JP6831426B2 - 腫瘍治療のための抗体組成物 - Google Patents

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Description

本願は、２０１５年３月４日に作成されたＡ００１５ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔという名称のファイル（８３４５４バイト）におけるコンピュータ読み取り可能な形式での配列表を含んでおり、これを本明細書の一部として本願に援用する。
本発明は、ＣＤ２０及びＣＤ３抗原を標的とする二重特異的抗体、及び腫瘍殺滅方法に関する。本発明はまた、腫瘍治療のための抗体療法に関連してＦｃ結合から生じ得るエフェクター機能を低減及び／または制御する方法に関する。
二重ターゲッティング抗体戦略は、多因子調節が治療上の有効性改善を目的とする複雑な疾患に適用されている。ＣＤ２０は、成熟Ｂ細胞の細胞膜上に発現した非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、それがＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬｓ）及び他のＢ細胞悪性腫瘍の９５％以上で発現されるが、Ｂ細胞前駆体、樹状細胞及び形質細胞上には存在しないので、Ｂ細胞腫瘍関連抗原と考えられている。ＣＤ２０を標的とすることにより癌を治療するための方法が当該分野で知られている。例えば、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のリツキシマブは、ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）のような癌の治療に使用され、または使用が提案されている。抗ＣＤ２０抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／またはアポトーシス及び化学療法に対する感作の誘導により、ＣＤ２０発現腫瘍細胞を死滅させると考えられているが、一部の患者は、抗ＣＤ２０療法に対する耐性を生じ、または不完全な応答を示すことが示されている（例えば、リツキシマブに対する耐性）。
ＣＤ３はＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と会合してＴ細胞上に発現されるホモ二量体またはヘテロ二量体抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされる。機能的ＣＤ３は、２〜４の異なる鎖（イプシロン、ゼータ、デルタ、ガンマ）の二量体会合から形成される。ＣＤ３及びＣＤ２０等の標的抗原を結合できる二重特異的抗体は、標的抗原を発現する組織及び細胞に対するターゲッティングＴ細胞免疫応答を含む治療的用途のために提案されている。
ＣＤ２０結合性アーム及びＣＤ３結合性アームを有する二重特異的抗体は、抗腫瘍活性を増強するために必要なクロストークを提供することができる。このような二重特異的抗体における第三の様式はＦｃドメインである。Ｆｃ結合特性の改変は、治療用抗体の抗腫瘍効力を更に増強することができる。
免疫グロブリンＦｃドメインのその受容体に対する結合は、種々のシグナル伝達及び免疫応答をもたらす。これら様々な「エフェクター機能」、例えばＣＤＣ及びＡＤＣＣ等は、Ｇクラス免疫グロブリン（ＩｇＧ）が、ＩｇＧのＦａｂドメインと標的抗原との間で複合体を形成する結果であるのに対して、ＩｇＧのＦｃドメインはエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合する。ＩｇＧの幾つかのエフェクター機能は抗原結合とは無関係であり、循環する血清レベル、及び障壁を横切ってＩｇを輸送する能力等の機能を実現する。他のエフェクター機能は、癌治療などの免疫療法において使用するために必須と考えられている。特にＡＤＣＣ機構は、ラスツズマブ（ｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；転移性乳癌）、及びリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫）のような、既に市場に出されている治療用抗体の主要な抗腫瘍メカニズムの一つであると考えられている。
現在の治療戦略は、低下したエフェクター機能（または低下したＦｃガンマ受容体結合）が、抗原の生物学的活性を中和または阻害することを目的とする抗体（例えば抗体ブロッカーまたは拮抗剤）、または下流の細胞シグナリングを活性化または開始することを目的とする抗体（例えば抗体アゴニスト）にとって有用であり得ることを典型的に示唆している。しかしながら、標的細胞の低下した細胞傷害性は、病気を治療するため、即ち、腫瘍細胞を破壊し、または主要増殖を阻害するためには有効でないことが予想されるので、エフェクター機能が低下した腫瘍ターゲッティング抗体の設計は、腫瘍の治療のためには直観に反するものである。
本明細書に記載の１つの戦略は、腫瘍マーカーを特異的にターゲッティングすると共に、腫瘍特異的Ｔ細胞死滅をトリガーする二重特異性抗原と組み合わせた、差別的Ｆｃ受容体結合を利用する。抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体を有するＴ細胞、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ様細胞の望ましくない死滅を排除または低減させるために、Ｆｃ受容体結合を慎重に制御するように設計される。ＦｃγＲＩＩ受容体結合相互作用を含むが、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩ相互作用を欠いたＦｃ受容体との相互作用に関するユニークな結合パターンは、腫瘍ターゲッティングＩｇ治療のためのためには当該技術分野において記載されていない。
このように、二重特異的Ｂ細胞と、Ｆｃ受容体への結合性が低下したＴ細胞ターゲッティング抗体との組み合わせは、予想外に有益な治療特性をもたらす。ＣＤ３及びＣＤ２０の両方に結合する二重特異的抗体は、特異的ＣＤ２０ターゲッティングが更に制御され且つ効率的な細胞障害性が望まれる臨床現場において、特に有用である。
第一の態様において、本発明は、ヒトＣＤ３及びＣＤ２０に結合する改変されたＦｃ結合ドメインを備えた二重特異的抗体を提供する。本発明のこの態様に従う抗体は、なかでも、例えばＴ細胞媒介性の死滅が、抗ＣＤ２０腫瘍細胞のような特定の細胞型へのＣＤ３媒介性のＴ細胞活性化を指令する二重特異的抗体の一部として有益であるか、または望ましい状況下において、ＣＤ３を発現するＴ細胞をターゲッティングするため、及びＴ細胞活性化を刺激するために有用である。前記抗体は更に、免疫系の天然のレパートリーでは発見されていない特定のエフェクター機能を有するように操作される。
本発明の典型的な抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体が、本明細書の表１〜８に列記されている。表１は、例示的な二重特異的抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、並びに重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を列記している。表２は、典型的な二重特異的抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３をコードする核酸分子の配列識別子を記載している。表３は、ＨＣＶＲ、重鎖定常領域（ＣＨ）及びＬＣＶＲの組合せを含む、典型的な二重特異的抗体のアミノ酸配列識別子の組み合わせを記載している。表４は、典型的な二重特異的抗体のＨＣＶＲ、重鎖定常領域（ＣＨ）及びＬＣＶＲの組み合わせをコードする核酸分子の、核酸配列識別子の組み合わせを記載している。
表５は、本発明の重鎖例についてのアミノ酸配列の識別子を示しており、ここでの二重特異的抗体は、本発明のＣＨとペアになった表５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含んだＨＣＶＲを具備している。表６は、本発明の軽鎖例についてのアミノ酸配列識別子を別々に記載しており、ここでの二重特異的抗体は表６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含んだＬＣＶＲを具備している。
本発明は、表１に列記したＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだＨＣＶＲを具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだＬＣＶＲを具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記した典型的な抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体内に含まれるアミノ酸配列ペアを含んだＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。一定の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号２／１８及び１０／１８（例えば、抗体１及び抗体２）からなる群から選択される。
本発明はまた、表１に列記したＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含んだ軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかとペアになった表１に列記したＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含んだＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）、例えば配列番号８／１６（例えば抗体１または抗体２）からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを具備する抗体、または
その抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表１に含まれる６つのＣＤＲの組（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含んだ抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。一定の実施形態において、アミノ酸配列のＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の組は、配列番号４−６−８−２０−２２−２４；または１２−１４−１６−２０−２２−２４（例えば抗体１または抗体２）である。
関連の実施形態において、本発明は、表１に列記した典型的な抗体を定義するような、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含まれる６つのＣＤＲの組（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含んだ抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１８（例えば抗体１または抗体２）からなる群から選択されるＨＣＦＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列の組を具備する抗体、またはその抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示された特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために用いることができる。ＣＤＲの境界を識別するために使用できる代表的な規則には、例えば、カバット（Ｋａｂａｔ）の定義、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の定義、及びＡｂＭ定義が含まれる。一般的には、カバット定義は配列変動性に基づいており、コチア定義は構造的ループ領域の位置に基づいており、またＡｂＭ定義は、カバット及びコチアのアプローチの折衷である。例えば、カバット著「免疫学的に興味あるタンパク質の配列」国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８（１９９７）；Ｍａｒｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照されたい。公共データベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
本発明はまた、抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供し、例えば、本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲまたはＬＣＶＲのアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する；一定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列記されたＨＣＦＲ／ＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を含んでいる。
本発明はまた、表１に列記したＨＣＤＲ１またはＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する；一定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列記されたＨＣＤＲ１またはＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を含んでいる。
本発明はまた、表１に列記したＬＣＤＲ１またはＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３のアミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する；一定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列記されたＬＣＤＲ１またはＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を含んでいる。
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでのＨＣＶＲは三つのＣＤＲの組（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ここでのＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、表１に列記した典型的な抗ＣＤ３抗体により定義される通りである。
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでのＬＣＶＲは三つのＣＤＲの組（即ち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここでのＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、表１に列記した典型的な抗ＣＤ３抗体により定義される通りである。
本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両者をコードする核酸分子を提供し、ここでのＨＣＶＲは表１に列記したＨＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、またここでのＬＣＶＲは表１に列記したＬＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含んでいる。一定の実施形態において、前記核酸分子は表２に列記されたＨＣＶＲ核酸配列、またはこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列、及び表２に列記されたＬＣＶＲ核酸配列、またはこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列を含んでいる。本発明のこの態様に従う一定の実施形態において、前記核酸分子はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここでのＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは両者共、表１に列記した同じ抗ＣＤ３抗体に由来する。
本発明はまた、表２に列記した重鎖定常領域（ＣＨ）のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を含むＣＨを備えた抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、表２に列記した重鎖定常領域（ＣＨ）の核酸配列配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列から選択される核酸配列によりコードされるＣＨを備えた抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明はまた、抗ＣＤ３抗体の重鎖または軽鎖可変領域及び抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現できる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記で述べた核酸分子の何れか、即ち、表１及び表２に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲ配列、及び／またはＣＨ配列の何れかをコードする核酸分子を備えた組換え発現ベクターを含むものである。また、本発明の範囲内には、このようなベクターが導入されたホスト細胞、並びに該ホスト細胞を前記抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で培養し、こうして産生された抗体及び抗体断片を回収することにより前記抗体またはその一部を産生する方法が含まれる。
別の態様において、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ２０に特異的に結合する治療的有効量の組換えヒト抗体またはその断片であって、該抗体はキメラＦｃドメインを含むものと、薬学的に受容可能なキャリアを提供する。関連の態様において、本発明は、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体と、第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態において、前記第二の治療剤は、有利には、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体と併用される任意の薬剤である。抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体と有利に組み合わせ得る典型的な薬剤には、限定されるものではないが、ＣＤ３シグナル伝達に結合及び／または活性化する薬剤（他の抗体またはその抗原結合性断片等を含む）、及び／またはＣＤ３に直接結合しないが、それでも免疫細胞を活性化し、または免疫細胞活性化を刺激し、または腫瘍の殺傷を高める薬剤が含ま
れる。本発明の抗ＣＤ３抗体を含む追加の併用療法、及び併用製剤が本明細書の他の箇所に開示される。
本発明の別の態様に従えば、本発明は、ＣＤ３及び標的抗原に結合する二重特異性の抗体結合性分子を提供し、ここでの前記分子は低下したエフェクター機能を有するキメラＦｃドメインを具備する。一定の実施形態において、前記分子は本明細書に記載するキメラＦｃドメインを具備する。一定の典型的な実施形態に従えば、前記二重特異的抗原結合性分子はＣＤ３及びＣＤ２０に結合する；このような二重特異的抗原結合性分子はまた、本明細書では「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子」と称する。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子の抗ＣＤ２０部分は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞腫瘍）をターゲッティングするために有用であり、前記二重特異的分子の抗ＣＤ３部分はＴ細胞を活性化するために有用である。腫瘍細胞上のＣＤ２０及びＴ細胞上のＣＤ３の同時結合は、活性化されたＴ細胞による標的腫瘍細胞の殺傷（細胞溶解）を媒介し、またキメラのＦｃドメインと結合するエフェクター細胞によって促進される。従って、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子は、特に、ＣＤ２０を発現する腫瘍（例えば、リンパ腫及びメラノーマ）に関連し、または該腫瘍によって引き起こされる疾患及び障害を治療するために有用である。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子は、ＣＤ２０陽性腫瘍を退縮させるための方法を提供する。従って、本発明は、被験者においてＢ細胞癌を治療するための方法を提供するものであり、該方法は治療的量の本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を投与することを含み、前記量は、前記被験者において腫瘍の負担を軽減し、腫瘍退縮を生じさせ、または腫瘍発生を減少させるのに十分な量である。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子は更に、ＣＤ２０陽性（即ち、ＣＤ２０を発現する）のメラノーマを抑制または退縮させる方法を提供する。従って、本発明は、被験者におけるＣＤ２０陽性メラノーマを治療する方法を提供するものであり、該方法は、治療的量の本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を投与することを含み、前記量は、前記被験者において腫瘍の負担を軽減し、腫瘍退縮を生じさせ、または腫瘍発生を減少させるのに十分な量である。
別の態様において、本発明は、被験者における癌を治療または改善するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、ここでの前記二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメインと、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメインと、前記第一及び第二の抗原結合性ドメインの各々に繋がれたキメラＦｃドメインを具備し、また前記癌を治療または改善することは、（ａ）前記被験者において腫瘍増殖を抑制することと、（ｂ）前記被験者においてＢ細胞溶解を媒介することと、（ｃ）前記被験者においてＢ細胞癌を治療することと、（ｄ）前記被験者においてＣＤ２０発現陽性の癌を治療すること、または（ｅ）前記被験者においてＣＤ２０を発現するメラノーマを治療することを含んでいる。
別の態様において、本発明は、被験者における腫瘍増殖を抑制するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、ここでの前記二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを含んでいる。幾つかの場合において、腫瘍増殖を抑制することは、（ａ）被験者における腫瘍増殖を阻害すること、（ｂ）被験者における腫瘍のサイズを減少させること、または（ｃ）被験者における腫瘍の数を減少させることを包含する。
別の態様において、本発明は、被験者においてＢ細胞溶解を媒介するための二重特異的
抗体の使用を提供するものであり、ここでの前記二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを含んでいる。幾つかの場合において、前記Ｂ細胞はプレＢリンパ球、成熟Ｂリンパ球、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞である。
別の態様において、本発明は、被験者におけるＢ細胞癌を治療するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、ここでの前記二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを含んでいる。幾つかの場合において、前記Ｂ細胞癌は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、瀰漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病及びバーキットリンパ腫からなる群から選択される。幾つかの場合において、前記被験者は（ａ）抗ＣＤ２０単一特異性療法単独、または（ｂ）リツキシマブ単剤療法に対して抵抗性であるか、または不完全に反応する腫瘍に罹患している。幾つかの場合、前記被験者は、二重特異的抗体の投与の少なくとも１日ないし１年前に、抗ＣＤ２０単一特異性抗体療法を受けている。幾つかの場合、前記抗ＣＤ２０単一特異性療法は、抗ＣＤ２０単一特異性抗体を含むか、または該抗体からなる。幾つかの場合において、前記抗ＣＤ２０単一特異性抗体はリツキシマブである。
別の態様において、本発明は、被験者においてＢ細胞癌を治療するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、これは（ａ）抗ＣＤ２０単一特異性療法単独に対して抵抗性、または不完全に応答する癌に罹患している被験者を選択することと、（ｂ）前記被験者に対して、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを具備する治療的量の二重特異的抗体を投与することを含んでいる。
幾つかの場合において、前記被験者は、抗ＣＤ２０単一特異性療法に対して抵抗性であるか、耐性であるか、または不完全に反応する腫瘍を有することに基づいて選択される。幾つかの場合に、抗ＣＤ２０単一特異性療法は、抗ＣＤ２０単一特異性抗体を含むか、または該抗体からなる。幾つかの場合に、前記抗ＣＤ２０単一特異性抗体はリツキシマブである。幾つかの実施形態において、前記Ｂ細胞癌はリンパ腫である。幾つかの場合、該リンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。幾つかの場合、前記Ｂ細胞癌は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
別の態様において、本発明は、被験者においてＢ細胞癌を治療するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、ここでの二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを含んでおり、また前記二重特異的抗体は、前記被験者において腫瘍の負担を軽減し、腫瘍退縮を生じさせ、腫瘍増殖を阻害し、または腫瘍発生を減少させるのに十分な量で投与される。
幾つかの場合において、前記Ｂ細胞癌は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、瀰漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病及びバーキットリンパ腫からなる群から選択される。幾つかの場合において、前記被験者は、抗ＣＤ２０単一特異性療法単独に対して抵抗性であるか、または不完全に反応する腫瘍に罹患している。幾つかの場合、前記被験者は、リツキシマブ単剤療法に対して抵抗性であ
るか、または不完全に反応する腫瘍に罹患している。幾つかの場合、前記被験者は、二重特異的抗体の投与の少なくとも１日前ないし１年前に、抗ＣＤ２０単一特異性抗体療法を受けている。幾つかの場合、前記抗ＣＤ２０単一特異性抗体療法は、抗ＣＤ２０単一特異性抗体を含むか、または該抗体からなる。幾つかの場合において、前記抗ＣＤ２０単一特異性抗体はリツキシマブである。幾つかの場合において、前記被験者において腫瘍の負担を軽減し、腫瘍の退縮を生じさせ、腫瘍増殖を阻害し、または腫瘍の発生を減少させるために十分な前記量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。幾つかの場合において、前記被験者において腫瘍の負担を軽減し、腫瘍の退縮を生じさせ、腫瘍増殖を阻害し、または腫瘍の発生を減少させるために十分な前記量は、約０．４ｍｇ／ｋｇである。
別の態様において、本発明は、被験者において、ＣＤ２０発現について陽性の癌を治療するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、該使用は（ａ）癌及び／または腫瘍に罹患している被験者を選択することと、（ｂ）前記被験者からから１以上の生物学的サンプルを収集することと、（ｃ）前記１以上のサンプルにおいてＣＤ２０を発現する癌細胞または腫瘍細胞を同定することと、（ｂ）前記被験者に対して、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラＦｃドメインを具備する治療的量の二重特異的抗体を投与することを含んでいる。
幾つかの場合において、前記被験者は、抗ＣＤ２０療法に対して抵抗性であるか、耐性であるか、または不完全に反応する癌または腫瘍を有することに基づいて選択される。幾つかの場合に、前記被験者は、残留癌を有することに基づいて選択される。幾つかの場合において、前記抗ＣＤ２０療法は、抗ＣＤ２０単一特異性抗体を含み、または該抗体からなる。幾つかの場合において、前記抗ＣＤ２０単一特異性抗体は、リツキシマブである。幾つかの場合において、前記癌はリンパ腫または白血病である。幾つかの場合において、前記リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、瀰漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病及びバーキットリンパ腫からなる群から選択される。幾つかの場合において、前記白血病は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
別の態様において、本発明は、被験者において、ＣＤ２０を発現するメラノーマ癌を治療するための二重特異的抗体の使用を提供するものであり、これはヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメインと、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメインと、前記第一及び第二の抗原結合性ドメインの各々に繋がれたキメラＦｃドメインを具備する治療的量の二重特異的抗体を投与することを含んでなり、ここでの前記量は腫瘍の負担を軽減し、腫瘍増殖を阻害し、または腫瘍の腫瘍の発生を減少させるために十分である。
本発明のこの態様による二重特異的抗原結合性分子は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメインと、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメインと、前記第一及び第二の抗原結合性ドメインの各々に繋がれたキメラＦｃドメインを具備する。本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子（例えば二重特異的抗体）を含み、ここでの各抗原結合性ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とペアになった重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を具備する。本発明の一定の典型的な実施形態において、前記抗ＣＤ３抗原結合性ドメイン及び前記抗ＣＤ２０抗原結合ドメインは、それぞれ共通のＬＣＶＲとペアになった、異なる別個のＨＣＶＲを含んでいる。例えば、本明細書の実施例２に示すように、二重特異的抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメインであって、抗ＣＤ３抗体由来のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペアを具備する第一の抗原結合性ドメインと；ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインであって、ＣＤ３抗体由来のＬＣＶＲ（例えば、
前記ＣＤ３抗原結合性ドメインに含まれる同じＬＣＶＲ）とペアになった抗ＣＤ２０抗体由来のＨＣＶＲを含む第二の抗原結合性ドメインを含むように構築される。換言すれば、本明細書で開示される典型的な分子において、抗ＣＤ２０抗体由来のＨＣＶＲと抗ＣＤ３抗体由来のＬＣＶＲとのペアリングは、ＣＤ２０に特異的に結合するが、ＣＤ３には結合しない抗原結合性ドメインを創成する。このような実施形態では、前記第一及び第二の抗原結合性ドメインは、異なる抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２０・ＨＣＶＲを含むが、共通の抗ＣＤ３・ＬＣＶＲを共有する。
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、表１または表２に記載のＨＣＶＲのアミノ酸配列の何れかを含んでいる。ＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインはまた、表１または表２に記載のＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかを含むことができる。一定の実施形態に従えば、ＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、表１または表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの何れかを含む。本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここではＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、表１または表２に記載の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列の何れか、及び／または表１または表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかを含んでいる。
一定の実施形態によれば、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１０を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を具備する。
一定の実施形態に従えば、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここではＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１８を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここではＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１０／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列ペアを含んでいる。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１６を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそれと実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号２４を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを具備する。
一定の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１６／２４を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含んでいる。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を提供するものであり、ここでＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１２を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または
少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号１４を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号２０を含むアミノ酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号２２を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを具備している。
一定の非限定的で典型的な本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子は、それぞれが配列番号１２−１４−１６−２０−２２−２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含んだ、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメインを具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインは、配列番号２を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインは、配列番号１８を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を具備する。本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する前記第二の抗原結合性ドメインは、配列番号７５を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインは、配列番号２／１８または配列番号２／７５を含むアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列ペアを具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号２４を含むアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを具備する。
