 돌연변이체의 열안정성(thermal stability)을 조사하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 트롬빈에 의해 분해된 산물(cleaved products)과 천연형의 α-시누클레인 단백질의 열안정성을 조사하였다. 상기 수득한 α-시누클레인 결실 돌연변이체는 각각 산성꼬리를 포함하고 있는 2개의 결실 돌연변이체(Syn61-140aa, Syn96-140aa), α-시누클레인 N-말단(Syn1-60aa)을 포함하고 있는 결실 돌연변이체 및 소수성 NAC 영역(Syn61-95aa)을 포함하고 있는 결실 돌연변이체이다.

실험 결과, 천연형의 α-시누클레인 단백질(Syn1-140)과 C-말단 산성 꼬리를 포함하고 있는 2개의 결실 돌연변이체(Syn61-140, Syn96-140)는 열처리에 의해 침전되지 않아 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였을 때 단백질 밴드가 나타났으며 따라서, 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, α-시누클레인의 N-말단 영역(Syn1-60)과 NAC 영역(Syn61-95)은 열처리에 의해 침전되어 단백질 밴드가 나타나지 않았다 (도 3 M: 마커, 래인 1: 천연형 시누클레인(Syn1-140), 래인 2: N-말단 영역(Syn1-60), 래인 3: 소수성 NAC영역(Syn61-95) 래인 4:산성꼬리를 포함하는 NAC 영역(Syn61-140), 래인 5: 산성 꼬리 영역(Syn96-140)). 상기 실험 결과로부터, α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리를 포함하는 결실 돌연변이체만이 내열성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, C-말단 산성꼬리가 내열성을 부여함을 알 수 있었다. 본 발명자들의 데이터와 일치하여, 이전의 연구에서 α-시누클레인 단백질의 C-말단 절단형과 NAC 펩타이드가 천연형 단백질에 비해 사상체(filaments)로 더 용이하게 형성될 수 있음이 보고된 바 있다 (Serpell L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4897-4902 (2000); Crowther R. A. et al., FEBS Letters, 436, 309-312 (1998); Han H. et al., Chem. Biol., 2, 163-169 (1995); Iwai A. et al., Biochemistry, 34, 10139-10145 (1995)). 이를 종합해보면, α-시누클레인 돌연변이 단백질의 C-말단 절단형은 천연형과 C-말단 산성꼬리를 함유한 단백질에 비해 실온에서와 고온에서 덜 안정적임을 알 수 있었다. 그 결과 C-말단 산성 꼬리가 α-시누클레인의 열용해성에 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 5: GST-시누클레인 융합 단백질들의 열반응성

상기 실시예 2에서 제조한 각각의 GST-시누클레인 융합 단백질의 열반응성을 조사하였다. 열반응성은 실시예 3과 동일한 방법으로 GST-α-시누클레인 융합 단백질들을 10분간 수욕에서 끓인 후 단백질 용액을 원심분리하고 상등액은 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 또한, GST-α-시누클레인 융합 단백질들의 열반응성을 65℃에서 경과 시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)).

실험 결과, 도 4A에서 나타낸 바와 같이, GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140은 열처리 전과 후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 단백질은 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, GST-Syn1-60과 GST-Syn61-95는 열처리 전에는 단백질 밴드가 나타났으나, 열처리 후에는 단백질 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 상기 단백질은 열에 불안정하며 열처리에 의해 완전히 침전되었음을 알 수 있었다.

또한, GST-시누클레인 융합 단백질의 열에 의해 유도된 응집을 65℃에서 시간에 따라 혼탁도를 측정함으로써 정량적으로 분석한 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이 GST 단백질의 OD₃₆₀은 열처리 후 2분이 지난 시점에서 극도로 증가하였고 대부분의 단백질들은 3분이 지나서 응집됨을 알 수 있었다. GST-Syn61-95는 GST 단백질과 유사하게 반응하였고 완전히 응집되었다. GST-Syn1-60의 응집은 비교적 지연됨에도 불구하고 열처리 후에 완전히 응집되었다. 도 4A의 결과와 일치하여 30분간의 열처리 후에도 GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140는 응집되지 않았다. 흥미롭게도, 이러한 3개의 내열성 GST-시누클레인 융합 단백질은 모두 α-시누클레인의 산성 꼬리를 포함하고 있었다. 상기와 같은 결과로부터 열에 불안정한 단백질은 α-시누클레인 산성 꼬리의 도입에 의해 내열성 단백질로 전환될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6: α-시누클레인 결실 돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질의 pI값 및 수친화도(hydropathy)의 비교

이전에, Jurkat T 세포 여액과 사람 혈청으로부터 유래된 많은 내열성 단백질들이 강산성 단백질로 보고되었다. 이는 pI값이 단백질의 내열성과 관련이 있음을 암시해준다 (Kim T. D., et al., Molecules and Cells, 7, 78-83 (2000)). 높게 하전된 단백질은 고온에서도 용해될 수 있기 때문에 단백질의 용해도는 내열성을 결정하는 것에 있어서 중요한 역할을 한다고 추측된다. 이러한 가설을 검증하기 위하여, α-시누클레인 결실 돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질의 pI값 및 수친화도(hydropathy)를 비교하였다(표 2). pI 값과 수친화도는 프롯파람(ProtParam) 프로그램을 사용하여 계산하였다

실험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인, Syn61-140, Syn96-140, GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140과 같은 내열성 단백질의 pI값과 수친화도가 비정상적으로 낮게 나타났다. 반면에 Syn61-95를 제외하고 열에 불안정한 단백질은 pI값과 수친화도가 더 높음을 알 수 있었다. 흥미롭게도, 열에 불안정한 펩타이드인 Syn61-95는 pI값이 매우 낮고 수친화도가 매우 높음을 알 수 있었다. 따라서, pI값과 수친화도가 낮게 하전된 단백질들은 열에 의해 유도된 단백질 응집에 대해 내성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.

α-시누클레인, α-시누클레인 결실 돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질의 등전점(pI)과 수친화도

단백질	온도 반응	pI 값a	수친화도b
α-시누클레인	HRc	4.67	-0.403
Syn1-60	HLd	9.52	-0.188
Syn61-95	HL	4.53	0.726
Syn61-140	HR	3.85	-0.564
Syn96-140	HR	3.76	-1.567
GST	HL	6.18	-0.390
GST-Syn1-140	HR	5.25	-0.378
GST-Syn1-60	HL	7.64	-0.349
GST-Syn61-95	HL	6.01	-0.244
GST-Syn61-140	HR	4.95	-0.435
GST-Syn96-140	HR	4.85	-0.560

^a pI 값은 프롯파람(ProtParam) 프로그램을 사용하여 계산하였다.

^b 수친화도는 프롯파람 프로그램을 사용하여 계산하였다.

^cHR, 내열성(heat-resistant)

^dHL, 열에 불안정성(heat-labile)

실시예 7: GST-시누클레인 융합 단백질들의 2가 양이온 결합의 영향

Cu²⁺와 Ca²⁺같은 2가 양이온은 마이크로몰(micromolar) 범위의 해리상수로 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리영역에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다 (Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem. In Press (2001)). 결합 부위가 아직 밝혀지지 않았지만 Zn²⁺도 또한 α-시누클레인에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다 (Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리가 단백질의 내열성에 중요하기 때문에, 2가 양이온의 결합이 C-말단 산성 꼬리를 포함하는 열에 의해 유도된 GST-시누클레인 융합 단백질의 응집에 미치는 영향을 조사하였다. 2가 양이온으로는 CaCl₂, MgCl₂ 및 ZnCl₂를 사용하였다. α-시누클레인의 산성꼬리를 포함하는 융합 단백질 GST-Syn1- 140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140을 각각의 2가 양이 온0-1.0mM를 함유한 20mM 트리스-HCl 완충용액으로 최종 농도 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 이 단백질 용액을 65℃에서 30분간 반응시키고 360nm에서 겉보기 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, 도 5A 및 도 5B에 나타낸 바와 같이, 저농도의 2가 양이온은 열에 의해 유도된 융합 단백질의 응집에 영향을 주지 않았다. 그러나, 고농도에서는 비록 융합 단백질이 완전하게 침전되지는 않았으나 유의적으로 단백질 응집을 증가시키는데 영향을 주었다. 특히, Zn²⁺는 열에 의해 유도된 단백질 응집을 증가시키는데 영향을 주었다. α-시누클레인과 2가 양이온 사이의 해리 상수는 상당히 낮으며 대부분의 단백질들은 고농도의 금속이온에 의해 영향을 받는다. 이러한 결과는 α-시누클레인 C-말단 산성 꼬리에 2가 양이온의 특이적인 결합이 융합 단백질의 열반응성에는 영향을 주지 않음을 나타내는 것이다. 그러나, 고농도의 금속이온의 비특이적인 결합은 열처리하는 동안에 단백질의 응집을 더 유도함을 알 수 있었다.

실시예 8: 열처리 후 GST-시누클레인 융합 단백질의 GST 활성

상술한 실시예들에서 천연형의 GST 단백질과 달리, GST-시누클레인 융합 단백질은 내열성인 것으로 나타났다. 이는 열에 불안정한 단백질이 α-시누클레인의 산성 꼬리를 도입함으로써 내열성 단백질로 전환될 수 있음을 보여 주는 것이다. 이어서, 본 발명에 따른 내열성 GST-시누클레인 융합 단백질이 열처리 후에도 그 효소활성이 유지되는지를 조사하였다. GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질들을 10분간 수욕에서 끓인 다음 실온에서 방냉한 후 열처리한 단백질의 촉매 활성을 비교하였다. 효소활성은 발색기질인 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(DTNB)을 사용하여 분석하였다 (Habig W. H. et al., J. Biol. Chem., 249, 7130-7139 (1974)). 정제된 GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질을 최종 농도가 20μg/ml가 되도록 기질용액(pH7.4인 0.1M 인산 완충용액에 용해된 1mM GSH와 2mM DTNB)으로 희석하고 10분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 완료되면 효소활성을 350nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 이때 흡광도는 스펙트라맥스 250 마이크로플레이트 리더(Spectramax 250 microplate reader; Molecular Devices, CA, USA)로 측정하였다.

실험 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, GST 및 GST 융합 단백질들은 모두 상기와 같은 극단적인 조건하에서는 효소활성을 완전히 상실하였다. 다음으로, 열처리 후에 초기 효소활성이 50%가 되는 온도인 T₅₀ 값을 결정하는데 사용되는 열불활성 곡선(thermal inactivation curve)으로 GST 및 GST-Syn96-140의 열안정성(thermostability)을 정량적으로 측정하였다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, GST-Syn96-140의 T₅₀값은 GST에 비해 약 2℃가 높았다. 흥미롭게도, GST의 열불활성화(thermal inactivation)는 단백질의 열 응집과 상관관계가 있었으며 도입된 산성 꼬리가 융합 단백질의 열에 의한 응집을 방지하여 열불활성화로부터 효소를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 9: 열에 의해 유도된 GST-ATSα 의 2차 구조 변화

이전에, 열에 의해 유도된 α-시누클레인의 2차 구조 변화를 CD 분석으로 측정한 결과가 보고되었다 (Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). α-시누클레인의 CD 스펙트럼은 단백질에 이차 구조 요소가 거의 완전히 결여되어 있음을 나타냈다. 100℃에서 α-시누클레인의 CD 스펙트럼은 25℃에서와 약간 다른 경향을 나타내었으나 불규칙 코일(random-coiled) 폴리펩타이드의 특성을 나타낸다. 이들의 결과와 일치하여, 풀어진(unfolded) 펩타이드에서 흔히 볼 수 있는 CD 신호의 온도에 따른 비례적 의존성(linear temperature-dependence) 이 관찰되었다.

본 발명자들은 열변성에 따른 GST의 CD 스펙트럼과 GST-시누클레인 융합 단백질의 CD 스펙트럼을 측정함으로써 2차 구조 변화를 분석하였다. CD 스펙트럼은 온도 조절 시스템이 장착된 Jasco-J715 분광편광계(Jasco, Japan)를 이용하여 연속 모드로 측정하였다. 극-UV CD의 측정은 25℃ 내지 100℃ 하에 0.5cm의 밴드 넓이를 갖는 190-250nm의 파장 범위, 1초 반응시간 및 10nm/min 스캔 속도에서 실행하였다. 측정된 스펙트럼을 완충용액 신호를 공제하여 교정한 5회 스캔의 평균치로 나타내었다. CD 데이터는 잉여타원율[θ]의 평균값(deg·cm²dmol-1)을 나타낸다. CD 측정을 위한 각각의 단백질 시료는 달리 특정되지 않는 한 10mM 인산나트륨 완충용액으로 제조하였고 모든 스펙트럼은 패스길이가 0.1cm인 큐벳에서 측정하였다.

