CN112236456A - 新型双特异性pd-1/lag-3抗体分子 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了抗LAG‑3/PD‑1双特异性抗体分子，编码其的分离的多核苷酸，包含其的药物组合物及其用途。

Description

新型双特异性PD-1/LAG-3抗体分子
优先权要求
本申请要求于2018年3月20日提交的PCT申请号PCT/CN2018/079691的优先权。
技术领域
本公开内容一般涉及针对人PD-1和人LAG-3的新型双特异性抗体分子。
背景技术
双特异性抗体正逐渐成为治疗性抗体的新类别。它们可以结合两个不同的靶标或靶标上的两个不同的表位，产生好于单个抗体的作用的累加或协同作用。在设计新的双特异性形式方面已投入了大量抗体工程化工作，例如DVD-Ig、CrossMab、BiTE等(Spiess等人，Molecular Immunology，67(2)，pp.95-106(2015))。但是，这些形式在稳定性、溶解性、短半衰期和免疫原性方面可能具有多种限制。
来自临床前和临床结果的越来越多的证据表明，靶向免疫检查点正成为治疗癌症患者的最有希望的方法。程序性细胞死亡1(PD-1)是免疫检查点蛋白之一，在限制T细胞的活性方面起着主要作用，这提供了肿瘤细胞逃避免疫监视的主要免疫抵抗机制。在激活的T细胞上表达的PD-1和在肿瘤细胞上表达的PD-L1的相互作用负调节免疫应答和抑制抗肿瘤免疫力。
淋巴细胞激活基因3(CD223)，也称为LAG-3，是I型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。
LAG-3是在激活的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达的细胞表面分子，而不在静止T细胞上表达。LAG-3与CD4共享大约20％的氨基酸序列同源性，但以更高的亲和力结合II类MHC，从而提供了对T细胞受体信号传导的负调控。
体外阻断LAG-3增加了T细胞增殖和细胞因子产生，并且LAG-3缺陷型小鼠在由超抗原葡萄球菌肠毒素B、肽或仙台病毒感染诱导的T细胞应答的下调中存在缺陷。LAG-3在激活的天然Treg(nTreg)和诱导的CD4+FoxP3+Treg(iTreg)细胞上表达，其中表达水平高于在激活的效应器CD4+T细胞上观察到的表达水平。Treg细胞上LAG-3的阻断消除了Treg细胞抑制器功能，而非Treg CD4+T细胞中LAG-3的异位表达赋予了抑制活性。基于LAG-3对慢性感染和癌症中T细胞功能的免疫调节作用，预测的LAG-3特异性单克隆抗体的作用机制是抑制对肿瘤特异性效应器T细胞的负调控。
在2017年，在用于治疗晚期实体瘤的早期临床开发中，仅有三种潜在调节LAG-3功能和抗肿瘤免疫应答的拮抗抗体。在专利申请US 20110150892 A1、US 20170101472 A1和WO 2015138920 A1中描述这些抗体，并且在下文中分别称为BMK1、BMK7和BMK5。如本文所述，BMK8是嵌合抗体BMK5的人源化形式。BMK1、BMK7和BMK8在本申请的上下文中用作基准抗体。因此，仍然需要具有改善的功效，例如高结合亲和力、低交叉家族反应和良好稳定性的抗人LAG-3抗体。在本申请中，发明人利用人源化的大鼠产生了一系列针对LAG-3的抗体和全人抗体。本申请的抗体具有高结合亲和力，特异性结合人LAG-3蛋白而没有交叉家族反应，并且有力地调控免疫应答。
尽管开发了分别靶向靶标的治疗剂，但是仍然强烈需要能够作用于两种靶标的新型双特异性治疗剂。
发明概述
在整个本公开中，冠词“一”、“一种/个”和“该”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“抗体”表示一个抗体或多于一个抗体。
本公开提供了新型双特异性PD-1/LAG-3抗体分子，其氨基酸和核苷酸序列及其用途。
在一方面，本公开在本文中提供了一种双特异性抗体分子，包含LAG-3结合结构域和PD-1结合结构域，其中：
所述LAG-3结合结构域包含：
选自SEQ ID NO：1-3的1、2或3个重链互补决定区(CDR)序列；和/或
选自SEQ ID NO：4-6的1、2或3个轻链CDR序列，和
PD-1结合结构域包含：
选自SEQ ID NO：11-13的1、2或3个重链互补决定区(CDR)序列；和/或
选自SEQ ID NO：14-16的1、2或3个轻链CDR序列，
所述LAG-3结合结构域包含独立地选自Fab和单链Fv抗体(scFv)中的一种；和
所述PD-1结合域包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含Fab。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含Fab。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含scFv。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含scFv。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：1-3的1、2或3个CDR序列，和/或轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：4-6的1、2或3个CDR序列。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含包括SEQ ID NO：7的重链可变区，和其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含包括SEQ ID NO：8的轻链可变区，和其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含包括SEQ ID NO：7的重链可变区和包括SEQ ID NO：8的轻链可变区。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：11-13的1、2或3个CDR序列，和/或轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：14-16的1、2个或3个CDR序列。
在某些实施方案中，PD-1-结合结构域包含SEQ ID NO：17的重链可变区，或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含SEQ ID NO：18的轻链可变区，或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含包括SEQ ID NO：17的重链可变区和包括SEQ ID NO：18的轻链可变区。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力，和/或PD-1结合结构域还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力。
在某些实施方案中，取代或修饰中的至少一个在一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个VH或VL序列中而不在任何CDR序列中。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子还包含免疫球蛋白(Ig)恒定区，任选地人Ig的恒定区，或任选地人IgG的恒定区。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域可操作地连接于PD-1结合结构域的N末端或C末端。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含scFv和PD-1结合结构域包含Fab。
在某些实施方案中，LAG-3结合性scFv包含SEQ ID NO：38的序列，并且PD-1结合性Fab-1包含包括SEQ ID NO：17的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：18的序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，LAG-3结合性scFv可操作地连接于PD-1结合性Fab之后的轻链恒定区的C末端。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含以下形式的重链：VH(抗-PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3，其与以下形式的轻链缔合：VL(抗-PD-1)-CL–间隔区-scFv(抗-LAG-3)。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含包括SEQ ID NO：31的序列的重链和包括SEQ ID NO：32的序列的轻链。
在某些实施方案中，LAG-3结合性scFv可操作地连接于PD-1结合性Fab之后的重链恒定区的C末端。
在某些实施方案中，双特异性抗体包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3-间隔区-scFv(抗LAG-3)，其与轻链VL(抗PD-1)-CL缔合。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含包括SEQ ID NO：33的序列的重链和包括SEQ ID NO：34的序列的轻链。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域是全人或人源化的。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子与一个或多个缀合部分连接。
在某些实施方案中，缀合物部分包含清除修饰剂(clearance-modifying agent)、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA-烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白粘合剂或其他抗癌药。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，包含本文提供的双特异性抗体分子和药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开提供了分离的多核苷酸，编码本文提供的双特异性抗体分子。
在某些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、29和30的核苷酸序列，和/或其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并取代的变体。
在另一方面，本公开提供了包含本文提供的分离的多核苷酸的载体。
在另一方面，本公开提供了包含本文提供的载体的宿主细胞。
另一方面，本公开提供了表达本文提供的双特异性抗体分子的方法，包括在表达本文提供的载体的条件下培养本文提供的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者中的将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体分子或本文提供的药物组合物。
在某些实施方案中，将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况选自癌症、病毒感染、细菌感染、原生动物感染、蠕虫感染、与气道耐受性受损相关的哮喘、神经系统疾病、多发性硬化症和免疫抑制性疾病。
在某些实施方案中，疾病或病况是PD-1相关的和/或LAG-3相关的。
在某些实施方案中，PD-1相关的疾病或病况是癌症或传染病。
在某些实施方案中，LAG-3相关的疾病或病况是癌症。
在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
在某些实施方案中，受试者是人。
在某些实施方案中，施用是经由口服、经鼻、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。
在另一方面，本公开提供了调控表达LAG-3的细胞中的LAG-3活性的方法，包括将表达LAG-3的细胞暴露于本文提供的双特异性抗体分子。
在另一方面，本公开提供了本文提供的双特异性抗体分子在制备用于治疗将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况的药物中的用途。
在另一方面，本公开提供了本文提供的双特异性抗体分子在制备用于治疗PD-1和/或LAG-3相关的疾病或病况的药物中的用途。
附图简述
图1显示了结合人PD-1蛋白的W365-G14和W365-G15。
图2显示了结合人LAG-3蛋白的W365-G14和W365-G15。
图3显示了结合细胞表面人PD-1的W365-G14和W365-G15。
图4显示了结合细胞表面人LAG-3的W365-G14和W365-G15。
图5显示了结合细胞表面食蟹猕猴PD-1的W365-G14和W365-G15。
图6显示了结合细胞表面食蟹猴LAG-3的W365-G14和W365-G15。
图7A显示了W365-G14和W365-G15不结合小鼠PD-1。
图7B显示了W365-G14和W365-G15不结合至小鼠LAG-3。
图8A显示了W365-G14和W365-G15不结合人CTLA-4蛋白。
图8B显示了W365-G14和W365-G15不结合人CD28蛋白。
图8C显示了W365-G14和W365-G15不结合人CD4蛋白。
图9显示了结合人PD-1和LAG-3蛋白的W365-G14和W365-G15。
图10显示了W365-G14和W365-G15阻断了PD-L1对表达PD-1的细胞的结合。
图11显示了W365-G14和W365-G15阻断了LAG-3对MHC-II的结合。
图12显示了W365-G14和W365-G15增强了表达PD-1的Jurkat细胞中的NFAT途径。
图13显示了W365-G14和W365-G15增强了表达LAG-3的Jurkat细胞中的IL-2途径。
图14显示了W365-G15增强了表达PD-1和LAG-3的Jurkat细胞中的的NFAT途径。
图15A显示了W365-G15增强了MLR测定法中的IL-2产生。
图15B显示了W365-G15增强了MLR测定法中的IFN-γ产生。
图16显示了W365-G15增强了用SEB刺激的PBMC的IL-2产生。
图17A显示了W365-G15在新鲜人血清中多达14天时是稳定的。
图17B显示了W365-G14在新鲜人血清中多达14天时是稳定的。
图18A显示了W365-G15在人PD-1/LAG-3敲入转基因小鼠中抑制了B16F10肿瘤的生长。
图18B显示了用W365-G15治疗后随时间推移携带B16F10肿瘤的人PD-1/LAG-3敲入转基因小鼠的重量。
发明详述
本公开的以下描述仅旨在示例说明本公开的各种实施方案。这样，所讨论的具体修改不应解释为对本公开范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同、改变和修改，并且应当理解这样的等同实施方案将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均通过引用整体并入本文。
定义
如本文所用，术语“抗体”包括结合特异性抗原的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)和第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物轻链分为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”形，Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区组成，它们通过二硫键结合在一起。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变区和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文公开的抗体和抗原结合结构域的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Al-Lazikani的惯例来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.等人,Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；N.R.Whitelegg等人Protein Engineering,v13(12),819-824(2000)；Chothia,C.等人,Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Marie-PauleLefranc等人,Developmental and Comparative Immunology,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,Immunome Research,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,MolecularBiology of B cells(second edition),chapter 26,481-514,(2015))。这三个CDR插入了称为框架区(FR)的侧翼区段之间，框架区比CDR更保守并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但是表现出多种效应器功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别是存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要的抗体类别分为亚类，例如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)，IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一个抗体片段(例如CDR和/或可变区序列)的抗原结合蛋白或多肽。抗体分子包括，例如，单克隆抗体、抗体片段或结构域、包含抗体片段或结构域的融合蛋白、包含抗体片段或结构域的多肽复合物等。
如本文所用，术语“二价”是指抗体或抗原结合结构域具有两个抗原结合位点；术语“单价”是指抗体或抗原结合结构域仅具有一个单一抗原结合位点；并且术语“多价”是指抗体或抗原结合结构域具有多个抗原结合位点。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合结构域是二价的。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”(例如LAG-3结合结构域或PD-1结合结构域)是指由包含一个或多个CDR的抗体的部分形成的抗体片段，或结合抗原但不包含完整天然抗体结构的其他抗体片段。抗原结合结构域的实例包括但不限于双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化的单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合结构域能够结合与亲本抗体结合的相同的抗原。在某些实施方案中，抗原结合结构域可以包含来自特定人抗体的一个或多个CDR，其嫁接到来自一种或多种不同人抗体的框架区。有关抗原结合结构域的更多详细形式描述在Spiess等人，2015(同上)和Brinkman等人，mAbs，9(2)，pp.182-212(2017)中，其通过提述完整并入本文。
关于抗体的“Fab”是指由单个轻链(可变区和恒定区)通过二硫键结合到单个重链的可变区和第一恒定区组成的抗体部分。
“Fab'”是指包含一部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”是指Fab’的二聚体。
关于抗体的“片段困难(Fd)”是指重链片段的氨基末端一半，其可以与轻链组合以形成Fab。例如，Fd片段可以由VH和CH1域组成。
关于抗体的“Fv”是指具有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由单个轻链的可变区结合到单个重链的可变区组成。已经提供了许多Fv设计，包括dsFv，其中通过引入的二硫键增强了两个结构域之间的缔合；并且可以使用肽接头将两个结构域结合在一起作为单个多肽而形成scFv。也已经生产了含有与相应免疫球蛋白重链或轻链的可变域和恒定域缔合的重或轻免疫球蛋白链的可变域的Fvs构建体。Fv也已经被多聚化以形成双抗体和三抗体(Maynard等人，Annu Rev Biomed Eng 2339-376(2000))。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由直接或经由肽接头序列彼此连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程化的抗体(Huston JS等人Proc Natl Acad Sci USA，85:5879(1988))。
“ScFab”是指具有经由多肽接头与轻链连接的Fd的融合多肽，导致形成单链Fab片段(scFab)。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其中单个轻链的可变区和单个重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方案中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”包含三个肽链：通过肽接头(例如，长柔性接头)连接的两个VH部分，并经由二硫键分别结合到两个VL部分。在一些实施方案中，dsFv-dsFv'是双特异性的，其中每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
“附加的IgG”是指具有Fab臂融合至IgG而形成双特异性(Fab)2-Fc形式的融合蛋白。它可以形成“IgG-Fab”或“Fab-IgG”，其中Fab在有或无连接体的情况下融合至IgG分子的C末端或N末端。在某些实施方案中，可以将附加的IgG进一步修饰成IgG-Fab4的形式(参见，Brinkman等人，2017，同上)。
