KR20230156921A - 비-활성화 항체 변이체 - Google Patents

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리차드 히버트
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Abstract

Fc 영역 등을 포함하는 단백질, 예컨대 모노클로날, 이중특이적 및 다중특이적 항체가 본원에 기재되며, 여기서 Fc 영역은 Fc-매개 이펙터 기능을 제거하거나 또는 강하게 감소시키기 위해, 동시에 치료 목적을 위해 우수한 개발가능성을 가능하게 하기 위해, 이러한 이펙터 기능이 바람직하지 않은 경우에 변형된다.

Description

비-활성화 항체 변이체
본 발명은 Fc 영역 등을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 모노클로날, 이중특이적 및 다중특이적 항체에 관한 것이며, 여기서 Fc 영역은 Fc-매개 이펙터 기능을 제거하거나 또는 강하게 감소시키기 위해, 동시에 치료 목적을 위해, 즉 우수한 개발가능성을 가능하게 하기 위해, 이러한 이펙터 기능이 바람직하지 않은 경우에 변형된다.
서론
항체는 특히 암의 치료 및 면역 조정을 위한 치료 분자로서 성공적인 것으로 입증되었다. 종양 표적-특이적 항체는 전형적으로 Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 또는 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP)을 통해 종양 세포 세포독성을 유발할 수 있다. 면역 세포-표적화 항체는 면역계의 세포, 예컨대 T 세포 및 대식세포를 부스팅할 수 있고, 이는 차례로 종양 세포 세포독성을 촉진할 수 있다. 면역계의 성분을 표적화하는 항체는 면역계 기능을 조정하는 데 사용될 수 있다.
특정 시나리오에서, 항체 요법을 통한 면역계 또는 그의 성분의 활성화는, 예컨대 (i) 시토카인을 전신 중화시키거나, (ii) 특이적 면역 세포 수용체를 차단하는 데 적용되는 경우 또는 (iii) 이펙터 세포를 표적 이환 조직으로 재지시하기 위해 이중특이적 항체를 사용하는 경우에 바람직하지 않을 수 있다 (Kang et al., Exp. Mol. Med. 2019; 51(11):1-9). 예를 들어, 면역 세포-표적화된 항체의 그의 Fc 영역을 통한 보체 성분 C1q와의 결속은, 예를 들어 표적 면역 세포의 CDC를 유발하는 전형적 보체계의 활성화를 개시할 수 있으며, 이는 바람직하지 않다. 또한, 항체 Fc 영역은 또한 다양한 면역 세포 상에서 발현된 Fc 수용체에 결합하여 이펙터 세포의 원치않는 고갈을 유발하거나 또는 고수준 시토카인 분비를 통해 면역-관련 독성을 유도할 수 있다.
바람직하지 않은 Fc-매개 이펙터 기능을 피하기 위해, 항체는 일부 또는 모든 Fc-매개 이펙터 메카니즘을 억제하거나 제거하는 Fc 부분의 돌연변이 (또한 비-활성화 돌연변이로도 지칭됨)를 보유하도록 조작되었다.
Fc-매개 이펙터 기능을 제거하기 위해 IgG1 이소형 항체의 불변 중쇄 영역에 아미노산 치환 및 그의 조합을 도입한, 광범위한 상이한 비-활성화 항체 포맷이 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Chiu et al., Antibodies 2019 Dec; 8(4): 55; Liu et al., Antibodies, 2020 Nov 17;9(4):64; 29(10):457-66; Shields et al., J Biol Chem., 2001 Mar 2;276(9):6591-604]). 이러한 치환의 예는 N297G 비-활성화 돌연변이의 도입 (Tao and Morrison, J Immunol 1989; 143(8):2595-601), E233P-L234V-L235A-delG236-S267K 비-활성화 돌연변이의 도입 (Moore et al., Methods 2019; 154:38-50), L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이의 도입 (Schlothauer et al., Protein Eng. Design and Selection 2016; 29(10):457-66), 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입 (또한 본원에서 FEA 또는 FEA 포맷으로도 지칭됨, Engelberts et al., EBioMedicine 2020; 52:102625; US10590206B2)을 포함한다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 IgG 하위부류 중 하나인 IgG4를, 항체의 불변 중쇄 영역 내의 아미노산 치환과 조합하여 사용하여 Fc-매개 이펙터 기능을 추가로 제거하는 다른 비-활성화 포맷이 개발되었다 (예를 들어 WO2015/143079에 기재된 E233P-F234V-L235A-G236del 비-활성화 돌연변이의 도입, 또는 문헌 [Vafa et al., Methods 2014; 65: 114-126]에 기재된 F234A-L235A 비-활성화 돌연변이의 도입).
그러나, 이러한 항체 조작의 결과로서, 치료제로서 항체의 잠재적 개발을 제한할 수 있는 개발가능성 및 제조성 이슈가 대두될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화는 잠재적인 항체 치료제의 개발에서 결정적인 단계를 구성한다. 표준 바이러스 불활성화 프로토콜은 낮은 pH 유지를 필요로 한다. 그러나, 조작된 단백질, 예컨대 항체는 낮은 pH 조건에 상이하게 반응하여, 잠재적으로 단백질 불안정성을 초래할 수 있다. 예를 들어 항체 개발 및 제조가능성에서 평가될 필요가 있는 다른 조건은 반복된 동결-해동 주기 및 저장 온도의 변경이다. 따라서, 이러한 조건 등에 노출되었을 때 단백질 안정성의 유지를 가능하게 하는 항체 치료제의 조작을 제공하는 것이 바람직한데, 이는 제조 및 분배의 용이성, 및 이러한 제품의 임상적 사용을 가능하게 하기 때문이다.
