CN113443633B - 小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药化学领域，具体涉及小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子及其制备方法。具体技术方案为：一种二氧化硅纳米粒子，所述二氧化硅纳米粒子包括内核和刺突，内核直径为5～100nm，内核表面原位生长数个数量、形状可控的纳米刺突。本发明首次提供了一种可精确控制内核直径、刺突数量、刺突形状的小尺寸仿病毒二氧化硅纳米粒子；并进一步合成为可快速降解的功能化病毒状二氧化硅纳米粒子；并进一步用其制备了转染试剂盒，转染效率高，细胞存活率高。

Description

小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药化学领域，具体涉及小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子及其制备方法。
背景技术
与传统药物相比，基于纳米科技的药物输送、诊疗体系的靶向性、生物利用性等都具有明显优势。在各种复杂的应用中，我们往往希望纳米载体能够像病毒一样，快速粘附穿越生物膜，并大量在病灶位置富集。目前，关于仿病毒纳米粒子的研究比较有限，如果对其进行表面化学修改，可能会导致细胞毒性的增加；如果在这类材料表面构筑粗糙的表面结构，已知的构筑过程都非常复杂，且构筑过程可控性差。因此，在材料表面原位生长出一些纳米结构，形成防病毒结构，成为最具潜力的方式之一。
已有研究虽然能制备一些防病毒结构的二氧化硅纳米粒子材料，但制备的纳米材料尺寸普遍偏大，难以控制在100nm乃至80nm以内，而更小尺寸的材料更容易穿透生物膜/跨越生物屏障。同时，现有的研究中，往往只有原位生长出刺突和不生长刺突两种选择，无法控制刺突的数量、形状，从而限制了纳米材料的应用场景。另外，已知的二氧化硅纳米材料生物降解缓慢，功能单一，也难以满足日益复杂的生物应用场景。
综上，科研和医药应用领域亟需一种小尺寸、表面刺突结构可控、可生物降解的二氧化硅纳米粒子。
发明内容
本发明的目的是提供一种小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种二氧化硅纳米粒子，所述二氧化硅纳米粒子包括内核和刺突，内核直径为5～100nm，内核表面原位生长数个数量、形状可控的纳米刺突。
优选的，所述内核为中空的球体或同心圆球形结构。
优选的，所述纳米刺突数量≥10个。
优选的，所述刺突形状为圆柱状或扁柱状；和/或；所述刺突为长直形或弯曲。
相应的，所述二氧化硅纳米粒子的制备方法，将硅源、催化剂、表面活性剂和水在50～80℃下搅拌，形成微乳液体系，持续搅拌反应，得所述二氧化硅纳米粒子。
优选的，所述硅源包括正硅酸乙酯；和/或；所述催化剂为NaOH或四丙基氢氧化铵；和/或；所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或双子表面活性剂。
优选的，所述硅源为正硅酸乙酯，所述催化剂为NaOH，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，按质量比，十六烷基三甲基溴化铵：NaOH：正硅酸乙酯：环己烷：H2O＝(0.1～2)：0.05：7：(2～23)：100。
优选的，所述硅源包括含四硫键的硅烷。
优选的，反应体系中还包括稀土元素。
相应的，利用所述二氧化硅纳米粒子制备的试剂、试纸、检测卡、试剂盒。
本发明具有以下有益效果：
在此前的文献报道中，需要在非常缓慢的搅拌下，保持环己烷和水两相分层体系的界面，才能形成二氧化硅纳米粒子，且粒子的粒径较大(80～300nm)，粒径可调控性较差，无法调控表面纳米刺突的数量，无法调控纳米粒子的内核尺寸。而本发明联合控制各反应物的用量和搅拌速度(快速搅拌)，形成稳定的微乳体系，从而可精确制备获得内核直径30～80nm乃至5～80nm的仿病毒二氧化硅纳米粒子。另外，发明人发现，改变环己烷的浓度也可以调节二氧化硅纳米粒子的尺寸。随着环己烷浓度从23wt％降至2wt％，纳米粒子的尺寸从80nm减小至60nm。而且，通过快速搅拌、调节CTAB的初始浓度和分梯度加入硅源，本发明还合成了几乎没有内核或内核很小(≤30nm)的病毒状二氧化硅纳米粒子。
同时，发明人发现：在CTAB极低浓度(≤1wt％)的情况下，通过改变CTAB的浓度可以调节二氧化硅纳米粒子表面刺突的数量。随着CTAB浓度从0.1wt％升至1wt％，表面刺突结构的数量从几个增加至80个左右。