一定の実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合する前記第二の抗原結合性ドメインは、配列番号８／２４を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを具備する。
本発明はまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的分子を提供するものであり、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、
または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号２０のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号２２のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的な類似配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを具備する。
本発明の、非限定的で典型的な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子は、それぞれが配列番号４−６−８−２０−２２−２４（例えば、抗体１または抗体２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインを具備する。
一実施形態において、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子は、ヒトＣＤ３に特異的に結合し、且つ三つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、Ａ１−ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２、Ａ１−ＬＣＤＲ３）を具備する第一の抗原結合性ドメイン（Ａ１）と；ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、且つ三つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、Ａ２−ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２、Ａ２−ＬＣＤＲ３）を具備する第二の抗原結合性ドメイン（Ａ２）を含み；ここで、（ａ）Ａ１−ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み；（ｂ）Ａ１−ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；（ｃ）Ａ１−ＨＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含み；（ｄ）Ａ１−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み；（ｅ）Ａ１−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；（ｆ）Ａ１−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含み；（ｇ）Ａ２−ＨＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み；（ｈ）Ａ２−ＨＣＤＲ２は配列番号６のアミノ酸配列を含み；（ｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み；（ｊ）Ａ２−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み；（ｋ）Ａ２−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；（ｌ）Ａ２−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
関連する態様において、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を含み、ここでのＣＤ２０に特異的に結合する前記第二の抗原結合性ドメインは、配列番号２／１８の重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）内に含まれる重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを具備する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列の何れかをコードする核酸分子を提供するものであり、これには本明細書の表２、７及び８に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、並びに表２、７及び８に記載のポリヌクレオチド配列のうちの二つの核酸分子をそれらの何れかの機能的組合せまたは配置で具備する核酸分子が含まれる。本発明の核酸を担持する組換え発現ベクター、及びこのようなベクターがその中に導入された宿主細胞もまた、該宿主細胞を前記抗体の産生を可能にする条件下で培養することと、産生された抗体を回収することによる抗体を製造する方法と共に、本発明に包含される。
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を含むものであり、ここでは、上記で述べたＣＤ３に特異的に結合する抗原結合性ドメインの何れかが、上記で述べ
たＣＤ２０に特異的に結合する抗原結合性ドメインの何れかと組み合わされ、結合され、または会合されて、ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二重特異的抗原結合性分子を形成する。
別の態様において、本発明は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、並びに前記第一及び第二の抗原結合性ドメインの各々に繋がれたＦｃドメインを具備した二重特異的抗体を提供する。関連の態様において、前記二重特異的抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合することができる。本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに優先的に結合し、ヒトのＦｃγＲＩまたはヒトのＦｃγＲＩＩＩには結合親和性を僅かしか、または全く示さない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を提供する。一つの態様において、前記二重特異的抗体は、インビトロアッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトのＦｃγＲＩ及び／またはヒトのＦｃγＲＩＩＩに対する結合についてよりも高い親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合することができる。本発明の二重特異的抗体は、インビトロアッセイで測定したときに、該抗体がヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγＲＩＩＩに結合するよりも高い親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合することができる。幾つかの実施形態では、前記抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢの両方に結合し、且つインビトロアッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩ及びヒトＦｃγＲＩＩＩの各々に対して１μΜＫＤ未満の結合親和性を示す。
他の態様において、本発明は、各々がキメラＦｃドメインを備えた第一及び第二の重鎖ポリペプチドを含む二重特異的抗体を提供し、ここでの前記第一の重鎖ポリペプチドはヒトＣＤ３に結合する抗原結合性ドメインを具備し、また前記第二の重鎖ポリペプチドはヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメインを具備する。
他の実施形態において、前記抗体は、インビトロアッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合に比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＡについてより高い結合親和性、即ちより強い結合親和性を示す。更に他の実施形態において、前記抗体はヒトＦｃγＲＩＩＡに結合し、インビトロアッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合に比較してより低いＫＤ値を示す。幾つかの実施形態において、前記抗体は２５℃においてヒトＦｃγＲＩＩＡに結合し、インビトロアッセイで測定したときに１０〜３０μＭのＫＤ値を有する。幾つかの実施形態において、前記抗体は２５℃においてヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、インビトロアッセイで測定したときに１００〜２５０μＭのＫＤ値を有する。
別の態様において、前記抗体はインビトロアッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩに対して検出可能な結合親和性を僅かしか、または全く示さない。幾つかの態様において、前記抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩに対する検出可能な結合親和性を、僅かしか、または全く示さない。
幾つかの実施形態において、前記インビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴アッセイである。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、インビトロ細胞傷害性アッセイで測定したときに、野生型Ｆｃドメインを含む抗体に比較して低下した抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を示す。
幾つかの実施形態において、前記抗体は無視できる抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示し、または検出可能なＡＤＣＣを示さない。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、インビトロ細胞傷害性アッセイで測定したときに、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して減少した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、インビトロアッセイでの細胞溶解の測定により決定したときに、５０％未満の細胞傷害性を示す。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、無視できる補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示し、または検出可能なＣＤＣを示さない。
幾つかの実施形態において、前記抗体は、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して、ＮＫ細胞またはマクロファージのようなＦｃ受容体を有する細胞の減少したＴ細胞媒介性死滅を誘導する。
一定の実施形態において、前記抗体は、野生型Ｆｃドメインを備えた抗体に比較して、ＮＫ細胞またはマクロファージのようなＦｃ受容体を有する細胞により媒介される減少したＴ細胞死滅を誘導する。
幾つかの実施形態において、インビトロアッセイにおけるＫＤの測定により決定されたときに、前記抗体はヒトＦｃγＲＩＩＡに対する結合親和性を示し、これはヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合親和性よりも強く、これはヒトＦｃγＲＩに対する結合親和性よりも強く、これはヒトＦｃγＲＩＩＩに対するその結合親和性よりも強いかまたは同等である。他の実施形態において、前記抗体は、インビトロアッセイで測定したときに次の序列での結合親和性を示す：ヒトＦｃγＲＩＩＡ＞ヒトＦｃγＲＩＩＢ＞ヒトＦｃγＲＩ＞＝ヒトＦｃγＲＩＩＩ。
幾つかの実施形態において、インビトロアッセイにおけるＫＤの測定により決定されたときに、前記抗体はヒトＦｃγＲＩＩＡに対する結合親和性を示し、これはヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合親和性よりも強く、これはヒトＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和性よりも強く、これはヒトＦｃγＲＩに対するその結合親和性よりも強いかまたは同等である。他の実施形態において、前記抗体は、インビトロアッセイで測定したときに次の序列での結合親和性を示す：ヒトＦｃγＲＩＩＡ＞ヒトＦｃγＲＩＩＢ＞ヒトＦｃγＲＩＩＩ＞＝ヒトＦｃγＲＩ。
幾つかの実施形態において、ヒトＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡまたはヒトＦｃγＲＩＩＩＢである。
幾つかの実施形態において、前記キメラＦｃドメインはキメラヒンジを備えている。
別の態様において、本発明は、第一の抗原結合性ドメイン、第二の抗原結合性ドメイン、及びキメラ重鎖の定常（ＣＨ）領域を備えた二重特異的抗体を提供し、ここで（ａ）前記第一の抗原結合性ドメインはＣＤ３に結合し、（ｂ）前記第二の抗原結合性ドメインはＣＤ２０に結合する。本発明の一定の態様において、前記キメラＣＨ領域は、インビトロアッセイで測定したときに、野生型ＣＨ領域を備えた抗体に比較して、より高い、即ちより強い親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する。更に別の態様において、キメラＣＨは、インビトロアッセイで測定したときに、野生型のＣＨ領域を備えた抗体と比較して、より低い、またはより弱い親和性で、ヒトＦｃγＲＩ及びヒトのＦｃγＲＩＩＩに結合する。
本発明は、キメラヒンジ領域を含む二重特異的抗体を提供する。幾つかの態様において
、前記キメラヒンジ領域は、位置２１６〜２３６（ＥＵ番号付け）のアミノ酸配列残基を含む。キメラヒンジが位置２２８〜２３６（ＥＵ番号付け）のヒトＩｇＧ２下側ヒンジ部のアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５２）を含んだ、本発明の二重特異的抗体が構築される。一定の実施形態において、本発明の二重特異的抗体はキメラヒンジを含み、また該キメラヒンジの上側ヒンジ部は、ＩｇＧ１上側ヒンジ部における位置２１６〜２２７（ＥＵ番号付け）のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、本発明の二重特異的抗体はキメラヒンジを含み、該キメラヒンジの上側ヒンジ部は、ＩｇＧ４の上側ヒンジ部における位置２１６〜２２７（ＥＵ番号付け）のアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、前記二重特異的抗体は、キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５３）を含む。別の実施形態において、前記二重特異的抗体は、キメラヒンジアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５４）を含む。一定の実施形態において、前記二重特異的抗体は、位置２３７〜３４０（ＥＵ番号付け）のヒトＩｇＧ４・ＣＨ２ドメインアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、前記二重特異的抗体は、ヒトＩｇＧ１・ＣＨ３ドメインまたはヒトＩｇＧ４・ＣＨ３ドメインに由来するＣＨ３ドメインを具備する。さらに他の実施形態において、前記二重特異的抗体は、ヒトＩｇＧ１・ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ１・ＣＨ３ドメインを具備する。より多くの実施形態において、前記二重特異的抗体は、ヒトＩｇＧ４・ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ４・ＣＨ３ドメインを具備する。
本発明の一態様は、キメラ定常重鎖領域を備えた二重特異的抗体を作製する方法を提供するものであり、該方法は、（ａ）ＣＤ３抗原に結合できる第一の軽鎖をコードする核酸分子で宿主細胞をトランスフェクトし、前記核酸分子は前記第一の軽鎖のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列、及び前記Ｉｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで選択された抗原特異性抗体の前記ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は動作可能に一緒に連結されることと；（ｂ）工程（ａ）の前記宿主細胞に、ＣＤ３抗原に結合できる前記抗体の第一の重鎖をコードする核酸分子をトランスフェクトし、前記核酸分子はヒトＩｇのＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びキメラ定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでのＩｇのＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列が動作可能に一緒に連結され；ここでの前記ＣＨ領域は、前記第二のＣＨ３のプロテインＡへの結合を低下または排除するＣＨ３ドメインにおける１以上のアミノ酸修飾をコードすることと；（ｃ）工程（ａ）の前記宿主細胞に、ＣＤ２０抗原に結合できる前記抗体の第二の重鎖をコードする核酸分子をトランスフェクトし、前記核酸分子はヒトＩｇのＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びキメラＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでの前記ＩｇのＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列およびＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列が動作可能に一緒に連結されることと；及び（ｃ）前記宿主細胞において（ａ）及び（ｂ）の前記核酸分子を共発現させることによって、前記抗体を作製することを含んでいる。
一実施形態において、本発明は、二重特異的抗体を作製する方法において：（ａ）宿主細胞に、（ｉ）抗体の軽鎖をコードする核酸分子であって、該核酸分子は配列番号１８を含むＬＣＶＲをコードするヌクレオチド配列、及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、また前記抗体のＬＣＶＲ領域をコードする前記ヌクレオチド配列はＩｇのＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される核酸分子をトランスフェクトすることと、（ｂ）工程（ａ）の前記宿主細胞に、（ｉ）前記抗体の第一の重鎖をコードする核酸分子であって、該核酸分子は配列番号１０を含むＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列及びＩｇＧのキメラＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでの前記ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０または配列番号３２をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでの前記ＨＣ
ＶＲをコードするヌクレオチド配列は、前記ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される核酸分子と、（ｉｉ）前記抗体の第二の重鎖をコードする核酸分子であって、該核酸分子は配列番号２を含むＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列及びＩｇＧのキメラＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでの前記ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列は前記ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される核酸分子をトランスフェクトすることと、（ｃ）前記宿主細胞内で（ａ）及び（ｂ）の核酸分子を共発現させることによって前記抗体を作製することによる方法を提供する。幾つかの場合に、当該方法は更に、工程（ｂ）の前記宿主細胞を培養する工程（ここで抗体が細胞培地中に分泌される）、及びこの細胞培地から前記抗体を単離する工程を含む。
幾つかの態様において、前記二重特異的抗体を作製する方法は、任意に、前記工程（ａ）の宿主細胞に、ＣＤ２０抗原に結合できる第二の軽鎖をコードする核酸分子をトランスフェクトすることを含み、該核酸分子は第二の軽鎖のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでの前記第二の軽鎖のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は動作可能に一緒に連結される。
幾つかの実施形態において、前記第一の重鎖は、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含んだＣＨ３領域を具備する。別の実施形態において、前記第一の重鎖は、更にＹ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴ；ＥＵ番号付けによるＹ４３６Ｆ）を含んだＣＨ３領域を具備する。更なる実施形態において、該方法は、プロテインＡを用いて前記抗体を単離することを含む。
本発明の別の態様は、二重特異的抗体であって、（ａ）第一の標的抗原を認識してこれに結合できる抗原結合性ドメインを備えた第一の重鎖と、（ｂ）第二の標的抗原を認識してこれに結合できる抗原結合性ドメインを備えた第二の重鎖と、（ｃ）前記第一または第二の標的抗原を認識してこれに結合できる抗原結合性ドメインを備えた共通の軽鎖とを具備し、前記（ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）及び（ｂ）の両方の重鎖が、配列番号５３または配列番号５４のアミノ酸配列を含むキメラヒンジ領域を備えた重鎖定常領域（ＣＨ）を具備する二重特異的抗体を提供する。
一定の実施形態において、前記重鎖定常領域（ＣＨ）は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２のアミノ酸配列を含んでいる。幾つかの実施形態において、前記キメラＣＨをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または配列番号３３を含んでいる。他の実施形態において、前記キメラＣＨヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２のアミノ酸配列をコードする。更に他の実施形態において、前記ＣＨ領域のヌクレオチド配列は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または配列番号３３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
一定の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする核酸分を含んでいる。別の態様において、前記二重特異的抗体は配列番号３４のヌクレオチド配列を含んだ、軽鎖をコードする核酸分子を含んでいる。
一定の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。他の態様において、前記二重特異的抗体は配列番号３６のヌクレオチド配列を含んだ、重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。
一定の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。他の態様において、前記二重特異的抗体は配列番号３８または配列番号３９のヌクレオチド配列を含んだ、重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。
一定の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。他の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。
一定の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。他の態様において、前記二重特異的抗体は、配列番号４３のヌクレオチド配列を含んだ重鎖をコードする核酸分子を含んでいる。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗体結合性分子の治療的有効量を提供する。関連の態様において、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗体結合性分子と、第二の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一つの実施形態において、前記第二の治療剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子と有利に組み合わされ得る典型的な薬剤は、本明細書の他の個所で詳細に述べる。
更に別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を使用して、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞をターゲッティング／死滅させるための治療方法であって、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を含有する治療的有効量の医薬組成物を、それを必要としている被験者に投与することを含む方法を提供する。幾つかの場合において、前記二重特異的抗原結合性分子（例えば抗体）は、ＣＤ２０を発現するヒト細胞に結合し、またはヒトＢ細胞に結合する。
更に別の態様において、本発明は二重特異的抗体を提供し、該抗体はヒトＣＤ３を発現するヒト細胞及びカニクイザルＣＤ３を発現するカニクイザル細胞に結合し；ヒトＴ細胞またはカニクイザルＴ細胞に結合し；ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞に１×１０−１２Ｍ〜１×１０−６ＭのＥＣ５０値で結合し；ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞に１×１０−９Ｍ〜１×１０−８ＭのＥＣ５０値で結合し；ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞に１×１０−１２Ｍ〜１×１０−６ＭのＥＣ５０値で結合し；ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞に１×１０−９Ｍ〜１×１０−８ＭのＥＣ５０値で結合し；または抗ＣＤ２０媒介性の細胞傷害性に対して抵抗性または耐性であるヒトＢ細胞のＴ細胞媒介性の細胞傷害性を高める。
本発明の種々の方法または使用において、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で前記二重特異的抗体を前記被験者に単回投与することは、前記二重特異的抗体の前記被験者への投与後の約２日までに、前記被験者におけるＢ細胞の数を検出可能なレベル未満にまで減少させる。幾つかの場合、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇの前記二重特異的抗体の単回用量を前記被験者に投与した後、少なくとも約７日までは、Ｂ細胞の数は検出可能なレベル未満のままである。
本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子の使用であって、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞をターゲッティング／死滅させるための使用、及びＣＤ２０発現に関連した、または該発現により生じる疾患または障害の治療のための医薬の製造における使用を含むものである。幾つかの場合に、本発明の二重特異的抗体は、被験者において癌を治療または緩和するための医薬の製造において使用され、ここでの前記二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメインと、ヒトＣＤ２０に結合する
第二の抗原結合性ドメインと、前記第一及び第二の抗原結合性ドメインの各々に繋がれたキメラＦｃドメインを具備し、また前記癌を治療または緩和することは、（ａ）前記被験者において腫瘍増殖を抑制すること、（ｂ）前記被験者においてＢ細胞溶解を媒介すること、（ｃ）前記被験者においてＢ細胞癌を治療すること、（ｄ）前記被験者においてＣＤ２０発現が陽性の癌を治療すること、または（ｅ）前記被験者においてＣＤ２０を発現するメラノーマ癌を治療することを包含する。
本発明はまた、第一の抗原結合性ドメイン、第二の抗原結合性ドメイン、及びキメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を備えた二重特異的抗体をも包含するものであり、ここで前記第一の抗原結合性ドメインはＣＤ３に結合し、前記第二の抗原結合性ドメインはＣＤ２０に結合し、前記キメラＣＨ領域は、野生型ＣＨ領域を備えた抗体に比較してより高い親和性、即ち、より強い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、このような二重特異的抗体は医薬の製造における使用のためのものである。本発明は、ＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメインと、ＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメインと、及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い、即ち、強い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡに結合するキメラＣＨ領域を備えた、医薬の製造において使用するための二重特異的抗体を提供する。
他の実施形態は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
キメラヒンジ領域の構築に使用されるヒンジアミノ酸及び対応するアミノ酸番号付け規則を示す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ・ＡＣＣＮ番号Ｐ０１８５７においてＩＧＨＧ１として記載された、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４５）を表す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ・ＡＣＣＮ番号Ｐ０１８５９においてＩＧＨＧ２として記載された、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４６）を表す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ・ＡＣＣＮ番号Ｐ０１８６１においてＩＧＨＧ４として記載された、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４７）を表す。 図５Ａ及び図５Ｂは、野生型またはキメラ型のヒンジＣＨ領域を有する抗体（「対照」抗体４＝ｗｔＩｇＧ１・ＣＨを備えた二重特異性Ａｂ、抗体１、抗体２、ＩｇＧ１アイソタイプ対照＝ｗｔＩｇＧ１・ＣＨを備えた非特異的Ａｂ）の存在下における、Ｄａｕｄｉ細胞（図５Ａ）及びＲａｊｉ細胞（図５Ｂ）に関するＣＤＣ活性の欠如を示す用量応答曲線。 図６Ａ及び図６Ｂは、野生型またはキメラ型のヒンジＣＨ領域を有する抗体（「対照」抗体４＝ｗｔＩｇＧ１・ＣＨを備えた二重特異性Ａｂ；抗体１；抗体２；ＩｇＧ１アイソタイプ対照＝ｗｔＩｇＧ１・ＣＨを備えた非特異的Ａｂ）の存在下における、Ｄａｕｄｉ細胞（図６Ａ）及びＲａｊｉ細胞（図６Ｂ）に関するＡＤＣＣ活性の欠如を示す用量応答曲線。 図７Ａ〜図７Ｆは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣ（またはＰＢＭＣ対照なし−図７Ｄ）の混合物を皮下に移植したＮＳＧマウスにおける、経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。ここでは、本発明のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体（Ａｂ１）または担体または対照抗体の何れかが、腫瘍移植及び治療に続いて投与され、腫瘍移植の同じ日（第０日）に始まり、研究の全期間を通して測定された。図７Ａ：担体治療で腫瘍増殖の阻害を示したマウスはいなかった；図７Ｂ：５匹のマウスのうちの１匹（１／５）は、０．４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（抗ＦｅＩＤ１Ａｂ）治療で腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｃ：５／５のマウスが、０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（Ａｂ１）治療で腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｄ：０／５のマウスが腫瘍増殖阻害を示し、ここではＰＢＭＣは移植されず、また０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１治療が用いられた；図７Ｅ：５／５のマウスが、０．０４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１治療で腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｆ：５／５のマウスが、０．００４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１治療で腫瘍増殖阻害を示した。 図７−１の続き。 図８Ａ及び図８Ｂは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下に移植され、ＩｇＧ補充を伴うかまたは伴わない担体と比較して、Ａｂ１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ）で治療されたＮＳＧマウス（図８Ａ）、またはＩｇＧ補充を伴うかまたは伴わない担体と比較して、Ａｂ４（ＣＤ３×ＣＤ２０−ｗｔＦｃ）で治療されたＮＳＧマウス（図８Ｂ）における経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。両方のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、このモデルにおいて、ＩｇＧ補充での有意な腫瘍増殖阻害を示す。図８Ａに見られるように、ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ二重特異的抗体（Ａｂ１）は、この実験において、ＩｇＧ補充の有無にかかわらず試験された期間の全体に亘って完全な腫瘍増殖阻害を示す。 ＣＤ３×ＣＤ２０の二重特異的抗体で治療されたＮＳＧマウスにおいて、樹立された腫瘍（〜２００−４００ｍｍ３）の第１４日までの退縮を示している。ＮＳＧマウスは、腫瘍を完全に樹立させるように、治療の１５日前にＲａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下に移植された。その後、マウスは０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）、または０．４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（抗ＦｅｌＤ１・Ａｂ）、または担体対照で週１回（第７日、第１４日、第２１日）治療された。 ＣＤ３×ＣＤ２０の二重特異的抗体で治療されたＮＳＧマウスにおいて、樹立された腫瘍（〜５００−９００ｍｍ３）の第２１日までの退縮を示している。ＮＳＧマウスは、腫瘍を完全に樹立させるように、治療の１５日前にＲａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下に移植された。その後、マウスは０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）、または０．４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（抗ＦｅｌＤ１・Ａｂ）で週１回（第７日、第１４日、第２１日）治療された。