KR102435081B1 - 종양 치료용 항체 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD3 및 종양 항원에 결합하는 이중특이성 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이성 항체는 감소된 효과기 기능을 나타내고, Fcγ 수용체에 대해 독특한 결합 프로파일 갖는다. 이중특이성 항체는 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸을 효율적으로 유도하도록 조작된다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 인간 CD3과 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20과 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 분자, 및 특이 결합 패턴으로 Fcγ 수용체와 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 B-세포 또는 흑색종 종양 발현 CD20의 성장을 억제할 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체는 각종 암 뿐만 아니라 다른 CD20-관련 질환 및 장애의 치료에 유용하다.

Description

종양 치료용 항체 조성물{ANTIBODY COMPOSITIONS FOR TUMOR TREATMENT}
서열 목록
본 출원은 A0015WO01-Sequence.txt라는 이름으로 2015년 3월 4일자로 만들어진 컴퓨터 판독가능한 형태의 서열 목록을 포함하며(83,454 바이트), 이것은 본원에 참고로 포함되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 CD20 및 CD3 항원을 표적으로 하는 이중특이성 항체, 및 종양 사멸 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 치료를 위한 항체 요법과 공동으로 Fc 결합으로부터 야기될 수 있는 효과기 기능을 감소 및/또는 조절하는 방법에 관한 것이다.
이중 표적 항체 전략은 치료 효능을 향상시키기 위해 다인성 조정이 의도되는 복합 질환에 적용되고 있다. CD20은 성숙한 B 세포의 세포 막에서 발현되는 비당화 인단백질이다. CD20은 B 세포 종양-관련 항원으로 간주되는데, 그 이유는 이것이 95% 이상의 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 및 다른 B-세포 악성 종양에 의해 발현되지만, 전구 B-세포, 수지상 세포 및 혈장 세포 상에서는 부재하기 때문이다. CD20을 표적화함으로써 암을 치료하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 키메라성 항-CD20 단일클론성 항체 리툭시맙이 NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 소 림프구성 림프종 (SLL)과 같은 암을 치료하는데 사용되어 왔고 사용하기 위해 제안되어 왔다. 일부 환자들은 항-CD20 요법에 대해 내성이 생기거나 불완전한 반응(예를 들면, 리툭시맙에 대한 내성)을 나타내는 것으로 밝혀졌지만, 항-CD20 항체는 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 아폽토시스 및 화학요법에 대한 감작화의 유도에 의해 CD20-발현 종양 세포를 사멸시키는 것으로 믿어진다.
CD3은 T 세포 수용체 복합체(TCR)와 관련하여 T 세포 상에 발현되는 동종이량체성 또는 이종이량체성 항원이고, T 세포 활성화를 위해 필요하다. 기능성 CD3은 4개의 상이한 쇄들: 엡실론, 제타, 델타 및 감마 중 2개의 이량체성 회합으로부터 형성된다. CD3 및 표적 항원, 예를 들면, CD20과 결합할 수 있는 이중특이성 항체가 표적 항원을 발현하는 조직 및 세포에 대한 T 세포 면역 반응을 표적화하는 것을 포함하는 치료학적 사용을 위해 제안되었다.
CD20-결합 아암과 CD3-결합 아암을 갖는 이중특이성 항체는 항종양 활성을 증대시키는데 필요한 크로스토크를 제공할 수 있다. 이러한 이중특이성 항체에서의 제3 양상은 Fc 도메인이다. Fc 결합 특성의 변형은 치료학적 항체의 항종양 효능을 더욱 증대시킬 수 있다.
면역글로불린 Fc 도메인이 이의 수용체에 결합하면 다양한 신호전달 및 면역 반응을 야기한다. 이러한 다양한 "효과기 기능", 예를 들면, CDC 및 ADCC는 IgG의 Fab 도메인과 표적 항원 간의 복합체를 형성하는 G 부류의 면역글로불린 (IgG)의 결과인 반면, IgG의 Fc 도메인은 효과기 세포 상에 Fc 수용체에 결합한다. IgG의 몇몇 효과기 기능은 항원 결합과는 무관하며, 순환 혈청 수준 및 장벽을 가로질러 Ig를 전달하는 능력과 같은 기능을 포함한다. 다른 효과기 기능들이 암 치료와 같은 면역글로불린 요법에서 사용하기에 필수적인 것으로 간주된다. ADCC 메카니즘이 특히 라스투주맙(전이성 유방암) 및 리툭시맙(비호지킨 림프종)과 같이 이미 시장에 출시된 치료 항체의 주요 항-종양 메카니즘 중의 하나인 것으로 간주된다.
현재의 치료학적 전략은 전형적으로 감소된 효과기 기능 (또는 감소된 Fc 감마 수용체 결합)이 항원의 생물학적 활성을 중화시키거나 억제하는 것(예를 들면, 항체 차단제 또는 길항제), 또는 다운스트림 세포 신호전달을 활성화시키거나 개시하는 것(예를 들면, 항체 효능제)을 목적으로 하는 항체에 유용할 수 있음을 시사한다. 그러나, 감소된 효과기 기능을 가진 항체를 표적으로 하는 종양의 설계가 종양 요법에는 반직관적인데, 그 이유는 표적 세포의 감소된 세포독성이 질환을 치료하는데, 즉 종양 세포를 파괴하거나 종양 성장을 억제하는데 효과적이지 않을 것으로 예상되기 때문이다.
본원에 기재된 한 가지 전략은 종양 마커를 특이적으로 표적화할 뿐만 아니라 종양-특이 T 세포 사멸을 일으키는 이중특이성 항원 결합을 구비한 차등 Fc 수용체 결합을 이용한다. 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체 결합을 신중하게 제어하여 T 세포, 자연 살해 세포 및 Fc 수용체를 갖는 대식세포와 같은 세포의 바람직하지 않은 사멸을 없애거나 감소시키도록 설계된다. FcγRII 수용체 결합 상호작용을 포함하지만 FcγRI 또는 FcγRIII 상호작용은 결여된 Fc 수용체 상호작용에 대한 독특한 결합 패턴은 종양-표적화 Ig 요법과 관련하여 당업계에 기재되어 있지 않다.
따라서, Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 항체를 표적화하는 이중특이성 B 세포와 T 세포의 조합은 예측치 못하게 유리한 치료학적 특성을 초래한다. CD3과 CD20 둘 다에 결합하는 이중특이성 항체는 제어되고 효율적인 세포독성을 표적화하는 특이적 CD20이 요구되는 임상 현장에서 특히 유용하다.
발명의 간단한 요약
제1 측면에서, 본 발명은 인간 CD3 및 CD20에 결합하는 변형된 Fc 결합 도메인을 갖는 이중특이성 항체를 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에 따르는 항체는, 그 중에서도, 예를 들면, T 세포-매개된 사멸이 CD3-매개된 T 세포 활성화가 항-CD20 종양 세포와 같은 특정 세포 유형에 지시된 이중특이성 항체의 일부로서 유리하거나 바람직한 상황하에서 CD3을 발현하는 T 세포를 표적화하는데 및 T 세포 활성화를 자극하는데 유용하다. 항체는 면역계의 천연 레퍼토리에서는 발견되지 않는 특이 효과기 기능을 갖도록 추가로 조작된다.
본 발명의 예시적인 항-CD3/CD20 항체가 본원의 표 1 내지 8에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 이중특이성 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR), 뿐만 아니라 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 기재하고 있다. 표 2는 예시적인 이중특이성 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 암호화하는 핵산 분자의 서열 식별자를 기재하고 있다. 표 3은 HCVR, 중쇄 불변 영역 (CH) 및 LCVR 조합을 포함하는 예시적인 이중특이성 항체의 조합의 아미노산 서열 식별자를 기재하고 있다. 표 4는 예시적인 이중특이성 항체의 HCVR, 중쇄 불변 영역 (CH) 및 LCVR 조합을 암호화하는 핵산 분자의 조합의 핵산 서열 식별자를 기재하고 있다.
표 5는 본 발명의 중쇄 예에 대한 아미노산 서열 식별자를 기술하고 있으며, 여기서, 이중특이성 항체는 본 발명의 CH와 쌍을 이룬 표 5의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCVR을 포함한다. 표 6은 본 발명의 경쇄 예에 대한 아미노산 서열 식별자를 별도로 기술하고 있으며, 여기서, 이중특이성 항체는 표 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 예시적인 항-CD3/CD20 항체 내에 함유된 아미노산 서열 쌍을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/18 및 10/18 (예를 들면, 항체 1 및 항체 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 8/16 (예를 들면, 항체 1 또는 항체 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍과 같은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중의 어느 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열의 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 세트는 서열번호 4-6-8-20-22-24; 또는 12-14-16-20-22-24 (예를 들면, 항체 1 또는 항체 2)이다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 서열번호 2/18 (예를 들면, 항체 1 또는 항체 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1 -HCDR2-HCDR3-LCDR1 -LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하기 위한 방법 및 기술들은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 개시되어 있는 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 동정하는데 사용될 수 있는 예시적인 관례로는, 예를 들면, 카밧(Kabat) 정의, 쵸티아(Chothia) 정의, 및 AbM 정의가 포함된다. 일반적인 용어로, 카밧 정의는 서열 가변성에 근거하고, 쵸티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 근거하며, AbM 정의는 카밧과 쵸티아 접근법 사이의 절충이다. 예를 들면, 문헌[Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani 등, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)]을 참조한다. 또한, 공공의 데이터베이스도 항체 내의 CDR 서열들을 동정하는데 이용가능하다.
본 발명은 또한 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 예를 들면, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 또는 LCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR/LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 또는 HCDR2 또는 HCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 또는 HCDR2 또는 HCDR3 핵산 서열 중의 어느 것, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 또는 LCDR2 또는 LCDR3 아미노산 서열 중의 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 또는 LCDR2 또는 LCDR3 핵산 서열 중의 어느 것, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서, HCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, 여기서, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-CD3 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서, LCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, 여기서, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-CD3 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 HCVR과 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서, HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중의 어느 것, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에 따르는 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하며, 여기서, HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에 열거된 동일한 항-CD3 항체로부터 유도된다.
본 발명은 또한 표 2에 열거된 CH 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 2에 열거된 CH 핵산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 항-CD3 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 및 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 상기 언급된 핵산 분자 중의 어느 것, 즉, 표 1 및 표 2에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열, 및/또는 CH 서열 중의 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 이러한 벡터들이 도입된 숙주 세포, 뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부를 생산하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD3 및 CD20에 특이적으로 결합하는 치료학적 유효량의 재조합 인간 항체 또는 이의 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 키메라성 Fc 도메인, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 관련 측면에서, 본 발명은 항-CD3/CD20 항체와 제2 치료제의 병용물인 조성물을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에서, 제2 치료제는 항-CD3/CD20 항체와 유리하게 병용되는 임의의 제제이다. 항-CD3/CD20 항체와 유리하게 병용될 수 있는 예시적인 제제는 CD3 신호전달에 결합하고/하거나 활성화하는 다른 제제(다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 등을 포함함) 및/또는 CD3에 직접적으로 결합하지 않지만 그럼에도 불구하고 면역 세포 활성화를 활성화시키거나 자극하는 제제를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항-CD3 항체를 포함하는 추가의 병용 요법 및 공동-제형은 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 CD3 및 표적 항원에 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서, 상기 분자는 감소된 효능기 기능을 갖는 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서 상기 분자는 본원에 기재된 바와 같은 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 특정 예시적인 실시형태에 따르면, 이중특이성 항원-결합 분자는 CD3 및 CD20에 결합하며; 이러한 이중특이성 항원-결합 분자를 본원에서는 "항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자"라고도 한다. 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자의 항-CD20 부분은 CD20 (예를 들면, B-세포 종양)을 발현하는 종양 세포를 표적화하는데 유용하고, 이중특이성 분자의 항-CD3 부분은 T-세포를 활성화하는데 유용하다. 종양 세포 상의 CD20과 T-세포 상의 CD3의 동시 결합은 활성화된 T-세포에 의한 표적화된 종양 세포의 지시된 사멸(세포 용해)을 매개하고 키메라성 Fc 도메인에 결합하는 효능기 세포에 의해 촉진된다. 따라서, 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자는, 그 중에서도, CD20-발현 종양과 관련되거나 이에 의해 야기되는 질환 및 장애(예를 들면, 림프종 및 흑색종 종양)를 치료하는데 유용하다.
본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자는 CD20-양성 종양의 퇴화 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 B 세포 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료량의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 투여함을 포함하고, 여기서, 양은 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴화를 초래하거나, 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양이다.
본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자는 CD20-양성 (즉, CD20-발현) 흑색종의 저해 또는 퇴화 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 CD20-양성 흑색종을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료량의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 투여함을 포함하고, 여기서, 양은 대상체에서 종양 성장을 억제하거나, 종양 부담을 감소시키거나, 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료 또는 개선시키기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하고, 암을 치료 또는 개선시키는 것은: (a) 대상체에서 종양 성장을 저해하거나, (b) 대상체에서 B-세포 용해를 매개하거나, (c) 대상체에서B-세포 암을 치료하거나, (d) 대상체에서 CD20 발현에 대해 양성인 암을 치료하거나, (e) 대상체에서 CD20-발현 흑색종 암을 치료함을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양 성장을 저해하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에, 종양 성장을 저해하는 것은 (a) 대상체에서 종양의 성장을 억제하거나, (b) 대상체에서 종양(들)의 크기를 감소시키거나, (c) 대상체에서 종양의 수를 감소시킴을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B-세포 용해를 매개하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에, B-세포는 프리-B 림프구, 성숙한 B-림프구, 또는 B-세포 비호지킨 림프종 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B-세포 암을 치료하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에, B-세포 암은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 소포성 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프모구 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 모발 세포 백혈병 및 버킷 림프종. 몇몇 경우에, 대상체는 (a) 항-CD20 단일특이적 요법 단독, 또는 (b) 리툭시맙 단일요법에 내성이거나, 또는 불완전하게 반응성인 종양을 앓고 있다. 몇몇 경우에, 대상체는 이중특이성 항체를 투여하기 적어도 1일 내지 1년 전에 항-CD20 단일특이성 항체를 제공받았다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이적 요법은 항-CD20 단일특이성 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이성 항체는 리툭시맙이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 항-CD20 단일특이적 요법 단독에 내성이거나, 또는 불완전하게 반응성인 암에 걸린 대상체를 선택하고; (b) 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하는 치료량의 이중특이성 항체를 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 B-세포 세포를 치료하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공한다.
몇몇 경우에, 대상체는 항-CD20 단일특이적 요법에 내성이거나, 난치성이거나, 불완전하게 반응성인 종양을 갖는지에 기반하여 선택된다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이적 요법은 항-CD20 단일특이성 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이성 항체는 리툭시맙이다. 몇몇 경우에, B-세포 암은 림프종이다. 몇몇 경우에, 림프종은 비호지킨 림프종 (NHL)이다. 몇몇 경우에, B-세포 암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B 세포 암을 치료하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 이중특이성 항체는 대상체에 서종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴화를 야기하거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 발달을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
몇몇 경우에, B-세포 암은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 소포성 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프모구 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 모발 세포 백혈병 및 버킷 림프종. 몇몇 경우에, 대상체는 항-CD20 단일특이적 요법 단독에 내성이거나, 또는 불완전하게 반응성인 종양을 앓고 있다. 몇몇 경우에, 대상체는 리툭시맙 단일요법에 내성이거나, 또는 불완전하게 반응성인 종양을 앓고 있다. 몇몇 경우에, 대상체는 이중특이성 항체를 투여하기 적어도 1일 내지 1년 전에 항-CD20 단일특이성 항체 요법을 제공받았다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이적 요법은 항-CD20 단일특이성 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이성 항체는 리툭시맙이다. 몇몇 경우에, 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴화를 야기하거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양은 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 몇몇 경우에, 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴화를 야기하거나, 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양은 약 0.4 mg/kg이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 암 및/또는 종양에 걸린 대상체를 선택하고; (b) 대상체로부터 하나 이상의 생물학적 샘플을 수집하며; (c) 하나 이상의 샘플에서 CD20-발현 암 또는 종양 세포를 동정하고; (b) 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하는 치료량의 이중특이성 항체를 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 CD20 발현에 대해 양성인 암을 치료하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공한다.
몇몇 경우에, 대상체는 항-CD20 요법에 내성이거나, 난치성이거나, 불완전하게 반응성인 암 또는 종양을 갖는지에 기반하여 선택된다. 몇몇 경우에, 대상체는 잔류 암을 갖는지에 기반하여 선택된다. 몇몇 경우에, 항-CD20 요법은 항-CD20 단일특이성 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 경우에, 항-CD20 단일특이성 항체는 리툭시맙이다. 몇몇 경우에, 암은 림프종 또는 백혈병이다. 몇몇 경우에, 림프종은 소포성 림프종, B-세포 림프모구 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 모발 세포 백혈병 및 버킷 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 백혈병은 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하는 치료량의 이중특이성 항체를 투여함을 포함하여, 대상체에서 CD20-발현 흑색종 암을 치료하기 위한 이중특이성 항체의 용도를 제공하며, 여기서, 양은 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 발달을 감소시키기에 충분하다.
본 발명의 이러한 측면에 따르는 이중특이성 항원-결합 분자는 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 키메라성 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자 (예를 들면, 이중특이성 항체)를 포함하고, 여기서, 각각의 항원-결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (LCVR)과 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다. 본 발명의 특정 예시적인 실시형태에서, 항-CD3 항원-결합 도메인 및 항-CD20 항원 결합 도메인 각각은 공통 LCVR과 쌍을 이룬 상이한 별개의 HCVR을 포함한다. 예를 들면, 본원의 실시예 2에 예시된 바와 같이, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인(여기서, 제1 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 HCVR/LCVR 쌍을 포함한다); 및 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인(여기서, 제2 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 LCVR (예를 들면, 항-CD3 항원-결합 도메인에 포함된 동일한 LCVR)과 쌍을 이룬 항-CD20 항체로부터 유도된 HCVR을 포함하는 이중특이성 항체가 작제되었다. 즉, 본원에 개시된 예시적인 분자에서, 항-CD20 항체로부터의 HCVR이 항-CD3 항체로부터의 LCVR과 쌍을 이루면 CD20에 특이적으로 결합(그러나, CD3에는 결합하지 않음)하는 항원-결합 도메인이 생성된다. 이러한 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 별개의 항-CD3 및 항-CD20 HCVR을 포함하지만 공통의 항-CD3 LCVR을 공유한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 HCVR 아미노산 서열 중의 어느 것을 포함한다. CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 또한 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 LCVR 아미노산 서열 중의 어느 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 중의 어느 것을 포함한다. 본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중의 어느 것, 및/또는 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중의 어느 것을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 10을 포함하는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 18을 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 10/18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR 및 LCVR (HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 16을 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 16/24를 포함하는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 서열번호 12를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 도메인; 서열번호 14를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 도메인; 서열번호 20을 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 도메인; 및 서열번호 22를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 도메인을 포함한다.
특정의 비제한적인 예시적인 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자는 서열번호 12-14-16-20-22-24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 각각 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 2를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 18을 포함하는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다. 본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 75를 포함하는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 2/18, 또는 서열번호 2/75를 포함하는 HCVR 및 LCVR (HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 8/24를 포함하는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 도메인; 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 도메인; 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 도메인; 및 서열번호 22의 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 도메인을 포함한다.
특정의 비제한적인 예시적인 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자는 서열번호 4-6-8-20-22-24 (예를 들면, 항체 1 또는 항체 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 각각 포함하는 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자는 인간 CD3에 특이적으로 결합하고 세 개의 중쇄 상보성 결정 영역 (A1-HCDR1, A1-HCDR2, A1-HCDR3) 및 세 개의 경쇄 상보성 결정 영역 (A1-LCDR1, A1-LCDR2, A1-LCDR3)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 (A1), 및 인간 CD20에 특이적으로 결합하고 세 개의 중쇄 상보성 결정 영역 (A2-HCDR1, A2-HCDR2 및 A2-HCDR3) 및 세 개의 경쇄 상보성 결정 영역 (A2-LCDR1, A2-LCDR2 및 A2-LCDR3)을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 (A2)을 포함하며; 여기서, (a) A1-HCDR1은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고; (b) A1-HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하며; (c) A1-HCDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (d) A1-LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하며; (e) A1-LCDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (f) A1-LCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하며; (g) A2-HCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; (h) A2-HCDR2는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하며; (i) A2-HCDR3은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; (j) A2-LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하며; (k) A2-LCDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (l) A2-LCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 서열번호 2/18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (HCVR/LCVR) 서열 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원의 표 2, 7 및 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 임의의 기능적 조합 또는 배열로 표 2, 7 및 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열 중의 두 개를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 본원에 개시된 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자의 HCVR, LCVR 또는 CDR 서열 중의 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산을 지닌 재조합 발현 벡터, 및 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포 또한 본 발명에 포함되고, 항체의 생산을 가능하게 하는 조건하에 숙주 세포를 배양하고, 생산된 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기한 항원-결합 도메인 중의 어느 것을 CD20과 특이적으로 결합하는 상기한 항원-결합 도메인 중의 어느 것과 조합되거나, 연결되거나, 또는 달리 회합되어 CD3 및 CD20에 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 관련 측면에서, 이중특이성 항체는 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명은 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 우선적으로 결합하며 인간 FcγRI 또는 인간 FcγRIII에 대한 결합 친화력을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공한다. 하나의 측면에서, 이중특이성 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIB, 인간 FcγRI, 및/또는 인간 FcγRIII에 대한 결합보다 더 높은 친화도로 인간 FcγRIIA에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 항체가 인간 FcγRI 또는 인간 FcγRIII에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB 둘 다에 특이적으로 결합하며, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 각각의 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 대해 1μM 미만의 KD 결합 친화도를 나타낸다,
또 다른 측면에서, 본 발명은 키메라성 Fc 도메인을 각각 포함하는 제1 및 제2 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서, 제1 중쇄 폴리펩타이드는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하고, 제2 중쇄 폴리펩타이드는 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIB에 대한 결합에 비해 인간 FcγRIIA에 대해 더 높은, 즉, 더 강한 결합 친화도를 나타낸다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 항체는 인간 FcγRIIA에 결합하며, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIB에 대한 결합에 비해 더 낮은 KD 값을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 10 내지 30μM의 KD 값을 갖고서 25℃에서 인간 FcγRIIA에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 100 내지 250μM의 KD 값을 갖고서 25℃에서 인간 FcγRIIB에 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRI에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 거의 또는 전혀 나타내지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIII에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 시험관내 검정은 표면 플라스몬 공명 검정이다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 항체-의존적-세포성 세포독성 (ADCC)을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 무시할 정도의 항체-의존적-세포성 세포독성 (ADCC)을 나타내거나 검출 가능한 항체-의존적-세포성 세포독성 (ADCC)을 전혀 나타내지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정에서 세포 용해의 측정에 의해 결정되는 바와 같이, 50% 미만의 세포독성을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 무시할 정도의 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내거나 검출 가능한 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 전혀 나타내지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여, NK 세포 또는 대식세포와 같은 Fc 수용체를 지닌 세포의 감소된 T 세포-매개된 사멸을 유도한다.
특정 실시형태에서, 항체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여, NK 세포 또는 대식세포와 같은 Fc 수용체-함유 세포에 의해 매개된, T-세포의 감소된 사멸을 유도한다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정에서 KD의 측정에 의해 결정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화도보다 더 강한 인간 FcγRIIA에 대한 결합 친화도를 나타내며, 인간 FcγRIIA에 대한 결합 친화도는 인간 FcvRI에 대한 이의 결합 친화도보다 강하고, 인간 FcvRI에 대한 결합 친화도는 인간 FcvRIII에 대한 이의 결합 친화도보다 강하거나 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIA > 인간 FcγRIIB > 인간 FcγRI >= 인간 FcvRIII에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정에서 KD의 측정에 의해 결정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화도보다 강한 인간 FcγRIIA에 대한 결합 친화도를 나타내고, 인간 FcγRIIB에 대한 결합 친화도는 인간 FcvRIII에 대한 이의 결합 친화도보다 강하고, 인간 FcvRIII에 대한 결합 친화도는 인간 FcγRI에 대한 이의 결합 친화도보다 강하거나 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 항체는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 인간 FcγRIIA > 인간 FcγRIIB > 인간 FcγRIII >= 인간 FcγRI에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