关于抗体的“Fc”是指由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键合结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体的部分。抗体的Fc部分负责多种效应器功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指包含两个VH结构域且无轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.Jun；74(4)：277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初衍生自骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。尽管没有轻链，但骆驼化的抗体具有真实的抗原结合库(Hamers-Casterman C.等人，Nature.Jun 3；363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等人“Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr；54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等人Immunology.May；109(1)：93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表通过适应性免疫应答生成的最小的已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人，FASEB J.Nov；21(13)：3490-8.Epub 2007年6月15日(2007))。
“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。
“结构域抗体”是指仅包含重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域用肽接头共价连接以产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可以靶向相同或不同的抗原。
如本文所用，术语“嵌合的”表示抗体或抗原结合结构域，具有衍生自一种物种的重链和/或轻链的一部分，和衍生自不同物种的其余重链和/或轻链。在示例说明性实例中，嵌合抗体可以包含衍生自人的恒定区和来自非人动物(例如，小鼠)的可变区。在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
如本文所用，术语“人源化”表示抗体或抗原结合结构域包含衍生自非人类动物的CDR、衍生自人的FR区，以及在适用时包含衍生自人的恒定区。
如本文所用，关于抗体或抗原结合结构域的术语“全人”表示抗体或抗原结合结构域具有对应于通过人或人类免疫细胞产生抗体的氨基酸序列或由其组成，或衍生自非人类来源例如利用人类抗体库或其他人抗体编码序列的转基因非人类动物。在某些实施方案中，全人抗体不包含衍生自非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头或插入序列)以使得它们处于允许以意图方式起作用的关系。当就多肽使用时，是指以允许连接的产物具有意图的生物学功能的方式连接多肽序列。例如，抗体可变区可以可操作地连接于恒定区，以便提供具有抗原结合活性的稳定产物。又例如，抗原结合结构域可以与另一个抗原结合结构域通过其间的插入序列可操作地连接，并且该类插入序列可以是间隔区或可以包含更长的序列，例如抗体的恒定区。该术语也可以关于多核苷酸使用。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接于调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，其意指该多核苷酸序列以允许从多核苷酸调节表达多肽的方式连接。
当就氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)使用时，术语“融合”或“融合的”是指两个或更多个氨基酸序列的组合，例如通过化学键合或重组的方式，形成天然不存在的单个氨基酸序列。融合氨基酸序列可以通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并且可以通过将包含重组多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
如本文所用，“抗原”是指可以刺激细胞培养物中或动物中抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物、肽、多肽、蛋白质或物质，包括组合物(例如一种包括癌症特异性蛋白质的组合物)加入到细胞培养物中(例如杂交瘤)，或者注射或吸收到动物体内。抗原与特定的体液或细胞免疫的产物(例如抗体)，包括由异源抗原诱导的产物发生反应。
如本文所用，“LAG-3”(或“Lag3”或“Lag-3”)是指衍生自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人、猴子)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的淋巴细胞激活基因3。人LAG-3的示例性序列包括智人(人)LAG-3蛋白(NCBI Ref Seq No.CAA73914.1)(部分)。LAG-3的示例性序列包括褐家鼠(Rat)LAG-3蛋白(NCBI RefSeq No.AAP57397.1)。
如本文所用，术语“LAG-3”旨在涵盖任何形式的LAG-3，例如，1)天然未加工的LAG-3分子，“全长”LAG-3链或天然存在的LAG-3变体，包括例如剪接变体或等位基因变体；2)由细胞内加工产生的任何形式的LAG-3；或3)通过重组方法生成的LAG-3亚基的全长、片段(例如截短形式、细胞外/跨膜结构域)或修饰形式(例如突变形式、糖基化/聚乙二醇化、His标签/免疫荧光融合形式)。
术语“抗LAG-3抗体”、“抗LAG-3结合结构域”或“LAG-3结合结构域”是指能够特异性结合LAG-3(例如人或猴子或小鼠LAG-3)的抗体或抗原结合结构域。
如本文所用，“PD-1”是指程序性细胞死亡蛋白，其属于免疫球蛋白的超家族并起共抑制性受体的作用以负调节免疫系统。PD-1是CD28/LAG-3家族的成员，并具有两个已知的配体，包括PD-L1和PD-L2。人PD-1的代表性氨基酸序列以NCBI登录号：NP_005009.2公开，和编码人PD-1的代表性核酸序列以NCBI登录号：NM_005018.2显示。
如本文所用，“PD-L1”是指程序性细胞死亡配体1(PD-L1，参见，例如，Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192:1027)。人PD-L1的代表性氨基酸序列以NCBI登录号：NP_054862.1公开，和编码人PD-L1的代表性核酸序列以NCBI登录号：NM_014143.3显示。PD-L1在胎盘、脾脏、淋巴结、胸腺、心脏、胎儿肝脏中表达，并且在许多肿瘤或癌细胞中也有表达。PD-L1结合其受体PD-1或B7-1，后者在激活的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达。PD-L1与其受体的结合诱导信号转导，从而抑制TCR介导的细胞因子生成和T细胞增殖的激活。因此，PD-L1在特定事件例如怀孕、自身免疫疾病、组织同种异体移植期间在抑制免疫系统中起主要作用，并且被认为可以使肿瘤或癌细胞绕过免疫学检查点并逃避免疫应答。
如本文所用，“抗PD-1抗体”、“抗PD-1结合结构域”或“PD-1结合结构域”是指能够以足以提供诊断和/或治疗用途的亲和力特异性结合PD-1(例如人或猴PD-1)的抗体或抗原结合结构域。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间，例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方案中，本文提供的抗体分子或抗原结合结构域以≤10-6M(例如，≤5x10-7M、≤2x10-7M、≤10-7M、≤5x10-8M、≤2x10-8M、≤10-8M、≤5x10- 9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9M、或≤10-9M)的结合亲和力(KD)特异性结合人PD-1和/或人LAG-3。本文中使用的KD是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，其可通过使用本领域已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体共振方法、微量热泳动法、HPLC-MS方法和流式细胞术(例如FACS)方法。在某些实施方案中，可以通过使用流式细胞术适当地确定KD值。
如本文所用，“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或抗原结合结构域抑制两个分子(例如人LAG-3和抗LAG-3抗体，人PD-1和抗PD-1抗体)之间的结合相互作用至任何可检测程度的能力。在某些实施方案中，阻断两个分子之间的结合的抗体或抗原结合结构域抑制两个分子之间的结合相互作用至少85％或至少90％。在某些实施方案中，抑制可以大于85％，或大于90％。
如本文所用，术语“表位”是指抗体所结合的在抗原上的原子或氨基酸的特定组。表位既可以由连续的氨基酸(也称为线性或顺序表位)形成，也可以由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(也称为构型或构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常沿蛋白质上的一级氨基酸残基线性排列，并且连续氨基酸的小区段可以从与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原中消化，或在暴露于变性溶剂中时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时失去。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更通常至少5个，约7个或约8-10个氨基酸。如果两种抗体表现出与抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原中相同或紧密相关的表位。例如，如果抗体或抗原结合结构域阻断参照抗体对抗原的结合至少85％，或至少90％或至少95％，则可以认为抗体或抗原结合结构域结合与参照抗体相同/密切相关的表位。
本文所用的抗体名称可以包括一个或多个后缀符号，其通常指示抗体的类型或对该抗体进行的特定修饰。例如，“uIgG4”表示具有IgG4同种型的人恒定区的抗体，“hAb”或“uAb”表示人抗体，“K”表示κ轻链，“L”表示λ轻链，“SP”表示抗体在人IgG4中具有S228P突变。
关于氨基酸序列的“保守取代”是指氨基酸残基替换为含有具有相似的理化性质的侧链的不同氨基酸残基。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)，具有中性亲水侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)，具有酸性侧链的残基(例如Asp、Glu)，具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)或具有芳香族侧链的残基(例如Trp、Tyr和Phe)中进行保守取代。如本领域中已知的，保守取代通常不引起蛋白质构象结构的显著改变，并因此可以保留蛋白质的生物学活性。
如本文所用，术语“同源”和“同源的”是可互换的并且是指当最佳比对时与另一个序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“百分比(％)序列同一性”定义为在对序列进行比对并在必要时引入缺口以获得最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可以认为或可以不认为是等同的残基。例如，可以使用公开可得的工具如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得，也参见Altschul S.F.等人,J.Mol.Biol.,215:403–410(1990)；Stephen F.等人,Nucleic Acids Res.,25:3389–3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所的网站上获得，也参见Higgins DG等人，Methods in Enzymology，266:383-402(1996)；Larkin MA等人，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以使用由工具提供的默认参数，或者可以例如通过选择合适的算法来定制适合于比对的参数。
如本文所用，“效应器功能”是指可归因于抗体的Fc区对其效应器如C1复合物和Fc受体结合的生物学活性。示例性效应器功能包括：通过抗体和C1复合物上C1q的相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；通过抗体的Fc区对效应器细胞上Fc受体的结合而诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；和吞噬作用。
如本文所用，“治疗”或“处理”病况包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速度，降低病况发展的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减轻或停止与病况相关的症状，生成病况的完全或部分消退，治愈病况或其一些的组合。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要疾病或病症的诊断、预后、改善、预防和/或治疗的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人，家畜，农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、奶牛、熊等。
如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起该蛋白质表达的媒介物。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元件在宿主细胞内表达。载体的实例包括质粒，噬菌粒，粘粒，人工染色体例如酵母菌人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体例如λ噬菌体或M13噬菌体，和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。载体可以是表达载体或克隆载体。
如本文所用，短语“宿主细胞”是指已向其中引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
如本文所用，“LAG-3相关的”疾病或病况是指由LAG-3表达或活性的增加或降低引起、加剧或与之相联系的任何疾病或病况。在一些实施方案中，LAG-3相关的病况是免疫相关病症，例如癌症或感染性疾病。
如本文所用，“PD-1相关的”疾病或病况是指由PD-1(例如人PD-1)的表达或活性增加或降低引起、加剧或与之相联系的任何病况。
如本文所用，“癌症”是指以恶性细胞生长或赘生物、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学病况，并且包括实体瘤和非实体癌(血液系统恶性肿瘤)例如白血病。如本文所用，“实体瘤”是指赘生物和/或恶性细胞的实体块。癌症或肿瘤的例子包括血液系统恶性肿瘤，口腔癌(例如唇、舌或咽)，消化器官(例如食道、胃、小肠、结肠、大肠或直肠)，腹膜，肝脏和胆道，胰腺，呼吸系统例如喉或肺(小细胞和非小细胞)，骨骼，结缔组织，皮肤(例如黑色素瘤)，乳房，生殖器官(输卵管、子宫、子宫颈、睾丸、卵巢或前列腺)，尿道(例如膀胱或肾脏)，大脑和内分泌腺(例如甲状腺)的癌症。在某些实施方案中，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌和结肠直肠癌。在某些实施方案中，癌症选自淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。
术语“药学上可接受的”表示指定的一种或多种载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成制剂的其他成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
A.双特异性抗体分子
在一方面，本公开在本文中提供了双特异性抗体分子。如本文所用，术语“双特异性”表示存在至少两种抗原结合结构域(即可以是双特异性或多特异性的)，每种都能够特异性结合不同的表位。本文提供的双特异性抗体分子包含LAG-3结合结构域和PD-1结合结构域，LAG-3结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种；并且PD-1结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
i.LAG-3结合结构域
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含W3395-3.40.19的抗LAG-3抗体的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。
如本文所用，“W3395-3.40.19”是指全人抗体，其包含SEQ ID NO：7的重链可变区和SEQ ID NO：8的轻链可变区。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含重链可变区，其包含包括SEQ ID NO：1的重链CDR1，包括SEQ ID NO：2的重链CDR2和包括SEQ ID NO：3的重链CDR3；和/或轻链可变区，其包含包括SEQ ID NO：4的轻链CDR1，包括SEQ ID NO：5的轻链CDR2和包括SEQ ID NO：6的轻链CDR3。
表1显示了抗LAG-3抗体的CDR序列。重链和轻链可变区序列也在下表2和表3中提供。
表1。
Figure BDA0002689405840000171
表2。
Figure BDA0002689405840000172
Figure BDA0002689405840000181
表3。
Figure BDA0002689405840000182
已知CDR负责抗原结合，但是，发现并非所有6个CDR都是必不可少的或不可改变的。换句话说，可以替换或改变或修饰本文提供的用于LAG-3结合域的一个或多个CDR，而基本上保留对LAG-3的特异性结合亲和力。
在某些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域包含抗LAG-3抗体W3395-3.40.19的重链CDR3序列。在某些实施方案中，本文提供的抗LAG-3抗体和抗原结合片段包含包括SEQ ID NO：3的序列的重链CDR3序列。
重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并因此认为与抗原接触最多并为抗体对抗原的亲和力提供了最大的自由能。还认为就长度、氨基酸组成和通过多种多样化机制的构象而言，重链CDR3是抗原结合位点的最多样化的CDR(Tonegawa S.Nature.302:575-81)。重链CDR3中的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL，Davis MM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等人，J Mol Biol.263:551-67)。
在某些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域包含任何合适的框架区(FR)序列，只要抗原结合结构域可以特异性结合LAG-3即可。在某些实施方案中，W3395-3.40.19的CDR序列获自大鼠抗体，但是可以使用本领域已知的合适方法例如重组技术将它们嫁接到任何合适物种例如小鼠、人、大鼠、兔等的任何合适FR序列上。
在某些实施方案中，本文提供的抗LAG-3抗体及其抗原结合片段是全人的。可以使用重组方法制备全人抗体。例如，可以使转基因动物例如小鼠携带人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，并因此在用适当的抗原免疫后能够产生全人抗体。可以从这种转基因动物中分离出全人抗体，或者备选地可以通过杂交瘤技术，通过将转基因动物的脾细胞与永生细胞系融合以生成分泌全人抗体的杂交瘤细胞来制备。示例性的转基因动物包括但不限于OmniRat，其大鼠免疫球蛋白基因的内源表达被失活并同时被工程化以包含功能性重组人免疫球蛋白基因座；OmniMouse，其小鼠免疫球蛋白基因的内源表达被失活并同时被工程化以包含具有J-基因座缺失和C-κ突变的重组人免疫球蛋白基因座；OmniFlic，其是转基因大鼠，它的大鼠免疫球蛋白基因的内源性表达被失活并同时经过工程改造以包含具有单个常见、重排的VkJk轻链和功能性重链的重组人免疫球蛋白基因座。详细信息可进一步参见：Osborn M.等人，Journal of Immunology，2013，190:1481-90；Ma B.等人，Journal ofImmunological Methods 400–401(2013)78-86；Geurts A.等人，Science，2009，325:433；美国专利8,907,157；EP专利2152880B1；EP专利2336329B1，通过引用将其整体并入本文。也可以使用其他合适的转基因动物，例如HuMab小鼠(详细参见Lonberg，N.等人Nature 368(6474)：856859(1994))、Xeno-Mouse(Mendez等人Nat Genet.1997，15:146-156)、TransChromo小鼠(Ishida等人，Cloning Stem Cells，2002，4:91-102)和VelocImmune小鼠(Murphy等人，Proc Natl Acad Sci USA，2014，111：5153–5158)、Kymouse(Lee等人，NatBiotechnol，2014，32:356-363)和转基因兔(Flisikowska等人，PLoS One，2011，6:e21045)。
