CN111548411A

CN111548411A - 一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111548411A
Application number: CN202010362347.6A
Authority: CN
Inventors: 曾木圣; 张林琦; 朱倩莹; 梁清泰; 左亚男
Original assignee: Tsinghua University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Tsinghua University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: CN111548411B

Abstract

本发明首次公开了一种EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、GAS、SEQ ID NO.5所示。该抗体能够阻断EBV感染上皮细胞，IC50为53ng/ml，而对埃博拉病毒感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染上皮细胞的能力。

Description

一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用。

背景技术

EB病毒最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例,美国NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。

目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。

单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的人源单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的人源单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于利用EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)膜蛋白gH/gL(glycoprotein H,glycoprotein L)作为钓饵，筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(single chain variable fragment,scFvs)文库，得到可同gH/gL蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有高中和活性的单克隆抗体。

本发明第二个方面的目的，在于提供编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

本发明第三个方面的目的，在于提供含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明第四个方面的目的，在于提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为GFSFDTYD(SEQ ID NO.1)，CDR2的氨基酸序列为ISYDGSET(SEQ ID NO.2)，CDR3的氨基酸序列为ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQ ID NO.3)；所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为QSISGTY(SEQ ID NO.4)，CDR2’的氨基酸序列为GAS，CDR3’的氨基酸序列为QQYGSSLFT(SEQ ID NO.5)。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

本发明的第二个方面，提供一种编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列如下所示：

CDR1的核苷酸序列为：GGATTTTCCTTCGATACCTATGAC(SEQ ID NO.6)；

CDR2的核苷酸序列为：ATTTCATATGATGGAAGTGAGACA(SEQ ID NO.7)；

CDR3的核苷酸序列为：

GCGAGATGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGCGGAGTTCATGGACGTC(SEQ ID NO.8)；

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列如下所示所示。

CDR1’的核苷酸序列为：CAGAGTATTAGCGGCACCTAC(SEQ ID NO.9)；

CDR2’的核苷酸序列为：GGTGCATCCC；

CDR3’的核苷酸序列为：CAGCAGTATGGTAGCTCACTATTCACT(SEQ ID NO.10)。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明的第三个方面，提供含有本发明第二个方面所述核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明的第四个方面，提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了一种中和EB病毒的抗体，通过酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(single chain variable fragment,scFvs)文库中分离特异性结合抗原的酵母单克隆，然后进行单克隆抗体基因的克隆和结构功能研究以及筛选。既避免了由于抗原免疫、杂交瘤融合和单克隆抗体筛选所需要的漫长过程，也可以大大降低动物来源抗体所引起的副作用。

本发明采用该方法，利用gH/gL筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段文库，获得可以特异性结合抗原的酵母单克隆，获得抗体可变区基因，然后将抗体可变区基因克隆到含有对应恒定区的真核细胞表达载体上并转染293T细胞，即可得到同gH/gL蛋白特异结合的单克隆抗体。然后通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有抗EBV中和活性的单克隆抗体。

本发明提供的该中和EB病毒的抗体能够阻断EBV感染上皮细胞，IC50为53ng/ml，而对埃博拉病毒的感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染上皮细胞的能力。

附图说明

图1实施例3中M3抗体对EBV感染HNE1细胞的中和效果。

图2实施例3中M3抗体对埃博拉假病毒感染Huh7细胞的中和效果。

具体实施方式

(1)EBV gH/gL重组蛋白的制备。

将编码EBV gH/gL蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达和纯化。重组抗原蛋白C端带有6×His-avi tag，使用镍柱进行gH/gL蛋白的亲和纯化。

(2)利用酵母表面展示scFv筛选技术，筛选获得同gH/gL蛋白特异结合的酵母单克隆。

从正常人体内分别扩增出的抗体重链和轻链可变区，中间通过G4S linker将两者连在一起构建到酵母展示载体上，即构建成功酵母表面展示scFv文库(本实验使用的酵母表面展示scFv文库来自Michael J.实验室)。将标记有生物素的gH/gL与酵母表面展示scFv文库共孵育，通过流式分选得到与gH/gL反应的阳性scFv酵母克隆。提取酵母克隆中scFv表达载体,再分别利用重链轻链特异性引物进行巢式PCR，测序得到抗体基因。

(3)单克隆抗体的表达纯化。

将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将带有抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein A beads进行抗体的纯化。

(4)抗体的中和活性检测。

EBV中和抗体的检测采用病毒感染细胞模型进行。将表达纯化的全长抗体按照一定的倍比稀释后同EB病毒共同孵育；将EBV相应的易感细胞铺至上述的共孵育体系中，培养细胞至48-72小时；感染后的细胞，用流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例；利用Prism 5软件计算单克隆抗体的IC50。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实例只用于解释和理解本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1EBV gH/gL重组蛋白的制备

gH/gL蛋白在EBV上皮细胞的过程中发挥重要作用。因此，发明人的研究团队选择gH/gL作为诱饵蛋白来筛酵母表面展示scFv文库，以期获得能阻断EBV感染的中和性抗体。