몇몇 실시형태에서 인간 FcvRIII은 인간 FcγRIIIA 또는 인간 FcγRIIIB이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라성 Fc 도메인은 키메라성 힌지를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 항원-결합 도메인, 제2 항원-결합 도메인, 및 키메라성 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서, (a) 제1 항원-결합 도메인은 CD3에 결합하고, (b) 제2 항원-결합 도메인은 CD20에 결합한다. 본 발명의 특정 측면에서, 키메라성 CH 영역은, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하여, 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 대해 더 높은, 즉 더 강한 친화도로 결합한다. 또 다른 측면에서, 키메라성 CH는, 시험관내 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하여, 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 대해 더 낮은, 즉 더 약한 또는 전무한 친화도로 결합한다.
본 발명은 키메라성 힌지 영역을 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 몇몇 측면에서 키메라성 힌지 영역은 위치 216 내지 236 (EU 넘버링)의 아미노산 서열 잔기를 포함한다. 키메라성 힌지가 위치 228 내지 236 (EU 넘버링)의 인간 lgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA (서열번호 52)을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체가 작제된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 키메라성 힌지를 포함하고, 키메라성 힌지의 상부 힌지부는 lgG1 상부 힌지의 위치 216 내지 227 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 키메라성 힌지를 포함하고, 키메라성 힌지의 상부 힌지부는 lgG4 상부 힌지의 위치 216 내지 227 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이성 항체는 키메라성 힌지 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA (서열번호 53)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이성 항체는 키메라성 힌지 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA (서열번호 54)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이중특이성 항체는 위치 237 내지 340 (EU 넘버링)의 인간 lgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이성 항체는 인간 lgG1 CH3 도메인 또는 인간 lgG4 CH3 도메인으로부터 유도된 CH3 도메인을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 이중특이성 항체는 인간 lgG1 CH1 도메인 및 인간 lgG1 CH3 도메인을 포함한다. 더 많은 실시형태에서, 이중특이성 항체는 인간 lgG4 CH1 도메인 및 인간 lgG4 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 측면은 키메라성 불변 중쇄 영역을 포함하는 이중특이성 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 CD3 항원에 결합할 수 있는 제1 경쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 상기 핵산 분자는 제1의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 선택된 항원-특이성 항체의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 Ig의 CL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 함께 작동가능하게 연결된다); (b) 단계 (a)의 숙주 세포를 CD3 항원에 결합할 수 있는 항체의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 상기 핵산 분자는 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 인간 Ig의 키메라성 불변 CH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 Ig의 CH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 함께 작동가능하게 연결되고; 여기서, CH 영역은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 없애는 CH3 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 암호화한다); (c) 단계 (a)의 숙주 세포를 CD20 항원에 결합할 수 있는 항체의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 상기 핵산 분자는 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 인간 Ig의 키메라성 CH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 Ig의 CH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 함께 작동가능하게 연결된다); 및 (c) 상기 숙주 세포에서 (a) 및 (b)의 핵산 분자를 동시-발현시킴으로써 상기 항체를 제조하는 단계를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포를 (i) 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 핵산 분자는 서열번호 18을 포함하는 LCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 Ig의 불변 CL　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 항체의 LCVR 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 Ig의 CL　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다); (b) 단계 (a)의 숙주 세포를 (i) 상기 항체의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산 분자(여기서, 상기 핵산 분자는 서열번호 10을 포함하는 HCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 IgG의 키메라성 CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 또는 서열번호 32를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, HCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다); 및 (ii) 상기 항체의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산 분자(여기서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2를 포함하는 HCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 IgG의 키메라성 CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 또는 서열번호 32를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, HCVR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 CH　영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다)로 형질감염시키는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에서 (a) 및 (b)의 핵산 분자를 동시-발현시켜 항체를 제조하는 단계에 의해 이중특이성 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, 상기 방법은 단계 (b)의 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 항체는 세포 배양 배지로 분비된다); 및 세포 배양 배지로부터 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 단계 (a)의 숙주 세포를 CD20 항원에 결합할 수 있는 제2 경쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 상기 핵산 분자는 제2 경쇄의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 제2 경쇄의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 Ig의 CL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 함께 작동가능하게 연결된다)를 임의로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 제1 중쇄는 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해 H435R)을 포함하는 CH3 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 중쇄는 Y96F 변형 (IMGT; EU 넘버링에 의해 Y436F)을 추가로 포함하는 CH3 영역을 포함한다. 더 많은 실시형태에서, 상기 방법은 단백질 A를 사용하여 항체를 분리함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 제1 표적 항원을 인식하고 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 중쇄, (b) 제2 표적 항원을 인식하고 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 중쇄, 및 (c) 제1 또는 제2 표적 항원을 인식하고 결합할 수 있는 공통 경쇄 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서, (a) 또는 (b) 또는 (a)와 (b) 둘 다의 중쇄는 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 힌지 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 중쇄 불변 영역 (CH)은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라성 CH-암호화 뉴클레오티드 서열은 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 또는 서열번호 33을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라성 CH 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 암호화한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, CH 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄-암호화 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-암호화 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 38 또는 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-암호화 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-암호화 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 이중특이성 항체는 서열번호 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-암호화 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 치료학적 유효량의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자와 제2 치료제의 병용물인 조성물을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에서, 제2 치료제는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자와 유리하게 병용되는 임의의 제제이다. 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자와 유리하게 병용될 수 있는 예시적인 제제는 본원의 다른 곳에 상세하게 논의되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 사용하여 CD20을 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸하기 위한 치료학적 방법을 제공하며, 여기서, 치료학적 방법은 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함한다. 몇몇 경우에, 이중특이성 항원-결합 분자 (예를 들면, 항체)는 CD20을 발현하는 인간 세포에 결합하거나 인간 B-세포에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이중특이성 항체를 제공하며, 여기서, 상기 항체는 인간 CD3을 발현하는 인간 세포 및 사이노몰거스 CD3을 발현하는 사이노몰거스 원숭이 세포에 결합하거나; 인간 T-세포 또는 사이노몰거스 T-세포에 결합하거나; 1x10-12　M 내지 1x10-6　M의 EC50 값으로 CD3-발현 인간 T-세포에 결합하거나; 1x10-9　M 내지 1x10-8　M의 EC50 값으로 CD3-발현 인간 T-세포에 결합하거나; 1x10-12　M 내지 1x10-6　M의 EC50 값으로 CD20-발현 인간 B-세포에 결합하거나; 1x10-9　M 내지 1x10-8　M의 EC50 값으로 CD20-발현 인간 B-세포에 결합하거나; 항-CD20-매개된 세포독성에 내성이거나 난치성인 인간 B-세포의 T-세포 매개된 세포독성을 증진시킨다.
본 발명의 다양한 방법 또는 용도에서, 이중특이성 항체를 적어도 약 0.01 mg/kg의 용량으로 대상체에 단일 투여하면 대상체에 이중특이성 항체를 투여한지 약 2일까지 대상체에서 B-세포의 수가 검출 가능한 수준 이하로 감소된다. 몇몇 경우에, B-세포의 수는 적어도 약 0.01 mg/kg의 단일 용량의 이중특이성 항체를 대상체에 투여한 후 적어도 약 7일까지 검출 가능한 수준 이하로 유지된다.
본 발명은 CD20을 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸하기 위한, 및 CD20 발현과 관련되거나 이에 의해 야기되는 질환 또는 장애의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자의 용도를 포함한다. 몇몇 경우에, 본 발명의 이중특이성 항체는 대상체에서 암을 치료하거나 개선하기 위한 약제의 제조에 사용되며, 여기서, 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 Fc 도메인을 포함하고, 암을 치료 또는 개선하는 것은 (a) 대상체에서 종양 성장을 저해하거나, (b) 대상체에서 B-세포 용해를 매개하거나, (c) 대상체에서 B-세포 암을 치료하거나, (d) 대상체에서 CD20 발현에 대해 양성인 암을 치료하거나, (e) 대상체에서 CD20-발현 흑색종 암을 치료함을 포함한다.
본 발명은 또한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1 항원-결합 도메인, 제2 항원-결합 도메인, 및 키메라성 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 이중특이성 항체를 포함하며, 여기서, 제1 항원-결합 도메인은 CD3에 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 CD20에 결합하고, 키메라성 CH 영역은, 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하여, 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 더 높은, 즉 더 강한 친화도로 결합한다. 본 발명은 약제의 제조에 사용하기 위한, CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 인간 FcγRIIB에 결합하는 것보다 더 높은, 즉 더 강한 친화도로 인간 FcγRIIA에 결합하는 키메라성 CH 영역을 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
다른 실시형태들은 다음의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1은 키메라성 힌지 영역의 작제 및 상응하는 아미노산 넘버링 협회에서 사용되는 힌지 아미노산을 도시한다.
도 2는 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01857 (서열번호 45)에 IGHG1로서 기재된 바와 같은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 lgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01859 (서열번호 46)에 IGHG2로서 기재된 바와 같은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 lgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01861 (서열번호 47)에 IGHG4로서 기재된 바와 같은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 lgG4 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5a 및 5b: 야생형 또는 키메라성 힌지 CH　영역을 갖는 항체의 존재하에서 Daudi (도 5a) 및 Raji (도 5b) 세포에 대한 CDC 활성의 부족을 도시한 용량-반응 곡선. ("대조군" 항체 4 = wt lgG1 CH를 갖는 이중특이성 Ab; 항체 1; 항체 2; lgG1 동형 대조군 = wt lgG1 CH를 갖는 비특이성 Ab.)
도 6a 및 6b: 야생형 또는 키메라성 힌지 CH　영역을 갖는 항체의 존재하에서 Daudi (도 6a) 및 Raji (도 6b) 세포에 대한 ADCC 활성의 부족을 도시한 용량-반응 곡선. ("대조군" 항체 4 = wt lgG1 CH를 갖는 이중특이성 Ab; 항체 1; 항체 2; lgG1 동형 대조군 = wt lgG1 CH를 갖는 비특이성 Ab.)
도 7a-7f는 Raji 종양 세포와 PBMC (또는 무 PBMC 대조군 - 도 7d)의 혼합물이 피하 이식된 NSG 마우스에서의 경시적인 종양 체적(mm3)을 보여주는 반면 본 발명의 CD3xCD20 이중특이성 항체(Ab1) 또는 비히클 또는 대조군 항체는 동일자의 종양 이식(0일째)을 시작으로 하여 종양 이식 및 치료 후 투여하였으며, 연구 기간 동안 측정하였다. 도 7a: 어떠한 마우스도 비히클 처리로 종양 성장 억제를 나타내지 않았다; 도 7b: 5마리 중 1마리 (1/5) 마우스는 0.4 mg/kg 대조군 Ab5 (항-FelD1 Ab) 처리로 종양 성장 억제를 나타내었다; 도 7c: 5/5 마우스는 0.4 mg/kg 항체 1(Ab1) 처리로 종양 성장 억제를 나타내었다; 도 7d: 0/5 마우스는 PBMC는 이식되지 않고 0.4 mg/kg Ab1 처리된 경우 종양 성장 억제를 나타내었다; 도 7e: 5/5 마우스는 0.04 mg/kg Ab1 처리로 종양 성장 억제를 나타내었다; 및 도 7f: 5/5 마우스는 0.004 mg/kg Ab1 처리로 종양 성장 억제를 나타내었다.
도 8a 및 8b는 Raji 종양 세포와 PBMC의 혼합물을 피하 이식하고 IgG 보충의 존재 또는 부재하에 비히클과 비교하여 Ab1 (CD3xCD20-키메라성 Fc)로 처리(도 8a)하거나, 또는 IgG 보충의 존재 또는 부재하에 비히클과 비교하여 Ab4 (CD3xCD20-wtFc)로 처리(도 8b)한 NSG 마우스에서의 경시적인 종양 체적(mm3)을 보여준다. CD3xCD20 이중특이성 항체 둘 다는 이 모델에서 IgG 보충으로 상당한 종양 성장 억제를 입증한다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, CD3xCD20-키메라성 Fc 이중특이성 항체 (Ab1)는 이 실험에서 IgG 보충의 존재 또는 부재하에서 시험된 기간에 걸쳐 완전한 종양 성장 억제를 입증한다.
도 9는 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 NSG 마우스에서 14일까지의 확립된 종양(~200-400 mm3)의 퇴화를 도시한다. NSG 마우스를 치료하기 15일 전에 Raji 종양 세포와 PBMC의 혼합물로 피하 이식하여 종양이 확립되도록 하였다. 마우스를 후속적으로 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc 항체), 또는 0.4 mg/kg 대조군 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비히클 대조군으로 주 1회(7일째, 14일째, 21일째) 처리하였다.
도 10은 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 NSG 마우스에서 21일째까지의 확립된 종양(~500-900 mm3)의 퇴화를 도시한다. NSG 마우스를 치료하기 15일 전에 Raji 종양 세포와 PBMC의 혼합물로 피하 이식하여 종양이 확립되도록 하였다. 마우스를 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc 항체), 또는 0.4 mg/kg 대조군 Ab5 (항-FelD1 Ab)로 주 1회(7일째, 14일째, 21일째) 처리하였다.
도 11a 및 11b는 7일간 연구에서 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중의 CD20+ B-세포 수준 또는 CD3+ T-세포 수준의 변화를 측정함으로써 단일특이성 항체 투여 (리툭시맙)와 비교하여 항체 1 및 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체 투여의 생체내 효능을 도시한다. 항체 또는 위약을 0일째에 투여하였다. 도 11a: 말초 혈액 중의 B-세포 수준은 위약을 제외한 모든 샘플에서 2일까지 상당히 고갈되었다; 도 11b: 이중특이성 항체로 처리한 동물의 말초 혈액에서 T-세포의 일시적인 손실이 2일까지 관찰되었으며 4일까지 기준선 수준으로 회복되었다. T-세포의 (기준선 아래로) 손실은 위약 또는 리툭시맙 (리툭산) 그룹에서 관찰되지 않았다.
도 12a 및 12b는 장기간 (3개월) 연구에서 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중의 CD20+ B-세포 수준 또는 CD3+ T-세포 수준의 변화를 측정함으로써 항체 1 및 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체 투여의 생체내 효능을 도시한다. 위약 (비히클) 또는 이중특이성 항체를 0일째에 1.0 mg/kg으로 투여하였다. 도 12a: 말초 혈액 중의 B-세포 수준은 2일까지 상당히 고갈되었으며 수준은 위약을 제외한 모든 샘플에서 연구 기간에 걸쳐 고갈된 채로 유지되었다; 도 12b: T-세포의 일시적인 손실이 2일까지 관찰된 다음 4일까지 T-세포가 기준선 수준으로 회복되고, 이중특이성 항체로 처리한 동물에 대해 연구 전반에 걸쳐 측정된 바와 같이(> 80일) 기준선 주위에서 유지되었다. T-세포의 일시적인 손실은 위약으로 처리한 동물에서 관찰되지 않았다.
도 13a 및 13b는 장기간 (2개월) 연구에서 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중의 CD20+ B-세포 수준 또는 CD3+ T-세포 수준의 변화를 측정함으로써 항체 1 및 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체 저 용량 투여의 생체내 효능을 도시한다. 이중특이성 항체를 0일째에 0.01 mg/kg 또는 0.001 mg/kg (1㎍/kg)으로 투여하였다. 도 13a: 말초 혈액 중의 B-세포 수준은 2일까지 상당히 고갈되었으며 수준은 보다 고용량의 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 동물에 대해 관찰된 바(도 11a 또는 12a 참조)와 유사하게, 연구 기간에 걸쳐 고갈된 채로 유지되었다; 도 13b: 매우 저 용량(1㎍/kg)의 이중특이성 항체로 처리한 동물은 보다 고 용량의 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 동물에서 보여지는 바와 같이(도 11b 또는 12b 참조) 동일한 일시적인 T-세포의 손실 및 회복을 경험한다.
도 14는 CD3xCD20-키메라성 Fc 항체 1로 처리한 동물의 말초 혈액에서의 B-세포 손실과 항체의 손실의 상관성을 보여준다. 동물의 순환에서 항체 노출(개방 기호)이 경시적으로 고갈됨에 따라, B-세포 집단(채워진 기호)은 회복되기 시작한다(예를 들면, 동물 번호 106881(채워진 원)에 대해 81일째에 관찰된 바와 같음).
도 15는 CD3xCD20-키메라성 Fc 항체 2로 처리한 동물의 말초 혈액에서의 B-세포 손실과 항체의 손실의 상관성을 보여준다. 동물의 순환에서 항체 노출(개방 기호)이 경시적으로 고갈됨에 따라, B-세포 집단(채워진 기호)은 회복되기 시작한다(예를 들면, 동물 번호 I06876 (채워진 삼각형)에 대해 66일째에, 및 동물 번호 I06877 (채워진 사각형)에 대해 68일째에 관찰된 바와 같음).
도 16은 CD3xCD20-wtFc (Ab 4) 이중특이성 항체로 처리한 동물의 말초 혈액에서의 B-세포 손실과 항체의 손실의 상관성을 보여준다. 동물의 순환에서 항체 노출(개방 기호)이 경시적으로 고갈됨에 따라, B-세포 집단(채워진 기호)은 회복되기 시작한다(예를 들면, 동물 번호 I06870 (채워진 삼각형)에 대해 91일째에, 및 동물 번호 I06872 (채워진 원)에 대해 64일째에 관찰된 바와 같음).
도 17a 및 17b는 이중특이성 코호트에 훨씬 더 적은 용량 (0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)을 투여하여, 항-CD20 단일특이성 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이성 항체의 투여로부터 야기되는 사이노몰거스 원숭이의 비장 (도 17a) 또는 장간막 림프절 (도 17b)에서의 조직 B-세포의 고갈을 도시한다. 이러한 고갈은 조직의 위약 대조군 동물 코호트에서는 보이지 않았다. CD3xCD20 이중특이성 항체 둘 다 (Ab1 및 Ab4)는 림프 기관에서 용량-의존적 B-세포 고갈을 야기하였으며, 0.1 mg/kg 이상의 용량에서, 이중특이성 항체는 리툭시맙보다 더 효과적으로 B-세포를 고갈시킨다.
도 18a 및 18b는 CD3xCD20 이중특이성 항체는 시험관내 생검에서 인간 PBMC(도 18a) 또는 사이노몰거스 PBMC(도 18b)의 증식을 유도하는 반면 대조군 항체 5( -▲- ; CD3xCD20에 특이적이지 않음)는 활성을 나타내지 않았음을 예시한다.
도 19a 및 19b는 세포독성 검정에서 CD3xCD20-매개된 Raji 표적 사멸을 예시한다. 항체 1은 인간(도 19a) 및 사이노몰거스(도 19b) T 세포에 대해 각각 25.0pM 및 9.1 OpM의 대표적인 EC50　값으로 표적 세포 사멸을 매개하였다. 항체 4는 인간(도 19a) 및 사이노몰거스(도 19b) T 세포에 대해 각각 15.7pM 및 1.73pM의 대표적인 EC50　값으로 표적 세포 사멸을 매개하였다. 대조군(-▲-)의 활성을 관찰되지 않았다.
도 20a 및 20b는 CD3xCD20 이중특이성 항체가 미접촉(naive) T-세포에 의해 세포 사멸을 매개함을 예시한다. 도 20a는 항체 4의 최고 시험 농도에서의 대표적인 FACS 산점도를 보여준다. B16F10.9 야생형 세포는 CFDA-SE로 표지하고 B16F10.9/CD20 세포는 바이올렛 세포 추적자(Violet Cell Tracker)로 표지한다. 효과기 세포는 표지하지 않는다. 도 20a의 제2 패널은 CD20-발현 세포가 항-CD3xCD20으로의 처리에 의해 없어진다(우측 하단 사분구간)는 것을 보여준다. 도 20b는 CD20xCD3 항체, 즉, 항체 4 (wtFc), 항체 1 (키메라성 Fc) 또는 대조군 Ab 5, 및 PBMC의 존재하에서 48시간 후 B16F10.9/CD20 세포를 생존시키는 비율을 보여준다. 생존 퍼센트는 살아있는 세포 집단에서 B16F10.9/CD20 세포의 퍼센트를 CD20 음성 B16F10.9 세포와 비교함으로써 구하였다. Ab 4 및 Ab 1은 인간 T 세포를 특이적으로 지시하여 세포의 혼합 집단에서 CD20을 발현하는 표적 세포만 사멸시킨다(도 20b). 표적 세포 사멸은 단지 이중특이성 항체의 존재하에서 관찰되었으며, B16F10.9/CD20 세포는 항체 4 (EC50 12.8pM) 및 항체 1 (EC50　19.5pM)에 의해 용량-의존적 방식으로 고갈되었다(도 20b). CD20-발현 세포의 5% 미만은 시험된 최고 용량(10 g/mL)에서 살아 있었다.
도 21은 B16F10.9/CD20 세포를 표적으로 하는 48시간 세포독성 검정에서 총 CD2+ 효능기 세포 중 활성화된 (CD69+) 세포의 퍼센트를 보여주며, 이때 이러한 활성화는 CD20xCD3 항체, 즉, 항체 4 (wtFc) 또는 항체 1 (키메라성 Fc)에 의해 유도된다.
도 22a 및 22b는 CD3xCD20 이중특이성 항체가 이중특이성 결합 아암을 통해 표적 세포 (CD20+ 세포)로 T-세포의 군집화를 유도하였음을 예시한다. 효과기 세포는 CFSE로 염색하고 CD20+ 세포는 바이올렛 세포 추적자로 염색하고 게이팅하여 사분구간을 분리한다. 무관한 대조군 항체(대조군 항체 5)와 항온처리한 후, 군집화(이중-염색)는 세포 혼합물에서 나타나지 않았다(도 22a). CD3xCD20 이중특이성 항체(Ab 4)와 항온처리 후, 세포 군집이 보이는데, 그 이유는 이들이 CFSE 및 바이올렛 둘 다로 염색되기 때문이다(굵은 사각형으로 강조된 바와 같이, 도 22b의 산점도 상의 좌측 상단 사분구간 참조).
도 23은 Raji 종양 세포와 PBMC의 혼합물을 피하 이식한 NSG 마우스에서의 종양 체적(mm3) 연구를 보여주는 반면 0.4 mg/kg, 2X/주 (i.p)의 본 발명의 CD3xCD20 이중특이성 항체(Ab 1), 0.4 mg/kg, 2X/주 (i.p)의 무관한 항체 대조군 Ab 6, 또는 비히클을 8 mg/kg, 5X/주 (i.p)의 리툭시맙, 항-CD20 항체, 및 0.5 mg/kg, 5X/주 (i.v)의 CD19xCD3 BiTE와 비교하였다. (CD19xCD3 BiTE에 대해, 문헌(Nagorsen D, 등 Pharmacol Ther. 2012 Dec;136(3):334-42, 2012) 참조). 치료제는 확립된 종양(~100-500 mm3)을 가진 마우스에게 투여하였다. 데이터는 평균 (SEM)으로 표현되며 ANOVA 분석에 적용하였다. 이 생체내 모델에서, 주당 2x로 i.p. 복용시킨 Ab1은 5x/주 i.v. 복용시킨 CD19xCD3 BiTE의 효능에 필적하였다.
도 24는, 도 23과 유사하게, Raji/PBMC 혼합물을 피하 이식한 NSG 마우스에서의 종양 체적(mm3) 연구를 보여주며, ANOVA 분석이 Ab 1, 대조군 Ab 6, 리툭시맙 및 비히클 대조군에 대해 제공된다. 주당 2x로 복용된 Ab 1은 확립된 Raji 종양을 저해하는데 있어서 리툭시맙 요법(8 mg/kg; 5x/주 i.p.로 복용됨)보다 우수하였다.
도 25a 및 25b는 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 인간화 마우스에서 hCD20/B16F10.9 종양 이식과 동시에 또는 순차적으로 치료가 개시되었을 때의 지연된 종양 성장을 예시한다. 도 25a: hCD3 마우스를 hCD20-형질도입된 B16F10.9 흑색종 세포로 피하 이식하고 0.004 mg/kg 또는 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc 항체), 또는 4 mg/kg 대조군 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비히클 대조군 (i.p. 주당 2회)로 동시에 처리하였다. 도 25b: hCD3 마우스를 hCD20/B16F10.9 흑색종 세포로 피하 이식하였으며, 확립된 종양을 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc 항체) 또는 대조군으로 10일째 또는 그후에 처리하였다. 마우스를 0.4 mg/kg 또는 4 mg/kg Ab1, 또는 0.4 mg/kg 대조군 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비히클 대조군으로 주당 2회 i.p. 처리하였다.
상세한 설명
본 발명을 기술하기 전에, 기술되는 특정 방법 및 실험 조건은 변할 수 있으므로 본 발명은 이러한 방법 및 조건에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에서 사용되는 용어는, 특정 실시형태를 기술할 목적만을 위한 것이고, 제한하도록 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은, 특정의 인용된 수치와 관련하여 사용되는 경우에, 상기 값은 인용된 값으로부터 1% 이하만큼 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "약 100"은 99 및 101, 그리고 이들 사이의 모든 값들(예를 들면, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실행 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술된다.
정의
본원에서 사용되는 표현 "CD3"은, 다중분자 T 세포 수용체(TCR)의 일부로서 T 세포 상에 발현되고, 4개의 수용체 쇄들: CD3-엡실론, CD3-델타, CD3-제타, 및 CD3-감마 중 2개의 회합으로부터 형성된 동종 이량체 또는 이종 이량체로 이루어진 항원을 말한다. 본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 참조는, 비-인간 종 유래인 것으로 명백하게 명시되지 않는 한 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버젼을 나타내는 것으로 의도된다. 따라서, 표현 "CD3"은, 비-인간 종 유래인 것, 예를 들면, "마우스 CD3", "원숭이 CD3" 등으로 명시되지 않는 한 인간 CD3을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "CD3에 결합하는 항체" 또는 "항-CD3 항체"는, 단일 CD3 서브유닛(예를 들면, 엡실론, 델타, 감마 또는 제타)을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 2개의 CD3 서브유닛의 이량체성 복합체(예를 들면, 감마/엡실론, 델타/엡실론, 및 제타/제타 CD3 이량체)를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 가용성 CD3 및/또는 세포 표면 발현된 CD3에 결합할 수 있다. 가용성 CD3은 천연 CD3 단백질 뿐만 아니라 막관통 도메인이 결여되어 있거나 그렇지 않으면 세포막과 회합되어 있지 않은, 재조합 CD3 단백질 변이체, 예를 들면, 단량체성 및 이량체성 CD3 작제물을 포함한다.
본원에서 사용되는 표현 "세포 표면-발현된 CD3"은, CD3 단백질의 적어도 일부가 세포막의 세포외측에 노출되어 항체의 항원-결합부에 접근 가능하도록 시험관내에서 또는 생체내에서 세포의 표면 상에 발현되는 하나 이상의 CD3 단백질(들)을 의미한다. "세포 표면-발현된 CD3"은, 세포의 막에서 기능성 T 세포 수용체의 내용물 내에 함유된 CD3 단백질을 포함한다. 표현 "세포 표면-발현된 CD3"은, 세포의 표면 상의 동종 이량체 또는 이종 이량체의 부분(예를 들면, 감마/엡실론, 델타/엡실론, 및 제타/제타 CD3 이량체)으로서 발현되는 CD3 단백질을 포함한다. 또한, 표현 "세포 표면-발현된 CD3"은, 세포의 표면 상에 다른 CD3 쇄 유형의 부재시 자체로 발현되는 CD3 쇄(예를 들면, CD3-엡실론, CD3-델타 또는 CD3-감마)를 포함한다. "세포 표면-발현된 CD3"은, 보통 CD3 단백질을 발현하는 세포의 표면 상에 발현되는 CD3 단백질을 포함하거나 이러한 CD3 단백질로 구성될 수 있다. 대안으로, "세포 표면-발현된 CD3"은, 보통 이의 표면 상에 인간 CD3을 발현하지 않지만 이의 표면 상에 CD3을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면 상에 발현되는 CD3 단백질을 포함하거나 이러한 CD3 단백질로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "항-CD3 항체"는, 단일 특이성을 갖는 1가의 항체, 및 CD3에 결합하는 제1 아암 및 제2 (표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이성 항체 둘 다를 포함하고, 여기서, 항-CD3 아암은, 본원의 표 1 또는 표 2에 제시된 바와 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열들 중 임의의 서열을 포함한다. 항-CD3 이중특이성 항체의 예는 본원의 다른 곳에 기술된다. 용어 "항원-결합 분자"는, 예를 들면, 이중특이성 항체를 포함하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 예시적인 항-CD3 항체는 또한 제US 2007/0280945A1호; 및 2013년 9월 19일자로 출원된 PCT 공개 출원 제PCT/US13/60511호에 기재되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "CD20"은 비-인간 종(예를 들면, "마우스 CD20", "원숭이 CD20" 등) 유래인 것으로 명시되지 않는 한 인간 CD20 단백질을 말한다. 인간 CD20 단백질은 NCBI 참고 서열 NP 690605.1에서와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 사용되는 표현 "항-CD20 항체"는 US 제7,879,984호에 기재된 바와 같이, 리툭산(리툭시맙)과 같은 단일 특이성을 지닌 1가 항체를 포함한다. 예시적인 항-CD20 항체는 또한 US 제7,879,984호 및 2013년 9월 19일자로 출원된 PCT 국제 출원 제PCT/US13/60511호에 기재되어 있으며, 각각은 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 특정 항원(예를 들면, CD3)에 특이적으로 결합하거나 특정 항원과 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 이의 다량체(예를 들면, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약기함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약기함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 칭하는 보다 보존된 영역들 사이에 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 칭하는 초가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항-CD3 항체(또는 이의 항원-결합부)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 2개 이상의 CDR들의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석에 근거하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 완전 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합부", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 완전 항체 분자로부터 임의의 적합한 표준 기술, 예를 들면, 단백질분해성 소화 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현에 관여하는 재조합 유전자 조작 기술을 이용하여 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들면, 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들면, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 서열분석되고 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 이용함으로써 조작되어, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 입체배치로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성시키거나, 아미노산 등을 변형, 부가, 또는 결실시킬 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들면, CDR3 펩타이드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드로 이루어진 최소 인식 단위. 또한, 다른 조작된 분자, 예를 들면, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들면, 1가의 나노바디, 2가의 나노바디 등), 소형 모듈 면역 약제(SMIP: samll modular immunopharmaceutical), 및 상어 가변 IgNAR 도메인도 본원에서 사용되는 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성물로 이루어질 수 있고, 일반적으로, 하나 이상의 프레임워크 서열과 인접하거나 하나 이상의 프레임워크 서열과 프레임 내에 존재하는, 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치될 수 있다. 예를 들면, 가변 영역은 이량체성일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 단편 (Fc) 도메인에 공유 결합되거나 달리 Fc 도메인에 매여진 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 용어 "에 매여진(tethered to)"은 불변 도메인에 매여진 가변 도메인과 같이 두 개의 성분을 함께 묶기 위한, 공유 결합, 또는 링커 폴리펩타이드 서열을 통한 직접적인 연결을 말한다. 따라서, 특정 예에서, CD3 및 CD20에 결합하여 이중특이성 항체를 형성하는 것과 같은 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 가변 도메인은 공유 결합 또는 링커 아미노산 서열을 통해, 예를 들면, (N-말단에서 C-말단으로) 완전 또는 부분 CH1, 키메라성 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 각각 직접적으로 연결된다(또는 매여진다). 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적인 입체배치는 다음을 포함한다 : (i) VH-CH1-힌지-CH2-CH3; (ii) VH-힌지-CH2-CH3; (iii) VH-CL; (iv) VL-Ch1 -Ch2-CH3; (V) VL-Ch2-Ch3; 및 (vi) VL-CL. 상기 열거된 예시적인 입체배치 중 임의의 것을 포함하는, 가변 및 불변 도메인의 임의의 입체배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로에 대해 직접적으로 링크될 수 있거나, 본 발명의 완전 또는 부분 키메라성 힌지에 의해, 또는 완전 또는 부분 CH1 및 키메라성 힌지에 의해 연결될(매여질) 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩타이드 링커(예를 들면, 2 내지 10개 아미노산)는 가변 및 Fc 도메인과 연결될(매여질) 수 있거나, 완전 또는 부분 키메라성 힌지 및/또는 CH1과 추가의 연결을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자 내에 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이의 가요성(flexible) 또는 반-가요성(semi-flexible) 연결을 초래하는 적어도 상부 및 하부 힌지 아미노산으로 이루어질 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 입체배치 중 임의의 것의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 기타 다량체)를 서로의 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과의 비-공유적 회합으로(예를 들면, 디설파이드 결합(들)에 의해) 포함할 수 있다.