따라서, Fc-매개 이펙터 기능이 결여되고 치료 용도를 위해 용이하게 개발 및 제조될 수 있는, 항체에 적합한 추가의 비-활성화 포맷을 제공할 필요가 있다.
L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이 (또한 본원에서 FEA 또는 FEA 포맷으로도 지칭됨)는 탁월한 안전성 프로파일 및 Fc-매개 이펙터 기능을 강하게 억제하는 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 보체-의존성 세포독성 (CDC)의 강력한 유도제인 IgG1 항체의 경우에, FEA 돌연변이를 보유하는 것은 일부 잔류 CDC를 나타낼 수 있는 것으로 관찰되었다 (특히 실시예 3 및 5 참조). 또한, FEA 포맷을 갖는 재조합적으로 발현된 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 그의 N-글리칸의 추가의 프로세싱의 결과로서 증가된 글리코실화 불균질성을 나타낼 수 있는 것으로 관찰되었고 (데이터는 제시되지 않음, 또한 실시예 14 참조), 또한 낮은 pH 조건에 의해 유도되는 응집에 보다 감수성인 것으로 제시되었다 (예를 들어 실시예 20 참조).
따라서, 본 발명자들은 잔류 CDC 활성을 피할 수 있고/거나, 야생형 유사 글리코실화 프로파일을 제공할 수 있고/거나, 낮은 pH 조건에 대해 보다 내성일 수 있는 개선된 비-활성화 포맷을 제공하고자 하였다. 놀랍게도, 본 발명자들이 IgG1 항체에서 돌연변이 L234F, L235E 및 G236R (또한 본원에서 FER 또는 FER 포맷으로도 지칭됨)을 조합한 경우, 이는 잠재적인 잔류 CDC 활성을 피하고, 야생형 유사 글리코실화를 제공하고, 낮은 pH 조건에 대해 개선된 내성을 가질 수 있는 개선된 불활성 포맷을 생성하였다. 이에 의해, 본 발명자들은 본 발명에 이르러 임상 개발 및 임상 용도에 매우 적합한 고도로 유리한 추가의 비-활성화 항체 포맷을 제공한다. 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, 항체 이외의 문맥에서 또한 유용할 수 있는 이러한 추가의 비-활성화 포맷, 예컨대 예를 들어 융합 단백질은 부류-중-최고의 비-활성화 포맷인 것으로 간주될 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 IgG1 Fc 영역을 갖고, 상기 영역은 Eu-넘버링에 따라 위치 234, 235 및 236에서 치환을 갖고, 바람직하게는 각각 치환 F, E, 및 R을 갖는 폴리펩티드에 대한 새로운 불활성 포맷을 제공한다. 이러한 불활성 포맷은 단일특이적 및 이중특이적 항체에 특히 유용하다. 본 발명에 따른 이러한 치환을 갖는 이러한 폴리펩티드, 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 비-활성화 IgG1 Fc 영역을 갖는 것으로 지칭될 수 있다.
이중특이적 항체의 경우, 이러한 불활성 포맷은 또한 불활성 포맷 치환과 관련하여 이종이량체 포맷으로 조합될 수 있고, 예를 들어 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 불활성 포맷 치환을 보유하는 1개의 쇄로 구성될 수 있는 반면, 다른 쇄는 상이한 불활성 포맷 치환, 예를 들어 FEA를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 불활성 포맷은, 예를 들어 요구되는 모든 검정을 재설계하고 재수행할 필요가 없는, 임상 용도를 위해 이미 개발을 거친 기존의 후보 항체와 조합되기에 매우 적합하고, 이에 의해 제어된 Fab-아암 교환과 같은 기술을 이용하여 이중특이적 항체를 신속하게 생성할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개는 변형되고 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 위치는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 것인 단백질이 제공된다. 상기한 바와 같이, 바람직하게는 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산은 각각 F, E 및 R로 치환된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나가 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 다른 것이 변형되고 위치 L234, L235, 및 D265의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A인, 본 발명에 따른 상기 단백질이 제공된다.
또 다른 추가 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다가 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하는 것인 본 발명에 따른 상기 단백질이 제공된다.
본 발명에 따른 단백질은 비-활성화 Fc-영역을 갖는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 단백질일 수 있는 것으로 이해된다. 이는, 예를 들어 기능적 도메인이 Fc 영역과 융합됨으로써, 예를 들어 개선된 혈장 반감기를 갖는 기능적 도메인을 제공하는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는 제1 및 제2 결합 영역을 포함한다. 제1 및 제2 결합 영역을 갖는 본 발명에 따른 예시적이고 바람직한 단백질은 항체이다.
따라서, 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 항체이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드는 본 발명에 따른 단백질 또는 항체에서 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 항체는 이들이 전형적으로 동일한 결합 도메인을 가질 수 있으므로 단일특이적 항체이다. 이러한 단일특이적 항체는 후속적으로 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 이중특이적 항체이다. 바람직하게는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 제1 및 제2 폴리펩티드로부터의 각각의 CH2 및 CH3 영역의 서열이 상이하도록 상기 각각의 CH2 및 CH3 영역에서 추가의 치환을 포함하며, 상기 치환은 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 상기 폴리펩티드를 수득하는 것을 가능하게 하는 것인, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다. 이러한 치환의 바람직한 예는 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나가 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환을 포함하고, 다른 것이 위치 K409의 아미노산의 R로의 치환을 포함하는 것을 포함한다. 대안적으로, 이종이량체를 제공하도록 하는 (특히 이중특이적 항체를 제공하기 위해 상이한 제1 및 제2 폴리펩티드를 조합하는) 다른 치환 또는 방법이 본 발명에 따라 고려될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서,
a) a. 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는, 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
b. 이뮤노글로불린 경쇄
를 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계;
b) a.