然后选用EBV-M81毒株的基因组为模板，分别扩增gH和gL的序列，并通过linker将两者连接在一起，以提高纯化蛋白的效率。

未经改造前gH原始序列：

ATGCAGTTGCTCTGTGTTTTTTGCCTGGTGTTGCTATGGGAGGTGGGGGCTGCCAGCCTTAGCGAGGTTAAGCTGCACCTGGACATAGAGGGGCATGCTTCGCATTACACCATCCCATGGACCGAACTGATGGCAAAGGTCCCAGGCCTTAGCCCAGAGGCGCTGTGGAGAGAGGCAAATGTCACCGAAGATTTGGCGTCTATGCTTAACCGCTACAAGTTAATTTACAAGACGTCTGGTACCCTTGGTATTGCGCTGGCCGAGCCTGTCGATATCCCTGCTGTCTCTGAAGGATCCATGCAAGTGGATGCATCTAAGGTCCATCCCGGAGTCATTAGCGGCCTGAATTCCCCTGCCTGCATGCTTAGTGCCCCCCTTGAGAAGCAGCTCTTCTACTATATTGGCACCATGCTGCCCAACACGCGGCCACACAGCTATGTCTTTTATCAGCTGCGCTGTCACTTGTCTTATGTGGCCCTGTCCATCAACGGGGACAAGTTTCAGTACACGGGGGCCATGACTTCTAAATTTCTGATGGGCACCTACAAGCGAGTGACCGAGAAGGGAGATGAGCATGTGTTGAGCCTGATCTTTGGCAAGACGAAGGACCTGCCGGATCTGAGGGGGCCTTTTAGTTACCCATCCTTAACCAGTGCCCAAAGCGGGGACTATTCCCTGGTGATTGTTACAACCTTTGTGCATTATGCCAACTTTCACAACTACTTTGTACCCAACCTGAAGGATATGTTTTCCCGAGCCGTCACCATGACAGCCGCCAGCTACGCTCGCTACGTTCTCCAGAAACTGGTCCTGCTGGAGATGAAGGGAGGCTGCCGGGAGCCAGAACTGGACACGGAAACGCTGACTACCATGTTTGAGGTTTCTGTGGCCTTCTTTAAGGTGGGTCATGCCGTGGGTGAGACTGGCAATGGCTGCGTGGACCTCCGCTGGTTGGCCAAGAGCTTCTTTGAGCTGACTGTCCTGAAAGACATCATCGGCATATGTTATGGGGCCACGGTCAAGGGCATGCAATCCTACGGGCTGGAGCGCTTGGCCGCCATGCTGATGGCCACGGTCAAGATGGAGGAGCTTGGTCACCTGACGACTGAGAAACAGGAGTACGCGCTGAGGTTAGCCACCGTCGGCTACCCCAAGGCCGGGGTTTACAGTGGCCTCATTGGAGGCGCCACATCTGTGCTTCTCTCGGCCTACAACCGCCACCCCCTTTTCCAGCCCCTGCATACCGTGATGAGAGAGACCCTGTTTATCGGCAGCCACGTGGTGCTACGCGAGTTGCGGCTGAACGTGACTACCCAGGGGCCCAACCTTGCCCTATACCAACTGCTGTCCACCGCCCTGTGCTCGGCCCTAGAGATTGGGGAGGTTTTGCGGGGGCTAGCCCTGGGGACGGAGAGCGGGCTCTTCTCACCGTGCTACCTCAGCCTACGATTTGACCTCACACGAGACAAGCTGCTGAGCATGGCCCCCCAGGAGGCAATGCTGGACCAGGCGGCCGTTTCAAATGCTGTGGATGGGTTTCTTGGGCGTCTCTCTTTGGAGCGAGAAGACAGGGATGCGTGGCATCTCCCCGCCTACAAATGCGTGGACAGGCTCGACAAAGTTCTGATGATTATCCCGCTCATCAACGTGACATTCATAATCTCTAGTGACCGTGAGGTCCGAGGCTCGGCGCTATACGAGGCCAGCACCACCTATCTCAGCAGCTCTCTCTTTCTCTCCCCCGTTATAATGAATAAATGTTCGCAGGGTGCTGTGGCTGGGGAGCCCCGCCAGATTCCAAAGATCCAGAATTTTACCAGGACGCAGAAATCCTGCATTTTTTGTGGCTTTGCCCTGCTCAGTTATGATGAAAAGGAAGGCCTGGAAACTACAACCTACATCACCTCCCAGGAAGTCCAAAACTCCATCTTGAGCTCCAACTACTTTGATTTTGACAACCTCCACGTTCACTATCTGCTGCTGACCACCAACGGGACTGTCATGGAAATTGCGGGCCTGTATGAAGAAAGAGCACACGTTGTTTTGGCAATAATCCTGTACTTTATTGCTTTTGCTCTGGGTATCTTTCTGGTTCACAAGATTGTTATGTTTTTCCTTTAG(SEQ ID NO.19)。

相对应的未经改造前gL原始序列：

ATGCGTGCTGTTGGTGTATTTCTGGCCACCTGTCTTGTCACCATTTTCGTCCTCCCAACATGGGGCAATTGGGCATACCCATGTTGTCACGTCACTCAGCTCCGCGCTCAACACCTTCTCGCGTTGGAAAACATTAGCGACATTTACCTGGTGAGCAATCAGACATGCGACGGCTTTAGTCTGGCCTCCTTAAATTCACCTAAGAATGGGAGCAACCAGCTGGTCATCAGCCGCTGCGCAAACGGACTCAACGTGGTCTCCTTCTTTATCTCCATCCTGAAGCGAAGCAGCTCCGCCCTCACGAGCCATCTCCGTGAGTTGTTAACCACCCTGGAGTCTCTTTACGGTTCATTCTCAGTGGAAGACCTGTTTGGTGCCAACTTAAACAGATACGCATGGCATCGCGGGGGCTAG(SEQ ID NO.20)。