본원에 개시된 예시적인 이중특이성 항체 포맷을 포함한 본 발명의 다중특이성 항체 포맷은 전형적으로 적어도 두 개의 상이한 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 다중특이성 포맷은 당업계에서 이용 가능한 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 조정될 수 있다.
본 발명의 항체는 시험관내에서 측정되는 바와 같이 감소된 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 갖거나 갖지 않도록 변형된다. "보체-의존적 세포독성"(CDC)은 보체의 존재시 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 말한다. "항체-의존적 세포-매개된 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)(예를 들면, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)를 발현하는 비특이성 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지함으로써 표적 세포의 용해를 초래하는, 세포-매개된 반응을 말한다. CDC 및 ADCC는 당업계에 익히 공지되어 있고 이용가능한 검정을 이용하여 측정할 수 있다. (예를 들면, U.S. 특허 제5,500,362호 및 제5,821,337호, 및 문헌[Clynes 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656)] 참조). 항체의 중쇄 불변 영역(CH)은, 보체를 고정하고 세포-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 CH는 세포독성을 매개하는 것이 항체에 바람직한지의 여부에 근거하여 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들면, CDR에서 그리고 특정 CDR3에서 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항체는, 몇몇 실시형태에서, 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들면, 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현되는 항체(하기에 추가로 기술됨), 재조합 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(하기에 추가로 기술됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들면, 문헌[Taylor 등 (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 다른 DNA 서열에의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(스플리싱)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자전이된 동물이 이용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이 유발)되고, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이들과 관련되어 있지만, 생체내 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이질성(heterogeneity)과 관련된 2개의 형태로 존재할 수 있다. 하나의 형태에서, 면역글로불린 분자는 이량체들이 쇄간 중쇄 디설파이드 결합에 의해 함께 고정된 대략 150 내지 160kDa의 안정한 4개의 쇄 작제물을 포함한다. 제2 형태에서, 이량체들은 쇄간 디설파이드 결합을 통해 연결되지 않고, 약 75 내지 80kDa의 분자는 공유적으로 커플링된 경쇄 및 중쇄(반-항체(half-antibody))로 이루어져 형성된다. 이들 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기가 매우 곤란하였다.
각종 온전한 IgG 이소타입에서의 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소타입과 관련된 구조적 차이에 기인한 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은, 인간 IgG1 힌지를 이용하여 전형적으로 관찰되는 수준으로 제2 형태의 출현을 유의적하게 감소시킬 수 있다(문헌 참조; Angal 등 (1993) Molecular Immunology 30:105). 본 발명은, 예를 들면, 생산시 원하는 항체 형태의 수율을 개선시킬 수 있는 힌지 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함한다.
발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 이의 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들면, 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생성되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체가, 본 발명의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 또한, 단리된 항체는 재조합 세포 내의 동일반응계(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 행한 항체이다. 특정 실시형태에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
본원에 개시되는 항-CD3 또는 항-CD20 가변 영역은, 항체들이 유도된 상응하는 생식선 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들면, 본원에 개시된 아미노산 서열을 공공의 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식선 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열들 중 임의의 서열로부터 유도되는 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 이들 항체들이 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환에 대해 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본원에서 총체적으로 "생식선 돌연변이"라고 함). 당업게의 통상의 숙련가는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, VH　및/또는 VL　도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기 전부는, 항체가 유도된 본래 생식선 서열에서 발견된 잔기로 역 돌연변이된다. 또 다른 실시형태에서, 특정 잔기들만이, 예를 들면, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이, 또는 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이 본래 생식선 서열로 역 돌연변이된다. 또 다른 실시형태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은, 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 본래 유도된 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 게다가, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들면, 여기서, 특정 개별 잔기들은 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이되는 반면 본래 생식선 서열과 상이한 특정의 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은, 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 향상된 길항제 또는 효능제 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시되어 있는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 서열의 변이체를 포함하는 항-CD3 또는 항-CD20 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본원의 표 1에 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 서열에 대하여, 예를 들면, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-CD3 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 파라토프로서 공지된 항체 분자의 가변 영역에서의 특정 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원성 결정인자를 말한다. 단일 항원은 1개 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 구역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체배좌 또는 선형일 수 있다. 입체배좌 에피토프는 선형 폴리펩타이드 쇄의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 제조된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 제조된 에피토프이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상의 사카라이드, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹의 모이어티들을 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 나타내는 경우의 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)으로의 결실로 최적으로 정렬되는 경우, 서열 동일성의 임의의 익히 공지되어 있는 알고리즘, 예를 들면, 하기에 논의되는 바와 같은 FASTA, BLAST, 또는 Gap에 의해 측정되는 바와 같이, 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다. 기준 핵산 분자에 대해 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 예에 있어서, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용되는 바와 같은 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 2개의 펩타이드 서열들, 예를 들면, 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 95%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환이 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은, 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 서열 동일성 퍼센트 또는 유사성 정도를 상향 조정하여 치환의 보존적 성질을 교정할 수 있다. 이러한 조정을 이루기 위한 수단은 당업계의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는, 문헌[Gonnet 등 (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시되어 있는 PAM250 로그-우도(log-likelihood) 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도 보존적" 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성이라고도 하는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 각종 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정값을 이용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련되어 있는 폴리펩타이드, 예를 들면, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩타이드 사이의 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 프로그램, 예를 들면, Gap 및 Bestfit을 함유한다. 예를 들면, GCG 버젼 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버젼 6.1의 프로그램인 디폴트 또는 권장 파라미터를 이용한 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 서열과 검색 서열 사이의 최고 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(Pearson (2000) supra). 상이한 유기체 유래의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 본 발명의 서열을 비교하는 경우의 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히, BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 문헌[Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-402]을 참조한다.
이중특이성 항원-결합 분자
본 발명의 항체는 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 1개 초과의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tutt 등, 1991 , J. Immunol. 147:60-69; Kufer 등, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]을 참조한다. 본 발명의 항-CD3xCD20 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 이들과 동시-발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 분자 실체(entity), 예를 들면, 다른 항체 또는 항체 단편에 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 회합 또는 기타에 의해) 기능적으로 연결되어 추가의 결합 특이성을 갖는 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역글로불린의 하나의 아암은 인간 CD3에 결합하고, 면역글로불린의 다른 아암은 표적 항원에 대해 특이적인 이중특이성 항체를 포함한다. CD3 이중특이성 항체의 다른 아암이 결합하는 표적 항원은, 표적화된 면역 반응이 요구되는 세포, 조직, 기관, 미생물 또는 바이러스 상에 또는 이들의 부근에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. CD3-결합 아암은 본원의 표 1에 제시된 바와 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열들 중 어느 것을 포함할 수 있다.
항체의 하나의 아암은 CD3에 결합하고 다른 아암은 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이성 항체의 맥락에서, 표적 항원은 종양-관련 항원일 수 있다. 특이 종양-관련 항원의 비제한적인 예는, 예를 들면, AFP, ALK, BAGE 단백질, BIRC5 (서비빈), BIRC7, β-카테닌, brc-abl, BRCA1 , BORIS, CA9, 탄산 무수화효소 IX, 카스파제-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, 사이클린-B1, CYP1 B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질(예를 들면, GAGE-1 , -2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE- A3, hTERT, LMP2, MAGE 단백질(예를 들면, MAGE-1 , -2, -3, -4, -6, 및 -12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Mud, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Mud 6(CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, 톰슨-누벨(Thompson-nouvelle) 항원 (Tn), TRP-1 , TRP-2, 티로시나제, 및 유로플라킨-3을 포함한다.
항체의 하나의 아암은 CD3에 결합하고 다른 아암은 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이성 항체의 맥락에서, 표적 항원은 감염성 질환-관련 항원일 수 있다. 감염성 질환-관련 항원의 비제한적인 예는, 예를 들면, 바이러스 입자의 표면 상에 발현되거나 바이러스로 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원을 포함하고, 여기서, 바이러스는 HIV, 간염(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들면, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로, 상기 표적 항원은 박테리아의 표면 상에 발현되거나 박테리아로 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원일 수 있고, 여기서, 박테리아는 클라미디아, 리케차, 마이코박테리아, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 뉴모노코커스, 메닝고코커스, 고노코커스, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 테타누스, 보툴리즘, 탄저병, 플라그, 렙토스피라, 및 라임 질환 박테리아로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 항원은 진균의 표면 상에 발현되거나 진균으로 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원이고, 여기서, 상기 진균은 칸디다(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스 등), 크립토코커스 네오포르만스, 아스페르길루스(푸미가투스, 니게르, 등), 뮤코랄레스(뮤코르, 압시디아, 리조푸스 등), 스포로트릭스쉔키이, 블라스토마이세스 더마티티디스, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 콕시디오이데스 이미티스, 및 히스토플라스마 캡슐라툼으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 항원은 기생충의 표면 상에 발현되거나 기생충으로 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원이고, 여기서, 상기 기생충은 엔타모에바 히스톨리티카, 발란티디움 콜라이, 나에글레리아 파울레리, 아칸타모에바 sp., 기아르디아 람비아, 크립토스포리디움 sp., 뉴모시스티스 카리니이, 플라스모디움 비박스, 바베시아 미크로티, 트리파노소마 브루세이, 트리파노소마 크루지, 레이슈마니아 도노바니, 톡소플라스마 곤디이, 니포스트롱길루스 브라실리엔시스, 타에니아 크라시셉스, 및 브루기아 말라이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특이 병원체-관련 항원의 비제한적인 예는, 예를 들면, HIV gp120, HIV CD4, 간염 B 당단백질 L, 간염 B 당단백질 M, 간염 B 당단백질 S, 간염 C E1, 간염 C E2, 간세포-특이 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 gB, 사이토메갈로 바이러스 gB, 및 HTLV 외피 단백질을 포함한다.
특정 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명은 CD3 및 CD20에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 분자는, 예를 들면, "항-CD3/항-CD20" 또는 "항-CD3/CD20" 또는 "항-CD3xCD20" 또는 "CD3xCD20" 이중특이성 분자, 또는 다른 유사한 용어로서 본원에 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "항원-결합 분자"는, 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 CDR 및/또는 프레임워크 영역(FR)과 조합하여 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하거나 이들로 이루어진 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 분자는 이들 용어가 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같이 항체 또는 항체의 단편이다.
본원에서 사용되는 표현 "이중특이성 항원-결합 분자"는 적어도 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 이중특이성 항원-결합 분자 내의 각각의 항원-결합 도메인은, 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 CDR 및/또는 FR과 조합하여 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인은 제1 항원(예를 들면, CD3)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 제2 별개의 항원(예를 들면, CD20)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 특정의 예시적인 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체의 각각의 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인(HCVR) 및 경쇄 가변 도메인(LCVR)을 포함한다. 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자(예를 들면, 이중특이성 항체)의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인의 CDR은 접두사 "A1"으로 표기될 수 있고, 제2 항원-결합 도메인의 CDR은 접두사"A2"로 표기될 수 있다. 따라서, 제1 항원-결합 도메인의 CDR은 본원에서 A1-HCDR1, A1-HCDR2, 및 A1-HCDR3이라고 할 수 있고; 제2 항원-결합 도메인의 CDR은 본원에서 A2-HCDR1, A2-HCDR2, 및 A2-HCDR3이라고 할 수 있다.
제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어, Fc 도메인에 추가로 결합된 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자(즉, 이중특이성 ScFv)를 형성할 수 있다. 대안적으로, 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 각각 별도의 Fc 도메인에 연결될 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 전형적으로 각각 개별적으로 별도의 항체 중쇄의 일부인 두 개의 Fc 도메인을 포함할 것이다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 이종이량체성(즉, 이중특이성) 분자의 정제의 촉진 또는 용이함을 위해 의도된 CH3 도메인에 돌연변이를 가짐을 제외하고는 동일한 서열의 것일 수 있다.
본 발명은 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 결여된 이중특이성 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이성 항체의 결합을 감소시킨다. 하나의 실시형태에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 Ig CH3 도메인은 H435R 변형(EU 넘버링에 의함; IMGT 엑손 넘버링에 의하면 H95R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지시키는 변형을 함유한다. 제2 CH3은 Y436F 변형(EU 넘버링에 의함; IMGT에 의하면 Y96F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: lgG1 CH3 도메인의 경우 EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I (IMGT에 의하면 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I); 및 lgG4 CH3 도메인의 경우 EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I (IMGT에 의하면 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I).
다른 이중특이성 항체 포맷 또는 기술이 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 항원 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 제2 항원 결합 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편에 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 회합 또는 기타에 의해)) 기능적으로 연결되어 이중특이성 항원-결합 분자를 제조할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 특정 예시적인 이중특이성 포맷은, 예를 들면, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이성 포맷, IgG-scFv 융합, 이원 가변 도메인(DVD)-Ig, 쿼드로마, 놉-인투-홀, 공통 경쇄(예를 들면, 놉-인투-홀 등을 갖는 공통 경쇄), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, Duobody, IgG1/IgG2, 이원 작용성 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이성 포맷을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다(상기 포맷의 검토를 위해, 예를 들면, 문헌[Klein 등 2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌을 참조한다).
본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자의 맥락에서, Fc 도메인은 목적하는 기능성을 변화시키지 않으면서 Fc 도메인의 명시된 키메라 버젼과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화(예를 들면, 삽입, 결실 또는 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 Fc와 FcRn 사이에 변형된 결합 상호작용(예를 들면, 증진되거나 감소된)을 갖는 변형된 Fc 도메인을 초래하는 Fc 도메인에 하나 이상의 변형을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이성 항원-결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역에 변형을 포함하며, 여기서, 상기 변형은 산성 환경에서(예를 들면, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들면, 위치 250(예를 들면, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들면, L 또는 F); 252(예를 들면, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들면, S 또는 T), 및 256(예를 들면, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들면, L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들면, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들면, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 변형은, 428L(예를 들면, M428L) 및 434S(예를 들면, N434S) 변형; 428L, 259I(예를 들면, V259I), 및 308F(예를 들면, V308F) 변형; 433K(예를 들면, H433K) 및 434(예를 들면, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예를 들면, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들면, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들면, 308F 또는 308P)을 포함한다.
서열 변이체
본 발명의 항체 및 이중특이성 항원-결합 분자는, 개별 항원-결합 도메인이 유도된 상응하는 생식선 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들면, 공공의 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식선 서열에 대해 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 본원에 개시된 예시적인 아미노산 서열들 중 어느 것으로부터 유도된 항원-결합 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환에 대해 돌연변이된다(이러한 서열 변화를 본원에서는 총체적으로 "생식선 돌연변이"라고 한다). 당업계의 숙련가는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기들 전부는 항원-결합 도메인이 본래 유도되는 본래 생식선 서열에서 발견된 잔기로 역 돌연변이된다. 또 다른 실시형태에서, 특정 잔기들만이, 예를 들면, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이, 또는 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이 본래 생식선 서열로 역 돌연변이된다. 또 다른 실시형태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항원-결합 도메인이 본래 유도된 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 게다가, 항원-결합 도메인은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들면, 여기서, 특정 개별 잔기들은 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이되는 반면 본래 생식선 서열과 상이한 특정의 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유하는 항원-결합 도메인은 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 향상된 길항제 또는 효능제 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자는 본 발명 내에 포함된다.
또한, 본 발명은, 하나의 또는 둘 다의 항원-결합 도메인이, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 서열의 변이체를 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 서열에 대하여, 예를 들면, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는, HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet 등 (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시되어 있는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도 보존적" 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성이라고도 하는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정할 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 각종 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정값을 이용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련되어 있는 폴리펩타이드, 예를 들면, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩타이드 사이의 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 프로그램, 예를 들면, Gap 및 Bestfit을 함유한다. 예를 들면, GCG 버젼 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버젼 6.1의 프로그램인 디폴트 또는 권장 파라미터를 이용한 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 서열과 검색 서열 사이의 최고 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(Pearson (2000) supra). 상이한 유기체 유래의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 본 발명의 서열을 비교하는 경우의 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히, BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 문헌[Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-402]을 참조한다.
pH-의존적 결합
본 발명은 pH-의존적 결합 특징을 갖는, 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-CD3 항체는 중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD3에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항-CD3 항체는 중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD3에 대해 증진된 결합을 나타낼 수 있다. 표현 "산성 pH"는 약 6.2 미만, 예를 들면, 약 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, 또는 그 미만의 pH 값을 포함한다. 본원에서 사용되는 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
특정 예에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 …감소된 결합"은 중성 pH에서의 항원에의 항체 결합의 KD 값에 대한 산성 pH에서의 항원에의 항체 결합의 KD 값의 비(또는 역으로)의 관점에서 표현된다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 약 3.0 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 본 발명의 목적을 위해 "중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD3에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 산성/중성 KD 비는 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 또는 그 이상일 수 있다.
pH-의존적 결합 특징을 갖는 항체는, 예를 들면, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 특정 항원에 대한 감소된(또는 증진된) 결합을 위해 항체의 집단을 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 추가로, 아미노산 수준에서의 항원-결합 도메인의 변형이 pH-의존적 특징을 갖는 항체를 산출할 수 있다. 예를 들면, (예를 들면, CDR 내의) 항원-결합 도메인의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 항원-결합을 갖는 항체를 수득할 수 있다.
Fc 수용체 결합
상이한 IgG 이소타입으로부터 유도되고 Fc 수용체 결합 및 활성화에 대해 독특한 특성을 갖는, Ig 중쇄의 힌지-CH2-CH3 불변 도메인과 같은 키메라성 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자 및 항체가 제공된다. 본 발명의 특정 Fc 도메인은 키메라성 힌지를 포함하도록 조작된다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라성"은 상이한 기원의 부분으로 이루어짐을 의미한다. 어구 "키메라성 단백질"은 자연에서는 통상적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 단백질에 연결된 제1 아미노산 단백질을 포함한다. 아미노산 서열은 별도의 단백질로서, 또는 동일한 단백질 상에 상이한 배열로 통상적으로 존재할 수 있으며, 새로운 배열로 융합 폴리펩타이드에서 합쳐진다. 키메라성 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 또는 목적하는 배열로 키메라성 단백질의 아미노산에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 생산될 수 있다. 예시적인 키메라성 단백질은 IgG의 중쇄 도메인을 연결하는 키메라성 힌지 서열, 및 본 발명의 인간 항체 및 항원-결합 단백질을 제조하기 위해 조작된 융합 단백질을 포함한다.
본원에 개시된 키메라성 단백질은, 예를 들면, 야생형 IgG Fc 영역 또는 도메인과 비교하여, 접합시 면역성 에피토프의 생성을 최소화하도록 설계되었다. 따라서, 본 발명의 조작된 단백질은 감소된 면역원성을 가지며, Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 나타내고, 효과기 기능이 감소되거나 없다.
본원에서 사용되는 용어 "힌지"는 CH1의 C-말단을 면역글로불린의 CH2 도메인의 N-말단에 연결하는 연속 아미노산 잔기의 영역을 포함하는 것으로 의도된다. CH2 엑손에 의해 코딩되는, CH2 도메인의 N-말단의 몇 개의 아미노산이 또한 "하부 힌지"의 일부로서 간주된다. 임의의 한 가지 이론에 의해 결부됨이 없이, lgG1, lgG2 및 lgG4의 힌지 영역의 아미노산은 별개의 힌지 엑손에 의해 암호화된 12-15개 연속 아미노산, 및 (CH2 엑손에 의해 암호화된) CH2 도메인의 수 개의 N-말단 아미노산을 포함함을 특징으로 하였다(문헌 참조; Brekke, O.H., 등 immunology Today 16(2) :85-90 (1995)). 다른 한편으로, lgG3은 4개의 세그먼트: lgG1의 힌지 영역과 유사한 하나의 상부 세그먼트, 및 lgG3에 독특한 동일한 아미노산 반복체인 3개의 세그먼트로 이루어진 힌지 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라성 힌지"는 하나의 Ig 분자의 힌지 영역으로부터 유도된 제1 아미노산 서열 및 Ig 분자의 상이한 종류 또는 하위종류의 힌지 영역으로부터 유도된 제2 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 본 발명의 키메라성 힌지는 인간 lgG1 힌지 영역 또는 인간 lgG4 힌지 영역으로부터 유도된 제1 아미노산 서열, 또는 "상부 힌지" 서열, 및 인간 lgG2 힌지 영역으로부터 유도된 제2 아미노산 서열, 또는 "하부 힌지" 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 또는 "상부 힌지" 서열은 EU 넘버링에 따라 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 또는 "하부 힌지" 서열은 EU 넘버링에 따라 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기를 포함한다.
본 기재내용의 목적을 위해, "상부 힌지" 영역은 EU 넘버링에 따라 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기(Kabat 넘버링에 따르면 위치 226 내지 240의 아미노산 잔기)를 포함하는 것으로 의도된다(도 1 참조). "하부 힌지" 영역은 EU 넘버링에 따라 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기(Kabat 넘버링에 따르면 위치 241 내지 249의 아미노산 잔기)를 포함하는 것으로 의도된다(도 1 참조).
본 발명의 실행자의 편의를 위해 본 기재내용에서, 인간 lgG1, lgG2 및 lgG4에 대한 힌지 영역의 아미노산은 IMGT® Scientific Chart, IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, 2001년 5월 17일에 생성되어 2013년 1월 10일에 마지막 업데이트된 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbwering/Hu_IGHGnber.html에 따라 업데이트된 바와 같이 "EU 넘버링" 또는 "EU 인덱스"로도 공지된 Kabat의 EU 넘버링 시스템에 의해 본원에 동정되었다(문헌 참조; Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th　ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)).
인간 lgG1, lgG2 및 lgG4 힌지 아미노산에 대한 EU 넘버링 및 IMGT 특유 도메인 넘버링, IMGT 엑손 넘버링, 및 Kabat 넘버링 협회 간의 대응(또한, 특히 Kabat, E.A. 등, 1991, 참조)이 다음과 같이 표 A 내지 F에 기재되어 있다:
표 A: lgG1 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00001