열변성(Thermal denaturation) 실험은 승온속도 1℃/min으로 수행하였고 반응시간은 1초로 하였다. 온도 스캔 데이터는 25℃부터 100℃까지를 수집하였다. GST와 GST-Syn96-140의 농도는 각각 0.1mg/ml, 0.3mg/ml로 하였다. CD 스펙트럼은 달리 특정되지 않는 한 222nm 파장에서 0.5℃마다 측정하였다. 온도 변화의 가역성은 온도증가에 의해 기록된 스캔과 열에 의해 풀어진 단백질 시료를 냉각시키면서 기록된 스캔을 비교하여 관찰하였다.

실험 결과, 25℃에서 GST의 CD 스펙트럼은 도 7A에 나타낸 바와 같이 잘 정돈된 2차 구조 요소를 포함함을 알 수 있었다. 그러나, 100℃에서는 극-UV CD 스펙트럼이 단백질의 침전에 의해 거의 사라져 버렸다(데이터 제시되지 않음). 열에 의해 유도된 GST의 222nm에서의 타원율(ellipticity)의 변화는 GST의 융점(Tm)이 약 70℃임을 나타내었다. GST는 100℃에서 완전히 침전되었고 222nm에서는 CD 신호가 나타나지 않아 GST가 비가역적으로 침전되었음을 알 수 있었다(데이터 제시되지 않음). 이러한 결과는 GST 단백질이 온도가 증가됨에 따라 풀어지고 침전되는 전형적인 열 불안정성 단백질임을 증명해 주는 것이다.

GST-Syn96-140의 극-UV CD 스펙트럼은 도 7B에 나타내었다. 실온에서 GST-Syn96-140의 극-UV CD 스펙트럼(실선)은 단백질이 잘 정돈된 2차 구조 요소를 포함함을 보여주었다. CD 스펙트럼은 100℃에서는 2차 구조 요소가 감소함을 보여주었지만, 전체적인 형태는 변화하지 않았다(점선). 이러한 결과는 가열이 완전한 풀어짐을 유도하지는 않음을 의미한다. 흥미롭게도, 불규칙한 코일(random-coil) 폴리펩타이드의 특징으로 195nm에서 새로운 흡수 밴드가 나타났다. 단백질 용액을 냉각한 후의 극-UV CD 스펙트럼은 초기 스펙트럼(괘선)과 차이가 있었으며 이는 GST-Syn96-140의 형태가 비가역적으로 변화되었음을 나타내는 것이다. 열처리한 GST-Syn96-140의 실온에서 측정한 CD 스펙트럼은 100℃에서와 유사하였고 이러한 결과는 상기 단백질이 2차 구조 요소와 불규칙-코일 형태의 2개의 독립적인 영역으로 구성되었음 보여주는 것이다. 가열에 의해 유도된 형태적 변화를 확인하기 위해, 온도에 따른 GST-Syn96-140의 용융곡선을 측정하였다. 222nm에서 열에 의해 유도된 타원율의 변화를 도 7B에 나타내었다. 흥미롭게도, 열에 의해 유도된 GST-Syn96-140의 풀어짐은 2단계로 이루어졌다. 62℃에서 첫 번째 변화가 일어나고 95℃에서 2번째 변화가 일어났다. 예상한 대로, GST-Syn96-140의 온도 곡선은 비가역적으로 나타났다(점선).

GST-Syn96-140이 내열성 단백질인 반면, GST는 열에 불안정한 단백질이다. 상기 두 단백질의 안정성을 비교하기 위하여, 두 단백질의 융점(Tm)을 결정하는 것이 매우 유용하다. 그러나, 상기 단백질들은 펩타이드 도메인의 수가 다르기 때문에 GST-Syn96-140과 GST의 융점을 직접적으로 비교하는 것은 어렵다. 흥미롭게도, GST-Syn96-140의 Tm 값(첫번째 변화시 62℃)은 GST(70℃)에 비해 약간 낮게 나타났다. 주어진 단백질의 융점은 천연의 단백질과 온도에 의해 변성된 단백질 사이의 자유 에너지의 변화와 관련이 있기 때문에, Tm은 단백질의 형태적 안정성에 대한 열역학적 변수로서 사용된다. 따라서, GST의 C-말단 산성 꼬리의 도입은 단백질의 온도증가와 같은 환경 스트레스에 대한 안정성과 내열성에 유리하지만, 단백질의 고유한 열 안정성(intrinsic thermal stability)에는 불리함을 알 수 있었다.

실시예 10: ATSα가 pH 및 금속에 의해 유도된 단백질의 응집에 미치는 영향

pH에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집은 혼탁도를 pH에 따라 측정함으로써 조사하였다. 혼탁도의 측정은 360nm에서 pH 변화에 따른 겉보기 흡광도를 조사함으로써 측정하였다. 상기 단백질을 각기 다른 pH 값을 갖는 완충용액으로 최종 농도가 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 완충용액으로는 0.1M 아세트산(pH4.0 및 pH5.0), 0.1M 구연산(pH6.0) 및 0.1M 트리스-HCl(pH7.4)를 사용하였다. 상기 완충용액으로 희석한 단백질 용액을 실온에서 1시간 동안 반응시키고 겉보기 흡광도를 벡크만 흡광분광계(DU650, Beckman)로 측정하였다. 또한, 금속이온인 Zn²⁺,혹은 Cu²⁺에 의해 유도된 GST와 GST-Syn96-140의 응집을 측정하였다. 각 단백질을 0-1.0mM Zn²⁺,혹은 Cu²⁺를 함유한 20mM 트리스-HCl 완충용액으로 최종 농도 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 단백질 용액을 실온에서 30분간 반응시키고 360nm에서 겉보기 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, pH에 의해 유도된 단백질의 응집은 도 8A에 나타낸 바와 같다. GST 단백질의 OD₃₆₀은 pH7.4에서 pH5.0까지 점차적으로 증가하였고 pH4.0에서 최고값에 도달하였다. 반면에, GST-Syn96-140의 OD₃₆₀은 pH5.0까지 변화하지 않았으나 pH4.0에서 매우 증가하였으며 이는 산성 꼬리의 중성화에 기인한 것으로 사료된다. 이로부터 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα, Syn96-140)가 강산성 조건에서는 보호효과가 크지 않지만 pH 4.0이상의 pH에 의해 유도된 응집으로부터 GST를 완벽하게 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 금속이온에 의해 유도된 단백질의 응집은 도 8B에 나타낸 바와 같다. 실험 결과, ATSα는 금속이온에 의해 유도된 응집으로부터도 GST를 보호할 수 있었다. GST 단백질의 OD₃₆₀은 0.2-1.0mM Zn²⁺를 처리하였을 때 점차 증가하였으며 GST-Syn96-140의 OD₃₆₀은 GST의 OD에 비해 항상 낮게 나타났다. 특히, ATSα는 Cu²⁺에 의해 유도된 응집으로부터 GST를 완벽하게 보호할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 ATSα가 금속이온에 의해 유도된 응집으로부터도 GST를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 11: ATSα가 스트레스에 의해 유도된 DHFR의 응집에 미치는 영향

ATSα(Syn96-140)를 GST 이외의 단백질에 융합시켰을 때도 융합 단백질이 환경 스트레스에 내성을 보이는지 알아보기 위해 본 발명자들은 DHFR의 C-말단 영역에 ATSα를 포함하는 DHFR-시누클레인 융합 단백질의 하나인 서열번호 81의 DHFR-ATSα(DHFR-Syn96-140)를 작제하였다.

우선 DHFR 단백질 코딩영역을 E.coil 발현 벡터 pRSETA(Invitrogen)의 BamHⅠ 및 HindⅢ 제한부위에 서브클로닝하였다(pDHFR). 다음에 ATSα 코딩 영역을 밑줄친 KpnI 제한 부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 26)와 밑줄친 SalI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 27)으로 PCR 증폭하였다. 상기 증폭된 DNA를 겔 정제하고 KpnI/SalI 제한효소로 소화한 다음 같은 제한효소로 소화해둔 pDHFR 벡터에 연결한 다음 E.coli에 형질전환시킨 후 재조합 벡터를 분리하였다. 상기 발현벡터(pDHFR-ATSα)를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

DHFR-시누클레인 융합 작제물의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산 서열	서열번호
8	센스	GCGCGGTACCAAGGACCAGTTGGGCAAGAATG	26
9	안티센스	GCGCGTCGACTTAGG CTTCAGGTTCGTAGT	27

상기 발현벡터(pDHFR-ATSα)로 E.coli BL21(DE3)를 형질전환하였다. 형질전환된 박테리아를 암피실린 0.1mg/ml를 포함하는 LB 배지에 접종하여 37℃에서 흡광도(A₆₀₀)가 0.8이 될 때까지 배양한 다음 0.5mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고 인산 완충용액(PBS, pH7.4)에 재현탁한 후 초음파처리(ultrasonication)하여 세포를 용해시켰다. 상기에서 용해된 균체를 제거한 다음 상등액을 로딩완충액[0.3M NaCl 및 10mM 이미다졸을 포함하는 50mM 인산완충액(pH 8.0)]으로 평형화시켜 둔 Ni-NTA 컬럼에 로딩하였다. 상기 로딩완충액을 세척한 다음, 단백질을 250mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액으로 용출시켰다. 상기 DHFR-ATSα를 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제하였다. 정제된 단백질을 센트리콘(Amicon, Beverly, MA)으로 농축하고 완충액을 교환하였다. 이렇게 작제된 DHFR-ATSα융합 단백질의 열에 대한 내성을 DHFR의 그것과 비교하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.2mg/ml)를 10분간 65℃와 100℃ 수욕에서 각각 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, 도 9에서 나타낸 바와 같이, DHFR-ATSα은 열처리 전과 65℃와 100℃ 열처리 후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 단백질은 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, DHFR은 열처리 전에는 단백질 밴드가 나타났으나, 65℃와 100℃ 열처리 후에는 모두 단백질 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 상기 단백질은 열에 불안정하며 열처리에 의해 완전히 침전되었음을 알 수 있었다. 이러한 사실은, 야생형 DHFR은 열에 의한 스트레스에 의해 쉽게 침전되는 열에 불안정한 단백질인데 반해 본 발명에 따른 DHFR-ATSα는 매우 높은 내열성을 지니고 있는 것으로 나타나 ATSa가 GST뿐만 아니라 DHFR과 다른 단백질에도 열에 대한 내성을 부여할 수 있는 성질이 있는 펩타이드임을 보여준다.