将gH与gL通过linker连接起来的序列：

ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGATGGGCATACCCATGTTGTCACGTCACTCAGCTCCGCGCTCAACACCTTCTCGCGTTGGAAAACATTAGCGACATTTACCTGGTGAGCAATCAGACATGCGACGGCTTTAGTCTGGCCTCCTTAAATTCACCTAAGAATGGGAGCAACCAGCTGGTCATCAGCCGCTGCGCAAACGGACTCAACGTGGTCTCCTTCTTTATCTCCATCCTGAAGCGAAGCAGCTCCGCCCTCACGAGCCATCTCCGTGAGTTGTTAACCACCCTGGAGTCTCTTTACGGTTCATTCTCAGTGGAAGACCTGTTTGGTGCCAACTTAAACAGATACGCATGGCATCGCGGGGGCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCAGCCTTAGCGAGGTTAAGCTGCACCTGGACATAGAGGGGCATGCTTCGCATTACACCATCCCATGGACCGAACTGATGGCAAAGGTCCCAGGCCTTAGCCCAGAGGCGCTGTGGAGAGAGGCAAATGTCACCGAAGATTTGGCGTCTATGCTTAACCGCTACAAGTTAATTTACAAGACGTCTGGTACCCTTGGTATTGCGCTGGCCGAGCCTGTCGATATCCCTGCTGTCTCTGAAGGATCCATGCAAGTGGATGCATCTAAGGTCCATCCCGGAGTCATTAGCGGCCTGAATTCCCCTGCCTGCATGCTTAGTGCCCCCCTTGAGAAGCAGCTCTTCTACTATATTGGCACCATGCTGCCCAACACGCGGCCACACAGCTATGTCTTTTATCAGCTGCGCTGTCACTTGTCTTATGTGGCCCTGTCCATCAACGGGGACAAGTTTCAGTACACGGGGGCCATGACTTCTAAATTTCTGATGGGCACCTACAAGCGAGTGACCGAGAAGGGAGATGAGCATGTGTTGAGCCTGATCTTTGGCAAGACGAAGGACCTGCCGGATCTGAGGGGGCCTTTTAGTTACCCATCCTTAACCAGTGCCCAAAGCGGGGACTATTCCCTGGTGATTGTTACAACCTTTGTGCATTATGCCAACTTTCACAACTACTTTGTACCCAACCTGAAGGATATGTTTTCCCGAGCCGTCACCATGACAGCCGCCAGCTACGCTCGCTACGTTCTCCAGAAACTGGTCCTGCTGGAGATGAAGGGAGGCTGCCGGGAGCCAGAACTGGACACGGAAACGCTGACTACCATGTTTGAGGTTTCTGTGGCCTTCTTTAAGGTGGGTCATGCCGTGGGTGAGACTGGCAATGGCTGCGTGGACCTCCGCTGGTTGGCCAAGAGCTTCTTTGAGCTGACTGTCCTGAAAGACATCATCGGCATATGTTATGGGGCCACGGTCAAGGGCATGCAATCCTACGGGCTGGAGCGCTTGGCCGCCATGCTGATGGCCACGGTCAAGATGGAGGAGCTTGGTCACCTGACGACTGAGAAACAGGAGTACGCGCTGAGGTTAGCCACCGTCGGCTACCCCAAGGCCGGGGTTTACAGTGGCCTCATTGGAGGCGCCACATCTGTGCTTCTCTCGGCCTACAACCGCCACCCCCTTTTCCAGCCCCTGCATACCGTGATGAGAGAGACCCTGTTTATCGGCAGCCACGTGGTGCTACGCGAGTTGCGGCTGAACGTGACTACCCAGGGGCCCAACCTTGCCCTATACCAACTGCTGTCCACCGCCCTGTGCTCGGCCCTAGAGATTGGGGAGGTTTTGCGGGGGCTAGCCCTGGGGACGGAGAGCGGGCTCTTCTCACCGTGCTACCTCAGCCTACGATTTGACCTCACACGAGACAAGCTGCTGAGCATGGCCCCCCAGGAGGCAATGCTGGACCAGGCGGCCGTTTCAAATGCTGTGGATGGGTTTCTTGGGCGTCTCTCTTTGGAGCGAGAAGACAGGGATGCGTGGCATCTCCCCGCCTACAAATGCGTGGACAGGCTCGACAAAGTTCTGATGATTATCCCGCTCATCAACGTGACATTCATAATCTCTAGTGACCGTGAGGTCCGAGGCTCGGCGCTATACGAGGCCAGCACCACCTATCTCAGCAGCTCTCTCTTTCTCTCCCCCGTTATAATGAATAAATGTTCGCAGGGTGCTGTGGCTGGGGAGCCCCGCCAGATTCCAAAGATCCAGAATTTTACCAGGACGCAGAAATCCTGCATTTTTTGTGGCTTTGCCCTGCTCAGTTATGATGAAAAGGAAGGCCTGGAAACTACAACCTACATCACCTCCCAGGAAGTCCAAAACTCCATCTTGAGCTCCAACTACTTTGATTTTGACAACCTCCACGTTCACTATCTGCTGCTGACCACCAACGGGACTGTCATGGAAATTGCGGGCCTGTATGAAGAAAGAGCACACCACCACCACCACCACGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA(SEQ ID NO.21)。

真核细胞表达载体的构建

将gH/gL基因片段连入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+，方法如下：

1)gH/gL蛋白基因的扩增

将gL蛋白本身的信号肽替换为CD5信号肽(signal peptide,SP)，并在信号肽前面加入KOZAK序列，以增强蛋白的表达。蛋白在哺乳动物细胞表达并分泌的过程中信号肽将被切除。gH与gL基因片段通过(G4S)3linker连接起来，因此gH蛋白的信号肽也不包括在表达蛋白基因内。由于蛋白存在跨膜区将无法分泌表达出来，因此gH蛋白的跨膜区不包括在表达蛋白基因内。最后在蛋白末端加入6×His-avi tag，用于后续的纯化操作。因此，重组蛋白的构建为SP-gL-(G4S)3-gH-his-avi。