표 B: lgG1 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00002

표 C: lgG2 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00003

Figure 112016101405608-pct00004

표 D: lgG2 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00005

표 E: lgG4 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00006

표 F: lgG4 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112016101405608-pct00007

엑손 스플리싱으로부터 생성된 아미노산은 괄호 안에 나타내어져 있다.
- 는 상응하는 숫자가 보고되지 않았음을 의미한다.
-- 는 이 위치에 상응하는 아미노산이 없음을 의미한다.
a　마지막 업데이트된 IMGT Scientific Chart에 따른 넘버링
b　문헌(Kabat, EA, 등 1991)에 보고된 바와 같은 EU 인덱스에 따른 넘버링
또한, 예를 들면, 문헌(Lefranc, M.-P. 등, Devel Comp Immunol, 29, 185-203 (2005); 및 Edelman, G.M. 등 PNAS USA, 63:78-85 (1969))을 참조한다.
예를 들면, 예비결정된 항원에 대한 또는 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 결합의 맥락에서 용어 "결합"은, 전형적으로 최소 두 개의 실체, 또는 분자 구조 간의 상호작용 또는 회합, 예를 들면, 항체-항원 상호작용, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질을 나타낸다.
예를 들면, 결합 친화도는, 예를 들면, 리간드로서 항원 또는 FcR를 그리고 분석물(또는 항리간드)로서 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질을 사용하여 BIAcore 3000 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 측정하는 경우, 전형적으로 약 10-7　M 이하, 예를 들면, 약 10-8　M 이하, 예를 들면, 약 10-9　M 이하의 KD　값에 상응한다. 따라서, 항체 또는 기타의 결합 단백질은 비특이성 항원(예를 들면, BSA, 카제인)에의 결합에 대한 이의 친화도보다 적어도 10배, 예를 들면, 적어도 100배, 예를 들면, 적어도 1,000배, 예를 들면, 적어도 10,000배, 예를 들면, 적어도 100,000배 더 낮은 KD　값에 상응하는 친화도로 예비결정된 항원 또는 수용체에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질의 해리 평형 상수를 말한다. KD와 결합 친화도 사이에는 역의 관계가 있으며, 따라서, KD　값이 작을수록, 친화도는 더 높아지고, 즉, 더 강해진다. 따라서, 용어 "보다 높은 친화도" 또는 "보다 강한 친화도"는 상호작용을 형성하는 보다 높은 능력, 따라서, 보다 작은 KD　값과 관련되며, 반대로 용어 "보다 낮은 친화도" 또는 "보다 약한 친화도"는 상호작용을 형성하는 보다 낮은 능력, 따라서, 보다 큰 KD　값과 관련된다. 일부 상황에서, 다른 상호작용적 파트너 분자(예를 들면, 수용체 Y)에 대한 분자(예를 들면, 항체)의 결합 친화도에 비해 이의 상호작용적 파트너 분자(예를 들면, 수용체 X)에 대한 특정 분자(예를 들면, 항체)의 보다 높은 결합 친화도(또는 KD)는 보다 큰 KD　값(보다 낮은 또는 보다 약한 친화도)을 보다 작은 KD(보다 높은 또는 보다 강한 친화도)로 나누어 구해진 결합 비로서 표현될 수 있으며, 예를 들면, 경우에 따라 5배 또는 10배 더 큰 결합 친화도로서 표현된다.
본원에서 사용되는 용어 "kd" (sec-1 또는 1/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질의 해리 속도 상수를 말한다. 상기 값을 koff　값이라고도 한다.
본원에서 사용되는 용어 "ka" (M-1 x sec-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질의 결합 속도 상수를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "KA" (M-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질의 결합 평형 상수를 말한다. 결합 평형 상수는 ka를 kd로 나누어 수득된다.
본원에서 사용되는 용어 "EC50" 또는 "EC50"은 반 최고 유효 농도를 말하며, 이것은 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대치 중간의 반응을 유도하는 항체의 농도를 포함한다. EC50은 필수적으로, 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 증가된 EC50, 또는 반 최고 유효 농도 값으로 감소된 결합이 관찰된다.
하나의 실시형태에서, 감소된 결합은 반-최대량의 표적 세포에의 결합을 가능하게 하는 증가된 EC50　항체 농도로서 정의될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 감소된 세포독성 활성, 예를 들면, ADCC 또는 CDC는 반-최대량의 표적 세포의 용해를 가능하게 하는 증가된 EC50 항체 농도로서 정의될 수 있다. 세포독성은 또한 세포독성 퍼센트, 또는 칼세인 방출 검정 또는 등가 검정에서 용해된 것으로 관찰된 세포의 총 집단의 분율인 용해 퍼센트로서 측정된다. 세포독성 퍼센트는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 감소된 증식은 반-최대량의 표적 세포의 증식을 가능하게 하는 증가된 EC50　항체 농도로서 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "효과기 기능"은 FcγR에 결합시 Fc-함유 단백질에 의해 부여되는 기능적인 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 어느 한 이론에 결부됨이 없이, Fc/FcγR 복합체의 형성으로 각종 효과기 세포가 결합된 항원의 부위로 모집되어, 전형적으로 세포 내의 다양한 신호전달 사건 및 중요한 후속적인 면역 반응을 야기한다.
본 발명의 키메라성 Fc-함유 항원-결합 단백질 및 항체는 상응하는 야생형 Fc-함유 항원-결합 단백질 또는 항체에 비해 변형된 또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 2014년 8월 7일자로 공개된 PCT 공개 제WO 2014/121087호를 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 감소되거나 변형된 효과기 기능은 세포독성 효과기 기능, 예를 들면, 세포독성, 보체-의존적 세포독성(CDC), 또는 항체-의존적 세포독성(ADCC)이다. 하나의 실시형태에서, 감소되거나 변형된 효과기 기능은 보체-의존적 세포독성이다. 또 다른 실시형태에서, 감소되거나 변형된 효과기 기능은 항체-의존적 세포독성이다. 또 다른 실시형태에서, 감소되거나 변형된 효과기 기능은 표적 세포의 세포 증식이다.
몇몇 항체 효과기 기능은 적어도 부분적으로 Fc 수용체(FcR)에 의해 매개되는데, 이것은 전형적인 면역글로불린의 불변 도메인(구체적으로, CH2 및 CH3 도메인)에서 항체의 Fc 영역에 결합한다. 상이한 부류의 면역글로불린, 즉, IgG, IgE, IgA, IgM, 및 IgD에 대해 특이적인 수많은 Fc 수용체들이 있다. 인간 IgG Fc 수용체 계열은 세 가지 그룹으로 나뉘어진다: 높은 친화도로 IgG에 결합할 수 있는 FcγRI (CD64), 둘 다 저 친화도 수용체인 FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16). 각각의 FcγR 하위부류는 2개 또는 3개의 유전자에 의해 암호화되며, 대안적인 RNA 스플리싱이 다중 전사체를 야기하고, 따라서, FcγR 동형에 있어서 광범위한 다양성이 존재한다(예를 들면, FcγRIA (CD64; FCGR1 A), FcγRIB (CD64; FCRG1 B), FcγRIIA (CD32A; FCGR2A), FcγRIIB (CD32B; FCGR2B), FcγRIIC (CD32C; FCGR2C), FcγRIIIA (CD16a; FCGR3A), 및 FcγRIIIB (CD16b; FCGR3B)). 추가로, FcRn, 또는 신생아 Fc 수용체(Fc 수용체 운반체, 알파, 또는 FCGRT로도 공지됨)는 IgG 항체를 태반을 가로질러 모체에서 태아로 운반할 수 있다. 게다가, Fc 수용체는, 예를 들면, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구, 및 특정 림프구를 포함한 다양한 세포 상에서 발현된다. 예를 들면, U937 세포, 인간 단핵구 세포주는 FcγRI 및 FcγRIIA 둘 다를 발현한다(예를 들면, 문헌[Jones, 등 J Immunol 135(5):3348-53 (1985); 및 Brooks, 등 J Exp Med 170:1369-85 (October 1989)] 참조). 본원에 언급된 각각의 수용체는 전사체 변이체, 동형체 및 다형체를 포함한 수용체의 임의의 공지된 기능적 형태를 포함한다.
이의 수용체에 대한 Ig Fc의 결합은 이러한 효과기 세포를 결합 항원의 부위로 데려와서, 궁극적으로 B 세포 활성화, 염증 반응, 세포독성 반응, 및 식세포 반응을 포함한 각종 신호전달 및 면역 반응을 야기한다. 그와 같이, 이의 수용체에 대한 Ig Fc의 감소되거나 변형된 결합은 감소된 효과기 기능을 야기할 수 있다.
어구 "항체-의존적 세포성 식균작용", 또는 "ADCP"는 세포용해를 유도한다기 보다는 표적 세포를 완전히 에워쌈으로써 표적 세포를 없애는(또는 사멸시키는) 효과기 기능과 관련된다. ADCP는 종양 세포를 사멸시키기 위한 중요한 생체내 메카니즘일 수 있다. ADCP는 2색 혈광 유동 세포계측 방법, 예를 들면, PKH2(녹색 형광 염료) 및 피코에리트린-접합된 (적색) 단일클론성 항체를 사용하여, 식세포 활성 및 식균작용의 속도를 구하는 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCP 측정은 당업계에 익히 공지되어 있다. FcγRIIB에 대해 FcγRIIA를 선택적으로 활성화시키는 치료학적 전략은 대식세포 식세포 활성을 증진시킬 수 있다(문헌 참조; Richards, JO, 등 2008 Mol Cancer Ther 7(8):2517-27). 본 발명의 키메라성 Fc-함유 항원-결합 단백질 및 항체는 인간 FcγRIIA에 결합하여 이를 활성화시킨다. 특정 상황에서, 본 발명의 항원-결합 단백질 및 항체는 항체가 FcγRIIB에 결합하는 것보다 더 높은 결합 친화도로 인간 FcγRIIA에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화도보다 약 5배 이상 더 강한 인간 FcγRIIA에 대한 결합 친화도를 나타내며, 이러한 결합 친화도 값은 KD로 표현된다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화도보다 약 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 1 1 -, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 또는 20배 더 강한 인간 FcγRIIA에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
항체 및 이중특이성 항원-결합 분자의 생물학적 특징
본 발명은 인간 CD3 및 CD20에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, CD3xCD20 항체에 대한 Jurkat 세포 또는 Raji 세포의 결합을 평가함), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 시험관내 결합 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 약 60 nM 미만의 EC50　값으로 Jurkat 세포(CD3+) 및 Raji 세포(CD20+)에 결합하는 항-CD3xCD20 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 시험관내 결합 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 약 75 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 65 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 또는 약 25 nM 미만의 EC50　값으로 세포(예를 들면, Jurkat 세포 및/또는 Raji 세포)의 표면 상에서 CD3 또는 CD20에 결합한다.
본 발명은 인간 CD3 및 인간 CD20에 동시에 결합할 수 있는 이중특이성 항원-결합 분자(예를 들면, 이중특이성 항체)를 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 CD3 및/또는 CD20을 발현하는 세포와 특이적으로 상호작용한다. 이중특이성 항원-결합 분자가 CD3 및/또는 CD20을 발현하는 세포에 결합하는 정도는, 본원의 실시예 4에 예시된 바와 같이, 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 CD3(예를 들면, Jurkat)을 발현하는 인간 T-세포주, CD20(예를 들면, Raji)을 발현하는 인간 B-세포주, 및 영장류 T-세포(예를 들면, 사이노몰거스 말초 혈액 단핵 세포[PBMCs])에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다. 본 발명은 실시예 4에 제시된 바와 같은 FACS 검정 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이 약 8.74x10-6　내지 약 5.99 x10-8, 또는 그 미만의 EC50　값으로 상기한 세포 및 세포주 중의 어느 것에 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 CD3에 결합하여 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸을 유도하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 5에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, 항-CD3 항체의 존재하에서 인간 PBMC에 의한 Raji 종양 세포 사멸의 정도를 평가함), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 시험관내 T 세포-매개된 종양 세포 사멸 검정에서 측정되는 바와 같이, 약 60 pM 미만의 EC50으로 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸을 유도하는 항-CD3xCD20 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 5에 정의된 바와 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 시험관내 T 세포-매개된 종양 세포 사멸 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 약 56 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 45 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 35 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 25 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 15 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 또는 약 1 pM 미만의 EC50 값으로 T 세포-매개된 종양 세포 사멸(예를 들면, Raji 세포의 PBMC-매개된 사멸)을 유도한다.
본 발명은 또한 인간 CD3/CD20에 결합하여 보체-의존적 세포독성(CDC)을 유도하지만 야생형 IgG Fc 도메인을 갖는 항체보다는 덜한 정도로 유도하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 6에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, 보체 및 항-CD3xCD20 항체의 존재하에서 표적 세포 사멸(Raji 또는 Daudi)의 정도를 평가함), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 시험관내 T 세포-매개된 종양 세포 사멸 검정에서 측정되는 바와 같이, 약 50% 미만의 세포독성 퍼센트(% 세포독성 또는 % 세포 용해)로 Raji 또는 Daudi(CD20-발현) 세포의 CDC 사멸을 유도하는 항-CD3xCD20 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 6에 정의된 바와 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 시험관내 보체-매개된 세포 사멸 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 백그라운드 세포독성 미만의 세포독성 퍼센트로 또는 검출 가능한 세포독성 없이 CDC 세포 사멸(예를 들면, Raji 또는 Daudi 세포의 보체-매개된 사멸)을 유도한다.
본 발명은 또한 인간 CD3/CD20에 결합하고 야생형 IgG Fc 도메인을 갖는 항체에 비해 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 유의적으로 유도하지는 않는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, NK 세포 및 항-CD3xCD20 항체의 존재하에서 표적 세포 사멸(Raji 또는 Daudi)의 정도를 평가함), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 시험관내 NK 세포-매개된 세포 사멸 검정에서 측정되는 바와 같이 약 20% 미만(또는 백그라운드 세포독성 미만)의 세포독성 퍼센트(% 세포독성 또는 % 세포 용해)로 Raji 또는 Daudi(CD20-발현) 세포를 인지가능하게 사멸시키지 않는 항-CD3xCD20 항체를 포함한다. 실질적으로 유사한 검정은 NK 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 또는 변이체 FcγRIII을 발현하는 세포를 포함한 기타의 FcγRIII-발현 세포의 존재를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여, 시험관내 FcγRIII-매개된 세포 사멸 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 백그라운 세포독성 미만의 세포독성 퍼센트로 또는 검출가능한 세포독성 활성 없이, 어떠한 검출가능한 ADCC 활성(예를 들면, Raji 또는 Daudi 세포의 NK 세포 또는 FcγRIII-매개된 사멸)로 나타내지 않는다
특정 실시형태에 따르면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 8에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 23.5μM 미만의 KD로 인간 FcγRIIA(예를 들면, 25℃에서)에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 8에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, mAb-포획 또는 항원-포획 포맷), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 20.5μM 미만, 약 20μM 미만, 약 19.3μM 미만, 약 18μM 미만, 약 17μM 미만, 약 16μM 미만, 약 15μM 미만, 약 10μM 미만, 약 9μM 미만, 약 8μM 미만, 약 7μM 미만, 약 6μM 미만, 약 5μM 미만, 약 4μM 미만, 약 3μM 미만, 약 2μM 미만, 약 1μM 미만, 약 900 nM 미만, 약 800 nM 미만, 또는 약 700 nM 미만의 KD로　FcγRIIA에 결합한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 8에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 233μM 미만의 KD로 인간 FcγRIIB(예를 들면, 25℃에서)에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 8에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, mAb-포획 또는 항원-포획 포맷), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 200μM 미만, 약 190μM 미만, 약 180μM 미만, 약 170μM 미만, 약 160μM 미만, 약 150μM 미만, 약 140μM 미만, 약 130μM 미만, 약 125μM 미만, 약 123μM 미만, 약 120μM 미만, 약 110μM 미만, 약 100μM 미만, 약 90μM 미만, 약 80μM 미만, 약 70μM 미만, 약 60μM 미만, 약 50μM 미만, 또는 약 40μM 미만의 KD로 FcγRIIB에 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 본원의 실시예 9에 정의된 바와 같은 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 8일 이상의 해리적 반감기(t½)로 CD3xCD20에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는, 예를 들면, 본원의 실시예 9에 정의된 바와 같은 검정 포맷(예를 들면, mAb-포획 또는 항원-포획 포맷), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 약 5일 이상, 6일 이상, 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 또는 약 20일 이상의 t½를 나타낸다.
본 발명은 또한 (a) 시험관내 PBMC 증식을 유도; (b) CDC 세포독성(예를 들면, 본원의 실시예 6 참조); (d) ADCC(예를 들면, 본원의 실시예 7 참조)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 검정에서 유의적인 활성을 나타내지 않는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 사이노몰거스 원숭이에서 B-세포(예를 들면, CD45+/CD20+ B-세포)를 고갈(예를 들면, 본원의 실시예 10 및 11 참조); (b) 면역결핍 마우스 모델에서 B-세포 종양 체적을 감소(예를 들면, Raji 종양 체적)(예를 들면, 실시예 12A 참조); 및 (c) 확립된 종양을 갖는 마우스 모델에서 종양의 퇴화(예를 들면, 실시예 12B 참조)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 검정에서 유의적인 활성을 나타내는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 B 세포를 고갈시킬 수 있는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함한다(예를 들면, 실시예 10 참조). 예를 들면, 특정 실시형태에 따르면, 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자가 제공되는데, 여기서, 대상체로의 (예를 들면, 약 1 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.06 mg/kg 약 0.04 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 또는 그 미만의 용량으로) 이중특이성 항원-결합 분자의 단일 투여는 대상체에서 (예를 들면, 대상체로부터 채취한 혈액 샘플 중의) B 세포의 수를 검출가능한 수준 아래로 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 약 0.1 mg/kg의 용량에서의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자의 단일 투여는 이중특이성 항원-결합 분자를 대상체에 투여한지 약 7일째, 약 6일째, 약 5일째, 약 4일째, 약 3일째, 약 2일째, 또는 약 1일째까지 대상체에서 B 세포의 수를 검출가능한 수준 아래로 감소시킨다. 특정 실시형태에 따르면, 약 0.01 mg/kg의 용량에서의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자의 단일 투여는 투여 후 적어도 약 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일 또는 그 이상까지 B-세포의 수를 검출가능한 수준 아래로 유지시킨다. 본원에서 사용되는 표현 "검출가능한 수준 아래로"는 어떠한 B 세포도 표준 B-세포 검출 검정, 예를 들면, 본원의 실시예 10에 제시된 바와 같은 B-세포 마커에 대한 FACS 검정을 사용하여 대상체로부터 채취한 혈액 샘플에서 직접 또는 간접적으로 검출될 수 없음을 의미한다
본 발명은 또한, 대상체에 투여되는 경우, 기껏해야 T 세포의 일시적인 감소를 야기하는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공한다. 예를 들면, 대상체에 약 0.01 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg의 용량으로 투여되는 경우, 투여 후 1일째에 T 세포의 수가 감소하지만 혈액 마이크로리터당 T 세포의 수는 그후(예를 들면, 투여 후 약 2일째, 4일째, 7일째, 14일째, 28일째 또는 그후) 시점에서 반등하는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자가 제공된다. 예를 들면, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서, 대상체에게 약 0.01 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg의 용량으로 항원 결합 분자를 투여한지 약 4일째 내지 약 7일째에 대상체로부터 채취한 혈액 마이크로리터당 T 세포의 수는, 표준 T-세포 검출 검정, 예를 들면, 본원의 실시예 10에 제시된 바와 같은 T-세포 마커에 대한 FACS 검정을 사용하여 검출된 바와 같이, 이중특이성 항원-결합 분자의 투여 전 대상체로부터 채취한 혈액 마이크로리터당 T 세포의 수와 같거나 그 이상이다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명의 항원-결합 분자가 결합하는 CD3 또는 CD20 상의 에피토프는 CD3 단백질의 3개 이상(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 단일 인접 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 CD3 또는 CD20의 다수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 항체는 단일 CD3 쇄(예를 들면, CD3-엡실론, CD3-델타 또는 CD3-감마) 내에 함유된 아미노산과 상호작용할 수 있거나, 둘 이상의 상이한 CD3 쇄 상의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 파라토프라고 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원성 결정인자를 말한다. 단일 항원은 1개 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체가 항원 상의 상이한 구역에 결합할 수 있으며 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체배좌 또는 선형일 수 있다. 입체배좌 에피토프는 선형 폴리펩타이드 쇄의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 제조된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 제조된 에피토프이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상의 사카라이드, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹의 모이어티들을 포함할 수 있다.
당업계의 통상의 숙련가에게 공지된 다양한 기술들이 항체의 항원-결합 도메인이 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 기술들은, 예를 들면, 문헌[Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기재된 바와 같은 일상적인 교차-차단 검정, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(참조; Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), 및 펩타이드 개열 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절개, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(참조; Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). 항체의 항원-결합 도메인이 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적인 측면에서, 수소/중수소 교환 방법은 관심의 대상인 단백질을 중수소-표지화하고, 이어서, 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시키는 것을 포함한다. 그후, 단백질/항체 복합체를 물로 이동시켜, 항체에 의해 보호된 잔기(이는 중수소-표지된 상태를 유지함)를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 일어나도록 한다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 개열 및 질량 분광 분석을 수행하여, 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 드러낸다. 예를 들면, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2) :252-259; Engen 및 Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]을 참조한다. 또한, 항원/항체 복합체의 X-선 결정학(crystallography)도 에피토프 맵핑 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술되는 특정 예시적인 항체 중 임의의 항체(예를 들면, 본원의 표 1에 제시되는 바와 같은 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD3 항체를 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 CD3에 결합하기 위해 본원에 기술되는 특정 예시적인 항체 중 임의의 항체(예를 들면, 본원의 표 1에 제시되는 바와 같은 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-CD3 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, 제1 항원-결합 도메인은 본원에 기재된 특정의 예시적인 CD3-특이적 항원-결합 도메인과 CD3 상의 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 제2 항원-결합 도메인은 본원에 기재된 특정의 예시적인 CD20-특이적 항원-결합 도메인과 CD20 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, 제1 항원-결합 도메인은 CD3에 결합하기 위해 본원에 기재된 특정의 예시적인 CD3-특이적 항원-결합 도메인 중의 임의의 도메인과 경쟁하고/하거나, 제2 항원-결합 도메인은 CD20에 결합하기 위해 본원에 기재된 특정의 예시적인 CD20-특이적 항원-결합 도메인 중의 임의의 도메인과 경쟁한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 제1 항원-결합 도메인이 인간 CD3에 결합하기 위해 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(A1-HCDR1, A1-HCDR2 및 A1-HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(A1-LCDR1, A1-LCDR2 및 A1-LCDR3)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 이중특이성 항체를 포함하며, 여기서, (i) A1-HCDR1은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) A1-HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하며; (iii) A1-HCDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; (iv) A1-LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하며; (v) A1-LCDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (vi) A1-LCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하기 위해 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 제1 항원-결합 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제2 항원-결합 도메인이 인간 CD20에 결합하기 위해 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(A2-HCDR1, A2-HCDR2 및 A2-HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(A2-LCDR1, A2-LCDR2 및 A2-LCDR3)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 이중특이성 항체를 포함하며, 여기서, (i) A2-HCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) A2-HCDR2는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하며; (iii) A2-HCDR3은 서열번호 8을 포함하고; (iv) A2-LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하며; (v) A2-LCDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; (vi) A2-LCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 이중특이성 항체는 인간 CD20에 결합하기 위해 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD3에 결합하기 위해 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR), 및 (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 제1 항원-결합 도메인을 갖고; 인간 CD20에 결합하기 위해 (iii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR), 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 기준 항원-결합 단백질과 경쟁하는 제2 항원-결합 도메인을 갖는 이중특이성 항체를 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 일상적인 방법을 이용함으로써, 특정 항원-결합 분자(예를 들면, 항체) 또는 이의 항원-결합 도메인이 본 발명의 기준 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합에 대해 경쟁하는지를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 본 발명의 기준 이중특이성 항원-결합 분자와 CD3 (또는 CD20) 상의 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 기준 이중특이성 항원-결합 분자가 먼저 CD3 단백질(또는 CD2 단백질)에 결합하도록 한다. 그후, CD3(또는 CD20) 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 시험 항체가 기준 이중특이성 항원-결합 분자와의 포화 결합 후 CD3(또는 CD20)에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 기준 이중특이성 항원-결합 분자와는 CD3(또는 CD20)의 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 다른 한편으로, 시험 항체가 기준 이중특이성 항원-결합 분자와의 포화 결합 후 CD3(또는 CD20) 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 본 발명의 기준 이중특이성 항원-결합 분자에 의해 결합된 에피토프와 동일한 CD3(또는 CD20)의 에피토프에 결합할 수 있다. 이어서, 관찰된 시험 항체의 결합의 결여가 실제로 기준 이중특이성 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여에 원인이 있는 것인지를 확인하기 위해, 추가의 일상적인 실험(예를 들면, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포계측 또는 당업계에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 예를 들면, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 과량의 하나의 항원-결합 단백질이 경쟁적 결합 검정(참조: 예를 들면, Junghans 등, Cancer Res. 1990:50:1495-1502)으로 측정하여 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 다른 항체의 결합을 억제하는 경우, 2개의 항원-결합 단백질은 동일한(또는 오버랩핑) 에피토프에 결합한다. 대안적으로, 하나의 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 항원 내의 필수적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소하거나 없애는 경우, 2개의 항원-결합 단백질들은 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다. 하나의 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 아미노산 돌연변이의 하위세트만이 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 경우, 2개의 항원-결합 단백질은 "오버랩핑 에피토프"를 갖는 것으로 생각된다.
항체 또는 이의 항원-결합 도메인이 결합을 위해 기준 항원-결합 분자와 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상기한 결합 방법을 2개의 배향으로 수행한다: 제1 배향에서, 기준 항원-결합 분자를 포화 조건하에 CD3 단백질(또는 CD20 단백질)에 결합하도록 하고, 이어서, CD3(또는 CD20) 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가하도록 한다. 제2 배향에서, 시험 항체를 포화 조건하에 CD3(또는 CD20) 분자와 결합하도록 하고, 이어서, CD3(또는 CD20) 분자에 대한 기준 항원-결합 분자의 결합을 평가하도록 한다. 상기 배향 둘 다에서, 제1 (포화) 항원-결합 분자만이 CD3(또는 CD20) 분자에 결합할 수 있는 경우, CD3(또는 CD20)에 결합하기 위해 시험 항체 및 기준 항원-결합 분자가 경쟁한다고 결론지어진다. 당업계의 통상의 숙련가에게 이해될 것인 바와 같이, 결합을 위해 기준 항원-결합 분자와 경쟁하는 항체는, 기준 항체와 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하지 않을 수 있지만, 오버랩핑되거나 인접한 에피토프에 결합시킴으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
항원-결합 도메인의 제조 및 이중특이성 분자의 작제
특정 항원에 대해 특이적인 항원-결합 도메인은 당업계에 공지되어 있는 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조될 수 있다. 일단 수득되면, 2개의 상이한 항원(예를 들면, CD3 및 CD20)에 대해 특이적인 2개의 상이한 항원-결합 도메인은 일상적인 방법을 이용하여 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 제조하기 위해 서로에 대해 적절하게 배열될 수 있다. (본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 작제하기 위해 사용될 수 있는 예시적 이중특이성 항체 포맷의 논의는 본원의 다른 곳에 제공된다). 특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이성 항원-결합 분자의 개별 성분들(예를 들면, 중쇄 및 경쇄) 중 하나 이상은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체로부터 유도된다. 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상은 VELOIMMUNE™ 기술을 이용하여 제조될 수 있다. VELOIMMUNE™ 기술(또는 임의의 다른 인간 항체 생성 기술)을 이용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, 특정 항원(예를 들면, CD3 또는 CD20)에 대한 고 친화도 키메라 항체를 초기에 단리한다. 항체를 특성화하고, 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 원하는 특성에 대해 선택한다. 마우스 불변 영역을 목적하는 인간 불변 영역으로 대체하여, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자에 도입될 수 있는 완전 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 생성시킨다.
