CN115093481A - 新型双特异性cd3/cd20多肽复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的双特异性抗CD3xCD20多肽复合物、生产所述双特异性抗CD3xCD20多肽复合物的方法、使用所述双特异性抗CD3xCD20多肽复合物治疗疾病或病况的方法、编码所述双特异性抗CD3xCD20多肽复合物的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体和宿主细胞和包含所述双特异性抗CD3xCD20多肽复合物的组合物和药物组合物。

Description

新型双特异性CD3/CD20多肽复合物
本申请是基于申请号为202010074264.7，申请日为2020年01月22日，发明名称为“新型双特异性CD3/CD20多肽复合物”的中国专利申请的分案申请。
优先权信息
本申请要求于2019年1月28日提交的中国发明专利申请201910080405.3和于2019年1月28日提交的PCT申请PCT/CN2019/073418的优先权，所述申请通过引用完全结合在本公开中。
序列表
本申请同时提交了电子形式的序列表文件。序列表的完整内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明总体上涉及双特异性抗CD3xCD20多肽复合物。
背景技术
双特异性抗体是一类新的治疗性抗体。它们可以结合两个不同的靶标或者一个靶标上的两个不同的表位，从而产生优于单个抗体作用的加成或协同作用。人们对新的双特异性形式的设计(如DVD-Ig、CrossMab、BiTE等)做了许多抗体工程化的尝试(Spiess等，Molecular Immunology，67(2)，pp.95–106(2015))。然而，这些双特异抗体形式都有潜在的稳定性、溶解性、半衰期短和免疫原性等方面的限制。
在这些双特异性抗体形式中，一种IgG样的双特异性抗体是通用形式：一条臂结合至靶标A，且另一条臂结合至靶标B。结构上其由抗体A的一半和抗体B的一半构成，具有与天然IgG相似的大小和形状。为了便于下游开发，期望这种双特异性分子可以像正常IgG一样容易地以高表达水平从单个宿主细胞产生和正确组装。遗憾地是，无法自动控制同源轻-重链的配对以及两个不同的半抗体的组装。随机方式的各种错配都可能导致显著的产物异质性。
通过向Fc区中引入突变，如“把手入孔”(knobs-into-holes)(Ridgway等，ProteinEngineering，9(7)，pp.617–21(1996)；Merchant等，Nature Biotechnology，16(7)，pp.677–681(1998))、静电(Gunasekaran等，Journal of Biological Chemistry，285(25)，pp.19637–19646(2010))或负状态设计(Von Kreudenstein等，mAbs，5(5)，pp.646–654(2013)；Leaver-Fay等，Structure，24(4)，pp.641–651(2016))，实现了两个不同的重链的异源二聚组装。然而，单个抗体各自的轻-重链的选择性配对仍然具有挑战性。轻-重链之间的界面包含可变结构域(VH-VL)和恒定结构域(CH1-CL)。已有数种方案应用于正交界面的设计，以便于同源配对。Roche交换了CH1和CL的结构域，并且创造了CrossMab平台(Schaefer等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America，108(27)，pp.11187–11192(2011))，MedImmune替代性地引入了二硫键(Mazor等，mAbs，7(2)，pp.377–389(2015))，Amgen在CH1-CL区进一步做了静电作用修饰(Liu等，Journal of Biological Chemistry，290(12)，pp.7535–7562(2015))，并且Lilly(Lewis等，Nature Biotechnology，32(2)，pp.191–198(2014))和Genentech(Dillon等，mAbs，9(2)，pp.213–230(2017))在可变结构域和恒定结构域均引入了突变。
CD20是B淋巴细胞表面表达的活化的糖基化磷酸蛋白。FDA在1997年核准的使用利妥昔单抗(Rituximab，即一种嵌合的抗CD20单克隆抗体(以下也称为“mAb”))的抗体治疗代表过去30年间对淋巴增生性病症治疗的最重要的进展之一。尤其是与多种化疗/放疗方案联合，利妥昔单抗显著改善B细胞淋巴瘤和慢性淋巴样淋巴瘤(CLL)患者的生存统计学各项指标(Chu TW,Zhang R,Yang J,et al.ATwo-Step Pretargeted Nanotherapy for CD20Crosslinking May Achieve Superior Anti-Lymphoma Efficacy toRituximab.Theranostics.2015Apr 26；5(8):834-46)。
在过去的三十年间，随着对CD20的蛋白质结构和分子功能研究的重大进展，产生了新一代的靶向CD20治疗性抗体并核准用于临床应用。奥法木单抗(Ofatumumab)是全人抗CD20治疗性抗体，与利妥昔单抗相比，其靶向更邻近细胞表面的不同CD20表位，导致比利妥昔单抗更慢的解离速率和更稳定的结合(Laurenti L,Innocenti I,Autore F,et al.Newdevelopments in the management of chronic lymphocytic leukemia:role ofofatumumab.Onco Targets Ther.2016Jan 20；9:421-9)。然而，临床上新一代的抗CD20单克隆抗体在效力和安全性方面并不显著优于利妥昔单抗。对于抗CD20 mAb治疗，几乎所有滤泡性淋巴瘤患者和CLL患者以及约一半侵袭性B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)患者仍然将发生疾病复发或再发生(Lim SH,Beers SA,French RR,et al.Anti-CD20monoclonal antibodies:historical and future perspectives.Haematologica.2010Jan；95(1):135-43)。因此，对于开发具有不同作用机制(MOA)的新的B细胞靶向治疗剂策略，如双特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗，仍然存在迫切的医学需要。
T细胞CD3受体是由四条不同的链(CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链)组成的蛋白质复合物。这四条链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和胞内ζ链缔合从而在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ链和CD3分子组成TCR复合物，其中TCR作为亚基用于识别和结合抗原，CD3作为亚基负责将抗原刺激传递至信号传导途径，并最终调节T细胞活性。CD3蛋白几乎存在于所有T细胞中。CD3-TCR复合物调节固有和适应性免疫应答中的T细胞功能，以及细胞和体液免疫功能，包括通过细胞毒性作用消除病原生物和控制肿瘤生长。靶向人CD3的小鼠单克隆抗体，例如OKT3(Kung等，Science，206：347-9(1979))，是开发用于治疗的第一代CD3抗体。尽管OKT3具有强免疫抑制效力，但其临床应用因其免疫原性和促有丝分裂潜能相关的严重副作用而受到阻碍(Chatenoud，Nature Reviews，3：123-132(2003))。OKT3诱导抗抗体反应，促进其自身的快速清除和中和(Chatenoud等，Eur.J.Immunol.，137：830-8(1982))。另外，OKT3在体内诱导细胞因子的大规模释放(Hirsch等，J.Immunol，142：737-43(1989))。这些严重的副作用限制了OKT3在临床上的应用。
靶向CD3和CD20的双特异性抗体可以同时结合T细胞和B细胞。一旦双特异性抗体同时与CD3阳性T细胞和CD20阳性B细胞结合就会促进溶细胞突触的形成，细胞毒性T细胞从而释放穿孔素和颗粒酶诱导B细胞的细胞凋亡。
综上所述，目前对靶向CD3和CD20的新型的有效的双特异性分子的发明仍然有很大的医疗需求，以便更好地用于治疗包括肿瘤在内与靶向CD20相关的疾病。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，
以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1、13、25、37和49的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2、14、26、38和50的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3、15、27、39和51的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4、16、28、40和52的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5、17、29、41和53的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6、18、30、42和54的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7、19、31、43和55的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8、20、32、44和56的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9、21、33、45和57的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10、22、34、46和58的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11、23、35、47和59的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12、24、36、48和60的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物的抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有选自SEQ ID NO：61、63、65、67和69的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：62、64、66、68和70的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物的抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含含有SEQ ID NO：71、73、75、77和79的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：72、74、76、78和80的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，和SEQ ID NO:84。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQID NO:89，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:91，和SEQ ID NO:92。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽序列的组合：SEQID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100。
在某些实施方案中，对SEQ ID NO：92所示的多肽链的第193、182、203、206或207位的天然糖基化位点中的一个或多个氨基酸进行了修饰，优选对第193位氨基酸进行修饰。在本发明的某些方案中，所述的修饰包括S193X、S182X、S203X、S206X、S207X中的一个或多个，其中X为丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)以外的任意氨基酸。在本发明的某些优选实施方案中，所述的修饰为S193X，其中X为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)或缬氨酸(Val)。在本发明的某些实施方案中，突变消除的是O-糖基化位点，所述O-糖基化类型为Core1构型的O-糖，结构式为NeuAc-Gal-GalNAc或NeuAc-Gal-(NeuAc)GalNAc。
在一个方面，本发明提供一种双特异性多肽复合物，其具有下述一种或多种特性：
(a)以适度的亲和力同时特异性结合人CD3和CD20蛋白；
(b)特异性结合人CD3蛋白和/或食蟹猴CD3蛋白；
(c)特异性结合人CD20蛋白和/或食蟹猴CD20蛋白；
(d)在体外细胞功能学实验中，与其他靶向CD3和CD20的双特异性抗体相比，能够诱导更有效的T细胞活化，并且能更有效地及特异性地杀伤CD20阳性的肿瘤细胞，同时较少地释放细胞因子；
(e)具有良好的热稳定性并且在食蟹猴或人血清中稳定；
(f)与其他靶向CD3和CD20的双特异性抗体相比，提供优异的体内抗肿瘤效果；以及
(g)在食蟹猴中显示了有效的B细胞清除效果及良好的半衰期，并且没有伴随的细胞因子风暴等不良反应。
在一个方面，本发明提供一种缀合物，其包含缀合至一个部分的本发明所提供的双特异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明所提供的双特异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种分离的载体，其包含本发明所提供的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明所提供的分离的多核苷酸，或本发明所提供的分离的载体。
在一个方面，本发明提供一种表达本发明所提供的双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括在所述双特异性多肽复合物被表达的条件下培养本发明所提供的宿主细胞。
在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明所提供的双特异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所提供的双特异性多肽复合物，以及药学上可接受的运载体。
在一个方面，本发明提供一种在有需要的受试者中治疗与CD20相关的疾病或病况的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本发明所提供的双特异性多肽复合物。在某些实施方式中，当所述第一抗原和所述第二抗原均被调节时，所述疾病或病况可以被缓解、消除、治疗或预防。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结构域，并且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域，其中所述第一和所述第二二聚化结构域是相缔合的。在某些实施方式中，所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以阻碍同源二聚化和/或促成异源二聚化的方式相缔合。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
在另一个方面，本发明提供一种用于检测、诊断、预后或治疗疾病或病况的试剂盒，其包含本发明所提供的多肽复合物。
在另一个方面，本发明提供本发明所述的双特异性多肽复合物在制备用于治疗受试者中与CD20相关的疾病或病况的药物组合物的用途。
在一个实施方案中，所述与CD20相关的疾病或病况是癌症，优选地，所述癌症选自，但不限于，淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
在一个实施方案中，所述与CD20相关的疾病或病况是B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
综上所述，本发明提供下述技术方案：
1.一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1、13、25、37和49的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2、14、26、38和50的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3、15、27、39和51的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4、16、28、40和52的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5、17、29、41和53的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6、18、30、42和54的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7、19、31、43和55的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8、20、32、44和56的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9、21、33、45和57的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10、22、34、46和58的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11、23、35、47和59的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12、24、36、48和60的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
2.根据实施方案1所述的双特异性多肽复合物，其中所述抗CD3结合部分包含含有选自SEQ ID NO：61、63、65、67和69的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有选自SEQ IDNO：62、64、66、68和70的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
3.前述实施方案中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述抗CD20结合部分包含含有SEQ ID NO：71、73、75、77和79的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：72、74、76、78和80的轻链可变结构域序列。
4.前述实施方案中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述第一抗原结合部分与第一二聚化结构域连接，所述第二抗原结合部分与第二二聚化结构域连接，其中所述第一和第二二聚化结构域是相缔合的。
5.根据实施方案4所述的双特异性多肽复合物，其中所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的。
6.根据实施方案5所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
7.根据实施方案6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体CH2结构域，和/或抗体CH3结构域。
8.根据实施方案6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一二聚化结构域在第三接合结构域可操作地连接至所述第一TCR恒定区(C1)。
9.根据实施方案6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
10.前述实施方案中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。
11.根据实施方案10所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
12.前述实施方案中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
13.根据实施方案1-11中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87和SEQID NO：88。
14.根据实施方案1-11中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91和SEQID NO：92。
15.根据实施方案1-11中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95和SEQID NO：96。
16.根据实施方案1-11中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99和SEQID NO：100。
17.根据实施方案14所述的双特异性多肽复合物，其中SEQ ID NO：92所示的多肽选自第193、182、203、206或207位的一个或多个氨基酸被修饰为除丝氨酸和苏氨酸以外的任意氨基酸，从而消除糖基化位点，优选地，第193位的氨基酸被修饰。
18.根据实施方案17所述的双特异性多肽复合物，其中SEQ ID NO：92所示的多肽第193位氨基酸被修饰为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸。
19.一种缀合物，其包含缀合至一个部分的根据前述任意一项实施方案所述的双特异性多肽复合物。
20.一种分离的多核苷酸，其编码根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
21.一种分离的载体，其包含根据实施方案20所述的多核苷酸。
22.一种宿主细胞，其包含根据实施方案20所述的分离的多核苷酸，或根据实施方案21所述的分离的载体。
23.一种表达根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括在所述双特异性多肽复合物被表达的条件下培养根据实施方案22所述的宿主细胞。
24.一种生产双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括：
a)将一个或多个编码根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物的多核苷酸引入宿主细胞；和
b)使所述宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。
25.根据实施方案23-24中任意一项所述的方法，所述方法进一步包括分离所述双特异性多肽复合物。
26.一种组合物，其包含根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
27.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物，以及药学上可接受的运载体。
28.根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物在制备用于治疗受试者中与CD20相关的疾病或病况的药物组合物的用途。
29.根据实施方案28所述的用途，其中所述疾病或病况是癌症。
30根据实施方案29所述的用途，其中所述癌症是淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
31.根据实施方案28所述的用途，其中所述疾病或病况是B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