以EBV-M81-BAC DNA为模板，用下面的引物分别对gL和gH进行扩增：

gL正向引物：

TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGATGGGCATACCCATGT(SEQ ID NO.22)；

gL反向引物：

GCTGCCGCCGCCGCCAGAGCCTCCTCCGCCGGAGCCTCCTCCTCCGCCCCCGCGATGCCA(SEQ IDNO.23)；

gH正向引物：GGCGGCGGCGGCAGCAGCCTTAGCGAGGTT(SEQ ID NO.24)；

gH反向引物:

GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTCTTTCTTCATACAGGC(SEQ ID NO.25)。

选用50μl的PCR反应体系：

扩增完成的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切割正确分子量的条带，按照试剂盒说明书操作回收PCR产物。

2)目的片段和载体的酶切与连接：

载体使用真核表达质粒pcDNA3.1+。目的片段和载体都采用EcoRI和NotI进行酶切，使用50μl的反应体系：

酶切在37℃进行，时间为3～5hr。片段使用DNA纯化试剂盒回收，载体酶切跑胶后进行胶回收。

使用20μl的体系进行连接反应，反应在37℃进行30min：

3)连接产物的转化

将连接产物加入刚刚融化的DH5α感受态细胞；冰上放置30min；42℃热激90s，放回冰上5min；加入200μl LB培养基于30℃慢摇复苏40min；吸取培养液涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

4)阳性克隆的筛选

挑取单个菌落接种于5ml加有氨苄的培养基中培养约12hr；使用质粒小提试剂盒提取质粒；酶切鉴定获取阳性克隆；测序验证，获得完全正确的重组质粒。大量提取质粒。

重组蛋白的表达和提取

293F细胞培养至1L，细胞密度至1.5×10^6/ml时用PEI转染试剂转染。将100mlDMEM培养基中加入1mg重组质粒与5ml 1mg/ml PEI充分震荡混匀，室温放置20min后，加入细胞中。培养5天后收细胞上清，4000rpm离心30min，弃去细胞沉淀，上清中含有目的蛋白。

gH/gL重组蛋白纯化

1)亲和层析

gH/gL重组蛋白C端带有6×His-avi tag，可以使用镍柱进行亲和纯化。

在高速离心后的上清液中加入镍柱beads，4℃孵育过夜；低速离心除去上清；用含有20mM咪唑的上样缓冲液共100mL淋洗beads；用5个柱体积的含有250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

2)凝胶过滤层析

使用30kD浓缩管对镍柱洗脱的蛋白进行浓缩，至体积小于1ml；样品使用superdex200柱纯化。

最终获得的氨基酸序列：

MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGWAYPCCHVTQLRAQHLLALENISDIYLVSNQTCDGFSLASLNSPKNGSNQLVISRCANGLNVVSFFISILKRSSSALTSHLRELLTTLESLYGSFSVEDLFGANLNRYAWHRGGGGGGSGGGGSGGGGSSLSEVKLHLDIEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGSMQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQYTGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLIFGKTKDLPDLRGPFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYANFHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVGETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYALRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGPNLALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEAMLDQAAVSNAVDGFLGRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNKCSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYLLLTTNGTVMEIAGLYEERAHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.26)。

gH/gL重组蛋白的生物素标记

利用试剂EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(Thermo公司)对gH/gL蛋白进行生物素标记。在浓度为2mg/ml的gH/gL中加入10mM biotin试剂，室温反应30min。最后用PBS对反应体系进行透析。

实施例2酵母文库的筛选

利用酵母文库筛选技术，获得同gH/gL蛋白特异结合酵母阳性克隆。

(1)材料与设备

酵母表面展示人类非免疫scFv文库是从58个正常人的脾和淋巴结的淋巴细胞内分别扩增出的抗体重链和轻链可变区，中间通过3个G₄S linker将两个基因连在一起构建到酵母展示载体上，即构建成功酵母表面展示scFv文库，该文库的库容量为10⁹(本实验使用的酵母表面展示scFv文库来自Michael J.实验室)；Omega酵母质粒小提试剂盒；Amp+平板；LB培养基；streptavidin-microbeads(miltenyi biotec)；anti-biotin-microbeads(miltenyi biotec)；streptavidin-APC(ebioscience)；anti-biotin-PE(ebioscience)；YPD培养基；SDCAA培养基；SDCAA平板；SGCAA培养基；Yeast strains EBY100；E.colistrains DH5α；pNL6 Plasmid；流式分选仪(Aril II，BD)。

(2)方法

1)诱导好的酵母细胞测OD后，取10¹⁰细胞，离心后，PBS洗1-2遍，再用10ml的PBS重悬并加入100nM的gH/gL-biotin蛋白。4℃孵育5-10分钟，PBS洗两遍后按照1：2500的稀释度加入streptavidin-microbeads，4℃孵育10分钟。PBS洗两遍，40mlPBS重悬后进行磁珠分选。分选下来的酵母细胞在SD-CAA培养基中扩增以及SG-CAA诱导后，进行第二轮磁珠分选，二抗换成anti-biotin-microbeads。第二轮分选得到的酵母阳性细胞直接取重新加入100nM的gH/gL蛋白，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍，加入streptavidin-APC，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍进行流式分选。分选得到的酵母细胞SD-CAA培养基中扩增以及SG-CAA诱导后，进行第二轮流式分选，二抗换成streptavidin-APC和anti-biotin-PE，观测是否有针对streptavidin-APC的酵母富集，得到与gH/gL结合的人源的scFv酵母阳性克隆。