在某些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域包含SEQ ID NO：7的重链可变域序列。在某些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域包含SEQ ID NO：8的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域包含重链可变结构域的全部或部分和/或轻链可变结构域的全部或部分。在一个实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域是单结构域抗体，其由本文提供的重链可变结构域的全部或部分组成。这种单结构域抗体的更多信息是本领域可获得的(参见，例如，美国专利号6,248,516)。
ii.PD-1结合结构域
在某些实施方案中，PD-1结合结构域能够特异性结合PD-1(例如人PD-1)，并且包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含抗PD-1抗体W3055-1.153.7的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。
如本文所用，“W3055-1.153.7”是指具有SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ IDNO：18的κ轻链可变区的全人单克隆抗体。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含重链可变区，其包含包括SEQ ID NO：11的重链CDR1、包括SEQ ID NO：12的重链CDR2和包括SEQ ID NO：13的重链CDR3，和/或轻链可变区，其包含包括SEQ ID NO：14的轻链CDR1、包括SEQ ID NO：15的轻链CDR2和包括SEQ IDNO：16的轻链CDR3。
表4显示了抗PD-1抗体的CDR序列。重链和轻链可变区序列也在下表5和表6中提供。
表4CDR氨基酸序列
Figure BDA0002689405840000201
表5.可变区氨基酸序列
Figure BDA0002689405840000202
表6.可变区核苷酸序列
Figure BDA0002689405840000211
已知CDR负责抗原结合，但是发现并非所有6个CDR都是必不可少的或不可改变的。换句话说，可以替换或改变或修饰本文提供的用于PD-1结合域的一个或多个CDR，而基本上保留对PD-1(例如人PD-1)的特异性结合亲和力。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1结合结构域包含SEQ ID NO：13(即抗PD-1抗体W3055-1.153.7的重链CDR3序列)。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1结合结构域是全人的。例如，W3055-1.153.7的PD-1结合域是全人的。
在某些实施方案中，本文提供的PD-1结合结构域包含包括SEQ ID NO：17的重链可变域序列。在某些实施方案中，本文提供的PD-1结合域包含包括SEQ ID NO：18的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，本文提供的PD-1结合结构域包含重链可变结构域的全部或部分和/或轻链可变结构域的全部或部分。在一个实施方案中，本文提供的PD-1结合结构域是单结构域抗体，其由本文提供的重链可变结构域的全部或部分组成。这种单结构域抗体的更多信息是本领域可获得的(参见，例如，美国专利号6,248,516)。
iii.双特异性抗体分子
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子包含LAG-3结合结构域，包含选自SEQ ID NO：1-6(即衍生自W3395-3.40.19)的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列，和PD-1结合结构域，包含选自SEQ ID No：11-16(即衍生自W3055-1.153.7)的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列，并且LAG-3结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种，PD-1结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含重链可变区，其包含SEQ ID NO：7的序列，或其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3(例如人LAG-3)的特异性结合亲和力的同源序列，和/或轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8的序列，或其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3(例如人LAG-3)的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含重链可变区，其包含SEQ ID NO：17的序列或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1(例如人PD-1)的特异性结合亲和力的同源序列，和/或轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18的序列或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1(例如人PD-1)的特异性结合亲和力的同源序列。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含包括SEQ ID NO：7的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：8的序列的轻链可变区(衍生自W3395-3.40)，和PD-1结合结构域包含包括SEQ ID NO：17的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：18的序列的轻链可变区(衍生自W3055-1.153.7)(这样的双特异性抗体分子在本文中也称为“W365B”)。
本文提供的LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
多种技术可以用于产生这种抗原结合结构域。示例说明性方法包括完整抗体的酶消化(参见，例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)；和Brennan等人，Science，229:81(1985))，通过宿主细胞(例如大肠杆菌)的重组表达(例如，用于Fab、Fv和ScFv抗体片段)，如上所述从噬菌体展示文库中筛选(例如，用于ScFv)以及将两个Fab'-SH片段化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业者将是显而易见的。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域是scFv。scFv的生成描述于例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。scFv可以在氨基或羧基末端融合至效应器蛋白以提供融合蛋白(参见，例如，Antibody Engineering，ed.Borrebaeck)。scFv可以包含直接地或经由肽接头连接至VL的VH。在某些实施方案中，VH可以在scFv的N末端和VL可以在scFv的C末端。在某些实施方案中，VL可以在scFv的N末端和VH可以在scFv的C末端。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含scFv或是scFv，该scFv包含包括SEQ IDNO：17的序列的重链可变区(VH)(W3055-1.153.7VH)经由肽接头连接至包含SEQ ID NO：18的序列的轻链可变区(VL)(W3055-1.153.7VL)。在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含scFv或是scFv，该scFv包含包括SEQ ID NO：7的序列的重链可变区(VH)(W3395-3.40.19VH)经由肽接头连接至包含SEQ ID NO：8的序列的轻链可变区(VL)(W3395-3.40.19VL)。
肽接头可包含由苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸组成的单个或重复序列，例如TGGGG(SEQID NO：43)、GGGGS(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：40)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：41)或SGGGG(SEQ ID NO：44)或其串联重复(例如2、3、4个或更多个重复序列)。在某些实施方案中，肽接头包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：42)。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含scFv或是scFv，该scFv包含包括SEQ IDNO：7的序列的VH(W3395-3.40.19VH)经由肽接头连接至包含SEQ ID NO：8的序列的VL(W3395-3.40.19VL)的N末端。在某些实施方案中，肽接头包含或是SEQ ID NO：41。在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含包括SEQ ID NO：38的scFv。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域包含Fab或是Fab。在某些实施方案中，PD-1结合结构域是Fab，其包含包括SEQ ID NO：17的重链可变区(W3055-1.153.7VH)和包含SEQ ID NO：18的轻链可变区(W3055-1.153.7VL)。在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含Fab或是Fab，其包含重链可变区SEQ ID NO：7(W3395-3.40.19VH)和轻链可变区SEQ ID NO：8(W3395-3.40.19VL)。重链可变区和轻链可变区可以是二硫键合的。术语“二硫键合的”是指经由一个或多个二硫键(任选地除了其他键之外)的连接。可以在例如抗体重链的一个半胱氨酸残基与轻链的另一个半胱氨酸残基之间形成二硫键。
在某些实施方案中，LAG-3结合和/或PD-1结合结构域是多价的，例如二价、三价、四价。如本文所用，术语“价”是指在给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。这样，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在抗原结合分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于特异性结合相同的抗原或相同的表位，则二价分子可以是单特异性的。类似地，例如，当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性的而第三结合位点对第二抗原(或表位)是特异性的时，三价分子可以是双特异性的。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子中的LAG-3结合和/或PD-1结合结构域可以是二价、三价或四价的，具有至少两个对相同抗原或表位具有特异性的结合位点。在某些实施方案中，这提供了比单价对应物对抗原或表位的更强的结合。在某些实施方案中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即具有相同的序列)，或在结构上不同(即具有不同的序列，尽管具有相同的特异性)。在某些实施方案中，LAG-3结合和/或PD-1结合结构域包含两个或更多个可操作地连接在一起的抗原结合位点(例如scFv或Fab)，具有或不具有间隔区。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域可操作地连接至PD-1结合结构域的N末端或C末端。在某些实施方案中，PD-1结合结构域可操作地连接至LAG-3结合结构域的N末端或C末端。
可操作的连接可以是直接化学键连接或者经由间隔区或经由插入序列的连接。如本文所用，术语“间隔区”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基或者长度是5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基的人工氨基酸序列，通过肽键连接并用于连接一个或多个结合结构域，例如scFv和Fab或IgG。间隔区可以与scFv中的肽接头相同或不同。在某些实施方案中，间隔区包含SEQ ID NO：39、40和42的1、2、3、4或更多个顺序或串联重复。在某些实施方案中，间隔区包含GGGGS(SEQ ID NO：39)。在某些实施方案中，间隔区包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：40)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSGGGGSGSGGGGS(SEQ ID NO：42)。本文使用的插入序列可以是位于LAG-3结合结构域和PD-1结合结构域之间的任何氨基酸序列，只要LAG-3结合结构域和PD-1结合结构域均能够结合其各自的抗原。在示例说明性实例中，插入序列可以包含重链恒定区或轻链恒定区。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含scFv和PD-1结合结构域包含Fab或IgG。在某些实施方案中，LAG-3结合性scFv可以可操作地连接至PD-1结合性Fab或IgG的重链的N末端或C末端(例如，重链恒定区的C末端，之后是PD-1结合性Fab)，或连接至PD-1结合性Fab或IgG的轻链的N末端或C末端，或其任何组合，反之亦然。
在示例说明性实例中，双特异性抗体分子可以包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3-间隔区-scFv(抗LAG-3)或scFv(抗-LAG-3)-间隔区-VH(抗-PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3，和以下形式的轻链：VL(抗-PD-1)-CL。如本文所用，VH(抗PD-1)和VL(抗PD-1)分别是指PD-1结合结构域的重链和轻链可变结构域；scFv(抗LAG-3)是指LAG-3-结合结构域的scFv，CL是指轻链恒定区；和CH1-铰链-CH2-CH3共同为重链恒定区。
在另一个示例说明性实例中，双特异性抗体分子可以包含以下形式的轻链：scFv(抗LAG-3)-间隔区-VL(抗PD-1)-CL或VL(抗PD-1)-CL-间隔区-scFv(抗LAG-3)，和以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3，以此类推。
在某些实施方案中，当PD-1结合结构域是scFv和LAG-3结合结构域是Fab或IgG时，PD-1结合结构域scFv可以可操作地连接至抗LAG-3Fab或IgG的重链的N末端或C末端，或连接至抗LAG-3Fab或IgG的轻链的N末端或C末端，或其任何组合，反之亦然。
在示例说明性实例中，双特异性抗体分子可以包含以下形式的重链：VH(抗LAG-3)-CH1-铰链-CH2-CH3-间隔区-scFv(抗PD1)或scFv(抗PD1)-间隔区-VH(抗LAG-3)-CH1-铰链-CH2-CH3，和以下形式的轻链：VL(抗LAG-3)-CL。在另一个示例说明性实例中，双特异性抗体分子可以包含以下形式的轻链：scFv(抗PD-1)-间隔区-VL(抗LAG-3)-CL或VL(抗LAG-3)-CL-间隔区-scFv(抗PD-1)，和以下形式的重链：VH(抗LAG-3)-CH1-铰链-CH2-CH3，以此类推。
在本文提供的双特异性抗体分子中，LAG-3结合结构域可以是单价的(即一个scFv或Fab)或多价的(例如多于一个scFv或Fab)，和/或PD-1-结合结构域可以是单价或多价的。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3，和以下形式的轻链：VL(抗PD-1)-CL-间隔区-scFv(抗LAG-3)，其中VH(抗PD-1)包含SEQ ID NO：17的序列，VL(抗PD-1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，和scFv(抗LAG-3)包含SEQ ID NO：38的序列。在某些实施方案中，间隔区包含SEQ ID NO：40的序列。在某些实施方案中，重链恒定区是人IgG4同种型的重链恒定区，并且任选地包含S228P和/或L235E的突变。在某些实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO：35或37的序列。在某些实施方案中，轻链恒定区包含SEQ ID NO：36的序列。在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含包括SEQID NO：31的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3-间隔区-scFv(抗LAG-3)，和包含以下形式的轻链：VL(抗PD-1)-CL，其中VH(抗PD-1)包含SEQ ID NO：17的序列，scFv(抗LAG-3)包含SEQ ID NO：38的序列和VL(抗PD-1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。在某些实施方案中，间隔区包含SEQ ID NO：42的序列。在某些实施方案中，重链恒定区是人IgG4同种型的重链恒定区，并且任选地包含S228P和/或L235E的突变。在某些实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO：35或37的序列。在某些实施方案中，轻链恒定区包含SEQ ID NO：36的序列。在某些实施方案中，双特异性抗体分子包含包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链。
表7和8显示了W365B的双特异性抗体分子(特别是W365-G14和W365-G15)的重链和轻链序列的组合。
表7
Figure BDA0002689405840000261
Figure BDA0002689405840000271
“CL”是指轻链恒定区；“CH”是指重链恒定区；“VL”是指轻链可变区；“VH”是指重链可变区；
“抗PD-1”是指抗PD-1抗体，特别地，表中提供的序列是衍生自抗PD-1抗体W3055_1.153.7的序列。
“抗LAG-3”是指抗LAG-3抗体，特别地，表中提供的序列是衍生自抗LAG-3抗体W3395-3.40.19的序列。
表8
Figure BDA0002689405840000272
Figure BDA0002689405840000281
Figure BDA0002689405840000291
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子可以还包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区域。在某些实施方案中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方案中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
本文提供的双特异性抗体分子可以具有免疫球蛋白(Ig)，任选地人Ig，任选地人IgG的恒定区。恒定区可以是任何合适的同种型。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子包含可以诱导ADCC或CDC的IgG1同种型的恒定区，或具有降低或耗尽的效应器功能的IgG4或IgG2同种型的恒定区。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子具有降低或耗尽的效应器功能。在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子具有IgG4同种型的恒定区，其具有降低或耗尽的效应器功能。诸如ADCC和CDC的效应器功能可以导致对表达PD-1的细胞的细胞毒性。许多细胞例如T细胞正常地表达PD-1。为了避免对那些正常细胞的不想要的潜在毒性，本文提供的抗体和抗原结合片段的某些实施方案可以具有降低或甚至耗尽的效应器功能。已知多种测定法来评估ADCC或CDC活性，例如Fc受体结合测定法、C1q结合测定法和细胞裂解测定法，并且本领域技术人员可以容易地选择。不希望被理论所束缚，但是据信具有降低或耗尽的效应器功能(例如ADCC或CDC)的抗体不会引起或引起最小的对PD-1表达细胞(例如那些T细胞)的细胞毒性，并从而使它们免于不想要的副作用，而与此同时，阻断PD-1会增强免疫系统，以治疗癌症或慢性感染等病况。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子具有减少的副作用。例如，本文提供的双特异性抗体分子可以包含至少一个完全人抗原结合结构域和Fc区，并因此与人源化抗体对应物相比降低的免疫原性。
B.双特异性抗体分子的表征
在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够特异性结合人PD-1和人LAG-3。本文提供的双特异性抗体分子保留对PD-1和LAG-3两者的特异性结合亲和力，在某些实施方案中，在该方面与亲本抗体至少相当或甚至更好。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子具有对LAG-3的特异性结合亲和力，其足以提供诊断和/或治疗用途。