32.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-18中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
33.根据实施方案32所述的试剂盒，其用于检测、诊断、预后或治疗CD20相关疾病或病症。
本发明的前述和其他特征以及优势在下文引用附图进行的对几个实施方式的详述中将变得明显。
附图说明
图1呈现了所研究的抗体形式的示意图，其中“E17R-1”、“F16-1”和“F17R-1”分别示意性表示双特异性抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP、W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP和W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP的形式，“F18R-1”示意性表示双特异性抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP和W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP的形式。在本公开的上下文中，双特异性抗体命名中的“U”是指抗CD20抗体或抗CD20结合部分，双特异性抗体命名中的“T”是指抗CD3抗体或抗CD3结合部分。“T”的恒定区(CL和CH1)被TCR的恒定结构域取代以设计与常规抗体正交的独特的轻-重链界面。将TCR修饰的“T”和天然的“U”与Fc结构域中的“把手入孔”突变共同用于设计双特异性抗体形式“E17R-1”、“F16-1”、“F17R-1”和“F18R-1”。
图2显示了通过FACS检测的靶标结合：(A)本公开的双特异性抗体(WBP3278 BsAb)与Jurkat细胞的结合检测，(B)本公开的双特异性抗体(WBP3278 BsAb)与Raji细胞的结合检测。
图3显示了通过FACS检测的同时双靶标结合。
图4显示了T细胞杀伤。
图5A和5B分别显示了以CD25表达和CD69表达所示的T细胞激活。
图6显示了CD4+T细胞的IL-2(A)和TNF-α(B)释放。
图7显示了血清稳定性的结果。
图8显示了本发明的BsAb在体内治疗性治疗模型中的剂量依赖性的抗肿瘤活性。
图9显示了对首次用于免疫的雄性食蟹猴施用WBP3278 lead Ab(即，W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4)后外周血循环B细胞的消耗。
图10A、10B和10C显示了用WBP3278 lead Ab治疗后外周血循环T细胞水平的变化。
图11显示了用WBP3278 lead Ab治疗后循环细胞因子水平的变化。
图12显示了WBP3278 lead Ab的血清浓度随时间的变化。
具体实施方式
本发明的以下描述只为说明本发明的多种实施方式。
定义
冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代该冠词的语法对象的一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)。举例来说，“一种/个多肽复合物”指一种/个多肽复合物或多于一种/个多肽复合物。
用于本发明的术语“约”或“大约”是指与参照量、水平、值、数量、频率、百分比、维度、大小、量、重量或长度相差30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的定量、水平、值、数量、频率、百分比、维度、大小、量、重量或长度。在特定实施方式中，当术语“约”或“大约”位于数值之前时，表示所述值加上或减去15％、10％、5％或1％的范围。
在本申请全文中，除非上下文另有规定，词语“包含”、“包括”和“含有”将被理解为表示包括所述的步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。“由……组成”所表示的是包括并且限于短语“由……组成”之后的内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是需要的或必需的，并且没有其他要素可存在。“基本由……组成”所表示的是包括列于此短语之后的任意要素，并且限于不妨碍或有助于所列的要素的如在本申请中详述的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本由……组成”表示所列出的要素是需要的或必需的，但其他要素是可选的并可取决于其是否影响所列出的要素的活性或作用而存在或不存在。
在本申请全文中提及的“一个实施方式”、“实施方式”、“特定实施方式”、“相关实施方式”、“某种实施方式”、“另外的实施方式”或“进一步的实施方式”或其组合表示所描述的与所述实施方式相关的特定特征、结构或特性包含于本申请的至少一个实施方式中。因此，在本说明书全文各处出现前述用语未必都指同一实施方式。此外，所述特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方式中以任意适宜方式组合。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本申请中可互换使用，其指氨基酸残基的聚合物，或多个氨基酸残基聚合物的集合体。这些术语应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及之后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即α碳结合至氢、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、去甲亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基(例如去甲亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。α-碳是指附接至官能团(如羰基)的第一个碳原子。β碳是指连接至α碳的第二个碳原子，并且此体系依希腊字母的字母排列顺序继续命名碳原子。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的化学化合物。术语“蛋白”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。多肽序列通常记述为多肽序列的左手端为氨基末端(N末端)；多肽序列的右手端为羧基末端(C末端)。用于本申请的“多肽复合物”是指包含一个或多个与实现某些功能相关的多肽的复合物。在某些实施方式中，所述多肽是免疫相关的。
本发明中使用的术语“抗体”涵盖任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一个可变区(“HCVR”)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成，而每条轻链由一个可变区(“LCVR”)以及一个恒定区(CL)组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的主干由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变环，称互补决定区(CDR)(轻(L)链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重(H)链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。抗体的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，Bethesda,Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。HCVR和LCVR各包含4个FR，并且CDR和FR自氨基端至羧基端依以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或同种型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
用于本申请的术语“可变结构域”用于抗体时，是指包含一个或多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变结构域可包含完整可变区(如HCVR或LCVR)，其也可能包含小于完整可变区但仍保持与抗原结合或形成抗原结合位点的能力。
用于本申请的术语“抗原结合部分”是指由含有一个或多个CDR的抗体部分所形成的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段。抗原结合部分的例子包含但不限于可变结构域、可变区、双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domainantibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合部分可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合部分可包含移接至来自一个或多个不同的人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。抗原结合部分的更多详细的形式记述于Spiess等，2015(同上)和Brinkman等，mAbs，9(2)，pp.182–212(2017)，其全部内容通过引用并入本文。
抗体的“Fab”是指由一条轻链(包含可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。在某些实施方式中，轻链和重链的恒定区均由TCR恒定区取代。
“Fab'”是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。
抗体的“fragment difficult(Fd)”是指可以与轻链组合以形成Fab的重链片段氨基末端的半段。
抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二(CH2)、第三(CH3)恒定区经二硫键结合第二重链的第二和第三恒定区而组成的抗体的部分。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能，如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。
就抗体而言的“铰链区”包含将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包含大约25个氨基酸残基且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。
用于本申请的术语“CH2域”是指包含重链分子自IgG抗体的例如约氨基酸244延伸至氨基酸360的部分，使用常规编号方案(氨基酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat,E.等，U.S.Department of Health and Human Services(1983))。
“CH3结构域”自IgG分子的CH2结构域延伸至C末端，并且包含大约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM，进一步包含CH4区。
抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合一条重链的可变区组成。提供了数种Fv设计，包含dsFv，其中两个结构域之间的连接通过引入的二硫键增强；并且可以使用肽连接子将两个结构域结合在一起成为单个多肽而形成scFv。已产生了含有重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链的可变结构域连接至对应的免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域和恒定结构域的Fv构建体。还已将Fv多聚化以形成双功能抗体和三功能抗体(Maynard等，Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000))。
“ScFab”是指具有经由多肽连接子将Fd连接至轻链的融合多肽，产生了单链Fab片段(scFab)。
“TriFab”是指由3个具有Fab功能的单位组成的三价、双特异性的融合蛋白。TriFab容纳两个普通Fab融合至不对称的类Fab部分。
“Fab-Fab”是指通过将第一Fab臂的Fd链融合至第二Fab臂的Fd链的N末端形成的融合蛋白。
“Fab-Fv”是指通过将HCVR融合至Fd链的C末端，且将LCVR融合至轻链的C末端形成的融合蛋白。“Fab-dsFv”分子可以通过在HCVR结构域和LCVR结构域间引入域间二硫键而形成。
“MAb-Fv”或“IgG-Fv”是指通过HCVR结构域融合至一条Fc链的C末端和LCVR结构域单独表达或融合至另一条Fc链的C末端而形成的融合蛋白，从而产生双特异性、三价的IgG-Fv(mAb-Fv)融合蛋白，其Fv通过域间二硫键稳定。
“ScFab-Fc-scFv2”和“ScFab-Fc-scFv”是指单链Fab与Fc和二硫键稳定的Fv结构域融合形成的融合蛋白。
“附接IgG”是指Fab臂融合至IgG以形成双特异性(Fab)2-Fc的形式的融合蛋白。其可以形成Fab融合至IgG分子的C末端或N末端的“IgG-Fab”或“Fab-IgG”，无论是否存在连接子。在某些实施方式中，附接IgG可以被进一步修饰为IgG-Fab4的形式(参见Brinkman等，2017，同上)。
“DVD-Ig”是指双可变结构域抗体，其通过将第二特异性的另外的HCVR结构域和LCVR结构域融合至IgG重链和轻链形成。“CODV-Ig”是指其中两个HCVR和两个LCVR结构域以允许可变HCVR-LCVR结构域交叉配对的方式连接的相关形式，其(自N至C末端)以HCVRA-HCVRB和LCVRB-LCVRA的顺序，或以HCVRB-HCVRA和LCVRA-LCVRB的顺序排列。
“CrossMab”是指将未经修饰的轻链与对应的未经修饰的重链配对，以及将经修饰的轻链与对应的经修饰的重链配对，从而产生轻链中错配减少的抗体的技术。
“BiTE”是双特异性的T-细胞参与分子，包含具有LCVR-HCVR方向上的第一抗原特异性的第一scFv连接至具有HCVR-LCVR方向上的第二抗原特异性的第二scFv。
“WuXiBody”是包含可溶性嵌合蛋白的双特异性抗体，其具有抗体的可变结构域和TCR的恒定结构域，其中TCR恒定结构域的亚基(例如α和β结构域)通过工程化的二硫键连接。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守取代可认为或可不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN、BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，还可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可使用所述工具的默认参数或可根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选适宜的算法。
用于本申请的“抗原”或“Ag”是指可以在细胞培养或在动物体内刺激产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物、肽、多肽、蛋白或物质，包含加入细胞培养物(如杂交瘤)中，或经注射或吸收进入动物的组合物(如包含癌特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物(如抗体，包含由异源抗原诱导的产物)反应。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原中与结合剂(如抗体)结合的区域。表位可以形成自连续的氨基酸(也称为线性或顺序表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的非连续的氨基酸(也称为构型或构象表位)。形成自连续的氨基酸的表位通常在蛋白上沿着一级氨基酸残基线性排列，且连续的氨基酸的小段可以由与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原消化，或在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位在一个独特的空间构象中通常包含至少3个，更常见地包含至少5个、约7个或约8-10个氨基酸。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请所提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物与抗原特异性结合，并且其结合亲和力(KD)≤10-6M(例如≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤2×10-9M、≤10-9M或≤10-10M)。用于本申请的KD是指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，可通过使用表面等离子共振法，例如使用如Biacore的仪器确定。
术语“可操作地连接”或“可操作地连接的”是指两个或更多个目标生物学序列的以使其处于使其以目的方式作用的关系的方式并列，无论是否存在间隔子或接头。当用于多肽时，该术语旨在表示多肽序列以使所连接的产物具有目的生物学功能的方式连接。例如，可将抗体可变区可操作地连接至恒定区，以形成具有抗原结合活性的稳定产物。所述术语还可用于多核苷酸。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接至调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，该术语旨在表示所述多核苷酸序列以允许所述多肽由所述多核苷酸调控表达的方式连接。
术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白)时，是指例如通过化学键合或重组手段，将两个或更多个氨基酸序列组合成为非天然存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通过两个编码多核苷酸序列的基因重组产生，并且可以通过将含有重组的多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
用于本申请的术语“间隔子”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基，或长度为5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基的通过肽键连接且用于连接一个或多个多肽的人造氨基酸序列。间隔子可具有或可不具有二级结构。间隔子序列是本领域公知的，参见例如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)；Poljak等，Structure 2:1121-1123(1994)。可以使用本领域公知的任意适宜的间隔子。
术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗原或其表位。
用于本申请的术语“取代”在用于氨基酸残基时是指在肽、多肽或蛋白中将天然存在的或引入的一个或多个氨基酸用另一个取代。多肽中的取代可导致多肽功能的减弱、增强或消除。
取代还可以是“保守取代”，其针对氨基酸序列时是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的不同氨基酸残基取代，或者对那些对多肽的活性并非至关重要的氨基酸的取代。例如，可以在非极性侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、Phe、Trp)、不带电的极性侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)、β分支侧链氨基酸间(例如Thr、Val和Ile)、含硫侧链氨基酸间(例如Cys和Met)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守取代。在某些实施方式中，取代、删除或添加也可以认为是“保守取代”。插入或删除的氨基酸的数量的范围可以为约1至5。保守取代通常不引起蛋白构象结构上的显著变化，并且因此能保持蛋白的生物学活性。
本申请使用的术语“突变”或“突变的”在用于氨基酸残基时是指氨基酸残基的取代、插入或添加。
本申请使用的术语“T细胞”是指在细胞介导的免疫中起着重要作用的一类淋巴细胞，包含辅助性T细胞(例如CD4+T细胞、T辅助性1型T细胞、T辅助性2型T细胞、T辅助性3型T细胞、T辅助性17型T细胞)、细胞毒性T细胞(例如CD8+T细胞)、记忆T细胞(例如中央型记忆T细胞(TCM细胞)、效应型记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)和常驻型记忆T细胞(TRM)，其为CD8+或CD4+)、自然杀伤T(NKT)细胞和抑制性T细胞。
天然“T细胞受体”或天然“TCR”是与不变的CD3链结合以形成能够介导信号转导的复合物的异二聚T细胞表面蛋白。TCR属于免疫球蛋白超家族，且与具有单一重链和单一轻链的半抗体相似。天然TCR具有胞外部分、跨膜部分和胞内部分。TCR的胞外结构域具有近膜恒定区和远膜可变区。
本申请使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包含哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场动物，以及动物园、竞技或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等等。
双特异性多肽复合物
在一个方面，本申请提供双特异性多肽复合物。用于本申请的术语“双特异性”表示存在两个抗原结合部分，其各自能够与不同抗原或相同抗原上的不同表位特异性结合。本申请提供的双特异性多肽复合物包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，并且其中之一与CD3特异性结合，另一个与CD20特异性结合。也就是说，所述第一抗原结合部分可与CD3特异性结合，且所述第二抗原结合部分可与CD20特异性结合。或者，所述第一抗原结合部分可与CD20特异性结合，且所述第二抗原结合部分可与CD3特异性结合。在本发明中，术语“双特异性抗CD3xCD20多肽复合物”与“靶向CD3和CD20的多肽复合物”或“抗CD3和CD20多肽复合物”可互换使用。
在某些实施方式中，本申请提供一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1、13、25、37和49的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2、14、26、38和50的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3、15、27、39和51的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4、16、28、40和52的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5、17、29、41和53的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6、18、30、42和54的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7、19、31、43和55的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8、20、32、44和56的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9、21、33、45和57的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10、22、34、46和58的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11、23、35、47和59的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12、24、36、48和60的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