2)取第三轮流式分选得到的scFv酵母混合液涂板SDCAA，挑取60个单克隆酵母菌落经SDCAA液体培养基扩增及SGCAA培养基诱导后，流式检测验证其与抗原结合活性。

实施例3单克隆抗体的测序及表达纯化

(1)将实施例2中筛选得到与gH/gL结合的人源的scFv酵母阳性克隆，提取酵母中的质粒，并测序得到抗体基因。

(2)单克隆抗体的表达纯化。将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将含有来自同一个上皮细胞扩增出来的抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein A beads进行抗体的纯化。

实施例4抗体在EBV病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.EBV病毒的制备

(1)培养感染EBV-GFP的Akata细胞至密度为2*10^6/ml，在无血清的1640培养基中，加入终浓度为8ul/ml的羊抗人IgG，37℃，5％CO2环境中培养6h。

(2)6h后将细胞的培养基更换成含5％FBS的1640培养基，37℃，5％CO2环境中继续培养3天。

(3)3天后收取细胞上清，上清经过0.45um滤膜过滤后再用超高速离心机20000rpm，4℃离心2h。

(4)病毒沉淀用无血清的1640培养基重悬。

2.单克隆抗体的中和活性检测

单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同EBV病毒在4℃共同孵育3h；

孵育后的病毒液加入到HNE1细胞中，培养细胞至48-72小时；

制备HNE1细胞悬液，用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的百分比；利用Prism 5软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，得到1株对具有中和EBV感染上皮细胞的抗体M3，其基本信息见表1，中和实验结果见图1和2。

表1 M3抗体序列基本信息

表1中列出了M3抗体的可变区序列信息，包括抗体家族分布、抗体胚系保守性及CDR3氨基酸序列。

从附图1和2的中和实验结果中可以看出，M3能阻断EBV感染上皮细胞，IC50为53ng/ml，而阴性对照抗体2G4不能阻断EBV感染上皮细胞。说明M3抗体具有很高的中和EBV感染上皮细胞的能力。

M3全长重链共473氨基酸，序列如下所示：

其中下划线部分为重链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

M3全长重链的编码基因共2508个碱基，序列如下所示：

其中下划线部分为重链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

M3全长轻链共234氨基酸，序列如下所示：

其中下划线部分为轻链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

M3全长轻链的编码基因共1741个碱基，序列如下所示：

其中下划线部分为轻链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

M3的重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的SEQ ID NO.17自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-129位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.15加粗部分序列)；轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，轻链可变区中的CDR1’、CDR2’和CDR3’依次为序列表SEQ ID NO.17自N末端第46-51位氨基酸残基、第69-71位氨基酸残基和第108-116位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.17的加粗部分序列)。

CDR1的氨基酸序列为：GFSFDTYD(SEQ ID NO.1)；

CDR2的氨基酸序列为：ISYDGSET(SEQ ID NO.2)；

CDR3的氨基酸序列为：ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQ ID NO.3)；

CDR1’的氨基酸序列为：QSISGTY(SEQ ID NO.4)；

CDR2’的氨基酸序列为：GAS；

CDR3’的氨基酸序列为：QQYGSSLFT(SEQ ID NO.5)。

编码CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列如下所示：

CDR1的核苷酸序列为：GGATTTTCCTTCGATACCTATGAC(SEQ ID NO.6)；

CDR2的核苷酸序列为：ATTTCATATGATGGAAGTGAGACA(SEQ ID NO.7)；

CDR3的核苷酸序列为：

GCGAGATGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGCGGAGTTCATGGACGTC(SEQ ID NO.8)；

CDR1’的核苷酸序列为：CAGAGTATTAGCGGCACCTAC(SEQ ID NO.9)；

CDR2’的核苷酸序列为：GGTGCATCCC；

CDR3’的核苷酸序列为：CAGCAGTATGGTAGCTCACTATTCACT(SEQ ID NO.10)。

M3的重链可变区的氨基酸序列由序列表的SEQ ID NO.15自N末端第20至143位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.15中下划线部分序列)：

QVQLVESEGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFDTYDMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSETYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMRSLRGEDTARYYCARWEIVVVPAAAEFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO.11)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.16中下划线部分序列)：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGAGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTTCCTTCGATACCTATGACATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATTTCATATGATGGAAGTGAGACATATTATGCAGACTCAGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAGAAGCCTGAGAGGTGAAGACACGGCGCGATATTACTGTGCGAGATGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGCGGAGTTCATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.12)。

M3的轻链可变区由序列表的SEQ ID NO.17自N末端第20至127位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.17中下划线部分序列)：

ETTLTQSPAFMSATPGDKVTISCRASQSISGTYLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSLFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO.13)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.18中下划线部分序列)：

GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGCATTCATGTCAGCGACTCCAGGAGACAAAGTCACCATCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCGGCACCTACTTAACCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCGGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA(SEQ ID NO.14)。

实施例5抗体在埃博拉假病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.埃博拉(Ebola-Zaire)假病毒的制备

(1)利用埃博拉全长膜蛋白的真核表达质粒(pcDNA3.1+,购自Invitrogen公司)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞；