双特异性抗体分子的结合也可以用“半最大有效浓度”(EC50)值表示，其是指观察到抗体的最大作用(例如结合或抑制等)的50％时抗体的浓度。可以通过本领域已知的方法来测量EC50值，例如，夹心测定法例如ELISA，Western印迹，流式细胞术测定法和其他结合测定法。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过ELISA不大于5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM或0.07nM的EC50(即50％结合浓度)特异性结合人PD-1。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过ELISA不大于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM或0.2nM的EC50(即50％结合浓度)特异性结合人LAG-3。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过流式细胞术不大于：50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM的EC50(即50％结合浓度)特异性结合至细胞表面人PD-1。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过流式细胞术不大于：100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM的EC50(即50％结合浓度)特异性结合细胞表面人LAG-3。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子与食蟹猴PD-1，例如在细胞表面上表达的食蟹猴PD-1，或可溶性重组食蟹猴PD-1交叉反应。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子与食蟹猴LAG-3，例如在细胞表面上表达的食蟹猴LAG-3，或可溶性重组食蟹猴LAG-3交叉反应。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过流式细胞术不大于：10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM或0.3nM的EC50特异性结合细胞表面食蟹猴PD-1。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子以通过流式细胞术不大于21nM，不大于：500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM或6nM的EC50特异性结合细胞表面食蟹猴LAG-3。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过ELISA不大于：10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM或0.04nM的EC50双重结合人PD-1和人LAG-3。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过流式细胞术不大于：20nM、18nM、16nM、14nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM的IC50(即50％抑制浓度)阻断PD-L1对PD-1的结合。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过流式细胞术不大于：50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM的IC50阻断LAG-3对MHC II的结合。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子不与人CD4、CTLA-4和CD28交叉反应。
本文提供的抗原结合结构域的结合亲和力可以通过KD值表示，其代表当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。抗原结合亲和力(例如KD)可以使用本领域已知的合适方法适当地测定，包括例如流式细胞术测定法。在一些实施方案中，可以通过流式细胞术测定在不同浓度抗体对抗原的结合，可以首先相对于抗体浓度绘制测定的平均荧光强度(MFI)，然后可以通过使用Prism版本5(GraphPadSoftware，San Diego，CA)将特异性结合荧光强度(Y)和抗体的浓度(X)的依赖性拟合入一个位点饱和方程：Y＝Bmax*X/(KD+X)来计算KD值，其中Bmax是指所测试抗体对抗原的最大特异性结合。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过表面等离振子共振(SPR)不大于：50x10-9M、40x10-9M、30x10-9M、20x10-9M、10x10-9M、9x10-9M、8x10-9M、7x10-9M、6x10-9M、5x10-9M、4x10-9M、3x10-9M或2x10-9M的结合亲和力(KD)特异性结合人PD-1。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过表面等离振子共振(SPR)不大于：50x10-11M、40x10-11M、30x10-11M、20x10-11M、10x10-11M、9x10-11M、8x10-11M、7x10-11M、6x10-11M、5x10-11M、4x10-11M、3x10-11M或2x10-11M的结合亲和力(KD)特异性结合人LAG-3。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子阻断人PD-1对其配体的结合，从而提供生物学活性，包括例如诱导从激活的T细胞(例如CD4+T细胞和CD8+T)的细胞因子产生，诱导激活的T细胞(例如CD4+T细胞和CD8+T细胞)的增殖，和逆转T reg的抑制功能。示例性细胞因子包括IL-2和IFNγ。术语“IL-2”是指白细胞介素2，其是免疫系统中调节白血细胞(例如白细胞)的活性的一种细胞因子信号传导分子。术语“干扰素γ(IFNγ)”是由自然杀伤(NK)、NK T细胞、CD4+和CD8+T细胞产生的细胞因子，它是巨噬细胞的关键激活剂和主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。可以使用本领域已知的方法，例如通过ELISA来测定细胞因子的产生。还可以使用方法检测T细胞的增殖，包括[3H]胸苷掺入测定法。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过报告基因测定法不大于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM或0.4nM的EC50特异性增强PD-1表达细胞中激活的T细胞途径的核因子(NFAT)。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够以通过报道基因测定法不大于20nM、18nM、16nM、14nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM或0.3nM的EC50特异性增强LAG-3表达细胞中的IL-2途径。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子能够同时刺激来自先天和适应性免疫系统的细胞。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子阻断人PD-1对其配体的结合，并从而提供生物学活性，包括例如诱导从激活的T细胞(例如CD4+T细胞和CD8+T)的细胞因子生成，诱导激活的T细胞(例如CD4+T细胞和CD8+T细胞)的增殖，和逆转Treg的抑制功能。示例性细胞因子包括IL-2和IFNγ。术语“IL-2”是指白细胞介素2，其是免疫系统中调节白血细胞(例如白细胞)活性的一种细胞因子信号传导分子。术语“干扰素γ(IFNγ)”是由自然杀伤(NK)、NK T细胞、CD4+和CD8+T细胞产生的细胞因子，它是巨噬细胞的关键激活剂和主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。可以使用本领域已知的方法，例如通过ELISA来测定细胞因子产生。还可以使用方法检测T细胞的增殖，包括[3H]胸苷掺入测定法。
C.双特异性抗体分子的形式
双特异性抗体片段是衍生自抗体但缺乏一些或全部抗体恒定结构域的抗原结合片段。这种双特异性抗体片段的实例包括，例如单结构域抗体、Fv、Fab和双抗体等。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子基于“完整”抗体的形式，例如完整IgG或IgG样分子。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子是以双特异性形式，选自具有附加抗原结合部分的IgG附加抗体，包含：IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；和scFv4-Ig。对于双特异性抗体形式的详细描述，请参见Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，其通过引用整体并入本文。
本文提供的双特异性抗体分子可以通过本领域已知的任何合适方法来制备。在常规方法中，两个具有不同抗原结合特异性的免疫球蛋白重链-轻链对可以在宿主细胞中共表达，以重组方式产生双特异性抗体(参见，例如Milstein和Cuello，Nature，305:537(1983))，然后通过亲和层析纯化。
也可以使用以下重组方法，其中将编码针对两种特异性的抗体重链可变域的序列分别融合至免疫球蛋白恒定结构域序列，然后插入表达载体中与用于轻链序列的表达载体共转染到合适的宿主细胞以重组表达双特异性抗体(参见，例如，WO 94/04690；Suresh等人，Methods in Enzymology，121:210(1986))。类似地，scFv二聚体也可以重组构建并从宿主细胞表达(参见，例如，Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))。
D.变体
本文提供的抗原结合结构域和双特异性抗体分子也涵盖其多种变体。在某些实施方案中，变体在如表1或表4中所提供的SEQ ID NO：1-6和11-16的一个或多个CDR序列，如表2或表5中所提供的SEQ ID NO：17、18、7和8的一个或多个可变区序列(但不在任何CDR序列中)，和/或恒定区(例如Fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这样的变体保留其亲本抗体对LAG-3和/或PD-1的特异性结合亲和力，但是具有通过修饰或取代赋予的一种或多种期望的特性。例如，抗体变体可以具有改善的抗原结合亲和力、改善的生产率、改善的稳定性、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基作用、降低的或耗尽的效应器功能、改善的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合的相容性(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)。
可以使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”(参见，例如，Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085)对亲本抗体序列筛选以鉴定待修饰或取代的合适或优选的残基。简而言之，可以鉴定靶残基(例如带电荷的残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，并产生修饰的抗体和筛选感兴趣的特性。如果在特定氨基酸位置的取代显示出感兴趣的功能变化，则可以将该位置鉴定为用于修饰或取代的潜在残基。可以通过用不同类型的残基(例如半胱氨酸残基，带正电的残基等)取代来进一步评估潜在的残基。
在某些实施方案中，本文提供的LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域在一个或多个CDR序列，和/或一个或多个FR序列，和/或一个或多个可变区序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方案中，变体总共在CDR序列和/或FR序列和/或一个或多个可变区序列中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施方案中，LAG-3结合结构域包含1、2或3个CDR序列，与选自SEQ ID NO：1-6的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留与其亲本抗体相似或甚至更高水平的对LAG-3的结合亲和力。
在某些实施方案中，抗LAG-3结合结构域包含一个或多个可变区序列，与SEQ IDNO：7或8具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留与其亲本抗体相似或甚至更高水平的对LAG-3的结合亲和力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：7或8的可变区序列中取代、插入或缺失总共1至10个氨基酸。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(例如，在FR中)。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含1、2或3个CDR序列，与选自SEQ ID NOs：11-16的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并同时保留与其亲本抗体相似或甚至更高水平的对PD-1的结合亲和力。
在某些实施方案中，PD-1结合结构域包含一个或多个可变区序列，与SEQ ID NO：17或18具有至少80％(例如、至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留与其亲本抗体相似或甚至更高水平的对PD-1的结合亲和力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：17或18的可变区序列中取代、插入或缺失总共1至10个氨基酸。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(例如，在FR中)。
i.糖基化变体
本文提供的抗原结合结构域和双特异性抗体分子还涵盖糖基化变体，其获得可以增加或减少双特异性抗体分子的糖基化程度。
本文提供的抗原结合结构域和双特异性抗体分子可以包含一个或多个具有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附着至该侧链。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链，例如三肽序列例如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是任何氨基酸除了脯氨酸。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见地附着至丝氨酸或苏氨酸。天然糖基化位点的去除可以方便地实现，例如，通过改变氨基酸序列使得上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)或者序列中存在的丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)被取代。可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基以类似方式创建新的糖基化位点。
ii.半胱氨酸工程化的变体
抗原结合结构域和双特异性抗体分子还涵盖半胱氨酸工程化的变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离的半胱氨酸残基是不属于二硫键的部分。半胱氨酸工程化的变体可以用于在工程化半胱氨酸的位点通过例如马来酰亚胺或卤代乙酰基与例如细胞毒性和/或成像化合物、标记或放射性同位素等的缀合。用于工程化抗体多肽以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域已知的，参见例如WO2006/034488。
iii.Fc变体
本文提供的抗原结合结构域和双特异性抗体分子还涵盖Fc变体，其在其Fc区和/或铰链区中包含一个或多个氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施方案中，抗原结合结构域和双特异性抗体分子包含一个或多个氨基酸取代，其改善对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。这样的变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性pH结合FcRn从而使其能够逃离溶酶体中的降解并然后被转运并释放出细胞。工程化抗体分子以改善与FcRn的结合亲和力的方法在本领域中是众所周知的，参见，例如，Vaughn，D.等人，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann，R.等人，Antibody Engineering，Volume 1,Chapter 27:Engineering of the Fc region forimproved PK,published by Springer,2010；Yeung,Y.等人,Cancer Research,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等人,J.Immunology,176:346-356(2006)。
在某些实施方案中，抗原结合结构域和双特异性抗体分子包含一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。可以取代在Fc区(例如在CH2结构域)的某些氨基酸残基以提供改变的(例如增强的、降低的或耗尽的)ADCC活性。备选地或另外地，可以改变抗体上的碳水化合物结构以改变(例如增强、降低或消耗)ADCC活性。通过抗体工程化来改变ADCC活性的方法已经在本领域中进行了描述，参见例如Shields RL.等人,J BiolChem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE.等人,J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人,J Immunol.1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.等人,J Immunol.2001,166(4):2571-5；Lazar GA.等人,PNAS,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.等人,Mol.Cancer Ther.,2007,6:3009-3018；Richards JO,.等人,Mol Cancer Ther.2008,7(8):2517-27；Shields R.L.等人,J.Biol.Chem,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等人,J.Biol.Chem,2003,278:3466-3473。
在某些实施方案中，抗原结合结构域和双特异性抗体分子包含人IgG4恒定区，其中第228个氨基酸残基被改变，例如Ser228Pro(S228P，其可以防止或减少链交换)，和/或第235个氨基酸残基被改变，例如Leu235Glu(L235E，其可以改变Fc受体相互作用。
在某些实施方案中，抗原结合结构域和双特异性抗体分子包含一个或多个氨基酸取代，其例如通过改善或减少C1q结合和/或CDC来改变补体依赖性细胞毒性(CDC)(参见例如，WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821)；和关于Fe区域变体的其他实例的WO94/29351。
在某些实施方案中，抗原结合结构域和双特异性抗体分子在Fc区的界面中包含一个或多个氨基酸取代，以协助和/或促进异二聚化。这些修饰包括将突起引入第一Fc多肽中和将腔引入第二Fc多肽中，其中突起可以位于腔中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用而形成异二聚体或复合物。生成具有这些修饰的抗体的方法在本领域中是已知的，例如，如在美国专利号5,731,168中所述。
E.缀合物
在一些实施方案中，双特异性抗体分子还包含缀合物部分。缀合物部分可以连接至双特异性抗体分子。缀合物部分是可以附着至双特异性抗体分子的非蛋白质部分。涵盖多种缀合物部分可以与本文提供的双特异性抗体分子连接(参见，例如，“ConjugateVaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(eds.),Carger Press,New York,(1989))。这些缀合部分可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入(intercalation)、配位结合、络合、缔合、掺合或加入等方法与双特异性抗体分子连接。
在某些实施方案中，可以将本文公开的双特异性抗体分子工程化为在表位结合部分之外包含可以用于结合一种或多种缀合物的特异性位点。例如，这样的位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，如例如半胱氨酸或组氨酸残基，以协助与缀合物的共价连接。
在某些实施方案中，双特异性抗体分子可以间接地或通过另一个缀合物部分与缀合物部分连接。例如，可以将双特异性抗体分子与生物素缀合，然后间接地缀合至与抗生物素蛋白缀合的第二缀合物部分。缀合物部分可以是清除修饰剂、毒素(例如化学治疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)或纯化部分。