为进一步提高可应用性，本发明还在通过引入四硫键硅源或引入稀土元素的方法，合成了可快速降解的功能化病毒状二氧化硅纳米粒子。并进一步用其制备了转染试剂盒，转染效率高，细胞存活率高。
附图说明
图1为纳米柱数量为10～15个的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图2为纳米柱数量为30～35个的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图3为纳米柱数量为50～60个的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图4为内核尺寸为30nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图5为内核尺寸为45nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图6为内核尺寸为65nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图7为内核尺寸为50nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图8为内核尺寸为10nm的二氧化硅纳米粒子投射电镜扫描图；
图9为内核尺寸为10nm的二氧化硅纳米粒子扫描电镜扫描图；
图10为内核尺寸为18nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图11为内核尺寸为30nm的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图12为整体尺寸为30nm的二氧化硅纳米粒子投射电镜扫描图；
图13为整体尺寸为30nm的二氧化硅纳米粒子扫描电镜扫描图；
图14为调控温度获得刺突弯曲的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图15为改变催化剂获得刺突弯曲的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图16为刺突扁柱状的二氧化硅纳米粒子电镜扫描图；
图17为二氧化硅纳米粒子在GSH溶液中0h的投射电镜照片；
图18为二氧化硅纳米粒子在GSH溶液中1h的投射电镜照片；
图19为二氧化硅纳米粒子在GSH溶液中4h的投射电镜照片。
具体实施方式
本发明提供了一种小尺寸内核仿病毒二氧化硅纳米粒子。所述二氧化硅纳米粒子由内核和刺突共同组成，内核粒径为5～100nm，优选为5～80nm。所述内核为多孔的球状结构或同心圆球形结构；所述同心圆球形结构，是指内核整体为球形，球形中间位置有通孔，横截面呈现同心圆形状。内核表面原位生长数个数量可控、形状可控的纳米刺突，刺突长度为6～70nm，刺突横截面宽度为6～10nm，刺突数量可选为15个、35个、60个或其它。所述刺突形状为圆柱状或扁柱状，所述刺突为长直形或弯曲。
更优选的方案为：所述二氧化硅纳米粒子可快速被生物降解。
本发明还提供了所述二氧化硅纳米粒子的制备工艺，具体包括如下步骤：
1、制备CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、NaOH混合水溶液，制备方法为：按质量比，CTAB：NaOH：H2O＝(0.1～2)：0.05：100，将CTAB和NaOH加入水中，加热至60℃，搅拌溶解。
2、按质量比，CTAB：NaOH：TEOS：环己烷：H2O＝(0.1～2)：0.05：7：(2～23)：100，再加入TEOS(正硅酸乙酯)和环己烷。在60℃下，快速搅拌(400～1500rpm)，形成稳定的微乳液体系。继续搅拌反应36～72小时，得到所需二氧化硅纳米粒子。
其中，内核直径大小随CTAB浓度的增加而逐渐增大，随搅拌速度的增大而减小。只使用CTAB时，内核成球形；联合使用CTAB和双子表面活性剂时(双子表面活性剂为：N,N'-双(十四烷基二甲基)-1、2-二溴化-乙二铵盐，双子表面活性剂与CTAB等质量)，内核为同心圆球形。
一种实施方式下，其余条件不变，将反应温度由60℃提高到70～80℃时，刺突由长直形变得弯曲。另一种实施方式为：其余条件不变，将NaOH更换为同摩尔量的四丙基氢氧化铵，刺突由长直形变得弯曲。在某些情况下，与长直形的刺突相比，弯曲的刺突更容易与细胞结合，或更容易穿透生物膜/跨越生物屏障。