(2)48小时后收集细胞上清，利用p24定量检测的ELISA试剂盒进行病毒滴度的测定。

2.单克隆抗体的中和活性检测

(4)单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同埃博拉假病毒在37℃共同孵育1h；

(5)孵育后的病毒液加入到Huh7细胞中，培养细胞至48-72小时；

(6)裂解细胞Huh7；检测裂解液中的荧光素酶活性，利用Prism 5软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，抗体M3对埃博拉假病毒没有中和能力，抗体2G4作为埃博拉假病毒中和的阳性对照。中和实验结果见图2。

从附图2中可以看出M3不能阻断埃博拉假病毒感染Huh7细胞，而2G4抗体作为阳性对照则能高效阻断埃博拉假病毒的感染，IC50为330ng/ml。综上所述，说明M3是一个对EBV具有高中和活性的特异性抗体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究

所）

<120> 一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Ser Phe Asp Thr Tyr Asp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Glu Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Arg Trp Glu Ile Val Val Val Pro Ala Ala Ala Glu Phe Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Ser Ile Ser Gly Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Phe Thr

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggattttcct tcgataccta tgac 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atttcatatg atggaagtga gaca 24

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgagatggg agattgtagt agtaccagct gccgcggagt tcatggacgt c 51

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cagagtatta gcggcaccta c 21

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagcagtatg gtagctcact attcact 27

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Thr Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Glu Ile Val Val Val Pro Ala Ala Ala Glu Phe Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caggtgcagc tggtggagtc tgagggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt ttccttcgat acctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg atggaagtga gacatattat 180

gcagactcag tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240

ttgcaaatga gaagcctgag aggtgaagac acggcgcgat attactgtgc gagatgggag 300

attgtagtag taccagctgc cgcggagttc atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Lys Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Thr

20 25 30

Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaacgacac tcacgcagtc tccagcattc atgtcagcga ctccaggaga caaagtcacc 60

atctcctgca gggccagtca gagtattagc ggcacctact taacctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcggtgta ttactgtcag cagtatggta gctcactatt cactttcggc 300

cctgggacca aagtggatat caaa 324

<210> 15

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe

35 40 45

Asp Thr Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Val Tyr Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Arg

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Glu Ile Val Val Val Pro Ala Ala Ala Glu

115 120 125

Phe Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

210 215 220

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

225 230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 16

<211> 2508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 60

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 120

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 180

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 240

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 300

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 360

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 420

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 480

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 540

tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 600

gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 660

ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc 720

ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac 780

acatacgatt taggtgacac tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt 840

ccactcccag gtccaactgc acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca 900

tgtatcatcc tttttctagt agcaactgca accggtgtac attctcaggt gcagctggtg 960

gagtctgagg gaggcgtggt ccagcctggg aggtccctga gactctcctg tgcagcctct 1020

ggattttcct tcgataccta tgacatgcac tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg 1080

gagtgggtgg cagttatttc atatgatgga agtgagacat attatgcaga ctcagtgaag 1140

ggccggttca ccatctccag agacaattcc aagaacacgg tgtatttgca aatgagaagc 1200

ctgagaggtg aagacacggc gcgatattac tgtgcgagat gggagattgt agtagtacca 1260

gctgccgcgg agttcatgga cgtctggggc aaagggacca cggtcaccgt ctcctcagcg 1320

tcgaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1380

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtctcgtgg 1440

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1500

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 1560

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 1620

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 1680

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1740

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1800

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1860

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1920

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1980

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 2040

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 2100

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2160

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 2220

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2280

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga gtgcgacggc cggcaagccc ccgctccccg 2340

ggctctcgcg gtcgtacgag gaaagcttgg ccgccatggc ccaacttgtt tattgcagct 2400

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 2460

ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcat 2508

<210> 17

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala

20 25 30

Thr Pro Gly Asp Lys Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

35 40 45

Ser Gly Thr Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly

100 105 110

Ser Ser Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 18

<211> 1741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 60

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 120

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 180

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 240

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 300

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 360

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 420

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 480

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 540

tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 600

gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 660

ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc 720

ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac 780

acatacgatt taggtgacac tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt 840

ccactcccag gtccaactgc acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca 900

tgtatcatcc tttttctagt agcaactgca accggtgtac attctgaaac gacactcacg 960

cagtctccag cattcatgtc agcgactcca ggagacaaag tcaccatctc ctgcagggcc 1020

agtcagagta ttagcggcac ctacttaacc tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc 1080

aggctcctca tctatggtgc atccagcagg gccactggca tcccagacag gttcagtggc 1140

agtgggtctg ggacagactt cactctcacc atcagcagac tggagcctga agattttgcg 1200

gtgtattact gtcagcagta tggtagctca ctattcactt tcggccctgg gaccaaagtg 1260

gatatcaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 1320

ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 1380

aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 1440

gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 1500

gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 1560

gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 1620

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1680

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1740

t 1741

<210> 19

<211> 2121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgcagttgc tctgtgtttt ttgcctggtg ttgctatggg aggtgggggc tgccagcctt 60