- 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A이거나, 또는
- 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는
인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
b. 이뮤노글로불린 경쇄
를 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계;
c) 여기서 상기 각각의 제1 및 제2 항체의 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용 각각보다 더 강하도록 하는 것인 단계;
d) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
e) 상기 제1 항체의 상기 제1 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제1 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 제2 항체의 상기 제2 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 수득하는 단계
를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
도 1은 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 표적 결합을 보여준다. 중쇄에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의한, Raji 세포 상에 존재하는 CD20에 대한 결합이 제시된다. 결합은 항체 농도 대 중앙 MFI-PE로서 제시된다 (데이터세트는 a 및 b로 분할됨). 데이터는 4회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG1-b12, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 2는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 Raji 세포의 CDC를 보여준다. 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1- 및 IgG4 항체 변이체에 의해 유도된 CD20-양성 Raji 세포의 CDC를 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 평가하였다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG1-b12, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 3은 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 C1q 결합을 보여준다. 결합은 항체 농도 대 중앙 MFI-FITC로서 제시된다. 데이터는 단일 실험의 삼중 측정으로부터 수득된 평균 값 (± SD)이다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1, IgG1-b12이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A 및 FER: L234F-L235E-G236R이다.
도 4는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 HLA-DR 항체 변이체에 의해 유도된 Raji 세포의 CDC를 보여준다. 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1-HLA-DR-4 (a) 및 IgG1-HLA-DR-1D09C3 (b) 항체 변이체, 뿐만 아니라 HLA-DR-표적화 F(ab')2 단편에 의해 유도된 Raji 세포의 CDC를 시험관내 CDC 검정에서 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 평가하였다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 K409R 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 (IgG1-K409R, 100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 5회 (야생형 및 L234F-L235E-D265A-K409R 변이체) 또는 2회 (L234F-L235E-G236R-K409R 변이체, 또는 F(ab')2 단편)의 독립적 반복으로부터의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-K409R, F(ab')2이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A 및 FER: L234F-L235E-G236R이다.
도 5는 ELISA 플레이트에의 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체의 포획을 보여준다. ELISA 플레이트에의 항-인간-IgG F(ab')2 단편에 의한 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 갖는 IgG1 및 IgG4 변이체의 고정화. 결합은 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. 항-인간-IgG-Fcγ-HRP 및 ABTS를 사용하여 검출을 수행하였다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 6은 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체의 FcγRIa, FcγRIIa (동종이형 131H 및 131R), FcγRIIb, 및 FcγRIIIa (동종이형 158F 및 158V)에 대한 결합을 보여준다. ELISA 검정에서 시험된 바와 같은 FcγRIa (a), FcγRIIa 동종이형 131H (b), FcγRIIa 동종이형 131R (c), FcγRIIb (d), FcγRIIIa 동종이형 158F (e), 및 FcγRIIIa 동종이형 158V (f)의 단량체 및 이량체 His-태그부착된 비오티닐화된 세포외 도메인 (ECD)에 대한 비-활성화 돌연변이를 갖는 고정된 IgG1 및 IgG4 변이체의 결합. 결합은 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. 스트렙타비딘-폴리HRP 및 ABTS를 사용하여 검출을 수행하였다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 7은 표적-발현 Raji 세포 및 FcyR-발현 리포터 세포를 사용하여 측정된 바와 같은, 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의한 FcγR 활성화를 보여준다. (a-f) CD20을 발현하는 Raji 세포 및 상이한 농도의 IgG1 및 IgG4 항체 변이체와 공동-배양 시 발광 수준 (RLU)에 의해 측정된 바와 같은, (a) FcγRIa, (b) FcγRIIa 동종이형 131H, (c) FcγRIIa 동종이형 131R, (d) FcγRIIb, (e) FcγRIIIa 동종이형 158F, 또는 (f) FcγRIIIa 동종이형 158V를 안정하게 발현하는 Jurkat 리포터 세포주의 활성화. 활성화는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 3회의 독립적 실험 반복으로부터의 데이터 평균 값 (± SEM). 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG1-b12, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 8은 델피아(DELFIA)® EuTDA TRF 세포독성 검정을 사용하여 측정된 바와 같은, 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의해 유도된 ADCC를 보여준다. (a-b) NK-세포-매개 ADCC는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체와의 공동-인큐베이션 시 BATDA 표지된 CD20-발현 Raji 세포로부터의 EuTDA 시약의 방출 수준에 의해 측정되었다. 일부 변이체에 대해 ADCC는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 4회 (야생형 및 K409R 변이체) 또는 2회 (L234F-L235E-D265A-K409R 및 L234F-L235E-G236R-K409R 변이체)의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. 