一种实施方式下，其余条件不变，搅拌速度设置为600rpm，反应温度由60℃提高到70℃，并将CTAB更换为双子表面活性剂(N,N'-双十四烷基二甲基-1、2-二溴化-乙二铵盐,简写C14-2-14)，则刺突形状由圆柱状变为扁柱状。与圆柱状刺突相比，纳米尺度的扁柱状刺突有时候可以和一些特殊的生物膜表面蛋白进行很好的形状匹配，产生某些特殊的生物学效应，比如更容易靶向、影响表面蛋白机械力因素、病毒抑制等。因此，精确控制表面纳米结构的形状，具有重要的生物医学研究和应用价值。
优选的方案为：引入硅时，同时掺入其它离子，从而获得功能性的二氧化硅纳米粒子。掺入含四硫键的硅烷和/或稀土元素，可帮助二氧化硅纳米粒子获得可生物降解的性能。例如，掺入Gd，可同时赋予二氧化硅纳米粒子生物降解和核磁成像的功能；再例如，掺入Mn/Ce，获得的二氧化硅纳米粒子不仅可生物降解，还可用于制备无机纳米酶。
一种实施方式下，掺入含四硫键的硅烷，可有效提高二氧化硅纳米粒子的生物降解性。具体实施方式为：利用TEOS和双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物硅烷(Bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide，简写为bis-sulfur silane)为混合硅源，替代上述步骤2中的TEOS，并调整各物质用量比例，其余步骤相同，从而制备获得可快速被生物降解的二氧化硅纳米粒子。整个体系中，按质量比，CTAB：NaOH：TEOS：bis-sulfur silane：环己烷：H2O＝(0.1～2)：0.05：6：(0.1～2)：(2～23)：100。bis-sulfur silane的用量越大，降解速率越快。
3、反应结束后，取水相离心，利用去离子水和乙醇各洗离心所得物三次。将清洗后的所得物分散到盐酸-乙醇溶液中(盐酸：乙醇＝1：100，v/v)中。80℃加热回流萃取表面活性剂(CTAB)，反复萃取3次，每次12h。再次离心分离，利用去离子水和乙醇各洗离心物三次，室温下真空干燥后，得到最终产物。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：制备具有不同纳米刺突数量的二氧化硅纳米粒子
在20mL水中，加入CTAB，搅拌速度为500rpm，温度为60℃，搅拌至CTAB充分溶解，然后加入0.01g的NaOH，继续搅拌30分钟，然后加入环己烷与TEOS的混合溶液(4.68g环己烷与1.4gTEOS)，继续在60℃下，搅拌反应48小时，得到仿病毒结构的二氧化硅纳米材料。该具体反应过程中，当CTAB的用量分别为0.15g、0.2g、0.3g时(CTAB浓度分别为0.75wt％、1.0wt％、1.5wt％时)，得到的仿病毒结构二氧化硅纳米粒子表面纳米柱的数量分别为：10～15个(如图1所示)，30～35个(如图2所示)，50～60个(如图3所示)。
实施例二：制备具有不同内核直径的二氧化硅纳米粒子
1、获得小尺寸(30～80nm)的二氧化硅纳米粒子：按质量比，CTAB：NaOH：H2O＝(0.1～2)：0.05：100，60℃下制备CTAB、NaOH混合水溶液。再加入TEOS和环己烷，按质量比，CTAB：NaOH：TEOS：环己烷：H2O＝(0.1～2)：0.05：7：23：100，在60℃下，快速搅拌(400～1500rpm)，形成稳定的微乳液体系。继续搅拌反应48小时，得到仿病毒结构的二氧化硅纳米材料。
通过调节搅拌速度，同时调节CTAB的初始浓度，可以精确调节病毒状二氧化硅纳米粒子的尺寸。控制参数、对应内核尺寸及对应图示如表1所示。
表1 二氧化硅纳米粒子尺寸控制对照表
组别 搅拌速度 CTAB的初始浓度 内核尺寸 对应附图
组1 1200rpm 0.25wt％ 30nm 图4
组2 900rpm 0.5wt％ 45nm 图5
组3 700rpm 1.0wt％ 65nm 图6
组4 1200rpm 1.0wt％ 50nm 图7
我们发现，若只提高搅拌速度，所得纳米粒子的内核会减小，但是很多情况下，这也会影响表面纳米柱的形成，无法得到良好的仿病毒结构。进一步地，我们发现，若提高搅拌速度的同时调节(降低)表面活性剂浓度，则可能可以保证表面纳米柱的生长形成，得到仿病毒结构。比如CTAB的浓度为1.5wt％、搅拌速度为600rpm时，得到内核为65nm的仿病毒二氧化硅纳米粒子；但是，若单纯提高搅拌速度到1000rpm,则无法得到病毒硅球，只能得到普通的表面无纳米柱的硅球。若我们同时提高搅拌速率到1000rpm，且同时降低表面活性剂的浓度为0.25wt％,则可以得到内核为30nm的仿病毒二氧化硅纳米粒子。因此，我们认为，一般情况下，需要同时调控2个参数，才能在调节病毒状二氧化硅纳米粒子内核尺寸时不影响表面纳米柱的形成。