유전자 조작된 동물을 이용하여 인간 이중특이성 항원-결합 분자를 제조할 수 있다. 예를 들면, 재배열하여 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 발현할 수 없는 유전자 변형된 마우스를 이용할 수 있고, 여기서, 상기 마우스는 내인성 마우스 카파 유전자좌에서 마우스 카파 불변 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 1개 또는 2개의 인간 경쇄 가변 도메인만을 발현한다. 이러한 유전자 변형된 마우스를 이용하여, 2개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절 중 하나로부터 유도된 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 회합되는 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 완전 인간 이중특이성 항원-결합 분자를 제조할 수 있다. (예를 들면, 이러한 조작된 마우스 및 이중특이성 항원-결합 분자를 제조하기 위한 이들의 사용에 대한 상세한 논의에 대해 제US 2011/0195454호를 참조한다).
생물학적 등가성
본 발명은 본원에 개시되는 예시적인 분자의 서열과는 다르지만 CD3 및/또는 CD20에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 변이체 분자는, 모 서열과 비교하는 경우, 아미노산의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있지만, 기술된 이중특이성 항원-결합 분자의 생물학적 활성과 필수적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 본원에 제시되는 예시적인 항원-결합 분자 중 임의의 분자와 생물학적 등가성인 항원-결합 분자를 포함한다. 2개의 항원-결합 단백질, 또는 항체는, 예를 들면, 이들이 약제학적으로 등가물인 경우에, 또는 이의 흡수 속도 및 정도가 유사한 실험 조건하에 단일 용량 또는 다중 용량의 동일한 몰 용량으로 투여되는 경우에 유의한 차이를 나타내지 않는 약제학적 대체물인 경우에 생물학적 등가성인 것으로 간주된다. 몇몇의 항원-결합 단백질은 이들이 이들의 흡수의 정도에 있어서 등가이지만 이들의 흡수 속도에 있어서 등가가 아닌 경우 등가물 또는 약제학적 대체물인 것으로 간주될 것이고, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이는 의도적이고 표지화에서 반영되며, 예를 들면, 만성 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 획득에 필수적이지 않으므로 여전히 생물학적 등가성인 것으로 고려될 수 있으며, 연구된 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주된다.
하나의 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질은 이들의 안전성, 순도, 및 효력에 있어서 임상학적으로 의미있는 차이가 없는 경우에 생물학적 등가성이다.
하나의 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질은 환자가, 스위칭(switching) 없이 지속된 치료요법과 비교하여, 면역원성에 있어서의 임상학적으로 유의한 변화, 또는 감소된 효율성을 포함하는 부작용의 위험에 있어서 예측된 증가 없이 기준 제제와 생물학적 제제 사이에서 1회 이상 스위칭될 수 있는 경우에 생물학적 등가성이다.
하나의 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 이들 둘 다가 작용 메커니즘이 공지되어 있는 정도로 사용 조건 또는 사용 조건들에 대한 일반적인 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해 작용하는 경우에 생물학적 등가성이다.
생물학적 등가성은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 등가성 척도는, 예를 들면, (a) 항체 또는 이의 대사물의 농도가 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 생물학적 체액 중에서 측정되는, 인간 또는 기타 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 인간 생체내 생체이용률 데이터와 상호관련되어 있고 인간 생체내 생체이용률 데이터가 충분하게 예측되는, 시험관내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성의 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항원-결합 단백질의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생물학적 등가성을 확립하는 잘-제어된 임상 시험을 포함한다.
본원에 제시되는 예시적인 이중특이성 항원-결합 분자의 생물학적 등가성 변이체는, 예를 들면, 잔기 또는 서열의 각종 치환 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 결실을 만듦으로써 작제될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산으로 대체되어 복원(renaturation)시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 가교의 형성을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적 등가성 항원-결합 단백질은 예시적인 이중특이성 항원-결합 분자의 당화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들면, 당화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 본원에 제시되는 예시적인 이중특이성 항원-결합 분자의 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 인간 CD3에 결합하지만 다른 종 유래의 CD3에는 결합하지 않는 항원-결합 분자가 제공된다. 또한, 인간 CD20에 결합하지만 다른 종 유래의 CD20에는 결합하지 않는 항원-결합 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 인간 CD3에 및 하나 이상의 비-인간 종 유래의 CD3에 결합하는 항원-결합 분자; 및/또는 인간 CD20에 및 하나 이상의 비-인간 종 유래의 CD20에 결합하는 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명의 특정의 예시적인 실시형태에 따르면, 인간 CD3 및/또는 인간 CD20에 결합하고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 사이노몰거스, 마모셋, 레서스 또는 침팬지 CD3 및/또는 CD20 중 하나 이상에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 항원-결합 분자가 제공된다. 예를 들면, 본 발명의 특정의 예시적인 실시형태에서, 인간 CD3 및 사이노몰거스 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원-결합 분자가 제공된다.
면역접합체
본 발명은 세포독소, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소와 같은 치료학적 모이어티("면역접합체")에 접합된 항원-결합 분자를 포함한다. 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 면역접합체를 형성하기 위한 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 제WO 05/103081호를 참조한다).
치료학적 제형 및 투여
본원에서 사용되는 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 독성, 자극, 또는 알레르기 반응과 같은 불리한 부작용 없이 목적하는 치료학적 반응을 산출하는데 충분한 활성 치료제의 양을 말한다. 구체적인 "유효량"은, 명백히, 치료되는 특정 병태, 환자의 신체적 상태, 치료되는 동물의 유형, 치료의 지속시간, 동시 요법(있다면)의 성질, 및 사용되는 특정 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 인자에 따라 변할 것이다. 이 경우에, 양은 다음 중의 하나 이상을 이에 제한되지 않지만 초래한다면 치료학적으로 유효한 것으로 생각된다: (a) 종양 성장(예를 들면, B-세포 암)의 억제; 및 (b) B-세포 암의 역전 또는 안정화.
환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량은 환자의 연령 및 신장, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자가 성인 환자에서 치료 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 지속시간은 조정될 수 있다. 이중특이성 항원-결합 분자를 투여하기 위한 유효 투여량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있다; 예를 들면, 환자 치료경과는 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있으며, 따라서 용량도 조절된다. 더욱이, 투여량의 종간 스케일링(interspecies scaling)은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들면, 문헌[Mordenti 등, 1991 , Pharmaceut. Res. 8:1351] 참조).
각종 전달 시스템, 예를 들면, 리포솜, 미립자, 미세캡슐의 캡슐화, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도사이토시스가 공지되어 있으며, 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다[예를 들면, 문헌(Wu 등, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) 참조]. 도입 방법은 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 당해 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 니들 및 시린지를 사용하여 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치(pen delivery device)는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 교체가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 약제학적 조성물이 모두 투여되어 카트리지가 비워지게 되면, 빈 카트리지를 폐기하고 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 쉽게 대체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치의 경우, 대체가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장소에 수용된 약제학적 조성물로 사전 충전된다. 일단 저장소의 약제학적 조성물이 비워지게 되면, 전체 장치를 폐기한다.
다수의 재사용가능한 펜 및 오토인젝터(autoinjector) 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 그 예로는, 단지 몇 개만을 들자면, AUTOPEN™(제조원: 영국 우드스톡 소재의 Owen Mumford, Inc.), DISETRONIC™ 펜(제조원: 스위스 베르크도르프 소재의 Disetronic Medical Systems), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(제조원: 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Eli Lilly and Co.), NOVOPEN™ I, II 및 III(제조원: 덴마크 코펜하겐 소재의 Novo Nordisk), NOVOPEN JUNIOR™(제조원: 덴마크 코펜하겐 소재의 Novo Nordisk), BD™ 펜(제조원: 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 Becton Dickinson), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ 및 OPTICLIK™(제조원: 독일 프랑크푸르트 소재의 sanofi-aventis)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 예로는, 단지 몇 개만을 들자면, SOLOSTAR™ 펜(제조원: sanofi-aventis), FLEXPEN™(제조원: Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(제조원: Eli Lilly), SURECLICK™ 오토인젝터(미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재의 Amgen), PENLET™(독일 슈투트가르트 소재의 Haselmeier), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA™ 펜(미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 Abbott Labs)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 상황에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다[참조: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201]. 또 다른 실시형태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있고; 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida]을 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템이 조성물의 표적의 부근에 위치될 수 있고, 이에 따라, 전신 용량의 분획만을 필요로 할 수 있다[예를 들면, Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 참조]. 다른 제어 방출 시스템은 문헌[참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533]의 검토에서 논의된다.
주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 용량 형태를 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 제제는 공공의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 제제는, 예를 들면, 주사용으로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 상기한 항체 또는 이의 염을 용해시키거나, 현탁시키거나, 유화시킴으로써 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들면, 생리학적 염수, 글루코스 및 기타 보조제를 함유하는 등장액 등이 있고, 이들은 적절한 가용화제, 예를 들면, 알콜(예를 들면, 에탄올), 다가 알콜(예를 들면, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들면, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자 오일의 폴리옥시에틸렌(50mol) 부가물)] 등과 조합하여 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들면, 호마 오일, 대두 오일 등이 사용되고, 이들은 가용화제, 예를 들면, 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 조합하여 사용될 수 있다. 이로써 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플 내에 충전된다.
유리하게는, 상기한 경구 또는 비경구용 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량을 조절하기에 적합한 단위 용량의 용량 형태로 제조된다. 단위 용량의 이러한 용량 형태는, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 상술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 용량으로의 용량 형태당 약 5 내지 약 500mg이며; 특히, 주사제 형태의 경우에는 상술한 항체가 약 5 내지 약 100mg 및 다른 용량 형태의 경우에는 약 10 내지 약 250mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항원-결합 분자의 치료학적 용도
본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD3 및 표적 항원(예를 들면, CD20)에 특이적으로 결합하는 항-CD3 항체 또는 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하는 치료학적 조성물을 투여함을 포함하는 방법을 포함한다. 치료학적 조성물은 본원에 개시되는 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원-결합 분자 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 표현 "치료를 필요로 하는 대상체"는 암의 하나 이상의 증상 또는 지표를 나타내거나, CD20 활성의 억제 또는 감소, 또는 CD20+ B 세포의 고갈 또는 CD20+ B 세포 종양의 퇴화가 이로울 수 있는, 인간 또는 비-인간 동물(예를 들면, 종양을 발현하거나 본원의 하기에 언급되는 암들 중 임의의 암을 앓고 있는 대상체)을 의미한다.
본 발명의 항체 및 이중특이성 항원-결합 분자(및 이를 포함하는 치료학적 조성물)는, 특히, 면역 반응의 자극, 활성화 및/또는 표적화가 이로울 수 있는 임의의 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자는 CD20 발현 또는 활성 또는 CD20+ B 세포의 증식과 관련되거나 이들에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 치료학적 방법이 달성되는 작용 메커니즘은, 예를 들면, 아폽토시스, 식세포 작용에 의한, 또는 이들 메커니즘 또는 유사한 세포독성 메카니즘 중 2개 이상의 조합에 의한, 효과기 세포의 존재하에서 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 포함한다. 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자를 이용하여 억제되거나 사멸될 수 있는 CD20을 발현하는 세포는, 예를 들면, 종양원성 B 세포를 포함한다.
종양 부담의 감소 또는 종양 퇴화는 대상체에서에서 종양 또는 종양들의 부분적인 또는 완전한 소멸을 포함한다. 종양 퇴화는 종양 부담을 낮추거나 질환 상태의 중증도를 덜하게 하는 쪽의 동향을 나타내는 것으로 이해된다. 그와 같이, 퇴화는 종양 크기의 감소 및/또는 종양 수의 감소를 포함한, 신체에서의 측정가능한 악성 종양의 점진적인 감소 제거이다. 종양 발달의 감소는 추가의 또는 새로운 종양 성장의 부분적인 또는 완전한 억제 또는 저해를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자는, 예를 들면, 뇌 및 뇌척수막, 인두, 폐 및 기관지, 위장관, 수컷 및 암컷 생식관, 근육, 골, 피부 및 부속 기관, 결합 조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 특정 감각 기관, 예를 들면, 눈에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 표적화 및 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 하기 암들 중 하나 이상을 치료하는데 사용된다: 신장 세포 암종, 췌장 암종, 유방암, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 결장직장암, 위암(예를 들면, MET 증폭을 갖는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 또는 흑색종. 특정의 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이성 항원-결합 분자는 B 세포 암(예를 들면, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종[NHL], 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종, 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병/소형 림프구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프 형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종, 소포성 림프종, 피부 여포성 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 모발 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식-후 림프증식성 장애, 발덴스트롬 거대 글로불린혈증, 및 역형성 거대-세포 림프종)을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자는 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴화를 야기하거나, 종양 성장을 억제하거나 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 몇몇 예시적인 실시형태에서, 투여되는 양은 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 또 다른 실시형태에서, 투여되는 양은 약 0.4 mg/kg이다. 또 다른 실시형태에서, 투여되는 양은 약 0.04 mg/kg이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 투여되는 양은 약 0.004 mg/kg이다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 항원-결합 분자는 항-CD20 요법 단독에 대해 내성(예를 들면, 리툭시맙 요법에 대해 내성)이거나 불완전 반응성인 B-세포 림프종(예를 들면, NHL)에 걸린 환자를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 또 다른 관련된 실시형태에 따르면, 항-CD20 요법에 대해 난치성인 B-세포 림프종(예를 들면, NHL)에 걸린 환자(예를 들면, 리툭시맙-난치성 종양을 갖거나 재발된 또는 난치성 B-세포 림프종을 갖는 환자)에게 본원에 개시되는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 투여함을 포함하는 방법이 제공된다. 당업계에 공지된 분석/진단 방법, 예를 들면, 종양 스캐닝 등을 이용하여, 환자가 항-CD20 요법 단독에 대해 내성이거나 불완전 반응성이거나 난치성인 종양을 갖는지를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 잔류 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "잔류 암"은 항암 요법으로의 치료 후 대상체에서의 하나 이상의 암성 세포의 존재 또는 지속을 의미한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 대상체가 항-CD20 단일요법을 투여받은 후(예를 들면, 리툭시맙과 같은 항-CD20 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 후) 대상체에게 본원의 다른 곳에 기술되는 이중특이성 항원-결합 분자들 중 하나 이상을 투여함을 포함하는, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애(예를 들면, B 세포 림프종)를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 대상체가 항-CD20 단일요법(예를 들면, 리툭시맙 치료 또는 이의 등가 치료)을 투여받은지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 1년, 또는 그 이상 후에 환자에게 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 투여함을 포함하는, B 세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
병용 요법 및 제형
본 발명은 본원에 기술되는 예시적인 항체 및 이중특이성 항원-결합 분자 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물을 하나 이상의 추가의 치료제와 병용하여 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항원-결합 분자와 병용될 수 있거나 병용하여 투여될 수 있는 예시적인 추가의 치료제로는, 예를 들면, EGFR 길항제(예를 들면, 항-EGFR 항체[예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소분자 억제제[예를 들면, 게피티닙 또는 에를로티닙]), 다른 EGFR 패밀리 구성원의 길항제, 예를 들면, Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4(예를 들면, 항-ErbB2, 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제제), EGFRvIII의 길항제(예를 들면, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), cMET 길항제(예를 들면, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제(예를 들면, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제(예를 들면, 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제제(예를 들면, 항-PCGFR-α 항체), PDGFR-β 억제제(예를 들면, 항-PDGFR-β 항체), VEGF 길항제(예를 들면, VEGF-트랩, 예를 들면, US 제7,087,411호(본원에서 "VEGF-억제성 융합 단백질"이라고 함) 참조), 항-VEGF 항체(예를 들면, 베바시주맙), VEGF 수용체의 소분자 키나제 억제제(예를 들면, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙)), DLL4 길항제(예를 들면, 제US 2009/0142354호에 개시되어 있는 항-DLL4 항체), Ang2 길항제(예를 들면, 제US 2011/0027286호에 개시되어 있는 항-Ang2 항체, 예를 들면, H1H685P), FOLH1 길항제(예를 들면, 항-FOLH1 항체), PRLR 길항제(예를 들면, 항-PRLR 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제(예를 들면, 항-STEAP1 항체 또는 항 STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제(예를 들면, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제(예를 들면, 항-MSLN 항체), CA9 길항제(예를 들면, 항-CA9 항체), 유로플라킨 길항제(예를 들면, 항-유로플라킨 항체), 항-CTLA4 항체(예를 들면, 이필리무맙(MDX-010)), 1가의 CD20 길항제(예를 들면, 1가의 항-CD20 항체, 예를 들면, 리툭시캅) 등이 포함된다.
본 발명의 항원-결합 분자와 병용하여 이롭게 투여될 수 있는 다른 제제는 면역 활성제 또는 억제제를 포함한다. 특정 면역 활성제 또는 억제제는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같은 사이토킨에 또는 이들 각각의 수용체에 결합하는 소분자 화합물 및 항체를 포함한, 사이토킨 활성제 또는 억제제이다. 본 발명의 약제학적 조성물(예를 들면, 본원에 개시되어 있는 항-CD3/항-CD20 이중특이성 항원-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물)은 또한 "ICE": 이포스파미드(예를 들면, Ifex®), 카보플라틴(예를 들면, Paraplatin®), 에토포시드(예를 들면, Etopophos®, Toposar®, Vepesid®, VP-16); "DHAP": 엑사메타손(예를 들면, Decadron®), 시타라빈(예를 들면, Cytosar-U®, 시토신 아라비노사이드, ara-C), 시스플라틴(예를 들면, Platinol®-AQ); 및 "ESHAP": 에토포시드(예를 들면, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), 메틸프레드니솔론(예를 들면, Medrol®), 고용량 시타라빈, 시스플라틴(예를 들면, Platinol®-AQ)으로부터 선택되는 하나 이상의 치료학적 병용물을 포함하는 치료학적 용법의 일부로서 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 항원-결합 분자들 중 임의의 분자 및 VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, 유로플라킨, 또는 상기 언급된 사이토킨들 중 임의의 사이토킨 중의 하나 이상의 억제제를 포함하는 치료학적 병용물을 포함하고, 여기서, 상기 억제제는 압타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디, 나노바디, 또는 항체 단편(예를 들면, Fab 단편; F(ab')2 단편; Fd 단편, Fv 단편; scFv; dAb 단편; 또는 다른 조작된 분자, 예를 들면, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 최소 인식 단위)이다. 또한, 본 발명의 항원-결합 분자는 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드 및/또는 NSAID와 병용하여 투여되고/되거나, 이들과 공동-제형화될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 또한 방사선 치료 및/또는 종래의 화학요법도 포함하는 치료 용법의 일부로서 투여될 수 있다.
추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본 발명의 항원-결합 분자의 투여 직전에, 이의 투여와 동시에, 또는 이의 투여 직후에 투여될 수 있다(본 개시의 목적을 위해, 이러한 투여 용법은 항원-결합 분자를 추가의 치료학적 활성 성분"과 병용하여" 투여하는 것으로 간주된다).
본 발명은 본 발명의 항원-결합 분자가, 본원의 다른 곳에 기술되는 추가의 치료학적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 공동-제형화되는 약제학적 조성물을 포함한다.
투여 용법
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 항원-결합 분자(예를 들면, 항-CD3 항체 또는 CD20 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자)의 다중 용량이 정의된 시간 경과에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따르는 방법은 본 발명의 항원-결합 분자의 다중 용량을 대상체에게 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 "순차적으로 투여하는"은 항원-결합 분자의 각각의 용량을 상이한 시점에, 예를 들면, 소정 간격(예를 들면, 시간, 일, 주 또는 개월)으로 떨어진 다른 날에 대상체에게 투여함을 의미한다. 본 발명은 환자에게 단일 개시 용량의 항원-결합 분자를 투여하고, 이어서, 항원-결합 분자의 1회 이상의 2차 용량을 투여하고, 이어서, 임의로, 항원-결합 분자의 1회 이상의 3차 용량을 투여하는 것을 순차적으로 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "개시 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 본 발명의 항원-결합 분자의 투여의 시간적 순차를 말한다. 따라서, "개시 용량"은 치료 용법을 시작할 때에 투여되는 용량("기준선 용량"이라고도 함)이고; "2차 용량"은 개시 용량 후에 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 후에 투여되는 용량이다. 개시, 2차, 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항원-결합 분자를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 측점에서 서로 상이할 것이다. 그러나, 특정 실시형태에서, 개시, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 항원-결합 분자의 양은 치료의 과정 동안 서로 다르다(예를 들면, 적절하게 상향 또는 하향 조정됨). 특정 실시형태에서, 치료 용법을 시작할 때에 "부하 용량(loading dose)"으로서 2회 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 또는 5회)의 용량이 투여되고, 이어서, 보다 적은 빈도로 투여되는 후속적 용량(예를 들면, "유지 용량(maintenance dose)")이 투여된다.
본 발명의 하나의 예시적인 실시형태에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 직전 용량 후 1 내지 26주(예를 들면, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½, 또는 그 이상)에 투여된다. 본원에서 사용되는 어구 "직전 용량"은, 다중 투여의 순차에서, 개재 용량(intervening dose) 없이 순차에서 바로 다음의 용량 투여 전에 환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량을 의미한다.
본 발명의 이러한 측면에 따르는 방법은 항원-결합 분자(예를 들면, CD20 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항원-결합 분자)의 2차 및/또는 3차 용량의 임의의 횟수를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 단일 2차 용량만이 환자에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 2회 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회, 또는 그 이상)의 2차 용량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 특정 실시형태에서, 단일 3차 용량만이 환자에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 2회 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회, 또는 그 이상)의 3차 용량이 환자에게 투여된다.
다중 2차 용량과 관련된 실시형태에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 2차 용량은 직전 용량 후 1 내지 2주에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다중 3차 용량과 관련된 실시형태에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 3차 용량은 직전 용량 후 2 내지 4주에 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 용법의 과정에 따라 변할 수 있다. 투여의 빈도는 또한 임상 실험에 따른 개별 환자의 요구에 따라 의사에 의한 치료 과정 동안에 조정될 수 있다.
항체의 진단적 용도
본 발명의 항-CD3xCD20 항체는 또한, 예를 들면, 진단 목적으로 샘플에서 CD3, 또는 CD3-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-CD3xCD20 항체, 또는 이의 단편을 CD3의 비정상적 발현(예를 들면, 과발현, 미만-발현, 발현의 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단할 수 있다. CD3에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들면, 환자로부터 수득된 샘플을 본 발명의 항-CD3xCD20 항체와 접촉시킴을 포함할 수 있으며, 여기서, 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-CD3xCD20 항체는 자체적으로 검출가능하게 표지된 이차 항체와 병용하여 진단 용도로 사용될 수 있다. 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예를 들면, 3H,　144C,　32P,　35S, 또는 125l; 형광성 또는 화학발광성 모이어티, 예를 들면, 플루오레세인 이소티아시아네이트, 또는 로다민; 또는 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 또는 루시페라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 중에서 CD3을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 및 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다.
본 발명의 항-CD3xCD20 항체는 또한 샘플에서 CD20, 또는 CD20-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는데, 또는 비슷하게 CD20의 비정상적인 발현(예를 들면, 과발현, 미만-발현, 발현의 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 CD3 또는 CD20 진단 검정에서 사용될 수 있는 샘플은 검출가능한 양의 CD3 및/또는 CD20 단백질, 또는 이의 단편을 함유하는 환자로부터 정상적인 또는 병리학적 병태 하에 수득될 수 있는 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(예를 들면, 비정상 CD3 또는 CD20 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태에 걸리지 않은 환자)로부터 수득된 특정 샘플 중의 CD3또는 CD20의 수준을 측정하여 기준선, 또는 표준 수준의 CD3 또는 CD20을 초기에 확립할 것이다. 이어서, CD3 또는 CD20의 기준선 수준을 각각 CD3- 또는 CD20-관련된 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 샘플 중에서 측정된 CD3의 수준에 대해 비교할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 당업계의 통상의 숙련가에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하도록 제시되고, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 수(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정확도를 확보하기 위한 노력이 이루어져 왔지만, 몇몇의 실험 오차 및 편차는 고려되어야만 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 도이고, 압력은 대기압이거나 대기압 부근이다.
실시예 1. 항- CD3 및 항- CD20 항체의 제조
항-CD3 또는 항-CD20 항체를 단리하기 위한 몇가지 방법들이 공지되어 있다. 하기 실시예에서 사용되는 완전 인간 항-CD3 항체는, 제US 2007/0280945A1호에 기재된 바와 같이, 골수종 세포에 융합 없이, 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리하였다.
항-CD3 항체의 추가의 예들이 방법에 사용될 수 있으며, 이러한 항체의 설명 및 이러한 항-CD3 항체의 생물학적 특성은 2013년 9월 19일자로 출원된 PCT 국제 출원 제PCT/US13/60511호에 기재되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함되어 있다. 예시적인 항-CD20 항체 및 이러한 항-CD20 항체의 생물학적 특성은 US 제7,879,984호 및 2013년 9월 19일자로 출원된 PCT 국제 출원 제PCT/US13/60511호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
항-CD20 항체 및 이 실시예의 이중특이성 항체를 작제하는데 사용되는 항체를 제조하는 방법은 US 제7,879,984호에 기재된 바와 같다.
본 발명의 이중특이성 항체의 항-CD3 항원-결합 아암 및 항-CD20 결합 아암을 작제하는데 사용되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자가 표 1에 제시되어 있다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 제시되어 있다.
표 1: 아미노산 서열 식별자 (서열번호)
Figure 112016101405608-pct00008