在某些实施方式中，本申请提供的双特异性多肽复合物包含含有来源于TCR恒定区的序列的第一抗原结合部分，但所述第二抗原结合部分不含有来源于TCR恒定区的序列。
本申请提供的双特异性多肽复合物显著地更不容易具有错配的重链和轻链可变结构域。不希望受限于任何理论，据信所述第一抗原结合部分中的稳定的TCR恒定区可以彼此特异性连接，并因此有助于目标VH1和VL1的高度特异性的配对，同时阻碍VH1或VL1与不提供目标抗原结合位点的其他可变区形成不想要的错配。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分进一步包含可操作地连接至VH2的抗体恒定CH1结构域，以及可操作地连接至VL2的抗体轻链恒定结构域。因此，所述第二抗原结合部分包含Fab。
当第一、第二、第三和第四可变结构域(例如VH1、VH2、VL1和VL2)在一个细胞中表达时，高度期望的是VH1与VL1特异性配对且VH2与VL2特异性配对，以使得到的双特异性蛋白产物会具有正确的抗原结合特异性。然而，在诸如杂交-杂交瘤(或四源杂交瘤)的现有技术中，VH1、VH2、VL1和VL2发生随机配对，从而导致多达10种不同分子的生成，其中仅有一种为有功能的双特异性抗原结合分子。这不仅降低了产率，还使目标产物的纯化变得复杂。
相比于第一和第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的情况，由于可变结构域更不容易发生错配，因而本申请所提供的双特异性多肽复合物是优越的。在一个示例性的实例中，所述第一抗原结合结构域包含与VL1-C2配对的VH1-C1，且所述第二抗原结合结构域包含与VL2-CL配对的VH2-CH1。已出人意料地发现C1和C2优先与彼此相缔合，而且不太容易与CL或CH1相缔合，由此阻碍并显著减少诸如C1-CH、C1-CL、C2-CH和C2-CL的不想要的配对的形成。由于C1-C2的特异性缔合，VH1与VL1特异性配对并且从而形成所述第一抗原结合位点，以及CH1与CL特异性配对，从而允许提供所述第二抗原结合位点的VH2-VL2的特异性配对。相应地，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易错配，并且相比于所述第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分(例如为VH1-CH1、VL1-CL、VH2-CH1和VL2-CL的形式)的情况，例如VH1-VL2、VH2-VL1、VH1-VH2、VL1-VL2之间的错配显著减少。
在某些实施方式中，本申请所提供的双特异性多肽复合物自细胞表达时，相比于在可比的条件下表达的参照分子，具有显著更少的错配产物(例如减少至少1、2、3、4、5或更多种错配产物)和/或显著更高的产率(例如提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多的产率)，其中所述参照分子除了以天然CH1取代C1和以天然CL取代C2之外，在其他方面与所述双特异性多肽复合物相同。
包含工程化的Cα和Cβ的抗原结合部分
本申请所提供的第一抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区的第一抗体重链可变结构域，以及可操作地连接至第二TCR恒定区的第一抗体轻链可变结构域，其中所述第一TCR恒定区和第二TCR恒定区经由至少一个非天然链间二硫键相缔合。所述第一抗原结合部分包含至少两条多肽链，其各自包含来源于抗体的可变结构域和来源于TCR的恒定区。因此，所述第一抗原结合部分包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其分别可操作地连接至一对TCR恒定区。在某些实施方式中，第一抗原结合部分中的TCR恒定区的配对是α/βTCR恒定区。本申请所提供的多肽复合物的TCR恒定区能够通过至少一个非天然的二硫键彼此缔合以形成二聚体。
出人意料地发现，可以将本申请所提供的具有至少一个非天然二硫键的第一抗原结合部分重组表达，并组装成所需的构象，其稳定化TCR恒定区二聚体并提供抗体可变区的良好的抗原结合活性。另外，发现所述第一抗原结合部分良好地承受常规的抗体工程化，例如糖基化位点的修饰和一些天然序列的移除。此外，本申请所提供的多肽复合物可以被并入双异特性形式，其由于在所述第一抗原结合部分中存在TCR恒定区，可以容易地以抗原结合序列的最少错配或几乎无错配被表达和组装。本申请所提供的第一抗原结合部分和构建体的其他优势在以下的公开内容中将变得更加明显。
总而言之，本申请提供的第一抗原结合部分包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，其中：C1和C2能够形成二聚体，并且C1和C2之间的非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体。
TCR恒定区
本申请所述的第一抗原结合部分包含来源于TCR的α或β恒定区。
人TCRα链恒定区被称为TRAC，其NCBI登录号为P01848。
人TCRβ链恒定区有两个不同的变体，称为TRBC1和TRBC2(IMGT命名法)(亦参见Toyonaga B等，PNAs，Vol.82，pp.8624-8628，Immunology(1985))。
在本申请中，本申请所提供的第一抗原结合部分的所述第一和所述第二TCR恒定区能够形成二聚体，所述二聚体包含所述TCR恒定区之间的至少一个能够稳定所述二聚体的非天然链间二硫键。
用于本申请的术语“二聚体”是指由两个分子(如多肽或蛋白)经由共价或非共价的相互作用形成的相缔合的结构。同源二聚体或同源二聚化由两个相同的分子形成，而异源二聚体或异源二聚化由两个不同的分子形成。由所述第一和所述第二TCR恒定区形成的二聚体为异源二聚体。
“突变的”氨基酸残基是指被取代、插入或添加并且不同于其对应的天然TCR恒定区中对应的天然残基的氨基酸残基。例如，如果将野生型TCR恒定区中特定位点处的氨基酸残基称为“天然”残基，那么其对应的突变残基为不同于所述天然残基但位于所述TCR恒定区上的相同位置的任何残基。突变残基可以是在相同位置取代天然残基的不同残基，或在天然残基之前插入并因此占据其原位置的不同残基。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定区已被工程化以包含一个或多个负责形成所述非天然链间二硫键的突变氨基酸残基。为了将这样的突变残基引入所述TCR恒定区，可以操纵TCR区的编码序列，以例如将编码天然残基的密码子取代为编码突变残基的密码子，或者以将编码突变残基的密码子插入天然残基的密码子之前。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定区已被工程化以包含一个或多个突变的半胱氨酸残基，使得在取代半胱氨酸残基之后，在两个TCR恒定区之间能形成非天然链间二硫键。
非天然链间二硫键能够稳定所述第一抗原结合部分。这种稳定方面的效果可以以各种方式体现。例如，突变氨基酸残基或非天然链间二硫键的存在可以使所述多肽复合物能够稳定表达，和/或以高水平表达，和/或缔合至具有理想的生物活性(例如抗原结合活性)的稳定复合物，和/或表达并组装为高水平的具有理想的生物活性的理想的稳定复合物。可以使用本领域公知的适宜方法(如在SDS-PAGE上显示分子量，或通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光法(DSF)测量热稳定性)来评估链间二硫键稳定所述第一和第二TCR恒定区的能力。在一个示例性的实例中，如果产物显示分子量与所述第一和所述第二多肽的组合的分子量相当，则可以通过SDS-PAGE确认形成了稳定的本申请所提供的第一抗原结合部分。在某些实施方式中，本申请所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性不少于天然Fab的50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方式中，本申请所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性可与天然Fab相当。
不希望受到任何理论的限制，据信形成于所述第一抗原结合部分中的所述第一和所述第二TCR恒定区之间的所述非天然链间二硫键能够稳定TCR恒定区的异二聚体，从而增强所述异二聚体的和所述第一抗原结合部分的正确折叠水平、结构稳定性和/或表达水平。不同于T细胞表面的细胞膜上锚定的天然TCR，发现天然TCR胞外结构域的异二聚体更不稳定，尽管其在3D结构上与抗体Fab相似。事实上，天然TCR在溶解状态中的不稳定性曾是使其晶体结构难以阐明的显著阻碍(参见Wang，Protein Cell，5(9)，pp.649–652(2014))。通过将一对半胱氨酸(Cys)突变引入TCR恒定区并且从而使链间非天然二硫键能够形成，可以稳定表达所述第一抗原结合部分同时保留抗体可变区的抗原结合能力。
包含突变残基的TCR恒定区在本申请中也称为“工程化的”TCR恒定区。在某些实施方式中，所述多肽复合物的第一TCR恒定区(C1)包含工程化的TCRα链(Cα)，并且所述第二TCR恒定区(C2)包含工程化的TCRβ链(Cβ)。在本文提供的多肽复合物中，C1包含工程化的Cβ，且C2包含工程化的Cα。
在本文提供的多肽复合物中，所述工程化的TCR恒定区包含一个或多个突变的半胱氨酸残基，所述一个或多个突变的残基包含于所述第一和/或所述第二工程化的恒定区的接触界面内。
用于本申请的术语“接触界面”是指在所述多肽上所述多肽彼此相互作用/相缔合的特定区域。接触界面包含一个或多个氨基酸残基，其能够在相互作用发生时与接触或缔合的对应的氨基酸残基相互作用。接触界面中的氨基酸残基可处于或可不处于连续的序列中。例如，当所述界面是三维的时，所述界面内的氨基酸残基可以在线性序列上的不同位置彼此分开。
在某些实施方式中，所述工程化的Cα与所述工程化的Cβ之间可以形成一个或多个二硫键。在某些实施方式中，所述半胱氨酸残基的配对能够形成非天然链间二硫键。
用于本申请全文的关于TCR恒定区的“XnY”旨在表示TCR恒定区上的第n个氨基酸残基X被取代为氨基酸残基Y，其中X和Y分别为特定氨基酸残基的单字母缩写。
在本文提供的多肽复合物中，所述工程化的Cβ包含或为SEQ ID NO:121，并且所述工程化的Cα包含或为SEQ ID NO:122。
SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122的序列提供于下文：
SEQ ID NO:121
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
SEQ ID NO:122
PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
在本申请所提供的多肽复合物中，在本申请提供的第一抗原结合部分中，天然TCR恒定区中存在的一个或多个天然糖基化位点可被修饰(例如移除)。用于本申请的术语“糖基化位点”用于多肽序列时是指带有碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至其的侧链的氨基酸残基。多肽(诸如抗体)的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链，例如三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)中的一个或多个或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个或多个被取代，可以方便地实现对天然糖基化位点的移除。
在本申请所提供的第一抗原结合部分中，至少一个天然糖基化位点在所述工程化的TCR恒定区中(例如在所述第一和/或所述第二TCR恒定区中)不存在。不希望受限于任何理论，据信本申请所述的第一抗原结合部分可以允许移除全部或部分糖基化位点，而不影响蛋白表达和稳定性，这与现有教导相反，即N连接的糖基化位点在TCR恒定区如Cα(即N34、N68和N79)和Cβ(即N69)上的存在对于蛋白表达和稳定性是必要的(参见Wu等，Mabs，7:2，364-376，2015)。
在本申请所提供的第一抗原结合部分中，来源于TCR的恒定区可操作地连接至来源于抗体的可变区。
在某些实施方式中，所述第一抗体可变结构域(VH)在第一接合结构域融合至所述第一TCR恒定区(C1)，所述第一抗体可变结构域(VL)在第二接合结构域融合至所述第二TCR恒定区(C2)。
用于本申请的术语“接合结构域”是指两个氨基酸序列融合或组合的交界或边界区。在某些实施方式中，所述第一接合结构域包含抗体V/C接合子的C末端片段的至少一部分，以及第二接合结构域包含TCR V/C接合子的N末端片段的至少一部分。
用于本申请的术语“抗体V/C接合子”是指抗体可变结构域和恒定结构域的交界，例如重链可变结构域与CH1结构域之间或轻链可变结构域与轻链恒定结构域之间的交界。相似地，术语“TCR V/C接合子”是指TCR可变结构域和恒定结构域的交界，例如TCRα可变结构域与恒定结构域之间或TCRβ可变结构域与恒定结构域之间的交界。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含序列，所述序列包含如式(I)可操作连接的结构域：VH-HCJ-C1，且所述第二多肽包含序列，所述序列包含如式(II)可操作连接的结构域：VL-LCJ-C2，其中：
VH为抗体的重链可变结构域；
HCJ为如上文定义的第一接合结构域；
C1为如上文定义的第一TCR恒定结构域；
VL为抗体的轻链可变结构域；
LCJ为如上文定义的第二接合结构域；
C2为如上文定义的第二TCR恒定结构域。
抗体可变区
本申请所提供的双特异性多肽复合物包含与第二抗原结合部分缔合的第一抗原结合部分，且其中的一个特异性地与CD3结合，另一个特异性地与CD20结合。在本申请提供的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，并且所述第二抗原结合部分包含第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述第一抗体和所述第二抗体是不同的并且选自由抗CD3抗体和抗CD20抗体组成的组。在某些实施方式中，所述第一抗体是抗CD3抗体，第二抗体是抗CD20抗体。在某些其他实施方式中，所述第一抗体为抗CD20抗体，且所述第二抗体为抗CD3抗体。
在常规的天然抗体中，可变区包含由侧翼的框架(FR)区间隔开的3个CDR区，例如自N末端至C末端以下式所列出的：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
a)抗-CD3结合部分
在本文提供的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分为抗CD3结合部分。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表A显示的抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表A
Figure BDA0003673865830000171
以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:61)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:101)：
caggtgcaactcgtgcagtctggagctgaagtgaagaagcctgggtcttcagtcaaggtcagttgcaaggccagtgggtattccttcactacctactacatccactgggtgcggcaggcaccaggacaggggcttgagtggatgggctggatctttcccggcaacgataatattaagtacagcgagaagttcaaagggagggtcaccattaccgccgacaaatccacttccacagcctacatggagttgagcagcctgagatccgaggatacagccgtgtactactgtgccattgacagcgtgtccatctactactttgactactggggccagggcacactggtcacagtgagcagc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:62)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:102)：
gacatcgtcatgacccagtccccagactctttggcagtgtctctcggggaaagagctaccatcaactgcaagagcagccagtcccttctgaacagcaggaccaggaagaattacctcgcctggtaccaacagaagcccggacagcctcctaagctcctgatctactgggcctcaacccggaagagtggagtgcccgatcgctttagcgggagcggctccgggacagatttcacactgacaatttcctccctgcaggccgaggacgtcgccgtgtattactgtactcagagcttcattctgcggacatttggcggcgggactaaagtggagattaag
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表B显示的抗体W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表B
Figure BDA0003673865830000181
以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:63)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:103)：
caggtgcagcttgtgcagtctggggcagaagtgaagaagcctgggtctagtgtcaaggtgtcatgcaaggctagcgggttcgcctttactgactactacatccactgggtgcggcaggctcccggacaagggttggagtggatgggatggatctccccaggcaatgtcaacacaaagtacaacgagaacttcaaaggccgcgtcaccattaccgccgacaagagcacctccacagcctacatggagctgtccagcctcagaagcgaggacactgccgtctactactgtgccagggatgggtactccctgtattactttgattactggggccagggcacactggtgacagtgagctcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:64)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:104)：
gatatcgtgatgacccagagcccagactcccttgctgtctccctcggcgaaagagcaaccatcaactgcaagagctcccaaagcctgctgaactccaggaccaggaagaattacctggcctggtatcagcagaagcccggccagcctcctaagctgctcatctactgggcctccacccggcagtctggggtgcccgatcggtttagtggatctgggagcgggacagacttcacattgacaattagctcactgcaggccgaggacgtggccgtctactactgtactcagagccacactctccgcacattcggcggagggactaaagtggagattaag
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表C显示的抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表C
Figure BDA0003673865830000182
以下提供了W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:65)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:105)：
caggtgcagcttgtgcagtctggggcagaagtgaagaagcctgggtctagtgtcaaggtgtcatgcaaggctagcgggttcgcctttactgactactacatccactgggtgcggcaggctcccggacaagggttggagtggatgggatggatctccccaggcaatgtcaacacaaagtacaacgagaacttcaaaggccgcgtcaccattaccgccgacaagagcacctccacagcctacatggagctgtccagcctcagaagcgaggacactgccgtctactactgtgccagggatgggtactccctgtattactttgattactggggccagggcacactggtgacagtgagctcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:66)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:106)：
gatatcgtgatgacccagagcccagactcccttgctgtctccctcggcgaaagagcaaccatcaactgcaagagctcccaaagcctgctgaactccaggaccaggaagaattacctggcctggtatcagcagaagcccggccagcctcctaagctgctcatctactgggcctccacccggcagtctggggtgcccgatcggtttagtggatctgggagcgggacagacttcacattgacaattagctcactgcaggccgaggacgtggccgtctactactgtactcagagccacactctccgcacattcggcggagggactaaagtggagattaag
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表D显示的抗体W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表D
Figure BDA0003673865830000191
以下提供了W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:67)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:107)：
caggtgcaactcgtgcagtctggagctgaagtgaagaagcctgggtcttcagtcaaggtcagttgcaaggccagtgggtattccttcactacctactacatccactgggtgcggcaggcaccaggacaggggcttgagtggatgggctggatctttcccggcaacgataatattaagtacagcgagaagttcaaagggagggtcaccattaccgccgacaaatccacttccacagcctacatggagttgagcagcctgagatccgaggatacagccgtgtactactgtgccattgacagcgtgtccatctactactttgactactggggccagggcacactggtcacagtgagcagc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:68)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:108)：
gacatcgtcatgacccagtccccagactctttggcagtgtctctcggggaaagagctaccatcaactgcaagagcagccagtcccttctgaacagcaggaccaggaagaattacctcgcctggtaccaacagaagcccggacagcctcctaagctcctgatctactgggcctcaacccggaagagtggagtgcccgatcgctttagcgggagcggctccgggacagatttcacactgacaatttcctccctgcaggccgaggacgtcgccgtgtattactgtactcagagcttcattctgcggacatttggcggcgggactaaagtggagattaag
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分来源于下表E显示的抗体W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的CDR序列。