2、获得超小内核尺寸(内核为10～30nm)的二氧化硅纳米粒子：
同时调节搅拌速度和CTAB的浓度，无法得到超小内核尺寸的仿病毒二氧化硅纳米粒子。我们进一步探索发现，同时调节搅拌速度、CTAB的浓度、TEOS的初始浓度(但是要保证总量不变，因此我们用分多次加入的方式，既可以保证初始浓度的变化，又保证TEOS的总加入量不变，具体操作为：将TEOS均等分为2～3份、分批次加入，每添加1次后，间隔12h再加下一次)，分次加入TEOS，可以得到超小内核的仿病毒纳米粒子。本实施例中，按质量比，CTAB：NaOH：TEOS：环己烷：H2O＝0.5：0.05：7：23：100。搅拌速度为800rpm,TEOS均分为若干次加入(例如，组2中，分2次加入，每次加入0.7g)，具体如下表，相邻两次加入TEOS的时间间隔为12小时，温度为60℃。进而，得到了内核为10nm、18nm、30nm的仿病毒二氧化硅纳米粒子。
表2 二氧化硅纳米粒子尺寸控制对照表
组别 硅源添加次数 搅拌速度 CTAB的初始浓度 内核尺寸 对应附图
组1 3 800rpm 0.5wt％ 10nm 图8、9
组2 2 800rpm 0.5wt％ 18nm 图10
组3 1 800rpm 0.5wt％ 30nm 图11
3、获得超小尺寸的仿病毒纳米粒子：在20mL水中，加入0.08g CTAB，搅拌速度为800rpm，温度为60℃，搅拌至CTAB充分溶解，然后加入0.01g的NaOH，继续搅拌30分钟，然后加入环己烷与TEOS的混合溶液(3g环己烷与1.4g TEOS)，继续在70℃下，800rpm搅拌反应48小时，得到整体尺寸约30nm的仿病毒纳米粒子(图12、图13)。
研究发现：同时减少环己烷和CTAB的用量，并提高转速，可获得超小尺寸的仿病毒纳米粒子；而分批次加入TEOS则是获得超小内核尺寸仿病毒纳米粒子的关键。
实施例三：制备具有特殊形状刺突的二氧化硅纳米粒子
1、通过改变反应温度控制刺突形状。
在20mL水中，加入0.4g CTAB，搅拌速度为600rpm，温度为70℃，搅拌至CTAB充分溶解，然后加入0.01g的NaOH，继续搅拌30分钟，然后加入环己烷与TEOS的混合溶液(4.68g环己烷与1.4gTEOS)，继续在70℃下，搅拌反应48小时，得到刺突明显弯曲的仿病毒结构的二氧化硅纳米材料。电镜扫描图如图14所示。
2、通过改变催化剂控制刺突形状。
在20mL水中，加入0.4g CTAB，搅拌速度为600rpm，温度为60℃，搅拌至CTAB充分溶解，然后加入0.056g的四丙基氢氧化铵，继续搅拌30分钟，然后加入环己烷与TEOS的混合溶液(4.68g环己烷与1.4gTEOS)，继续在70℃下，搅拌反应48小时，得到刺突明显弯曲的仿病毒结构的二氧化硅纳米材料。电镜扫描图如图15所示。
3、多条件联合调控刺突形状。
制备双子表面活性剂(N,N'-双(十四烷基二甲基)-1、2-二溴化-乙二铵盐,C14-2-14)、NaOH混合水溶液，制备方法为：按质量比，双子表面活性剂：NaOH：H2O＝1：0.05：100，将双子表面活性剂和NaOH加入水中，加热至70℃，搅拌溶解。按质量比，双子表面活性剂：NaOH：TEOS：环己烷：H2O＝1：0.05：7：23：100，再加入TEOS和环己烷的混合液(4.68g环己烷与1.4gTEOS)。在70℃下，600rpm搅拌，形成稳定的微乳液体系。继续搅拌反应48小时，得到所需二氧化硅纳米粒子。电镜扫描图如图16所示，刺突形状为扁柱状。
实施例四：制备可快速生物降解的二氧化硅纳米粒子
1、20mL水中，加入0.4g CTAB，0.01gNaOH加热至60℃，搅拌溶解。再加入TEOS、bis-sulfur silane、环己烷的混合溶液(4.68g环己烷+1.2gTEOS+0.3g bis-sulfur silane)，整个体系中各种物质的质量比为CTAB：NaOH：TEOS：bis-sulfur silane：环己烷：H2O＝1：0.05：6：1.5：23：100，在60℃温度下，快速搅拌，形成稳定微乳体系。继续搅拌反应48小时，得到可快速降解的仿病毒结构的二氧化硅纳米粒子。
2、将合成的二氧化硅纳米粒子分散到10mM的GSH(还原型谷胱甘肽)溶液中，在37℃下，观察二氧化硅纳米粒子的溶解情况。约1小时仿病毒二氧化硅纳米粒子开始降解，约4小时降解完全。图17、18、19分别为在GSH溶液中0h、1h和4h下的投射电镜照片。
实施例五：利用可快速生物降解的二氧化硅纳米粒子制备试剂盒
1、本实施例所用质粒、siRNA、microRNA mimics及microRNA inhibitors均用GIBICO公司的无血清DMEM培养基或MEM培养基稀释。