agcgaggtta agctgcacct ggacatagag gggcatgctt cgcattacac catcccatgg 120

accgaactga tggcaaaggt cccaggcctt agcccagagg cgctgtggag agaggcaaat 180

gtcaccgaag atttggcgtc tatgcttaac cgctacaagt taatttacaa gacgtctggt 240

acccttggta ttgcgctggc cgagcctgtc gatatccctg ctgtctctga aggatccatg 300

caagtggatg catctaaggt ccatcccgga gtcattagcg gcctgaattc ccctgcctgc 360

atgcttagtg ccccccttga gaagcagctc ttctactata ttggcaccat gctgcccaac 420

acgcggccac acagctatgt cttttatcag ctgcgctgtc acttgtctta tgtggccctg 480

tccatcaacg gggacaagtt tcagtacacg ggggccatga cttctaaatt tctgatgggc 540

acctacaagc gagtgaccga gaagggagat gagcatgtgt tgagcctgat ctttggcaag 600

acgaaggacc tgccggatct gagggggcct tttagttacc catccttaac cagtgcccaa 660

agcggggact attccctggt gattgttaca acctttgtgc attatgccaa ctttcacaac 720

tactttgtac ccaacctgaa ggatatgttt tcccgagccg tcaccatgac agccgccagc 780

tacgctcgct acgttctcca gaaactggtc ctgctggaga tgaagggagg ctgccgggag 840

ccagaactgg acacggaaac gctgactacc atgtttgagg tttctgtggc cttctttaag 900

gtgggtcatg ccgtgggtga gactggcaat ggctgcgtgg acctccgctg gttggccaag 960

agcttctttg agctgactgt cctgaaagac atcatcggca tatgttatgg ggccacggtc 1020

aagggcatgc aatcctacgg gctggagcgc ttggccgcca tgctgatggc cacggtcaag 1080

atggaggagc ttggtcacct gacgactgag aaacaggagt acgcgctgag gttagccacc 1140

gtcggctacc ccaaggccgg ggtttacagt ggcctcattg gaggcgccac atctgtgctt 1200

ctctcggcct acaaccgcca cccccttttc cagcccctgc ataccgtgat gagagagacc 1260

ctgtttatcg gcagccacgt ggtgctacgc gagttgcggc tgaacgtgac tacccagggg 1320

cccaaccttg ccctatacca actgctgtcc accgccctgt gctcggccct agagattggg 1380

gaggttttgc gggggctagc cctggggacg gagagcgggc tcttctcacc gtgctacctc 1440

agcctacgat ttgacctcac acgagacaag ctgctgagca tggcccccca ggaggcaatg 1500

ctggaccagg cggccgtttc aaatgctgtg gatgggtttc ttgggcgtct ctctttggag 1560

cgagaagaca gggatgcgtg gcatctcccc gcctacaaat gcgtggacag gctcgacaaa 1620

gttctgatga ttatcccgct catcaacgtg acattcataa tctctagtga ccgtgaggtc 1680

cgaggctcgg cgctatacga ggccagcacc acctatctca gcagctctct ctttctctcc 1740

cccgttataa tgaataaatg ttcgcagggt gctgtggctg gggagccccg ccagattcca 1800

aagatccaga attttaccag gacgcagaaa tcctgcattt tttgtggctt tgccctgctc 1860

agttatgatg aaaaggaagg cctggaaact acaacctaca tcacctccca ggaagtccaa 1920

aactccatct tgagctccaa ctactttgat tttgacaacc tccacgttca ctatctgctg 1980

ctgaccacca acgggactgt catggaaatt gcgggcctgt atgaagaaag agcacacgtt 2040

gttttggcaa taatcctgta ctttattgct tttgctctgg gtatctttct ggttcacaag 2100

attgttatgt ttttccttta g 2121

<210> 20

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgcgtgctg ttggtgtatt tctggccacc tgtcttgtca ccattttcgt cctcccaaca 60

tggggcaatt gggcataccc atgttgtcac gtcactcagc tccgcgctca acaccttctc 120

gcgttggaaa acattagcga catttacctg gtgagcaatc agacatgcga cggctttagt 180

ctggcctcct taaattcacc taagaatggg agcaaccagc tggtcatcag ccgctgcgca 240

aacggactca acgtggtctc cttctttatc tccatcctga agcgaagcag ctccgccctc 300

acgagccatc tccgtgagtt gttaaccacc ctggagtctc tttacggttc attctcagtg 360

gaagacctgt ttggtgccaa cttaaacaga tacgcatggc atcgcggggg ctag 414

<210> 21

<211> 2502

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60

tcctgcctcg gatgggcata cccatgttgt cacgtcactc agctccgcgc tcaacacctt 120

ctcgcgttgg aaaacattag cgacatttac ctggtgagca atcagacatg cgacggcttt 180

agtctggcct ccttaaattc acctaagaat gggagcaacc agctggtcat cagccgctgc 240

gcaaacggac tcaacgtggt ctccttcttt atctccatcc tgaagcgaag cagctccgcc 300

ctcacgagcc atctccgtga gttgttaacc accctggagt ctctttacgg ttcattctca 360

gtggaagacc tgtttggtgc caacttaaac agatacgcat ggcatcgcgg gggcggagga 420

ggaggctccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggcagca gccttagcga ggttaagctg 480