表E
Figure BDA0003673865830000192
以下提供了W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD3结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:69)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:109)：
caggtgcagcttgtgcagtctggggcagaagtgaagaagcctgggtctagtgtcaaggtgtcatgcaaggctagcgggttcgcctttactgactactacatccactgggtgcggcaggctcccggacaagggttggagtggatgggatggatctccccaggcaatgtcaacacaaagtacaacgagaacttcaaaggccgcgtcaccattaccgccgacaagagcacctccacagcctacatggagctgtccagcctcagaagcgaggacactgccgtctactactgtgccagggatgggtactccctgtattactttgattactggggccagggcacactggtgacagtgagctcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:70)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:110)：
gatatcgtgatgacccagagcccagactcccttgctgtctccctcggcgaaagagcaaccatcaactgcaagagctcccaaagcctgctgaactccaggaccaggaagaattacctggcctggtatcagcagaagcccggccagcctcctaagctgctcatctactgggcctccacccggcagtctggggtgcccgatcggtttagtggatctgggagcgggacagacttcacattgacaattagctcactgcaggccgaggacgtggccgtctactactgtactcagagccacactctccgcacattcggcggagggactaaagtggagattaag
本文提供的抗CD3结合部分还包含合适的框架区(FR)序列，只要所述抗CD3结合部分可以特异性结合CD3。
本申请的抗CD3抗体对表达CD3的细胞(例如CD4 T细胞)具有特异性结合亲和力，并且可以激活人T细胞并触发TNFα和IFNγ的细胞因子释放。
本申请所提供的抗CD3结合部分的结合亲和力可以由KD值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比值(koff/kon)。使用本领域公知的适宜方法，包括例如流式细胞术测定，可以恰当地确定抗原结合亲和力(例如KD)。在一些实施方式中，可以通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可以首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，随后可以通过使用Prism版本5(GraphPadSoftware，圣地亚哥，加利福尼亚)将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的依赖性拟合至单位点饱和方程式：Y＝Bmax*X/(KD+X)，从而计算出KD值，其中Bmax是指待测抗体与抗原的最大特异性结合。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分能够特异性地与表达在细胞表面上的人CD3或重组人CD3结合。CD3为在细胞上表达的受体。重组CD3为重组表达且不与细胞膜缔合的可溶性CD3。重组CD3可以通过多种重组技术制备。在一个实例中，编码人CD3胞外结构域(NP_000724.1)(Met1-Asp126)的CD3 DNA序列可在表达载体中在C末端处与聚组氨酸标签融合，并随后在293E细胞中被转染与表达，并通过镍亲和层析纯化。
在一些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分能够以不超过5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过10-10M、不超过5×10-11M或不超过4×10-11M、不超过3×10-11M或不超过2×10-11M或不超过10-11M的结合亲和力(KD)特异性地与表达在细胞表面上的人CD3结合，所述KD值是通过流式细胞术测定的。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分与食蟹猴CD3(例如表达在细胞表面上的食蟹猴CD3，或可溶性的重组食蟹猴CD3)交叉反应。
抗CD3结合部分与重组CD3或表达在细胞表面上的CD3的结合可以通过本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western印迹、流式细胞术和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07nM或不超过0.08nM的EC50(即50％结合浓度)特异性地与重组人CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过2nM、不超过3nM、不超过4nM、不超过5nM、不超过6nM、不超过7nM、不超过8nM、不超过9nM或不超过10nM的EC50特异性地与表达在细胞表面上的人CD3结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分以与人CD3相似的结合亲和力与食蟹猴CD3结合。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分以不超过0.001nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50特异性地与重组食蟹猴CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD3结合部分具有足以用于诊断性和/或治疗性应用的与人CD3的特异性结合亲和力。许多治疗方案通过靶向TCR信号传导，特别是通过临床使用的抗人CD3单克隆抗体调节T细胞免疫力。
b)抗CD20抗体
在本文提供的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分为抗CD20结合部分。
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表A’显示的抗体W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表A’
Figure BDA0003673865830000211
以下提供了W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:71)：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:111)：
gaggtgcaattggtggagagcggaggagggctcgtgcagcctggaagatctcttaggctgagttgcgctgcatctgggttcacattcaacgactacgccatgcactgggtgaggcaggctcccggcaaagggctggaatgggtgtcaactatctcctggaactccggcagcatcggctacgccgatagcgtcaagggccggtttacaatttcccgcgataacgccaagaagtccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggatactgccctctactactgtgccaaggacattcagtacgggaattactattacgggatggacgtctggggccaggggaccaccgtgacagtcagctcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:72)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:112)：
gaaatcgtgctgacccagtccccagcaaccctctccctttctcctggagagagagctaccctcagctgtagggcctcacagtctgtctccagttacctggcttggtaccagcagaaacccgggcaggcccctaggttgctgatctacgacgccagcaatagggccactggcatcccagcccggttttccggaagcggcagcgggacagatttcacactcactattagcagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagcggtccaactggcccattacatttggccaagggacacgcctggagattaag
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表B’显示的抗体W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表B’
Figure BDA0003673865830000221
以下提供了W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:73)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
VH-核酸序列(SEQ ID NO:113)：
caggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtcaaacccggggctagcgtgaaaatgtcttgcaaagcaagtggttacacattcacttcctataacatgcactgggtgaagcagacacctgggcgaggtctggaatggatcggcgccatctacccaggcaacggagacactagctataatcagaagtttaaaggaaaggccaccctgacagctgataagtccagctctaccgcttacatgcagctgagttcactgacaagtgaggactcagcagtgtactattgcgcccgttctacctactatggcggagattggtatttcaatgtgtggggcgccggtaccacagtcaccgtgtccgcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:74)：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:114)：
cagattgtcctgagccagagccctgccatcctgtctgctagtcccggcgagaaggtgaccatgacatgcagggcatccagctctgtctcctacatccactggttccagcagaagcccgggagttcacctaaaccatggatctacgctacatccaacctggcaagcggtgtgcctgtcaggttttcaggttccggcagcggaacatcttacagtctgactatttctcgggtggaggccgaagacgccgctacctactattgccagcagtggacctccaatccccctacattcggcggagggactaagctggagatcaaa
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表C’显示的抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表C’
Figure BDA0003673865830000222
以下提供了W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:75)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
VH-核酸序列(SEQ ID NO:115)：
caggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtcaaacccggggctagcgtgaaaatgtcttgcaaagcaagtggttacacattcacttcctataacatgcactgggtgaagcagacacctgggcgaggtctggaatggatcggcgccatctacccaggcaacggagacactagctataatcagaagtttaaaggaaaggccaccctgacagctgataagtccagctctaccgcttacatgcagctgagttcactgacaagtgaggactcagcagtgtactattgcgcccgttctacctactatggcggagattggtatttcaatgtgtggggcgccggtaccacagtcaccgtgtccgcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:76)：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:116)：
cagattgtcctgagccagagccctgccatcctgtctgctagtcccggcgagaaggtgaccatgacatgcagggcatccagctctgtctcctacatccactggttccagcagaagcccgggagttcacctaaaccatggatctacgctacatccaacctggcaagcggtgtgcctgtcaggttttcaggttccggcagcggaacatcttacagtctgactatttctcgggtggaggccgaagacgccgctacctactattgccagcagtggacctccaatccccctacattcggcggagggactaagctggagatcaaa
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表D’显示的抗体W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表D’
Figure BDA0003673865830000231
以下提供了W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:77)：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
VH-核酸序列(SEQ ID NO:117)：
gaggtgcaattggtggagagcggaggagggctcgtgcagcctggaagatctcttaggctgagttgcgctgcatctgggttcacattcaacgactacgccatgcactgggtgaggcaggctcccggcaaagggctggaatgggtgtcaactatctcctggaactccggcagcatcggctacgccgatagcgtcaagggccggtttacaatttcccgcgataacgccaagaagtccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggatactgccctctactactgtgccaaggacattcagtacgggaattactattacgggatggacgtctggggccaggggaccaccgtgacagtcagctcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:78)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:118)：
gaaatcgtgctgacccagtccccagcaaccctctccctttctcctggagagagagctaccctcagctgtagggcctcacagtctgtctccagttacctggcttggtaccagcagaaacccgggcaggcccctaggttgctgatctacgacgccagcaatagggccactggcatcccagcccggttttccggaagcggcagcgggacagatttcacactcactattagcagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagcggtccaactggcccattacatttggccaagggacacgcctggagattaag
在某些实施方案中，抗CD20结合部分来源于下表E’显示的抗体W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP。以下提供了W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的CDR序列。
表E’
Figure BDA0003673865830000232
以下提供了W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体的抗CD20结合部分的重链和κ轻链可变区序列。
VH-氨基酸序列(SEQ ID NO:79)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
VH-核酸序列(SEQ ID NO:119)：
caggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtcaaacccggggctagcgtgaaaatgtcttgcaaagcaagtggttacacattcacttcctataacatgcactgggtgaagcagacacctgggcgaggtctggaatggatcggcgccatctacccaggcaacggagacactagctataatcagaagtttaaaggaaaggccaccctgacagctgataagtccagctctaccgcttacatgcagctgagttcactgacaagtgaggactcagcagtgtactattgcgcccgttctacctactatggcggagattggtatttcaatgtgtggggcgccggtaccacagtcaccgtgtccgcc
VK-氨基酸序列(SEQ ID NO:80)：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
VK-核酸序列(SEQ ID NO:120)：
cagattgtcctgagccagagccctgccatcctgtctgctagtcccggcgagaaggtgaccatgacatgcagggcatccagctctgtctcctacatccactggttccagcagaagcccgggagttcacctaaaccatggatctacgctacatccaacctggcaagcggtgtgcctgtcaggttttcaggttccggcagcggaacatcttacagtctgactatttctcgggtggaggccgaagacgccgctacctactattgccagcagtggacctccaatccccctacattcggcggagggactaagctggagatcaaa
本文提供的抗CD20结合部分还包含合适的框架区(FR)序列，只要所述抗CD20结合部分可以特异性结合CD20。
在一些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分能够以不超过5×10-9M、不超过1×10-9M、不超过9×10-10M、不超过8×10-10M、不超过7×10-10M、不超过6×10-10M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M或不超过1×10-10M的结合亲和力(KD)，特异性地与表达在细胞表面上的人CD20结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分与食蟹猴CD20(例如在细胞表面表达的食蟹猴CD20或可溶性重组食蟹猴CD20)交叉反应。
所述抗CD20结合部分与表达在细胞上的CD20的结合可以通过本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western印迹、流式细胞测定和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.1nM、不超过0.2nM、不超过0.3nM、不超过0.4nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM或不超过1nM的EC50特异性地与表达在细胞上的人CD20结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，抗CD20结合部分以与人CD20相似的结合亲和力结合食蟹猴CD20。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CD20结合部分以不超过0.2nM、不超过0.5nM、不超过0.8nM、不超过1nM、不超过2nM或不超过3nM的EC50特异性地与表达在细胞上的食蟹猴CD20结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD20结合部分以不超过1pM、不超过2pM、不超过3pM、不超过4pM、不超过5pM、不超过6pM、不超过7pM、不超过8pM、不超过9pM、不超过10pM、不超过11pM、不超过12pM、不超过13pM、不超过14pM、不超过15pM、不超过16pM、不超过17pM、不超过18pM、不超过19pM、不超过20pM、不超过21pM、不超过22pM、不超过23pM、不超过24pM、不超过25pM、不超过30pM、不超过35pM、不超过40pM、不超过45pM或不超过50pM的EC50被CD20表达细胞内化，所述EC50值通过Fab-Zap试验测定。
双特异性多肽复合物
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价的，如二价、三价、四价的。用于本申请的术语“价”是指给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。同样，三价分子可以是双特异性的，例如当两个结合位点是针对第一抗原(或表位)单特异性的，而第三个结合位点是针对第二抗原(或表位)特异性的。在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物中的所述第一和/或所述第二抗原结合部分可以是二价、三价或四价的，其具有至少两个针对同一抗原或表位的结合位点。在某些实施方式中，这提供了比单价的对应抗体更强的与所述抗原或表位的结合。在某些实施方式中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即具有相同序列)或在结构上不同(即具有不同序列但特异性相同)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价的，并且包括两个或更多个可操作地互相缔合在一起(具有或不具有间隔子)的抗原结合位点。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分包含所述第二抗体的两个或更多个Fab。两个Fab可以可操作地互相缔合，例如，第一Fab可以经由重链共价附接至第二Fab，之间存在或不存在间隔子。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结构域，且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域。用于本申请的术语“二聚化结构域”是指能够相互缔合以形成二聚体的肽结构域，或者在一些示例中，使两个肽能够自发二聚化的肽结构域。
在某些实施方式中，所述第一二聚化结构域可以与所述第二二聚化结构域相缔合。所述缔合可以经由任何适宜的相互作用或联接或键合(例如经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥，或疏水-亲水相互作用，或其组合)实现。示例性的二聚化结构域包括但不限于抗体铰链区、抗体CH2结构域、抗体CH3结构域，以及其他能够二聚化及互相缔合的适宜的蛋白单体。铰链区、CH2和/或CH3结构域可以来源于任何抗体同种型，如IgG1、IgG2和IgG4。