실시예 12: ATSα 펩타이드 단편과 GST와의 융합 단백질의 열에 대한 내성

ATSα는 45개의 아미노산(잔기 96-140)으로 구성되어 있으며 15개의 Glu/Asp 잔기가 이 영역에 걸쳐 분산되어 있다. 본 발명자들은 상기 ATSα 영역 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 일련의 GST-시누클레인 융합 단백질(GST-(ATSα단편))이 열에 대한 내성을 갖는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 pGEX 벡터에 (ATSα단편)을 코딩하는 유전자를 연결하여 일련의 GST-(ATSα단편)을 제조하였다. ATSα 단편을 코딩하는 DNA는 자동 DNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하였다 (표 4, 서열번호 28-35). 올리고뉴클레오타이드 서열번호 28과 29는 GST-Syn103-115를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 30과 31은 GST-Syn114-126를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 32과 33은 GST-Syn119-140를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 34와 35는 GST-Syn130-140를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이다. 합성된 센스와 안티센스 DNA 짝을 각각 어닐링(annealing)한 후 pGEX 벡터의 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 ATSα 유전자 부분을 연결시킴으로써 다음과 같은 일련의 GST-ATSα 결손 돌연변이체의 발현 벡터를 제조하였다. ATSα의 13개 아미노산(잔기 103-115)을 포함하는 GST-Syn103-115(서열번호 82); ATSα의 13개 아미노산(잔기 114-126)을 포함하는 GST-Syn114-126(서열번호 83); ATSα의 22개 아미노산(잔기 119-140)을 포함하는 GST-Syn119-140(서열번호 84); 및 ATSα의 11개 아미노산(잔기 130-140)을 포함하는 GST-Syn130-140(서열번호 85)를 각각 제조하였다(도 10A). 상기 모든 발현벡터(pGST-Syn103-115, pGST-Syn114-126, pGST-Syn119-140 및 pGST-Syn130-140)는 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

GST-ATSα(GST-Syn96-140)의 ATSα 펩타이드 단편 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산 서열	서열번호
10	센스	GATCCAATGAAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGCATTCTGGAAGATTAAG	28
11	안티센스	AATTCTTAATCTTCCAGAATGCCTTCCTGTGGGGCTCCTTCTTCATTG	29
12	센스	GATCCGAAGATATGCCTGTAGATCCTGACAATGAGGCTTATGAATAAG	30
13	안티센스	AATTCTTATTCATAAGCCTCATTGTCAGGATCTACAGGCATATCTTCG	31
14	센스	GATCCGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAAG	32
15	안티센스	AATTCTTAGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATACCCTTCCTCAGAAGGCATTTCATAAGCCTCATTGTCAGGATCG	33
16	센스	GATCCGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAAG	34
17	안티센스	AATTCTTAGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATACCCTTCCTCG	35

발현벡터 pGST-Syn103-115, pGST-Syn114-126, pGST-Syn119-140 및 pGST-Syn130-140을 E.coli BL21(DE3)에 형질전환한 다음 재조합 단백질을 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 ATSα 단편과 GST와의 융합 단백질들을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제한 다음, 각각 열에 대한 내성을 조사하였다. 우선 각 시료를 열처리한 후 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 정성 분석하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, 도 10B에서 나타낸 바와 같이 이들 ATSα 단편과 GST와의 융합 단백질들을 높은 농도 (0.6mg/ml)에서 10분간 100℃에서 열처리했을 때, ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 열처리 후에도 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11 내지 13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 대부분 침전되고 일부만 수용액 중에 남아 있었다. 반면에 이들 GST-ATSα 융합 단백질의 결실 돌연변이체들을 낮은 농도 (0.2mg/ml)에서 같은 조건으로 열처리했을 때는 이들 모두 전혀 응집되지 않았다 (데이타 생략).

또한, 상기 ATSα 단편과 GST와의 융합 단백질들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과 시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 10C에 나타낸 바와 같이 GST 단백질의 OD₃₆₀은 열처리 후 2분이 지난 시점에서 극도로 증가하였고 3분이 지난 후에는 모두 응집되었다. 반면에 상기 ATSα 단편과 GST와의 융합 단백질들은 같은 조건하에서 10분간의 열처리 후에도 전혀 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 융합 단백질의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 10D에 나타낸 바와 같이 ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 농도에 관계없이 열처리 후에 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11 내지 13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 낮은 농도에서는 전혀 침전이 되지 않았으나 농도가 높아질수록 응집되는 양이 증가하였다. 단백질의 응집이 농도에 비례한다는 사실은 주지의 사실이다. 이상의 결과를 종합해 보면, 이들 GST-ATSα 융합 단백질의 결실 돌연변이체들이 모두 야생형 GST에 비해 열에 대한 내성이 월등함을 보여주며, 흥미롭게도 ATSα의 길이에 따라 열에 대한 내성에 차이가 남을 보여준다. 따라서, 표적단백질의 크기 및 성질에 따라 ATSα의 길이를 적당히 선택하면 최적의 효과를 얻을 것으로 기대한다.

실시예 13: ATS β 또는 ATSγ를 포함하는 GST-시누클레인 융합 단백질의 열에 대한 내성

인간에서 발견되는 β-시누클레인 및 γ-시누클레인도 α-시누클레인과 더불어 시누클레인 가족을 이루는 단백질 구성원으로 이들은 서로 아미노산 서열상 높은 유사성을 보인다. 특히, 시누클레인 N-말단 양친매성 영역은 가오리로부터 사람에 이르기까지 시누클레인 계열의 일원간에 강하게 보존되어 있다. 그러나, 시누클레인 계열의 일원간에 C-말단 산성 꼬리 영역은 그 크기와 서열이 매우 다양하다 (Lavedan C., Genome Research, 8, 871-880 (1998); Lucking C. B and Brice A. Cell Mol Life Sci, 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochem. Biophys. Acta, 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol. 9, 707-720 (1999)). 본 발명자들은 β-시누클레인의 산성꼬리(이하, ATSβ라 함) 및 γ-시누클레인의 산성꼬리(이하, ATSγ라 함)영역을 포함하는 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ 융합 단백질의 경우에도 열에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다.

pGEX 벡터에 ATSβ(잔기 85-134)와 ATSγ(잔기 96-127)를 각각 서브클로닝하여 서열번호 86의 GST-ATSβ 및 서열번호 87의 GST-ATSγ 융합 단백질을 제조하였다 (도 11A). 상기 ATSβ 단백질 코딩 영역은 밑줄친 BamHI 제한 부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 36)와 밑줄친 XhoI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 37)로 PCR 증폭하였다. ATSγ 단백질 코딩 영역은 밑줄친 BamHI 제한부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 38)와 밑줄친 EcoRI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 39)로 PCR 증폭하였다.

GST-ATSβ 및 GST-ATSγ의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산 서열	서열번호
18	센스	AGCTAAGGATCCAAGAGGGAGGAATTCC	36
19	안티센스	AAGTAACTCGAGCTACGCCTCTGGCTCATA	37
20	센스	AAGAATGGATCCCGCAAGGAGGACTTGA	38
21	안티센스	AATAGCGAATTCCTAGTCTCCCCCACTCT	39

상기 증폭된 DNA를 겔 정제하고 적합한 효소로 소화한 다음 적합한 효소로 소화해둔 pGEX 벡터에 연결하고 겔 정제하였다. 상기 발현벡터 pGST-ATSβ 및 pGST-ATSγ의 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 발현 벡터 pGST-ATSβ 및 pGST-ATSγ를 E. coil BL21(DE3)에 형질전환하고 재조합 GST-시누클레인 융합 단백질 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ를 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 GST-시누클레인 융합 단백질을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제하였다. 이렇게 작제된 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ가 각각 열에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다. 우선 PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다. 실험 결과, 도 11B에 나타낸 바와 같이, GST-ATSα뿐만 아니라 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ도 열처리 후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 융합 단백질은 매우 높은 내열성을 지님을 알 수 있었다.

또한, 상기 GST-ATS 융합 단백질들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과 시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 11C에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 2-3분이 지난 후에는 모두 응집되었다. 반면에 상기 GST-ATS 융합 단백질들은 같은 조건하에서 10분간의 열처리 후에도 전혀 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 GST-ATS 융합 단백질들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 11D에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 낮은 농도에서도 모두 응집된 반면, 상기 GST-ATS 융합 단백질들은 같은 조건하에서 농도에 관계없이 열처리 후에도 거의 응집되지 않았다. 이상의 결과를 종합해 보면, ATSα뿐만 아니라 ATSβ와 ATSγ도 다른 단백질에 내열성을 부여할 수 있는 성질이 있는 펩타이드임을 알 수 있고, 이들을 환경 스트레스에 내성을 갖는 융합 단백질의 제조에 활용할 수 있음을 알 수 있다. 더불어, 시노레틴의 아미노산 서열이 γ-시누클레인과 매우 유사하기 때문에, 시노레틴의 산성 꼬리도 동일한 용도로 사용될 수 있으리라 추정된다.

실시예 14: 폴리글루타메이트로 구성된 산성 꼬리를 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질의 열에 대한 내성

시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역에는 Glu/Asp 잔기와 같이 음전하를 띠는 아미노산 잔기가 다수 분포되어 있는 특징이 있다. 본 발명자들은 폴리글루타메이트와 같이 순수하게 음전하를 띤 펩타이드 단편을 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질도 열에 대한 내성을 갖는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 pGEX 벡터에 폴리글루타메이트 유전자 부분을 연결하여 일련의 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질을 제조하였다 (도 12A). 폴리글루타메이트 펩타이드를 코딩하는 DNA는 자동 DNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하였다 (표 6, 서열번호 40-43). 올리고뉴클레오타이드 서열번호 40과 41은 GST-E5 (글루타메이트 잔기 5개 포함)를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 42와 43은 GST-E10 (글루타메이트 잔기 10개 포함)를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이다. 합성된 센스와 안티센스 DNA 짝을 각각 어닐링한 후 pGEX 벡터의 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 폴리글루타메이트 유전자 부분을 연결시킴으로써 일련의 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질을 지령하는 발현벡터를 제조하였다. 상기 모든 발현벡터 (pGST-E5와 pGST-E10)는 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

GST-폴리글루타메이트 융합 단백질의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산 서열	서열번호
22	센스	GATCCGAAGAAGAAGAAGAATAA	40
23	안티센스	AATTCTTATTCTTCTTCTTCTTCG	41
24	센스	GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATAAG	42
25	안티센스	AATTCTTATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG	43

발현벡터 pGST-E5 및 pGST-E10을 E.coli BL21(DE3)에 형질전환한 다음 재조합 단백질을 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제한 다음 (도 12B), 각각 열에 대한 내성을 조사하였다. 우선 PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 실험 결과, 서열번호 88의 GST-E5와 서열번호 89의 GST-E10 융합 단백질 모두 상기와 같은 열처리 후에 단백질 밴드가 사라졌으며 이로부터 열처리에 의해서 완전히 침전되었음을 알 수 있었다 (데이타 생략). 따라서, 상기 단백질은 이러한 극단적인 조건하에서는 내열성이 없음을 알 수 있었다.

또한, 상기 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과 시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 12C에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 65℃에서 2-3분이 지난 후에는 모두 응집되었고, GST-E5 융합 단백질들도 같은 조건하에서 상당량이 응집된 반면, GST-E10 융합 단백질은 65℃에서 10분간의 열처리 후에도 거의 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 12D에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 낮은 농도에서도 모두 응집되었고 GST-E5 융합 단백질도 높은 농도에서는 대부분 응집되었다. 반면에, GST-E10 융합 단백질들은 같은 조건하에서 열처리 후에 일부만 응집되었으며 농도가 높아질수록 응집되는 양이 현저하게 증가하는 양상을 나타내었다. 이상의 결과를 종합해 보면, 폴리글루타메이트의 길이가 늘어날수록 음전하가 증가하여 표적단백질에 열에 대한 내성을 부여하는 성질이 높아짐을 알 수 있다. 그러나 흥미롭게도 폴리글루타메이트 꼬리는 같은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 ATS에 비해 열에 대한 내성을 부여하는 능력이 훨씬 낮음을 알 수 있다. 실제로 GST-Syn130-140이 같은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E5보다 월등히 높은 내열성을 보이고 있고, 두 배나 많은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E10 보다는 약간 낮은 내열성을 보이고 있다 (도 10D와 도 12D 비교). 따라서 ATS가 환경 스트레스에 대한 내성을 보이는 기전은 단순한 음전하량의 증가에 의한 단백질의 수용성이 증가하는 것 이외에도 ATS의 독특한 아미노산 서열이 중요한 역할을 하고 있음을 추정할 수 있다. 아울러 본 발명자들은 흥미롭게도 양전하를 띠는 폴리-아르기닌과 같은 펩타이드는 열에 대한 내성을 부여하는 성질이 거의 없음을 관찰하여 (데이타 생략), ATS의 독특한 아미노산 서열이 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하는데 있어 매우 중요한 역할을 하고 있음을 뒷받침해 주는 결과를 얻었다.

실시예 15: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 단백질의 제조

hGH의 발현 벡터는 pRSETA 발현벡터(Invitrogen)에 hGH 유전자를 서브클로닝하여 작제하였다. hGH의 cDNA는 인간성장 호르몬을 분비하는 뇌하수체 조직으로부터 poly(A)mRNA를 Aviv 등의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69, 1408-1412)으로 얻은 후, 이 mRNA로부터 역전사효소가 포함된 RNA PCR 키트(TAKARA, (AMV) 버전 2.1, Japan)을 이용하여 이중나선의 cDNA를 얻었다. hGH의 cDNA를 템플레이트로 하여 밑줄친 NdeI 제한부위를 가진 프라이머 (5'-GCGCTCGAGCCCATATGTTCCCAACTATACCA-3' : 서열번호 44)과 밑줄친 HindIII 제한 부위를 가진 프라이머 (5'-GCGCAAGCTTAAGCTTTTAGAAGCCACAGCTGCC-3' : 서열번호 45)를 사용하여 각각 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동 방법으로 정제하고 NdeI과 HindIII 제한효소로 절단한 다음 동일한 효소로 절단한 pRSETA 벡터에 연결하여 pRSETA-hGH를 제작하였다.

hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 제조물은 pRSETA 발현벡터에 hGH과 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다(도 13). 간략하게 설명하면, ATSα의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 DNA를 화학적으로 합성하였다(서열번호 46, 47, 48, 49). 서열번호 46 및 47은 Syn119-140-hGH 융합 단백질 제조를 위한 ATS의 양쪽 스트랜드(double strand)의 염기서열이며, 서열번호 48 및 49는 hGH-Syn119-140 융합 단백질 제조를 위한 ATS의 양쪽 스트랜드의 염기서열이다.