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、７日間の試験において、カニクイザルの末梢血中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することによる、単一特異性抗体投与（リツキシマブ）と比較した抗体１及び抗体４ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体投与のインビボでの効力を示している。抗体またはプラセボを第０日に投与した。図１１Ａ：末梢血中のＢ細胞レベルは、プラセボを除く全てのサンプルにおいて第２日までに有意に枯渇された。図１１Ｂ：二重特異的抗体で治療された動物の末梢血中では、Ｔ細胞の一過性の損失が第２日までに観察され、第４日までにベースラインレベルにまで回復した。Ｔ細胞の損失（基準値未満）は、プラセボまたはリツキシマブ（リツキサン）群では観察されなかった。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、長期間（３月）の研究において、カニクイザルの末梢血中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することによる、抗体１及び抗体４ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体投与のインビボでの効力を示している。プラセボ（担体）または二重特異的抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇで第０日に投与した。図１２Ａ：末梢血中のＢ細胞レベルは、プラセボを除く全てのサンプルにおいて第２日までに有意に枯渇され、また研究の長さに亘って枯渇したままであったた。図１２Ｂ：二重特異的抗体で治療された動物については、研究の全体を通して（＞８０日）測定したときに、Ｔ細胞の一過性の損失が第２日までに観察され、次いで第４日までにベースラインレベルにまで回復し、その後は測定されたベースライン付近のままであった。Ｔ細胞の損失（基準値未満）は、プラセボで治療された動物群では観察されなかった。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、長期間（２月）の研究において、カニクイザルの末梢血中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することによる、抗体１及び抗体４ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の低用量投与のインビボでの効力を示している。二重特異的抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．００１ｍｇ／ｋｇ（１μｇ／ｋｇ）で第０日に投与した。図１３Ａ：末梢血中のＢ細胞レベルは、より高用量のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体で治療された動物について観察されたのと同様に（図１１Ａまたは図１２Ａも参照のこと）、第２日までに有意に枯渇され、また研究の長さに亘って枯渇したままであった。図１３Ｂ：きわめて低用量（１μｇ／ｋｇ）の二重特異的抗体で治療された動物は、より高用量のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体で治療された動物に見られるのと同じＴ細胞の一過性の損失及びで回復を経験する（図１１Ｂまたは図１２Ｂも参照のこと）。 ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体１で治療された動物の末梢血における、Ｂ細胞喪失と抗体喪失との間の相関を示している。動物の循環系における抗体露出（白記号）が経時的に枯渇されるに伴って、Ｂ細胞集団（黒記号）は回復を始める（例えば、動物番号ｌ０６８８１（黒丸）については第８１日に観察される）。 ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体２で治療された動物の末梢血における、Ｂ細胞喪失と抗体喪失との間の相関を示している。動物の循環系における抗体露出（白記号）が経時的に枯渇されるに伴って、Ｂ細胞集団（黒記号）は回復を始める（例えば、動物番号ｌ０６８７６については第６６日（黒三角）に、動物番号ｌ０６８７７については第６８日（黒四角）に観察される）。 ＣＤ３×ＣＤ２０−ｗｔＦｃ（Ａｂ４）二重特異性的抗体で治療された動物の末梢血における、Ｂ細胞喪失と抗体喪失との間の相関を示している。動物の循環系における抗体露出（白記号）が経時的に枯渇されるに伴って、Ｂ細胞集団（黒記号）は回復を始める（例えば、動物番号ｌ０６８７０については第９１日（黒三角）に、動物番号ｌ０６８７２については第６４日（黒丸）に観察される）。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、抗ＣＤ２０単一特異性抗体に比較して、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の投与から生じるカニクイザルの脾臓における組織Ｂ細胞（図１７Ａ）または腸間膜リンパ節（図１７Ｂ）の枯渇を描いており、二重特異性コホートに対しては遥かに低い用量（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量）が投与される。この枯渇は、プラセボ対照動物コホートにおいては、何れの組織においてもみられなかった。両方のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体（Ａｂ１及びＡｂ４）は、リンパ器官において用量依存的なＢ細胞枯渇を生じ、また０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量において、前記二重特異的抗体はリツキシマブよりも効率的にＢ細胞を枯渇させる。 図１８Ａ及び図１８Ｂは、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、インビトロでのバイオアッセイにいて、ヒトＰＢＭＣ（図１８Ａ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（図１８Ｂ）の増殖を誘導するのに対して、対照抗体５（−▲−；ＣＤ３×ＣＤ２０に対して特異性でない）は活性を示さなかったことを示している。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、細胞傷害アッセイにおける、ＣＤ３×ＣＤ２０に媒介されたＲａｊｉ標的殺滅を示している。抗体１は、ヒト（図１９Ａ）及びカニクイザル（図１９Ｂ）のＴ細胞について、それぞれ２５．０ρＭ及び９．１０ρＭの代表的なＥＣ５０で標的細胞の殺滅を媒介した。抗体４は、ヒト（図１９Ａ）及びカニクイザル（図１９Ｂ）のＴ細胞について、それぞれ１５．７ρＭ及び１．７３ρＭの代表的なＥＣ５０で標的細胞の殺滅を媒介した。対照（−▲−）では活性は観察されなかった。 図２０Ａ及び図２０Ｂは、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体が、未処置のＴ細胞による細胞の死滅を媒介することを示している。図２０Ａは、抗体４の最高試験濃度での代表的なＦＡＣＳ散乱プロットを示している。Ｂ１６Ｆ１０．９野生型細胞はＣＦＤＡ−ＳＥで標識され、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞はバイオレット細胞追跡剤で標識される。エフェクター細胞は標識されない。図２０Ａの２番目のパネルは、ＣＤ２０を発現する細胞が抗ＣＤ３×ＣＤ２０での処理により除去されること（右下象限）を示している。図２０Ｂは、ＣＤ２０×ＣＤ３抗体、すなわち抗体４（ｗｔＦｃ）、抗体１（キメラＦｃ）または対照Ａｂ ５、及びＰＢＭＣの存在下での、４８時間後のＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞の生存比率を示している。生存パーセントは、生細胞集団において、ＣＤ２０陰性Ｂ１６Ｆ１０．９細胞に対するＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞のパーセンテージを比較することによって決定した。Ａｂ４及びＡｂ１は、細胞の混合集団におけるＣＤ２０（図２０Ｂ）を発現する標的細胞のみを死滅させるために、ヒトＴ細胞に対して特異的に指向された。標的細胞の死滅は二重特異的抗体の存在においてのみ観察され、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞は、抗体４（ＥＣ５０：１２．８５ρＭ）及び抗体１（ＥＣ５０１９．５ρＭ）によって用量依存的に枯渇された（図２０Ｂ）。ＣＤ２０発現細胞の５％未満は、試験した最高用量（１０μｇ／ｍＬ）において生存した。 Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞を標的とする４８時間の細胞傷害性アッセイにおける、総ＣＤ２＋エフェクター細胞のうちの活性化された（ＣＤ６９＋）細胞のパーセントを示しており、このような活性化は何れかのＣＤ２０×ＣＤ３抗体、即ち、抗体４（ｗｔＦｃ）または抗体１（キメラのＦｃ）によって誘導されたものである。 図２２Ａ及び図２２Ｂは、ＣＤ３×ＣＤ２０の二重特異的抗体が、その二重特異性結合性アームを介して、標的細胞（ＣＤ２０＋細胞）とＴ細胞のクラスタリングを誘導したことを示している。エフェクター細胞をＣＦＳＥで染色し、ＣＤ２０＋細胞はバイオレット細胞追跡剤で染色して、これらを別々の象限にゲーティングする。無関係な対照抗体（対照抗体５）と共にインキュベーションした後、細胞混合物中には何のクラスタリング（二重染色）も出現しない（図２２Ａ）。ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体（Ａｂ４）とのインキュベーション後に細胞クラスターが出現するが、これはそれらがＣＦＳＥ及びバイオレットの両方で染色されているからである（太字の四角によって強調されているので、図２２Ｂの散乱プロット左上の象限を参照されたい）。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３で）研究を示しており、０．４ｍｇ／ｋｇの本発明のＣＤ３×ＣＤ２０の二重特異的抗体（Ａｂ１）、２回／週（ｉ．ｐ）、０．４ｍｇ／ｋｇの無関係の抗体対照Ａｂ６、２回／週（ｉ．ｐ）、または担体が、リツキシマブ、０．４ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２０抗体、５回／週（ｉ．ｐ）、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９×ＣＤ３ＢｉＴＥ、５回／週（ｉ．ｖ）と比較された（ＣＤ１９×ＣＤ３ＢｉＴＥについては、Ｎａｇｏｒｓｅｎ Ｄら．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｄｅｃ；１３６（３）：３３４−４２，２０１２を参照されたい）。治療剤は、樹立された腫瘍（〜１００−５００ｍｍ３）を持つマウスに投与された。データは平均（ＳＥＭ）として表わされ、ＡＮＯＶＡ解析に掛けられた。このインビボモデルにおいて、週２回ｉ．ｐ投与されたＡｂ１は、週５回ｉ．ｖ投与されたＣＤ１９×ＣＤ３ＢｉＴＥの効力に匹敵した。 図２３と同様に、Ｒａｊｉ／ＰＢＭＣ混合物を皮下移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３で）研究を示しているが、ＡＮＯＶＡ解析は、Ａｂ１、対照Ａｂ６、リツキシマブ及び担体対照について提供された。樹立されたＲａｊｉ腫瘍を抑制することにおいて、週２回投与されたＡｂ１は、リツキシマブ療法（８ｍｇ／ｋｇ；５回／週ｉ．ｐで投与された）よりも優れていた。 図２５Ａ及び図２５Ｂは、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体で治療されるヒト化マウスにおいて、ｈＣＤ２０／Ｂ１６Ｆ１０．９腫瘍移植と同時に、またはその後に治療が開始されたときの、遅延された腫瘍増殖を示している。図２５Ａ：ｈＣＤ３マウスは、ｈＣＤ２０を遺伝子導入されたＢ１６Ｆ１０．９メラノーマ細胞を皮下移植され、同時に０．００４ｍｇ／ｋｇまたは０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）または４ｍｇ／ｋｇ対照Ａｂ５（抗ＦｅＩＤ１Ａｂ）、または担体対照（週２回のｉ．ｐ．）で治療された。図２５Ｂ：ｈＣＤ３マウスは、ｈＣＤ２０／Ｂ１６Ｆ１０．９メラノーマ細胞を皮下移植され、樹立された腫瘍は第１０日以降に、抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）または対照で治療された。マウスは、０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１、または０．４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（抗ＦｅＩＤ１Ａｂ）、または担体対照を用いて、週２回ｉ．ｐ．で治療された。
本発明を説明する前に、方法及び条件は変化する可能性があるので、本発明は記載される特定の方法及び実験条件に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけものであり、また本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、当該用語が限定を意図する
ものでないことが理解されるべきである。
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用されるとき、特定の引用された数値に関して使用される場合の「約」の用語は、その値が、列挙された値から１％以下だけ変化してもよいことを意味し得る。例えば、本明細書で使用されるとき、「約１００」の表現は、９９及び１０１、並びに９９と１０１の間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
ここに記載するものに類似した、または均等の如何なる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用し得るが、好ましい方法及び材料について以下に説明する。
＜定義＞
ここで用いられる「ＣＤ３」の表現は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞上で発現される抗体であって、２〜４の受容体鎖、即ち、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータ、及びＣＤ３ガンマの会合から形成されるホモ二量体またはヘテロ二量からなる抗原を意味する。本明細書においてタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種に由来するものとして明示的に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指称することが意図されている。従って、「ＣＤ３」の表現は、非ヒト種由来である（例えば「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」等）として明示的に特定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ３に結合する抗体」または「抗ＣＤ３抗体」は、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマまたはゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合性断片、並びに二つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、ゼータ／ゼータＣＤ３ダイマー）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合性断片を含む。本発明の抗体及び抗原結合性断片は、可溶性ＣＤ３及び／または細胞表面に発現したＣＤ３に結合してよい。可溶性ＣＤ３には、天然のＣＤ３タンパク質、並びに組換えＣＤ３タンパク質変異体、例えば膜貫通ドメインを欠失しているか、または細胞膜と結合していない単量体及び二量体のＣＤ３構築物が含まれる。
本明細書中で使用するとき、「細胞表面に発現されたＣＤ３」の表現は、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に露出して抗体の抗原結合部分がアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボで細胞表面上に発現される１以上のＣＤ３タンパク質を意味する。「細胞表面に発現されたＣＤ３」には、細胞の膜における機能的なＴ細胞受容体の枠内に包含されるＣＤ３タンパク質が含まれる。「細胞表面に発現されたＣＤ３」の表現は、ホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、ゼータ／ゼータＣＤ３二量体）の一部として細胞表面に発現されたＣＤ３タンパク質が含まれる。「細胞表面に発現されたＣＤ３」の表現はまた、細胞の表面上に、他のＣＤ３鎖タイプを伴わずに、それ自身で発現されるＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタまたはＣＤ３ガンマ）が含まれる。「細胞表面に発現されたＣＤ３」は、正常にＣＤ３タンパク質を発現する細胞の表面に発現されたＣＤ３タンパク質を含むことができ、または該タンパク質からなることができる。或いは、「細胞表面に発現されたＣＤ３」は、正常にはその表面にヒトＣＤ３を発現しないが、該表面にＣＤ３を発現するよう人工的に操作された細胞の表面に発現されたＣＤ３タンパク質を含むことができ、または該タンパク質からなることができる。
本明細書中で使用するとき、「抗ＣＤ３抗体」の表現には、単一特異性を備えた一価抗
体、並びにＣＤ３に結合する第一のアーム及び第二の（標的）抗原に結合する第二のアームを備えた二重特異的抗体が含まれ、ここでの抗ＣＤ３アームは、本明細書の表１または表２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列の何れかを含んでいる。抗ＣＤ３二重特異的抗体の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。「抗原結合性分子」の用語には、例えば二重特異的抗体を含む抗体、及び抗体の抗原結合性断片が含まれる。典型的な抗ＣＤ３抗体はまた、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１、及び２０１３年９月１９日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１に記載されており、それらの各々を本明細書の一部として援用する。
本明細書で使用する「ＣＤ２０」の用語は、非ヒト種由来（例えば、「マウスＣＤ２０」、「サルＣＤ２０」等）として特定されない限り、ヒトＣＤ２０タンパク質を指称する。ヒトＣＤ２０タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６９０６０５．１のようなアミノ酸配列を有している。
本明細書で使用するとき、「抗ＣＤ２０抗体」の表現には、ＵＳ７，８７９，９８４に記載された、リツキサン（リツキシマブ）のような単一の特異性を有する一価抗体が含まれる。典型的な抗ＣＤ２０抗体はまた、ＵＳ７，８７９，９８４、及び２０１３年９月１９日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１に記載されており、それらの各々を本明細書の一部として援用する。
本明細書で使用される「抗体」の用語は、特定の抗原（例えばＣＤ３）と特異的に結合または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を備えた、任意の抗原結合性分子または分子複合体を意味する。「抗体」の用語には、免疫グロブリンの４つのポリペプチド鎖、即ち、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む分子、ならびにその多量体（例えばＩｇＭ）が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含んでいる。重鎖定常領域は３つのドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでいる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含んでいる。軽鎖定常領域は一つのドメイン（ＣＬ１）を含んでいる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存された領域が介在された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域へと細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬ領域は３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の別の実施形態において、抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であってよく、或いは自然にまたは人工的に改変されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２以上のＣＤＲの対照分析に基づいて定義されてよい。
本明細書で使用する「抗体」の用語には、完全な抗体分子の抗原結合性断片も含まれる。ここで用いる抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」等の用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、何らかの天然に生じる、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子的に加工されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合性断片は、タンパク質分解性消化、または抗体可変ドメイン及び任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、例えば完全な抗体分子から誘導することができる。このようなＤＮＡは既知であり、及び／または商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手でき、或いは合成することができる。このＤＮＡは、例えば１以上の可変ドメイン及び／または定常ドメインを適切な編成で配置し、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加または欠失させるために、化学的に、または分子生物学的技術を使用することによって、配列決定され且つ操作されてよい。
抗原結合性断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（Ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが含まれる。他の操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、ここで用いる「抗原結合性断片」の表現の範囲内に包含される。
抗体の抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含んでいる。該可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般には、１以上のフレームワーク配列に対して隣接し、または該配列と共にインフレームである少なくとも一つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと関連付けられたＶＨドメインを有する抗原結合性断片において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、相互に任意の適切な配置でおかれてよい。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含んでよい。或いは、抗体の抗原結合性断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含んでよい。
一定の実施形態において、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも一つの定常断片（Ｆｃ）ドメインに共有結合され、或いはＦｃドメインに繋がれた少なくとも一つの可変ドメインを含んでよい。「係留された」の用語は、定常ドメインに係留された可変ドメインのように二つの成分を一緒にするための、共有結合またはリンカーポリペプチド配列を介した直接の連結を意味する。従って、一定の実施例において、第一及び第二の抗原結合性ドメインを含む可変ドメイン、例えば、ＣＤ３及びＣＤ２０に結合して二重特異的抗体を形成するものは、各々が共有結合またはリンカーアミノ酸配列を介して、例えば、（Ｎ末端からＣ末端へ）完全もしくは部分的なＣＨ１、キメラヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに直接連結（または係留）されてよい。本発明の抗体の抗原結合性断片内にみられ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的で典型的な構成は、次のものを含んでいる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｉｉ）ＶＨ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｉｖ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（Ｖ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（ｖｉ）ＶＬ−ＣＬ。上記で列記した典型的な構成の何れかを含む可変ドメイン及び定常ドメインの任意の構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは互いに直接連結されてよく、または本発明の完全もしくは部分的なキメラヒンジにより、または完全もしくは部分的なＣＨ１及びキメラヒンジにより連結（係留）されよい。幾つかの場合には、ポリペプチドリンカー（例えば、２〜１０のアミノ酸から）が可変ドメイン及びＦｃドメインを結合（係留）してよく、または完全もしくは部分的なキメラヒンジ及び／またはＣＨ１との追加の結合を含んでよい。ヒンジ領域は、少なくとも上側及び下側のヒンジ部アミノ酸から構成されてよく、これらは単一のポリペプチド分子内において、隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメインの間の可撓性または半可撓性リンケージを生じる。更に、本発明の抗体の抗原結合性断片は、相互の及び／または１以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインとの非共有結合（例えばジスルフィド結合により）において、上記で列記した可変及び定常ドメイン構成の何れかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
本明細書で開示される典型的な二重特異的抗体フォーマットを含んだ本発明の多重特異性抗体フォーマットは、典型的には、各可変ドメインが別々の抗原に特異的に結合できる少なくとも２つの異なる可変ドメインを含具備する。多重フォーマットは、当技術分野で
利用可能な日常的な技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合性断片との関連において使用するために適合させることができる。
本発明の抗体は、インビトロで測定したときに、減少した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有するように、または該細胞傷害性を有さないように修飾される。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）とは、補体の存在下での、抗原発現細胞の本発明の抗体による溶解を意味する。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲを）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解を導く細胞媒介性反応を意味する。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野で周知であり且つ利用可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許番号５，５００，３６２及び５，８２１，３３７、並びにＣｌｙｎｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６参照）。抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体のＣＨは、該抗体が細胞傷害性を媒介するために望ましいかどうかに基づいて選択することができる。
本発明の一定の実施形態において、本発明の二重特異的抗体はヒト抗体である。本明細書で用いられる「ヒト抗体」の用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてよい。しかしながら、本明細書中で使用される「ヒト抗体」の用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図するものではない。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は組換えヒト抗体であってよい。本明細書で使用するとき、「組換えヒト抗体」の用語は、組換え手段により調製され、発現され、創生され、または単離される全てのヒト抗体、例えば宿主細胞（以下で更に説明する）中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下で更に説明する）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列への素プライシングを含む他の任意の手段により調製、発現、作製または単離された抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有している。しかしながら、一定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物を用いる場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け、従って、該組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ領配列に由来し、これに関連しているにも関わらず、インビボのヒト抗体生殖系列のレパートリー内に天然には存在しない可能性がある。
ヒト抗体は、ヒンジの異質性に関連付けられる二つの形態で存在することができる。一つの形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間の重鎖ジスルフィド結合により一緒に保持された約１５０〜１６０ｋＤａの安定した四鎖構築物を含んでいる。第二の形態において、前記二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されず、共有結合した軽鎖及び重鎖（半抗体）で構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、親和性精製の後でさえも分離が極めて困難であった。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける前記第二の形態の出現頻度は、限定されるものではないが、抗体ヒンジ領域のアイソタイプに関連した構造上の相違によるものである。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、有意に第２の形態の出現を、典型的にはヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して観察されるレベルにまで低下させることができる（Ａｎｇａｌ ら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明には、ヒンジ領域に、例えば製造の際に望ましい抗体形の収率を改善できる１以上の変異を有する抗体が包含される。
本発明の抗体は、単離された抗体であることができる。本明細書で使用する「単離された抗体」とは、その自然環境の少なくとも一つの成分から同定され、分離及び／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも一つの成分から、或いはその中において前記抗体が天然に存在し、または天然に産生される組織もしくは細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。また、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュー抗体も含まれる。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。一定の実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
本明細書に開示される抗ＣＤ３または抗ＣＤ２０可変領域は、該抗体が誘導された対応する生殖細胞系配列に比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域に１以上のアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含んでいてよい。このような変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系配列と比較することによって、容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列の何れかに由来する抗体、その抗原結合性断片を含むものであり、ここでの１以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸は、前記抗原が由来する生殖細胞系配列の対応する残基に、または前記別のヒト生殖細胞系配列の対応する残基に、または前記対応する生殖系残基の保存敵アミノ酸置換に変異される（このような配列変化を、本明細書では一纏めに「生殖細胞系変異」と称する）。一定の実施形態において、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内の全てのフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基は、前記抗体が由来する元の生殖細胞系配列に見られる残基へと戻し変異させることができる。他の実施形態では、一定の残基だけ、例えばＦＲ１の最初の８アミノ酸内またはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られる変異された残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内に見られる変異された残基のみが元の生殖細胞系配列へと戻し変異される。他の実施形態においては、前記フレームワーク及び／またはＣＤＲ残基の一以上が、異なる生殖細胞系配列（即ち、前記抗体が由来する塩基生殖細胞系配列とは異なる生殖細胞系配列）の対応する残基へと変異される。更に、本発明の抗体は、塩基フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２以上の生殖細胞系変異の任意の組み合わせを含んでいてよく、例えば、ここでの一定の個々の残基は特定の生殖細胞系配列の対応する残基へと変異される一方、前記元の生殖細胞系配列とは異なる一定の他の残基は維持され、または異なる生殖細胞系配列の対応する残基へと変異される。一旦得られたら、１以上の生殖系突然変異を含む抗体及び抗原結合断片は、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善されもしくは向上した拮抗剤もしくはアゴニストの生物学的性質（そのような場合であれば）、または低下した免疫原性等のような１以上の望ましい性質について容易に試験することができる。この一般的方法において得られた抗体及び抗原結合性断片は、本発明の範囲内に包含される。
本発明にはまた、１以上の保存的置換を有する本明細書中に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲのアミノ酸配列の任意の変異体を備えた抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ２０の可変領域も含まれる。例えば、本発明は、本明細書表１に記載されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列の何れかに対して、例えば１０以下、８以下
、６以下、４以下等の保存性アミノ酸置換を備えたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤＲ抗体を含むものである。
「エピトープ」の用語は、パラトープとして知られる抗体分子可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有することができる。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してよく、異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは高次構造または線状の何れであってもよい。高次構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なる区分からの空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって生じるものである。一定の環境において、エピトープは抗原上の糖の部分、ホスホリル基またはスルホニル基を含み得る。