일부 변이체에 대해 ADCC는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%) 대비 10 μg/ml 항체 농도에서의 (b) 백분율 용해로서 제시된다. 데이터는 2회의 독립적 실험으로부터 6명의 공여자로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-AAG-K409R, IgG1-RR-K409R, IgG1lh2-S267K-K409R, IgG1-N297G-K409R, IgG1-AEASS-K409R, IgG1, IgG1-K409R, IgG1-b12, IgG4lh2-S228P, IgG4-PAA, IgG4, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 9는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 항체 IgG1- 또는 IgG4-huCLB-T3/4의 변이체에 의한 T-세포 활성화를 보여준다. (a-b) 표시된 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의해 유도된 PBMC 공동-배양물에서의 T 세포 상의 초기 T-세포 활성화에 대한 척도로서 CD69 발현의 상향조절 (유동 세포측정 분석에 의해 측정됨). CD69 상향조절은 (a) 용량-반응 대 CD69+ T 세포 (CD28+)의 백분율로서 또는 (b) 공여자 및 실험 반복당 야생형 항체 변이체 IgG1-F405L (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험 반복으로부터의 평균 값 (± SEM)이다 (실험 반복당 2명의 독립적 공여자). 시험된 변이체는 IgG1-FEA-F405L, IgG1-FER-F405L, IgG1-AAG-F405L, IgG1-RR-F405L, IgG1lh2-S267K-F405L, IgG1-N297G-F405L, IgG1-AEASS-F405L, IgG1-F405L, IgG4lh2-S228P-F405L-R409K, IgG4-PAA-F405L-R409K, IgG4-S228P이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, IgG1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, IgG4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 10은 비-활성화 이중특이적 항체 변이체에 의한 시험관내 T-세포-매개 세포독성을 보여준다. (a-c) PBMC 공동-배양물에서의 HER2-양성 SK-OV-3 세포의 T-세포 매개 세포독성은 알라마르 블루를 사용하여 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체, CD3xHER2 (a), CD3xb12 (b; 표적 세포에 결합하지 않음), 또는 b12xHER2 (c; T 세포에 결합하지 않음)를 사용하여 평가하였다. 590 nm에서의 흡광도를 엔비전(Envision) 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고, 100% 세포독성을 나타내는 스타우로스포린-처리된 세포 및 0% 세포독성을 나타내는 배지 대조군 (항체 없음, PBMC 없음)을 사용하여 공여자 및 실험 반복당 백분율 생존 세포를 계산하였다. 데이터는 용량-반응 곡선 대 % 생존 SK-OV-3 세포로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험 반복으로부터의 평균 값 (± SEM)이다 (실험 반복당 2명의 독립적 공여자). 시험된 이중특이적 항체 변이체는 BisG1 F405LxK409R, BisG1 FEA-F405LxFEA-K409R, BisG1 FER-F405LxFER-K409R, BisG1 AAG-F405LxAAG-K409R, BisG1 RR-F405LxRR-K409R, BisG1lh2 S267K-F405LxS267K-K409R, BisG4lh2 S228P-F405L-R409KxS228P, BisG1 N297G-F405LxN297G-K409R, BisG1 AEASS-F405LxAEASS-K409R, BisG4 PAA-F405L-R409KxPAA이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, AAG: L234A-L235A-P329G, RR: G236R-L328R, G1lh2: E233P-L234V-L235A-G236del, AEASS: L234A-L235E-G237A-A330S-P331S, G4lh2: E233P-F234V-L235A-G236del, 및 PAA: S228P-F234A-L235A이다.
도 11은 항-인간 CD20 IgG1 또는 항-인간 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체를 주사한 마우스로부터 수집한 혈액 샘플에서 측정된 바와 같은 총 인간 IgG (hIgG) 농도를 보여준다. (a) 주사 후 상이한 시점에 야생형 항-인간 CD20 IgG1, IgG1-CD20-K409R, IgG1-CD20-L234F-L235E-D265A-K409R, 및 IgG1-CD20-L234F-L235E-G236R-K409R을 주사한 마우스로부터 수집한 혈액 샘플 중 총 hIgG 농도. 데이터는 IgG1-FER-K409R (2마리의 마우스)을 제외하고, 군당 3마리의 마우스로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. (b) 주사 후 상이한 시점에 야생형 항-인간 CD3 IgG1, IgG1-CD3-F405L, IgG1-CD3-L234F-L235E-D265A-F405L 및 IgG1-CD3-L234F-L235E-G236R-F405L을 주사한 마우스로부터 수집한 혈액 샘플 중 총 hIgG 농도. 데이터는 군당 3마리의 마우스로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. (c) 항체 투여 후 제21일까지의 클리어런스를 식 D*1000/AUC에 따라 결정하였고, 여기서 D, 주사된 용량 및 AUC, 농도-시간 곡선의 곡선하 면적이다. 모든 도면에서, 점선은 SCID 마우스에서 야생형 IgG1 항체에 대한 시간상 예측된 IgG1 농도를 나타낸다. 제시된 데이터는 IgG1-FER-K409R (2마리의 마우스)을 제외하고, 군당 3마리의 마우스로부터 수득된 것이다. 시험된 변이체는 IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-K409R, IgG1-K409R, IgG1-FEA-F405L, IgG1-FER-F405L, IgG1-F405L, IgG1이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A 및 FER: L234F-L235E-G236R이다.
도 12는 실시예 14에서 시험된 IgG1 항체 변이체 상에서 검출된 상이한 글리칸 종의 개략적 표현을 보여준다.
도 13은 bsAb 변이체의 생성을 위한 제어된 Fab-아암-교환 (cFAE)의 효율을 보여준다. 이중특이적 항체 (BisG1로 표시됨)는 cFAE에 의해 생성되며, 여기서 하나의 단일특이적 항체 (IgG1-A로 표시됨)는 F405L 돌연변이를 보유하고, 또 다른 단일특이적 항체 (IgG1-B로 표시됨)는 K409R 돌연변이를 보유한다. bsAb 변이체의 생성에 대한 cFAE의 효율을 변이체에 대해 평가하였으며, 여기서 (a; 20개의 데이터 포인트) 둘 다의 단일특이적 항체는 F405L 및 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R (FER) 비-활성화 돌연변이를 보유하고, (b; 16개의 데이터 포인트) 제1 단일특이적 항체는 F405L 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 보유하고, 제2 단일특이적 항체는 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A (FEA) 돌연변이를 보유하고, (c; 12개의 데이터 포인트) 제1 단일특이적 항체는 F405L 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A (FEA) 돌연변이를 보유하고, 제2 단일특이적 항체는 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 보유한다. bsAb 또는 잔류 단일특이적 항체 변이체 (IgG1-A 또는 IgG1-B)의 백분율 (%)을 제시하며, 이는 오비트랩 큐-이그잭티브 플러스(Orbitrap Q-ExactivePlus) 질량 분광계를 사용하여 결정하였다. FEA: L234F-L235E-D265A 및 FER: L234F-L235E-G236R.