“毒素”可以是对细胞有害或可以损害或杀死细胞的任何试剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替诺泊苷，长春新碱，MMAE，MMAF，DM1，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素及其类似物，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷基化剂(例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素(以前称为更生霉素)、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))，抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)，拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)，酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)，放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素)，发光标记，发色团部分，洋地黄毒苷，生物素/亲和素，DNA分子或用于检测的金。
在某些实施方案中，缀合物部分可以是清除修饰剂，其帮助增加抗体的半衰期。示例说明性实例包括水溶性聚合物，例如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果附着多于一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。
在某些实施方案中，缀合物部分可以是纯化部分，例如磁珠。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体分子用于缀合物的基础。
F.多核苷酸和重组方法
本公开提供了编码本文提供的双特异性抗体分子的分离的多核苷酸。
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，所述多核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可以通过生成其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(参见Batzer等人，NucleicAcid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
在某些实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：9、10、19、20所示的一个或多个核苷酸序列和/或其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并取代的变体，并编码本文提供的示例性抗体的可变区。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。编码DNA也可以通过合成方法获得。
使用本领域已知的重组技术，可以将编码双特异性抗体分子(例如，包括表3和表6所示的序列)的分离的多核苷酸插入载体中以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。许多载体是可得的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)以及转录终止序列。
本公开提供了包含本文提供的编码双特异性抗体分子的核酸序列的载体(例如表达载体)，与核酸序列可操作地连接的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，和至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(例如SV40)，λ噬菌体，和M13噬菌体，质粒pcDNA3.3，pMD18-T，pOptivec，pCMV，pEGFP，pIRES，pQD-Hyg-GSeu，pALTER，pBAD，pcDNA，pCal，pL，pET，pGEMEX，pGEX，pCI，pEGFT，pSV2，pFUSE，pVITRO，pVIVO，pMAL，pMONO，pSELECT，pUNO，pDUO，Psg5L，pBABE，pWPXL，pBI，p15TV-L，pPro18，pTD，pRS10，pLexA，pACT2.2，pCMV-SCRIPT.RTM，pCDM8，pCDNA1.1/amp，pcDNA3.1，pRc/RSV，PCR 2.1，pEF-1，pFB，pSG5，pXT1，pCDEF3，pSVSPORT，pEF-Bos等。
可以将包含编码双特异性抗体分子的多核苷酸序列的载体导入宿主细胞用于进行克隆或基因表达。用于克隆或表达本文的载体中的DNA的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或更高等的真核细胞。为此目的合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。
除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于提供的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通的面包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文中是普遍可获得的和有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，沃氏克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌如例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本文提供的糖基化的双特异性抗体分子的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株和变体以及相应的允许的来自寄主的昆虫寄主细胞，所述寄主例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是可公开获得的，例如，苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这些病毒可用作根据本发明的本文的病毒，特别用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且在培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(在悬浮培养中亚克隆生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝癌细胞系(Hep G2)。在一些优选的实施方案中，宿主细胞是293F细胞。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于产生双特异性抗体分子并在经适当修饰的常规营养培养基中培养用于诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。在另一个实施方案中，双特异性抗体分子可以通过本领域已知的同源重组产生。
用于产生本文提供的双特异性抗体分子的宿主细胞可以在多种培养基中培养。诸如Ham的F10(Sigma)，基本必需培养基(MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)，Sigma)的可商购获得的培养基都适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或U.S.Pat.Re.30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能量来源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，双特异性抗体分子可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间中的抗体的方法。简而言之，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在双特异性抗体分子分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩来自这种表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可以包括在上述任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止不定污染物的生长。
由细胞制备的双特异性抗体分子可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。
在某些实施方案中，固定化在固相上的蛋白A用于双特异性抗体分子的免疫亲和纯化。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于在双特异性抗体分子中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和人类γ3(Guss等人，EMBO J.5:1567 1575(1986))。亲和配体所附着的基质最通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质(例如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许比琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。当双特异性抗体分子包含CH3结构域时，BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可以用于纯化。取决于要回收的抗体，还可以使用其他蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上的分馏，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅土上的色谱，在肝素SEPHAROSETM上的色谱，在阴离子或阳离子交换树脂上的色谱(例如聚天冬氨酸柱)，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，可以使用洗脱缓冲液在约2.5-4.5的pH进行包含目的抗体分子和污染物的混合物的低pH疏水相互作用色谱法，优选地在低盐浓度执行(例如，约0-0.25M的盐)。
G.药物组合物
本公开还提供了包含双特异性抗体分子和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
用于本文公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮液/分散剂、隔绝剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的其他组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂，例如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，硫基甘油，硫基乙醇酸，硫基山梨糖醇，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包含如本文所提供的双特异性抗体分子和缀合物的组合物中包含一种或多种抗氧化剂，例如甲硫氨酸，降低了双特异性抗体分子的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而改善了抗体稳定性并最大化了保质期。因此，在某些实施方案中提供了包含一种或多种如本文公开的双特异性抗体分子和一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸的组合物。还提供了通过将双特异性抗体分子与一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸混合来防止如本文提供的双特异性抗体分子的氧化、延长保质期和/或提高功效的方法。
为了进一步示例说明，药学上可接受的载体可以包括例如水性媒介物，例如氯化钠注射剂，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物例如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以加入到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
药物组合物可以是液体溶液，悬浮剂，乳剂，丸剂，胶囊剂，片剂，缓释制剂或粉剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。
在某些实施方案中，药物组合物配制成可注射的组合物。可以以任何常规形式制备可注射药物组合物，如例如液体溶液，悬浮液，乳液或适于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。用于注射的制备物可以包括准备注射的无菌和/或非热原性溶液，无菌干燥可溶产品，如准备在使用前与溶剂混合的冻干粉，包括皮下注射片剂，准备注射的无菌悬浮液，准备在使用前与媒介物组合的无菌干燥的不溶性产品，以及无菌和/或非热原性乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施方案中，单位剂量的肠胃外制备物包装在安瓿、小瓶或带针的注射器中。如本领域已知和实践的，用于肠胃外施用的所有制备物应是无菌的而不是热原性的。
在某些实施方案中，通过将如本文公开的双特异性抗体分子溶解在合适的溶剂中来制备无菌的冻干粉末。溶剂可以包含改善稳定性的赋形剂和粉末或由粉末制备的重构溶液的其他药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水，右旋糖，山梨醇，果糖，玉米糖浆，木糖醇，甘油，葡萄糖，蔗糖或其他合适的试剂。在一个实施方案中，溶剂可以包含在约中性pH的缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂。溶液的随后无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，提供了理想的制剂。在一个实施方案中，将所得溶液分配到小瓶中用于冻干。每个小瓶可以包含单剂量或多剂量的双特异性抗体分子或其组合物。可以接受超出一个剂量或一组剂量所需(例如约10％)的少量过量灌装小瓶，以利于准确的样品抽取和准确给药。冻干的粉末可以在适当的条件下，例如在约4℃至室温储存。
冻干粉末与注射用水的重构提供了用于肠胃外施用的制剂。在一个实施方案中，为了重构，将无菌的和/或非热原性的水或其他液体合适载体加入到冻干的粉末中。精确的量取决于给予的所选择的疗法，并可以凭经验确定。
H.使用方法
在另一方面，提供了用于治疗受试者中将从免疫反应的上调中受益的病况的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体分子。将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况选自癌症、病毒感染、细菌感染、原生动物感染、蠕虫感染、与气道耐受性受损相关的哮喘、神经系统疾病、多发性硬化症和免疫抑制性疾病。
还提供了治疗方法，包括：向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体分子，从而治疗或预防PD-1相关和/或LAG-3相关的病况或病症。
PD-1相关的病况和病症可以是免疫相关的疾病或病症、肿瘤和癌症、自身免疫性疾病或传染性疾病。在某些实施方案中，PD-1相关的病况和病症包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肾细胞癌，结肠直肠癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，膀胱癌，食道癌，间皮瘤，黑色素瘤，头颈癌，甲状腺癌，肉瘤，前列腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，胸腺癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，蕈样真菌病，默克尔细胞癌，和其他血液系统恶性肿瘤，例如经典霍奇金淋巴瘤(CHL)，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤，EBV阳性和阴性PTLD，以及与EBV相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，浆母细胞性淋巴瘤，结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻咽癌和HHV8相关原发渗出性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)的肿瘤，例如原发性CNS淋巴瘤，脊髓轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。在某些实施方案中，肿瘤和癌症是转移性的，尤其是表达PD-L1的转移性肿瘤。
在某些实施方案中，PD-1相关的病况和病症包括自身免疫疾病。自身免疫性疾病包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其为具有自身免疫性组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性Addison病、自身免疫性糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌症、口炎性腹泻-疱疹样皮炎(celiac sprue-dermatitis hepetiformis)；慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮(cicatricial pemphigoid)、冷凝集素病、crest综合征、克罗氏病、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳氏病)、幼年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病(Meniere’s disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血(pernacious anemia)、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病(进行性系统性硬化病(PSS)，也称为系统性硬化病(SS))、Sjogren综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。
在某些实施方案中，PD-1相关的病况和病症包括感染性疾病。感染性疾病包括例如慢性病毒感染，例如真菌感染，寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如疟疾，球孢子菌病(coccidioiodmycosis immitis)，组织胞浆菌病，甲真菌病，曲霉菌病，芽孢杆菌病，白色念珠菌病，类球孢子菌病，微孢子虫病，棘阿米巴角膜炎，阿米巴病，蛔虫病，巴贝虫病，小袋虫病，Baylisascariasis，Chagas病，支睾吸虫病，锥蝇属(Cochliomyia)病，隐孢子虫病，裂头绦虫病，龙线虫病，包虫病，象皮病，蛲虫病，片吸虫病，姜片吸虫病，丝虫病，贾第虫病，颚口线虫病，膜壳绦虫病，等孢子虫病，片山热，利什曼病，莱姆病，后殖吸虫病，蝇蛆病，盘尾丝虫病，虱病，疥疮，血吸虫病，昏睡病，类圆线虫病，绦虫病，弓蛔虫病，弓形体病，旋毛虫病，鞭虫病，锥虫病，蠕虫感染，以下的感染：乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、HIV-1、HIV-2、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、卡波西韦氏肉瘤相关疱疹病毒流行病、细环病毒(Torqueteno病毒)、人T淋巴细胞营养病毒I、人T淋巴细胞营养病毒II、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒。
在一些实施方案中，已经将受试者鉴定为可能对PD-1拮抗剂应答。感兴趣的生物样品上PD-L1的存在或水平可以指示生物样品来源的受试者是否可能对PD-1拮抗剂应答。可以使用多种方法来测定来自受试者的测试生物样品中PD-L1的存在或水平。例如，测试生物样品可以暴露于抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其结合并检测表达的PD-L1蛋白。备选地，也可以使用诸如定量聚合酶链反应(qPCR)、逆转录酶PCR、微阵列、基因表达的系列分析(SAGE)、荧光原位杂交(FISH)等等的方法在核酸表达水平上检测PD-L1。在一些实施方案中，测试样品衍生自癌细胞或组织，或者肿瘤浸润免疫细胞。在某些实施方案中，测试生物学样品中PD-L1的存在或上调水平指示应答的可能性。如本文所用，术语“上调的”是指与使用相同抗体检测的参考样品中的PD-L1蛋白水平相比，测试样品中PD-L1的蛋白水平不低于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更高的总升高。参考样品可以是从健康或未患病的个体获得的对照样品，或者是从获得测试样品的同一个人获得的健康或未患病的样品。例如，参考样品可以是与测试样品(例如肿瘤)相邻或附近的未患病样品。
在一些实施方案中，受试者对PD-1拮抗剂疗法或PD-L1抑制剂疗法有抗性或已发展出抗性。例如，受试者可以是在用PD-1抑制剂(例如，本文所述的抗体分子)和/或PD-L1抑制剂(例如，抗体分子)的疗法期间进展(例如经历肿瘤生长)的受试者。
本公开还提供了治疗方法，包括：向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体分子，从而治疗或预防LAG-3相关的病况或病症。在一些实施方案中，LAG-3相关的病况或病症是癌症或感染性疾病。