「実質的同一性」または「実質的に同一」の用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入もしくは欠失と共に別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列された場合、以下で述べるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはギャップのような周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定したときに、少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。基準核酸分子との実質的同一性を有する核酸分子は、一定の場合に、基準核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一、または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的同一性」または「実質的に類似」とは、二つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重みを使用したＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）をもった側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能的性質を変化させない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換により相互に異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するように上方調節され得る。この調節を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似した化学的特性をもった側鎖を有する一群のアミノ酸の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。或いは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の改変に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似した配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含んでおり、これは異なる生物種由来の相同性ポリペプチドのように密
接に関連したポリペプチド間の配列相同性を決定するため、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するために、デフォルトのパラメータと共に使用することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問合せ配列と検索配列の間の最良の重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）ｓｕｐｒａ）。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと本発明の配列とを比較する別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用したコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
＜二重特異的抗原結合性分子＞
本発明の抗体は、二重特異性または多重特異性であることができる。多重特異性抗体は、一つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、または２以上の標的ポリペプチドについての特異的な抗原結合ドメインを含んでよい。例えば、Ｔｕｔｔ ら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒら，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体は、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質に連結することができ、またはこれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片のような１以上の他の分子実体に機能的に連結されて（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合その他によって）、追加の結合特異性を備えた二重特異的抗体または多重特異性抗体を生じることができる。
従って、本発明には、免疫グロブリンの一方の腕がヒトＣＤ３に結合し、免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に特異的である二重特異的抗体が含まれる。ＣＤ３二重特異的抗体が結合する標的抗原は、細胞、組織、器官、微生物またはウイルスに発現し、またはその近傍に発現する任意の抗原であることができ、該抗原にターゲッティングされた免疫応答が望まれるものである。該ＣＤ３結合性アームは、本明細書の表１に記載されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列何れかを含むことができる。
抗体の一方のアームがＣＤ３に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異的抗体の関連において、前記標的抗原は腫瘍関連抗原であることができる。特異的腫瘍関連抗原の非限定的な例には、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、βカテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリンＢ１、ＣＹＰ１・Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ−１、−２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＥＲ２、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／Ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６、及び１２）、ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｄ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｄ１６（ＣＡ−１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３の、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＴＥＡＰ−１、Ｓｅａｐ−２、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、トンプソン−ヌーベル抗原（
Ｔｎ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、及びウロプラキン−３が含まれる。
抗体の一方のアームがＣＤ３に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異的抗体の関連において、前記標的抗原は感染症関連抗原であることができる。感染症関連抗原の非限定的な例としては、例えば、ウイルス粒子の表面上に発現し、または該ウイルスに感染した細胞上に優先的に発現される抗原が含まれ、前記ウイルスはＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＨＡＶ−６、ＶＺＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、及びアルボウイルス性脳炎ウイルスからなる群から選択される。或いは、前記標的抗原は、細菌の表面に発現される抗原、または細菌に感染される細胞に優先的に発現される抗原であることができ、ここでの前記細菌はクラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ菌、菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ、及びライム病細菌からなる群から選択される。一定の実施形態において、前記標的抗原は真菌の表面上に発現される抗原、または真菌に感染した細胞上に優先的に発現される抗原であり、ここでの前記真菌はカンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカ等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガタス、ニジェール等）、ケカビ目（ムコール、アブシディア、リゾプス等）、スポロスリックス・シェンキー、ブラストミセスデルマ、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス虫、及びヒストプラスマ・カプスラーツムからなる群から選択される。特定の実施形態では、前記標的抗原は寄生生物の表面上に発現する抗原、または寄生虫に感染した細胞上に優先的に発現する抗原であり、前記寄生虫は赤痢アメーバ、バランチジウム・コリ、ネグレリアフォーレリ、アカントアメーバ属、ジアルジア・ランビア、クリプトスポリジウム属、カリニ肺炎菌、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、トリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ、ニッポストロンギルス属・ブラジリエ、テニア・クラッシセプス（ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、及びマレー糸状虫からなる群から選択される。特定の病原体関連抗原の非限定的な例としては、例えば、ＨＩＶ・ｇｐ１２０、ＨＩＶ・ＣＤ４、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎Ｅ１、Ｃ型肝炎Ｅ２、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、及びＨＴＬＶエンベロープタンパク質が含まれる。
特定の典型的な実施形態によれば、本発明には、具体的には、ＣＤ３及びＣＤ２０に特異的に結合する二重特異的抗原結合性分子が含まれる。このような分子は、本明細書では「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０」または「抗ＣＤ３／ＣＤ２０」または「抗ＣＤ３×ＣＤ２０」または「ＣＤ３×ＣＤ２０」二重特異的分子、または他の類似の用語で指称され得る。
本明細書中で使用するとき、「抗原結合性分子」の表現は、単独で、または１以上の追加のＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域（ＦＲ）との組み合わせにおいて、特定の抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んだ、または該領域からなるタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。一定の実施形態において、抗原結合性分子とは、これら用語が本明細書の別の個所で定義されるように、抗体または抗体の断片である。
本明細書で用いるとき、「二重特異的抗原結合性分子」の表現は、少なくとも第一の抗原結合性ドメイン及び第二の抗原結合性ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは
分子複合体を意味する。該二重特異的抗原結合性分子内における各抗原結合性ドメインは、単独で、または１以上の追加のＣＤＲ及び／またはＦＲとの組み合わせにおいて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも一つのＣＤＲを備えている。本発明の文脈において、第一の抗原結合性ドメインは第一の抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合し、第二の抗原結合ドメインは第二の異なる抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異的に結合する。
本発明の一定の典型的な実施形態において、前記二重特異的抗原結合性分子は、二重特異的抗体である。二重特異的抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。第一及び第二の抗原結合性ドメインを含む二重特異的抗原結合性分子（例えば、二重特異的抗体）の関連において、前記第一の抗原結合ドメインのＣＤＲは接頭辞「Ａ１」で指定されてよく、また第二の抗原結合ドメインのＣＤＲは接頭辞「Ａ２」で指定されてよい。従って、前記第一の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＡ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、及びＡ１−ＨＣＤＲ３と称することができ；また第二の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＡ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、及びＡ２−ＨＣＤＲ３と指称することができる。
第一の抗原結合性ドメイン及び第二の抗原結合性ドメインは、直接的または間接的に相互に結合されて本発明の二重特異的抗原結合性分子（即ち、二重特異性ｓｃＦｖ）を形成し、更にＦｃドメインに結合されてよい。或いは、第一の抗原結合性ドメイン及び第二の抗原結合性ドメインは、各々が別個のＦｃドメインに結合されてもよい。本発明の二重特異的抗原結合性分子は、典型的には、各々が別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含むであろう。この第一及び第二のＦｃドメインは、ヘテロ二量体（すなわち二重特異性）分子の精製を促進または容易にするためにＣＨ３ドメインに変異を有する以外は、同じ配列のものであってよい。
本発明には、第一のＣＨ３ドメイン及び第二のＩｇＣＨ３ドメインを備えた二重特異性の抗原結合性分が含まれ、ここでの第一及び第二のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸が相互に異なり、また少なくとも一つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠いた二重特異的抗体と比較して、プロテインＡに対する該二重特異的抗体の結合を低下させる。一実施形態において、前記第一のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、前記第二のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ４３５Ｒ修飾（ＥＵ番号付けによる；ＩＭＧＨエキソン番号付けによるＨ９５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を低減または無効にする。第二のＣＨ３は更に、Ｙ４３６Ｆ修飾（ＥＵ番号付けによる；ＩＭＧＨによるＹ９６Ｆ）を含んでいる。第二のＣＨ３内において発見できる更なる修飾には次のものが含まれる：即ち、ＩｇＧ１ＣＨ３ドメインの場合は、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴによるＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ）；またＩｇＧ４ＣＨ３ドメインの場合には、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴによるＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ）である。
他の二重特異的抗体のフォーマットまたは技術が、本発明の二重特異的抗原結合性分子を作製するために使用されてよい。例えば、第一の抗原結合特異性を有する抗体またはその断片は、１以上の他の分子実体、例えば第二の抗原結合特異性を有する別の抗体またはその断片に機能的に連結されて（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、また非共有会合その他によって）、二重特異性の抗原結合性分子を生じることができる。本発明の関連において使用することができる特定の典型的な二重特異性フォーマットには、限定されなるものではないが、例えば、ｓｃＦｖベースのまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブ・インツー・ホール（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブ・
インツー・ホール等と共通の軽鎖）、交差Ｍａｂ、交差Ｆａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディー、ロイシンジッパー、デュオボディー（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれる（上記フォーマットの論評については、例えば、Ｋｌｅｉｎら２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１−１１、及びそこに引用された参考文献を参照されたい）。
本発明の二重特異的抗原結合性分子との関連において、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの特定のキメラバージョンに比較して望ましい機能性を変化させることなく、１以上のアミノ酸変化（例えば挿入、欠失または置換）を含み得る。例えば、本発明には、ＦｃとＦｃＲｎの間の修飾された（例えば、増強または減弱された）結合的相互作用をもった改変Ｆｃ領域を生じるような、Ｆｃドメイン内の１以上の修飾を含んだ二重特異性の抗原結合性分子が含まれる。一実施形態において、前記二重特異的抗原結合性分子は、ＣＨ２、またはＣＨ３領域内の修飾を含んでおり、ここでの前記修飾は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲にあるエンドソームにおいて）ＦｃドメインのＦｃＲｎに対する親和性を増大させる。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０及び４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾；または４２８位及び／または４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）における修飾及び／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０位及び／または４２８位における修飾；または３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位における修飾が含まれる。１つの実施形態において、前記修飾には、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；及び３０７及び／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）が含まれる。
＜配列変異体＞
本発明の抗体及び二重特異的抗原結合性分子は、対応する個々の抗原結合性ドメインが由来する生殖細胞系配列と比較したときに、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域において１以上のアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含んでいてよい。このような変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系配列に比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合性分子は、本明細書に開示した典型的なアミノ酸配列の何れかに由来する抗原結合性ドメインを含んでおり、ここでの１以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸配列は、前記抗体が由来する生殖細胞系配列の対応する残基へと変異され、または別のヒト生殖細胞系配列の対応する残基へと変異され、または対応する生殖系残基の保存的アミノ酸置換へと変異される（このような配列変化は本明細書では一纏めに「生殖細胞系変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示された重鎖及び軽鎖可変領域配列で開始して、１以上の個々の生殖細胞系変異またはそれらの組み合わせを含む、多数の抗体及び抗原結合性断片を製造することができる。一定の実施形態において、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基の全部が、当該抗原結合性ドメインが最初に誘導された起源としての生殖細胞系配列に見られる残基へと戻し変異される。他の実施形態においては、特定の残基のみが元の生殖細胞系配列へと戻し変異され、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内またはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られた突然変異された残基のみ、或いは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内で見られた変異した残基のみが戻し変異される。他の実施形態では、１以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）が、異なる生殖細胞系配列（即
ち、前記抗原結合性ドメインが最初に誘導された生殖細胞系配列とは異なる生殖細胞系配列）の対応する残基へと変異される。更に、前記抗原結合性ドメインは、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２以上の生殖細胞系変異の任意の組み合わせを含んでいてよく、例えば、ここでは一定の個々の残基が特定の生殖細胞系配列の対応する残基に変異される一方、前記元の生殖細胞系配列とは異なる一定の他の残基は維持されるか、または異なる生殖細胞系配列の対応する残基へと変異される。一旦得られたら、１以上の生殖細胞系変異を含む抗原結合性ドメインは、１以上の所望の特性、例えば改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善もしくは向上されたた拮抗剤もしくはアゴニストとしての生物学的特性（場合に応じて）、低下した免疫原性等に関して容易に試験することができる。この一般的方法で得られた１以上の抗原結合性ドメインを含む二重特異的抗原結合性分子は、本発明の範囲内に包含されるものである。
本発明にはまた、一方または両方の抗原結合性ドメインが、１以上の保存的置換を有する本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列の任意の変異体を含んだ抗原結合性分子が含まれる。例えば、本発明は、ここに開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲの何れかに対して、例えば１０以下、８以下、６以下、４以下等の保存的アミノ酸置換を含んだＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合性ドメインを具備する抗原結合性分子を含むものである。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、また（７）硫黄含有側鎖のシステイン及びメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。或いは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、配列分析ソフトウェアを使用して測定することがでる。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含んでおり、これは生物の異なる種から相同性ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチドの間、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間における配列相同性または配列同一性を決定するために、デフォルトパラメータと共に使用することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨のパラメータ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問合せ配列と検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）ｓｕｐｒａ）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
＜ｐＨ依存的結合＞
本発明には、ｐＨ依存的結合特性を備えた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗体が含まれる。例えば、本発明の抗ＣＤ３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨではＣＤ３に対して低下した結合を示す可能性がある。或いは、本発明の抗ＣＤ３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨではＣＤ３に対する増強した結合を示す可能性がある。「酸性ｐＨ」の表現には、約６．２未満のｐＨ値、例えば約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ以下のｐＨ値が含まれる。本明細書で使用するとき、「中性ｐＨ」の表現は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」の表現には、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値が含まれる。
一定の場合において、「中性ｐＨと比較して、…酸性ｐＨにおいて低下した結合」とは、中性ｐＨにおける抗原への抗体結合のＫＤ値に対する、酸性ｐＨにおける抗原への抗体結合のＫＤ値の比（またはその逆）で表される。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、該抗体またはその抗原結合断片が、約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を示す場合に、本発明の目的では「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるＣＤ３への低下した結合」を示すと看做すことができる。一定の典型的な実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片についての酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、または１００．０以上であることができる。
ｐＨ依存性の結合特性をもった抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける特定の抗原への結合の低下（または増強）について、抗体の集団をスクリーニングすることにより取得することができる。加えて、アミノ酸レベルでの抗原結合性ドメインの修飾によって、ｐＨ依存性の特性を有する抗体を生じる可能性がある。例えば、抗原結合性ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに比較して酸性ｐＨにおいて抗原結合性が低下した抗体を得ることができる。
＜Ｆｃ受容体結合＞
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子及び抗体は、別のＩｇＧアイソタイプに由来するＩｇ重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３定常ドメインのようなキメラＦｃドメインを具備するように、またＦｃ受容体結合及び活性化に関するユニークな特性を有するように提供される。本発明の一定のＦｃドメインは、キメラヒンジを具備するように操作される。
本明細書で使用される「キメラ」の用語は、起源の異なる部分で構成されることを意味する。「キメラタンパク質」の語句は、自然においては通常は結合しない第二のアミノ酸タンパク質に連結された第一のアミノ酸タンパク質を含む。これらのアミノ酸配列は、通常は別々のタンパク質として、または同じタンパク質上に異なる配置で存在することができ、新たな配置で融合ポリペプチドの中に一緒にされる。キメラタンパク質は、当該技術において知られた種々の方法によって、例えば化学合成により、またはキメラタンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを所望の配置で作製することによって創生できる。典型的なキメラタンパク質は、ＩｇＧの重鎖ドメインを連結するキメラヒンジ配列と、本発明のヒト抗体及び抗原結合性タンパク質を作製するように加工された融合タンパク質を含む。
本明細書に開示されたキメラタンパク質は、例えば、野生型ＩｇＧ・Ｆｃ領域またはドメインと比較して、接合部における免疫原性エピトープの生成を最小限に抑えるように設計された。従って、本発明の操作されたタンパク質は、低下した免疫原性を有し、Ｆｃ受容体への低下した結合性を示し、並びに無くなるまで低下したエフェクター機能を示す。
「ヒンジ」の用語は、本明細書で使用するときは、免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端をＣＨ２のＮ末端に結合する連続するアミノ酸残基の領域を含むことが意図されている。ＣＨ２エキソンによりコードされるＣＨ２のＮ末端の幾つかのアミノ酸はまた、「下側ヒンジ」の一部とみなされる。如何なる理論にも拘束されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸は、異なるヒンジエキソンによりコードされる１２〜１５の連続したアミノ酸、及びＣＨ２ドメインの幾つかのＮ末端アミノ酸（ＣＨ２エキソンによってコードされる）を含むものとして特徴付けられている（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈら．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６（２）：８５−９０（１９９５））。他方、ＩｇＧ３は４つのセグメント、即ちＩｇＧ１のヒンジ領域に類似した一つの上部セグメント、及びＩｇＧ３に固有の同一のアミノ酸リピートである三つのセグメントからなるヒンジ領域を含んでいる。
本明細書で使用される「キメラヒンジ」の用語は、一つのＩｇ分子のヒンジ領域に由来する第一のアミノ酸配列と、異なる分類またはサブ分類のＩｇ分子のヒンジ領域に由来する第二のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を含むことが意図されている。本発明の例示的なキメラヒンジは、ヒトｌｇＧ１ヒンジ領域またはヒトのＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する第一のアミノ酸配列または「上側ヒンジ」配列、及びヒトＩｇＧ２のヒンジ領域に由来する第二のアミノ酸配列または「下側ヒンジ」配列を含んでいる。一定の実施形態では、第一のまたは「上側ヒンジ」配列は、ＥＵ番号付けによる２１６〜２２７位のアミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、第二のまたは「下側ヒンジ」配列は、ＥＵ番号付けによる２２８〜２３６位のアミノ酸残基を含む。
本開示の目的にとって、「上側ヒンジ」領域は、ＥＵ番号付けによる２１６〜２２７位のアミノ酸残基（カバット番号付けによる２２６〜２４０位のアミノ酸残基）を含むことが意図されている（図１参照）。「下側ヒンジ」領域は、ＥＵ番号付けによる２２８〜２３６位のアミノ酸残基（カバット番号付けによる２４１〜２４９位のアミノ酸残基位）を含むことが意図されている（図１参照）
本開示では、本発明の実施者の便宜のために、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のためのヒンジ領域のアミノ酸が、カバットのＥＵ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら，免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２（１９９１））によって、本明細書において同定されている。この番号付けシステムは、２００１年５月１７日に作製され、２０１３年１月１０日に最後に更新された、ＩＭＧＴ（登録商標） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｈａｒｔ，ＩＭＧＴ（登録商標），ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌに従って更新された、「ＥＵ番号付け」または「ＥＵインデックス」としても知られている。
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ヒンジアミノ酸のためのＥＵ番号付けと、ＩＭＧＴ固有ドメイン番号付け、ＩＭＧＴエキソン番号付け、及びカバット番号付けの規則（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら，１９９１，ｓｕｐｒａも参照のこと）との間の対応関係は、以下の表Ａ〜表Ｆに記載されている。
Figure 0006831426
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例えば予め定められた抗原またはＦｃγＲに対する抗体、Ｉｇ、抗体結合性断片、またはＦｃ含有タンパク質の結合に関する「結合」の用語は、典型的には、最小限二つの実体、または分子構造の間の相互作用または会合、例えば抗体−抗原相互作用、またはＦｃγＲに対するＦｃ含有タンパク質の会合を意味する。
例えば、リガンドとして抗原またはＦｃＲ、及びアナライト（または抗リガンド）として抗体、Ｉｇ，抗体結合性断片、またはＦｃ−含有タンパク質を用いたＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により測定したときに、典型的には、結合親和性は約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下のＫＤ値に対応する。従って、抗体または他の結合性タンパク質は、予め定められた抗原または受容体に対して、非特異的抗原（例えばＢＳＡ，カゼイン）に対する結合についてのその親和性より少なくとも１０倍低いＫＤ値、例えば少なくとも１００倍低く、例えば、少なくとも１，０００倍低く、例えば少なくとも１０，０００倍低く、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤ値に対応する親和性で結合する。
本明細書中で使用されるとき、「ＫＤ」（Ｍ）の用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、またはＦｃγＲに対する抗体、Ｉｇ、抗体結合性断片、またはＦｃ含有タンパク質の解離平衡定数意味する。ＫＤと結合親和性の間には逆関係が存在し、従って、ＫＤ値が小さいほど親和性は高い（即ち、より強い）。従って、「より高い親和性」または「より強い親和性」の用語は、相互作用を形成するより高い能力、従ってより小さいＫＤ値に関し、逆に「より低い親和性」または「より弱い親和性」の用語は、相互作用を形成するためのより低い能力、従ってより大きなＫＤ値に関する。幾つかの状況において、前記分子（例えば抗体）の相互作用パートナー分子（例えば受容体Ｙ）に対する結合親和
性に比較して、特定の分子（例えば抗体）のその相互作用パートナー分子（例えば受容体Ｘ）に対するより高い結合親和性（またはＫＤ）は、より大きいＫＤ値（より低い、または弱い親和性）をより小さいＫＤ（より高く、またはより強い親和性）で除することにより決定される結合比として表すことができ、例えば、場合によっては５倍または１０倍大きい結合親和性として表される。
本明細書で使用するとき、「ｋｄ」（ｓｅｃ−１、または１／ｓ）の用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数、またはＦｃγＲに対する抗体、Ｉｇ、抗体結合性断片またはＦｃ含有タンパク質の解離速度乗数を意味する。前記値はまた、ｋｏｆｆ値とも称される。
本明細書で使用するとき、用語「ｋａ」（Ｍ−１×ｓｅｃ−１、または１／Ｍ）は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数、またはＦｃγＲに対する抗体、Ｉｇ、抗体結合性断片、またはＦｃ含有タンパク質の会合速度定数を意味する。
本明細書で使用する「ＫＡ」（Ｍ−１または１／Ｍ）の用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数、またはＦｃγＲに対する抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質の会合平衡定数を意味する。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで除することにより得られる。