표 2: 핵산 서열 식별자 (서열번호)
Figure 112016101405608-pct00009

실시예 2. CD3 및 CD20 에 결합하는 이중특이성 항체의 생성
항-CD3-특이 결합 도메인 및 항-CD20-특이 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항체는 항-CD3 항체로부터의 중쇄 및 동족 경쇄를 항-CD20 항체로부터의 중쇄와 조합하는 표준 방법을 사용하여 상기 서열로 작제하였다.
그와 같이, 본 실시예에 따라 생성된 이중특이성 항체는 두 개의 별개의 항원-결합 도메인(즉, 결합 아암)을 포함한다. 제1 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 경쇄 가변 영역("CD3-VL")과 쌍을 이룬, 항-CD20 항체로부터 유도된 중쇄 가변 영역("CD20-VH")을 포함한다. CD20-VH/CD3-VL 쌍은 CD20을 특이적으로 인지하는 항원-결합 도메인을 생성한다. 제2 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 경쇄 가변 영역("CD3-VL")과 쌍을 이룬, 항-CD3 항체로부터 유도된 중쇄 가변 영역("CD3-VH")을 포함한다. CD3-VH/CD3-VL 상은 쌍은 CD3을 특이적으로 인지하는 항원-결합 도메인을 생성한다. 동일한 CD20-VH가 본 실시예에서 생성된 모든 이중특이성 항체에 사용되었으며, "CD20-VH-A"라고 명명하였다.
각각의 중쇄에 대한 야생형 중쇄 불변 도메인(CH)은 재조합 기술에 의해 키메라성 CH로 대체하였다. 하나의 결합 아암(예를 들면, 항-CD3 결합 아암)의 CH는 이중특이성의 분리를 촉진하는 CH의 CH3 영역의 돌연변이를 함유한다.
당해 실시예에 따라 제조된 다양한 이중특이성 항체의 성분 부분의 요약이 표 3 및 표 4에 제시되어 있다.
표 3: 아미노산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00010

표 4: 핵산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00011

표 5 및 6은 당해 실시예의 이중특이성 항체의 각종 중쇄 가변 영역(표 5) 및 경쇄 가변 영역(표 6)에 대한 아미노산 서열 식별자와 상응하는 CDR를 열거한다.
표 5: 중쇄 아미노산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00012

표 6: 경쇄 아미노산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00013

또한, 표 7 및 8은 당해 실시예의 이중특이성 항체의 각종 중쇄 가변 영역(표 7), 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 가변 영역(표 8)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 식별자와 이들의 상응하는 CDR를 열거한다.
표 7: 중쇄 핵산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00014

표 8: 경쇄 핵산 서열 식별자
Figure 112016101405608-pct00015

상기한 이중특이성 항체에 더하여, 하기 대조군 항체가 또한 다음 실시예들에 기재된 특정 실험에 사용되었다:
대조군 항체 1: US 제4,361,549호에 기재되고 하이브리도마 CRL-8001(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 이용가능한 인간 T-세포 표면 항원에 대한 단일클론성 항체 "OKT-3".
대조군 항체 2: BD Pharmagen, Cat # 55052로부터 이용가능한, 인간 T 림프구 세포 상의 T3 복합체의 엡실론 쇄에 대해 반응성인 항체 "SP34".
대조군 항체 3: US 제5,736,137호에 개시된 바와 같은, Rituxan®(리툭시맙)의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-CD20 치료 항체.
(대조군) 항체 4: CD3xCD20 항체-야생형 Fc(wtFc)로도 공지됨, 단리를 용이하게 하기 위해 CH3 도메인에 서열번호 2/18의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍(서열번호 4-6-8-20-22-24의 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열), 및 야생형 lgG1 CH 영역(서열번호 45)을 포함하는 항-CD20 아암; 및 서열번호 10/18의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍(서열번호 12-14-16-20-22-24의 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열), 및 2개의 아미노산 변형을 갖는 야생형 lgG1 CH 영역(서열번호 48)을 포함하는 항-CD3 아암을 갖는 이러한 항체는 상기 방법과 유사하게 제조되었다. CD3xCD20 항체-wtFc(항체 4)는, 항체 효과기 기능, 또는 기타의 특성들을 상이한 Fc 도메인 서열 또는 구조를 갖는 항체와 비교할 목적으로 야생형 lgG1 Fc 도메인을 갖는 매칭된 대조군 항체라고 할 수 있다(즉, 본 발명의 CD3xCD20-키메라성 Fc 항체의 항원-결합 도메인에 매칭됨).
대조군 항체 5: 항-FelD1 단일클론성 항체는 인간 CD20 또는 CD3에 대한 교차-반응성 없이 고양이 항원에 결합한다. 이러한 lgG1 비특이성 항체 대조군은 2013년 11월 7일자로 공개된 PCT 공개 제WO2013/166236호에 기재된 방법으로 수득되었다.
대조군 항체 6: 항-FelD1 항원-결합 도메인은, PCT 공개 제WO2013/166236호에 기재된 바와 같이, Ab 1에 유사하게 키메라성 lgG4 Fc 도메인을 함유하도록 본원에 기재된 바와 같이 조작되었다. 대조군 Ab 6은 인간 CD20 또는 CD3에 대한 교차-반응성을 갖지 않지만, Ab 1에 유사한 효과기 기능을 갖는다.
실시예 3. 키메라성 중쇄 작제
키메라성 중쇄, 예를 들면, 키메라성 CH lgG4(서열번호 26) 및 키메라성 CH lgG1(서열번호 30)은, 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 먼저, 키메라성 lgG4 CH를 2단계 PCR 증폭 과정을 통해 생성하였다. 두 개의 PCR 단편, 단편 1 및 2를 각각 CH 영역, P1-P2 및 P3-P4를 플랭킹하는 프라이머 쌍을 사용하는 야생형 hlgG4 CH DNA를 함유하는 출발 벡터 작제물 pR001을 사용하여 증폭시켰다(아래 표 9 참조). 프라이머는 목적하는 lgG2 하부 힌지 서열(이것은 서열번호 52를 암호화한다) 및 플랭킹 제한 부위 둘 다를 단편에 도입하였다. 그후, 이러한 두 개의 단편을 PCR 프라이머 P2 및 P4를 사용하여 결합시켰다. 생성된 서열을 Xho1-Not1 제한 부위를 통해 pR001에 삽입하여 lgG2 하부 힌지 서열을 갖는 키메라성 lgG4 CH를 함유하는 벡터 작제물 pR002를 생성하였다. 서열은 프라이머 P10 및 P11을 사용하여 확인하였다.
또한, 키메라성 lgG1 CH는 다중 단계 PCR 증폭을 통해 생성하였다. 단편 1a은 주형 pR85503(이것은 야생형 인간 lgG1 CH DNA를 함유한다)으로부터 프라이머 P2 및 P5(아래 표 9 참조)를 사용하여 생성하였다. 단편 2a는 주형으로서 pR002(키메라성 lgG4 CH DNA를 함유함)를 사용하여 프라이머 P6 및 P8로 증폭시켰다. 단편 3은 주형 pR003(야생형 hlgG1 CH DNA; 서열번호 45)으로부터 프라이머 P7 및 P9를 사용하여 제조하였다. 단편 1a 및 2a를 프라이머 P2 및 P8를 사용하여 결합시켰으며, 이것이 단편 4를 생성하였다. 단편 2a 및 3을 프라이머 P6 및 P9를 사용하여 결합시켜 단편 5를 생성하였다. 그후, 단편 4 및 5를 프라이머 P2 및 P9를 사용하여 융합시켰다. 생성된 서열을 Xho1-Not1 제한 부위를 통해 pR001에 삽입하여 lgG1 불변 영역과 lgG2 하부 힌지 및 lgG4 CH2 도메인을 갖는 작제물 pR004를 생성하였다. 서열은 프라이머 P10 및 P11을 사용하여 확인하였다.
표 9: 키메라성 C H 　핵산 작제물의 PCR 생성을 위한 프라이머
Figure 112016101405608-pct00016

실시예 4. CD20 x CD3 이중특이성 항체는 단일특이성 항체와 비교하여 Jurkat, Raji 및 원숭이 T-세포에 선택적으로 결합한다
CD3xCD20 항체-wtFc(대조군 항체 4)를 Jurkat (CD3+, CD20- 인간 T-세포주), Raji (CD3-, CD20+ 인간 B-세포주), 또는 사이노몰거스 PBMC("mkT 세포")에 결합할 수 있는 이들의 능력에 대해 FACS 결합 방법을 통해 실시예 2에 제시된 바와 같이 일특이성 대조군 항체와 비교하였다.
FACS 데이터는 다음의 프로토콜을 사용하여 획득하였다: 웰당 2x105개의 세포를 연속 희석된 항체와 빙상에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 세척하고 적합한 이차 항체(Jurkat, Raji 세포) 또는 이의 칵테일(cyno PBMC의 경우)을 가하고 추가로 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 세척하고, 1% BSA를 함유하는 냉 PBS에 재현탁시키고, BD FACS Canto II 상에서 유동 세포계측에 의해 분석하였다. Jurkat 및 Raji 세포는 측방 및 전방 산란기에 의해 게이팅되는 반면 사이노몰거스 T 세포는 또한 CD2+CD4+ 집단으로서 게이팅되었다. 세포 결합 적정을 위한 EC50은 4-매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산된 값으로 Prism 소프트웨어를 사용하여 구하였다. 결과가 표 10에 나타내어져 있다.
표 10: 일특이성 vs. CD3xCD20 이중특이성 항체에 대한 EC50 결합 값 (몰)
Figure 112016101405608-pct00017

표 10에 나타낸 바와 같이, 시험된 항체의 패널은 이들의 특이성에 따라, 다양한 세포주에 대한 광범위한 결합 친화도를 나타내었다. 이중특이성 대조 항체 4는 인간 및 사이노몰러스 표적주 둘 다에 결합하는 능력을 나타내었다. 대조군 항체 4는 본 발명의 항체 1 및 항체 2와 동일한 항-CD3xCD20 가변 영역을 포함하지만, 야생형 lgG1 CH 영역을 갖는다. 항-CD3 대조군 1(OKT3), 항-CD3 대조군 2(SP34), 및 항-CD20 대조군 3은 각각 Jurkat, 사이노몰거스 T 세포, 및 RAJI에 결합되었다.
실시예 5. 야생형 CH를 갖는 CD20 x CD3 이중특이성 항체는 활성화된 T-세포의 존재하에서 Raji 세포에 대한 세포독성을 유도한다
CD20 x CD3 이중특이성 항체가 CD20-발현 Raji 세포에 대해 T-세포 매개된 사멸을 재지시하는 능력을 시험관내 세포독성 검정으로 시험하였다. 또한, 이중특이성 항체와 모 항-CD3 항체 둘 다가 Fc/FcR 상호작용을 통해 U937 세포를 사멸시키는 능력을 또한 연구하였다.
칼세인 사멸 검정은 다음의 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 인간 및 사이노몰거스 PBMC를 각각 ficoll-플라크 상에서 또는 Lympholyte 포유동물 세포 분리 배지를 통해 단리하였다. 단리된 PBMC를 수 일의 과정에 걸쳐 재조합 인간 IL-2(30 U/ml) 및 T-세포 할성화 비드(인간 PBMC의 경우 항-CD3/CD28, 사이노몰거스 PBMC의 경우 항-CD2/CD3/CD28)를 함유하는 배지로 활성화시켰다.
표적 세포(CD20 매개된 사멸의 경우 Raji 및 FcR 매개된 사멸의 경우 U937)를 칼세인으로 표지하고, 37℃에서 3시간의 과정에 걸쳐 항체의 3배 연속 희석을 사용하여 10:1 효과기: 표적 비에서 활성화된 T-세포와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 형광 분석을 위해 반투명 흑색의 투명 바닥 플레이트로 옮겼다. 50% 세포독성을 유도하는 이중특이성 항체의 몰 농도로서 정의된 EC50을 Prism을 사용하여 구하였다. 값은 4-매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였다. 결과가 표 10에 요약되어 있다.
표 11: Raji 및 U937 세포에의 CD20 x CD3-유도된 세포독성에 대한 EC 50 값
Figure 112016101405608-pct00018

표 11에 나타낸 바와 같이, 인간-특이성 및 사이노몰거스 교차 반응성 항-CD3 아암, 및 야생형 lgG1 CH 영역을 함유하는 이중특이성 CD20 x CD3 항체는 인간 활성화된 T 세포의 존재하에서 Raji 세포에 대한 세포독성을 특이적으로 재지시할 수 있었다. 사이노몰거스 활성화된 T 세포의 존재하에서, Raji는 이들이 원숭이 T-세포를 활성화시키는 항-CD3 아암을 갖는 대조군 Ab 4 이중특이성 항체와 항온처리되었을 경우 사멸하였다. 이중특이성 항체 뿐만 아니라 대조군 Ab 1(항-CD3 mAb) 둘 다는 U937 Fc/FcR 의존적 사멸 검정에서 활성을 나타내었다. 이 활성은 블록킹 비특이성 인간 IgG를 반응에 가함으로써 차단될 수 있다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 6. 키메라성 CH 영역을 포함하는 CD20 x CD3 이중특이성 항체는 CDC 검정에서 감소된 효과기 기능을 나타낸다
실시예 2에 상기 기재된 바와 같은 키메라성 CH 영역을 갖는 CD20xCD3 이중특이성 항체(항체 1 및 항체 2)를 효과기 기능을 변형시키거나 감소시키도록 조작하였다. lgG1 이소타입(대조군 Ab 4)의 야생형 (wt) 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체와 비교하여, CH 영역에서의 아미노산 치환은 Ig Fc가 이의 수용체(들)에 결합하는 능력을 방해할 수 있다. 따라서, 신호전달 및 면역 반응, 예를 들면, B 세포 활성화 또는 식균 작용이 변할 수 있다. 보체 의존성 세포독성(CDC)(당해 실시예에서) 및 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC) 효과기 기능(실시예 7 참조)에 대한 CH 영역에서의 아미노산 변형의 효과를 실험하였다.
CDC 효과기 기능에 대한 항체 1 및 항체 2의 효과를 실험하기 위해, CD20-발현 Raji (표적) 세포 (5000/웰) 또는 Daudi 세포를 5% 인간 혈청 보체의 존재하에서 플레이팅하였다. 100nM에서 시작하여, 항체 1, 항체 2 및 대조군 항체의 연속 희석물을 37℃에서 4시간 동안 세포에 가하였다. 표적 세포 용해를 CytoTox Glo™ 키트(Promega)를 사용하여 구하고, 세포독성 퍼센트를 계산하였다.
세포독성 퍼센트는 다음의 방정식을 사용하여 계산하였다:
% 세포독성 = ((LS　- LSR)/(LMR-LSR))*100%, 여기서, LSR은 기준선 표적 세포 발광이고, LMR은 디기토닌에 의해 용해된 세포로부터의 최대 칼세인 방출이다. 세포독성에 대한 EC50은 Prism 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 구하였다. 값은 4-매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였으며 표 12, 및 도 5a와 5b에 나타내어져 있다.
Daudi 및 Raji 세포에 대한 항체 1 및 항체 2의 CDC 활성은 wt 중쇄 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 상당히 감소된다. 표 12, 및 도 5a/b 참조. 몇몇 CDC 활성이 Raji 세포에 대해 항체 1로 관찰되었지만, 전반적인 결과는 키메라 항체가 wt lgG1 Fc 대조군 항체보다 더 약한 효과기 반응을 가짐을 보여준다.
표 12: 키메라성 CH 영역을 포함하는 CD20xCD3 이중특이성 항체는 효과기 기능을 측정하는 CDC 검정에서 감소된 활성을 나타낸다
Figure 112016101405608-pct00019