“二硫键”是指具有R-S-S-R’结构的共价键。氨基酸半胱氨酸包含巯基，其可以与例如来自另一半胱氨酸残基的第二巯基形成二硫键。所述二硫键可以在分别存在于两个多肽链上的两个半胱氨酸残基的巯基之间形成，从而形成链间桥或链间键。
氢键是当氢原子共价结合至高度电负性的原子(如氮、氧或氟)时，由两个极性基团之间的静电相互作用形成。氢键可以在多肽中两个残基各自的骨架氧(例如硫族基团)与酰胺氢(氮基团)之间形成，如Asn中的氮基团与His中的氧基团，或Asn中的氧基团与Lys中的氮基团。氢键强于范德瓦尔斯相互作用，但弱于共价键或离子键，对于维持二级结构和三级结构十分关键。例如，当氨基酸残基的间隔在位置i和i+4之间规律发生时，形成α螺旋，而β折叠为当两条肽段通过至少两个或三个骨架氢键连接时形成的长度为3-10个氨基酸的肽链段，其形成扭转、褶皱的片层。
静电相互作用为非共价相互作用，在蛋白折叠、稳定性、柔性和功能中十分重要，包含离子相互作用、氢键合和卤键合。静电相互作用可以形成于多肽中，例如在Lys与Asp之间、在Lys与Glu之间、在Glu与Arg之间，或在第一链上的Glu、Trp与第二链上的Arg、Val或Thr之间。
盐桥为近距离的静电相互作用，其主要产生于Asp或Glu的阴离子羧酸根和来自Lys的阳离子铵或来自Arg的胍
Figure BDA0003673865830000251
根，其为天然蛋白结构中空间上靠近的带相反电荷的残基对。主要疏水的界面中的带电和极性残基可作为用于结合的热点。包含具有可电离的侧链的残基(如His、Tyr和Ser)在内的其他残基也可以参与盐桥的形成。
疏水相互作用可以在第一链上的一个或多个Val、Tyr和Ala与第二链上的一个或多个Val、Leu和Trp之间形成，或第一链上的His和Ala与第二链上的Thr和Phe之间形成(参见Brinkmann等，2017，同上)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域可进一步包含抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含铰链-Fc区的至少一部分，即铰链-CH2-CH3结构域。在某些实施方式中，所述第一二聚化结构域可以可操作地连接至第一TCR恒定区的C末端。在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可以可操作地连接至第二抗原结合部分的抗体CH1恒定区的C末端。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一二聚化结构域可操作地连接至工程化的TCR恒定区的C末端，并且一起形成嵌合恒定区。也就是说，所述嵌合恒定区包括所述第一二聚化结构域与所述工程化的TCR恒定区可操作地连接。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区包括附接至来源于IgG1、IgG2或IgG4的第一铰链-Fc区的工程化的Cβ。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区进一步包含第一抗体CH2结构域和/或第一抗体CH3结构域。例如，所述嵌合恒定区进一步包含附接至所述第三接合结构域的C末端的第一抗体CH2-CH3结构域。
这些嵌合恒定区和第二TCR恒定区对是有用的，因为其可以被操作以融合至理想的抗体可变区，以提供本申请所述的多肽复合物。例如，抗体重链可变区可以融合至所述嵌合恒定区(包括C1)，从而提供本申请所述的多肽复合物的所述第一多肽链；并且相似地，抗体轻链可变区可以融合至所述第二TCR恒定区(包括C2)，从而提供本申请所述的多肽复合物的所述第二多肽链。
在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域包括铰链区。所述铰链区可来源于抗体，如IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可选地可进一步包括抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域，例如铰链-Fc区。所述铰链区可附接至所述第二抗原结合位点的抗体重链(例如Fab)。
在所述双特异性多肽复合物，所述第一和所述第二二聚化结构域能够缔合成为二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。例如，可以选择所述第一和所述第二二聚化结构域，使得其不相同，且其优先在彼此之间形成异源二聚体，而不是与自身形成同源二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由形成把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域包含CH2和/或CH3结构域，其分别突变为能够形成把手入孔。可以通过在第一CH2/CH3多肽用大氨基酸残基取代小氨基酸残基来获得把手，并且可以通过用小氨基酸残基取代大氨基酸残基来获得孔。关于把手入孔的突变位点的详情请参见Ridgway等，1996，同上，Spiess等，2015，同上，以及Brinkmann等，2017，同上。
双特异性形式
在本文所述的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分和所述第二结合部分可以缔合成为Ig样结构。Ig样结构类似天然抗体，具有Y型构造，有两条用于抗原结合的臂和一个用于缔合和稳定的茎部。与天然抗体的相似性可以提供多种优势，如良好的体内药代动力学、理想的免疫应答和稳定性等。已发现包括本申请所提供的第一抗原结合部分与本申请所提供的第二抗原结合部分相缔合的Ig样结构具有与Ig(例如IgG)相当的热稳定性。在某些实施方式中，本申请所提供的Ig样结构为天然IgG的至少70％、80％、90％、95％或100％。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包括4条多肽链：i)VH1-C1-铰链-CH2-CH3；ii)VL1-C2；iii)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，和iv)VL2-CL，其中C1和C2能够形成包括至少一个非天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个可以协助二聚化的链间键。
当与其他形式的双特异性多肽复合物相比较时，本申请所提供的双特异性多肽复合物具有更长的体内半衰期并且相对容易地制造。
双特异性复合物序列
在一些实施方案中，双特异性复合物的第一抗原结合部分能够特异性结合CD3，并且第二抗原结合部分能够特异性结合CD20。在其他实施方式中，所述双特异性复合物的所述第一抗原结合部分能够特异性地与CD20结合，且所述第二抗原结合部分能够特异性地与CD3结合。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84(W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ IDNO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88(W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92，如实施例2所示。在某一实施方案中，所述双特异性多肽复合物包含五条多肽链：a)具有如SEQ ID NO：89所示序列的第一多肽链；b)具有如SEQ ID NO：90所示序列的第二多肽链；c)具有如SEQ ID NO：91所示序列的第三多肽链；d)具有如SEQ ID NO：91所示序列的第四多肽链；和e)具有如SEQ ID NO：92所示序列的第五多肽链。例如，在具体的实施方案中，所述双特异性多肽复合物为W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP抗体，其包含两个抗CD20结合部分，其中一个的重链VH-CH1结构域与抗CD3结合部分的重链VH结构域可操作地连接，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96(W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100(W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP抗体)，如实施例2所示。在这样的实施方案中，所述第一抗原结合部分与CD3结合，且所述第二抗原结合部分与CD20结合。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含4个多肽链，其包含：i)可操作地连接至第一嵌合恒定区的VH1；ii)可操作地连接至第二嵌合恒定区的VL1；iii)可操作地连接至常规抗体重链恒定区的VH2，以及iv)可操作地连接至常规抗体轻链恒定区的VL2。在某些实施方式中，所述第一嵌合恒定区可以包含C1-铰链-CH2-CH3，其各部分如上文所定义。在某些实施方式中，所述第二嵌合恒定区可以包含C2，其如上文所定义。在某些实施方式中，所述常规抗体重链恒定区可以包含CH1-铰链-CH2-CH3，其各部分如上文所定义。在某些实施方式中，所述常规抗体轻链恒定区可以包含CL，其如上文所定义。
在本发明的某些实施方案中，对SEQ ID NO：92所示的多肽链的第193、182、203、206、207位的天然糖基化位点中的一个或多个氨基酸进行了修饰，优选对第193位氨基酸进行修饰。在本发明的某些实施方案中，所述的修饰包括S193X、S182X、S203X、S206X、S207X中的一个或多个，其中X为丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)以外的任意氨基酸。在本发明的某些优选实施方案中，所述的修饰为S193X，其中X为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)或缬氨酸(Val)。在本发明的某些实施方案中，突变消除的是O-糖基化位点，所述O-糖基化类型为Core1构型的O-糖，结构式为NeuAc-Gal-GalNAc或NeuAc-Gal-(NeuAc)GalNAc。
如上所述，在本发明的双特异性抗体中对相应的多肽链中的天然糖基化位点进行修饰，与未进行修饰的双特异性抗体相比，所得到的双特异性抗体更接近天然抗体，免疫原性显著降低，提高半衰期，提升成药性。
制备方法
本申请提供了编码本申请所述的多肽复合物和双特异性抗CD3 x CD20多肽复合物的分离的核酸或多核苷酸。
用于本申请的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单或双链形式的多聚物。除非经明确限制，该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的多核苷酸，所述天然核苷酸类似物具有与参照核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定的多核苷酸序列还暗含其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、同源基因、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成序列实现，其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
可以使用重组技术构建编码本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物的核酸或多核苷酸。为此，编码亲本抗体的抗原结合部分(如CDR或可变区)的DNA可以使用常规步骤分离和测序(例如通过使用能够特异性地与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合的寡核苷酸探针)。编码TCR恒定区的DNA也可以同样地获取。作为示例，获取并可操作地连接编码所述可变结构域(VH)的多核苷酸序列和编码所述第一TCR恒定区(C1)的多核苷酸序列，以允许宿主细胞中的转录和表达，以产生所述第一多肽。相似地，编码VL的多核苷酸序列可操作地连接至编码C1的多核苷酸序列，以使得允许所述第二多核苷酸在宿主细胞中的表达。如果需要，一个或多个间隔子的编码多核苷酸序列也可操作地连接至其他编码序列，以使所需产物表达。
所述编码多核苷酸序列可以进一步可操作地连接至一个或多个调控序列，可选地在表达载体中，以使得所述第一和所述第二多肽的表达或产生是可行的，且在适宜的控制下进行。
使用本领域公知的重组技术，可以将所述编码多核苷酸序列插入载体，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一个实施方式中，本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物可通过本领域公知的同源重组产生。多种载体可供选择。载体组分通常包含但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
用于本申请的术语“载体”是指可将编码蛋白的多核苷酸可操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。通常，其构造还包含适当的调控序列。例如，所述多核苷酸分子可以包含位于编码向导RNA的核酸序列和/或编码定点修饰的多肽的核酸序列的5’侧翼区的调控序列，以能够在宿主细胞中表达所述的转录/基因的方式可操作地连接至所述编码序列。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包含：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类包含逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包含协助其进入细胞的成分，包含但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
在一些实施方式中，所述载体系统包含哺乳动物、细菌、酵母系统等，并且包含质粒，诸如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等，以及其他实验室用的和市售的载体。适宜的载体可包含质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
包含本申请所述的多核苷酸序列的载体可以导入宿主细胞用于克隆或基因表达。用于本申请的用语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
适用于克隆或表达本申请所述载体中的DNA的宿主细胞为上文所述的原核细胞、酵母或高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包含真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科，如大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌，如绿脓杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于克隆或表达编码所述多肽复合物和所述双特异性多肽复合物的载体的宿主细胞。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
适用于表达糖基化本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包含植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可以用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎动物细胞，且脊椎动物细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))，如Expi293；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；链仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述的表达或克隆载体转化宿主细胞，并可以将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基按需要改动以用于诱导启动子、选择转化细胞或扩增克隆载体。
为了生产本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物，用所述表达载体转化的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Sigma)适用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国专利申请Re.30,985中描述的培养基都可用作所述宿主细胞的培养基。在需要时这些培养基都可添加激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔浓度范围的无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在一个方面，本公开提供了一种表达本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物的方法，其包含在所述多肽复合物或所述双特异性多肽复合物被表达的条件下培养本申请所述的宿主细胞。
在某些实施方式中，本公开提供了一种产生本申请所述的双特异性多肽复合物的方法，其包含a)将编码第一抗原结合部分的一个或多个多核苷酸包括编码第一多肽的第一多核苷酸(所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1))，编码第二多肽的第二多核苷酸(所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2))以及编码第二抗原结合部分的一个或多个另外的多核苷酸导入宿主细胞，其中：C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定C1和C2的二聚体，相比于第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分具有减少的错配，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述第二抗体具有第二抗原特异性，b)使所述宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。
在某些实施方式中，所述方法进一步包含分离所述双特异性多肽复合物。
在使用重组技术时，本申请所提供的双特异性多肽复合物可以在胞内、壁膜空间生产，或被直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生产，首先除去宿主细胞或裂解片段的颗粒残骸，例如可通过离心或超声的方法。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。细胞碎片可以通过离心除去。如所述抗体分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白降解，以及可加入抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的本申请所述的双特异性多肽复合物可以采用以下方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。
当本申请所述的双特异性多肽复合物包含免疫球蛋白Fc结构域时，则依赖于存在于所述多肽复合物中的Fc结构域的种类和同种型，蛋白A可以用作亲和配体。蛋白A可以用于基于人γ1，γ2或γ4重链的多肽复合物的纯化(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可以实现更快的流速和更短的处理时间。
当本申请所述的双特异性多肽复合物包含CH3结构域时，则可用BakerbondABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。根据需要回收的抗体，其他蛋白纯化的技术也可使用，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有关注的多肽复合物和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如从约0到0.25M盐浓度)。
在某些实施方式中，可以容易地使用常规方法以高产率纯化本申请所述的双特异性多肽复合物。所述双特异性多肽复合物的一个优势为重链和轻链可变结构域序列之间的错配显著减少。这减少了不要的副产物的产生，并且使得使用相对简单的纯化过程以高产率获得高纯度产物成为可能。
衍生物
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物可以用作与所需的缀合物缀合的基础。
可以设想，本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物可以与多种缀合物连接(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物可通过共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合(coordinate binding)、络合、缔合、混合或加入及其他方式，与所述多肽复合物或双特异性多肽复合物连接。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物可通过工程化的方法使其在表位结合部分以外含有可用来结合一种或多种缀合物的特定位点。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基或组氨酸残基，用于促进与缀合物的共价连接。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物可直接，或者例如通过另一个缀合物或通过接头间接连于缀合物。
例如，具有反应性残基(如半胱氨酸)的双特异性多肽复合物可与巯基反应性试剂连接，其中反应性基团为例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶二硫化物或其他巯基反应性缀合伴侣(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，Molecular Probes,Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3:2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach，Academic Press，伦敦；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，圣地亚哥pp.40-55，643-671)。
再例如，所述双特异性多肽复合物可与生物素缀合，随后间接与缀合至亲和素的第二缀合物缀合。又例如，所述多肽复合物或所述双特异性多肽复合物可与进一步连接至缀合物的接头连接。接头的实例包含双功能耦联剂(如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫代烷(IT))、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对双重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，以及组氨活性的氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的耦联剂包含N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。
所述缀合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可包含荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素、发光标记)、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包含例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。“细胞毒性部分”可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包含但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