本明細書で使用される「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」の用語は、ベースラインと指定された露出時間後の最大値の間の中間の応答を誘発する抗体濃度を含む最大有効濃度の半分を意味する。Ｅ５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察される抗体濃度を表す。従って、増大したＥＣ５０または半最大有効濃度値では、低下した結合が観察される。
一実施形態において、減少した結合性は、半最大量の標的細胞への結合を可能にする増大したＥＣ５０抗体濃度として定義することができる。
幾つかの実施形態において、減少したＡＤＣＣまたはＣＤＣのような細胞傷害活性は、標的細胞の半最大量の溶解を可能にする増大したＥＣ５０抗体濃度として定義することができる。細胞傷害性はまた、細胞傷害性パーセント、またはカルセイン放出アッセイまたは同等のアッセイで溶解した細胞として観察される細胞総集団の割合である溶解パーセントとして測定される。パーセント細胞傷害性は、実施例６に記載したようにして測定することができる。
他の実施形態において、減少した増殖は、標的細胞の半最大半量の増殖を可能にする増大したＥＣ５０抗体濃度として定義することができる。
本明細書で使用するとき、「エフェクター機能」の用語は、ＦｃγＲへの結合に際してＦｃ含有タンパク質により与えられる機能的能力を含むことが意図されている。如何なる理論にも拘束されるものではないが、Ｆｃ／のＦｃγＲ複合体の形成は、種々のエフェクター細胞を結合した抗原の部位に動員し、典型的には、細胞内での種々の信号伝達事象及び後続の重要な免疫応答を生じる。
本発明のキメラＦｃを含む抗原結合性タンパク質及び抗体は、対応する野生型Ｆｃ含有抗原結合性タンパク質または抗体と比較して、改変もしくは低下したエフェクター機能を示す。例えば、その全体を本明細書の一部として援用する２０１４年８月７日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１２１０８７を参照されたい。
幾つかの実施形態において、低下または変更されるエフェクター機能は、細胞傷害性エ
フェクター機能、例えば、細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）である。一実施形態では、前記低下または変更されるエフェクター機能は、補体依存性細胞傷害性である。別の実施形態では、前記低下または変更されるエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害性である。他の実施形態では、前記低下または変更されるエフェクター機能は、標的細胞の細胞増殖である。
幾つかの抗体エフェクター機能は、一般的な免疫グロブリンの定常領域（具体的には、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）における抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって、少なくとも部分的に媒介される。異なるクラスの免疫グロブリン、即ち、ＩｇＧ、ＩｇＥＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤに特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。ヒトＩｇＧ・Ｆｃ受容体ファミリーは三つの群、即ち、高い親和性でＩｇＧと結合できるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、両者とも低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分けられる。二つまたは三つの遺伝子によりコードされる各ＦｃγＲサブクラス、及び選択的ＲＮＡ素プライシングは複数の転写物を導き、従ってＦｃγＲにおける広範な多様性が存在する（例えば、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４；ＦＣＧＲ１Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４；ＦＣＲＧ１Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ；ＦＣＧＲ２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ；ＦＣＧＲ２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２Ｃ；ＦＣＧＲ２Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ；ＦＣＧＲ３Ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ；ＦＣＧＲ３Ｂ））。加えて、ＦｃＲｎまたは新生児Ｆｃ受容体（Ｆｃ受容体トランスポーター、アルファ、またはＦＣＧＲＴとしても知られる）は、胎盤を横切って母親から胎児へとＩｇＧ抗体を移送することができる。更に、Ｆｃ受容体は、例えばＢ細胞、単球、樹状細胞、好中球、及び一定のリンパ球を含む、種々の細胞に発現される。例えばＵ９３７細胞、即ち、ヒト単球細胞株は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡの両方を発現した（例えばＪｏｎｅｓら．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５（５）：３３４８−５３ （１９８５）；及びＢｒｏｏｋｓら．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７０：１３６９−８５ （１９８９年１０月）を参照されたい）。本明細書で言及する各受容体には、転写変異体、アイソフォーム及び多型を含んだ、該受容体の何れか既知の機能的形態が含まれる。
ＩｇＦｃのその受容体への結合は、これらのエフェクター細胞を、結合された抗原の部位へともたらし、最終的には、Ｂ細胞活性化、炎症反応、細胞傷害性応答、及び食細胞応答を含む種々のシグナル伝達及び免疫応答を生じる。このように、ＩｇＦｃのその受容体への低下または変化した結合は、低下したエフェクター機能を生じる可能性がある。
「抗体依存性細胞食作用」または「ＡＤＣＰ」の用語は、細胞溶解を誘導するのではなく、標的細胞を飲み込むことにより標的細胞を排除する（または致死させる）エフェクター機能に関する。ＡＤＣＰは、腫瘍細胞を死滅させるための重要なインビボ機構であり得る。ＡＤＣＰは、二色蛍光フローサイトメトリー法によって測定することができ、例えば、ＰＫＨ２（緑色蛍光色素）及び異なる細胞表面タンパク質に対するフィコエリトリン接合（赤）モノクローナル抗体を利用して試験細胞を識別し、食細胞活性及び食作用速度を決定する方法を利用することができる。ＡＤＣＰの測定は、当技術分野において周知である。ＦｃγＲＩＩＢに対してＦｃγＲＩＩＡを選択的に活性化させる治療戦略は、マクロファージ食作用活性を高めることができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ＪＯら．２００８ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７（８）：２５１７−２７）。本発明のキメラＦｃを含有する抗原結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合してこれを活性化させる。一定の状況では、本発明の抗原結合性タンパク質及び抗体は、該抗体がヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い結合親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合する。幾つかの実施形態において、該抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対して、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合親和性よりも約５超強い結合親和性を示し、かかる結合親和性の値はＫＤで表される。他の実施形態において、該抗体はヒトＦｃγＲＩＩＡに対して、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するその結合親和性よりも約６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、
１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍強い結合親和性を示す。
＜抗体及び二重特異的抗原結合性分子の生物学的特性＞
本発明には、そのヒトＣＤ３及びＣＤ２０抗体に結合する抗体及びその抗原結合性断片が含まれる。例えば、本発明には、本明細書の実施例３に定義されたアッセイフォーマット（例えば、ＣＤ３×ＣＤ２０抗体に対するＪｕｒｋａｔ細胞またはＲａｊｉ細胞の結合を評価する）または実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロ結合アッセイにより測定したときに、約６０ｎＭ未満のＥＣ５０でＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋）及びＲａｊｉ細胞（ＣＤ２０＋）に結合する抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体が含まれる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片は、例えば、本明細書の実施例４で定義されたアッセイ、または実質的に同様のアッセイのようなのアッセイフォーマット形式を使用してインビトロ結合アッセイにより測定されたときに、約７５ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６５ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満のＥＣ５０で、細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び／またはＲａｊｉ細胞）の表面上のＣＤ３またはＣＤ２０に結合する。
本発明には、ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ２０に同時に結合できる二重特異的抗原結合性分子（例えば、二重特異的抗体）が含まれる。一定の実施形態によれば、本発明の二重特異的抗原結合性分子は、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０を発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異的抗原結合性分子が、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０を発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例４に示すように、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。例えば、本発明には、ＣＤ３発現するヒトＴ細胞株（例えば、ジャーカット）、ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞株（例えば、Ｒａｊｉ細胞）、及び霊長類Ｔ細胞（例えば、カニクイザル末梢血単核細胞［ＰＢＭＣ］）に特異的に結合する二重特異性の抗原結合性分子が含まれる。本発明は、実施例４に記載したＦＡＣＳアッセイまたは実質的に同様のアッセイを使用して決定したときに、約８．７４×１０−６〜約５．９９×１０−８のＥＣ５０で前述の細胞及び細胞株の何れかに結合する二重特異的抗原結合性分子を含むものである。
本発明にはまた、ヒトＣＤ３に結合して、Ｔ細胞に媒介された腫瘍細胞死滅を誘導する抗体、及びその抗原結合性断片が含まれる。例えば、本発明には、本明細書で実施例５に定義されたアッセイフォーマットを使用したインビトロでのＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイ（例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下に、ヒトＰＢＭＣによるＲａｊｉ腫瘍細胞死滅の程度を評価する）、または実質的に類似のアッセイで測定したときに、約６０ｐＭ未満のＥＣ５０でＴ細胞媒介性の腫瘍細胞死滅を誘導する抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体が含まれる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片は、例えば本明細書の実施例５に定義されたアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用したしてインビトロのＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅アッセイにより測定したときに、約５６ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４５ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３５ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＥＣ５０で、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞死滅（例えば、ＰＢＭＣ媒介性のＲａｊｉ細胞の死滅）を誘導する。
本発明はまた、野生型ＩｇＧ・Ｆｃドメインを有する抗体よりも程度は低いが、ヒトＣＤ３／ＣＤ２０に結合して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する抗体及びその抗原結合性断片を含むものである。例えば、本発明には、本明細書の実施例６に定義したアッセイフォーマット（例えば、補体及び抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体の存在において標的細胞殺滅（ＲａｊｉまたはＤａｕｄｉ）の程度を評価する）、または実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイで測定したときに、約５０％未
満のパーセント細胞傷害性（％細胞傷害性または％細胞溶解）でＲａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞（ＣＤ２０を発現する）のＣＤＣ死滅を誘導する、抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体が含まれる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例６に定義したアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用してインビトロの補体媒介性細胞死滅アッセイにより測定したときに、約４５％未満、約４０％未満を、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、バックグラウンド細胞傷害性未満、または検出不能な細胞傷害性のパーセント細胞傷害性で、ＣＤＣ細胞の死滅（例えば、Ｒａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞の補体媒介性の死滅）を誘導する。
本発明にはまた、ヒトＣＤ３／ＣＤ２０に結合するが、野生型ＩｇＧ・Ｆｃドメインを有する抗体に比較して抗体依存性の細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）を有意に誘導しない抗体及びその抗原結合性断片が含まれる。例えば、本発明には、本明細書の実施例７に定義したアッセイフィーマット（例えばＮＫ細胞及び抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体の存在において標的細胞殺滅［ＲａｊｉまたはＤａｕｄｉ］の程度を評価する）、または実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロＮＫ細胞媒介性の細胞殺滅アッセイで測定したときに、約２０％未満（またはバックグラウンド細胞傷害性未満）のパーセント細胞傷害性（％細胞傷害性また％細胞溶解性）でのＲａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞の明らかな死滅を伴わない、抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体が含まれる。実質的に類似のアッセイは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、または変異体ＦｃγＲＩＩＩを発現する細胞を含む他のＦｃγＲＩＩＩ発現細胞の存在を含むことができる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片は、例えば本明細書の実施例７で定義されたアッセイフォーマット、または実質的に同様のアッセイを使用して、インビトロＦｃγＲＩＩＩに媒介された細胞死滅アッセイにより測定したときに、約３０％未満、約未満２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、バックグラウンド細胞傷害性未満のパーセント細胞傷害性で、検出可能なＡＤＣＣ活性（例えばＮＫ細胞、またはＲａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞のＦｃγＲＩＩＩ媒介性死滅）を示さず、または検出可能な細胞傷害活性を示さない。
一定の実施形態に従えば、本発明には、本明細書の実施例８において定義したアッセイフォーマットを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに、（例えば２５℃において）約２３．５μＭ未満のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＡに結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片が含まれる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片は、本明細書の実施例８において定義したアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕獲または抗原捕獲フォーマット）、または実質的に類似のフォーマットを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに、約２０．５μΜ未満、約２０μΜ未満、約１９．３μΜ未満、約１８μΜ未満、約１７μΜ未満、約１６μΜ未満、約１５μΜ未満、約１０μΜ未満、約９μΜ未満、約８μΜ未満、約７μΜ未満、約６μΜ未満、約５μΜ未満、約４μΜ未満、約３μΜ未満、約２μΜ未満、約１μΜ未満、約９００ｎＭ未満、約８００ｎＭ、または約７００ｎＭ未満のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＡに結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片が含まれる。
一定の実施形態に従えば、本発明には、本明細書の実施例８において定義したアッセイフォーマットを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに、（例えば２５℃において）約２３３μＭ未満のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片が含まれる。一定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性断片は、本明細書の実施例８において定義したアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕獲または抗原捕獲フォーマット）、または実質的に類似のフォーマットを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに、約２００μΜ未満、約１９０μΜ未満、約１８０μΜ未満、約１７０μΜ未満、約１６０μΜ未満、約１５０μΜ未満、約１４０μΜ未満、約１３０μ
Μ未満、約１２５μΜ未満、約１２３μΜ未満、約１２０μΜ未満、約１１０μΜ未満、約１００μΜ未満、約９０μΜ未満、約８０μΜ未満、約７０μΜ未満、約６０μΜ未満、約５０μＭ未満、約４０μＭ未満のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片が含まれる。
本発明にはまた、本明細書の実施例９に記載のアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定したときに、約８日超の解離半減期（ｔ１／２）でＣＤ３×ＣＤ２０に結合する抗体及びその抗原結合性断片が含まれる。一定の実施形態において、当該抗体は、本明細書の実施例９において定義したアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕獲または抗原捕獲フォーマット）、または実質的に類似のフォーマットを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定したときに、約５日超、６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１３日超、約１４日超、約１５日超、または約２０日超のｔ１／２を示す。
本発明はまた、（ａ）インビトロでＰＢＭＣ増殖を誘導すること；（ｂ）ＣＤＣ細胞傷害性（例えば本明細書の実施例６参照）；（ｄ）ＡＤＣＣ（例えば本明細書の実施例７参照）からなる群から選択される１以上のアッセイにおいて、実質的な活性を示さない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を包含する。
本発明はまた、（ａ）カニクイザルにおけるＢ細胞（例えば、ＣＤ４５＋／ＣＤ２０＋Ｂ細胞）の枯渇（例えば、本明細書の実施例１０及び１１参照）；（ｂ）免疫不全マウスモデルにおけるＢ細胞腫瘍体積（例えば、ラージ腫瘍体積）の減少（例えば、実施例１２Ａ参照）；及び（ｃ）確立された腫瘍を有するマウスモデルにおける腫瘍の退縮（例えば、実施例１２Ｂ参照）からなる群から選択される１以上のアッセイにおいて実質的な活性を示す、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を包含する。
本発明には、被験者においてＢ細胞を枯渇させることができる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子が含まれる（例えば実施例１０参照）。例えば、一定の実施形態に従えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子が提供され、ここでの二重特異的抗原結合性分子の単回投与（約１ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下の用量）は、被験者におけるＢ細胞数（例えば、被験体から採取した血液サンプルにおける）の検出可能なレベル未満への減少を生じる。一定の実施形態において、前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子の単回投与は、約０．１ｍｇ／ｋｇの用量において、前記二重特異的抗原結合性分子の投与後の約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、または約１日までに、記被験者におけるＢ細胞数の検出可能なレベル未満への減少を生じる。一定の実施形態において、前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子の単回投与は、約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量において、前記二重特異的抗原結合性分子の投与後の約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、またはそれ以上まで、記被験者におけるＢ細胞数の検出可能なレベル未満に維持させる。本明細書で使用されるとき、「検出可能なレベル未満」の表現は、標準的なＢ細胞検出アッセイ、例えば本明細書の実施例１０に記載したようなＢ細胞マーカーのためのＦＡＣＳアッセイを使用して、被験者から採取した血液中にＢ細胞を直接または間接的に検出できないことを意味する。
本発明はまた、被験体に投与された場合に、Ｔ細胞における一過性の減少以上を生じない、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を提供する。例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与された場合に、投与後第１日にはＴ細胞数を減少させるが、その後の時点（例えば約第２日、第４日、第７日、第１４日、第２８日またはそれ以降までに）では血液１マイクロリットル当たりのＴ細胞数をリバウンドさせる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子が提供される。例えば、本発明は、本明細書の実施例１０に記載した標準的なＴ細胞検出アッセイ、例えばＴ細胞マーカーのＦＡＣＳアッセイを用いて検出したときに、前記抗原結合性分子を約０．０１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの用量で前記被験者に投与した約４日〜約７日後の時点で被験者から採取された血液１マイクロリットル当たりのＴ細胞の数が、前記二重特異的抗原結合性分子の投与前に前記患者から採取された血液のマイクロリットル当たりのＴ細胞数以上である、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を提供する。
＜エピトープマッピング及び関連技術＞
本発明の抗原結合性分子が結合するＣＤ３またはＣＤ２０上のエピトープは、ＣＤ３タンパク質の３以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなり得るものである。或いは、該エピトープは、ＣＤ３またはＣＤ２０の複数の非連続的なアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなることもあり得る。本発明の抗体は、単一のＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタまたはＣＤ３ガンマ）内に含まれるアミノ酸と相互作用することができ、または２以上の異なるＣＤ３鎖のアミノ酸と相互作用することができる。本明細書で使用する「エピトープ」の用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を意味する。単一の抗原は、複数のエピトープを有することができる。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してよく、また異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは高次構造または線状の何れであってもよい。高次構造エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残基により生成されたものである。一定の状況において、エピトープは、前記抗原上の糖部分、ホスホリル基、またはスルホニル基を含んでいてよい。
当業者に知られている種々の技術を、抗体の抗原結合性ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内の１以上のアミノ酸と相互作用するか否かを決定するために使用することができる。典型的な技術には、例えばハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）著の抗体（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ））に記載されたようなルーチンの交差ブロッキングアッセイ、アラニン走査変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断解析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合性ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用し得る別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的に言えば、水素／重水素交換法は、興味あるタンパク質を重水素で標識し、続いてこの重水素標識されたタンパク質に抗体を結合させることを含んでいる。次に、該タンパク質／抗体複合体は水に移されて、前記抗体で保護された残基（これは重水素で標識されたまま残る）を除く全ての残基において、水素−重水素交換を生じさせる。前記抗体の解離後に、標的タンパク質はプロテアーゼ開裂及びマススペクトル解析に掛けられ、それによって前記抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基が明らかにされる。例えば、文献［Ｅｈｒｉｎｇ （１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａ］を参照のこと。抗原／抗体複合体のＸ線結晶学もまた、エピトープマッピングのため使用され得る。
本発明には更に、本明細書に記載の特異的な例示抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列の何れかを含む抗体）の何れかと同じエピトープに結合する抗ＣＤ３抗体が含まれる。同様に、本発明はまた、ＣＤ３への結合について本明細書に記載の特異的な例示抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列の何れかを含む抗体）の何れかと競合する抗ＣＤ３抗体を含む。
本発明にはまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメイン、及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインを備えた二重特異的抗原結合性分子が含まれ、ここでの前記第一の抗原結合性ドメインは、本明細書に記載の特定の典型的なＣＤ３特異的抗原結合性ドメインと同じＣＤ３上のエピトープに結合し、及び／または前記第二の抗原結合性ドメインは、本明細書に記載の特定の典型的なＣＤ２０特異的抗原結合性ドメインと同じＣＤ２０上のエピトープに結合する。
同様に、本発明にはまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメイン、及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインを備えた二重特異的抗原結合性分子が含まれ、ここでの前記第一の抗原結合性ドメインは、ＣＤ３への結合について、本明細書に記載の特定の典型的なＣＤ３特異的抗原結合性ドメインと競合し、及び／または前記第二の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２０への結合について、本明細書に記載の特定の典型的なＣＤ２０特異的抗原結合性ドメインと競合する。
一つの態様において、本発明には、第一の抗原結合性ドメインがヒトＣＤ３への結合について参照抗原結合性タンパク質と競合する二重特異的抗体が含まれ、前記タンパク質は三つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２及びＡ１−ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２及びＡ１−ＬＣＤＲ３）を備えており、ここで（ｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、（ｉｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、（ｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、（ｖｉ）Ａ１−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。幾つかの場合において、該二重特異的抗体は、ヒトＣＤ３への結合について参照抗原結合性タンパク質と競合する第一の抗原結合性ドメインを具備し、前記タンパク質は（ｉ）配列番号１０の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号１８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含んでいる。
別の態様において、本発明には、第二の抗原結合性ドメインがヒトＣＤ２０への結合について参照抗原結合性タンパク質と競合する二重特異的抗体が含まれ、前記タンパク質は三つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を備えており、ここで（ｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ２は配列番号６のアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｉｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、（ｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、（ｖｉ）Ａ２−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。幾つかの場合において、該二重特異的抗体は、ヒトＣＤ２０への結合について参照抗原結合性タンパク質と競合する第二の抗原結合性ドメインを具備し、前記タンパク質は（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽
鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでいる。
別の態様において、本発明には、ヒトＣＤ３への結合について、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を備えた参照抗原結合性タンパク質と競合する第一の抗原結合性ドメインを有し；またヒトＣＤ２０への結合について、（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を備えた参照抗原結合性タンパク質と競合する第二の抗原結合性ドメインを有する二重特異的抗体が含まれる。
特定の抗原結合性分子（例えば、抗体）またはその抗原結合性ドメインが、本発明の参照抗原結合性分子と同じエピトープに結合するかどうか、またはその使用により、本発明の参照抗原結合性分子と同じエピトープに結合するかどうか、または前記参照分子との結合について競合するかどうかは、当該技術において知られたルーチンの方法によって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の二重結合性の基準抗原結合性分子と同じＣＤ３（またはＣＤ２０）上のエピトープに結合するかどうかを決定するために、前記参照二重結合性分子は、先ずＣＤ３タンパク質（またはＣＤ２０タンパク質）に結合される。次に、試験抗体がＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に結合する能力が評価される。もし、前記二重結合性の基準抗原結合性分子との飽和結合の後に、前記試験抗体がＣＤ３（またはＣＤ２０）に結合できるならば、前記試験抗体は、前記二重特異性の基準抗原結合性分子よりも、ＣＤ３（またはＣＤ２０）の異なるエピトープに結合すると結論することができる。一方、前記試験抗体が、前記二重結合性の基準抗原結合性分子との飽和結合の後にＣＤ３（またはＣＤ２０）に結合できないならば、前記試験抗体は、本発明の前記二重結合性の基準抗原結合性分子により結合されるエピトープと同じＣＤ３（またはＣＤ２０）のエピトープに結合する可能性がある。次いで、試験抗体の観察された結合性欠如が、実施兄塩基二重結合性の基準抗原結合性分子と同じエピトープへの結合性によるものか、または立体的ブロッキング（または別の現象）が観察された結合性の欠如の理由なのかどうかを確認するために、更なるルーチンの実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ビアコア、フローサイトメトリーまたは当技術において利用可能な他の任意の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本発明の一定の実施形態に従えば、競合結合アッセイで測定したときに、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗原結合性タンパク質が、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％または更に９９％阻害するならば、二つの抗原結合性タンパク質は同じ（または重畳する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２参照）。或いは、一方の抗原結合性タンパク質の結合を低減または排除する抗原における実質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合性を低減または排除するならば、二つの抗原結合性タンパク質は同じエピトープに結合すると考えられる。もし、一方の抗原結合性タンパク質の結合性を低減または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の結合性を低減または排除するのであれば、二つの抗原結合性タンパク質は「重畳するエピトープ」を有すると考えられる。