癌症的实例包括但不限于淋巴瘤，膀胱癌，骨癌，脑和中枢神经系统癌，乳腺癌，子宫或子宫内膜癌，直肠癌，食道癌，头颈癌，肛门癌，胃肠道癌，上皮内肿瘤，肾脏或肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)，黑素瘤，骨髓瘤，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，外阴癌，内分泌系统癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，阴茎癌，儿童期实体瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，垂体腺瘤或表皮样癌。
免疫抑制分子，例如PD-1和LAG-3/TIM3，可以调节例如协同调节T细胞功能以促进肿瘤免疫逃逸。在某些实施方案中，可以施用本文所提供的双特异性分子以治疗癌症，例如但不限于实体瘤。在一些实施方案中，受试者是在用PD-1抑制剂(例如本文所述的抗体分子)和/或PD-L1抑制剂(例如抗体分子)疗法期间进展(例如经历肿瘤生长)的受试者。
本文提供的双特异性抗体分子的治疗有效量将取决于本领域已知的多种因素，如例如体重、年龄、既往病史、当前用药、受试者的健康状况以及潜在的交叉反应、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。如这些和其他情况或要求所示，本领域普通技术人员(例如医师或兽医)可以按比例减少或增加剂量。
在某些实施方案中，可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量施用本文提供的双特异性抗体分子。在这些实施方案的某些中，以约50mg/kg或更少的剂量施用双特异性抗体分子，并且在这些实施方案的某些中，剂量是10mg/kg或更少，5mg/kg或更少，3mg/kg或更少，1mg/kg或更少，0.5mg/kg或更少，或0.1mg/kg或更少。在某些实施方案中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在治疗过程中变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单剂量，或者可以随时间施用数个分开的剂量。
本文公开的双特异性抗体分子可以通过本领域已知的任何途径施用，如例如肠胃外(例如皮下，腹膜内，静脉内，包括静脉内输注，肌内，或皮内注射)或非肠胃外(例如口服，鼻内，眼内，舌下，直肠或局部)途径。
在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体分子可以单独施用或者与一种或多种另外的治疗手段或试剂组合施用。例如，本文公开的双特异性抗体分子可以与另一种治疗剂，例如化学治疗剂或抗癌药组合施用。
在这些实施方案的某些中，与一种或多种另外的治疗剂组合施用的本文公开的双特异性抗体分子可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用，并且在这些实施方案的某些中，双特异性抗体分子和另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的双特异性抗体分子不必与该试剂同时或在相同的组合物中施用。即使在双特异性抗体分子和第二种试剂经由不同途径施用的情况下，也认为在另一种试剂之前或之后施用的双特异性抗体分子与该试剂“组合”施用，如该短语在本文中使用的。在可能的情况下，根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表或根据Physicians's DeskReference 2003(《Physicians'Desk Reference,57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；57th edition(November 2002))或本领域众所周知的方案施用与本文公开的双特异性抗体分子组合施用的另外的治疗剂。
本公开进一步提供了使用该双特异性抗体分子的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了检测样品中LAG-3和/或PD-1的存在或量的方法，包括使样品与双特异性抗体分子接触，并测定样本中LAG-3和/或PD-1的存在或量。
在一些实施方案中，本公开还提供了本文提供的双特异性抗体分子在制备用于治疗受试者的PD-1和/或LAG-3相关的疾病或病况的药物中的用途。
I.优点
本文提供的双特异性抗体在许多方面好于现有疗法。例如，本文提供的双特异性抗体可以阻断PD-1和Lag-3途径，并且它们特别抑制Treg功能并复活耗尽的T细胞。本文提供的双特异性抗体好于单特异性抗PD-1抗体，或单特异性抗Lag-3抗体，或者单特异性抗PD-1抗体和单特异性抗Lag-3抗体的组合。本文提供的双特异性抗体的有利之处还在于它们与人、猴PD-1和Lag-3具有交叉反应，但与鼠PD-1没有交叉反应。本文提供的双特异性抗体也不与人CTLA-4、CD28或CD4蛋白交叉反应。本文提供的双特异性抗体显示出优异的体内黑色素瘤抑制作用。因此，该双特异性抗体可以用于治疗对抗PD-1疗法有抗性或从抗PD-1疗法中复发的患者。
提供以下实施例以更好地示例说明所要求保护的发明并且不理解为限制本发明的范围。以下描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法无意于限制本发明，而仅仅是为了示例说明落入本发明范围内的特定实施方案。本领域技术人员可以开发等同的组合物、材料和方法，而无需行使创造性能力并且不脱离本发明的范围。将理解的是，可以在本文描述的过程中做出许多变化而仍然保持在本发明的范围内。发明人的意图是这种变化包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：W3055-1.153.7单克隆抗体的生成和表征
如PCT申请号：PCT/CN2016/094624中所述获得全人W3055-1.153.7，具有SEQ IDNO：17的重链可变区，SEQ ID NO：18的κ轻链可变区，和人IgG4恒定区。如在PCT申请号PCT/CN2016/094624中所公开的，通过SPR，W3055-1.153.7对重组人PD-1的亲和力是2.79nM。通过FACS测定的，W3055-1.153.7结合食蟹猴PD-1但不结合鼠PD-1。W3055-1.153.7特异性结合PD-1，但不结合PD-1家族的CD28和CTLA4。分区(binning)测试的SPR测定法和FACS的结果表明，W3055-1.153.7结合的人PD-1上的表位不同于现有的PD-1抗体(即基准抗体纳武单抗(nivolumab)(BMS专利US9084776B2的5C4克隆)和派姆单抗(pembrolizumab)(在US8354509B2和WO2008156712A1中公开为克隆hPD-1.09A)。[3H]胸苷掺入测定法显示W3055-1.153.7增强了浓度依赖性T细胞增殖。
在W3055-1.153.7的存在下，用同种异体树突细胞(DC)刺激人CD4+T细胞，通过ELISA其以剂量方式增加IL-2分泌、IFNγ分泌。如通过[3H]胸苷掺入评估的，W3055-1.153.7增强了由载有CMV pp65肽的自体DC刺激的浓度依赖性CMV+-CD4+T细胞增殖。W3055-1.153.7消除了Treg的抑制功能并恢复了响应T细胞增殖和IFNγ分泌，如通过[3H]胸苷掺入评估的。
W3055-1.153.7不具有ADCC和CDC功能。
实施例3：人W3395-3.40.19LAG-3Ab单克隆抗体的生成和表征
如PCT/CN2019/076356中所述生成单克隆人LAG-3抗体W3395-3.40.19。通常，用人LAG-3抗原免疫OMT大鼠(具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠，如US8,907,157B2中所述并产生)以获得其中框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列的抗体。分离、选择并亚克隆通过免疫的大鼠淋巴结和脾脏与骨髓瘤细胞融合生成的杂交瘤。提取杂交瘤的总RNA，并且合成和扩增cDNA。将VH和VL基因重新扩增并克隆到表达载体中以创建抗体的相应克隆。
通过FACS，W3395-3.40.19对细胞表面人LAG-3的结合亲和力具有EC50值为0.13nM，其远低于BMK7(0.61nM，在US 20170101472 A1中称为“H4sH15482P”)和BMK8(0.90nM，在WO2015138920 A1中称为“BAP050-hum01”)。在另一项亲和力测试中，通过FACS，W3395-3.40.19对细胞表面人LAG-3的结合亲和力具有KD值为5.30E-11M，其低于BMK1(2.70E-10M)、BMK7(5.80E-10M)和BMK8(9.40E-10M)。
通过FACS，W3395-3.40.19以0.67nM的EC50阻断LAG-3蛋白与Raji细胞上表达的MHC-II的结合，这好于BMK7(EC50为1.25nM)和BMK8(EC50为0.88nM)或与之相当。W3395-3.40.19还阻断LAG-3蛋白与LSECtin和Galectin-3的结合。在ELISA测试中，W3395-3.40.19以0.51nM的EC50阻断LSECtin，以0.56nM的EC50阻断Galectin-3，这好于BMK7(EC50分别为0.59和0.79nM)和BMK8(EC50分别为1.06和1.07nM)或与之相当。在表面等离子体共振(SPR)的测试中，W3395-3.40.19以1.06E-11M的KD值结合人LAG-3，这低于BMK1(6.85E-10M)、BMK7(4.97E-10M)和BMK8(7.97E-11M)。
测试到W3395-3.40.19以3.92nM的EC50值结合食蟹猴LAG-3，并且弱结合鼠LAG-3。W3395-3.40.19不结合人CD4蛋白。
在表位分区测试中，显示W3395-3.40.19具有与所有BMK1、BMK7和BMK5不同的表位(在WO2015138920 A1中称为“BAP050-chi”)。
W3395-3.40.19以0.21nM的EC50增强了报告基因测定法中Jurkat的IL-2途径，低于BMK7(2.65nM)和BMK8(65.3nM)。在人类同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)测试中，W3395-3.40.19增强了IFN-γ分泌和T细胞增殖。W3395-3.40.19不介导ADCC和CDC作用。此外，W3395-3.40.19在新鲜的人血清中稳定长达14天。
实施例4.双特异性抗体的构建和表征
1.抗原和其他蛋白质的产生
1.1抗原的产生
由Sangon Biotech合成了编码人PD-1，人和小鼠LAG-3ECD(细胞外结构域)的核酸。从合成的核酸中扩增PD-1或LAG-3基因片段，并将其插入表达载体pcDNA3.3(ThermoFisher)中。通过DNA测序进一步证实了插入的PD-1或LAG-3基因片段。通过将人PD-1或LAG-3基因转染到293F细胞(ThermoFisher)中，获得了含有人LAG-3ECD与多种标签，包括人Fc、小鼠Fc的融合蛋白。将细胞在37℃，5％CO2的FreeStyle 293表达培养基中培养。培养5天后，从瞬时转染的细胞的培养物中收获上清液用于蛋白质纯化。融合蛋白通过蛋白A和/或SEC柱纯化。通过使用因子Xa蛋白酶裂解带有切割位点的ECD-hFc融合蛋白生成未不带标签LAG-3 ECD蛋白。纯化的蛋白质用于筛选和表征。
如上所述产生带小鼠Fc标签的人PD-L1 ECD、人CTLA-4 ECD和CD28 ECD。
1.2基准抗体的生产
基于专利申请US20110150892A1(W339-BMK1被称为“25F7”)和WO2006121168(W305-BMK1被称为“5C4”)中公开的信息合成了抗人PD-1或LAG-3基准抗体的基因序列(W339-BMK1和W305-BMK1)。
分别基于专利申请WO2015200119A8(W365-BMK1被称为“SEQ25&SEQ27”)、WO2017087589A2(W365-BMK2被称为“SEQ110”)和WO2015200119A8(W365-BMK3被称为“SEQ 5和4”)合成抗人PD-1xLAG-3基准抗体W365-BMK1、W365-BMK2和W365-BMK3的序列。合成的基因序列掺入质粒pcDNA3.3。将用质粒转染的细胞培养5天，并收集上清液用于使用蛋白A柱的蛋白纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析获得的基准抗体，然后保存在-80℃。
2.细胞系生成
生成人、猕猴PD-1或LAG-3转染细胞系。简而言之，根据制造商的说明，使用Lipofectamine转染试剂盒分别用含有全长人、食蟹猴PD-1或LAG-3的pcDNA3.3表达载体转染CHO-S或293F细胞。转染后48-72小时，将转染的细胞在含有杀稻瘟素的培养基中培养以进行选择并测试靶标表达。通过有限稀释获得表达人PD-1的单克隆细胞系和表达食蟹猴LAG-3的单克隆细胞系。
使用Nucleofactor(Lonza)，用含有人全长PD-1/NFAT报道子或LAG-3/IL-2报道子的质粒转染Jurkat细胞系。转染后72小时，将转染的细胞在含有潮霉素的培养基中培养以进行选择并测试靶标表达。两个月后获得表达人PD-1或LAG-3以及稳定整合的NFAT或IL-2荧光素酶报道基因的Jurkat细胞。
3.双特异性抗体生成
1.构建表达载体
使用分子生物学方案进行双特异性抗体的构建。简而言之，对于W365-G14，编码在C末端带有抗LAG3抗体的scFv(VH-(G4S)3-VL)的抗PD-1抗体轻链，以及人IgG4(S228P)重链恒定区上的抗PD1抗体重链的DNA序列分别克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中。
对于W365-G15，编码抗PD-1抗体的轻链，和具有在人IgG4(S228P)重链恒定区C末端的抗-LAG3抗体的scFv(VH-(G4S)3-VL)的抗PD-1抗体重链的DNA序列分别克隆到修饰的pcDNA3.3表达载体中。
4.体外表征
4.1 W365-G14和W365-G15对人PD-1或LAG-3蛋白的结合
分别在4℃用W365-G14和W365-G15包被平板过夜。封闭和洗涤后，将多种浓度的带小鼠Fc标签PD-1蛋白或LAG-3蛋白加入到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤平板，并随后与HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。使用多孔板读数器在450nm处读取吸光度。
如图1和表9所示，W365-G14和W365-G15与PD-1蛋白结合的EC50与基准相当。
表9.W365-G14和W365-G15结合人PD-1蛋白的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 0.07
W365-G15 0.07
W305-BMK1 0.09
W365-BMK1 0.15
W365-BMK2 0.18
W365-BMK3 0.09
如图2和表10所示，W365-G14和W365-G15结合LAG-3蛋白的EC50与基准相当。
表10.W365-G14和W365-G15结合人LAG-3蛋白的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 0.27
W365-G15 0.32
W305-BMK1 0.23
W365-BMK1 0.35
W365-BMK2 0.28
W365-BMK3 0.25
4.2 W365-G14和W365-G15对细胞表面人PD-1或LAG-3的结合
将人PD-1表达细胞或瞬时转染的人LAG-3表达293F细胞分别与多种浓度的W365-G14和W365-G15孵育。PE标记的山羊抗人IgG抗体用于检测W365-G14和W365-G15在细胞上的结合。通过流式细胞术测量细胞的MFI并通过FlowJo(7.6.1版)进行分析。
如图3和表11所示，W365-G14和W365-G15结合细胞表面人PD-1的EC50与基准相当。
表11.W365-G14和W365-G15结合细胞表面人PD-1的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 1.32
W365-G15 1.34
W339-BMK1 0.50
W365-BMK1 1.96
W365-BMK2 0.82
W365-BMK3 1.32
如图4和表12所示，W365-G14和W365-G15结合细胞表面人LAG-3的EC50与基准相当。
表12.W365-G14和W365-G15结合细胞表面人LAG-3的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 2.57
W365-G15 5.88
W305-BMK1 2.40
W365-BMK3 0.96
4.3 W365-G14和W365-G15对细胞表面食蟹猴PD-1或LAG-3的结合
将食蟹猴PD-1或LAG-3表达293F细胞分别与多种浓度的W365-G14和W365-G15孵育。PE标记的山羊抗人IgG抗体用于检测W365-G14和W365-G15在细胞上的结合。通过流式细胞术测量细胞的MFI并通过FlowJo进行分析。
如图5和表13所示，W365-G14和W365-G15结合细胞表面食蟹猴PD-1的EC50与基准相当。
表13.W365-G14和W365-G15结合细胞表面食蟹猴PD-1的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 0.38
W365-G15 0.31
W305-BMK1 0.28
W365-BMK3 0.33
如图6和表14所示，W365-G14和W365-G15结合细胞表面食蟹猴LAG-3的EC50好于W339-BMK1。
表14.W365-G14和W365-G15结合细胞表面食蟹猴LAG-3的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 6.5
W365-G15 20.9
W339-BMK1 弱
W365-BMK3 2.0
4.4 W365-G14和W365-G15对小鼠PD-1或LAG-3的结合
对于小鼠PD-1结合，将平板分别用W365-G14和W365-G15在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将多种浓度的小鼠PD-1蛋白加入到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤平板，并随后与HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止显色反应。使用多孔板读数器在450nm处读取吸光度。
对于小鼠LAG-3结合，将平板用小鼠抗His抗体在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将带His标签的LAG-3蛋白加入到孔中。洗涤后，将多种浓度的W365-G14和W365-G15加入到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤平板，并随后与HRP标记的山羊抗人IgG抗体孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止显色反应。使用多孔板读数器在450nm处读取吸光度。
如图7A和7B所示，W365-G14和W365-G15不结合小鼠PD-1或LAG-3。
4.5对人CD4、CTLA-4和CD28的交叉反应性
通过ELISA测量对人CD4、CTLA-4或CD28的交叉反应性。将平板用1μg/mL的人CD4、CTLA-4或CD28在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将多种浓度的W365-G14和W365-G15加入到平板中，并在室温孵育1小时。然后洗涤板，并随后与相应的二抗孵育60分钟。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止显色反应。
图8A、8B和8C的结果指示W365-G14和W365-G15不结合人CTLA-4、CD28或CD4蛋白。
4.6通过SPR针对人PD-1和LAG-3的亲和力测试
使用Biacore 8K通过SPR测定法测定双特异性抗体对抗原的结合亲和力。将PD-1xLAG-3抗体捕获到固定在CM5传感器芯片(GE)上的抗人IgG Fc抗体。以30μL/min的流速将不同浓度的带His标签的人PD-1蛋白(MW：40KD)和食蟹猴PD-1(MW：40KD)注射到传感器芯片，缔合阶段是120s之后是800s解离。
对于针对人LAG-3的亲和力，将PD-1×LAG-3抗体固定在CM5传感器芯片上。将不同浓度的无标签的人LAG-3以30μL/min的流速注射到传感器芯片，缔合阶段是180s之后是3600s解离，使用单循环动力学方法。用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生芯片。
从测试传感图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图。使用Langmiur分析通过1:1模型拟合实验数据。表15和16中显示的结果指示W365-G14和W365-G15针对人PD-1和人LAG-3的亲和力均高于基准。
表15.W365-G14和W365-G15针对人PD-1的亲和力
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
W365-G14 2.83E+05 6.95E-04 2.46E-09
W365-G15 2.75E+05 5.92E-04 2.16E-09
W305-BMK1 4.02E+05 1.35E-03 3.37E-09
W365-BMK3 3.80E+05 1.36E-03 3.58E-09
表16.W365-G14和W365-G15针对人LAG-3的亲和力
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
W365-G14 3.83E+05 <1.00E-05 <2.61E-11
W365-G15 7.14E+05 1.89E-05 2.65E-11
W339-BMK1 4.87E+05 3.34E-04 6.85E-10