합성된 cDNA를 이용하여, 우선 N-말단 융합(pATS-N)을 위해 Syn119-140를 코딩하는 유전자를 NdeI과 BamHI 로 절단하여 pRSETA벡터에, C-말단 융합(pATS-C)을 위해서는 Syn119-140를 코딩하는 유전자를 BamHI과 HindIII로 절단하여 pRSETA벡터에 각각 라이게이션 하여 Syn119-140가 결합된 벡터를 제조하였다. pRSETA-hGH를 BamHI과 HindIII 로 절단하여 전기영동하여 겔상에서 hGH 단편을 분리한 후 동일한 효소로 절단한 pATS-N 벡터에 라이게이션하여 Syn119-140-hGH 융합 단백질을 코딩하는 벡터 pATS-hGH을 제조하였다. 또한 pRSETA-hGH를 NdeI과 BamHI으로 절단하여 전기영동하여 겔상에서 hGH 단편을 분리한 후 동일한 효소로 절단한 pATS-C 벡터에 라이게이션하여 hGH-Syn119-140 융합 단백질을 코딩하는 벡터 phGH-Syn119-140 를 제조하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다. hGH-Syn119-140과 Syn119-140-hGH의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 90 및 92에, 그들이 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 91 및 93에 나타내었다.

실시예 16: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 재조합 단백질의 발현 및 정제

hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 단백질을 발현시키기 위하여 실시예 15에서 제조한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)에 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균은 0.1mg/ml 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하여 37℃에서 흡광도가 600nm에서 0.8이 될 때까지 배양한 다음 0.5mM IPTG로 유도한 후에 4시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산 완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파 처리하여 파괴시켰다. hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 단백질들은 모두 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 비슷한 발현 수준을 보이며 과발현 됨을 알 수 있었다(자료 생략).

발현된 봉입체(Inclusion body)는 Kim 등에 의한 방법(Kim et al., (1997) J. Immunol. 159, 3875-3882)에 의해 분리한 후, Patra 등에 의한 알카리 방법( Patra et al., (2000) Prot. Exp. Purif. 18, 182-192)을 이용하여 재접힘 반응을 실시하였다.

재접힘 반응이 끝난 단백질은 DEAE-세파셀(Sephacel) 음이온 교환수지에 시료를 흘린 후, 0.1 M 염화나트륨, 5 mM EDTA, 0.4 M 우레아 및 0.02% 소디움 아지드를 함유하는 20 mM 트리스 완충액(pH 8.5)으로 세척하였다. 음이온 교환수지에 결합된 시료는 20 mM 트리스 완충액(pH 8.5) 100 ㎖과 0.4 M 염화나트륨을 함유한 동일한 완충액 100 ㎖씩을 사용하여, 선형구배로 용출시켰다.

최종 정제를 위한 마지막 단계로 FPLC(fast protein liquid chromatography)를 이용하여, HiLoadTM 16/60컬럼으로 시료를 정제하였으며, 완충액으로 PBS을 사용하였다. 준비된 시료를 가한 후 120분간 완충액을 흘려주고, 용출되는 분획은 280nm에서 흡광도를 측정하여 균일하게 단백질을 정제하였다.

hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 알카리 방법에 의한 재접힘 효율이 야생형인 hGH보다 약 2배 가량 높게 나타났고(표 7), 재접힘 완충액에 소량의 시료를 희석하는 재접힘 방법에서도 같은 결과를 얻었으며 이는 ATS 펩타이드가 단백질의 재접힘 반응을 도와준다는 것을 의미하는 것이다.

hGH, Syn119-140-hGH와 hGH-Syn119-140의 정제수율 비교

단 계	hGH		Syn119-140-hGH		hGH-Syn119-140
	총 단백질양 (mg)	전체 수율 (%)	총 단백질양 (mg)	전체 수율 (%)	총 단백질양 (mg)	전체 수율 (%)
세포 용해물	125		115		109
봉입체	40	100	45.1	100	35.6	100
가용화	36	90	43.8	97.1	32.2	90.4
이온교환 크로마토그래피	10.5	26.2	14.7	32.6	16.3	45.8
겔 여과 크로마토그래피	6.5(±.1)	16.2	11.9(±.34)	26.4	11.3(±.52)	31.7

GH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 최종 수율은 야생형 hGH보다 약 2배 가량 높았으며 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과(도 14), hGH는 SDS-PAGE상에서 22kDa의 크기를 나타낸 반면, Syn119-140-hGH와 hGH-Syn119-140 융합 단백질들은 24kDa의 크기를 나타내었다. hGH는 표준 hGH과 SDS-PAGE상에서 그 크기가 동일함을 확인 할 수 있었다(자료 생략).

MALDI-TOF로 측정한 정제된 hGH, Syn119-140-hGH및 hGH-Syn119-140의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다(표 8).

정제된 hGH, Syn119-140-hGH와 hGH-Syn119-140의 MALDI-TOF를 통한 분자량 비교

	이론상 분자량(Dalton)	실제 측량한 분자량(Dalton)
hGH	22260.3	22259.43
Syn119-140-hGH	24964.9	24964.11
hGH-Syn119-140	24964.9	24957.50

유발되는 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140 단백질의 2차 구조를 알아보기 위해 분광 편광계(Spectropolarimeter)를 통한 CD 스펙트럼을 실시 하였다. 25℃에서 hGH의 스펙트럼은 알파 나선형 단백질의 특징적인 208nm와 222nm의 흡광도를 나타내었다(도 15, 직선: hGH, 괘선: hGH-Syn119-140, 점선: Syn119-140-hGH). 또한, 야생형 hGH와 매우 유사한 형태를 나타내었으며 이는 융합 단백질이 정확하게 재접힘 구조를 지니고 있다는 것을 의미 하는 것이다. 이러한 사실은 생물학적 활성도 실험을 통해 더 확실하게 증명되었다.

실시예 17: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 단백질의 생물학적 활성 측정

hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 단백질들의 생물학적 활성은 Nb2세포의 증식을 측정함으로써 분석하였으며(Tanaka et al., (1980) J. Clin. Endoclinol. Metab. 51, 1058-1063.; Dattani et al., (1995) G120R, J. Biol. Chem. 270, 9222-9226 ; Peterson et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 21444-21448), STAT-5의 인산화된 형태(phosphorylated form)를 감지함으로 이를 더욱 확증하였다(Friedrichsen et al., (2001) Mol Endocrinol. 15, 136-148.; Graichen et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, 6346-6354).

Nb2-11 쥐 림프종 세포(Tanaka et al., (1980), J. Clin. Endoclinol. Metab. 51, 1058-1063)는 ECACC(European Collection of Cell Culture)에서 구입하였다. 동물세포 배양에 사용되는 모든 초자기구, 배지 및 증류수는 멸균하거나, 멸균된 제품을 사용하였다. RPMI1640배지(GibcoBRL, Cat # :31800-022)을 삼차 증류수에 녹이고 여기에 0.37% 중탄산소다를 첨가한 후 염화수소를 이용하여 pH를 7.2로 적정한 다음 막공 크기가 0.22um의 필터를 통과시켜 멸균하였다. 상기 멸균 배지에 2 mM 머켑토에탄올, 50 unit/ml 페니실린, 50ug/ml 스트렙토마이신, 2x 10^-3 M L-글루타민, 및 10% 말 혈청을 첨가하여 세포를 배양하였다. 배지는 2~3일을 주기로 교환해 주었다. 배양용기 표면에 세포가 80~90% 정도에 이르렀을 때 계대 배양을 실시하였다. 2X10⁴ 개의 세포를 96웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 3중(triplate)으로 넣은 후 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140 각각의 단백질을 1X10^-4nM 내지 100nM이 되도록 동일한 배지에 희석하여 웰에 첨가하고 48시간 동안 세포를 자극하였다. 각각의 웰의 최종부피는 100ul로 고정시켰다. 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소의 활성에 의해 MTS가 갈색을 띠는 물질로 전환되는 것을 응용하여 세포 생존율을 측정하였다. 96웰 플레이트에서 배양한 Nb2세포가 포함된 배지 100ul에 MTS를 80ul를 첨가하고 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 반응 시켰다. 최종 반응물은 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 16에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질의 Nb2세포 증식활성은 야생형의 hGH와 비슷한 양상을 보였다.

실시예 18: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 의 웨스턴 블랏 분석

Wang et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1391-1395의 방법에 따라 hGH 시료들을 처리한 것과 그렇지 않은 세포의 전체 세포 용해질을 준비한 후 STAT-5의 타이로신 인산화 형태에 대한 단클론 항체를 이용하여 제조사(Transduction Laboratories)가 제공한 방법에 의거하여 웨스턴블롯을 실시하였다. 이는 hGH가 세포표면의 수용체(GH receptor)에 결합하면 세포내 Jak2 티로신 키나제가 활성화 되고, 활성화된 Jak2에 의해 모아진 STAT-5가 티로신 위치에서 인산화가 되는 원리를 이용한 것이다.

Nb2 세포주에 1nM의 hGH, Syn119-140-hGH 혹은 hGH-Syn119-140를 각각 15분, 30분간 자극하였다. 파이펫팅으로 세포를 떼어내고, 세포와 배지를 15,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여, 세포 침전물을 분리했다. 세포 침전물은 용해 완충액 100ul를 가하여 얼음에서 30분간 반응시키고 다시 20,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 이렇게 분리한 상등액은 12% SDS PAGE 겔로 전기영동 후 겔-막 이동 키트를 이용하여 PVDF막으로 500 mA에서 1시간 30분간 이동시켰다. 이동이 끝난 막을 비특이적 결합에 의한 배경신호를 차단하기 위하여 3% 탈지분유를 포함한 세척완충액을 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 단클론 항-stat5(1:500)의 1차 항체를 3% 탈지우유를 포함하는 세척완충액 상에서 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 세척완충액으로 10분 동안 3번에 걸쳐 세척하였다. 세척이 끝난 막에 2차 항체인 당근과산화효소(1:1,000)을 3% 탈지우유가 포함된 세척완충용액을 이용하여 1시간 동안 실온에서 다시 반응 시키고 세척완충용액으로 10분 동안 4번에 걸쳐 세척하였다. DAP(20ug)과 과산화수소(30ul) 혼합액을 항체가 붙은 막에 1분간 반응시키고 밴드를 가시화 하였다.

Nb2 세포에서 hGH 융합 단백질들은 효과적으로 STAT-5를 인산화시키는 것으로 나타났다(도 17). 이러한 결과는 hGH-Syn119-140와 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 활성적인 측면에서 야생형 hGH와 마찬가지로 생물학적 기능을 완전히 유지하고 있음을 보여 주는 것이다.

실시예 19: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 의 교반에 의한 단백질 응집 실험

실시예 15에서 얻은 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140을 교반시키면서 시간에 따른 응집을 관찰하였다.

PBS 완충액 pH 7.4상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다(도 18). 또한 반응 시료들은 매 24시간 마다 표본추출, 원심분리를 통하여 불용성 응집체를 제거한 후 상등액을 컬럼에 가하고 PBS 완충용액을 15분간 흘려주면서 HPLC 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 단백질 응집 정도를 분석하였다. 280 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였다(도 20).

교반은 치료용 단백질을 생산, 운반 및 다루는 데 있어 용액과 공기 사이에서 일어나는 스트레스중의 하나로 도 18에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질은 심지어 교반 90시간 후에도 특이할 만한 응집체를 형성하지 않는 반면 야생형의 hGH는 교반 수 시간 안에 빠르게 응집체를 형성한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 각각의 단백질 농도를 증가시켜 실행한 실험에서도 동일한 측정결과를 얻을 수 있었다(자료생략).

교반으로 유도된 hGH의 응집체는 육안으로도 식별이 가능하나 hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질의 용액은 교반 후에도 맑은 상태로 남아 있었다(도 19).

이러한 결과들로 hGH에 융합시킨 Syn119-140펩타이드는 교반으로 일어나는 응집반응으로부터 hGH를 효과적으로 보호할 수 있다는 것을 명확히 알 수 있다.