抗体または抗原結合ドメインが、その参照抗原結合性分子との結合について競合するかどうかを決定するために、二つの配向で上記の結合方法が実行される：第一の配向において、前記参照抗原結合性分子が飽和条件下でＣＤ３タンパク質（またはＣＤ２０タンパク質）に結合され、続いて試験抗体のＣＤ３（またはＣＤ２０）分子への結合の評価が行われる。第二の配向において、前記試験抗体は飽和条件下でＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に結合され、続いて前記参照抗原結合性分子のＣＤ３（またはＣＤ２０）分子への結合が評価される。もし、両方の配向において、第一（飽和性）の抗原結合性分子のみがＣＤ３（またはＣＤ２０）に結合できるならば、前記試験抗体及び参照抗原結合性分子はＣＤ３
（またはＣＤ２０）への結合について競合すると結論される。当業者が理解するように、参照抗原結合性分子との結合について競合する抗体は、必ずしも前記参照分子と同じエピトープには結合せず、重畳または隣接するエピトープに結合することによって前記参照抗体の結合を立体的にブロックする可能性がある。
＜抗原結合性ドメインの調製及び二重特異的分子の構築＞
特定の抗原に対して特異的な抗原結合性ドメインは、当技術分野において知られた任意の抗体作製技術により調製することができる。一旦得られたら、二つの異なる抗原（例えばＣＤ３及びＣＤ２０）に特異的な二つの異なる抗原結合性ドメインは、ルーチンの方法を使用して本発明の二重特異的抗原結合性分子を製造するために、相互に適切に配置することができる。（本発明の二重特異的抗原結合性分子を構築できる例示的な二重特異的抗体フォーマットの議論は、本明細書の他の箇所に提供される）。一定の実施形態において、本発明の多重特異的な抗原結合性分子の個々の成分（例えば、重鎖及び軽鎖）の１以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全なヒト抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は、当該分野において周知である。例えば、本発明の二重特異的抗原結合性分子の１以上の重鎖及び／または軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）の技術を用いて調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、特定の抗原（例えばＣＤ３及びＣＤ２０）に対する高親和性のキメラ抗体が最初に単離される。該抗体は、親和性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特性について、特徴付け及び選択される。該マウス定常領域を望ましいヒト定常領域で置換して、本発明の二重特異的抗原結合性分子に組み込むことができる完全なヒト重鎖及び／または軽鎖を作製することができる。
遺伝子操作された動物を、ヒト二重特異的抗原結合性分子を作製するために使用することができる。例えば、再配置でき且つ内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖化配列を発現できる遺伝子的に改変されたマウスを使用することができ、ここでの該マウスは、内因性マウスカッパ遺伝子座においてマウスカッパ定常遺伝子に動作可能にリンクされたヒト免疫グロブリン配列によりコードされる一つまたは二つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。このような遺伝子改変マウスは、二つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの一方に由来する可変ドメインを備えた同一の軽鎖と会合する、二つの異なる重鎖を含む完全なヒト二重特異的抗原結合性分子を生成することができまる。（こにょうな改変マウスの詳細な議論及び二重特異的抗原結合性分子を生成するためのその使用については、例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい）。
＜生物学的同等製剤＞
本発明は、本明細書に開示される典型的な分子のものと異なるが、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０に結合する能力を保持したアミノ酸配列を有する抗原結合性分子を包含する。このような変異体分子は、親配列と比較したときに１以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含み得るが、前記で記載した二重特異的抗原結合性分子のものと実質的に等価な生物学的活性を示すことができる。
本発明には、本明細書に記載の典型的な抗原結合性分子の何れかに対しての生物学的に同等である抗原結合性分子が含まれる。二つの抗原結合性タンパク質または抗体は、例えばそれらが医薬的同等製剤または医薬的代替物であり、同様の実験条件、単一もしくは複数の用量の下に同じモル用量で投与されたときに、それらの吸収の速度及び範囲が有意な差を示さないならば、それらは生物学的同等製剤であると看做される。幾つかの抗原結合性タンパク質は、それらが吸収の範囲において同等であれば、それらの吸収速度において同等でないときにも同等製剤または医薬的代替物であると看做されるであろう。更に、このような吸収速度の相違は意図的で且つラベリングに反映され、例えば慢性的使用の際の有効な身体薬物濃度の達成に本質的に重要でなく、研究される特定の薬物にとって医薬的
に重要でないと看做されるので、生物学的同等製剤と看做すことができる。
一つの実施形態において、二つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力において臨床的に意味のある相違が存在しないならば、生物学的等価製剤である。
一つの実施形態において、参照製品と生物学的製剤との間での切り替えを伴わずに続けられた治療と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または減少した有効性を含む副作用リスクの予想される増加を伴わずに、参照製品と生物学的製剤との間で１回以上切り替えることができる場合には、二つの抗原結合性タンパク質は生物学的に同等である。
一つの実施形態において、二つの抗原結合タンパク質は、それらの両者が使用の条件（複数可）について共通の作用機序（複数可）により作用する場合には、このようなメカニズムが知られている範囲で生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロの方法により実証することができる。生物学的同等性の測定には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が、血液、血漿、血清、または他の生物学的液体において時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトのインビボでの生物学的利用能のデータと相関しており、合理的に該利用能を予測させるインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性、または生物学的利用能または生物学的同等性を確立するよく制御された臨床試験が含まれる。
本明細書に記載された例示的な二重特異的抗原結合性分子の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を行うか、または生物学的活性に必要でない末端もしくは内部の残基もしくは配列の削除を行うことにより構築することができる。例えば、生物学的活性に不可欠でないシステイン残基は、復元時に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の状況において、生物学的に同等の抗原結合タンパク質には、例えば、分子のグリコシル化特性を変更するアミノ酸の変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含んだ、本明細書に記載の典型的な二重特異的抗原結合性分子の変異体が包含され得る。
＜種選択性及び種交差反応性＞
本発明の一定の実施形態によれば、他の種由来のＣＤ３ではなく、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合性分子が提供される。また、他の種由来のＣＤ２０ではなく、ヒトＣＤ２０に結合する抗原結合性分子も提供される。本発明はまた、ヒトＣＤ３及び１以上の非ヒト種由来のＣＤ３に結合する抗原結合性分子；及び／またはヒトＣＤ２０及び１以上の非ヒト種由来のＣＤ２０に結合する抗原結合性分子を包含するものである。
本発明の一定の典型的な実施形態によれば、ヒトＣＤ３及び／またはヒトＣＤ２０に結合し、また場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーＣＤ３及び／またはＣＤ２０の１以上に結合しても結合しなくてもよい抗原結合性分子が提供される。例えば、本発明の特定の典型的実施形態においては、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、並びにヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメインを具備する二重特異的抗原結合性分子が提供される。
＜免疫複合体＞
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位体のような治療部分に結合された抗原結合性分子（「免疫複合体」）を包含する。細胞傷害性剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するための適切な細胞傷害性剤及び化学療法剤の例が、当該技術において知られている（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい）。
＜治療用製剤及び投与＞
本明細書で使用するとき、「有効量」及び「治療的有効量」の用語は、毒性、刺激、またはアレルギー反応のような過度の有害な副作用を伴うことなく、所望の治療応答を得るのに十分な活性治療薬の量を意味する。特定の「有効量」は、明らかに、治療される特定状態、患者の身体状態、治療される動物のタイプ、治療の期間、併用療法（もしあれば）の種類、及び用いられる特異的製剤、並びに化合物もしくはその誘導体の構造のような因子と共に変化するであろう。この場合、ある量は、限定されるものではないが、（ａ）腫瘍増殖（例えばＢ細胞癌）の阻害；及び（ｂ）Ｂ細胞癌の反転または安定化の１以上がもたらされるならば、治療的に有効と看做されるであろう。
患者に投与された抗原結合性分子の投与量は、患者の年齢、サイズ、対象疾患、症状、及び投与経路等に依存して変化する可能性がある。好ましい用量は、典型的には、体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異的抗原結合性分子が成人患者での治療目的のために使用される場合、本発明の二重特異的抗原結合性分子は、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、静脈内に投与するのが有利であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調節することができる。二重特異的抗原結合性分子を投与するための有効投与量及びスケジュールは、経験的に決定することができる；例えば、患者の進行状況は定期的な評価によってモニターでき、それに応じて用量を調整できる。更に、投与量の種間でのスケーリングは、当該分野で周知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
様々な送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用できる：例えば、リポソーム中への封入、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現し得る組換え細胞中でのカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の便宜な経路によって、例えば輸液またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与されてよく、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてよい。投与は全身的または局所的であることができる。
本発明の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて、皮下または静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関しては、ペン型送達装置が本発明の医薬組成物の送達において容易な適用を有する。このようなペン型送達装置は、再使用可能または使い捨てであることができる。再使用可能なペン型送達装置は、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が全部投与されてカートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に破棄し、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。このペン型送達装置は、再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスでは、交換可能なカートリッジが存在しない。使い捨てのペン型送達装置は、装置内に保持されたリザーバ内に医薬組成物を予め充填している。リザーバの医薬組成物が空になったら、装置全体が廃棄される。
多数の再使用可能なペン型自動注入送達装置が、本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する。例として幾つかの名前だけを挙げれば次のものが含まれるが、これらに限定されない：オートペン（商標）（オーウェン・マンフォード社、ウッドストック、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（ディセトロニック・メディカルシステムズ社、バーグドルフ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧミックス７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（イーライリリー社、インディアナポリス、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（ノボノルディスク、コペンハーゲン、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（ノボノルディスク、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（ベクトン・ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮスターレット（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（サノフィ・アベンティス、フランクフルト、ドイツ）。本発明の医薬組成物の皮下送達において用途を有する使い捨てペン型送達装置の例には、幾つかの名前だけを挙げれば次のものが含まれるが、これらに限定されない：、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（サノフィ・アベンティス）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（ノボノルディスク）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（イーライリリー）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）オートインジェクタ（アムジェン社、サウザンドオークス、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（ハゼルマイヤー社、シュトゥットガルト、ドイツ）、エピペン（デイ、Ｌ.Ｐ.）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（アボット研究所、アボットパーク、ＩＬ）。
一定の状況において、医薬組成物は制御放出系で送達することができる。一つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；制御放出の医療適用、ランガー及びワイズ（編）、１９７４年、ＣＲＣプレス社、ボカラトン、フロリダ州を参照されたい。更に別の実施形態において、制御放出系は組成物の標的近傍に配置することができ、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３による考察において議論されている。
注射用製剤としては、例えば静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴などのための剤形が含まれてよい。これらの注射用製剤は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射用製剤は、注射のために従来に使用されている無菌水性媒体または油性媒体中に、上述の抗体またはその塩を溶解し、懸濁させ、または乳化することによって調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液があり、これらはアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］等と組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤と組み合わせて使用することができる。こうして調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプル中に充填される。
有利には、上述した経口または非経口で使用するための医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するように、適切な単位用量剤形に調製される。単位用量でのそのような剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。含有される上記抗体の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に、好ましくは、注射の形態では含有される上記抗体は約５〜約１００ｍｇであり、他の剤
形については約１０〜約２５０ｍｇである。
＜抗原結合性分子の治療的使用＞
本発明は、抗ＣＤ３抗体、またはＣＤ３及び標的抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異的に結合する二重特異的抗原結合性分子を含有する治療用組成物を、それを必要性としている被験者に投与することを含む方法を包含する。該治療用組成物は、本明細書に開示された抗体または二重特異的抗原結合性分子、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含有することができる。本明細書で使用するとき、「それを必要としている被験者」の表現は、癌の１以上の症候または兆候を呈するヒトまたは非ヒト動物（例えば、腫瘍発現し、または以下で述べる何れかの癌に罹患している被験者は）を意味し、或いは、そうでなければＣＤ２０活性における阻害もしくは低下、またはＣＤ２０＋Ｂ細胞の枯渇、またはＣＤ２０＋Ｂ細胞腫瘍の退縮による恩恵を受けるヒトまたは非ヒト動物を意味する。
本発明の抗体及び二重特異的抗原結合性分子（及びそれを含む治療組成物）は、中でも、免疫応答を刺激し、活性化し、及び／またはターゲッティングすることが有益である任意の疾患または障害を遅漏するために有用である。特に、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子は、ＣＤ２０の発現、またはＣＤ２０＋Ｂ細胞の活性もしくは増殖に関連し、またはこれによって媒介され得る疾患もしくは障害の治療、予防及び／または改善のために使用することができる。本発明の治療方法が達成される作用機序には、例えば、アポトーシス、食作用、またはこれら機構の２以上の組み合わせ、または同様の細胞傷害性による、エフェクター細胞の存在下でのＣＤ２０発現細胞の死滅が含まれる。本発明の二重特異的抗原結合性分子を用いて阻害または死滅させ得るＣＤ２０発現細胞には、例えば、腫瘍原性Ｂ細胞が含まれる。
腫瘍量の減少または腫瘍退縮には、被験者における腫瘍（複数可）の部分的または完全な消失が含まれる。腫瘍退縮は、より低い腫瘍負荷またはより低い疾患重症度への傾向を表すことが理解さる。このように、縮退は腫瘍サイズ及び／または腫瘍数の減少を含む、体内の測定可能な悪性腫瘍の進行性の低下または除去である。腫瘍発生の減少には、更なるまたは新たな腫瘍増殖の、部分的もしくは完全な阻害もしくは抑制が含まれる。
本発明の抗原結合性分子は、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支、消化管、男性及び女性の生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞及び骨髄、肝臓、尿路、及び眼のようの特殊な感覚器官に発生する、例えば原発性及び／または転移性の腫瘍をターゲッティング及び治療するために使用することができる。一定の実施形態において、本発明の二重特異的抗原結合性分子性は、以下の癌の１以上を治療するために使用される：即ち、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、頭頸部癌、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、またはメラノーマである。一定の例示的実施形態によれば、本発明の二重特異的抗原結合性分子は、Ｂ細胞癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫［ＮＨＬ］、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物を治療するために使用されます、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を拡散、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫）を治療するために使用される。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子は、腫瘍負荷を低減し、腫瘍退縮を生じさせ、腫瘍増殖を阻害し、または被験者における腫瘍の発生を減少させるために十分な量で投与される。本発明の幾つかの例示的実施形態において、前記投与量は、約
０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態において、前記投与量は、約０．４ｍｇ／ｋｇです。他の実施形態では、前記投与量は、約０．０４ｍｇ／ｋｇである。更に他の実施形態では、前記投与量は約０．００４ｍｇ／ｋｇである。
本発明の一定の実施形態によれば、前記抗原結合性分子は、抗ＣＤ２０療法単独に対して耐性（例えばアリツキシマブ療法に対して耐性）であるか、または不完全に反応するＢ細胞リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）に罹患した患者を治療するために有用である。本発明の関連する他の実施形態によれば、抗ＣＤ２０療法に対して耐性であるＢ細胞リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）に罹患した患者（例えば、リツキシマブ耐性腫瘍、または再発性または耐性Ｂ細胞リンパ腫を有する患者）に対して、本明細書に開示された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を投与することを含む方法が提供される。腫瘍スキャンニング等のような当技術分野で既知の解析／診断方法は、抗ＣＤ２０療法単独に対して不完全に応答し、または耐性である腫瘍を患者が保持するかどうかを確認するために使用することができる。
本発明はまた、被験者における残留癌を治療するための方法を包含する。本明細書で使用する「残留癌」の用語は、抗癌療法で治療した後の被験者において、１以上の癌性細胞が存在または持続することを意味する。
一定の態様によれば、本発明は、ＣＤ２０の発現に関連する疾患または障害（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）を治療するための方法であって、被験者が抗ＣＤ２０単独療法を受けた後に（例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体を含入する医薬組成物を投与した後に）、本明細書の他の箇所で記載した１以上の二重特異的抗原結合性分子を投与することを含む方法を提供する。例えば、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫を治療するための方法であって、前記被験者が抗ＣＤ２０単独療法（例えば、リツキシマブ治療またはその等価物の治療）を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間もしくは４週間、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年、またはそれ以上後に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を投与することを含む方法を包含する。
＜併用療法及び製剤＞
本発明は、本明細書の何処かに記載した例示的抗体及び二重特異的抗原結合性分子の何れかを含有する医薬組成物を、１以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合性分子と組み合わせて投与することができる典型的な追加の治療剤には、例えば、ＥＧＦＲの拮抗剤（例えば抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４のような別のＥＧＦＲファミリーメンバーの拮抗剤（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４の抗体、またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩの拮抗剤（例えば、ＥＧＦＲＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴ拮抗剤（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒ拮抗剤（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦ拮抗剤（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１参照［本明細書では「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも言う］、抗ＶＥＧＦ抗体［例えば、ベバシズマブ］、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤［例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ］）、ＤＬＬ４拮抗剤（例えばＵＳ２００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２拮抗剤（例えば、Ｈ１Ｈ６８５ＰのようなＵＳ２０１１／００２７２８６に記載された抗Ａｎｇ２に抗体）、ＦＯＬＨ１拮抗剤（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＰＲＬＲ拮抗剤（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２拮抗剤（例え
ば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２拮抗剤（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮ拮抗剤（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９拮抗剤（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキン拮抗剤（例えば、抗ウロプラキン抗体）、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０））、一価ＣＤ２０拮抗剤（例えば、リツキシマブのような一価の抗ＣＤ２０抗体）等が含まれる。
本発明の抗原結合性分子と組み合わせて有益に投与できる他の薬剤には、免疫活性化剤または阻害剤が含まれる。一定の免疫活性化剤または阻害剤は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のサイトカイン、またはそれらの各受容体に結合する小分子化合物及び抗体を含む、サイトカイン活性化剤または阻害剤である。本発明の医薬組成物（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異的抗原結合性分子を含む医薬組成物）はまた、次の「ＩＣＥ」から選択される１つ以上の治療的組み合わせを含む 最適治療計画の一部として投与できる：即ち、イホスファミド（例えば、
Ｉｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、パラプラチン）、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ−１６）；「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ＡＲＡ−Ｃ）、シスプラチン（例えば、プラチノール−ＡＱ）； 及び「ＥＳ
ＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰＥＳＩＤ（商標）、ＶＰ−１６）、メチルプレドニゾロン｛例えば、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、プラチノール（登録商標）−ＡＱである）。
本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合性分子の何れかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２の、ＥｒｂＢ３の、ＥｒｂＢ４の、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＦＯＬＨ １、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、または上記サイトカインの何れかのうちの１以上の阻害剤を含む治療的組み合わせを包含するものであり、ここでの前記阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片；またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び最小認識単位等の他の操作された分子）である。本発明の抗原結合性分子はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド及び／またはＮＳＡＩＤ類との組み合わせにおいて投与及び／または同時処方することができる。本発明の抗原結合性分子はまた、放射線治療及び／または従来の化学療法を含む最適治療計画の一部として投与することができる。
追加の治療的活性成分（複数可）は、本発明の抗原結合性分子の投与の直前に、該投与と同時に、または該投与の暫く後に投与されてよい（本開示の目的のために、そのような投与計画は、追加の治療的活性成分「との組み合わせで」抗原結合性分子の投与が考慮される）。
本発明は、本明細書の他の箇所で説明したように、本発明の抗原結合性分子が１以上の追加の治療的活性成分と同時に製剤化される医薬組成物を包含する。
＜投与計画＞
本発明の一定の実施形態によれば、抗原結合性分子（例えば、抗ＣＤ３抗体、またはＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異的抗原結合性分子）の複数回投与は、定義された時間コースに亘って被験者に投与することができる。本発明のこの態様による方法
は、本発明の抗原結合性分子の複数回用量を、被験者に経時的に投与することを含んでいる。ここで用いるとき、「経時的に投与する」とは、抗原結合性分子の各用量が、異なる時点において、例えば予め定められた間隔（例えば時間、日数、週数または月数）で隔てられた異なる日に、前記被験者に投与されることを意味する。本発明は、前記患者に対して、抗原結合性分子の単回の初期用量と、続いて前記抗原結合性分子の１回以上の二次用量と、続いて任意に、抗原結合性分子の１回以上の三次用量を順次患者に投与することを含む方法を包含する。
「初期用量」、「二次用量」及び「三次用量」の用語は、本発明の抗原結合性分子の時系列的投与を言う。従って、「初期用量」は、治療計画の開始時に投与される用量であり（以下、「ベースライン用量」という）；「二次用量」は、初期用量の後に投与される用量であり；「三次用量」は、前記二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、及び三次用量は全て、同じ量の抗原結合性分子を含有してもよいが、一般には、投与頻度の点で相互に異なっていてよい。しかし、一定の実施形態において、初期、二次及び／または三次用量に含まれる抗原結合性分子の量は、治療コースの際に相互に変化する（例えば、適宜上方または下方調節される）。一定の実施形態において、２以上（例えば、２、３、４、または５）の用量が、「負荷用量」として治療計画の開始時に投与されより、続いて、より少ない頻度ベースで投与されるその後の用量（例えば「維持用量」）が投与される。
本発明の典型的な一実施形態において、それぞれの二次及び／また三次用量は、直前の用量の１〜２６週後（例えば、１、１1/2、２、２1/2、３、３1/2、４、４1/2、５、５1/2、６、６1/2、７、７1/2、８、８1/2、９、９1/2、１０、１０1/2、１１、１１1/2、１
２、１２1/2、１３、１３1/2、１４、１４1/2、１５、１５1/2、１６、１６1/2、１７、
１７1/2、１８、１８1/2、１９、１９1/2、２０、２０1/2、２１、２１1/2、２２、２２1/2、２３、２３1/2、２４、２４1/2、２５、２５1/2、２６、２６1/2、またはそれ以上後）に投与される。ここで用いるとき、本明細書で使用される「直前の用量」の語句は、経時的な複数回投与において、介在する用量を伴わない時系列において、その直後の用量の直前に投与される抗原結合性分子の用量を意味する。
本発明のこの態様に従う方法は、患者への抗原結合性分子（例えば、ＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異的抗原結合性分子）の任意の回数の二次及び／または三次用量を投与することを含むことができる。例えば、一定の実施形態では、単回の二次用量が患者に投与されます。他の実施形態では、２回以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、一定の実施形態では、単回の三次用量が患者に投与される。他の実施形態では、２回以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
複数の二次用量を含む実施形態において、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与されてよい。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間後に患者に投与することができる。同様に、複数の三次用量を含む実施形態において、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与してもよい。例えば、各々の三次用量は、直前の用量の２〜４週間後に患者に投与することができる。或いは、二次及び／または三次の用量が患者に投与される頻度は、治療計画の過程において変化することができる。投与の頻度はまた、臨床検査に従い、個々の患者の必要性に応じて臨床医が治療の経過中に調製することができる。
＜抗体の診断的使用＞
本発明の抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体はまた、例えば診断目的のために、サンプル中のＣＤ３またはＣＤ３発現細胞を検出及び／または測定するために使用できる。例えば、抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体、またはその断片は、ＣＤ３の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発
現、発現の欠如等）を特徴とする状態または疾患を診断するために使用することができる。ＣＤ３についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体と接触させることを含むことができ、ここでの前記抗体は検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。或いは、非標識の抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体は、それ自身が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて、診断用途で使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または２５Ｉのような放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、またはローダミンのような蛍光性もしくは化学発光性部分；または、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼのような酵素であることができる。試料中のＣＤ３を検出または測定するために用い得る特定の例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本発明の抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体はまた、サンプル中のＣＤ２０、またはＣＤ２０発現細胞を検出及び／または測定するために、或いはＣＤ２０の異常発現（例えば過剰発現、過少発現、発現欠如等）を特徴とする状態または疾患を診断するために使用することができる。