실시예 7. 키메라성 CH 영역을 포함하는 CD3xCD20 이중특이성 항체는 ADCC 검정에서 감소된 효과기 기능을 보여준다
ADCC 효과기 기능에 대한 항체 1 및 항체 2 vs. 야생형 CH 영역(및 동일한 가변 영역)을 갖는 이중특이성 항체의 효과를 실험하기 위해, FcγRIIIA의 보다 높은 친화도 V 대립형질을 발현하도록 조작된 새로 단리한 비자극된 CD56-양성 NK 세포 또는 NK92 세포를 키메라성 CH-항체(항체 1 및 항체 2) 및 wt-CH 대조군 항체(대조군 항체 4)의 존재하에서 칼세인-표지된 CD20-양성 Raji 또는 Daudi 세포로 플레이팅하였다. 표적 세포로부터의 칼세인 방출을 모니터링하고, 세포독성 퍼센트를 구하였다. 세포독성 퍼센트 및 EC50은 상기 CDC 검정에 대해 기재된 바와 같이 계산하였다. 결과가 표 13 및 도 6a와 6b에 나타내어져 있다.
키메라성 CH 항체, 항체 1 및 항체 2는 Raji 또는 Daudi 세포에 대한 ADCC 활성을 매개하지 않는다(표 13).
표 13: 키메라성 CH 영역을 포함하는 CD3 x CD20 이중특이성 항체는 효과기 기능을 측정하는 ADCC 검정에서 감소된 활성을 나타낸다
Figure 112016101405608-pct00020

실시예 8. 키메라 항체의 표면 플라스몬 공명 유도된 결합 친화도 및 동역학 상수
키메라성 불변 중쇄 영역을 항-CD3 x 항-CD20 이중특이성 항체인 항체 1 및 항체 2를 인간 및 사이노몰거스 Fcγ 수용체에 대한 이들의 동적 결합 파라미터를 구하기 위해 표면 플라스몬 공명(SPR)(Biacore) 기술을 사용하여 분석하였다. 이소타입 대조군, 즉, wt-lgG1 이소타입 대조군 및 wt-lgG4 CPPC 이소타입 대조군을 유사한 방식으로 시험하였다.
간략하게, SPR 실험은 카복시메틸 덱스트란-코팅된 (CM-5) 칩을 사용하는 Biacore T200 기기 상에서 25℃에서 수행하였다. 마우스 단일클론성 항-펜타-히스티딘 항체(GE Healthcare)를 표준 아민-커플링 화학을 사용하여 CM-5 센서 칩의 표면 상에 고정하였다. His-태그된 인간 또는 원숭이 FcγR 단백질의 140RU-376RU를 항-펜타-히스티딘 아민-커플링된 CM-5 칩 상에 포획하고, 항체의 스톡 용액을 포획된 단백질 상에 2.5분 동안 20㎕/min으로 주입하였다. mAb 결합 반응을 모니터링하고, 저 친화도 수용체에 대해, 정상-상태 결합 평형을 계산하였다. 데이터를 프로세싱하고 Scrubber 2.0 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 피팅시킴으로써 동적 회합(ka) 및 해리(kd) 속도 상수를 구하였다. 결합 해리 평형 상수(KD)℃ 및 해리 반감기(ti/2)는 다음과 같이 동적 속도 상수로부터 계산하였다: KD　(M) = kd　/ ka; 및 t1/2　(min) = (In2/(60*kd).
표 14: 야생형 (wt) 및 키메라성 중쇄 항체에 대한 동적 결합 파라미터
Figure 112016101405608-pct00021

표 14의 결과가 입증하는 바와 같이, 항체 1 및 항체 2 이중특이성 항체는, SPR 검정에서, 야생형 (wt) hlgG1 또는 hlgG4-CPPC CH 영역을 갖는 항체와 비교하여, 인간 FcγRI에 대한 결합을 나타내지 않는다. 본 발명의 키메라성 중쇄 이중특이성 항체는 또한 wt hlgG1 또는 hlgG4-CPPC Fc 서열을 갖는 항체와 비교하여 저-친화도 인간 FcRγ 수용체 중의 몇 가지에 대해 약한 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않는다(예를 들면, 인간 FcRγllA, FcRγllB에서 약한 결합, 인간 FcRγl, FcRγlllA, 또는 FcRγlllB에서는 결합이 검출되지 않음)(아래 표 15).
표 15: 야생형 (wt) 및 키메라성 중쇄 항체에 대한 정상-상태 평형 결합
Figure 112016101405608-pct00022

실시예 9. 키메라 항체의 약동학 프로파일
항체 1 및 항체 2의 독성역학 프로파일은, 단일 30분 IV 주입을 제공받은 다음 12주 관찰 기간을 거친 수컷 사이노몰거스 원숭이(3마리 동물/처리 그룹)로부터의 혈액 샘플을 수득함으로써 평가하였다. 혈청 중의 총 약물 농도의 독성역학 분석을 위한 혈액 샘플은 투여전 및 투여한지 5분, 및 5, 24, 48, 72 및 168시간, 및 14, 21, 35, 49, 66 및 84일 후에 수집하였다. 수득된 혈청 샘플을 직접 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 분석하여 Ab 1 또는 Ab 2의 총 약물 농도를 구하였다. 시험 물품의 독성역학을 비-구획적 분석(Phoenix WinNonLin)을 사용하여 평가하여 약동학 파라미터를 구하였다. 결과가 표 16에 나타내어져 있다(AUC = 농도 vs. 시간 곡선하 면역; Cmax　= 혈청 중의 관찰된 최대 농도).
표 16: 사이노몰거스 원숭이에 단일 정맥 주입한 후의 사이노몰거스 원숭이의 혈청 중의 키메라 항체의 약동학 프로파일
Figure 112016101405608-pct00023

사이노몰거스 원숭이에서 Ab 1 및 Ab 2의 1.0 mg/kg의 단일 정맥 투여 후, 각각 33.4 및 26.0㎍/mL의 평균 피크 농도(Cmax), 및 각각 100 및 61.1 일*ug/ml의 평균 AUC0 -168h 값이 관찰되었다. 겉보기 말단 반감기는 이들 두 분자의 8.14-14.0일 것으로 추정되었다. 데이터는 Ab 1 및 Ab 2에의 연속 노출이 12-주 관찰 기간의 대부분 동안 모든 동물에서 유지되었으며 노출은 처리 그룹에 걸쳐 필적하였음을 나타낸다. 시험 물품으로 겉보기 면역원성은 관찰되지 않았다. Ab 1 및 Ab 2의 전반적인 약동학 프로파일은 사이노몰거스 원숭이에서 투여된 단일클론성 항체를 대표한다.
실시예 10. CD3 x CD20 이중특이성 항체는 단일특이성 항체보다 더 낮은 용량으로 사이노몰거스 원숭이에서 CD20 + B-세포를 고갈시킬 수 있다
항체 1 및 대조군 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체 투여의 생체내 효능을 측정하기 위해, 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중의 CD20+ B-세포 수준의 변화를 일특이성 항-CD20 항체(대조군 Ab 3)와 비교하여 항-CD3xCD20 이중특이성 항체의 투여 후 FACS를 통해 실험하였다. 연구는 다음과 같이 투여 그룹당 3마리 동물로 하여 8개의 투여 그룹으로 조직된 수컷 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 수행하였다: 그룹 1은 위약 그룹(비히클 대조군 투여)이었고; 그룹 2는 단일특이성 항체(대조군 Ab 3; 리툭산)를 30 mg/kg (원숭이에서의 30 mg/kg은 375 mg/m2의 인간 용량과 등가이며, 이것은 최대 임상 용량으로 간주된다)으로 제공받았고; 그룹 3은 0.01 mg/kg의 이중특이성 CD3xCD20 대조군 항체 4이고; 그룹 4 - 0.1 mg/kg의 항체 4; 그룹 5 - 1 mg/kg의 항체 4; 그룹 6 - 0.01 mg/kg의 항체 1; 그룹 7 - 0.1 mg/kg의 항체 1; 그룹 8 - 1 mg/kg의 항체 1. 혈액은 동물에게 투여하기 -7일째 및 -4일째에 채취하였다. 항체 약물 또는 비히클 (위약)의 용량은 i.v. 주입에 의해 투여하였으며 혈액은 투여 후 2, 4, 및 7일째에 채취하였다. 혈액 샘플을 B 세포(CD20; 표 17) 및 T 세포(CD3, 아래 참조) 마커에 대해 FACS에 의해 분석하고 이들 세포의 절대 수를 구하였다.
간략하게, 100㎕의 혈액을 에펜도르프 튜브에서 3분 동안 1.5 ml RBC 용해 완충액과 함께 항온처리하였다. 세포를 0.4xg에서 5분 동안 원심분리하고, FACS 세척액(PBS+3%FBS)으로 2x 세척하고, Fc 차단 시약으로 실온에서 10분 동안 차단하였다. 그후, 세포를 hCD45 및 CD20 형광 시약에 직접 접합된 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. B 세포 하위세트(CD20) 또는 T 세포 하위세트(CD3)의 정량적 측정을 먼저 백혈구(WBC) 집단을 기술하는 CD45 형광 염색 및 측방 산란 특성(SSC) 경계(CD45brightSSCdim)로 이루어진 이질 게이팅 전략을 사용하여 수행하였다. 그후, B 세포 집단을 관련 형광 표지된 항체(CD20 APC-Cy7)의 사용을 통해 동정하였다. 염색 후, 세포를 FACSCanto 세포계측에 의한 FACS 획득 및 FlowJo 소프트웨어로의 분석 전에 2회 세척하였다. 결과가 표 17 및 도 11a 및 11b에 나타내어져 있다.
표 17: 처리 후 원숭이 말초 혈액 중의 순환 CD45, CD20 양성 세포의 수
Figure 112016101405608-pct00024

Figure 112016101405608-pct00025

표 17 및 도 11a에 나타낸 바와 같이, CD3xCD20 이중특이성 항체 및 항-CD20 단일특이성 항체의 투여는 순환 B-세포를 측정된 제1 시점(2일째)까지 기준선 수준으로 고갈시켰다. 이러한 고갈은 위약 대조군 동물 코호트에서는 보이지 않았다. 이중특이성 코호트에서의 B-세포 고갈은 1 mg/kg의 이중특이성 항체를 투여한 후 1주 동안 유지되었으며, B-세포 고갈은 또한 0.01 및 0.10 mg/kg 용량 이중특이성 코호트에서 유지되었다.
T-세포(CD3+) 수준을 또한 형광 표지된 항-CD3 항체에 의해 이 실험에서 모니터링하였다. 순환 T-세포의 일시적인 손실이 이중특이성 항체 코호트 (Ab 4 및 Ab 1; 모두 투여)에서 투여후 2일째에 관찰되었다. 측정된 시점에서 비히클 (위약) 대조군 또는 대조군 Ab 3 (Rituxan) 그룹에서 T-세포의 손실(기준선 아래로)은 관찰되지 않았다. T-세포 수준은 4일째 시점까지 이중특이성 항체 코호트에서 기준선 수준으로 되돌아가고 실험 말기까지 기준선 수준에서 유지되었다(도 11b 참조).
항체 1 및 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체의 생체내 효능은, 상기한 연구와 유사하게, CD20+ B-세포 수준 또는 CD3+ T-세포 수준의 변화를 측정하는 장기간 (3개월) 연구에서 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중에서 측정하였다. 위약 (비히클) 또는 이중특이성 항체를 0일째에 1.0 mg/kg 투여하였다. 말초 혈액 중의 B-세포 수준은 이중특이성 항체 코호트 둘 다에서 2일째까지 유의적으로 고갈되었으며 수준은 위약을 제외한 모든 샘플에서 연구의 길이 전반에 걸쳐 고갈된 채로 유지되었다(도 12a 참조). 이중특이성 항체로 처리된 동물에 대해 연구(> 80일) 전반에 걸쳐 측정된 바와 같이 T-세포의 일시적인 손실이 이중특이성 코호트에서 2일째까지 관찰된 다음 T-세포는 4일째까지 기준선 수준으로 회복되었다가 기준선 주위에서 유지되었다(도 12b). 위약으로 처리된 동물에서는 T-세포의 일시적인 손실이 관찰되지 않았다.
저 용량 투여에서 항체 1 및 항체 4 CD3xCD20 이중특이성 항체의 생체내 효능을 추가로 측정하기 위해, 상기 실험과 유사하게 CD20+ B-세포 수준 또는 CD3+ T-세포 수준의 변화를 장기간 (2개월) 연구에서 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액 중에서 측정하였다. 이중특이성 항체를 0일째에 0.01 mg/kg 또는 0.001 mg/kg (1㎍/kg) 투여하였다. 말초 혈액 중의 B-세포 수준은, (표 17 및 도 11a 또는 12a에서 알 수 있는 바와 같이) 보다 고 용량의 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리된 동물에 대해 관찰된 바와 유사하게 2일째까지 유의적으로 고갈되었으며 CD3xCD20 코호트 둘 다에 대해 연구의 길이에 걸쳐 고갈된 채로 유지되었다(도 13a). 매우 저 용량(1㎍/kg)의 이중특이성 항체로 처리한 동물은 보다 고 용량의 CD3xCD20 이중특이성 항체로 처리한 동물에서 알 수 있는 바와 같이 T-세포의 동일한 일시적 손실 및 회복을 경험한다(도 11b 또는 12b와 비교하여 도 13b 참조).
기술된 연구에서 관찰된 바와 같은 B-세포 손실은 CD3xCD20-키메라성 Fc 항체 1로 처리된 동물의 말초 혈액 중의 순환 항체의 손실과 상관성이 있었다(도 14 참조). 동물의 순환계에서의 항체 노출이 시간 경과에 따라 고갈됨에 따라, B-세포 집단은 회복되기 시작한다(예를 들면, 동물 번호 I06881에 대해 81일째에 관찰된 바와 같음).
말초 혈액 중의 순환 항체의 손실과 B-세포 손실의 상관성은 또한 CD3xCD20-키메라성 Fc 항체 2로 처리된 동물에서 볼 수 있는 반면(도 15 참조), 동물의 순환계에서의 항체 노출은, 예를 들면, 동물 번호 I06876에 대해 66일째에, 및 동물 번호 I06877에 대해 68일째에 관찰된 바와 같이, 시간 경과에 따라 고갈된 다음 B-세포 집단은 회복되기 시작한다. 유사한 상관성은 또한 CD3xCD20-wtFc (Ab 4) 이중특이성 항체로 처리된 동물에서 보여졌다(도 16 참조). 동물의 순환계에서 항체 노출이 시간 경과에 따라 고갈됨에 따라, B-세포 집단은 회복되기 시작한다(도 16 참조, 예를 들면, 동물 번호 I06870에 대해 91일째에, 및 동물 번호 I06872에 대해 64일째에 관찰된 바와 같음).
실시예 11. CD3 x CD20 이중특이성 항체는 단일특이성 항체보다 저 용량으로 사이노몰거스 원숭이의 림프구성 조직에서 CD20 + B-세포를 고갈시킬 수 있다
사이노몰거스 원숭이의 림프구성 조직에서의 CD20+ B-세포 수준의 변화는 일특이성 항-CD20 항체(대조군 Ab 3-Rituxan)와 비교하여 항-CD3xCD20 이중특이성 항체 (항체 1 또는 항체 4)의 투여 후 FACS를 통해 실험하였다. 연구는, 상기 실시예 10에 요약된 바와 같이 그룹 1-8과 유사하게, 투여 그룹당 3마리 동물의 투여 그룹으로 조직된 수컷 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 수행하였다. 항체 약물 또는 비히클의 용량을 i.v. 주입에 의해 투여하고 동물을 투여한지 7일후에 희생시키고 조직을 수집하였다. 조직 샘플을 백혈구(CD45+), 및 특이적으로 B 세포(CD20+), 마커에 대해 FACS에 의해 분석한 다음 B 세포의 체적 %를 구하였다.
B 세포 집단을 실시예 10에 대해 상기한 방법과 유사하게 관련 형광 표지된 항체(CD20 APC-Cy7)의 사용 및 FACS 획득을 통해 동정하였다. 결과가 표 18 및 도 17a 및 17b에 나타내어져 있다.
표 18: 처리 후 원숭이 장간막 림프절 및 비장에서의 CD20 양성 세포 퍼센트
Figure 112016101405608-pct00026

Figure 112016101405608-pct00027

표 18 및 도 17a에 나타낸 바와 같이, 항-CD20 단일특이성 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이성 항체의 투여는 이중특이성 코호트에 대해 훨씬 더 저 용량(0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)에서 비장에서의 조직 B-세포의 고갈을 초래한다. 이 고갈은 위약 대조군 동물 코호트에서는 보이지 않았다.
표 18 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, 항-CD20 단일특이성 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이성 항체의 투여는 이중특이성 코호트에 대해 훨씬 저 용량(0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)에서 장간막 림프절에서의 조직 B-세포의 고갈을 초래하며, 이때 0.1 mg/kg 용량 및 1 mg/kg 용량의 이중특이성 항체는 일특이성 코호트에서보다 더 효율적인 B-세포 고갈을 초래한다. 이러한 고갈은 위약 대조군 동물 코호트에서는 보이지 않았다. CD20에 대해 면역조직화학 염색시(데이터는 나타내지 않음), 잔류 B-세포가 일특이성-처리된 (Rituxan® 30mg/kg) 코호트의 림프절에서 검출되었다. 잔류 B-세포는 0.1 내지 1.0 mg/kg 용량의 이중특이성 항-CD3xCD20 항체로 처리된 코호트로부터 수집된 조직에서는 검출되지 않았다. 이러한 데이터는 Ab1 및 Ab1이 Ab3보다 더 강한 B 세포의 사멸 깊이를 가짐을 입증한다.
실시예 12. CD3 x CD20 이중특이성 항체로의 종양 치료
A. CD20 x CD3 이중특이성 항체로의 처리는 NSG 마우스에서 Raji 종양 성장을 저해한다
Raji 종양 성장을 감소시키는데 있어서의 선택된 항-CD3xCD20 이중특이성 항체의 효능을 평가하기 위해, 잭슨 라보라토리즈(Bar Harbor, Maine, USA)로부터 구입한 NSG 마우스(NOD/LtSz-scid/IL2Rγnu" 마우스)를 2x106　Raji 종양 세포 및 5x105　인간 PBMC로 피하 동시-이식하였다(0일째). 동일자에, 마우스를 마우스(치료 그룹당 N=5마리 마우스) 당 0.4, 0.04 또는 0.004 mg/kg의 복강내 용량의 항체 1, 또는 대조군 항체 5(무관한 표적에 대한 lgG1 항체), 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 0일째에 시작하여, 마우스를 연구의 잔여일 동안 복강내 용량의 약물 또는 비히클로 주 2회 처리하였다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 주당 2회 측정하고, 종양 체적은 다음과 같이 계산하였다: 체적 = (길이 x 폭2)/2. 통계학적 분석은 GraphPad 소프트웨어 Prism 5.0 (Macintosh Version)를 사용하여 수행하였다.
통계적 유의성은 Tukey의 다중 비교 사후-검정으로 이원 ANOVA로 구하였다. 각각의 판독치로부터의 데이터를 처리 그룹에 걸쳐 비교하였다. p<0.05의 역치가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 결과가 도 7a-7f에 나타내어져 있다. 이러한 결과는 항체 1(CD3xCD20-키메라성 Fc)이 인간 면역 세포를 동시-이식한 마우스에서 Raji 종양을 표적화하여, 시험된 용량에서 완전한 종양 성장 저해를 초래함을 보여준다(도 7c: 0.4 mg/kg Ab1 ; 도 7e: 0.04 mg/kg Ab1 ; 도 7f: 0.004 mg/kg Ab1). 당해 실시예는 CD3xCD20 이중특이성 항체 1로의 처리가 종양 이식 시점에서 출발하여 종양 성장을 억제하는데 효과적이었음을 입증한다. Raji 종양 성장은, 대조군에 비해, 0.4, 0.04 또는 0.004 mg/kg 항체 1의 용량이 주어진 마우스에서 이식 후 23일까지 완전히 저해되었다. 또한 항체 1과 대조군 항체 중 어느 것도 연구 동안 마우스 체중에 유의적 영향을 갖지 않는 것으로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
CD3xCD20 이중특이성 항체의 항종양 효과를 유사한 NSG 마우스 모델(상기한 바와 같음)에서 추가로 시험하였지만, 각각의 NSG 마우스는 -1일째에, 및 그후 주당 1회 1 mg 마우스 IgG (mlgG2a Fc)가 투여되었다. 결과가 도 8a-8b에 나타내어져 있다.
이 실험은 CD3xCD20 이중특이성 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc) 또는 CD3xCD20 이중특이성 항체 4 (CD3xCD20-wtFc)로의 처리가 순환 IgG의 존재하에서 시험된 이중특이성 Ab의 용량에서 종양 이식 시점에서 출발하여 종양 성장을 억제하는데 효과적이었음을 입증한다(도 8a-8b). 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, 항체 1 (CD3xCD20-키메라성 Fc 이중특이성 항체)은 이 실험에서 IgG 보충의 존재 또는 부재하에 시험된 기간에 걸쳐 완전한 종양 성장 억제를 입증한다.
B. CD3 x CD20 이중특이성 항체로의 처리는 NSG 마우스에서 확립된 종양을 축소시킨다
NSG 마우스에서 확립된 종양을 감소시키는데 있어서의 선택된 항-CD3xCD20 이중특이성 항체의 효능을 평가하였다. NSG 마우스 (NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull마우스)는 잭슨 라보라토리즈(Bar Harbor, Maine, USA)로부터 구입하였고, HLA-매칭된 Raji 종양 세포(2x106) 및 인간 PBMC(5x105)(-15일째)로 피하로 동시-이식되었다. 처리 전 15일 동안 숙주에서 종양이 확립되도록 하였다. 약물 투여 전일에(-1일째), 마우스에게 각각 5 mg mlgG2a Fc를 보충하여 투여하였다. 그후 마우스에게 실험(7일, 14일 등)의 길이 동안 주당 1회 마우스당 5 mg로 mlgG2a Fc를 후속적으로 투여하였다. 마우스를 종양 크기에 따라 약물 투여 전에 2개의 실험 그룹으로 분리하였다: 그룹 1: ~200-400 mm3　또는 그룹 2: ~500-900 mm3.
약물 처리 후, 0, 3, 6, 10, 14, 17, 21 및 28일째에 각 마우스에서 종양 크기를 모니터링하고 각 마우스에서 기록하였다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 주당 2회 측정하였으며, 종양 체적은 다음과 같이 계산하였다: 체적 = (길이 x 폭2)/2. 종양의 존재를 또한 감지할 수 있음(palpability)에 의해 측정하였다. 통계학적 분석은 GraphPad 소프트웨어 Prism 5.0 (Macintosh Version)를 사용하여 수행하였다. 각각의 판독치로부터의 데이터를 처리 그룹에 걸쳐 비교하였다. 결과가 도 9 및 10에 나타내어져 있다.
a. 그룹 1 : ~200-400 mm3　종양. 0일째에 출발하여, 각각 4 또는 5마리 마우스의 몇몇 코호트를 다음과 같이 주당(즉, 7일, 14일 등) 1회 제시된 용량의 약물 또는 비히클로 처리하였다:
i. 대조군: 비히클 단독
ii. 대조군 항체 5, 0.4 mg/kg
iii. 항체 1 (CD20xCD3-키메라성 Fc), 0.4 mg/kg
b. 그룹 2: ~500-900 mm3　종양. 0일째에 출발하여, 각각 4마리 마우스의 몇몇 코호트를 다음과 같이 주당(즉, 7일, 14일 등) 1회 제시된 용량의 약물로 처리하였다:
i. 대조군 항체 5, 0.4 mg/kg
ii. 항체 1 (CD20xCD3-키메라성 Fc), 0.4 mg/kg
종양은 14일까지 0.4 mg/kg 항체 1 (CD20xCD3-키메라성 Fc)이 투여된 코호트에서 완전히 퇴화되었다. 도 9 참조.
보다 큰 확립된 종양(즉, 그룹 2, ~500-900 mm3)을 가진 모델에서, 항체 1 (CD20xCD3-키메라성 Fc) 처리(0.4 mg/kg)는 21일까지 마우스에서 관찰된 종양의 완전한 박리를 야기하였다. 체적이 0.5 cm 이상 0.9cm 이하인 보다 큰 림프종 덩어리(즉, CD20 발현에 대해 양성인 종양)를 가진 마우스를 치료하는데 있어서의 Ab1의 효과를 입증하는 도 10을 참조한다.
실시예 13. CD3xCD20 이중특이성 항체는 시험관내에서 PBMC 증식을 유도한다
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자극하고 증식을 유도하는 선택된 CD3xCD20 이중특이성 항체 및 대조군 작제물의 능력을 ATP 촉매된 정량(CellTiter Glo®)을 사용하여 평가하였다. PBMC의 활성화는 세포 증식을 유도하는 사이토킨의 방출을 초래한다.
증식 데이터는 다음의 프로토콜을 사용하여 획득하였다: 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 유래의 PBMC(5x105/웰)를 37℃에서 72시간 동안 CD3xCD20 이중특이성 항체 또는 대조군 항체 및 시판 항-CD28 항체(인간: 200 ng/mL, cyno: 500 ng/mL)의 연속 희석물과 함께 항온처리하였다. 세포를 세포 적정기 Glo®을 사용하여 정량하고, 세포 생존율에 대한 판독치로서의 발광을 VICTOR X5 멀티-라벨 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 측정하여 살아있는 세포를 검출하였다. 세포 생존율(자극된 세포 대 비자극된 세포의 배수 유도)은 자극된 세포의 발광도를 비자극된 세포의 기준선 발광도로 나누어 구하였으며, Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프화하였다. 결과가 표 19 및 도 18a와 18b에 요약되어 있다.
표 19: 항- CD3x CD20 이중특이성 항체에 의해 유도된 인간 및 사이노몰거스 PBMC 증식에 대한 EC 50
Figure 112016101405608-pct00028