用于将缀合物与蛋白(如抗体、免疫球蛋白或其片段)缀合的方法见于例如美国专利号5,208,020；美国专利号6,4411,163；WO2005037992；WO2005081711和WO2006/034488，其全部内容通过引用并入本文。
药物组合物
本申请还提供了药物组合物，其包含本申请所述的双特异性多肽复合物和药学上可接受的运载体。
术语“药学上可接受的”表示所指的运载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他成分相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
“药学上可接受的运载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其生物活性可接受并且对受试者无毒。用于本申请公开的药物组合物中的药学上可接受的运载体可包含例如药学上可接受的液体、凝胶或固体运载体、水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物物质、等渗物质、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质，本领域公知的其他组分或以上的多种组合。
适宜的组分可包含例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适宜的抗氧化剂可包含例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在本申请所述的药物组合物中包含一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述多肽复合物或双特异性多肽复合物的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高蛋白稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本申请所述的组合物中包含本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物，以及一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸。
为进一步说明，药用可接受的载剂可包含例如水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包含酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适宜的辅料可包含例如水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适宜的无毒辅助物质可包含例如乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包含标准运载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包含注射即用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包含皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域熟知，所有用于注射施用的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将如本申请所公开的多肽复合物或双特异性多肽复合物溶解于某适宜的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。可用的辅料包含但不限于水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适宜的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可以容纳单次剂量或多次剂量的本申请所述的多肽复合物、双特异性多肽复合物或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而协助精确取样和精确给药。冻干粉可以在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射施用的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适宜的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，且可以根据经验值决定。
治疗方法
还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物施用给有需要的受试者，由此治疗或预防病况或病症。在某些实施方式中，所述受试者已被确认为具有很可能响应于本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物的病症或病况。
对某种病况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种病况，降低某种病况兴起或发展的速度，减少发展出某种病况的风险，预防或延迟与某种病况相关的症状发展，减少或终止与某种病况相关的症状，产生某种病况的完全或部分的逆转，治愈某种病况，或以上的组合。
本申请所述的双特异性多肽复合物的治疗有效剂量将依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康病况和交叉反应的潜力、过敏、超敏和副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些和其它情形或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间施用(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在这些实施方式的某些中，本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物以约50mg/kg或更少的剂量施用，且在这些实施方式的某些中，剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。在某些实施方式中，施用剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可比后续施用剂量高。在某些实施方式中，可在治疗进程中根据受试者的反应调整施用剂量。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如可施用单剂量，或者可在一段时间施用多个分隔的剂量。
本申请所述的双特异性多肽复合物可通过本领域公知的途径施用，例如肠胃外(如皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包含静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非肠胃外(如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物治疗的病况或病症为癌症或癌性病况、自身免疫疾病、感染性和寄生虫疾病、心血管疾病、神经病变、神经精神病学病况、损伤、炎症或凝血障碍。
用于本申请的“癌症”或“癌性病况”是指由肿瘤性或恶性的细胞生长、增生或转移介导医疗病况，并且既包含实体癌症也包含非实体癌症，如白血病。用于本申请的“肿瘤”是指肿瘤性和/或恶性细胞的实体团块。
对于癌症，“治疗”或“疗法”可指抑制或减缓肿瘤性或恶性的细胞生长、增生或转移，预防或延缓肿瘤性或恶性的细胞生长、增生或转移的发展，或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”或“疗法”包含除掉全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延缓肿瘤的发展，或其一些组合。
例如，对于本申请公开的双特异性多肽复合物用于治疗癌症的用途，治疗有效量为能够除掉全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌性病况的细胞的生长或增生、抑制肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病况相关的任何症状或标记、预防或延缓肿瘤或癌性病况的发展，或其一些组合的所述多肽复合物的剂量或浓度。
在某些实施方式中，所述病况或病症包含肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、真菌病、默克尔细胞癌，以及其他恶性血液病，如经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、EBV阳性和阴性PTLD、EBV相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌，以及HHV8相关的原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，如原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤。
在某些实施方式中，所述病况和病症包含CD20相关病况，如B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包含：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
所述双特异性多肽复合物可单独施用或与一种或多种其他治疗手段或药剂联合施用。
在某些实施方式中，当用于治疗癌症或肿瘤或增生性疾病时，本申请所述的双特异性多肽复合物可与化学疗法、放射疗法、用于治疗癌症的外科手术(例如肿瘤切除术)、一种或多种止吐剂，或者用于化学疗法产生的并发症的其他疗法，或用于治疗癌症或相关的任何医疗病症的任何其他治疗剂联合施用。用于本申请的“联合施用”包含作为相同的药物组合物的一部分同时施用、作为不同的药物组合物同时施用或作为不同的药物组合物在不同时间施用。用于本申请的用语“联用”的含义还包含，在另一个治疗剂之前或之后施用的组合物也被认为是与该治疗剂“联合”施用，即使所述组合物与第二药剂是通过不同途径施用的。在可能的情况下，与本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物联合施用的其他治疗剂参照列于该其他治疗剂的产品说明书中的方案施用，或参照外科医生的案头参考书(Physicians'Desk Reference，第70版(2016))，或参照其他本领域公知的方案。
在某些实施方式中，所述治疗剂可以诱导或促进针对癌症的免疫应答。例如，可以使用肿瘤疫苗诱导对某些肿瘤或癌症的免疫应答。还可以使用细胞因子疗法增加肿瘤抗原向免疫系统的呈递。细胞因子疗法的实例包含但不限于干扰素(如干扰素α、β和γ)、集落刺激因子(如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF)、白细胞介素(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12)、肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β)。还可以使用使免疫抑制靶标灭活的药剂，例如TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂和Fas配体抑制剂。另一组药剂包含激活对肿瘤或癌症细胞的免疫应答性的药剂，例如增强T细胞活化的药剂(例如T细胞共刺激分子的激动剂，如CTLA-4、ICOS和OX-40)，以及增强树突细胞功能和抗原呈递的药剂。
试剂盒
本公开进一步提供了包含本申请所述的双特异性多肽复合物的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可用于检测其存在或水平、或捕获或富集生物样品中一个或多个感兴趣的靶标。所述生物样品可以包括细胞或组织。
在一些实施方式中，所述试剂盒包含本申请所述的双特异性多肽复合物，其与可检测标记缀合。在某些其他的实施方式中，所述试剂盒包含未标记的本申请所述的双特异性多肽复合物，并进一步包含能够与所述未标记的本申请所述的双特异性多肽复合物结合的标记的第二抗体。所述试剂盒可进一步包含使用说明和在试剂盒中将每个组件分隔开的包装。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物与基底或仪器结合。有用的基底或仪器可以是例如磁珠、微孔板或试纸，其可以用于结合试验(如ELISA)、免疫图试验、捕获或富集生物样品中的靶标分子。
提供以下实施例以便更好地说明本发明，它们不应被理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为了举例说明落入本发明范围内的特定实施方式。本领域熟练技术人员在不发挥创造性及不偏离本发明范围的情况下可以开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1
材料准备和基准抗体
1.材料准备
实施例中所用的可商购的材料的信息提供在表1中。
表1.可商购的材料
Figure BDA0003673865830000351
Figure BDA0003673865830000361
2.产生基准抗体
两种基准抗体W327-BMK1和W327-BMK4在实施例中用作参比抗体。
基于来自美国专利申请US 20140004037 A1的克隆C2B8的序列产生抗人CD20基准抗体BMK1(利妥昔单抗)。按照美国专利申请US 20150266966 A1中的序列合成抗CD3×CD20参比双特异性抗体BMK4(REGN1979)基因。BMK抗体由Expi293细胞表达，然后利用蛋白A层析纯化。
实施例2
制备本申请的双特异性抗体
1.抗体和TCR嵌合蛋白的设计和工程化
TCR序列
TCR为由两条链构成的异二聚蛋白。约95％的人T细胞具有由α和β链构成的TCR。考虑到更多的晶体结构对于β链TRBC1是可获得的，因此选择TRBC1序列作为设计本申请公开的多肽复合物(“WuXiBody”)的主骨架。TRBC1的典型氨基酸序列可见于Protein Data Bank(PDB)结构4L4T。
TCR的链间二硫键
使用TCR晶体结构来引导我们的WuXiBody设计。不同于T细胞表面膜上锚定的天然TCR，可溶性TCR分子较不稳定，尽管其3D结构非常近似于抗体Fab。事实上，TCR在溶解状态中的不稳定性曾是使其晶体结构难以阐明的很大阻碍(参见Wang，Protein Cell,5(9),pp.649–652(2014))。我们采用了在TCR恒定区中引入一对Cys突变的方案，并发现其可以显著地改善链组装并增强表达。
连接抗体可变结构域和TCR恒定结构域的接合区、其相对的融合定向以及连接Fc的接合区都经过仔细的精细调制。由于TCR结构非常近似于抗体Fab，我们将抗体Fv同源模型叠加在TCR可变区上(PDB 4L4T)。经叠加的结构表明抗体Fv在结构上与TCR恒定结构域兼容。全部相关的工程化参数基于这一结构比对以及对应的序列设计。
2.制备本申请的双特异性抗体
以把手入孔格式产生作为人IgG4的W3278 BsAbs(S.Atwell,J.B.Ridgway,J.A.Wells,P.Carter,Stable heterodimers from remodeling the domain interfaceof a homodimer using a phage display library.J.Mol.Biol.270,26–35(1997)；C.Spiess,M.Merchant,A.Huang,et al.D.G.Yansura,J.M.Scheer,Bispecificantibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteriaexpressing two distinct half-antibodies.Nat.Biotechnol.31,753–758(2013))。人IgG4 Fc区序列设计有S228P突变。由内部方案经由杂交瘤技术，通过用人CD3ε和CD3δECD蛋白免疫小鼠，产生抗CD3单克隆抗体。抗CD20臂可变区序列是基于奥法木单抗(PCT公布号WO2010083365A1的克隆2F2)或利妥昔单抗(美国专利申请US 20140004037 A1的克隆C2B8)的序列。W3278 BsAb候选子的序列列在表2中，它们的DNA序列在Genewiz(上海)合成并且克隆到改良的pcDNA3.3表达载体中。通过使用ExpiFectamine293转染试剂盒(Invitrogen-A14524)将抗CD20臂和抗CD3臂的表达载体共转染到Expi293(Invitrogen-A14527)中。将细胞在含有8％CO2的湿润气氛的37℃培养箱中在以135rpm旋转的有轨摇床平台上在Expi293表达培养基(Invitrogen-A1435101)中培养。收集培养上清，使用蛋白A柱(GE Healthcare,17543802)进行蛋白纯化。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)测量蛋白浓度。通过SDS-PAGE和分析级HPLC-SEC估测蛋白纯度。图1描述了W3278-BsAb候选子的示意图。
表2.每个BsAb中重链和/或轻链的序列
Figure BDA0003673865830000371
Figure BDA0003673865830000381
Figure BDA0003673865830000391
Figure BDA0003673865830000401
Figure BDA0003673865830000411
注：TCR序列以斜体表示。
进一步地，在双特异性抗体W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP中，本发明人对SEQ IDNO：92所示的轻链的第193、182、203、206、207位的天然糖基化位点中的一个或多个氨基酸进行了修饰，优选对第193位氨基酸进行修饰。在某些实施方案中，所述的修饰包括S193X、S182X、S203X、S206X、S207X中的一个或多个，其中X为丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)以外的任意氨基酸。在某些优选实施方案中，所述的修饰为S193X，其中X为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)或缬氨酸(Val)。上述突变消除的是O-糖基化位点，所述O-糖基化类型为Core1构型的O-糖，结构式为NeuAc-Gal-GalNAc或NeuAc-Gal-(NeuAc)GalNAc。
如上所述，在本发明的双特异性抗体中对相应的多肽链中的天然糖基化位点进行修饰，与未进行修饰的双特异性抗体相比，所得到的双特异性抗体更接近天然抗体，免疫原性显著降低，提高半衰期，提升成药性。
实施例3
体外表征
1.细胞系和原代细胞分离
使用在完全培养基(补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640)中培养的下述细胞系：Jurkat(CD3+/CD20-细胞)，Raji，Ramos和NAMALWA(CD20+/CD3-细胞)，SU-DHL-1(CD20-/CD3-细胞)。
通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度离心从来自健康的正常献血者的肝素化静脉血新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)。通过EasySep试剂盒(Stemcell-19053)从新鲜的人PBMC分离原代人CD8+T细胞，并且通过EasySep(Stemcell-19052)柱纯化CD4+T细胞。
2.W3278 BsAb与靶细胞的结合
W3278 BsAb与靶细胞的结合通过流式细胞术确定。简言之，将1×105个/孔的靶细胞(CD3+/CD20-细胞或CD20+/CD3-细胞)用W3278 BsAb或人IgG4同种型对照抗体的连续稀释液在4℃温育60分钟。温育后，将细胞用冷1％BSA/1×PBS洗涤两次，然后加入AlexaFluor647缀合的山羊抗人IgG Fc(Jackson-109-605-098)并在4℃温育30分钟。在洗涤两次后，使用FACS Canto II血细胞计数器(BD Biosciences)测量被染色的细胞的几何平均荧光(MFI)。不包含抗体或仅含有荧光二抗的孔用于建立背景荧光。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software,La Jolla,CA)确定细胞结合的EC50值，其中使用四参数非线性回归分析计算各值。W3278 BsAb与靶细胞的FACS结合显示在图2中，并且结合EC50显示在下表3中。
表3.W3278 BsAbs和亲本抗体与细胞表面靶标的FACS结合EC50。
Figure BDA0003673865830000421
为了检测W3278 BsAb与CD3和CD20表达细胞的同时结合，将1×106个/ml Raji细胞和1×106个/ml Jurkat细胞分别用50nM Calcein-AM(Invitrogen-C3099)和20nMFarRed(Invitrogen-C34572)标记。用冷1％BSA/1XPBS洗涤后，将标记的Raji和Jurkat细胞重悬并以1:1的比例混合至终浓度为1×106个/ml。用1x105个/孔混合的细胞涂布，然后添加W3278 BsAb的连续稀释液。在4℃温育60分钟后，通过FACS分析Calcein-AM和FarRed双阳性细胞的百分数。
图3的结果表明W3278 lead BsAb表现出剂量依赖性的同时双靶标结合，所述同时双靶标结合比BMK4更有效。
3.体外细胞毒性测定
经由基于FACS的细胞毒性测定确定BsAb通过CD8+T淋巴细胞调控肿瘤细胞溶解的功效。简言之，将新鲜分离的人CD8+T细胞在含有50IU/ml重组人IL-2和10ng/ml OKT-3的完全培养基中培养3至5天。在次日，将靶细胞、Raji、Ramos、NAMALWA和SU-DHL-1(1×106个细胞/ml)用在DPBS中的20nM Far-Red(Invitrogen-C34572)在37℃标记30分钟，然后用测定缓冲液(无酚红的RPMI 1640培养基+10％FBS)洗涤两次。Far-Red标记的靶细胞(2x104个/孔)涂布在110μl/孔包含效应CD8+T细胞(效应子/靶细胞比例为5:1)和BsAbs或hIgG4同种型对照的连续稀释液的完全培养基中，并在37℃温育过夜。最后，添加碘化丙啶(PI)(Invitrogen-P3566)并在室温温育15分钟，然后通过流式细胞术分析。使用下述等式计算细胞毒性百分数：细胞毒性％＝100*Far Red+PI+/(Far Red+PI++Far Red+PI-)*100％。使用Prism四参数非线性回归分析确定体外细胞毒性的EC50值。
图4的结果表明W3278 lead Ab“W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4”不杀伤CD20阴性SU-DHL-1细胞。与BMK4相比，W3278 lead Ab“W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4”更有效地诱导CD20阳性细胞的细胞杀伤，并且杀伤效率EC50与细胞表面CD20表达水平成比例增加。BsAb介导的细胞毒性EC50和最大细胞毒性(Max Cyto)％显示在表4中。
表4.W3278 lead BsAb和BMK4 BsAb对不同B细胞系的细胞毒性EC50和最大细胞毒性％。
Figure BDA0003673865830000422
4.细胞激活和细胞因子释放测定
通过流式细胞术测量效应细胞CD69或CD25的表达评估·BsAb介导的T细胞激活。新鲜分离的纯化的CD4+T细胞和CD8+T细胞分别作为效应细胞进行检验。简言之，将5x104个CD4+或CD8+T细胞涂布在110μl/孔包含BsAbs或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液的完全培养基中，在1x104个Raji或SU-DHL-1细胞/孔的存在下在37℃24小时。温育后，将细胞用1％BSA/1XDPBS洗涤两次，然后用抗人Ab组(FITC标记的抗人CD4(BD Pharmingen-550628)；PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8(BD Pharmingen-565310)；PE标记的抗人CD69(BDPharmingen-555531)和APC标记的抗人CD25(BD Pharmingen-555434))在4℃染色30分钟。通过FACS分析经由CD69或CD25表达评估的T细胞激活。通过使用四参数非线性回归分析确定T细胞激活的EC50。