本発明に従うＣＤ３及び／またはＣＤ２０診断アッセイにおいて使用できるサンプルには、正常なまたは病理学的状態の下で患者から入手可能な、検出可能な量のＣＤ３及び／またはＣＤ２０タンパク質、またはその断片を含有する任意の組織もしくは体液サンプルが含まれる。一般的に、健康な患者（例えば、ＣＤ３またはＣＤ２０の異常なレベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られた特定のサンプル中のＣＤ３またはＣＤ２０のレベルは、ＣＤ３またはＣＤ２０のベースライン、または標準のレベルを最初に確立するために測定されるであろう。このＣＤ３またはＣＤ２０のベースラインレベルは、その後、それぞれＣＤ３またはＣＤ２０に関連する疾患または状態を有することが疑われる個体から得た試料中で測定されたＣＤ３のレベルと比較することができる。
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の方法及び組成物を作成する方法及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されるものであり、発明者等が彼等の発明であると看做す範囲の限定を意図するものではない。使用する数（例えば量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、幾つかの実験的誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の度数であり、圧力は大気圧または大気圧近傍におけるものである。
実施例１：抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２０抗体の生成
抗ＣＤ３または抗ＣＤ２０抗体を単離するための幾つかの方法が知られている。ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されているように、以下の実施例で使用される完全ヒト抗ＣＤ３抗体は、骨髄腫細胞に融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離された。
抗ＣＤ３抗体の更なる例は、前記方法で用いることができ、そのような抗体及び抗ＣＤ３抗体の生物学的特性の記述は、２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１に記載されており、その全体を本明細書の一部として援用する。例示的な抗ＣＤ２０抗体及びかかる抗ＣＤ２０抗体の生物学的特性は、ＵＳ７，８７９，９８４及び２０１３年９月１９日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１に記載されており、その各々を本明細書の一部として援用する。
この実施例の二重特異的抗体を構築するために使用される抗ＣＤ２０抗体、及びこの実施例の抗体を構築するために使用される抗ＣＤ２０抗体及びその抗体の作成方法は、ＵＳ７，８７９，９８４に記載される通りである。
本発明の二重特異的抗体の抗ＣＤ３抗原結合性アーム及び抗ＣＤ２０結合性アームを構成するために使用される、重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列識別子が表１に記載されている。対応する核酸配列識別子が表２に記載されている。
Figure 0006831426
実施例２：ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二重特異的抗体の生成
抗ＣＤ３特異的結合性ドメイン及び抗ＣＤ２０特異的結合性ドメインを具備する二重特異的抗体が、前記標準的な方法論を使用して上記の配列を用いて構築され、ここでは抗ＣＤ３抗体由来の重鎖及び同族の軽鎖が、抗ＣＤ２０抗体由来の重鎖と組み合わされた。
このように、本実施例に従って作成された二重特異的抗体は、２つの別々の抗原結合性ドメイン（すなわち、結合性アーム）を含む。第一の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３−ＶＬ」）に由来する軽鎖可変領域とペアになった、抗ＣＤ２０抗体（「ＣＤ２０−ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を具備する。ＣＤ２０−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬの対合によって、ＣＤ２０を特異的に認識する抗原結合性ドメインが作製される。第二の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ３抗体に由来する軽鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＬ」）とペアになった抗ＣＤ３抗体に由来する重鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＨ」）を具備する。ＣＤ３−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対合により、ＣＤ３を特異的に認識する抗原結合性ドメインが作製される。同じＣＤ２０−ＶＨは、この実施例において作製された全ての二重特異的抗体に使用され、「ＣＤ２０−ＶＨ−Ａ」と称される。
各重鎖のための野生型重鎖定常ドメイン（ＣＨ）は、組換え技術によって、キメラＣＨで置換された。一つの結合性アーム（例えば、抗ＣＤ３結合性アーム）のＣＨには、ＣＨのＣＨ３領域における変異が含まれており、これは二重特異性の単離を容易にする。
本実施例に従って製造された種々の二重特異的抗体のパーツの概要を、表３及び表４に記載する。
Figure 0006831426
表５及び６は、本実施例の二重特異的抗体の種々の重鎖可変領域（表５）及び軽鎖可変領域（表６）のアミノ酸配列識別子を、それらの対応するＣＤＲと共に提示している。
Figure 0006831426
加えて、表７及び８は、この実施例の二重特異的抗体の種々の重鎖可変領域（表７）、重鎖定常領域、及び軽鎖可変領域（表８）をコードするヌクレオチド配列についての配列識別子を、それらの対応するＣＤＲと共に提示している。
Figure 0006831426
上記の二重特異的抗体に加えて、以下のような対照抗体もまた、この実施例に提示され一定の実験において使用した：
対照抗体１：ＵＳ４，３６１，５４９に記載され、且つハイブリドーマＣＲＬ−８００１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡ）から入手可能な、ヒトＴ細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体「ＯＫＴ−３」。
対照抗体２：ＢＤファルマジェン社、カタログ＃５５０５２から入手可能なヒトＴリンパ球細胞上のＴ３複合体イプシロン鎖に対して反応性の抗体「ＳＰ３４」。
対照抗体３：ＵＳ５，７３６，１３７に開示されたリツキサン（登録商標）（リツキシマブ）の重鎖及び軽鎖配列を有する抗ＣＤ２０治療用抗体。
対照抗体４：ＣＤ３×ＣＤ２０抗体−野生型Ｆｃ（ｗｔＦｃ）としても知られる。この抗体は、配列番号２／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３：配列番号４−６−８−２０−２２−２４のアミノ酸配列）、及び野生型ＩｇＧ１・ＣＨ領域（配列番号４５）を備えた抗ＣＤ２０アームと；配列番号１０／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対（配列番号１２−１４−１６−２０−２２−２４のＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列）、及び単離を容易にするためにＣＨ３ドメインに２つのアミノ酸修飾を含む野生型ＩｇＧ１・ＣＨ領域（配列番号４８）を具備する抗ＣＤ３アームを有するように、上記方法と同様に作成された。ＣＤ３×ＣＤ２０抗体―ｗｔＦｃ（抗体４）は、異なるＦｃドメイン配列または構造を有する抗体に対して抗体エフ
ェクター機能または他の特性を比較する目的で、野生型ＩｇＧ１・Ｆｃドメインを有する適合性対照抗体（即ち、本発明のＣＤ３×ＣＤ２０キメラＦｃ抗体の抗原結合性ドメインに適合された）と呼ぶことができる。
対照抗体５：抗ＦｅｌＤ１モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２０またはＣＤ３に対する交差反応性を伴わずにネコ抗原に結合する。このＩｇＧ１非特異的抗体対照は、２０１３年１１月７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１６６２３６に記載された方法によって得た。
対照抗体６：本明細書に記載の抗ＦｅｌＤ１抗原結合ドメインが、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１６６２３６に記載されているように、Ａｂ１と同様に、キメラＩｇＧ４・Ｆｃドメインを含むように操作された。対照Ａｂ６は、ヒトＣＤ２０またはＣＤ３に対する交差反応性を有していないが、Ａｂ１と同様のエフェクター機能を有する。
実施例３：キメラ重鎖の構築
キメラ重鎖、例えばキメラＣＨ・ＩｇＧ４（配列番号２６）及びキメラＣＨ・ＩｇＧ１（配列番号３０）の生成は、標準的なクローニング技術を用いて行った。先ず、キメラＩｇＧ４・ＣＨは２段階ＰＣＲ増幅法を介して生成された。２つのＰＣＲ断片、即ち、断片１及び２は、それぞれＣＨ領域に隣接するプライマー対であるＰ１−Ｐ２及びＰ３−Ｐ４を用いて、野生型ｈＩｇＧ４ＣＨ・ＤＮＡを含む出発ベクター構築物ｐＲ００１を用いて増幅させた。下記の表９を参照されたい。これらのプライマーは、望ましいＩｇＧ２の下側ヒンジ配列（これは配列番号５２をコードする）、及び隣接する制限部位を前記断片の中に導入した。次いで、これら二つの断片は、ＰＣＲプライマーＰ２及びＰ４を用いて連結された。得られた配列をＸｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ００１の中に挿入して、ＩｇＧ２下側ヒンジ配列を有するキメラＩｇＧ４・ＣＨを含んだベクター構築物ｐＲ００２生成した。配列は、プライマーＰ１０及びＰ１１を用いて確認した。
加えて、キメラＩｇＧ１・ＣＨが、複数ステップのＰＣＲ増幅によって生成された。断片１ａは、テンプレートｐＲ８５５０３（これは野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ・ＤＮＡを含む）から、プライマーＰ２及びＰ５（下記の表９を参照されたい）を使用して生成させた。断片２ａを、テンプレートとしてｐＲ００２（キメラＩｇＧ４ＣＨ・ＤＮＡを含む）を使用し、プライマーＰ６及びＰ８を用いて増幅した。断片３は、テンプレートｐＲ００３（野生型ｈＩｇＧ１ＣＨ・ＤＮＡ；配列番号４５）から、プライマーＰ７及びＰ９を用いて作製された。断片１ａ及び２ａを、プライマーＰ２及びＰ８を用いて融合させ、これにより断片４が生じた。プライマーＰ６及びＰ９を使用して断片２ａ及び３を連結することにより、断片５を作製した。次いで、プライマーＰ２及びＰ９を使用して断片４及び５を融合させた。この得られた配列を、Ｘｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ００１の中に挿入し、ＩｇＧ２下側ヒンジ及びＩｇＧ４・ＣＨ２ドメインと共にＩｇＧ１定常領域を有する構築物ｐＲ００４を生じさせた。該配列は、プライマーＰ１０及びＰ１１を用いて確認された。
Figure 0006831426
実施例４：単一特異性の対照抗体と比較して、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体はＪｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞及びサルＴ細胞に選択的に結合する
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ２０−ヒトＴ細胞株）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ２０＋ヒトＢ細胞株）、またはカニクイザルのＰＢＭＣ（「ｍｋＴ細胞」）に対する結合能力についてのＦＡＣＳ結合法を介して、ＣＤ３×ＣＤ２０抗体ｗｔＦｃ（対照抗体４）を、実施例２に記載した単一特異性の対照抗体と比較した。
ＦＡＣＳデータは、以下のプロトコルを用いて取得された：ウエル当たり２×１０５細胞を氷上で３０分間、連続希釈した抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、適切な二次（ジャーカット細胞、ＲＡＪＩ細胞）または二次抗体カクテル（カニクイザルＰＢＭＣ用）を添加し、更に３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１％ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、ＢＤ・ＦＡＣＳカントＩＩフローサイトメトリーにより分析し再洗浄した。ジャーカット細胞及びＲａｊｉ細胞を側方及び前方散乱によりゲートされる一方、カニクイザルのＴ細胞もまた、ＣＤ２＋ＣＤ４＋の集団としてゲートされた。細胞結合滴定のためのＥＣ５０を、４パラメータの非線形回帰分析を用いて計算された値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定した。結果を表１０に示す。
Figure 0006831426
表１０に示すように、試験した抗体のパネルは、それらの特異性に依存して、種々の細胞株へのある範囲の結合親和性を示した。二重特異性対照抗体４は、ヒト及びカニクイザル標的細胞株の両方に結合する能力を示した。対照抗体４は、抗体１及び本発明の抗体２と同じ抗ＣＤ３×ＣＤ２０可変領域を含む、野生型ＩｇＧ１・ＣＨ領域を有している。抗ＣＤ３対照１（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ３対照２（ＳＰ３４）、及び抗ＣＤ２０対照３は、ジャーカット細胞、カニクイザルＴ細胞及びＲａｊｉ細胞にそれぞれ結合した。
実施例５：野生型ＣＨを備えたＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体は、活性化Ｔ細胞の存在下で、Ｒａｊｉ細胞に対する細胞傷害性を誘導する
ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞に対してＴ細胞媒介性殺滅をリダイレクトさせるＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体の能力を、インビトロ細胞傷害アッセイで試験した。加えて、Ｆｃ／のＦｃＲ相互作用を介してＵ９３７細胞を死滅させる、二重特異的抗体の及び親抗ＣＤ３抗体の両方の能力についても研究した。
カルセイン殺傷アッセイを、以下のプロトコルを用いて行った：ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣをそれぞれ、フィコール・プラーク上で、またはリンホライト（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ）哺乳類細胞分離媒体を介して単離した。この単離されたＰＢＭＣを、組換えヒトＩＬ−２（３０Ｕ／ｍＬ）及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣのための抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣのための抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する培地を用いて、数日間のコースに亘って活性化させた。
標的細胞（ＣＤ２０媒介性死滅のためのＲａｊｉ及びＦｃＲを媒介性死滅のためのＵ９３７）をカルセインで標識し、３倍血清希釈の抗体を用い、１０：１のエフェクター：ターゲット比において活性化Ｔ細胞と共に、３７℃で３時間のコースに亘ってインキュベートした。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、その上清を蛍光分析のための半透明黒色透明底プレートに移した。５０％の細胞傷害性を誘導する二重特異的抗体のモル濃度として定義されるＥＣ５０を、プリズムを用いて測定した。数値は、４パラメータ非線形回帰分析を用いて計算された。結果を表１０に要約する。
Figure 0006831426
表１１に示すように、ヒト特異的でカニクイザル交差反応性の抗ＣＤ３アーム、及び野生型ＩｇＧ１・ＣＨ領域を含む二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体は、ヒト活性化Ｔ細胞の存在下で、細胞傷害性をＲａｊｉ細胞に特異的にリダイレクトさせることができた。カニクイザル活性化Ｔ細胞の存在下において、Ｒａｊｉは、それらがサルＴ細胞を活性化させる抗ＣＤ３アームを有する対照Ａｂ４二重特異的抗体と共にインキュベートされたときに殺滅された。前記二重特異的抗体並びに対照Ａｂ１（抗ＣＤ３ｍＡｂ）の両者が、Ｕ９３７Ｆｃ／ＦｃＲ依存性殺滅アッセイにおける活性を示した。この活性は、非特異的ヒトＩｇＧのブロッキングを反応に加えることによって阻止された（データは示さず）。
実施例６：ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体を含むキメラＣＨ領域は、ＣＤＣアッセイにおいて低下したエフェクター機能を示す
キメラＣＨ領域を有するＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体（抗体１、抗体２）は、上記の実施例２で述べたように、エフェクター機能を変化させ、または減少させるように操作された。ＩｇＧ１アイソタイプ（対照Ａｂ４）の野生型（ＷＴ）重鎖定常領域を備えた抗体と比較して、ＣＨ領域におけるアミノ酸置換は、ＩｇＦｃがその受容体（複数可）に結合する能力を妨げることができる。従って、Ｂ細胞の活性化または食作用のような、シグナル伝達及び免疫応答は変更され得る。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）（この実施例で）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能（実施例７参照）に対する、ＣＨ領域でのアミノ酸置換の影響が試験された。
ＣＤＣエフェクター機能に抗体１及び抗体２の効果を調べるために、ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ（標的）細胞（５０００／ウェル）またはＤａｕｄｉ細胞を、５％ヒト血清補体の存在下で播種した。１００ｎＭで開始して、抗体１、抗体２及び対照抗体の連続希釈液を、３７℃で４時間、細胞に添加した。標的細胞の溶解は、ＣｙｔｏＴｏｘグロ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定し、パーセント細胞傷害性を算出した。
パーセント細胞傷害性は、以下の式を用いて計算した：
％細胞傷害性＝（（ＬＳ−ＬＳＲ）／（ＬＭＲ−ＬＳＲ））×１００％
ここでのＬＳＲは、ベースライン標的細胞発光であり、ＬＭＲは、ジギトニンにり溶解されたた細胞からの最大カルセイン放出である。細胞傷害性についてのＥＣ５０は、プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。数値は４パラメータ非線形回帰分析を用いて計算したものであり、これを表１２、図５Ａ及び図５Ｂに示す。
抗体１及び抗体２のＤａｕｄｉ細胞及びＲａｊｉ細胞に対するＣＤＣ活性は、ｗｔ重鎖定常領域を持った対応の抗体に比較して有意に低下する。表１２、及び図５Ａ／Ｂを参照されたい。Ｒａｊｉ細胞に対する抗体１で幾らかのＣＤＣ活性が観察されたが、全体的な
結果は、キメラ抗体が野生型ＩｇＧ１・Ｆｃ対照抗体よりも弱いエフェクター応答をマウントすることを示している。
Figure 0006831426
実施例７：キメラＣＨ領域を含むＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、ＡＤＣＣアッセイにおいて低下したエフェクター機能を示す
ＡＤＣＣエフェクター機能に対する抗体１及び抗体２ ｖｓ．野生型ＣＨ領域（及び同一の可変領域）を備えた二重特異的抗体の効果を調べるために、ＦｃγＲＩＩＩＡのより高い親和性Ｖ対立遺伝子を発現するように操作された新鮮に単離された未刺激でＣＤ５６陽性のＮＫ細胞もしくはＮＫ９２細胞を、キメラＣＨ抗体（抗体１及び抗体２）及び野生型ＣＨ対照抗体（対象抗体４）の存在下に、カルセイン標識されたＣＤ２０陽性のＲａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞と共に播種した。標的細胞からのカルセインの放出をモニターし、パーセント細胞傷害性を決定した。パーセント細胞傷害性及びＥＣ５０は、上記のＣＤＣアッセイについて述べたようにして計算した。結果を、表１３ならびに図６Ａ及び６Ｂに示す。
前記キメラＣＨ抗体、抗体１及び抗体２は、Ｒａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性（表１３）を媒介しない。
Figure 0006831426
実施例８：キメラ抗体の、表面プラズモン共鳴由来の結合親和性及び反応速度定数
キメラ定常重鎖領域を有する抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異的抗体、抗体１抗体及び抗体２は、ヒト及びカニクイザルのＦｃγ受容体に対するその動的結合パラメータを決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ社）技術を用いて分析された。アイソタイプ対照、即ち、ｗｔ−ＩｇＧ１アイソタイプ対照及びｗｔ−ＩｇＧ４のＣＰＰＣアイソタイプ対照を、同様の方法で試験した。
簡単に述べると、ＳＰＲ実験は、カルボキシメチルデキストランでコーティングされた（ＣＭ−５）チップを用いたビアコアＴ２００機器において、２５℃で行った。マウスモノクローナル抗ペンタヒスチジン抗体（ＧＥヘルスケア）を、標準的なアミンカップリング化学を用いて、ＣＭ−５センサーチップ表面に固定化した。Ｈｉｓタグを付したヒトまたはサルＦｃγＲタンパク質の１４０ＲＵ−３７６ＲＵを、抗ペンタヒスチジンアミン結合されたＣＭ−５チップ上に捕獲し、抗体のストック溶液を捕獲されたタンパク質上に、２０μＬ／ｍｉｎで２．５分間注入した。ｍＡｂ結合反応をモニターし、低親和性受容体について、定常状態結合平衡を計算した。動的な会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）の速度定数が、スクラバー２．０曲線フィッティングソフトウェアを使用して前記データを処理し、且つ１：１結合モデルにフィッティングすることにより決定された。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、次の速度定数から計算した：ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；及び ｔ1/２（ｍｉｎ）＝（Ｉｎ２／（６０＊ｋｄ）。
Figure 0006831426
表１４の結果が示すように、抗体１及び抗体２二重特異的抗体は、野生型（ｗｔ）ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ・ＣＨ領域を有する抗体と比較して、ＳＰＲアッセイにおいてヒトＦｃγＲＩへの結合を示さない。本発明のキメラ重鎖二重特異的抗体はまた、ｗｔ・ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ配列を備えた抗体に比較して、幾つかの低親和性ヒトＦｃＲγ受容体については弱い結合しか示さず、または結合を示さない（例えば、ヒトＦｃＲγＩＩＡ、ＦｃＲγＩＩＢについては弱い結合が検出され、またヒトＦｃＲγＩ、ＦｃＲγＩＩＩＡ、またはＦｃＲγＩＩＩＢでは結合が検出されなかった）（以下の表１５）。
Figure 0006831426
実施例９：キメラ抗体の薬物動態プロファイル
抗体１及び抗体２の毒物動態プロファイルは、単回の３０分ＩＶ注入を受け、続いて１２週間の観察期間を経た雄のカニクイザル（３匹の動物／治療群）から、血液サンプルを入手することにより評価した。血清中の全薬物濃度の毒物動態分析用の血液サンプルは、投与前、並びに投与後５分、５時間、２４時間、４８時間、７２時間及び１６８時間、１４日、２１日、３５日、４９日、６６日及び８４の時点で採取した。得られた血清サンプルを直接的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析して、Ａｂ１またはＡｂ２の全薬物濃度を決定した。薬物動態学的パラメータを決定するために、非コンパートメント解析（フェニックスＷｉｎＮｏｎＬｉｎ）を用いて被験製品の毒物動態を評価した。結果を表１６に示す（ＡＵＣ＝濃度対時間曲線下のＡＵＣ面積；Ｃｍａｘ＝観察された血清中の最大濃度）。
Figure 0006831426
カニクイザルにおける抗体１及び抗体２の１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与に続いて、それぞれ３３．４及び２６．０μｇ／ｍＬの平均ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、及び１００及び６１．１日＊uｇ／ｍＬの平均ＡＵＣ０−１６８ｈ値がそれぞれ観察された。これら
の２つの分子の見かけの最終半減期は、８．１４〜１４．０日であると推定された。データは、１２週間の観察期間の大半に亘って、Ａｂ１及びＡｂ２に対する連続的な露出が全ての動物で維持され、また露出は治療グループ間で同等であったこと示している。被験物質での明白な免疫原性は認められなかった。抗体１、抗体２の全体的な薬物動態プロファイルは、カニクイザルに投与されたモノクローナル抗体に典型的である。
実施例１０：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、単一特異性抗体よりも低用量で、カニクイザルにおいてＣＤ２０＋Ｂ細胞を枯渇させることができる
抗体１及び対照抗体４・ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体投与のインビボでの効力を決定するために、カニクイザルの末梢血中におけるＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルの変化を、単一特異性抗ＣＤ２０抗体（対照Ａｂ３）に比較して、抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の投与後にＦＡＣＳを介して調べた。研究は、次のように投与群あたり動物３匹の８投与群に編成した雄のカニクイザル（カニクイザル）で実施した：第１群は、プラセボ群（担体対照投与）であった；第２群は、単一特異性抗体（対照Ａｂ３；リツキサン）を３０ミリグラム／ｋｇの用量（サルにおける３０ｍｇ／ｋｇは、最大臨床用量であると考えられ３７５ｍｇ／ｍ２のヒト用量と同等である）で投与を受けた；第３群は、０．０１ｍｇ／ｋｇでの二重特異性ＣＤ３×ＣＤ２０対照抗体４である；第４群−０．１ｍｇ／ｋｇの抗体４；第５群−１ｍｇ／ｋｇの抗体４；第６群−０．０１ｍｇ／ｋｇの抗体１；第７群−０．１ｍｇ／ｋｇの抗体１；第８群−１ｍｇ／ｋｇの抗体１。血液は、動物に投与する前の−７日及び４日に採血された。抗体医薬または担体（プラセボ）の用量は静脈内注入により投与され、血液は投与後第２、４及び７日に採血された。血液サンプルは、Ｂ細胞（ＣＤ２０；表１７）及びＴ細胞（ＣＤ３、下記参照）マーカーについてＦＡＣＳにより分析され、これら細胞型の絶対数が決定された。
簡単に説明すると、１００μＬの血液を、１．５ｍＬの赤血球溶解緩衝液と共にエッペ
ンドルフ管の中で３分間インキュベートした。細胞を０．４×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ洗浄液（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）で２回洗浄し、Ｆｃブロック試薬を用いて室温で１０分間ブロックした。次いで、細胞を４℃で３０分間、ｈＣＤ４５及びＣＤ２０蛍光試薬に直接結合された抗体と共にインキュベートした。Ｂ細胞サブセット（ＣＤ２０）またはＴ細胞サブセット（ＣＤ３）の定量的決定は、最初に、白血球（ＷＢＣ）集団の輪郭を描くために、ＣＤ４５蛍光染色及び側方散乱特性（ＳＳＣ）境界決定（ＣＤ４５ブライトＳＳＣｄｉｍ）からなる不均一ゲーティング戦略を用いて行われた。次いで、関連する蛍光標識された抗体（ＣＤ２０・ＡＰＣ−Ｃｙ７の）の使用を介して、Ｂ細胞集団が同定された。染色後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏサイトメーターによるＦＡＣＳ取得及びＦｌｏｗＪｏソフトソフトウェアでの解析の前に、細胞を２回洗浄した。結果を、表１７及び図１１Ａ及び１１Ｂに示す。
Figure 0006831426
表１７及び図１１Ａに示すように、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体と抗ＣＤ２０単一
特異性抗体の投与は、測定された最初の時点（２日目）までに、循環Ｂ細胞のベースラインレベルへの枯渇をもたらした。この枯渇は、プラセボ対照動物のコホートでは見られなかった。二重特異性コホートにおけるＢ細胞枯渇は、二重特異的抗体の１ｍｇ／ｋｇの投与後１週間は維持され、また同様に、０．０１及び０．１０ｍｇ／ｋｇ用量の二重特異性コホートにおいてもＢ細胞枯渇が維持された。
Ｔ細胞（ＣＤ３＋）レベルもまた、この実験において、蛍光標識された抗ＣＤ３抗体によってモニターされた。循環Ｔ細胞の一過性の損失が、二重特異的抗体コホート（Ａｂ４及びＡｂ１；全用量）において、投与後第２日に観察された。担体（プラセボ）対照または対照抗体３（リツキサン）の群では、測定した時点においてＴ細胞の損失（ベースライン未満）は観察されなかった。二重特異的抗体コホートにおいて、Ｔ細胞レベルは第４日の時点までにベースラインレベルに戻り、実験終了までベースラインレベルに維持された（図１１Ｂを参照されたい）。
抗体１及び抗体４ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体のインビボでの能力は、上記で述べた研究と同様に、ＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定する長期（３ヶ月）の研究において、カニクイザルの末梢血中で測定された。プラセボ（担体）または二重特異的抗体は、第０日において、１．０ｍｇ／ｋｇ手投与された。末梢血でのＢ細胞レベルは、両方の二重特異的抗体コホートにおいて第２日までに有意に枯渇し、またプラセボを除く全サンプルにおける研究の長さに亘って、レベルは枯渇したままであった（図１２Ａ参照）。Ｔ細胞の一過性の損失は、二重特異性コホートにおいて第２日まで観察され、次いで、Ｔ細胞第４日までにベースラインレベルに回復し、二重特異的抗体で処置された動物についての研究の全体を通じて（＞８０日）、測定されたベースラインの付近のままであった（図１２Ｂ）。Ｔ細胞の一過損失は、プラセボで処置した動物では観察されなかった。
艇投与量での抗体１及び抗体４ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体のインビボでの能力を測定するために、上記の実験と同様に長期（２月）の研究において、ＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化がカニクイザルの末梢血中で測定された。二重特異的抗体は、第０日において、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．００１ｍｇ／ｋｇ（１μｇ／ｋｇ）の何れかで投与された。末梢血中のＢ細胞レベルは第２日までに有意に枯渇し、より高用量のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体で治療した動物について観察されたもの（表１７及び図１１Ａまたは１２Ｂに見られる通り）と同様に、レベルは両方のＣＤ３×ＣＤ２０コホートについての研究の長さに亘って枯渇したままであった（図１３Ａ）。非常に低用量（１μｇ／ｋｇ）の二重特異的抗体で処置した動物は、より高用量のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体で処置した動物に見られるのと同じ一過性のＴ細胞損失及び回復を経験する（図１１Ｂまたは１２Ｂと比較して図１３Ｂを参照されたい）。
記載された研究において観察されたＢ細胞損失は、ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体１で治療された動物の末梢血における循環抗体の喪失と相関していた（図１４参照）。動物の循環中の抗体曝露は経時的に低下するので、（例えば、動物番号Ｉ０６８８１について第８１日に観察されるように）Ｂ細胞集団は回復し始める。
Ｂ細胞喪失と、末梢血中の循環抗体の喪失との相関は、ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ抗体２で治療された動物にも見られる（図１５参照）のに対して、動物の循環系における抗体露出は経時的に低下して、Ｂ細胞集団は、例えば動物番号Ｉ０６８７６について第６６日に、また動物番号Ｉ０６８７７について第６８日に観察されたように回復し始める。同様の相関関係はまた、ＣＤ３×ＣＤ２０−ｗｔＦｃ（Ａｂ４）二重特異的抗体で処置した動物でも見られた（図１６参照）。動物の循環中の抗体曝露は経時的に低下するので、Ｂ細胞集団は回復し始める（図１６参照、例えば動物番号Ｉ０６８７０について第９１日
に、及び動物番号Ｉ０６８７２について第６４日に観察される）。
実施例１１：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、単一特異性抗体よりも低用量で、カニクイザルのリンパ組織におけるＣＤ２０＋Ｂ細胞を枯渇させることができる
カニクイザルのリンパ組織におけるＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルの変化を、単一特異性の抗ＣＤ２０抗体（対照Ａｂ３−リツキサン）と比較して、抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体抗体１または抗体４）の投与後にＦＡＣＳを介して検査した。上記実施例１０に概説した研究群１〜８と同様に、研究は、次のように投与群当たり動物３匹の８投与群に編成された雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において行われた。抗体医薬及び担体の用量は静脈内注入により投与し、投与後第７日に動物を屠殺し、組織を採取した。組織サンプルは、白血球（ＣＤ４５＋）、特にＢ細胞（ＣＤ２０＋）マーカーについてＦＡＣＳにより分析し、次いで、Ｂ細胞の％体積を決定した。
Ｂ細胞集団を、上記実施例１０に記載の方法と同様に、関連の蛍光標識された抗体（ＣＤ２０ ＡＰＣ−Ｃｙ７）及びＦＡＣＳ収集の使用を介して同定した。結果を表１８並びに図１７Ａ及び１７Ｂに示す。
Figure 0006831426
表１８及び図１７Ａに示すように、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の投与は、抗ＣＤ２０単一特異性抗体と比較して、二重特異性コホートについては、非常に低い用量（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ）で脾臓における組織Ｂ細胞の枯渇をもたらした。この枯渇は、プラセボ対照動物コホートでは見られなかった。
表１８及び図１７Ｂに示したように、抗ＣＤ２０単一特異性抗体と比較して、ＣＤ３×
ＣＤ２０二重特異的抗体の投与は、二重特異的コホートについて遥かに低用量（０．０１から１．０ｍｇ／ｋｇ用量）で腸間膜リンパ節における組織Ｂ細胞の枯渇をもたらし、０．１ｍｇ／ｋｇ用量及び１ｍｇ／ｋｇ用量の二重特異的抗体は、単一特異性コホートにおけるよりも効率的なＢ細胞枯渇をもたらした。この枯渇は、プラセボ対照動物コホートでは見られなかった。ＣＤ２０のための免疫組織化学的染色（データは示さず）時、残留Ｂ細胞は、単一特異性で処置された（リツキサン（登録商標）の３０ｍｇ／ｋｇ）コホートのリンパ節において検出された。残留Ｂ細胞は、０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗ＣＤ３×ＣＤ２０抗体の用量で処置したコホートから採取した組織では検出されなかった。これらのデータは、Ａｂ１及びＡｂ１がＡｂ３より強いＢ細胞の殺傷深さを有することを示している。
実施例１２：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体での腫瘍治療
Ａ．ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体での治療は、ＮＳＧマウスにおけるＲａｊｉ腫瘍増殖を抑制する
腫瘍増殖を減少させるのに選択された抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の有効性を評価するために、ジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州、米国）から購入したＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス）に、２×１０６個のＲａｊｉ腫瘍細胞及び５×１０５個のヒトＰＢＭＣを皮下に同時移植した（第０日）。同じ日に、マウス（Ｎ＝処置群あたり５匹のマウス）は、マウス当たり０．４、０．０４または０．００４ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与量の抗体１または対照抗体５（無関係な標的にＩｇＧ１抗体）の何れかで治療された。第０日で開始して、マウスは週２回、研究の残余のための薬物または担体の腹腔内投与で治療された。腫瘍の大きさはカリパスを用いて週に２回測定し、腫瘍体積は、体積＝（長さ×幅２）／２として算出した。統計的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアのＰｒｉｓｍ５．０（マッキントッシュ版）を用いて行った。