cacctggaca tagaggggca tgcttcgcat tacaccatcc catggaccga actgatggca 540

aaggtcccag gccttagccc agaggcgctg tggagagagg caaatgtcac cgaagatttg 600

gcgtctatgc ttaaccgcta caagttaatt tacaagacgt ctggtaccct tggtattgcg 660

ctggccgagc ctgtcgatat ccctgctgtc tctgaaggat ccatgcaagt ggatgcatct 720

aaggtccatc ccggagtcat tagcggcctg aattcccctg cctgcatgct tagtgccccc 780

cttgagaagc agctcttcta ctatattggc accatgctgc ccaacacgcg gccacacagc 840

tatgtctttt atcagctgcg ctgtcacttg tcttatgtgg ccctgtccat caacggggac 900

aagtttcagt acacgggggc catgacttct aaatttctga tgggcaccta caagcgagtg 960

accgagaagg gagatgagca tgtgttgagc ctgatctttg gcaagacgaa ggacctgccg 1020

gatctgaggg ggccttttag ttacccatcc ttaaccagtg cccaaagcgg ggactattcc 1080

ctggtgattg ttacaacctt tgtgcattat gccaactttc acaactactt tgtacccaac 1140

ctgaaggata tgttttcccg agccgtcacc atgacagccg ccagctacgc tcgctacgtt 1200

ctccagaaac tggtcctgct ggagatgaag ggaggctgcc gggagccaga actggacacg 1260

gaaacgctga ctaccatgtt tgaggtttct gtggccttct ttaaggtggg tcatgccgtg 1320

ggtgagactg gcaatggctg cgtggacctc cgctggttgg ccaagagctt ctttgagctg 1380

actgtcctga aagacatcat cggcatatgt tatggggcca cggtcaaggg catgcaatcc 1440

tacgggctgg agcgcttggc cgccatgctg atggccacgg tcaagatgga ggagcttggt 1500

cacctgacga ctgagaaaca ggagtacgcg ctgaggttag ccaccgtcgg ctaccccaag 1560

gccggggttt acagtggcct cattggaggc gccacatctg tgcttctctc ggcctacaac 1620

cgccaccccc ttttccagcc cctgcatacc gtgatgagag agaccctgtt tatcggcagc 1680

cacgtggtgc tacgcgagtt gcggctgaac gtgactaccc aggggcccaa ccttgcccta 1740

taccaactgc tgtccaccgc cctgtgctcg gccctagaga ttggggaggt tttgcggggg 1800

ctagccctgg ggacggagag cgggctcttc tcaccgtgct acctcagcct acgatttgac 1860

ctcacacgag acaagctgct gagcatggcc ccccaggagg caatgctgga ccaggcggcc 1920

gtttcaaatg ctgtggatgg gtttcttggg cgtctctctt tggagcgaga agacagggat 1980

gcgtggcatc tccccgccta caaatgcgtg gacaggctcg acaaagttct gatgattatc 2040

ccgctcatca acgtgacatt cataatctct agtgaccgtg aggtccgagg ctcggcgcta 2100

tacgaggcca gcaccaccta tctcagcagc tctctctttc tctcccccgt tataatgaat 2160

aaatgttcgc agggtgctgt ggctggggag ccccgccaga ttccaaagat ccagaatttt 2220

accaggacgc agaaatcctg cattttttgt ggctttgccc tgctcagtta tgatgaaaag 2280

gaaggcctgg aaactacaac ctacatcacc tcccaggaag tccaaaactc catcttgagc 2340

tccaactact ttgattttga caacctccac gttcactatc tgctgctgac caccaacggg 2400

actgtcatgg aaattgcggg cctgtatgaa gaaagagcac accaccacca ccaccacggt 2460

ctgaacgaca tcttcgaggc tcagaaaatc gaatggcacg aa 2502

<210> 22

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tagtccagtg tggtggaatt cgccaccatg cccatggggt ctctgcaacc gctggccacc 60

ttgtacctgc tggggatgct ggtcgcttcc tgcctcggat gggcataccc atgt 114

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gctgccgccg ccgccagagc ctcctccgcc ggagcctcct cctccgcccc cgcgatgcca 60

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggcggcggcg gcagcagcct tagcgaggtt 30

<210> 25

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gccctctaga ctcgagcggc cgcttattcg tgccattcga ttttctgagc ctcgaagatg 60

tcgttcagac cgtggtggtg gtggtggtgt gctctttctt catacaggc 109

<210> 26

<211> 834

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val

20 25 30

Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp

35 40 45

Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser

50 55 60

Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys

65 70 75 80

Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg

85 90 95

Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu

100 105 110

Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn

115 120 125

Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu

145 150 155 160

His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr

165 170 175

Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg

180 185 190

Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys

195 200 205

Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro

210 215 220

Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser

225 230 235 240

Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met

245 250 255

Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met

260 265 270

Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys

275 280 285

His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr

290 295 300

Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val

305 310 315 320

Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr

325 330 335

Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr

340 345 350

Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val

355 360 365

His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met

370 375 380

Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val

385 390 395 400

Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro

405 410 415

Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala

420 425 430

Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val

435 440 445

Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys

450 455 460

Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser

465 470 475 480

Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met

485 490 495

Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg

500 505 510

Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile

515 520 525

Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu

530 535 540

Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser

545 550 555 560

His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro

565 570 575

Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu

580 585 590

Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly

595 600 605

Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp

610 615 620

Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala

625 630 635 640

Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg

645 650 655

Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg

660 665 670

Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile

675 680 685

Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser

690 695 700

Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn

705 710 715 720

Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys

725 730 735

Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe

740 745 750

Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr

755 760 765

Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe

770 775 780

Asp Phe Asp Asn Leu His Val His Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly

785 790 795 800

Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu Tyr Glu Glu Arg Ala His His His

805 810 815

His His His Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp

820 825 830

His Glu

Claims

1.一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，

其中，CDR1的氨基酸序列为GFSFDTYD(SEQ ID NO.1)，

CDR2的氨基酸序列为ISYDGSET(SEQ ID NO.2)，

CDR3的氨基酸序列为ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQ ID NO.3)；

所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，

其中，CDR1’的氨基酸序列为QSISGTY(SEQ ID NO.4)，

CDR2’的氨基酸序列为GAS，

CDR3’的氨基酸序列为QQYGSSLFT(SEQ ID NO.5)。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

4.根据权利要求1至3任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

5.根据权利要求1至3任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

6.一种编码权利要求1至5任一所述抗体的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

8.根据权利已要求6或7所述的核苷酸序列，其特征在于，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

9.含有权利要求6至8任一所述核苷酸序列的转基因细胞系。

10.一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利已要求1至5任一所述的抗体。