실시예 20: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 동결/해동에 의한 단백질 응집 실험

동결/해동의 반복 스트레스에 대한 hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 안정성을 비교하였다.

hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140 단백질 시료는 PBS 완충액 pH 7.4 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였으며 15주기 후 원심분리를 통하여 불용성 응집체를 제거한 후 상등액을 컬럼에 가하고 PBS 완충용액을 15분간 흘려주면서 HPLC 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 단백질 응집 정도를 분석하였다. 280 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였다.

야생형 hGH는 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였으며(도 21), 스트레스를 가한 시료를 HPLC 겔 여과 크로마토그래피로 분석한 결과, 야생형의 hGH는 동결/해동의 반복회수 5회부터 상당량의 단백질들이 침전이 되었으며 반복회수 15회에서는 거의 모든 단백질들이 침전이 되었다(도 22, 상). 이와는 달리, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질은 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 대해 강력한 내성을 지닌 것으로 확인 되었다(도 21). 또한, 야생형의 hGH와 동일하게 스트레스를 가한 융합 단백질의 샘플을 HPLC 겔 여과 크로마토그래피로 분석한 결과, ATS융합 단백질들은 동결/해동의 환경적 스트레스에 매우 강한 내성을 나타내었다(도 22의 중 및 하). 즉, 도 22에서 보듯이 대부분의 동결/해동의 반복회수가 증가함에 따라 약간의 소량체(oligomer)가 증가할지라도 대부분의 ATS융합 단백질들은 단량체(monomer) 형태로 남아 있음을 확인하였다. 특히 Syn119-140-hGH가 hGH-Syn119-140보다 동결/해동에 대한 스트레스에서는 더욱더 안정적인 것으로 나타났다.

실시예 21: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 pH에 의해 유도된 단백질 응집

pH에 의해 유도된 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140의 응집은 pH에 따라 혼탁도를 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정함으로써 조사하였다. 상기 단백질을 각기 다른 pH값을 갖는 완충용액으로 최종 농도가 0.2 mg/ml가 되도록 희석하였다. 완충용액으로는 0.1M 시트레이트(citrate), 쑥시네이트(succinate), 트리스(Tris), 헤피스(HEPES), 아세테이트(acetate), 및 글리신(glycine)을 혼합한 완충액으로 pH 3 내지 pH 12가 되도록 조정하였다. 상기 완충용액으로 희석한 단백질 용액을 25℃에서 1시간 동안 반응시키고 겉보기 흡광도를 벡크만(Beckman) 흡광 분광계로 측정하였다.

단백질 응집반응에 대한 완충용액의 염(salt)의 영향을 최소화하기 위해 혼합 완충용액을 전 pH 범위에 사용하였다. 도 23에서 보듯이 전 pH범위에서 어떠한 hGH의 응집체도 확인할 수 없었다. 이러한 결과들은 hGH는 낮은 염농도의 산성 또는 알카리 조건하에서는 응집체를 형성하지 않는다는 선행보고와 일치하는 결과를 보여준다.

실시예 22: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 저장 안정성

hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140에 대한 보관안정성에 대한 실험을 실시하였는데 이는 일반 보관 온도보다 증가된 온도에서 단백질을 보관하면서 SDS-PAGE 실시와 혼탁도를 측정함으로써 비교하였다.

hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140 단백질 시료는 PBS 완충액 pH 7.4 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하고, 상기 단백질 시료의 저장 안정성은 25℃, 37℃ 및 60℃에서 반응시키며 관찰하였다. 각 단백질의 응집 정도는 시간별로 405 nm의 흡광도를 측정하였으며(도 24 및 26), 최종단계 후 SDS-PAGE로 이를 확인하였다(도 25 및 27).

도 24에서 보듯이, 25℃과 37℃에서는 어떠한 단백질의 응집현상도 관찰할 수 없었다. 그러나 25℃과 37℃에서 30일 동안 보관한 후 관찰한 결과 대부분의 hGH는 단백질 분해가 일어난 반면, 대부분의 hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 본래의 상태를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 25). 60℃에서의 실험에서는 야생형의 hGH는 빠르게 응집체를 형성하여 3일 안에 대부분의 단백질들이 응집체를 형성하였다(도 26). 이와는 반대로, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 이 기간 동안 수용성의 상태를 유지하고 있었다. SDS-PAGE 실험 결과, 대부분의 hGH는 60℃에서 3일간 저장시 상당부분 단백질 분해가 일어났으나 ATS 융합 단백질의 경우에서는 대부분이 본래의 크기를 유지하고 있음을 확인하였다(도 27).

이러한 결과들로 유추컨대, ATS 펩타이드는 용액상태에서 융합 단백질의 저장 안정성을 증가시킬 수 있다.

실시예 23: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 열에 의해 유도된 단백질 응집

열에 의해 유도된 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140의 응집을 분석하기 위하여 각 시료를 열처리한 후 SDS-PAGE 겔로 정성분석하였다.

PBS완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉하였다. 열처리한 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 15% SDS-PAGE 겔로 분석하였다. 도 28에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 100℃에서 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않는 반면, hGH는 완전히 응집이 일어났다.

또한 80℃에서 시간 변화에 따라 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140의 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 즉, 단백질들의 최종 농도가 0.5 mg/ml이 되도록 PBS 완충액에 희석한 후 자동 온도 조절이 가능한 흡광분광계 큐벳에 넣고 80℃에서 시간변화에 따른 겉보기 흡광도를 벡크만 흡광분광계로 측정하였다. 도 29에서 보듯이, hGH는 실험 2-3분만에 거의 대부분이 응집체를 형성한 반면 hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들은 열처리 후 심지어 10분 후에도 응집체를 형성하지 않았다.

PBS 완충용액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 25℃, 65℃, 70℃, 75℃ 및 80℃에서 각각 10분간 열처리한 후, 원심분리로 불용성 응집물을 제거한 후 HPLC 겔 여과 크로마토그래프로 분석하였다(도 30). 원심분리한 상등액 시료를 컬럼에 가하고 PBS 완충액을 15분간 흘려주며 280 nm에서 흡광도를 측정하여 크로마토그래프를 얻었다. HPLC 겔 여과 크로마토그래피 분석결과, 열처리한 hGH 샘플은 상기 온도에서 응집체를 형성하고 활성을 지닌 단량체(monomer)의 형태를 완전히 잃어 버렸다(도 30, 상). 그러나, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질은 온도가 증가함에 따라 단량체의 양이 감소하고 소량체(oligomer)가 증가는 하였으나 침전은 일어나지 않았다(도 30의 중 및 하).

이러한 결과는 ATS 펩타이드가 hGH의 열에 대한 내성과 열용해성(thermosolubility)을 증가시켜주고 있음을 말해주는 것이다.

실시예 24: hGH, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH의 CD 스펙트로스코피에 의한 단백질의 2차 구조 변화 측정

온도를 증가 시킴에 따라 유발되는 hGH, Syn119-140-hGH 및 hGH-Syn119-140 단백질의 2차 구조를 알아보기 위해 분광 편광계(Spectropolarimeter)를 통한 CD 스펙트럼을 실시 하였다.

CD스펙트럼은 온도 조절 시스템이 장착된 Jasco-J810분광 편광계(Jasco, Japan)를 이용하여 연속모드로 측정하였다. 25℃ 하에서 0.5cm의 밴드넓이를 갖는 190-250nm의 파장범위, 1초 반응시간 및 10nm/min 스캔 속도에서 극-UV CD를 측정하였다. 측정된 스펙트럼을 완충액 신호를 공제하여 교정한 5회 스캔의 평균치로 나타내었다. CD 데이터는 잉여타원율[θ]의 평균값(deg.cm2dmol-1)을 나타낸다. 열변성 실험은 승온속도 1℃/min으로 수행하고 반응시간은 1초로 하였다. 단백질 농도는 0.5mg/ml로 패스길이가 0.1cm인 큐벳을 사용했으며, 온도 스캔 데이터는 25℃부터 95℃까지를 수집하였다. CD스펙트럼은 222nm에서 매 0.5℃마다 측정하였다.

특히 이들 단백질에 대한 열 안정도를 비교하기 위해 각각의 단백질의 열에 의한 풀림(unfolding)을 온도를 변화시키면서 222nm에서 측정하였다(도 31). 이전에 발표한 논문(Filikov, A. V., Hayes, R. J., Luo, P., Stark, D. M., Chan, C., Kundu, A., Dahiyat, B. I. (2002) Protein Sci. 11, 1452-1461)과 동일하게 hGH의 열처리에 의한 풀림은 78℃ 근처에서 시작하여 80℃의 용해온도(Melting temperature, Tm)를 나타내었다. 그러나, hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질의 풀림 온도는 훨씬 더 높은 온도에서 일어났다(도 31, 각각 괘선과 점선으로 표시). 열처리에 의한 hGH-Syn119-140 융합 단백질의 풀림은 83℃ 근처에서 시작하여 87℃의 융해온도(Tm)를 나타내었고 Syn119-140-hGH 융합 단백질의 풀림은 85℃근처에서 시작하여 90℃의 용해온도(Tm)를 나타내었다. 여기서 주어진 Tm 값은 정확한 열역학적 수치는 아니지만 ATS 펩타이드를 hGH에 융합시킴으로써 hGH 융합 단백질의 열에 대한 안정성을 유의적으로 증가시켰다는 것을 말해주는 것이다. 또한 65, 70, 75, 80 및 85℃에서 열처리한 hGH샘플들의 생물학적 활성도 역시 hGH-Syn119-140 및 Syn119-140-hGH 융합 단백질들이 야생형의 hGH보다 훨씬 더 열안정성을 지니고 있음을 말해주고 있다(도 32).

실시예 25: Syn119-140 펩타이드 융합이 hGH의 약물동역학에 미치는 영향

쥐에서 hGH, ATS-Syn119-140 (N-말단에 ATS가 융합된 hGH)와 hGH-Syn119-140 (C-말단에 ATS가 융합된 hGH) 융합 단백질들의 약물동역학을 비교해 보기 위하여, 수컷 Sprague-Dawley쥐(280±10g) 12마리를 무작위로 분리하여 4세트로 구분 하였다. 피하(S.C)에 같은 몰농도의 hGH(96mg/kg), Syn119-140-hGH 또는 hGH-Syn119-140 (110mg/kg)을 1회 주사한 후 혈중 hGH 농도를 측정하였다. 혈액 시료의 채취는 매 1시간 마다 이루어졌으며, 채혈한 시료는 EDTA가 포함된 PBS 완충용액에 1:1로 희석하여 얼음에 보관하였다. 1시간 가량 얼음에 방치한 후 원심분리 하여 혈장을 제거한 후, 혈중 hGH 농도 분석에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 시료의 분석은 상업적으로 판매되는 hGH 검출용 ELISA-kit(Roche)를 사용하였다.

실험 결과 도 33에 나타나 있듯이 주사한 야생형 hGH 단백질들 (ATGen과 Sereno 제품)은 주사후 1시간까지 혈중에 높은 농도를 유지하다가 그 후 급속히 감소하는 경향을 보였다. 반면에 ATS 펩타이드가 융합된 hGH-Syn119-140 융합 단백질들은 주사후 2시간까지 혈중에 높은 농도를 유지하다가 그후 야생형보다 좀더 완만히 감소하는 경향을 보였다. 도 33의 그래프를 바탕으로 측정한 hGH 단백질들의 혈중내 반감기는 연구자들이 합성한 hGH와 Sereno사에서 상품화한 hGH는 공히 2시간 정도인 반면, hGH-Syn119-140 융합 단백질들은 약 4시간 정도로 2배 정도 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ATS가 융합된 hGH가 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서도 야생형 hGH보다 훨씬 안정함을 보여준다. ATS가 융합된 hGH가 혈중내에서도 야생형에 비해 반감기가 긴 이유는 아마도 ATS 펩타이드가 스트레스에 대한 내성을 부여하는 성질 이외에 혈중 프로테아제의 공격을 막아주는 효과를 지녔기 때문에 가능할 것으로 여겨진다.