도 14는 F405L 또는 K409R에 더하여 불변 중쇄 영역에 L234F-L235E-G236R (FER) 또는 L234F-L235E-D265A (FEA) 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 생산 수준을 보여준다. 항체 변이체를 Expi293F 세포에서 생산하였다. 생산 역가는 mg/L로서 산점도로 나타내어지며, 평균 값 (± SEM)이 표시된다. 각각의 점은 표시된 돌연변이를 보유하는 특정한 항체 클론의 생산 수율 데이터 (그러한 특정한 클론에 대해 보다 많은 생산 데이터가 이용가능한 경우에 평균 값)를 나타낸다. 비교를 가능하게 하기 위해, L234F-L235E-D265A-F405L 항체 변이체 (FEA-F405L; 백색 원형) 및 L234F-L235E-G236R-F405L 항체 변이체 (FER-F405L; 흑색 원형)에 대한 매칭된 클론의 생산 역가를 제시한다. 유사하게, L235E-D265A-K409R 항체 변이체 (FEA-K409R, 백색 사각형) 및 L234F-L235E-G236R-K409R 항체 변이체 (FER-K409R, 흑색 사각형)에 대한 매칭된 클론의 생산 역가를 제시한다.
도 15는 단일특이적 항체 (a) 및 이중특이적 항체 (b)의 예시적인 개략도를 보여준다. (a) 중쇄는 흑색으로 도시된 바와 같고; 경쇄는 백색으로 도시된 바와 같다. 개별 항체 중쇄 및 경쇄 도메인은 CH1, CH2, CH3 및 VH (불변 중쇄 (H1, H2, H3) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인), CL 및 VL (CL, VL, 불변 및 가변 경쇄 도메인)로 표시된다. (b) Fab 아암의 2개의 상이한 특이성을 갖는, 예컨대 제어된 Fab-아암 교환을 통해 생성된 2개의 절반-분자 (각각 흑색 및 백색 중쇄 및 경쇄로서 제시된 1개의 절반-분자; 줄무늬 패턴의 중쇄 및 경쇄로 제시된 1개의 절반-분자)로 이루어진 이중특이적 항체. 힌지 영역, Fab 아암 및 Fc 도메인은 표시된 바와 같다.
도 16은 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 C1q 결합을 보여준다. 결합은 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1-CD20 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 항체 변이체는 IgG1-CD20 야생형 (IgG1) 및 그의 변이체 IgG1-FEA-F405L, IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-F405L, IgG1-FER-K409R, BisG1 FEA-F405LxFEA-K409R, BisG1 FER-F405LxFER-K409R, BisG1 FER-F405LxFEA-K409R, BisG1 FEA-F405LxFER-K409R이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R 및 FEA: L234F-L235E-D265A이다.
도 17은 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 Raji 세포의 CDC를 보여준다. 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD20 항체 변이체에 의해 유도된 CD20-양성 Raji 세포의 CDC를 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 평가하였다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1-CD20 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 항체 변이체는 IgG1-CD20 야생형 (IgG1) 및 그의 변이체 IgG1-FEA-F405L, IgG1-FEA-K409R, IgG1-FER-F405L, IgG1-FER-K409R, BisG1 FEA-F405LxFEA-K409R, BisG1 FER-F405LxFER-K409R, BisG1 FER-F405LxFEA-K409R, BisG1 FEA-F405LxFER-K409R이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R 및 FEA: L234F-L235E-D265A이다.
도 18은 비-활성화 이중특이적 항체 변이체에 의한 시험관내 T-세포-매개 세포독성을 보여준다. (a-b) 알라마르 블루를 사용하여, PBMC 공동-배양물에서의 HER2-양성 SK-OV-3 세포의 T-세포 매개 세포독성을 Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체 CD3xHER2 (a) 또는 CD3xb12 (b; 표적 세포에 대한 결합 없음)를 사용하여 평가하였다. 엔비전 플레이트 판독기를 사용하여 590 nm에서의 흡광도를 측정하고, 100% 세포독성을 나타내는 스타우로스포린-처리된 SK-OV-3 세포 및 0% 세포독성을 나타내는 배지 대조군 (SK-OV-3 세포, 항체 없음, PBMC 없음)을 사용하여 공여자 및 실험 반복당 백분율 생존 세포를 계산하였다. 데이터는 용량-반응 곡선 대 백분율 생존 SK-OV-3 세포로서 제시된다. 데이터는 2회의 독립적 실험 (독립적 실험당 2명의 공여자)으로부터 4명의 공여자로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 CD3xHER2 및 CD3xb12 이중특이적 항체 변이체는 BisG1 F405LxK409R, BisG1 FER-F405LxK409R, BisG1 FER-F405LxFEA-K409R, BisG1 FER-F405LxAAG-K409R, 및 BisG1 FER-F405LxN297G-K409R이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, FEA: L234F-L235E-D265A, 및 AAG: L234A-L235A-P329G이다.
도 19는 비-활성화 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체에 의한 T-세포 활성화를 보여준다. 인간 PBMC 공동-배양물에서의 T 세포 상의 초기 T-세포 활성화에 대한 척도로서 CD69 발현의 상향조절 (유동 세포측정 분석에 의해 측정됨)을 야생형 유사 CD3xHer2 이중특이적 항체 변이체 및 Fc 영역에 표시된 대칭 또는 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체를 사용하여 평가하였다. CD69 상향조절은 공여자 및 실험 반복당 비-결합 음성 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 유사 IgG1 이중특이적 항체 변이체 (BisG1 F405LxK409R, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 2회의 독립적 실험 (독립적 실험당 2명의 공여자)에서 4명의 공여자로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다. 시험된 CD3xHER2 이중특이적 항체 변이체는 BisG1 F405LxK409R, BisG1 FER-F405LxK409R, BisG1 FER-F405LxFEA-K409R, BisG1 FER-F405LxAAG-K409R, 및 BisG1 FER-F405LxN297G-K409R이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, FEA: L234F-L235E-D265A, 및 AAG: L234A-L235A-P329G이다.