데이터는 3개 이상의 독립적인 검정의 중간값이다. NA = 활성 없음.
표 19 및 도 18a-18b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CD20 x CD3 이중특이성 항체 둘 다는 인간 또는 사이노몰거스 PBMC의 증식을 유도하였다. 항체 1은 대략 동등한 효능으로 인간 및 사이노몰거스 PBMC 둘 다의 증식을 유도하였다. 대조군 Ab 5는 활성을 나타내지 않았다.
실시예 14. CD20 x CD3 이중특이성은 시험관내 활성화된 T-세포에 의한 세포 사멸을 매기한다
인간 또는 사이노몰거스 PBMC는 각각 Ficoll-플라크 상에서 또는 Lympholyte 포유동물 세포 분리 배지를 사용하여 단리하였다. 단리된 PBMC(1 x106 세포/mL 인간 PBMC 또는 5x106　세포/mL 사이노몰거스 PBMC)를 재조합 인간 IL-2(인간 PBMC에 대해 30 U/mL, 사이노몰거스 PBMC에 대해 100 U/mL) 및 T 세포 활성화 비드(인간 PBMC에 대해 항-CD3/CD28, 사이노몰거스 PBMC에 대해 항-CD2/CD3/CD28)를 함유하는 완전 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 292 ㎍/mL L-글루타민으로 보충된 RPMI) 중에서 각각 7일 및 21일 동안 활성화시켰다. CD20 발현 Raji 세포(2x106　세포/mL)를 37℃에서 30분 동안 8μM 칼세인-AM으로 표지하고 배지로 3회 세척하였다. 칼세인-표지된 표적 세포 (10,000-20,000개 세포/웰)를 37℃에서 2시간 동안 완전 배지 중에서 활성화 T 세포(효과기/표적 세포 비 10:1) 및 항체 1, Ab 4 또는 대조군 Ab 5의 연속 희석물(인간 농도 범위: 2nM 내지 0.00003nM; 사이노몰거스 농도 범위: 6.6nM 내지 0.002pM)로 200㎕로 플레이팅하였다. 항온처리 후, 플레이트를 원심분리하고 상청액을 형광 분석을 위해 반투명 흑색의 투명 바닥 플레이트로 옮겼다. 세포독성 퍼센트를 방정식을 사용하여 계산하였다:
% 세포독성 = ((FS - FSR)/(FMR-FSR))*100%,
여기서, FS는 시험 웰로부터의 칼세인 방출이고, FSR은 자발적인 칼세인 방출이며, FMR은 Triton-X에 의해 용해된 세포로부터의 최대 칼세인 방출이다.
세포 생존율(ATP 촉매된 정량)의 EC50을 Prism 소프트웨어를 사용하여 구하였다. 세포 용해(세포독성)는 최대 방출의 분율로서 칼세인 방출에 의해 측정하였다. 세포 세포독성 퍼센트는 최대 방출과 비교한 관찰된 방출 및 측정된 EC50　값으로서 계산하였다. 결과는 표 20 및 도 19a(인간 T-세포) 및 19b(원숭이 T-세포)에 나타내어져 있다.
표 20: Raji 세포에 대한 CD3xCD20 -유도된 세포독성에 대한 EC 50 　값
Figure 112016101405608-pct00029

표 20에 나타낸 바와 같이, 항체 1은 인간 (도 19a) 및 사이노몰거스 (도 19B) T 세포에 대해 각각 25.0pM 및 9.1 OpM의 대표적인 EC50　값으로 표적 세포 사멸을 매개하였다. 항체 4는 인간 (도 19a) 및 사이노몰거스 (도 19B) T 세포에 대해 각각 15.7pM 및 1.73pM의 대표적인 EC50　값으로 표적 세포 사멸을 매개하였다. 대조군의 활성은 관찰되지 않았다.
유동 세포계측에 의해 CD20-함유 표적 세포의 특이 사멸을 모니터링하기 위해, B16F10.9 모 뮤린 골수종 세포(CD20를 발현하지 않는 것) 및 인간 CD20을 안정적으로 발현하도록 조직된 B16F10.9 세포(B16F10.9/CD20)를 각각 1μM의 형광 트랙킹 염료 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFDA-SE) 및 바이올렛 세포 추적자로 표지하였다. 표지화 후, 세포를 1:1 비로 혼합하고, 37℃에서 밤새 플레이팅하였다. 별도로, 부착 대식세포, 수지상 세포, 및 몇몇 단핵구를 고갈시킴으로써 림프구에 대해 풍부화하기 위해 인간 PBMC를 보충된 RPMI 배지에서 1 x106　세포/mL로 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 표적 세포를 부착 세포-고갈된 미접촉 PBMC(효과기/표적 세포 4:1 비) 및 시험 CD3xCD20 이중특이성 항체 또는 lgG1 대조군 항체 5의 연속 희석물(농도 범위: 66.7nM 내지 0.25pM)과 37℃에서 48시간 동안 동시-항온처리하였다. 세포를 효소-비함유 세포 분해 완충액을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 제거하고, FACS에 의해 분석하였다. FACS 분석을 위해, 세포를 사멸한/살아있는 근적외선 세포 추적자(Invitrogen)로 염색하였다. 사멸의 특이성의 평가를 위해, 세포를 살아있는 바이올렛 및 CFDA-SE 표지된 집단 상에 게이팅하였다. 각 집단의 퍼센트가 다음과 같이 조절된 생존율의 계산에 대해 보고되었다: 조절된 생존율=(R1/R2)*100, 여기서, R1 = 항체의 부재하에서의 [(B16F10.9/CD20) / 방관자 세포 (B16F10.9)]*100, R2 = 시험 항체의 존재하에서의 동일한 비.
표 21: B16F10 .9/CD20 세포에서의 표적-특이 사멸에 대한 EC 50 　값
Figure 112016101405608-pct00030

CD3xCD20-키메라성 Fc (항체 1) 및 CD3xCD20-wtFc (항체 4) 둘 다는 세포의 혼합 집단에서 CD20(도 20a-b)을 발현하는 표적 세포만을 사멸하도록 인간 T 세포를 특이적으로 지시하였다. 표적 세포 사멸은 단지 이중특이성 항체의 존재하에서 관찰되었으며, B16F10.9/CD20 세포는 항체 1 (EC50　19.5pM) 및 항체 4 (EC50　12.8pM)에 의해 용량-의존적 방식으로 고갈되었다(도 20b). 5% 미만의 CD20-발현 세포가 시험된 최고 용량(10 ㎍/mL)에서 살아있었다(도 20b). 모 B16F10.9 세포 집단에서 또는 대조군 Ab 5, lgG1 대조군 항체를 갖는 B16F10.9/CD20 집단에서는 세포 사멸의 증거가 관찰되지 않았다.
실시예 15. CD3xCD20 이중특이성 항체는 20시간 FACS 시험관내 검정에서 T 세포에 대해 초기 활성화 마커 CD69 를 상향조절한다
CD69+는 T 세포가 활성화되었음을 나타내는 최단 유도 세포 표면 마커 중의 하나이다. T-세포 활성화는 CD69와 같은 특정 세포 표면 마커의 상향조절을 실험함으로써 측정할 수 있다.
CD3xCD20 이중특이성 항체가 전혈에서 인간 또는 사이노몰거스 T 세포에 대한 초기 활성화 마커 CD69를 상향조절하는 능력을 20시간 시험관내 FACS 검정에 의해 측정하였다. 간략하게, T 세포 활성화는 새로 단리된 인간 또는 사이노몰거스 전혈(100㎕)을 RPMI+L-글루타메이트 중의 항체 1, 항체 4 또는 대조군 Ab 5(농도 범위 50nM 내지 0.0006nM)의 5배(인간) 또는 10배(사이노몰거스) 연속 희석물과 함께 200㎕의 최종 체적으로 37℃에서 20시간 동안 평저 96 웰 플레이트 중에서 항온처리함으로써 평가하였다. 항온처리 후, 플레이트를 1000rpm에서 5분 동안 회전시켜 혈장을 제거하였다. T 세포에 대한 CD69 상향조절을 측정하기 위해, CD2 및 CD69, 뿐만 아니라 CD45, CD4, CD8, 및 CD19 (인간) 또는 CD16 (사이노몰거스)에 직접적으로 접합된 항체를 함유하는 표현형 칵테일을 4℃에서 30분 동안 혈액에 직접 가하였다. 적혈구 세포를 제조자의 지침에 따라 1.5mL PharmLyse 완충액으로 15분 동안 용해시켰다. 세포를 2회 세척하고, 200㎕ 냉 PBS + 1% FBS에 재현탁시키고, BD FACSCanto 세포계측기를 사용하여 유동 세포계측에 의해 분석하였다. CD4+ T 세포를 먼저 생존가능한 소 CD45+ 림프구 상에서 게이팅한 다음 CD19-/CD2+/CD4+ T 세포 (인간) 또는 CD16-/CD2+/CD4+ T 세포 (사이노몰거스) 상에서 게이팅함으로써 동정하였다.
총 CD2+ 효과기 세포 중에서 활성화된 (CD69+) T 세포의 퍼센트가 보고되어 있다. 표 22 및 또한 도 21을 참조한다. 결과는 CD3xCD20 이중특이성 항체가 초기 활성화 마커 CD69에 의해 검출되는 바와 같이 T 세포를 유의적으로 활성화시켰음을 보여준다.
표 22: B16F10 .9/CD20 세포에서 표적-특이적 사멸에 대한 EC 50 　값
Figure 112016101405608-pct00031

실시예 16. CD3xCD20 이중특이성 항체는 표적 세포로 T 세포의 군집화를 유도한다
세포 군집화 포맷을 사용하여 CD3xCD20 이중특이성 항체가 이의 이중특이성 결합 아암을 통해 T-세포를 표적 세포(CD20+ 세포)와 브릿징함을 측정하였다. 효과기 세포를 CFSE로 예비염색하고, CD20+ 세포를 24시간 동안 바이올렛 세포 추적자로 예비염색하고, 게이팅하여 무관한 대조군 항체(대조군 항체 5, 무관한 lgG1 이소타입 항체)와 항온처리 후 사분구간을 분리하였다. 무관한 항체로의 처리를 위한 세포 혼합물에서 군집화(이중-염색)을 나타내지 않는 도 22a를 참조한다. CD3xCD20 이중특이성 항체와 항온처리 후, CFSE 및 바이올렛 둘 다로의 염색으로 인해 세포 군집이 보인다(도 22B, 굵은 사각형으로 강조된 바와 같이, 산점도 상의 좌측 상단 사분구간 참조).
실시예 17. CD3 + 세포 상의 억제성 Tim-3 및 PD-1 마커의 발현
T 세포 기능장애, 또는 고갈이 종양-함유 숙주에서 발생한다. Tim-3 및 PD-1 수용체가 만성 질환 상태에서 고갈된 T 세포의 마커로서 동정되었다. 연구원 사퀴시 케이 등(Sakuishi, K. 등)(문헌 참조; J. Exp. Med. 207(10):2187-2194, 2010)에 따르면, Tim-3 및 PD-1에 대해 양성인 종양-침윤성 림프구(TIL)(Tim-3+PD-1+TIL)는 IL-2, TNF, 및 IFN-γ의 증식 및 생산 실패에 의해 정의된 바와 같이 가장 심각한 고갈된 표현형을 나타낸다.
CD3-양성 세포를 HLA-매칭된 Raji 종양 세포 및 인간 PBMC로 피하에 동시-이식된 NSG 마우스의 혈액 및 종양으로부터 추출하였다 - 상기 실시예 12b 참조. 간략하게, 종양을 치료 전 15일 동안 숙주에서 확립되도록 하고 - 그후 마우스를 종양 크기에 기초하여 두 개의 치료 그룹으로 분리하였다(실시예 12b 참조). 혈액을 각각의 연구 그룹, 즉, 그룹 1, ~200-400 mm3　또는 그룹 2, ~500-900 mm3로부터 9일째에 처리(이중특이성 Ab) 및 비처리 마우스로부터 추출하였다. 1500 mm3에 도달한 종양을 갖는 비처리(비히클 또는 대조군 Ab)된 마우스를 연구 말기에 희생시키고 이러한 종양을 PD1 및 Tim-3의 발현에 대해 시험하였다.
순환 T 세포 실험에 대해, 생존가능한 CD45+CD3+ T 세포 분획을 Tim-3 또는 PD-1(Biolegend로부터 상업적으로 이용가능함)에 직접-표지된 항체를 사용하여 마커 동정을 위해 선택하였다. Tim-3+PD-1 + 세포는 비처리 동물의 혈액 중의 순환 T 세포의 주요 분획이었다. 그러나, CD20xCD3 이중특이성 항체 (Ab 1) 처리된 동물의 혈액 중의 T 세포는 Tim-3+PD-1 + 세포의 보다 낮은 분획을 나타내었다.
비처리 숙주로부터의 종양 세포를 분리하고 생존력에 대해 염색하였다. FACS 분석은 CD45+CD3+ 세포 분획을 분류한 다음 Tim-3 또는 PD-1 발현에 대해 시험하기 위해 생존가능한 단일 세포에 대해 수행하였다.
본 출원인은 억제성 수용체 Tim-3 및 PD-1이 실시예 12b에 기재된 실험 동안 비처리 마우스의 NSG B 세포 림프종에서 CD3+ TIL 상에 발현되고, Tim-3+PD-1+ 세포가 T 세포 침윤성 종양의 주요 분획임을 밝혀내었다.
실시예 18. CD3 x CD20 이중특이성 항체로의 처리는 확립된 Raji 종양을 갖는 NSG 마우스에서 항-CD20+ 항체보다 더 효과적이다
NSG 마우스에서 확립된 종양을 감소시키는데 있어서의 선택된 항-CD3xCD20 이중특이성 항체의 효능을 평가하였다. NSG 마우스 (NOD/LtSz-scid/IL2Rvnull 마우스; Jackson Laboratories)를 Raji 종양 세포 (2x106) 및 인간 PBMCs (5x105)(-14일째에)로 피하에 동시-이식하였다(상기 본원의 실시예 12b와 유사하게).
CD20xCD3 이중특이성 Ab1(0.4mg/kg; 2x/주 i.p.로 투여)는 확립된 Raji 종양을 저해하는데 있어서 CD19xCD3 BiTE (0.5mg/kg; 5x/주 i.v.로 투여)에 필적하였고(도 23), 리툭시맙 요법(8 mg/kg; 5x/주 i.p.로 투여)보다 우수하였으며(도 24), 이로써 Ab1이 체적이 0.5cm보다 큰 대형 림프종 덩어리를 갖는 포유동물을 치료하는데 효과적이었음을 입증한다.
실시예 19. CD3 x CD20 이중특이성 항체로의 CD20 + 흑색종의 치료
연구원들은 CD20+ 흑색종 종양 세포와 같은 환자에서의 흑색종 암의 특정 하위집단이 종양-개시 특성 및 보다 높은 질환 재발 위험을 나타낼 수 있음을 알아냈다(문헌 참조; Pine 등 Mol Ther. 20(5):1056-1062, 2012, epub 2012 Feb 21). CD20xCD3 이중특이성 항체 Ab1은, 이것이 면역-적격 세포에서 hCD20-형질도입된 B16F10.9(B16F10.9/CD20) 종양 성장을 유의적으로 지연시키기 때문에 CD20을 발현하는 B16F10.9 종양 세포에 대해 강력한 활성을 입증하였다.
CD3에 대해 인간화된 마우스(인간화 CD3γε 마우스)를 마우스가 인간화 단백질 둘 다를 발현하도록 CD20 유전자좌에서 인간화시켰다. 인간화 CD3/CD20 마우스를 인간 CD20으로 형질도입된 2x105개 B16F10.9 흑색종 종양 세포(K. Peters/Charles Lin; Duke University)로 피하 이식하였다. 0일째(종양 이식일)에 시작하여, 마우스를 주당 2회 비히클 (PBS; n=5), 0.4 mg/kg 대조군 Ab5 (무관한 항원에 대한 대조군 항체; n=5), 0.4 mg/kg의 Ab1 (N=5), 또는 0.004 mg/kg Ab1 (n=5)로 복강내 처리하였다. 종양 체적을 도 25a에 제시된 바와 같이 측정하였다. 종양이 1500 mm3 이상의 체적에 도달할 경우 마우스를 희생시켰다. 도 25a에 입증된 바와 같이, Ab1로의 처리는 처리가 종양 이식과 동시에 개시된 경우 종양 성장을 지연시켰다.
별도의 실험에서, Ab1이 이전에 확립된 종양에서 종양 성장을 억제하는 능력을 또한 시험하였다(도 25b). 인간화 CD3/CD20 마우스를 인간 CD20을 발현하는 2x105개　B16F10.9 흑색종 종양 세포로 피하 이식하였다. 종양 이식 후 10일째에, 마우스를 종양 크기에 기초하여 무작위화하고 각 그룹을 5마리 마우스로 하여 다음의 처리 그룹으로 조직하였다: 비히클 (PBS), 4 mg/kg 대조군 Ab5 (무관한 항원에 대한 대조군 항체), 4 mg/kg의 Ab1, 또는 0.4 mg/kg Ab1. 모든 마우스는 주 2회 i.p. 처리하였다. 종양이 1500 mm3 이상의 체적에 도달할 경우 마우스를 희생시켰다. 도 25b에 나타낸 바와 같이, Ab1로의 처리는 이미 확립된 종양의 종양 성장을 지연시켰으며, 이것은 Ab1이 CD20을 발현하는 B16F10.9 흑색종 세포에 대해 강력한 활성을 나타냄을 입증한다.
본 발명은 본원에 기술되는 특정 실시형태에 의해 그 범위가 한정되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기술되는 것 이외에도 본 발명의 각종 변형은 상기 발명을 실시 하기 위한 구체적인 내용 및 수반되는 도면으로부터 당업계의 숙련가에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 특허청구범위의 범위 내에 있도록 의도된다.
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTIBODY COMPOSITIONS FOR TUMOR TREATMENT <130> A0015WO01 <150> 61/955,663 <151> 2014-03-19 <150> 61/981,641 <151> 2014-04-18 <150> 62/007,385 <151> 2014-06-03 <150> 62/033,460 <151> 2014-08-05 <160> 75 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaagtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacctttaat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagtt attagttgga atagtgatag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatgc acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagataat 300 cactatggtt cggggagtta ttactactac caatacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc ag 382 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 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His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 60 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 62 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 ttcgcgcagc ttaggtttat gccagggggg acgggtggca cgggtcgtgg tggacaccgt 60 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac ccgggtctct 40 <210> 65 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaa 58 <210> 66 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 tgtgtcttca gggagaggga cagagaccca tttactcgcc ggcg 44 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg tggacaccgt 60 <210> 68 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag caccacctgt g 51 <210> 69 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta cacc 54 <210> 70 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 ctcttttggt agaggtttcg gtttcccgtc ggggctcttg gtgtccacat gtgg 54 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 cttcagggag agggacagag gcccatttac tcgccggcg 39 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 gctgacagac taacagactg 20 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 atacattata cgaagttata ccggta 26 <210> 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Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (165)

  1. 대상체에서 CD20 양성 B-세포 암을 치료하거나 개선시키기 위한 이중특이성 항체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 이중특이성 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하고,
    상기 키메라성 CH 영역은 서열번호 26, 28, 30 또는 32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 이중특이성 항체는, 인간 FcγRIIB와 비교하여 인간 FcγRIIA에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내고, 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정되는 바와 같이 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 대해 거의 또는 전혀 검출가능한 결합 친화도를 나타내지 않는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B-세포 암이 소포성 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프모구 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 모발 세포 백혈병 및 버킷 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 B-세포 암이 비호지킨 림프종인, 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 B-세포 암이 소포성 림프종인, 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 B-세포 암이 미만성 거대 B 세포 림프종인, 약제학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 B-세포 암이 외투 세포 림프종인, 약제학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 B-세포 암이 변연부 림프종인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 (a) 항-CD20 단일특이적 요법 단독, 또는 (b) 리툭시맙 단일요법에 내성이거나, 또는 불완전하게 반응성인 종양을 앓고 있는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 이중특이성 항체를 투여하기 적어도 1일 내지 1년 전에 항-CD20 단일특이성 항체 요법을 제공받은, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    (a) 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정되는 바와 같이 KD　값을 10 내지 30μM로 하여 25℃에서 인간 FcγRIIA에 결합하거나;
    (b) 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정되는 바와 같이 KD　값을 100 내지 250μM로 하여 25℃에서 인간 FcγRIIB에 결합하는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    (a) 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 항체-의존적-세포성 세포독성(ADCC)을 나타내거나;
    (b) 무시해도 좋을 정도의 ADCC를 나타내거나 검출가능한 ADCC를 전혀 나타내지 않거나;
    (c) 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 나타내거나;
    (d) 시험관내 검정에서 세포 용해의 측정에 의해 검출되는 바와 같이 50% 미만의 세포독성을 나타내거나;
    (e) 무시해도 좋을 정도의 CDC를 나타내거나 검출가능한 CDC를 전혀 나타내지 않거나;
    (f) 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 NK 세포 또는 대식세포와 같이 Fc 수용체를 함유하는 세포의 감소된 T 세포-매개된 사멸을 유도하거나;
    (g) 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 NK 세포 또는 대식세포와 같은 Fc 수용체-함유 세포에 의해 매개되는 T-세포의 감소된 사멸을 유도하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인이 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인이 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인이 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하고, 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인이 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인(A1)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A1-HCDR1이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A1-HCDR2가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A1-HCDR3이 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A1-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A1-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A1-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인(A2)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A2-HCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A2-HCDR2가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A2-HCDR3이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A2-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A2-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A2-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인(A1)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A1-HCDR1이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A1-HCDR2가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A1-HCDR3이 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A1-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A1-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A1-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고;
    인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인(A2)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A2-HCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A2-HCDR2가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A2-HCDR3이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A2-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A2-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A2-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 CH 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 CH 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 CH 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 CH 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 매여진 키메라성 중쇄 불변 영역을 포함하는 이중특이성 항체로서,
    인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인(A1)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A1-HCDR1이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A1-HCDR2가 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A1-HCDR3이 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A1-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A1-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A1-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고;
    인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인(A2)이 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 여기서,
    (i) A2-HCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A2-HCDR2가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A2-HCDR3이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A2-LCDR1이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A2-LCDR2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A2-LCDR3이 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 키메라성 중쇄 불변 영역은 서열번호 26, 28, 30 또는 32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 이중특이성 항체는, 인간 FcγRIIB와 비교하여 인간 FcγRIIA에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내고, 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정되는 바와 같이 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 대해 거의 또는 전혀 검출가능한 결합 친화도를 나타내지 않는, 이중특이성 항체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가
    (a) 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 항체-의존적-세포성 세포독성(ADCC)을 나타내거나;
    (b) 무시해도 좋을 정도의 ADCC를 나타내거나 검출가능한 ADCC를 전혀 나타내지 않거나;
    (c) 시험관내 세포독성 검정으로 측정되는 바와 같이, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 나타내거나;
    (d) 시험관내 검정에서 세포 용해의 측정에 의해 검출되는 바와 같이 50% 미만의 세포독성을 나타내거나;
    (e) 무시해도 좋을 정도의 CDC를 나타내거나 검출가능한 CDC를 전혀 나타내지 않거나;
    (f) 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 NK 세포 또는 대식세포와 같이 Fc 수용체를 함유하는 세포의 감소된 T 세포-매개된 사멸을 유도하거나;
    (g) 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 NK 세포 또는 대식세포와 같은 Fc 수용체-함유 세포에 의해 매개되는 T-세포의 감소된 사멸을 유도하는, 이중특이성 항체.
  26. 제24항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인이 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체.
  27. 제24항에 있어서, 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인이 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체.
  28. 제24항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인이 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하고; 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인이 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열, 및 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체.
  29. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  30. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  31. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  32. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  33. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  34. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
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