실시예 26: Syn119-140 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드와 hGH의 융합 단백질 (hGH-ATSw와 hGH-ATSp)의 스트레스에 대한 내성

본 발명자들은 Syn119-140 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드와 hGH의 융합 단백질 (각각 hGH-ATSw와 hGH-ATSp)의 경우에도 스트레스에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다.

hGH-ATSw 와 hGH-ATSp 융합작제물은 기존의 hGH-Syn119-140 융합작제물에 Syn119-140 펩타이드 (a-synuclein의 아미노산 잔기 119-140) 유전자 대신 ATS 펩타이드 전체에 5개의 아미노산이 추가된 펩타이드 유전자 (ATSw;Syn114-140, 27 아미노산 잔기)와 ATS 펩타이드의 단편을 포함하는 펩타이드 유전자 (ATSp;Syn119-135, 17 아미노산 잔기)를 코딩하는 유전자를 각각 서브클로닝하여 작제하였다. 간략하게 설명하자면, ATSw 와 ATSp 를 coding 하는 DNA는 BamHⅠ제한부위를 가진 프라이머와 EcoR1 제한부위를 가진 프라이머 (표 9)를 사용하여 각각 PCR로 증폭하였다. 각각의 증폭된 DNA는 BamHI과 EcoR1 제한효소로 절단한 다음 BamHI과 EcoR1으로 ATS가 절단된 hGH-Syn119-140 융합 작제물에 각각 라이게이션하여 작제하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

Syn119-140 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드와 hGH의 융합 단백질(hGH-ATSw 및 hGH-ATSp)의 발현벡터 제조에 사용된 프라이머

	프라이머 이름	프라이머 시퀀스	서열번호
hGH-ATSw	ATSw-BamHⅠ	5'- GCA ACT GGA TCC GAA GAT ATG CCT GTG	50
	ATSw-EcoRⅠ	5'- ACT GCC GAA TTC TTA GGC TTC AGG TTC	51
hGH-ATSp	ATSp-BamHⅠ	5'- GCA ACT GGA TCC GAT CCT GAC AAT GAG	52
	ATSp-EcoRⅠ	5'- ACT GCC GAA TTC TTA GTC TTG ATA CCC	53

서열번호 94의 hGH-ATSw과 서열번호 95의 hGH-ATSp 융합 단백질들은 모두 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 비슷한 발현 수준을 보이며 과발현되었다. 발현된 봉입체는 Kim 등에 의한 방법 (Kim, J., Chwae, Y. J., Kim, M. Y., Choi, I. H., Park, J. H., Kim, S. J. (1997) J. Immunol. 159, 3875-3882)을 조금 변형시켜 분리하였으며 재접힘 반응은 Patra등에 의한 알카리 방법(Patra, A. K., Mukhopadhyay, R., Mukhija, R., Krishnan, A., Garg, L. C., Panda, A. K. (2000) Prot. Exp. Purif. 18, 182-192)을 조금 변형시켜 실시하였고 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용해 순수하게 정제하였다. 정제된 단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과 hGH-ATSw와 hGH-ATSp 융합 단백질들은 23-24kDa의 크기를 나타내었다 (도 34A). 또한 MALDI-TOF로 측정한 ATS 융합 단백질들의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다 (데이타 생략).

실험에 사용된 각각의 ATS 펩타이드들의 아미노산 서열은 표 10과 같다.

Syn119-140, ATSw와 ATSp의 아미노산 서열

	아미노산 서열	특 징	서열번호
Syn119-140	DPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA	Syn119-140	7
ATSw	EDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA	Syn119-140에 5개 아미노산 추가된 펩타이드	9
ATSp	DPDNEAYEMPSEEGYQD	Syn119-140에 5개 아미노산 결실된 펩타이드	10

상기 Syn119-140 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드와 hGH의 융합 단백질 (hGH-ATSw와 hGH-ATSp)들의 스트레스에 대한 내성을 비교분석하기 위하여 우선 열에 의해 유도되는 응집 양상을 비교하였다. PBS 완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 100℃ 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉한 후 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 도 34B에서 보듯이, hGH-Syn119-140 융합 단백질들은 모두 100℃에서 10분간 가열하여도 거의 응집이 일어나지 않는 반면, hGH는 완전히 응집되었다. hGH-Syn119-140, hGH-ATSw에 비해 hGH-ATSp의 경우 열에 대한 내성이 다소 떨어지는 것으로 나타났으나 야생형 hGH에 비하여는 월등히 높았다 (도 34B).

다음으로 hGH-ATSw과 hGH-ATSp 융합 단백질들이 야생형 hGH 및 hGH-Syn119-140 융합 단백질에 비해 교반에 의해 유도되는 응집양상에 어떠한 차이가 있는지를 비교하였다. PBS 완충액 (pH 7.4)상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 단백질 용액 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다. 도 34C에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 상기 hGH-ATSw과 hGH-ATSp 융합 단백질들은 모두 교반 50시간 후에도 특이할 만한 응집체를 형성하지 않는 반면 야생형의 hGH는 교반 수 시간 안에 빠르게 응집체를 형성하였다.

마지막으로 동결/해동의 반복 스트레스에 대한 hGH, hGH-Syn119-140 및 상기 hGH-ATSw과 hGH-ATSp 융합 단백질들의 안정도를 비교하였다. 각각의 단백질 시료는 PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 야생형 hGH는 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였다(도 34D). 이와는 달리, hGH-Syn119-140 및 상기 hGH-ATSw과 hGH-ATSp 융합 단백질들은 모두 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 대해 강력한 내성을 지닌 것으로 확인 되었다(도 34D).

이상의 결과들은 ATS 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 2종의 대표적 펩타이드들 (ATSw, ATSp)도 모두 야생형 ATS 펩타이드와 거의 동일하게 융합 단백질에 스트레스에 대한 내성을 부여하여 융합 단백질의 안정도를 증가시키는 능력이 있음을 입증하는 결과이다. 본 결과로 미루어 볼 때, ATS 펩타이드의 전체 혹은 단편을 포함하는 임의의 다른 합성펩타이드도 유사한 성질이 있을 것으로 예상된다.

실시예 27: 점돌연변이된 Syn119-140 펩타이드 융합이 hGH 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성에 미치는 영향

hGH-Syn119-140의 점돌연변이(point mutants) 발현벡터는 hGH-Syn119-140 융합작제물에 특정부위돌연변이(site-directed mutagenesis)방법을 이용하여 작제하였다. 간략하게 설명하면, 돌연변이를 원하는 특정부위에 한개 혹은 두개의 염기를 치환시킨 프라이머와 그와 상보적인 서열을 갖는 프라이머 (표 11)를 사용하여 PCR로 hGH-Syn119-140 융합작제물 전체를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 DpnⅠ제한효소로 절단한 다음, E.coli XL10 gold 균주에 형질전환하여 발현벡터를 제작하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 돌연변이 서열을 확인하였다.

hGH-Syn119-140의 점 돌연변이(point mutation) 발현벡터의 제작에 사용된 프라이머 시퀀스

mutants		sequence	서열번호
E123A	S	5'-CCT GAC AAT GCG GCT TAT GAA ATG	54
	AS	5'-CAT TTC ATA AGC CGC ATT GTC AGG	55
Y133A	S	5'-GAG GAA GGG GCT CAA GAC TAC	56
	AS	5'-GTA GTC TTG AGC CCC TTC CTC	57
A124E	S	5'-GAC AAT GAG GAA TAT GAA ATG	58
	AS	5'-CAT TTC ATA TTC CTC ATT GTC	59
N122V	S	5'-GAT CCT GAC GTG GAG GCT TAT G	60
	AS	5'-C ATA AGC CTC CAC GTC AGG ATC	61
M127S	S	5'-GCT TAT GAA AGC CCT TCT GAG	62
	AS	5'-CTC AGA AGG GCT TTC ATA AGC	63
A140S	S	5'-GAA CCT GAA AGC GGA TCC TTC C	64
	AS	5'-G GAA GGA TCC GCT TTC AGG TTC	65

A124E를 포함한 6종류 (표 11)의 Syn119-140 부위 점돌연변이체와 hGH 융합 단백질은 모두 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 비슷한 발현 수준을 보이며 과발현 되었다. 발현된 봉입체는 Kim 등에 의한 방법 (Kim, J., Chwae, Y. J., Kim, M. Y., Choi, I. H., Park, J. H., Kim, S. J. (1997) J. Immunol. 159, 3875-3882)을 조금 변형시켜 분리 하였으며 재접힘 반응은 Patra등에 의한 알카리 방법( Patra, A. K., Mukhopadhyay, R., Mukhija, R., Krishnan, A., Garg, L. C., Panda, A. K. (2000) Prot. Exp. Purif. 18, 182-192)을 조금 변형시켜 실시하였고 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 순수하게 정제하였다. 정제된 단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과 Syn119-140 점 돌연변이 융합 단백질들은 모두 24kDa의 크기를 나타내었다 (도 35A). MALDI-TOF로 측정한 6종류의 점 돌연변이 단백질의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다 (데이타 생략).

실험에 사용한 6종의 hGH-ATS 점돌연변이체의 ATS 부위 아미노산 서열은 표 12와 같다. ATS 펩타이드 내에 음전하를 띤 아미노산 잔기 (negatively charged residues)의 증감이 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성에 미치는 영향을 조사하기 위해 E132A와 A124E 점돌연변이체를 제작하였고, ATS 펩타이드 내에 소수성 잔기(hydrophobic residues)의 증감이 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성에 미치는 영향을 조사하기 위해 Y133A와 N122V 점돌연변이체를 제작하였으며, 시누클레인 족에서 보존되어있지 않은 잔기의 변화가 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성에 미치는 영향을 조사하기 위해 M127S와 A140S 점돌연변이체를 제작하였다.

hGH-Syn119-140 점돌연변이체의 Syn119-140 부위 아미노산 서열

mutants	서열		서열번호
Syn119-140	DPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA	a-synuclein의 아미노산 잔기 119-140	7
E123A	DPDNAAYEMPSEEGYQDYEPEA	- charge 하나 감소	11
Y133A	DPDNEAYEMPSEEGAQDYEPEA	hydrophobic residue 하나 감소	12
A124E	DPDNEEYEMPSEEGYQDYEPEA	- charge 하나 증가	13
N122V	DPDVEAYEMPSEEGYQDYEPEA	hydrophobic residue 하나 증가	14
M127S	DPDNEAYESPSEEGYQDYEPEA	synuclein족의 보존되지 않은 1개 잔기 치환	15
A140S	DPDNEAYEMPSEEGYQDYEPES	synuclein족의 보존되지 않은 1개 잔기치환	16

상기 서열번호 96의 hGH-Syn(E123A), 서열번호 97의 hGH-Syn(Y133A), 서열번호 98의 hGH-Syn(A124E), 서열번호 99의 hGH-Syn(N122V), 서열번호 100의 hGH-Syn(M127S), 서열번호 101의 hGH-Syn(A140S) 융합 단백질들의 스트레스에 대한 내성을 야생형 hGH 및 hGH-Syn119-140 단백질과 비교분석하기 위하여 우선 열에 의해 유도되는 응집양상을 비교하였다. PBS 완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉한 후 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 도 35B에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 상기 6종의 점돌연변이 hGH-Syn119-140 융합 단백질들은 모두 100℃에서 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않는 반면, hGH는 완전히 응집이 일어났다.

다음으로 상기 점돌연변이 hGH-Syn119-140 융합 단백질들의 교반에 의해 유도되는 응집양상을 비교하였다. PBS 완충액 (pH 7.4)상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 단백질용액 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다. 도 35C에서 보듯이, hGH-Syn119-140 및 상기 6종의 점돌연변이 hGH-Syn119-140 융합 단백질은 모두 심지어 교반 40시간 후에도 특이할 만한 응집체를 형성하지 않는 반면 야생형의 hGH는 교반 수 시간 안에 빠르게 응집체를 형성하였다.

마지막으로 동결/해동의 반복 스트레스에 대한 hGH, hGH-Syn119-140 및 상기 점돌연변이된 융합 단백질들의 안정성을 비교하였다. 각각의 단백질 시료는 PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 야생형 hGH는 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였다(도 35D). 이와는 달리, hGH-Syn119-140 및 상기 6종의 점돌연변이된 융합 단백질은 모두 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 대해 강력한 내성을 지닌 것으로 확인 되었다(도 35D).

이상의 결과들은 Syn119-140 펩타이드의 점돌연변이체들은 모두 야생형 Syn119-140 펩타이드와 거의 동일하게 융합 단백질에 스트레스에 대한 내성을 부여하는 능력이 있음을 입증하는 결과이다.