不存在靶细胞时，W3278 lead Ab不诱导T细胞激活。仅在存在靶细胞时，W3278lead Ab诱导CD4+和CD8+T细胞激活，由CD25表达(图5A)和CD69表达(图5B)所示，并且比BMK4更有效。激活EC50显示在表5A和5B中。
表5A.在Raji细胞存在下由W3278 BsAb和BMK4 BsAb介导的T细胞CD25表达EC50。
Figure BDA0003673865830000431
表5B.在Raji细胞存在下由W3278 BsAb和BMK4 BsAb介导的T细胞CD69表达EC50。
Figure BDA0003673865830000432
对于细胞因子释放(TNF-α和IL-2)测定，将5x104个新鲜分离的CD4+T细胞涂布在110μl/孔包含BsAbs或hIgG4同种型对照抗体的连续稀释液的完全培养基中，在1x104个Raji或SU-DHL-1细胞/孔的存在下在37℃24小时。24小时温育后，将平板离心并收集上清保存在-80℃用于通过ELISA进行细胞因子浓度测量。
对于通过ELISA的TNF-α检测，将96孔ELISA平板(Nunc MaxiSorp,ThermoFisher)用50μl在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(20mM Na2CO3,180mM NaHCO3,pH9.2)中的捕获抗体纯化的抗人TNF(BD Pharmingen-51-26371E)在4℃包被过夜。次日，将平板用洗涤缓冲液(1XPBST缓冲液,0.05％吐温-20)洗涤，然后用200μl测定稀释剂(PBS+10％FBS)封闭。封闭后，加入50μl测试样品和重组人TNF标准品(BD Pharmingen-51-26376E)，并将平板在室温温育2小时。通过检测抗体生物素化抗人TNF(BD Pharmingen-51-26372E)检测TNF-α与平板的结合。链霉抗生物素蛋白-HRP试剂(BD Pharmingen-51-9002813))和四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G)用于颜色反应。在各步骤之间用洗涤缓冲液洗涤。约30分钟后用2M HCl终止颜色反应。使用多功能平板读取仪(
Figure BDA0003673865830000433
M5e)在450nm测量各孔的吸光度。
类似地，通过ELISA检测培养物上清中的IL-2浓度。抗人IL-2抗体mAb(R&D-MAB602)用作捕获抗体，生物素化抗人IL-2抗体(R&D-BAF202)用作检测抗体。
如图6所示，在CD20阴性SU-DHL-1细胞存在下，W3278 lead Ab不诱导T细胞的细胞因子释放。仅在存在靶标Raji细胞时，W3278 lead Ab能够诱导与BMK4相比更低水平的细胞因子释放。并且由W3278Ab引起的EC50窗口(以细胞因子释放和细胞杀伤之间的EC50比所示)大于BMK4(表6)。
表6.BsAb介导的CD4+T细胞的细胞因子释放EC50和最大水平以及细胞因子释放与Raji细胞杀伤的EC50比。
Figure BDA0003673865830000441
5.血清稳定性检测
将抗体与新鲜采集的人血清混合，并且确保混合样品中血清比例>95％。将混合样品的等份分装并在37℃温育0-14天。在图7所示的每个时间点，将样品在液氮中快速冷冻，并且在分析之前保存在-80℃。通过FACS分析每份样品与Raji或Jurkat细胞的结合。
如图7所示，人血清处理的W3278 Ab与Jurkat(图7A)和Raji(图7B)两种细胞的结合与刚解冻的Ab(第0天)相似。这些结果表明W3278 Ab在人血清中稳定至少14天(图7)。
6.DSF测定和热稳定性检测
使用实时荧光定量PCR(QuantStudio 7Flex,Thermo Fisher Scientific)进行DSF测定。简言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合并添加到96孔平板(Biosystems)中。将平板以2℃/min的速率从26℃加热到95℃，并采集所产生的荧光数据。计算荧光变化相对于不同温度的负导数，并且最大值定义为解链温度Th。如果蛋白质具有多个解折叠过渡态，则报告前两个Th，称为Tm1和Tm2。Tm1总是解释为正式的解链温度Tm，以方便不同蛋白质之间的比较。数据采集和Th计算由操作软件(QuantStudio Real-Time PCR PCR Software v1.3)自动进行。W3278 Ab在不同缓冲液中的Tm1和Tm2值显示在表7中。W3278的Tm为约61℃，表示W3278 Ab良好的热稳定性。
表7.通过DSF测定检测的热稳定性(Tm值由表中的Tm1所示)
Figure BDA0003673865830000442
实施例4
体内抗肿瘤功效
在PBMC人源化NOG小鼠的Raji肿瘤模型中检测抗体体内抗肿瘤功效。在研究中使用6-8周龄的雌性NOG小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。将Raji肿瘤细胞(
Figure BDA0003673865830000443
CCL-86TM)在37℃含5％CO2的孵育箱中以及在含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基中单层培养。将肿瘤细胞常规每周传代两次。收集处在指数生长期生长的细胞并计数，以用于肿瘤接种。按照制造商的使用说明，使用Ficoll-PaquePlus从健康献血个体的肝素全血分离人PBMC。
对于治疗模型，将每只小鼠在右上侧腹共同皮下注射预先混合的Raji肿瘤细胞(2.0×106个)和PBMC(3.0×106个)。当平均肿瘤体积达到约60mm3时，将动物随机分组并接受第一次抗体注射。对于功效研究，小鼠每周接受所示量的抗体静脉内注射两次一共3周。研究中所有涉及动物处理、护理和治疗的程序都按照WuXi AppTec机构动物护理和应用委员会(IACUC)遵循实验室动物护理评估和鉴定协会(AAALAC)的指南核准的指导进行。对于所有的肿瘤研究，将小鼠称重，并且使用卡尺每周测量肿瘤生长两次。肿瘤体积以1/2(长×宽2)估算。
如图8所示，W3278 lead Ab治疗展示出剂量依赖性抗肿瘤活性，其比BMK4更有效(图8A)。在实验期间小鼠体重正常(图8B)。
实施例5
在首次用于免疫的食蟹猴中用WBP3278双特异性抗体进行的单剂量研究
为了确定使用WBP3278双特异性抗体治疗是否能够消耗灵长类动物中的循环B细胞，并确定是否导致任何意料不到的毒性，本发明人在食蟹猴(食蟹猕猴(MacacaFascicularis))中进行了探索性的非GLP药理学研究。4只首次用于免疫的雄性食蟹猴(年龄3～4岁，体重约4kg)由广东肇庆创药生物科技有限公司提供。研究中所有与动物的处理、护理和治疗相关的步骤均按照PharmaLegacy实验室机构动物护理和使用委员会(IACUC)遵循实验动物护理评估和认可委员会(AAALAC)的指导核准的指南进行。
四只动物分成两组(每组2只)，分别通过缓慢静脉内注射在60秒内施用WBP3278lead抗体(即,W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4,下文中简称为WBP3278 lead Ab)1mg/kg(组1)和10mg/kg(组2)，施用一次。针对下述淋巴细胞，通过FACS监测外周血循环B细胞和T细胞的水平，监测4周：B淋巴细胞(CD45+/CD20+)；T淋巴细胞(CD45+/CD3+)；CD4+T淋巴细胞(CD4+/CD45+/CD3+)和CD8+T淋巴细胞(CD8+/CD45+/CD3+)。通过使用BDTM细胞计数微珠阵列(Cytometric Bead Array，CBA)非人灵长类动物Th1/Th2细胞因子试剂盒(BD Bioscience，Cat:557800)分析循环炎性细胞因子的水平。使用WBP3278 lead Ab治疗导致立即且完全的循环B细胞消耗，持续至少4周(图9)。在WBP3278 lead Ab治疗后，循环T细胞的水平最初也被降低，在72小时后恢复到基线水平或略高的水平并且持续至少4周(图10A)。72小时后，CD8+T细胞水平升高(图10B)，CD4+T细胞水平恢复至正常水平(图10C)，并且均持续至少4周。在用WBP3278 lead Ab治疗后，观察到循环细胞因子水平快速升高，并且24小时后所有细胞因子恢复至正常水平(图11)。
血清中WBP3278 lead Ab的浓度通过ELISA测定。简言之，将ELISA板用抗人IgG(SouthernBiotech,#2049-01)包被，然后加入血清样品的连续稀释物。结合信号用山羊抗人IgG生物素(SouthernBiotech,#2049-08)和链霉抗生物素蛋白-HRP(Life,#SNN1004)检测。使用多孔板读数器(
Figure BDA0003673865830000451
M5e)在(450-540)nm测量吸光度。使用PhoenixWinNonlin软件(version 8.1,Pharsight,Mountain View,CA)，对食蟹猴中WBP3278 leadAb的浓度进行非房室模型药代动力学分析。应用线性/对数梯形法则获得PK参数。在计算平均浓度时排除个体BLQ。在计算所有的药代动力学参数时使用正常剂量水平和标称取样次数。PK参数的总结列在表8中并显示在图12中。由此可见，当剂量从1mg/kg增加至10mg/kg时，系统暴露C0由19.9μg/mL增加至282μg/mL(约14倍)，AUC0-last由259μg.h/mL增加至5788μg.h/mL(约22倍)。WBP3278双特异性抗体的血清半衰期(T1/2)在1mg/kg和10mg/kg时分别为43.3小时和89.8小时。
表8.WBP3278 lead Ab的PK参数总结
PK参数 1mg/kg(平均) 10mg/kg(平均)
C<sub>0</sub>(μg/mL) 19.9 282
T<sub>1/2</sub>(h) 43.3 89.8
AUC<sub>0-last</sub>(μg.h/mL) 259 5788
此外，实验过程中笼边观察显示，对于高剂量和低剂量水平的WBP3278 lead Ab，都没有观察到意料不到的毒性(数据未显示)。
本实验的结果表明，WBP3278 lead Ab能够有效清除体内B细胞，并且没有细胞因子风暴等不良反应，在食蟹猴中有足够的半衰期。这些实验结果支持将WBP3278 lead Ab推进做临床前药物开发。
本领域技术人员应该进一步理解，本发明可以在不背离其精神和核心属性的前提下以其他具体形式实施。在前述说明书中，本发明仅公开了示例性的实施方案，应该理解其他的变化也被包括在本发明的范围之内。因此，本发明不限于本文详细描述的具体实施方案。相反，关于本发明的范围和内容，应该参考后附的权利要求书。
SEQUENCE LISTING
<110> 正大天晴药业集团股份有限公司
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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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<213> 人工序列
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<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
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<223> VK
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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<213> 人工序列
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<223> VK
<400> 74
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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<400> 76
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
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<220>
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<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
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<213> 人工序列
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<223> VK
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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<400> 79
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 80
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
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100 105
<210> 81
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链1
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 82
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链2
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe
115 120 125
Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His
130 135 140
Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp
145 150 155 160
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
165 170 175
Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp
180 185 190
Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
195 200 205
Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu
210 215 220
Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln
225 230 235 240
Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470
<210> 83
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链1
<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 84
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链2
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn
100 105 110
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
145 150 155 160
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys
165 170 175
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu
180 185 190
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 85
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链1
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
180 185 190
Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
210 215 220
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470
<210> 86
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链2
<400> 86
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
245 250 255
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
275 280 285
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
290 295 300
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr
325 330 335
Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
355 360 365
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
420 425 430
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
450 455 460
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
545 550 555 560
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Gly
675
<210> 87
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链1
<400> 87
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 88
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链2
<400> 88
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 89
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链1
<400> 89
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys
275 280 285
Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
290 295 300
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn
340 345 350
Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile
355 360 365
Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His
385 390 395 400
Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu
405 410 415
Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
420 425 430
Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr
435 440 445
Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val
450 455 460
Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
595 600 605
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
690 695 700
<210> 90
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链2
<400> 90
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 91
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链1
<400> 91
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 92
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链2
<400> 92
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 93
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链1
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
225 230 235 240
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
245 250 255
Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
260 265 270
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
290 295 300
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
305 310 315 320
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe
325 330 335
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys
340 345 350
Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
355 360 365
Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val
385 390 395 400
His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala
405 410 415
Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
420 425 430
Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
435 440 445
Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro
450 455 460
Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
485 490 495