도 20은 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 시험관내 CDC 검정에서 평가된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 항체 변이체에 의해 유도된 Raji 세포의 CDC를 보여준다. CDC를 유도하는 능력을 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신을 함유하거나 또는 결여되도록 생산된 변이체 사이에서 비교하였다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 야생형 IgG1-CD20 항체 (IgG1; 100%) 및 항체 부재 대조군 샘플 (0%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-delK, IgG1-FEA, IgG1-FEA-delK, IgG1-FER, IgG1-FER-delK이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, delK: HC C-말단 리신의 재조합 결실이다.
도 21은 표적-발현 Raji 세포 및 FcγR-발현 리포터 세포를 사용하여 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화를 보여준다. FcγR 활성화를 유도하는 능력을 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신을 함유하거나 결여되도록 생산된 변이체 사이에서 비교하였다. (a-d) CD20을 발현하는 Raji 세포 및 상이한 농도의 IgG1-CD20 또는 IgG1-CD20-delK 항체 변이체와의 공동-배양 시 발광 수준에 의해 측정된 바와 같은, (a) FcγRIa, (b) FcγRIIa 동종이형 131H, (c) FcγRIIb, 또는 (d) FcγRIIIa 동종이형 158V를 안정하게 발현하는 Jurkat 리포터 세포주의 활성화. 활성화는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-delK, IgG1-FEA, IgG1-FEA-delK, IgG1-FER, IgG1-FER-delK이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, delK: HC C-말단 리신의 재조합 결실이다.
도 22는 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 시험관내 CDC 검정에서 평가된 바와 같은, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체의 동종이형 변이체 및 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의해 유도된 Raji 세포의 CDC를 보여준다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 야생형 항-인간 CD20 항체 (동종이형 IgG1(f); 100%) 및 항체 부재 대조군 샘플 (0%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1(fa), IgG1(zax), IgG1(zav), IgG1(za), 및 IgG1(f)이며, 여기서 FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R이다.
도 23은 표적-발현 Raji 세포 및 FcyR-발현 리포터 세포를 사용하여 측정된 바와 같은, 상이한 IgG1 동종이형 변이체의 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화를 보여준다. (a-d) CD20을 발현하는 Raji 세포 및 상이한 농도의 IgG1-CD20 항체 변이체와의 공동-배양 시 발광 수준에 의해 측정된 바와 같은, (a) FcγRIa, (b) FcγRIIa 동종이형 131H, (c) FcγRIIb, 또는 (d) FcγRIIIa 동종이형 158V를 안정하게 발현하는 Jurkat 리포터 세포주의 활성화. 활성화는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1(f) (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1(f), IgG1(za), IgG1(zav), IgG1(zax), IgG1(fa), 및 FER 또는 FEA 돌연변이를 보유하는 그의 변이체이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R 및 FEA: L234F-L235E-D265A이다.
도 24는 보체에 대한 공급원으로서 NHS를 사용하여 시험관내 CDC 검정에서 평가된 바와 같은, 야생형 항-인간 CD20 항체의 하위부류 변이체 및 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의해 유도된 Raji 세포의 CDC를 보여준다. (a) 야생형 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG3 항체 (동종이형 IGHG3*01 [IgG3] 및 IGHG3*04 [IgG3rch2]) 및 그의 비-활성화 변이체에 의해 유도된 CDC. (b) 야생형 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의해 유도된 CDC. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 (IgG1; 100%) 및 항체 부재 대조군 샘플 (0%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터의 평균 값 ± SEM이다. FEA: L234F-L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R, EA: L235E-D265A, 및 ER: L235E-G236R.
도 25는 표적-발현 Raji 세포 및 FcyR-발현 리포터 세포를 사용하여 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1, IgG3 및 IgG4 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화를 보여준다. (a-d) CD20을 발현하는 Raji 세포 및 상이한 농도의 IgG-CD20 항체 변이체와의 공동-배양 시 발광 수준에 의해 측정된 바와 같은, (a) FcγRIa, (b) FcγRIIa 동종이형 131H, (c) FcγRIIb, 또는 (d) FcγRIIIa 동종이형 158V를 안정하게 발현하는 Jurkat 리포터 세포주의 활성화. 활성화는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG3 (IGHG3*01), IgG3rch2 (IGHG3*04), IgG4, 및 ER, EA, FER 또는 FEA 돌연변이를 보유하는 그의 변이체이며, 여기서 ER: L235E-G236R, EA: L235E-D265A, FER: L234F-L235E-G236R 및 FEA: L234F-L235E-D265A이다.
도 26은 표적-발현 Raji 세포 및 FcyR-발현 리포터 세포를 사용하여 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화를 보여준다. (a-d) CD20을 발현하는 Raji 세포 및 상이한 농도의 뮤린 IgG2a-CD20 항체 변이체와의 공동-배양 시 발광 수준에 의해 측정된 바와 같은, (a) FcγRIa, (b) FcγRIIa 동종이형 131H, (c) FcγRIIb, 또는 (d) FcγRIIIa 동종이형 158V를 안정하게 발현하는 Jurkat 리포터 세포주의 활성화. 활성화는 실험 반복당 비-결합 대조군 IgG2a-b12 (0%) 및 야생형 IgG2a-CD20 (100%)에 대해 정규화된 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SEM이다. 시험된 변이체는 IgG2a, IgG2a-FER, IgG2a-LALA 및 IgG2a-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, LALA: L234A-L235A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다.