실시예 28: β-시누클레인 또는 γ-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역을 포함하는 hGH-시누클레인 융합 단백질 (hGH-Synβ113-134와 hGH-Synγ106-127)의 스트레스에 대한 내성

인간에서 발견되는 β-시누클레인 및 γ-시누클레인도 α-synuclein과 더불어 시누클레인 가족을 이루는 단백질 구성원이다 [Lavedan C., Genome Research, 8, 871-880 (1998); L?cking C. B and Brice A. Cell Mol Life Sci, 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochem. Biophys. Acta, 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol. 9, 707-720 (1999)]. 본 발명자들은 β-시누클레인의 단편 및 γ-시누클레인의 단편을 포함하는 hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 융합 단백질의 경우에도 스트레스에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다.

hGH-Synβ113-134와 hGH-Synγ106-127 융합작제물은 hGH-Syn119-140 융합작제물에 Syn119-140 (a-synuclein의 아미노산 잔기 119-140)를 코딩하는 유전자 대신 Synβ113-134(β-synuclein의 아미노산 잔기 113-134)와 Synγ106-127(γ-synuclein의 아미노산 잔기 106-127)을 코딩하는 유전자를 각각 서브클로닝하여 작제하였다. 간략하게 설명하자면, Synβ113-134와 Synγ106-127를 코딩하는 DNA는 BamHⅠ제한부위를 가진 프라이머 (표13)와 EcoR1 제한부위를 가진 프라이머 (표13)를 사용하여 각각 PCR로 증폭하였다. 각각의 증폭된 DNA는 BamHⅠ와 EcoR1 제한효소로 절단한 다음 BamHⅠ와 EcoR1으로 Syn119-140가 절단된 hGH-Syn119-140 융합작제물에 각각 라이게이션하여 작제하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127의 발현벡터 제조에 사용된 프라이머

	프라이머	프라이머 시퀸스	서열번호
hGH-Synβ113-134	ATSB-BamH1-F	5'-GGA CTT CC GGA TCC GAG CCA GAA GGG GAG AGT	66
	ATSB-EcoR1-R	5'-AAG CTT GAA TTC TCA CGC CTC TGG CTC ATA CTC	67
hGH-Synγ106-127	ATSG-BamH1-F	5'-GGA ATT CC GGA TCC CAA CAG GAG GGT GTG GCA	68
	ATSG-EcoR1-R	5'-AAG CTT GAA TTC TCA GTC TCC CCC ACT CTG GGC	69

서열번호 102의 hGH-Synβ113-134와 서열번호 103의 hGH-Synγ106-127 단백질들은 모두 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 비슷한 발현 수준을 보이며 과발현 되었다. 발현된 봉입체는 Kim 등 에 의한 방법 (Kim, J., Chwae, Y. J., Kim, M. Y., Choi, I. H., Park, J. H., Kim, S. J. (1997) J. Immunol. 159, 3875-3882)을 조금 변형시켜 분리 하였으며 재접힘 반응은 Patra 등에 의한 알카리 방법(Patra, A. K., Mukhopadhyay, R., Mukhija, R., Krishnan, A., Garg, L. C., Panda, A. K. (2000) Prot. Exp. Purif. 18, 182-192)을 조금 변형시켜 실시하였고 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 순수하게 정제하였다. 정제된 단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과 hGH-Synβ113-134와 hGH-Synγ106-127 융합 단백질들은 모두 24kDa의 크기를 나타내었다 (도 36A). 또한 MALDI-TOF로 측정한 ATS 융합 단백질들의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다 (데이타 생략).

실험에 사용된 각각의 ATS 펩타이드들의 아미노산 서열은 표 14와 같다. Synα119-140과 Synβ113-134의 아미노산 서열 동일성 (sequence identity)은 약 59%이며, 아미노산 서열 유사성 (sequence similarity)은 약 81%이다. Synα119-140과 Synγ106-127의 아미노산 서열 동일성 (sequence identity)은 약 14%이며, 아미노산 서열 유사성 (sequence similarity)은 약 36%이다.

Synα119-140, Synβ113-134 및 Synγ106-127의 ATS 부위 아미노산 서열

mutants	서열		서열번호
Syn119-140	DPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA	α-synuclein 아미노산 잔기 119-140	7
Synβ113-134	EPEGESYEDPPQEEYQEYEPEA	β-synuclein 아미노산 잔기 113-134	17
Synγ106-127	QQEGVASKEKEEVAEEAQSGGD	γ-synuclein 아미노산 잔기 106-127	18

상기 hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 융합 단백질들의 스트레스에 대한 내성을 비교분석하기 위하여 우선 열에 의해 유도되는 응집양상을 비교하였다. PBS 완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉한 후 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 도 36B에서 보듯이, hGH-ATS 융합 단백질들은 모두 100℃에서 10분간 가열하여도 거의 응집이 일어나지 않는 반면, hGH는 완전히 응집이 일어났다. hGH-Syn119-140, Synβ113-134 에 비해 hGH-Synγ106-127의 경우 열에 대한 내성이 다소 떨어지는 것으로 나타났으나 야생형 hGH에 비하여는 월등히 높았다.

다음으로 상기 Synβ113-134 및 Synγ106-127 융합 단백질들이 교반에 의해 유도되는 응집양상에 어떠한 차이가 있는지를 비교하였다. PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다. 도 36C에서 보듯이, hGH-ATS 융합 단백질들은 모두 교반 50시간 후에도 특이할 만한 응집체를 형성하지 않는 반면 야생형의 hGH는 교반 수 시간 안에 빠르게 응집체를 형성하였다.

마지막으로 동결/해동의 반복 스트레스에 대한 hGH, hGH-Synα119-140, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 융합 단백질들의 안정성을 비교하였다. 각각의 단백질 시료는 PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 야생형 hGH는 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였다(도 36D). 이와는 달리, hGH-Synα119-140, hGH-Synβ113-134 및 hGH-Synγ106-127 융합 단백질들은 모두 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 대해 강력한 내성을 지닌 것으로 확인 되었다(도 36D).

이상의 결과들은 ATSβ, ATSγ의 단편 펩타이드인 Synβ113-134 및 Synγ106-127은 모두 Synα119-140 펩타이드와 거의 동일하게 융합 단백질에 스트레스에 대한 내성을 부여하는 능력이 있음을 입증하는 결과이다. 본 결과로 미루어 볼 때, 다른 동물 시누클레인 단백으로부터 유래된 ATS 펩타이드들 (ATSα, ATSβ, ATSγ 모두)도 동일한 성질이 있을 것으로 여겨진다. 또한 ATSα, ATSβ, ATSγ 사이의 아미노산 서열 동일성이 14-59%, 유사성이 36-81% 로 비교적 낮음에도 불구하고 융합 단백질을 스트레스로부터 보호하여 안정화 시키는 성질이 동일하게 유지된 것으로 보아 ATS와 아미노산 서열이 유의한 임의의 다른 합성 펩타이드도 유사한 성질이 있을 것으로 예상된다.

실시예 29: Syn119-140 펩타이드 융합에 의한 GCSF의 안정화

ATS 펩타이드를 hGH 이외의 치료용 단백질에 융합시켰을 때도 융합 단백질이 환경 스트레스에 내성을 보여 안정화되는지를 알아보기 위해 본 발명자들은 우선 GCSF의 C-말단 영역에 Syn119-140를 포함하는 서열번호 104의 GCSF-Syn119-140 융합 단백질을 작제하였다.

우선 사람의 GCSF 유전자를 혈구세포로부터 RT-PCR 방법으로 클로닝하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 건강한 성인의 혈액 100ml을 채취하여 RPMI-1640 배지와 1:1로 희석한 후, Ficoll-hypaque에 조심스럽게 올려놓은 후 층을 유도하였다. 2,000g로 25분간 농도구배 원심분리를 통하여 PBMCs 층을 얻어 분리하였다. 전체 RNA는 1× 10⁷의 PBMC에서 guanidine isothiocynate-phenol-chloroform 추출법을 이용하여 분리하였으며, cDNA는 RNA PCR Kit (AMV) ver2.1(TaKaRa Bio Inc., Japan)에 전체 RNA 1-5ug을 첨가한 후 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 확보하였다.

GCSF 발현벡터는 GCSF를 코딩하는 유전자를 포함하는 cDNA 10ul와 제한효소 NdeⅠ 인식부위가 포함된 5‘ 프라이머와 HindⅢ 인식부위가 포함된 3’프라이머 (표 15)를 혼합한 후 PCR을 통해 증폭한 후, 반응물은 제한효소 NdeⅠ과 HindⅢ로 절단하여 pRSETA (Invitrogen)에 삽입하여, 발현벡터를 작제하였다.

GCSF-Syn119-140 융합작제물은 pRSET 발현벡터에 hGCSF와 Syn119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다. 간략하게 설명하면, Syn119-140를 코딩하는 DNA를 화학적으로 합성하여 C- 말단 융합을 위해 Syn119-140유전자를 BamHⅠ과 HindⅢ 제한부위를 이용해 pRSETA 벡터에 삽입하였고(pATS-C), GCSF의 단백질 코딩 영역을 NdeⅠ과 BamHⅠ제한부위를 이용하여 pATS-C 벡터에 서브클로닝하여 작제하였다. 화학적으로 합성된 프라이머의 DNA 시퀀스는 표 11과 같다

GCSF 와 GCSF-Syn119-140 발현벡터 제작에 사용된 DNA 프라이머 시퀀스

		sequence	서열번호
GCSF	GCSF-Nde1	5'-ACA GTC TCA CAT ATG ACC CCC CTA GGA CCT	70
	GCSF-HindⅢ	5'-GTT TCA AAG CTT TCA GGG CTG GGC AAG	71
GCSF-Syn119-140	GCSF-BamH1-R	5'-GTT TCA GGA TCC GGG CTG GGC AAG GTG	72

상기 GCSF와 GCSF-Syn119-140 발현벡터로 대장균을 형질변환시켜 각각의 단백질을 얻었다. 야생형 GCSF 단백질들은 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 과발현된 반면 GCSF-Syn119-140 는 수용체 형태로 과발현 되었다. 우선, 야생형의 GCSF 봉입체는 Lu등에 의한 방법(Lu HS, Clogston CL, Narhi LO, Merewether LA, Pearl WR, Boone TC.(1992), JBC. 267, 8770-8777)에 의해 분리하였으며 재접힘 반응은 Souza에 의한 구리 산화법(Souza, LM. (1989), U.S. Patent 4,810,643)을 실시하였고, 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 순수하게 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과 높은 순도의 18.8kDa 크기를 나타내었다 (도 37A). 수용성으로 발현되는 ATS융합 GCSF는 균체 파쇄후 30% Ammonium sulfate로 침전시킨 후 원심분리하여 회수하였다. 침전된 GCSF-ATS는 구리 산화법(Souza, LM. (1989), U.S. Patent 4,810,643)을 조금 변형시켜 재접힘 반응을 실시하였고, 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 균일하게 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과 21.5kDa 크기를 나타내었다 (도 37A). MALDI-TOF로 측정한 야생형 GCSF와 ATS 융합 단백질들의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다 (데이타 생략).

상기 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성을 비교분석하기 위하여 우선 열에 의해 유도되는 응집양상을 비교하였다. PBS 완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉한 후 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 도 37B에서 보듯이, GCSF-Syn119-140 융합 단백질은 40℃에서 60℃까지 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않는 반면, GCSF는 40℃에서 응집이 일어나기 시작해 45℃에서 완전히 응집되었다. 또한 GCSF-Syn119-140 융합 단백질은 100℃에서 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않았다 (데이타 생략).

다음으로 야생형 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질이 교반에 의해 유도되는 응집양상에 어떠한 차이가 있는지를 비교하였다. PBS 완충액 (pH 7.4)상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다. 도 37C에서 보듯이, GCSF-Syn119-140 융합 단백질은 교반 50시간 후에도 특이할 만한 응집체를 형성하지 않는 반면 야생형의 GCSF는 교반 수 시간 안에 빠르게 응집체를 형성하였다.

마지막으로 동결/해동의 반복 스트레스에 대한 GCSF와 GCSF-Syn119-140 융합 단백질의 안정성을 비교하였다. 각각의 단백질 시료는 PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 야생형 GCSF는 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였다(도 37D). 이와는 달리, GCSF-Syn119-140 융합 단백질은 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 의해 전혀 응집되지 않았다 (도 37D).

이러한 결과는 ATS 펩타이드가 hGH 뿐만 아니라 GCSF의 안정화를 위해서도 매우 유용하게 사용되어질 수 있음을 보여준다.