統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後テストを用い、２方向ＡＮＯＶＡにより決定した。各読み出しからのデータを、治療群の間で比較した。Ｐ＜０．０５の閾値を統計的に有意と看做した。
結果は、図７Ａ〜７Ｆに示されている。これらの結果は、抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ）が、同時移植されたヒト免疫細胞をもたないマウスにおいて、Ｒａｊｉ腫瘍をターゲッティングし、試験された用量において完全な腫瘍増殖抑制をもたらした（図７Ｃ：０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１；図７Ｅ：０．０４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１；図７Ｆ：０．００４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１）。この実施例は、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体１での治療は、腫瘍移植の時点で開始して、腫瘍増殖を阻害するのに有効であったことを示している。Ｒａｊｉ腫瘍の増殖は、０．４、０．０４または０．００４ｍｇ／ｋｇの抗体１の用量を投与されたマウスにおいては、対照に比較して、２３日まで完全に抑制されたままであった。また、抗体１または対照抗体は何れも、研究中のマウス体重に対して顕著な影響を持たなかった（データは示さず）。
ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の抗腫瘍効果が、（上記で述べたのと）同様のＮＳＧマウスモデルにおいて更に試験されたが、各ＮＳＧマウスは第１日に１ｍｇマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ２ａ・Ｆｃ）を投与され、その後は週１回投与された。結果を図８Ａ〜８Ｂに示す。
この実験は、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ）またはＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体４（ＣＤ３×ＣＤ２０−ｗｔＦｃ）の何れかでの治療は、循環ＩｇＧの存在下で試験された二重特異性Ａｂの用量において、腫瘍移植時に始まった腫瘍の増殖を阻害するのに有効であったことを示している（図８Ａ〜８Ｂ）。図８Ａに見られるように、抗体１（ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ二重特異的抗体）は、この
実験においてＩｇＧ補充の有無にかかわらず、試験された時間に亘って完全な腫瘍増殖阻害を示している。
Ｂ．ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、ＮＳＧマウスで樹立された腫瘍を縮小させる
ＮＳＧマウスにおいて樹立された腫瘍を減少させることにおいて、選択された抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の効果を評価した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス）を、ジャクソン・ラボラトリーズ（バーハーバー、メイン州、米国）から購入し、ＨＬＡ適合のＲａｊｉ腫瘍細胞（２×１０６）及びヒトＰＢＭＣ（５×１０５）と共に皮下に同時移植した（第１５日）。腫瘍は、治療前の１５日間に亘って宿主中で樹立された。マウスは、薬物投与の１日前（−１日）に、それぞれ５ｍｇの補充ｍＩｇＧ２ａ・Ｆｃを投与された。これらマウスはその後、該実験期間に亘って、マウス当たり５ｍｇのｍＩｇＧ２ａ・Ｆｃを週１回投与された（第７日、第１４日等）。薬物投与の前に、マウスは腫瘍サイズに従って二つの実験群に分けられた：第１群：〜２００−４００ｍｍ３、または第２群：〜５００−９００ｍｍ３。
薬物治療の後、第０日、第３日、第６日、第１０日、第１４日、第１７日、第２１日及び第２８日に、各マウスにおいて腫瘍サイズをモニター及び記録した。腫瘍サイズは週２回カリパーを用いて測定し、体積＝（長さ×幅２）／２として腫瘍堆積を計算した。腫瘍の存在はまた、触診によっても決定した。統計的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍ５．０（マッキントッシュ版）を利用して行った。各々の齧歯類からのデータを、治療群間で比較した。結果を図９及び図１０に示す。
ａ．第１群：〜２００−４００ｍｍ３腫瘍。第０日で開始して、４または５匹のマウスの幾つかのコホートは、それぞれ次のように指示された用量の薬物または担体で、週１回（即ち、第７日、第１４日等）次のように治療された。
ｉ．対照：担体のみ
ｉｉ．対照抗体５：０．４ｍｇ／ｋｇ
ｉｉｉ．抗体１（ＣＤ２０×ＣＤ３−キメラＦｃ）：０．４ｍｇ／ｋｇ
ｂ．第２群：〜５００−９００ｍｍ３腫瘍。第０日で開始して、４匹のマウスの幾つかのコホートは、それぞれ次のように指示された用量の薬物で、週１回（即ち、第７日、第１４日等）治療された。
ｉ．対照抗体５：０．４ｍｇ／ｋｇ
ｉｉ．抗体１（ＣＤ２０×ＣＤ３−キメラＦｃ）：０．４ｍｇ／ｋｇ
０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ２０×ＣＤ３−キメラＦｃ）を投与したコホートでは、腫瘍は第１４日までに完全に消失した。図９を参照されたい。
樹立された大きい腫瘍のモデル（即ち、第２群：〜５００−９００ｍｍ３）では、抗体１（ＣＤ２０×ＣＤ３−キメラＦｃ）での治療（０．４ｍｇ／ｋｇ）は、第２１日めまでに、マウスで観察された腫瘍の完全な除去をもたらした。体積が０．５ｃｍ超で０．９ｃｍ以下の大きなリンパ腫塊（即ち、ＣＤ２０発現について陽性の腫瘍）を持ったマウスの治療でのＡｂ１の有効性を示す、図１０を参照されたい。
実施例１３：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体はインビトロでのＰＢＭＣ増殖を誘導する
選択されたＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体及び対照構築物が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激し、増殖を誘導する能力を、ＡＴＰ触媒定量法（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標））を用いて評価した。ＰＢＭＣの活性化は、細胞増殖を駆動するサイトカインの放出を生じる。
増殖データは以下のプロトコルを使用して取得した：ヒトまたはカニクイザル由来のＰ
ＢＭＣ（５×１０５／ウェル）を、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体または対照抗体、及び市販の抗ＣＤ２８抗体（ヒト：２００ｎｇ／ｍＬ、カニクイザル：５００ｎｇ／ｍＬ）の連続希釈物と共に、３７℃で７２時間インキュベートした。細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）を用いて定量し、また細胞生存率の読取りとしての発光は、生存細胞を検出するためのＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して測定した。細胞生存率（刺激されない細胞に対する刺激された細胞の誘導倍率）は、刺激された細胞の発光を刺激されない細胞のベースライン発光で割ることによって決定し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフにした。結果を表１９ならびに図１８Ａ及び１８Ｂに要約する。
Figure 0006831426
表１９及び図１８Ａ〜１８Ｂに示すように、本発明の両方のＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体は、ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣの増殖を誘導した。抗体１は、ほぼ等しい効力でヒト及びカニクイザルＰＢＭＣの増殖を誘導した。対照Ａｂ５は活性を示さなかった。
実施例１４：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性は、インビトロでの活性化Ｔ細胞による細胞死滅を媒介する
ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣを、それぞれフィコール・パックＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ上で、またはリイホライト（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ）哺乳類細胞分離媒体を使用して単離した。単離されたＰＢＭＣ（１×１０６細胞／ｍＬのヒトＰＢＭＣ、または５×１０６細胞／ｍＬのカニクイザルＰＢＭ）は、それぞれ７日間及び２１日間、組換えヒトＩＬ−２（ヒトＰＢＭＣについては３０Ｕ／ｍＬ、カニクイザルＰＢＭＣについては１００Ｕ／ｍＬ）、及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣについては抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣについては抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する完全培地中（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２９２μｇ／ｍＬのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ）の中で活性化された。ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、３７℃において３０分間、８μΜカルセインＡＭで標識し、培地で３回洗浄した。カルセイン標識標的細胞（１０，０００〜２０，０００細胞／ウェル）を、活性化Ｔ細胞（１エフェクター／標的細胞比１０）及び抗体１、抗体４または対照Ａｂ５の連続希釈（ヒト濃度範囲：２ｎＭ〜０．００００３ｎＭ、カニクイザル濃度範囲：６．６ｎＭ〜０．００２ｐＭ）と共に、２００μＬの完全培地中に３７℃において２時間播種した。インキュベーションの後、プレートを遠心分離し、蛍光分析のために上清を半透明の黒色透明底プレートに移した。パーセント細胞傷害性は、次式を用いて計算した。
％細胞傷害性＝（（ＦＳ−ＦＳＲ）／（ＦＭＲ−ＦＳＲ））＊１００％
ここで、ＦＳは被験ウエルからのカルセイン放出であり、ＦＳＲは自発的なカルセイン放出であり、ＦＭＲは、トリトンＸで溶解した細胞からの最大カルセイン放出である。
細胞生存率のＥＣ５０（ＡＴＰ触媒定量）は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定した。細胞溶解（細胞傷害性）は、カルセイン放出により最大放出の割合として測定した。パーセント細胞傷害性は、最大放出及び決定されたＥＣ５０値に比較したときの、観測された放出として決定した。結果を表２０、並びに図１９Ａ（ヒトＴ細胞）及び１９Ｂ（サルＴ細胞）に示す。
Figure 0006831426
表２０に示すように抗体１は、ヒト（図１９Ａ）及びカニクイザル（図１９Ｂ）のＴ細胞について、それぞれ２５．０ｐＭ及び９．１０ｐＭの代表的なＥＣ５０値で、標的細胞殺滅を媒介する。抗体４は、ヒト（図１９Ａ）及びカニクイザル（図１９Ｂ）のＴ細胞について、それぞれ１５．７ｐＭ及び１．７３ｐＭの代表的ＥＣ５０値で、標的細胞の殺滅を媒介した。対照の活性は観察されなかった。
フローサイトメトリーによってヒトＣＤ２０を発現する標的細胞の特異的殺滅をモニターするために、Ｂ１６Ｆ１０．９親マウス骨髄腫細胞（ＣＤ２０を発現しない）及びＣＤ２０を安定に発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０．９細胞（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）を、１μＭの蛍光追跡色素のカルボキシフルオレセイン・ジアセテート・スクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）及びバイオレット細胞追跡剤でそれぞれ標識した。標識した後、細胞を１：１の比率で混合し、３７℃で一晩播種した。これとは別に、ヒトＰＢＭＣを、補充されたＲＰＭＩ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで播種し、３７℃で一晩インキュベートして、接着性マクロファージ、樹状細胞、及び幾つかの単球を枯渇させることによりリンパ球を豊富化させた。翌日、標的細胞を、接着細胞を枯渇させた生来のＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞の比率は４：１）、及び被験ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体またはＩｇＧ１対照抗体５の連続希釈物（濃度範囲：６６．７ｎＭ〜０．２５ｐＭ）と共に３７℃で４８時間、同時インキュベートした。酵素フリーの細胞解離緩衝液を用いて細胞培養プレートから細胞を除去し、ＦＡＣＳによって細胞を分析した。ＦＡＣＳ分析のために、死滅／生存遠赤細胞追跡剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で細胞を染色した。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生きたバイオレット及びＣＦＤＡ−ＳＥで標識された集団に関してゲーティングした。各集団のパーセントは、調整された生存率の計算について次のように報告された：
調整された生存率＝（Ｒ１／Ｒ２）＊１００
ここで、Ｒ１＝［（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）／バイスタンダー細胞（Ｂ１６Ｆ１０．９）］＊１００（但し、抗体の不存在で）
Ｒ２＝同じ比率（但し、被験抗体の存在下で）
Figure 0006831426
ＣＤ３×ＣＤ２０−キメラＦｃ（抗体１）及びＣＤ３×ＣＤ２０−ｗｔＦｃ（抗体４）の両方が、細胞の混合集団におけるＣＤ２０発現標的細胞のみを特異的に死滅させるように（図２０Ａ−Ｂ）、ヒトＴ細胞に指令した。標的細胞の死滅は、二重特異的抗体の存在下でのみ観察され、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞は抗体１（ＥＣ５０：１９．５ｐＭ）及び抗体４（ＥＣ５０：１２．８ｐＭ）によって用量依存的に枯渇された（図２０Ｂ）。試験した最高用量（１０μｇ／ｍＬ）において、ＣＤ２０発現細胞の５％未満が生存していた（図２０Ｂ）。細胞死の証拠は対照Ａｂ５及びＩｇＧ１対照抗体を用いた、親Ｂ１６Ｆ１０．９細胞集団またはＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０集団においては観察されなかった。
実施例１５：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、２０時間ＦＡＣＳインビトロアッセイにおいて、Ｔ細胞上の早期活性化マーカーＣＤ６９を上方調節する
ＣＤ６９＋は、Ｔ細胞が活性化されていることを示す最も初期の誘導性細胞表面マーカーの一つである。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ６９のような特定の細胞表面マーカーの情報調節を調べることによって決定することができる。
全血においてヒトまたはカニクイザルＴ細胞上の早期活性化マーカーＣＤ６９を情報調節するＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の能力が、２０時間インビトロＦＡＣＳアッセイにより決定された。簡単に言えば、Ｔ細胞活性化は、新鮮に単離されたヒトまたはカニクイザルの新鮮に単離された全血（１００μＬ）を、最終容積２００μＬのＲＰＭＩ＋Ｌグルタミン中の抗体１、抗体４または対照Ａｖ５の５倍（ヒト）または１０倍（カニクイザル）連続希釈液（濃度は５０ｎＭ〜０．０００６ｎＭ）の共に、平底の９６ウエルプレーの中において３７℃で２０時間インキュベートすることによって評価される。インキュベーション後、該プレートを１０００ｒｐｍで５分間スピンダウンして血漿を除去した。Ｔ細胞上でのＣＤ６９の上方調節を測定するために、ＣＤ２及びＣＤ６９、ならびにＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９（ヒト）またはＣＤ１６（カニクイザル）の何れかに対して直接結合した抗体を含む表現型カクテルを、４℃で３０分間、前記血液に直接添加した。赤血球を、１．５ｍＬのＰｈａｒｍＬｙｓｅ緩衝液を用い、製造業者の指示に従って１５分間溶解した。細胞を２回洗浄し、２００μＬの冷ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中に再懸濁し、ＢＤ・ＦＡＣＳＣａｎｔｏサイトメーターを用いったフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、最初に生存可能な小ＣＤ４５＋リンパ球上でゲーティングし、次いで、ＣＤ１９−／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヒト）またはＣＤ１６−／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞（カニクイザル）上でゲーティングすることにより同定された。
総ＣＤ２＋エフェクター細胞のうちの、活性化（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞の割合が報告されている。表２２及び図２１を参照されたい。この結果は、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗
体が、初期活性化マーカーＣＤ６９によって検出されたように、Ｔ細胞を顕著に活性化したことを示している
Figure 0006831426
実施例１６：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、Ｔ細胞の標的細胞とのクラスタリングを誘導する
細胞クラスタリングフォーマットを使用して、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体は、その二重特異性結合性アームを介して、Ｔ細胞を標的細胞（ＣＤ２０＋細胞）と架橋させることを決定した。エフェクター細胞をＣＦＳＥで２４時間前染色し、ＣＤ２０＋細胞をバイオレット細胞追跡剤で前染色し、無関係の対照抗体（対照抗体５、無関係なＩｇＧ１アイソタイプ抗体）とのインキュベーションの後に、別々の象限へとゲーティングした。図２２Ａを参照されたい：これは無関係の抗体での治療のための細胞混合物中にクラスタリング（二重染色）は存在しないことを示す。ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体とのインキュベーション後、細胞クラスターは、ＣＦＳＥ及びバイオレットの両方での染色に起因して出現する（図２２Ｂ参照、太字の四角で協調されているように、散乱プロット上の左上象限）。
実施例１７：ＣＤ３＋細胞上での阻害的Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１マーカーの発現
Ｔ細胞の機能不全または枯渇は、腫瘍を有する宿主において起きる。Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１受容体は、慢性疾患状態において消耗したＴ細胞のマーカーとして同定されている。研究者であるＳａｋｕｉｓｈｉ、Ｋら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７（１０）：２１８７−２１９４、２０１０年）によると、Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１について陽性である腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）（Ｔｉｍ−３＋ＰＤ−１＋ＴＩＬ）は、増殖障害、並びにＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ−γを産生する障害により定義されるように、最も深刻な枯渇した表現型を示す。
ＣＤ３陽性細胞は、ＨＬＡ適合性Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びヒトＰＢＭＣを皮下に同時移植されたＮＳＧマウスの血液及び腫瘍から抽出された（例えば、上記の実施例１２Ｂ参照）。簡単に言えば、腫瘍は、治療の１５日前に宿主において樹立され、次いでこれらマウスは腫瘍のサイズに基づいて二つの治療群に分けられた（実施例１２Ｂを参照されたい）。血液は、第９日に、各研究群（即ち、第１群：〜２００−４００ｍｍ３、または第２群：〜５００−９００ｍｍ３）から治療（二重特異的Ａｂ）されたマウス及び未治療マウスから抜き取った。１５００ｍｍ３に達する腫瘍を有する未治療（担体または対照Ａｂ）のマウスは、研究の終了時点で屠殺し、これらの腫瘍をＰＤ１及びＴｍ−３の発現について試験した。
このＴ細胞実験を循環させるために、Ｔｉｍ−３またはＰＤ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
から商業的に入手可能）の何れかに直接標識された抗体を使用したマーカー識別のために、生存するＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞画分が選択された。Ｔｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞は、未治療の動物の血液中における循環Ｔ細胞の主要な画分であった。しかし、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体（抗体１）で治療された動物の血液中のＴ細胞は、Ｔｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞の低い画分を示した。
未治療の宿主から腫瘍細胞を分離し、生存細胞を染色した。生存単一細胞についてＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞画分についてソートし、次いでこれをＴｉｍ−３またはＰＤ−１発現について試験した。
我々は、阻害性受容体のＴｉｍ−３及びＰＤ−１が、実施例１２Ｂに記載された実験の際に未治療マスのＮＳＧ Ｂ細胞リンパ腫におけるＣＤ３＋ＴＩＬ上に発現されたこと、及びＴｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞がＴ細胞浸潤性腫瘍の支配的な画分であることを発見した。
実施例１８：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体での治療は、樹立されたＲａｊｉ腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける抗ＣＤ２０＋抗体よりも効果的である
ＮＳＧマウスにおいて樹立された腫瘍を減少させるうえでの、選択された抗ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体の有効性を評価した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒｖｎｕｌｌマウス、ジャクソン研究所）を、Ｒａｊｉ腫瘍細胞（２×１０６）及びヒトＰＢＭＣ（５×１０５）（第−１４日）と同時皮下移植した（上記実施例１２Ｂと同様）。
ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性Ａｂ１（０．４ｍｇ／ｋｇ、２回／週、ｉｐで投与）は、樹立されたＲａｊｉ腫瘍を抑制する上でＣＤ１９×ＣＤ３ＢｉＴＥ（０．５ｍｇ／ｋｇ；５回／週、ｉｐで投与）に匹敵し（図２３）、またリツキシマブ療法（８ｍｇ／ｋｇ、５回／週、ｉｐで投与）よりも優れており（図２４）、それによって、Ａｂ１は体積が０．５ｃｍを超える大きなリンパ腫塊をもった哺乳動物を治療する上で効果的であることを示した。
実施例１９：ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異的抗体でのＣＤ２０＋メラノーマの治療
研究者等は、このようなＣＤ２０＋メラノーマ細胞のような、患者におけるメラノーマ癌の特定の亜集団は、腫瘍開始特性及び疾患再発の高いリスクを表す可能性がある（Ｐｉｎｅら．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０（５）：１０５６−１０６２，２０１２，ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ２１）。ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異的抗体Ａｂ１は、それが免疫コンピテントなマウスにおいてｈＣＤ２０形質導入Ｂ１６Ｆ１０．９（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）腫瘍増殖を有意に遅延させたので、ＣＤ２０を発現するＢ１６Ｆ１０．９腫瘍細胞に対して強力な活性を示した。
ＣＤ３についてヒト化されたマウス（ヒト化ＣＤ３γεマウス）をＣＤ２０遺伝子座においてヒト化し、該マウスが両方のヒト化タンパク質を発現するようにした。ヒト化ＣＤ３／ＣＤ２０マウスに、ヒトＣＤ２０を形質導入した２×１０５個のＢ１６Ｆ１０．９メラノーマ腫瘍細胞（Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓ／Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｎ；デューク大学）を皮下に移植した。マウスは、第０日（腫瘍移植の日）から、担体（ＰＢＳ；ｎ＝５）、または０．４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（無関係の抗原に対する対照抗体；ｎ＝５）、または０．００４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１（ｎ＝５）の何れかを腹腔内に用いて治療された。図２５Ａに示されるようにして腫瘍体積を測定した。腫瘍が１５００ｍｍ３超の堆積に達したときに、マウスを屠殺した。図２５Ａに示すように、Ａｂ１での治療は、腫瘍移植と同時に開始したときに腫瘍増殖を遅延させた。
別の実験では、既に樹立された腫瘍における腫瘍増殖を、Ａｂ１が阻害する能力も試験した（図２５Ｂ）。ヒトＣＤ３／ＣＤ２０マウスに、ヒトＣＤ２０を発現している２×１０５個のＢ１６Ｆ１０．９メラノーマ腫瘍細胞を皮下に移植した。腫瘍移植後の第１０日に、腫瘍サイズに基づいてマウスをランダム化し、以下のように各群５匹のマウスでなる治療群に編成した：担体（ＰＢＳ）；４ｍｇ／ｋｇの対照Ａｂ５（無関係な抗原に対する対照抗体）；４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１；または０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ。全てのマウスは、腹腔内で週２回治療された。腫瘍が１５００ｍｍ３超の堆積に達したときにマウスを屠殺した。。図２５Ｂに示すように。Ａｂ１を用いた治療は、既に樹立された腫瘍の腫瘍増殖を遅遅延させ、Ａｂ１はＣＤ２０を発現するＢ１６Ｆ１０．９メラノーマ細胞に対して強力な活性を示すことを実証した。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、特許請求の範囲に記載した範囲内にあるものであることが意図されるものである。

Claims (19)

  1. ヒトＣＤ３に結合する第一の抗原結合性ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第二の抗原結合性ドメイン、及び第一及び第二の抗原結合性ドメインのそれぞれに繋がれたキメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む二重特異的抗体であって、
    ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合性ドメイン（Ａ１）は、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、
    ここで、
    （ｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、そして
    （ｖｉ）Ａ１−ＬＣＤＲ３は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
    ヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合性ドメイン（Ａ２）は、三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、
    ここで、
    （ｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、そして
    （ｖｉ）Ａ２−ＬＣＤＲ３は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
    キメラ重鎖定常領域は：
    （ｉ）位置２１６〜２２７（ＥＵ番号付け）からのヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４上側ヒンジ部のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）位置２２８〜２３６（ＥＵ番号付け）からのＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５２
    ）を含むヒトＩｇＧ２下側ヒンジ部アミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１・ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ１・ＣＨ３ドメイン、又はヒトＩｇＧ４・ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ４・ＣＨ３ドメイン、及び
    （ｉｖ）位置２３７〜３４０（ＥＵ番号付け）のヒトＩｇＧ４・ＣＨ２ドメインアミノ酸配列、を含み、そして、
    前記二重特異的抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定したときに、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの結合に比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＡについてより高い結合親和性を示し、ヒトＦｃγＲＩ及びヒトＦｃγＲＩＩＩに対して検出可能な結合親和性を僅かしか、又は全く示さない、前記二重特異的抗体。
  2. 前記二重特異的抗体は：
    （ａ）インビトロ細胞傷害性アッセイで測定したときに、野生型Ｆｃドメインを含む抗体に比較して低下した抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を示すか；
    （ｂ）無視できるＡＤＣＣを示すか、又は検出可能なＡＤＣＣを示さないか；
    （ｃ）インビトロ細胞傷害性アッセイで測定したときに、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して減少した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示すか；
    （ｄ）インビトロアッセイでの細胞溶解の測定により決定したときに、５０％未満の細胞傷害性を示すか；
    （ｅ）無視できるＣＤＣを示すか、又は検出可能なＣＤＣを示さないか；
    （ｆ）野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して、ＮＫ細胞又はマクロファージのようなＦｃ受容体を有する細胞の減少したＴ細胞媒介性死滅を誘導するか；又は
    （ｇ）野生型Ｆｃドメインを備えた抗体に比較して、ＮＫ細胞又はマクロファージのようなＦｃ受容体を有する細胞により媒介される減少したＴ細胞死滅を誘導する、請求項１に記載の二重特異的抗体。
  3. 前記二重特異的抗体は：
    （ａ）キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５３）；又は
    （ｂ）キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５４）を含む、請求項１又は２に記載の二重特異的抗体。
  4. キメラ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１・ＣＨ１ドメイン、配列番号５３のキメラヒンジのアミノ酸配列、ヒトＩｇＧ４・ＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ１・ＣＨ３ドメインを含む、請求項３に記載の二重特異的抗体。
  5. キメラ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４・ＣＨ１ドメイン、配列番号５４のキメラヒンジのアミノ酸配列、ヒトＩｇＧ４・ＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ４・ＣＨ３ドメインを含む、請求項３に記載の二重特異的抗体。
  6. ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第一の抗原結合性ドメインは、配列番号１０を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列、及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を具備する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  7. ヒトＣＤ２０に特異的に結合する前記第二の抗原結合性ドメインは、配列番号２を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列、及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を具備する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  8. 配列番号２６のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖定常領域を具備する、請求項１〜３、又は５〜７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  9. 配列番号２８のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖定常領域を具備する、請求項１〜３、又は５〜７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  10. 配列番号３０のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖定常領域を具備する、請求項１〜４、６又は７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  11. 配列番号３２のアミノ酸配列を含むキメラ重鎖定常領域を具備する、請求項１〜４、６又は７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  12. 配列番号２６のアミノ酸配列を含む第一の重鎖定常領域と配列番号２８のアミノ酸配列を含む第二の重鎖定常領域とを含む、請求項１〜３、又は５〜７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  13. 配列番号３０のアミノ酸配列を含む第一の重鎖定常領域と配列番号３２のアミノ酸配列を含む第二の重鎖定常領域とを含む、請求項１〜４、６又は７のいずれか１項に記載の二重特異的抗体。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の二重特異的抗体を含む、医薬に使用するための医薬組成物。
  15. 被験者におけるＢ細胞癌の治療又は緩和において使用するための、請求項１２又は１３に記載の二重特異的抗体を含む医薬組成物。
  16. 前記Ｂ細胞癌は濾胞性リンパ腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記Ｂ細胞癌は瀰漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. 前記Ｂ細胞癌はマントル細胞リンパ腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  19. 前記Ｂ細胞癌は辺縁帯リンパ腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
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