使用实施例四制备的二氧化硅纳米粒子制备转染试剂盒。试剂盒具体如表3所示。当然，本领域技术人员也可以按照本领域的公知方法制备试剂盒及类似产品。需要说明的是：表3是针对不同培养板和核酸形式所建议的体系。
表3 各体系展示表
Figure BDA0003135426590000101
2、使用试剂盒对所需细胞(悬浮细胞或贴壁细胞)进行转染。按本领域常规技术进行即可。转染、培养后，测定mRNA、蛋白质水平。细胞接种：转染前一天接种细胞，第二天细胞密度在80％左右。转染混合物准备：使用无血清培养基分别稀释转染试剂(二氧化硅纳米粒子)和核酸(siRNA)，分别孵育5min后，将二者混合，室温孵育持续约20min。转染：将混合物加入培养孔内，轻轻晃动培养板，混匀。37℃置于培养箱培养18～72h，随后检测基因抑制效果。一般情况荧光蛋白于24h可以观察到表达，24～72h检测mRNA水平，36～72h检测蛋白水平。
本实施例测试了8种不同细胞：miapaca-2、MKN-74、NCI-1299、MDA-MB-231、cho、A549、HEK293、RBL-2H3细胞。分别进行转染效率测试和存活率测试。
效率测试：分别于24孔板中生长至细胞融合率达到70％时，分别用本发明实施例四制备的二氧化硅纳米粒子转染试剂盒和Lip2000转染试剂(货号11668019，ThermoFisher)转染GFP(货号VT1110，优宝生物)，每孔细胞转染0.5μg的GFP，以及荧光标记的siRNA阴性对照NC每孔20pmol。转染48h后用荧光显微镜观察绿色荧光并拍照，结果如表4所示(因黑白图限制，未提供荧光图)。所有数据用(均数±标准差)表示，采用SPSS 22.0统计软件处理。多组间比较用单因素方差分析。P＜0.01表示有显著统计学差异。
表4 细胞转染效率对比表
Figure BDA0003135426590000111
本发明提供的试剂盒在测试的几种细胞上均具有很高的转染效率。其中，在A549细胞、NCI-1299细胞和RBL-2H3细胞上均显著高于阳离子脂质体Lip2000转染试剂的转染效率。
存活率测试：在293细胞于24孔板中生长至细胞融合率达到70％时，分别加入用本发明二氧化硅纳米粒子转染试剂盒配制的转染试剂和Lip2000转染试剂共孵育不同时间后，测定细胞存活率。在共孵育6h、12h、24h和48h后，每孔加入10μL CCK8溶液(货号CK04，DOJINDO)，37℃孵育1～4h，酶标仪测量450nm处吸光值，计算细胞存活率，结果如表5所示。
表5 细胞存活率对比表
Figure BDA0003135426590000112
Figure BDA0003135426590000121
共孵育时间不小于6h时，使用本发明提供的试剂盒细胞存活率显著高于Lip2000转染试剂。说明本发明提供的试剂盒生物相容性好、免疫原性低、毒性低，用于基因转染安全性比常用的Lip2000转染试剂好，细胞存活率高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述二氧化硅纳米粒子包括内核和刺突，内核直径为5～80nm，内核表面原位生长数个数量、形状可控的纳米刺突；
所述刺突形状为圆柱状或扁柱状；或；所述刺突为长直形或弯曲；
制备所述二氧化硅纳米粒子的反应体系包括硅源、催化剂、表面活性剂和水，将反应体系各物质在50～80℃下搅拌，形成微乳液体系，持续搅拌反应，得所述二氧化硅纳米粒子；
所述硅源为正硅酸乙酯，所述催化剂为NaOH，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，按质量比，十六烷基三甲基溴化铵：NaOH：正硅酸乙酯：环己烷：H2O=（0.1～2）：0.05：7：（2～23）：100。
2.根据权利要求1所述二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述内核为中空的球体或同心圆球形结构。
3.根据权利要求1所述二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述纳米刺突数量≥10个。
4.根据权利要求1所述二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于：反应体系中还包括稀土元素。
5.利用权利要求1～4任意一项所述制备方法制备的二氧化硅纳米粒子在制备试剂、试纸、检测卡、试剂盒中的应用。
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