실시예 30: Syn119-140 펩타이드 융합에 의한 인간 Leptin의 안정화

ATS 펩타이드를 hGH와 GCSF 이외의 치료용 단백질에 융합시켰을 때도 융합 단백질이 환경 스트레스에 내성을 보여 안정화되는지를 보다 확실히 증명해보이기 위해 본 발명자들은 다음으로 hLeptin의 C-말단 영역에 Syn119-140을 포함하는 서열번호 105의 Leptin-ATS 융합 단백질을 작제하였다.

우선, 지방조직에서 추출한 전체 RNA로부터 역전사 PCR(RT-PCR)를 이용하여 인간의 leptin cDNA를 증폭하였다. hLeptin 발현벡터는 이 cDNA 10ul와 제한효소 NdeⅠ 인식부위가 포함된 5‘ primer와 EcoRⅠ 인식부위가 포함된 3’primer (표 16)를 혼합한 후 PCR을 통해 증폭되었고, 이 반응물은 제한효소 NdeⅠ과 EcoRⅠ로 절단하여 pRSETA (Invitrogen)에 삽입하여, 발현벡터를 작제하였다.

hLeptin-Syn119-140 융합작제물은 pRSET 발현벡터에 hLeptin과 Syn119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다. 간략하게 설명하면, Syn119-140를 코딩하는 DNA를 화학적으로 합성하여 C- 말단 융합을 위해 ATS 유전자를 BamHⅠ과 HindⅢ 제한부위를 이용해 pRSETA 벡터에 삽입하였고(pATS-C), hLeptin의 단백질 코딩 영역을 NdeⅠ과 BamHⅠ제한부위를 이용하여 pATS-C 벡터에 서브클로닝하여 작제하였다. 화학적으로 합성된 hLeptin을 코딩하는 프라이머의 DNA 시퀀스는 표 16와 같다.

hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 발현벡터 제작에 사용된 DNA 프라이머 시퀀스

		sequence	서열번호
hLeptin	hLeptin-Nde1	5'-ACA GTC TCA CAT ATG GTG CCC ATC CAA AAA GT	73
	hLeptin-EcoR1	5'-GTC AAG CTT GAA TTC TCA GCA CCC AGG GC	74
hLeptin- Syn119-140	hLeptin-BamH1-R	5'-ACA GTC GGA TCC GCA CCC AGG GCT GAG	75

hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 단백질들은 모두 대장균에서 불용성 응집체의 형태로 비슷한 발현 수준을 보이며 과발현 되었다. 발현된 봉입체는 Kim 등에 의한 방법 (Kim, J., Chwae, Y. J., Kim, M. Y., Choi, I. H., Park, J. H., Kim, S. J. (1997) J. Immunol. 159, 3875-3882)을 조금 변형시켜 분리 하였으며 재접힘 반응은 Jeong등에 의한 투석방법(Jeong KJ, Lee SY. (1999) Appl Environ Microbiol. 65, 3027-32.)을 조금 변형시켜 실시하였고 재접힘 반응이 끝난 단백질들은 일반적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 순수하게 정제하였다. 정제된 단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과 정제된 hLeptin은 SDS-PAGE상에서 16kDa의 크기를 나타내었으며, 반면에 정제된hLeptin-ATS융합 단백질들은 18kDa의 크기를 나타내었다 나타내었다 (도 38A). MALDI-TOF로 측정한 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 분자량은 각각의 아미노산 서열로부터 유추한 분자량의 크기와 동일함을 확인하였다 (데이타 생략).

상기 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 스트레스에 대한 내성을 비교분석하기 위하여 우선 열에 의해 유도되는 응집양상을 비교하였다. PBS완충액에 현탁된 각 단백질 시료(1 mg/ml)를 10분간 열판에서 열처리하고 실온에서 10분간 방냉한 후 405 nm에서 겉보기 흡광도를 측정하여 열에 의해 유도된 응집정도를 조사하였다. 도 38B에서 보듯이, hLeptin-Syn119-140 융합 단백질은 40℃에서 70℃까지 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않는 반면, 야생형 hLeptin은 50℃에서 응집이 일어나기 시작해 60℃에서 완전히 응집되었다. 또한 hLeptin-ATS 융합 단백질은 100℃에서 10분간 가열하여도 전혀 응집이 일어나지 않았다 (데이타 생략).

다음으로 야생형 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질이 교반에 의해 유도되는 응집양상에 어떠한 차이가 있는지를 비교하였다. PBS 완충액 (pH 7.4)상에서 각 1 mg/ml 단백질을 준비한 후, 단백질의 응집씨드로 작용할 수 있는 덩어리를 제거하기 위해 1ml을 0.2um 주사기 필터를 통과시켜 걸러주었다. 그 후 실온에서 150 rpm 궤도성 교반기(Superteck, 서린과학)로 계속 흔들면서 반응시켰다. 응집의 정도는 매 시간마다 405 nm의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 관찰하였다. 도 38C에서 보듯이, hLeptin-Syn119-140 융합 단백질은 교반 40시간 까지는 특이할 만한 응집체를 형성하지 않고 그 후부터 응집되기 시작하는 반면, 야생형의 hLeptin은 교반 10시간 후부터 빠르게 응집체를 형성하였다.

마지막으로 동결/해동의 반복 스트레스에 대한 hLeptin과 hLeptin-Syn119-140 융합 단백질의 안정성을 비교하였다. 각각의 단백질 시료는 PBS 완충액 (pH 7.4) 상에서 1 mg/ml의 농도로 준비하였다. 동결/해동에 의한 단백질 응집은 액화 질소에서 동결하고, 37℃ 수욕에서 해동하는 주기를 반복함으로써 유도하였다. 응집의 정도는 매 5회 동결/해동 주기마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 실험 결과 야생형 hLeptin은 동결/해동의 반복 회수가 증가함에 따라 빠르게 응집체를 형성하였다 (도 38D). 이와는 달리, hLeptin-Syn119-140 융합 단백질은 이러한 동결/해동의 반복 스트레스에 의해 전혀 응집되지 않았다 (도 38D).

이러한 결과는 ATS 펩타이드가 hGH와 GCSF 뿐만 아니라 hLeptin의 안정화를 위해서도 매우 유용하게 사용되어질 수 있음을 보여준다. 또한 ATS 펩타이드가 다른 치료용 단백질의 안정화를 위해 일반적으로 사용되어질 수 있을 것으로 여겨진다.

실시예 31: ATS 펩타이드 융합이 단백질의 용해도에 미치는 영향

ATS 펩타이드 아미노산 서열의 가장 큰 특징은 Glu나 Asp와 같이 음전하를 띤 아미노산이 많이 있어 pI 값이 매우 낮다는 사실이다. 일반적으로 단백질의 용해도는 각 단백질의 순전하 (net charge)의 제곱에 비례하므로 (Tanford, 1961, in Physical Chemistry of macromolecules), ATS 융합 단백질은 야생형에 비해 단백질의 용해도가 현저하게 증가할 것으로 예상되어진다.

이를 정량적으로 증명하기 위해 다음으로 Syn119-140 펩타이드 유무에 따른 각종 단백질의 용해도 차이를 비교 실험하였다. 95% 이상의 높은 순도의 GST, hGH 그리고 hLeptin 단백질과, 각각의 단백질 C말단 영역에 Syn119-140가 융합된 단백질을 이용하여 용해도 차이를 정량적으로 측정하였다. 동량의 단백질을 9,000 X g로 10분간 센트리콘 농축기(Amicon, Beverly, MA)를 이용하여 원심분리 후, 상등액을 취해 브래드포드(Bradford)법으로 단백질 농도를 정량하였다. 남은 시료를 다시 동일한 조건으로 5~7회 반복하여 더 이상 농축이 되지 않을 때까지 원심분리 한 후 상등액의 단백질 농도를 Bradford법으로 정량하였다.

실험 결과 표 17에 나타나 있듯이, Syn119-140 융합 단백질이 야생형 단백질에 비해 용해도가 훨씬 높게 나타났다. GST의 경우 Syn119-140 펩타이드 융합으로 단백질의 용해도가 20% 이상 증가하였고, hGH의 경우는 Syn119-140 펩타이드 융합으로 단백질의 용해도가 2배 이상 증가하였으며, hLeptin의 경우는 약 5배 이상 증가하였다. 특히 hGH나 hLeptin의 경우는 농축시 높은 농도에서 침전물이 검출되었으나 ATS 융합 단백질의 경우에는 전혀 침전물이 관찰되지 않았다. 일반적으로 용해도가 낮은 단백질의 경우 (hLeptin이나 hGH의 경우)가 용해도가 높은 경우(GST의 경우)에 비해 Syn119-140 펩타이드 융합으로 단백질의 용해도가 많이 증가하는 경향을 보였다.

Syn119-140 펩타이드 유무에 따른 단백질의 용해도 차이

protein	solubility	precipitation
GST	∽200 mg/ml	No
GST-Syn119-140	∽250 mg/ml	No
hGH	∽80 mg/ml	Yes
hGH-Syn119-140	∽150 mg/ml	No
hLeptin	∽20 mg/ml	Yes
hLeptin-Syn119-140	∽100 mg/ml	No

이러한 결과는 ATS 펩타이드가 치료용 단백질의 안정도를 증가시키기 위한 용도 뿐만 아니라 용해도를 증가시키기 위한 목적으로도 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. 치료용 단백질은 보통 주사를 통해 환자에게 투여되므로, 환자의 편의성을 위해 고농도로 농축하여 소량을 주사하도록 제형화할 필요가 있다. ATS 펩타이드 융합을 통한 치료용 단백질 의약품의 용해도 증가는 이러한 필요성에 잘 부합될 수 있을 것이다.

시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATS)영역 유래의 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 또는 변이체를 포함하는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 융합 파트너 단백질의 고유 성질을 유지하면서 각종 환경 스트레스에 대한 내성을 나타내기 때문에 의학, 생명공학, 식품 등의 많은 분야에서 산업적으로 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

1. (i) 서열번호 1의 α-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 96 내지 140 잔기에 해당하는 아미노산 서열 중 5개 이상의 산성 아미노산(Asp 또는 Glu)을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편,

   (ii) 서열번호 2의 β-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 85 내지 134 잔기에 해당하는 아미노산 서열 중 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편,

   (iii) 서열번호 3의 γ-시누클렌인 C-말단 산성꼬리 영역 96 내지 127 잔기에 해당하는 아미노산 서열 중 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편, 또는

   (ⅳ) 서열번호 4의 시노레틴 C-말단 산성꼬리 영역 96 내지 127 잔기에 해당하는 아미노산 서열 중 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편인, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드(단, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 의 펩타이드는 제외).
2. 서열번호 1의 α-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역의 아미노산 서열 중 5개 이상의 산성 아미노산을 포함한 10개 이상의 연속 아미노산 서열을 가지는 단편 중아미노산 제122, 123, 124, 127, 133 및 140번 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산이 원래의 아미노산과 상이한 임의의 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하는 펩타이드.
3. 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드.
4. 제1항에 있어서, 서열번호 17인 β-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역의 단편인 펩타이드.
5. 제1항에 있어서, 서열번호 18인 γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역의 단편인 펩타이드.
6. 제1항에 있어서, 환경 스트레스가 온도, pH, 금속이온, 동결과 해동의 반복, 교반, 또는 고농도 조건인 펩타이드.
7. 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질과 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합 단백질.
8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드가 상기 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질의 고유 성질에 영향을 미치지 않는 아미노산 잔기의 위치에 결합하여 제조되는 융합 단백질.
9. 제7항에 있어서, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질은 환경 스트레스에 불안정한 단백질인 융합 단백질.
10. 제7항에 있어서, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질의 변성이 감소되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
11. 제7항에 있어서, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질의 용해도가 증가되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
12. 제7항에 있어서, 상기한 펩타이드가 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질의 N-말단, C-말단 또는 양 말단에 결합한 융합 단백질.
13. 제7항에 있어서, 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하고자 하는 단백질이 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
14. 제13항에 있어서, 융합 파트너 단백질이 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕테이즈, 성장호르몬, 렙틴, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 결합시킴으로써 환경 스트레스에 대한 단백질의 내성을 증가시키는 방법.
16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열.
17. 제7항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
18. 제16항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
19. 제18항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
20. 제7항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 내성을 가지는 융합 단백질을 제조하는 방법.
21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환 또는 결실시키거나, 상기 펩타이드의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 삽입함으로써, 환경 스트레스에 대한 내성 부여 능력이 유지되는 상기 펩타이드의 변이체를 제조하는 방법.
22. 제17항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
23. 제22항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.

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