도 27은 C1q에 대한 공급원으로서 정상 인간 혈청 (NHS)을 사용한 CD20-양성 Raji 세포의 옵소닌화 시 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 변이체에 의한 C1q 결합을 보여준다. 결합은 비-결합 대조군 항체 IgG2a-b12 (0%) 및 야생형 뮤린 IgG2a-CD20 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 항체 변이체는 야생형 IgG2a, IgG2a-FER, IgG2a-LALA 및 IgG2a-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, LALA: L234A-L235A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다.
도 28은 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 변이체에 의한 Raji 세포의 CDC를 보여준다. 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG2a-CD20 항체 변이체에 의해 유도된 CD20-양성 Raji 세포의 CDC를 보체에 대한 공급원으로서 정상 인간 혈청 (NHS)을 사용하여 평가하였다. 세포 용해는 유동 세포측정법에 의한 PI-양성 세포의 백분율의 분석에 의해 결정된다. CDC는 비-결합 대조군 항체 IgG2a-b12 (0%) 및 야생형 뮤린 IgG2a-CD20 (100%)에 대해 정규화된 곡선하 면적 (AUC)으로서 제시된다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다. 시험된 항체 변이체는 야생형 IgG2a, IgG2a-FER, IgG2a-LALA 및 IgG2a-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, LALA: L234A-L235A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다.
본원에 기재된 바와 같이, 항체의 Fc 영역 내 아미노산 위치에서의 특이적 변형은 단백질을 Fc 기능과 관련하여 기본적으로 불활성으로 만들면서, 동시에 제조 관점에서 유리한 특성을 갖는 비-활성화 변형인 것으로 입증되었다.
본원에 사용된 용어 "비-활성화"는 본 발명에 따른 단백질과 광범위한 이펙터 세포, 예컨대 단핵구 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와의, 또는 보체 경로를 활성화시키기 위한 C1q와의 상호작용의 억제 또는 제거를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 "비-활성화"는 감소된 CDC 활성, 감소된 C1q-결합, 감소된 ADCC, 인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)에 대한 결합의 감소 또는 부재, 인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)를 통한 활성화 및 신호전달의 감소 또는 부재를 포함한다. "비-활성화"는 또한 CD3을 표적화하는 것과 관련하여 사용될 때 (예를 들어 CD3을 표적화하는 단일특이적 항체에서, 또는 종양-연관 항원-비의존성 방식의 이중특이적 또는 다중특이적 항체와 관련하여 사용될 때) T-세포 활성화를 유도하지 않는 것을 포함한다. 이러한 "비-활성화" 특색은 바람직하게는 "비-활성화"되지 않은 단백질과 대비하여, 예를 들어 야생형 유사 기능성을 갖는 비변형된 Fc 영역을 갖는 항체를 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 변형된 Fc 영역과 비교하는 것에 비해 평가되는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 영역을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 서로 공유 연결된 아미노산의 1개 이상의 쇄를 포함하는 대형 생물학적 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 연결은 펩티드 결합 및/또는 디술피드 가교를 통한 것일 수 있다. 아미노산의 단일 쇄는 또한 "폴리펩티드"로 명명될 수 있다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 단백질은 1개 이상의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 임의의 유형의 단백질, 예컨대 항체 또는 모 항체의 변이체, 또는 융합 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 전형적인 생리학적 조건 하에 유의한 기간, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3, 4, 5, 6, 7일 이상 등의 반감기, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로-정의된 기간 (예컨대 항원에 대한 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 증진 및/또는 조정하는 데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는 데 충분한 시간)으로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 그 중 어느 하나의 유도체를 지칭하는 것으로 의도된다. 항원과 상호작용하는 결합 영역 (또는 본원에 사용될 수 있는 결합 도메인, 둘 다 동일한 의미를 가짐)은 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역을 포함한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 보체 활성화의 전형적 경로에서의 제1 성분인 C1q를 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원의 용어 항체는 달리 언급되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 항원과 특이적으로 상호작용하는, 예컨대 결합 능력이 유지된 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 "항체" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 WO2007059782 (젠맙 에이/에스(Genmab A/S))에 기재된 바와 같은 1가 항체; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고 또한 도메인 항체로도 불리는 (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90) dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 낙타류 또는 나노바디 (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조)로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 달리 나타내지 않거나 또는 문맥에 의해 명백하게 나타내지 않는 한 용어 항체 내에 포괄된다. 이러한 단편이 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 집합적으로 및 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 고유한 특색이다. 본 발명의 문맥에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편은 본원에서 추가로 논의된다. 용어 항체는, 달리 명시되지 않는 한, 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기술에 의해 제공된 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체 단편 (항원-결합 단편)을 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 생성된 항체는 임의의 이소형을 보유할 수 있다.
항체가 단편, 예컨대 결합 단편인 경우에, 본 발명의 문맥 내에서 상기 단편은 본원에 기재된 바와 같이 Fc 영역에 융합된 것으로 이해되어야 한다. 이에 의해, 항체는 본 발명의 범주 내에 속하는 융합 단백질일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 단백질은 융합 단백질이다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "인간화"는 인간 항체 불변 도메인, 및 인간 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는 함께 항원 결합 부위를 형성하는 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상에 그라프팅하는 것에 의해 달성될 수 있다 (특히 WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체 결합 영역의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역으로의 치환 (복귀-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체 결합 영역의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 가변 영역 또는 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의로 포함하는 인간 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 바람직한 특징, 예컨대 특히 유용한 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 항체 또는 인간화 가변 영역을 수득하기 위해, 예를 들어 탈아미드화를 피하고/거나, "불활성 Fc 영역"을 제공하고/거나, 이종이량체화를 증진시키고/거나, 제조를 개선시키는 변형을 포함하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있다.