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
500 505 510
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
515 520 525
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
530 535 540
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
545 550 555 560
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
565 570 575
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
580 585 590
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
595 600 605
Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
610 615 620
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
625 630 635 640
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
645 650 655
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
660 665 670
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
675 680 685
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重链2
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
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<223> 轻链1
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链2
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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<213> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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420 425 430
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
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515 520 525
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580 585 590
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<223> 重链2
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
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<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链1
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
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Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
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Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链2
<400> 100
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<223> VH
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ccaggacagg ggcttgagtg gatgggctgg atctttcccg gcaacgataa tattaagtac 180
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atggagttga gcagcctgag atccgaggat acagccgtgt actactgtgc cattgacagc 300
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<212> DNA
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<220>
<223> VK
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gacatcgtca tgacccagtc cccagactct ttggcagtgt ctctcgggga aagagctacc 60
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tggtaccaac agaagcccgg acagcctcct aagctcctga tctactgggc ctcaacccgg 180
aagagtggag tgcccgatcg ctttagcggg agcggctccg ggacagattt cacactgaca 240
atttcctccc tgcaggccga ggacgtcgcc gtgtattact gtactcagag cttcattctg 300
cggacatttg gcggcgggac taaagtggag attaag 336
<210> 103
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 103
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
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atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
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<211> 336
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<220>
<223> VK
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cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
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tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
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<211> 336
<212> DNA
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<220>
<223> VK
<400> 106
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
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<212> DNA
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<220>
<223> VH
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agttgcaagg ccagtgggta ttccttcact acctactaca tccactgggt gcggcaggca 120
ccaggacagg ggcttgagtg gatgggctgg atctttcccg gcaacgataa tattaagtac 180
agcgagaagt tcaaagggag ggtcaccatt accgccgaca aatccacttc cacagcctac 240
atggagttga gcagcctgag atccgaggat acagccgtgt actactgtgc cattgacagc 300
gtgtccatct actactttga ctactggggc cagggcacac tggtcacagt gagcagc 357
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<220>
<223> VK
<400> 108
gacatcgtca tgacccagtc cccagactct ttggcagtgt ctctcgggga aagagctacc 60
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aagagtggag tgcccgatcg ctttagcggg agcggctccg ggacagattt cacactgaca 240
atttcctccc tgcaggccga ggacgtcgcc gtgtattact gtactcagag cttcattctg 300
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<220>
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tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 110
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 110
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
<210> 111
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 111
gaggtgcaat tggtggagag cggaggaggg ctcgtgcagc ctggaagatc tcttaggctg 60
agttgcgctg catctgggtt cacattcaac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggcaaag ggctggaatg ggtgtcaact atctcctgga actccggcag catcggctac 180
gccgatagcg tcaagggccg gtttacaatt tcccgcgata acgccaagaa gtccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat actgccctct actactgtgc caaggacatt 300
cagtacggga attactatta cgggatggac gtctggggcc aggggaccac cgtgacagtc 360
agctcc 366
<210> 112
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 112
gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60
ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120
gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180
cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300
gggacacgcc tggagattaa g 321
<210> 113
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 113
caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60
tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180
aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240
atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300
tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360
gcc 363
<210> 114
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 114
cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60
atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120
agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180
ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240
gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300
actaagctgg agatcaaa 318
<210> 115
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 115
caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60
tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180
aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240
atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300
tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360
gcc 363
<210> 116
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 116
cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60
atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120
agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180
ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240
gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300
actaagctgg agatcaaa 318
<210> 117
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 117
gaggtgcaat tggtggagag cggaggaggg ctcgtgcagc ctggaagatc tcttaggctg 60
agttgcgctg catctgggtt cacattcaac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggcaaag ggctggaatg ggtgtcaact atctcctgga actccggcag catcggctac 180
gccgatagcg tcaagggccg gtttacaatt tcccgcgata acgccaagaa gtccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat actgccctct actactgtgc caaggacatt 300
cagtacggga attactatta cgggatggac gtctggggcc aggggaccac cgtgacagtc 360
agctcc 366
<210> 118
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 118
gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60
ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120
gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180
cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300
gggacacgcc tggagattaa g 321
<210> 119
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 119
caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60
tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180
aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240
atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300
tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360
gcc 363
<210> 120
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VK
<400> 120
cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60
atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120
agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180
ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240
gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300
actaagctgg agatcaaa 318
<210> 121
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改造的TCRBeta
<400> 121
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
115 120 125
<210> 122
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改造的TCRAlpha
<400> 122
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95

Claims (10)

1.一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1和C2能够形成包含至少一个在C1和C2之间的非天然的链间键的二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD20结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：1、13、25、37和49的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：2、14、26、38和50的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：3、15、27、39和51的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：4、16、28、40和52的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：5、17、29、41和53的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：6、18、30、42和54的氨基酸序列的κ轻链CDR3，
抗CD20结合部分来源于抗CD20抗体，其包含：
a)包含选自SEQ ID NO：7、19、31、43和55的氨基酸序列的重链CDR1，
b)包含选自SEQ ID NO：8、20、32、44和56的氨基酸序列的重链CDR2，
c)包含选自SEQ ID NO：9、21、33、45和57的氨基酸序列的重链CDR3，
d)包含选自SEQ ID NO：10、22、34、46和58的氨基酸序列的κ轻链CDR1，
e)包含选自SEQ ID NO：11、23、35、47和59的氨基酸序列的κ轻链CDR2，和
f)包含选自SEQ ID NO：12、24、36、48和60的氨基酸序列的κ轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的双特异性多肽复合物，其中所述抗CD3结合部分包含含有选自SEQ ID NO：61、63、65、67和69的氨基酸序列的重链可变结构域序列和含有选自SEQ ID NO：62、64、66、68和70的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
3.前述权利要求中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述抗CD20结合部分包含含有SEQ ID NO：71、73、75、77和79的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：72、74、76、78和80的轻链可变结构域序列。
4.前述权利要求中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述第一抗原结合部分与第一二聚化结构域连接，所述第二抗原结合部分与第二二聚化结构域连接，其中所述第一和第二二聚化结构域是相缔合的。
5.根据权利要求4所述的双特异性多肽复合物，其中所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的。
6.根据权利要求5所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
7.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体CH2结构域，和/或抗体CH3结构域。
8.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一二聚化结构域在第三接合结构域可操作地连接至所述第一TCR恒定区(C1)。
9.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
10.前述权利要求中任一项的双特异性多肽复合物，其中所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。
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