W365-BMK3 1.02E+07 8.70E-04 8.51E-11
4.7 W356-G14和W365-G15对人PD-1和LAG-3蛋白的双重结合
平板用1μg/mL的带小鼠Fc标签的人PD-1在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将多种浓度的W365G-14和W365-G15加入平板中，并在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤平板，并随后与带His标签的LAG-3蛋白孵育1小时。洗涤后，将HRP标记的抗His抗体加入到平板中，并在室温孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止显色反应。使用多孔板读数器在450nm处读取吸光度。
如图9和表17所示，W365-G14和W365-G15结合LAG-3蛋白的EC50与W365-BMK3相当并且好于W365-BMK1和BMK2。
表17.W365-G14和W365-G15结合人PD-1和LAG-3蛋白的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 0.04
W365-G15 0.05
W365-BMK1 2.41
W365-BMK2 0.20
W365-BMK3 0.03
4.8阻断PD-L1蛋白结合PD-1表达细胞
将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释并在4℃与带小鼠Fc标签的PD-L1蛋白混合。将混合物转移到接种有PD-1表达CHO-S细胞的96孔板中。山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体用于检测PD-L1蛋白对PD-1表达细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI并通过FlowJo软件进行分析。
如图10和表18所示，W365-G14和W365-G15阻断PD-L1对PD-1表达细胞的结合的IC50与基准相当。
表18.W365-G14和W365-G15阻断PD-1对PD-L1的结合的IC50
抗体 IC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 1.01
W365-G15 1.09
W305-BMK1 0.59
W365-BMK1 0.72
W365-BMK2 1.36
W365-BMK3 0.64
4.9阻断LAG-3蛋白结合在Raji细胞上表达的MHC-II
将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释并在4℃与带小鼠Fc标签的LAG-3蛋白孵育。将混合物转移到接种有在表面上表达MHC-II的Raji细胞的96孔板中。山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体用于检测LAG-3蛋白对Raji细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI并通过FlowJo软件进行分析。
如图11和表19所示，W365 W365-G14和W365-G15阻断LAG-3对表达MHC-II的Raji细胞的结合的IC50好于W365-BMK1和W365-BMK2，并且与其他基准相当。
表19.W365-G14和W365-G15阻断LAG-3对MHC-II的结合的IC50。
抗体 IC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 2.20
W365-G15 1.68
W339-BMK1 1.68
W365-BMK1 30.0
W365-BMK2 4.90
W365-BMK3 1.88
4.10 W365-G14和W365-G15对具有NFAT报道基因的PD-1表达Jurkat的作用
将表达人PD-1以及具有稳定整合的NFAT荧光素酶报道基因的Jurkat细胞和表达人PD-L1的人工APC(抗原呈递细胞)细胞接种在96孔板中。将测试抗体加入到细胞中。将平板在37℃，5％CO2孵育6小时。孵育后，加入重构的荧光素酶底物One-Glo并通过微孔板分光光度计测量荧光素酶强度。
如图12所示，在报告基因测定法中，抗体增强了Jurkat的NFAT途径。此外，如表20所示，此测定法中的W365-G14和W365-G15的EC50好于W365-BMK1，与其他基准抗体相当。
表20.在表达PD-1的Jurkat中NFAT途径增强的EC50
抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
W365-G14 0.40
W365-G15 0.41
W305-BMK1 0.23
W365-BMK1 3.10
W365-BMK2 0.27
W365-BMK3 0.62
4.11 W365-G14和W365-G15对具有IL-2报告基因的LAG-3表达Jurkat的作用
在SEE(葡萄球菌肠毒素E)存在下，将表达人LAG-3以及稳定整合的IL-2荧光素酶报道基因的Jurkat细胞和Raji细胞接种在96孔板中。将测试抗体加入到细胞中。将板在37℃，5％CO2孵育过夜。孵育后，加入重构的荧光素酶底物One-Glo并通过微孔板分光光度计测量荧光素酶强度。
如图13和表21所示，在报告基因测定法中抗体增强了Jurkat的IL-2途径。
表21.表达LAG-3的Jurkat中IL-2途径增强的EC50。
Figure BDA0002689405840000601
Figure BDA0002689405840000611
4.12 W365-G15对具有NFAT报道基因的表达PD-1和LAG-3的Jurkat的作用
将完整的人LAG-3质粒与稳定整合的NFAT荧光素酶报道基因一起瞬时转染到表达人PD-1的Jurkat细胞中。48小时后，将细胞与Raji细胞一起在SEE(葡萄球菌肠毒素E)存在下接种于96孔板中。将测试抗体加入到细胞中。平板在37℃，5％CO2孵育过夜。孵育后，加入重构的荧光素酶底物One-Glo并通过微孔板分光光度计测量荧光素酶强度。
如图14所示，在报告基因测定法中，抗体增强了表达PD-1和LAG-3的Jurkat的NFAT途径。倍数高于W305-BMK1和W339-BMK1的组合以及其他基准抗体。
4.13 W365-G15对人同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的作用
使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的说明，使用人单核细胞富集试剂盒分离单核细胞。将细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7天以生成树突细胞(DC)。根据制造商的方案，使用人CD4+T细胞富集试剂盒分离人CD4+T细胞。在存在多种浓度的W365-G15的情况下，将纯化的CD4+T细胞与同种异体未成熟DC(iDC)共培养在96孔板中。将板在37℃，5％CO2孵育。分别在第3天和第5天收获上清液用于IL-2和IFN-γ测试。使用匹配的抗体对通过ELISA测量人IL-2和IFN-γ的释放。重组人IL-2和IFN-γ分别用作标准品。平板分别用对人IL-2或IFN-γ特异的捕获抗体预包被。封闭后，将50μL的标准品或样品吸移到每个孔中并在环境温度孵育2小时。除去未结合的物质后，将对相应细胞因子具有特异性的生物素缀合的检测抗体加入到孔中并孵育一小时。然后将HRP标记的链霉亲合素蛋白加入到孔中在环境温度孵育30分钟。通过分配50μL的TMB底物显色，并然后用50μL 2N HCl终止。使用微孔板分光光度计在450nM处读取吸光度。
如图15A和15B所示，W365-G15增强了混合淋巴细胞反应中的IL-2和IFN-γ分泌。
4.14 W365-G15对人PBMC激活的影响
在SEB的存在下，将PBMC和多种浓度的PD-1×LAG-3抗体共培养在96孔板中。将平板在37℃，5％CO2孵育3天，并收集上清液用于IL-2测试。通过ELISA测量人IL-2的释放。如第4.13节所述，通过ELISA测量人IL-2释放。
如图16所示，W365-G15增强了用SEB刺激的PBMC中IL-2和IFN-γ分泌。
4.15通过差示扫描荧光法(DSF)的热稳定性测试
使用QuantStudioTM 7Flex Real-time PCR系统(Applied Biosystems)研究了抗体的Tm。将19μL抗体溶液与1μL 62.5x SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合，然后转移到96孔板中。将板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集得到的荧光数据。计算相对于不同温度的荧光变化的负导数，并将最大值定义为熔融温度Tm。如果蛋白质具有多个解折叠转换，则报告前两个Tm，分别命名为Tm1和Tm2。数据收集和Tm计算由操作软件自动进行。结果示于表22。
表22.PD-1×LAG-3双特异性抗体的Tm
Figure BDA0002689405840000621
4.16血清稳定性
先导抗体在37℃在新鲜分离的人血清(血清含量＞95％)中孵育。在指定的时间点，从培养箱中取出等分的血清处理样品，并在液氮中速冻，然后保存在80℃至准备测试。在稳定性测试之前，立即将样品快速融化。
将平板用1μg/mL的带小鼠Fc标签的人PD-1在4℃包被过夜。封闭并洗涤后，将多种浓度的W365-G14和W365-G15加入平板中，并分别在洗涤后在室温孵育1小时。然后洗涤板，并随后与带His标签的LAG-3蛋白孵育1小时。洗涤后，将HRP标记的小鼠抗His抗体加入板中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止显色反应。用多孔板读数器在450nm处读取吸光度。
在图17A和17B中证明了W365-G14和W365-G15在新鲜人血清中稳定长达14天。
5.体内表征
PD-1×LAG-3抗体的体内抗肿瘤活性
使用人PD-1/LAG-3敲入小鼠(Biocytogen)和B16F10肿瘤模型来评估W365-G15在体内抑制肿瘤细胞生长的能力。在第0天将1×106只小鼠黑素瘤细胞B16F10皮下植入小鼠，并且当肿瘤达到60-70mm3时将小鼠分组(n＝8)。
在第0、3、6和9天，分别用单独的PD-1mAb(W305-BMK1)(10mg/kg)，单独的LAG-3mAb(W339-BMK1)(10mg/kg)，PD-1×LAG-3抗体W365-G15(13.1mg/kg)或W305-BMK1(10mg/kg)和W339-BMK1(10mg/kg)的组合腹膜内处理小鼠。给予人IgG4同种型对照抗体(10mg/kg)作为阴性对照。
在注射后两周测量肿瘤体积和动物体重。肿瘤体积将使用以下公式以mm3表示：V＝0.5ab2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
经治疗的小鼠的肿瘤体积和存活曲线显示在图18A和18B中。结果显示用W339-BMK1或W305-BMK1抗体的治疗对hLAG-3/hPD-1敲入小鼠的B16F10肿瘤生长的抑制作用很小，而W365-G15比单独的W339-BMK1或单独的W305-BMK1导致更大的肿瘤生长抑制。W365-G15的功效与PD-1和LAG-3抗体的组合相当。同时，在图18B中，每组的体重增加指示安全性良好，没有明显的毒性。
为了在两组之间进行比较，使用T检验分析数据；为了在三个或更多组之间进行比较，使用双向ANOVA分析数据。Graphpad Prism用于所有数据分析。p<0.05认为具有显著差异。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离本发明的精神或中心属性的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。由于本发明的前述描述仅公开了本发明的示例性实施方式，其他变化应该被理解为在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 新型双特异性PD-1/LAG-3抗体分子
<130> 053674-8028WO02
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Val Val
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人
<400> 8
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Thr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ser Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人
<400> 9
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtga ctccatcagc agtactagtt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtttct attatagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atttccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaactctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgaggatg 300
cagctatggt cgtacgatgt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 10
<211> 333
<212> DNA
<213> 人
<400> 10
cagtctgccc tgactcaacc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gggtatgact atgtcgcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagtccccaa actcatgatt tatgatgtca gtgagcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcaccac cactctcgtt 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgtccgtc ctg 333
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala Met Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 12
Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 13
Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 14
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Asp Val His
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人
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Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人
<400> 16
Gln Val Trp Asp Ser Ile Trp Val
1 5
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 105
<212> PRT
<213> 人
<400> 18
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Asp Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Gly Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ile Trp Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> 人
<400> 19
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactg 60
tcctgcgcag cctctggatt cacctttagc agccatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attactggtg gtggtggtag catatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attattgtgc gaaaaaccgc 300
gctggggagg gttactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 20
<211> 315
<212> DNA
<213> 人
<400> 20
tcctatgagc tgactcagcc actctcagtg tcagtggccc tgggacagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gagacaacat tggaaataaa gatgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcat ctatagggat agcaaccggc cctctgggat ccctgaggga 180
ttctctggct ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcagagc ccaagccggg 240
gatgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacagcattt gggtgttcgg cggagggacc 300
aagctgaccg tccta 315
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 21
Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 22
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 23
Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 24
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 25
Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 26
Met Gln Leu Thr His Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
caggtgcagc tggtccagtc tggagctgag gtgaagaaac ccggcagctc cgtgaaggtc 60
agttgcaaag catcaggctt cacttttacc acatactata tctcttgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagta cctgggctat attaacatgg ggtccggcgg gaccaactac 180
aatgaaaagt tcaaagggcg ggtgactatc accgcagaca agtccacatc tactgcctat 240
atggagctgt ctagtctgag atccgaagac acagccgtct actattgtgc tattatcggc 300
tactttgatt attgggggca gggaacgatg gtgacagtct caagc 345
<210> 30
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
gacgtggtca tgactcagtc tcccctgtcc ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60
atcagttgcc gaagctccca gtcactgctg gacagcgatg ggggtacata cctgtattgg 120
tttcagcaga gaccaggaca gagcccccgg cggctgatct acctggtgtc caccctggga 180
tctggagtcc ctgacaggtt ctcaggaagc ggctccggga ccgacttcac cctgaagatt 240
agccgcgtgg aggccgaaga tgtgggggtc tactattgta tgcagctgac tcactggcca 300
tatacctttg gacagggcac aaagctggag atcaag 336
<210> 31
<211> 446
<212> PRT
<213> 人
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 32
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Asp Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Gly Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ile Trp Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys
115 120 125
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr
130 135 140
Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr
145 150 155 160
Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys
180 185 190
Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr
195 200 205
Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Gln
210 215 220
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr Ser Tyr Tyr
245 250 255
Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
260 265 270
Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
275 280 285
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
290 295 300
Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
325 330 335
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
355 360 365
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
385 390 395 400
Val Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val
405 410 415
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
420 425 430
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
435 440 445
Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
450 455 460
Ser Val Leu
465
<210> 33
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
465 470 475 480
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser
485 490 495
Thr Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro
515 520 525
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
530 535 540
Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val Trp Gly
565 570 575
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala
595 600 605
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly
610 615 620
Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln
625 630 635 640
His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg
645 650 655
Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
660 665 670
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
675 680 685
Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly
690 695 700
Gly Thr Lys Leu Ser Val Leu
705 710
<210> 34
<211> 211
<212> PRT
<213> 人
<400> 34
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Asp Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Gly Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ile Trp Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys
115 120 125
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr
130 135 140
Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr
145 150 155 160
Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys
180 185 190
Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr
195 200 205
Glu Cys Ser
210
<210> 35
<211> 327
<212> PRT
<213> 人
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人
<400> 36
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 37
<211> 326
<212> PRT
<213> 人
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 38
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
145 150 155 160
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln His
165 170 175
Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala
195 200 205
Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Ser Val Leu
245
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Thr Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5

Claims (45)

1.一种双特异性抗体分子，包含LAG-3结合结构域和PD-1结合结构域，其中：
LAG-3结合结构域包含：
选自SEQ ID NO：1-3的1、2或3个重链互补决定区(CDR)序列；和/或
选自SEQ ID NO：4-6的1、2或3个轻链CDR序列，和
PD-1结合结构域包含：
选自SEQ ID NO：11-13的1、2或3个重链互补决定区(CDR)序列；和/或
选自SEQ ID NO：14-16的1、2或3个轻链CDR序列，
LAG-3结合结构域包含独立地选自Fab和单链Fv抗体(scFv)中的一种；和
PD-1结合结构域包含独立地选自Fab和scFv中的一种。
2.权利要求1的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含Fab。
3.权利要求1的双特异性抗体分子，其中PD-1结合结构域包含Fab。
4.权利要求1或3的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含scFv。
5.权利要求1或2的双特异性抗体分子，其中PD-1结合结构域包含scFv。
6.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：1-3的1、2或3个CDR序列，和/或轻链可变区，其包含选自SEQ IDNO：4-6的1、2或3个CDR序列。
7.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含包括SEQID NO：7的重链可变区，和其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力的同源序列。
8.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含包括SEQID NO：8的轻链可变区，和其具有至少80％序列同一性而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力的同源序列。
9.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含包括SEQID NO：7的重链可变区和包括SEQ ID NO：8的轻链可变区。
10.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中PD-1结合结构域包含重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：11-13的1、2或3个CDR序列，和/或轻链可变区，其包含选自SEQID NO：14-16的1、2或3个CDR序列。
11.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中PD-1结合域包含SEQ ID NO：17的重链可变区或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力的同源序列。
12.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中PD-1结合结构域包含SEQ IDNO：18的轻链可变区，或其具有至少80％序列同一性而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力的同源序列。
13.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中PD-1结合结构域包含包括SEQID NO：17的重链可变区和包括SEQ ID NO：18的轻链可变区。
14.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰而仍保留对LAG-3的特异性结合亲和力，和/或PD-1结合结构域还包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰而仍保留对PD-1的特异性结合亲和力。
15.权利要求14的双特异性抗体分子，其中取代或修饰中的至少一个在一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个VH或VL序列中但不在任何一个CDR序列中。
16.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中双特异性抗体分子还包含免疫球蛋白(Ig)恒定区，任选地人Ig的恒定区，或任选地人IgG的恒定区。
17.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域可操作地连接于PD-1结合结构域的N末端或C末端。
18.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域包含scFv和PD-1结合结构域包含Fab。
19.权利要求18的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合性scFv包含SEQ ID NO：38的序列，并且PD-1结合性Fab包含包括SEQ ID NO：17的序列的重链可变区和包括SEQ ID NO：18的序列的轻链可变区。
20.权利要求18或19的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合性scFv可操作地连接于PD-1结合性Fab之后的轻链恒定区的C末端。
21.权利要求20的双特异性抗体分子，其中双特异性抗体包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3，其与以下形式的轻链缔合：VL(抗PD-1)-CL-间隔区-scFv(抗LAG-3)。
22.权利要求21的双特异性抗体分子，包含包括SEQ ID NO：31的序列的重链和包括SEQID NO：32的序列的轻链。
23.权利要求18或19的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合性scFv可操作地连接于PD-1结合性Fab之后的重链恒定区的C末端。
24.权利要求23的双特异性抗体分子，其中双特异性抗体包含以下形式的重链：VH(抗PD-1)-CH1-铰链-CH2-CH3-间隔区-scFv(抗LAG-3)，其与轻链VL(抗PD-1)-CL缔合。
25.权利要求24的双特异性抗体分子，包含包括SEQ ID NO：33的序列的重链和包括SEQID NO：34的序列的轻链。
26.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其中LAG-3结合结构域和/或PD-1结合结构域是全人的或人源化的。
27.前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子，其与一个或多个缀合物部分连接。
28.权利要求27的双特异性抗体分子，其中缀合物部分包含清除修饰剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其他抗癌药。
29.一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项的双特异性抗体分子和药学上可接受的载体。
30.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-28的双特异性抗体分子。
31.权利要求30的分离的多核苷酸，包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、29和30的核苷酸序列，和/或其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并取代的变体。
32.一种载体，包含权利要求30或31的分离的多核苷酸。
33.一种宿主细胞，包含权利要求32的载体。
34.表达权利要求1-28中任一项的双特异性抗体分子的方法，包括在表达权利要求32的载体的条件下培养权利要求33的宿主细胞。
35.一种治疗受试者的将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-28中任一项的双特异性抗体分子或权利要求29的药物组合物。
36.权利要求35的方法，其中将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况选自下组：癌症、病毒感染、细菌感染、原生动物感染、蠕虫感染、与气道耐受性受损相关的哮喘、神经系统疾病、多发性硬化症和免疫抑制性疾病。
37.权利要求35或36的方法，其中疾病或病况是PD-1相关的和/或LAG-3相关的。
38.权利要求35-37中任一项的方法，其中PD-1相关的疾病或病况是癌症或传染病。
39.权利要求35-38中任一项的方法，其中LAG-3相关的疾病或病况是癌症。
40.权利要求38和39中任一项的方法，其中癌症是淋巴瘤、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
41.权利要求35-40中任一项的方法，其中受试者是人。
42.权利要求35-41中任一项的方法，其中施用是经由口服、经鼻、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。
43.一种调控表达LAG-3的细胞中LAG-3活性的方法，包括将表达LAG-3的细胞暴露于权利要求1-28中任一项的双特异性抗体分子。
44.权利要求1-28中任一项的双特异性抗体分子在制备用于治疗将从免疫应答的上调中受益的疾病或病况的药物中的用途。
45.权利要求1-28中任一项的双特异性抗体分子在制备用于治疗与PD-1和/或LAG-3相关的疾病或病症的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114144429B (zh) * 2019-07-16 2023-10-13 上海药明生物技术有限公司 针对pd-1和lag-3的双特异性抗体
CN110950966B (zh) * 2019-12-13 2020-12-11 启辰生生物科技(珠海)有限公司 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途
BR112022012437A2 (pt) * 2019-12-23 2022-09-20 Macrogenics Inc Método de tratamento de um câncer compreendendo a administração de uma molécula biespecífica pd-1 x lag-3 a um indivíduo em necessidade deste e método de tratamento de um câncer em um indivíduo
BR112023019703A2 (pt) * 2021-03-31 2023-10-31 Incyte Corp Frações de ligação multiespecíficas compreendendo novos domínios de ligação à pd-1

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015042246A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
WO2015200119A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Macrogenics, Inc. Covalently bonded diabodies having immunoreactivity with pd-1 and lag-3, and methods of use thereof
WO2016110593A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-14 Immutep S.A.S. Combined preparations for the treatment of cancer or infection
WO2017025498A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Novel fusion polypeptide specific for lag-3 and pd-1
WO2017087589A2 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1 and/or lag3 binders
WO2018217944A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
WO2019009728A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Merus N.V. ANTIBODIES THAT MODULATE A BIOLOGICAL ACTIVITY EXPRESSED BY A CELL

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3328419B1 (en) * 2015-07-30 2021-08-25 MacroGenics, Inc. Pd-1-binding molecules and methods of use thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015042246A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
WO2015200119A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Macrogenics, Inc. Covalently bonded diabodies having immunoreactivity with pd-1 and lag-3, and methods of use thereof
WO2016110593A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-14 Immutep S.A.S. Combined preparations for the treatment of cancer or infection
WO2017025498A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Novel fusion polypeptide specific for lag-3 and pd-1
WO2017087589A2 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1 and/or lag3 binders
WO2018217944A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
WO2018217940A2 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
WO2019009728A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Merus N.V. ANTIBODIES THAT MODULATE A BIOLOGICAL ACTIVITY EXPRESSED BY A CELL

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