항체 및 항체의 가변 영역과 관련하여 본원에 사용된 용어 "인간"은 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인으로부터 유래된 불변 도메인을 갖는, 유전자 조작될 수 있는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 가변 영역 또는 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실)를 포함할 수 있다. "인간 항체"는 인간에서의, 예를 들어 문헌 [Lee et al., Nature Biotech, 32(4) 2014 pp 355-63 및 Macdonald et al., PNAS April 8, 2014 111 (14) 5147-52] 등에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 동물에서의 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 생성된 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다. 이러한 VH 및 VL 서열은 인간 VH 및 VL 서열로 간주되며, 이는 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인으로부터 유래된 불변 도메인에 융합될 수 있다. 임의로, 바람직한 특징, 예컨대 특히 유용한 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수득하기 위해, 예를 들어 탈아미드화를 피하고/거나, "불활성 Fc 영역"을 제공하고/거나, 이종이량체화를 증진시키고/거나, 제조를 개선시키는 변형을 포함하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있다. 따라서, "인간 항체"는 조작된 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보체-의존성 세포독성" ("CDC")은 항체가 세포 또는 비리온 상의 그의 표적에 결합된 경우에 MAC 어셈블리에 의해 생성된 막 내의 세공의 결과로서 세포 또는 비리온의 용해를 유발하는 항체-매개 보체 활성화의 과정을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" ("ADCC")은 결합된 항체의 불변 영역을 인식하는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포 또는 비리온의 사멸 메카니즘을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린 중쇄" 또는 "이뮤노글로불린의 중쇄"는 이뮤노글로불린의 중쇄 중 하나를 지칭하는 것으로 의도된다. 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 이뮤노글로불린의 이소형을 정의하는 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. CH1 및 CH2는 전형적으로 힌지 영역을 통해 연결된다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린"은 2쌍의 폴리펩티드 쇄, 즉 1쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 1쌍의 중쇄 (H)로 이루어지며 모든 4개는 디술피드 결합에 의해 잠재적으로 상호연결된, 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭하는 것으로 의도된다. 이뮤노글로불린의 구조는 잘 특징화되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조). 이뮤노글로불린의 구조 내에서, 2개의 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 중쇄와 동등하게, 각각의 경쇄는 전형적으로 여러 영역; 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, CL로 구성된다. 또한, VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변 영역 (또는 서열 및/또는 구조적으로 규정된 루프의 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한 문헌 [Lefranc MP et al., Dev Comp Immunol Jan:27(1):55-77 (2003)] 참조).
본원에 사용된 용어 "제1 폴리펩티드" 및 "제2 폴리펩티드"는 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 따라서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 동종이량체 또는 이종이량체를 형성할 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 추가의 폴리펩티드와 회합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 이소형 (예를 들어 IgG, IgD, IgA, IgE 또는 IgM) 또는 그의 하위부류 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 또는 그의 임의의 동종이형을 지칭한다. IgG1의 동종이형의 예는 IgG1m(za) 및 IgG1m(f)을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 단백질은 IgG1 부류의 이뮤노글로불린 또는 그의 임의의 동종이형의 중쇄를 포함한다. 추가로, 각각의 중쇄 이소형은 카파 (κ) 및/또는 람다 (λ) 경쇄, 또는 그의 임의의 동종이형과 조합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 카바트 (문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재됨)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 상응한다.
VH 및 VL 영역은 "인간 VH 및 VL 영역" 또는 "인간화 VH 및 VL 영역"일 수 있다. 인간 VH 및/또는 인간 VL 영역과 관련하여, 이러한 영역은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 인간 배선 서열로부터 유래되거나 또는 그에서 발견되는 바와 같은 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되는 것으로 이해된다. 이러한 VH 및 VL 영역은 인간화 동물 모델 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 인간 B 세포 또는 형질 세포로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간화 VH 및 VL 영역"은 인간 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된, 비-인간 항체로부터 유래된 유전자 조작된 VH 및 VL 영역을 지칭한다. 이는 함께 항원 결합 부위를 형성하는 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상에 그라프팅하는 것에 의해 달성될 수 있다 (특히 WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역으로의 치환 (복귀-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 VH 및 VL 영역은 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의로 포함하는 인간 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 바람직한 특징, 예컨대 특히 유용한 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 또는 인간 VH 및 VL 영역을 수득하기 위해, 예를 들어 탈아미드화를 피하고/거나 제조를 개선시키는 변형을 포함하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전장 항체"는 야생형 항체에서 통상적으로 발견되는 것에 상응하는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유하는, 즉 예를 들어 인간 (또는 인간화) IgG1 중쇄 등 또는 인간 (또는 인간화) 카파 또는 람다 경쇄와 같이 중쇄에 각각 VH, CH1, 링커, CH2, CH3 영역을 갖고 경쇄에 각각 VL 및 CL 영역을 갖는 항체 (예를 들어, 모 또는 변이체 항체)를 지칭한다. 이중특이적 항체는 또한 전장 항체, 즉 야생형 항체 등에서 통상적으로 발견되는 것과 같은 상이한 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어 본 발명에 따라 본원에 정의된 바와 같은 치환 또는 변형을 포함하는 전장 항체가 조작될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "위치에 상응하는 아미노산"은 인간 IgG1 중쇄에서의 아미노산 위치 번호를 지칭한다. 달리 언급되지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 불변 영역 서열의 아미노산은 본원에서 Eu-넘버링 지수에 따라 넘버링된다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재됨). 따라서, 또 다른 서열 내의 아미노산 또는 절편"에 상응하는" 하나의 서열 내의 아미노산 또는 절편은 표준 서열 정렬 프로그램, 예컨대 ALIGN, 클러스탈W 또는 유사한 것을 사용하여 전형적으로 디폴트 설정에서 다른 아미노산 또는 절편과 정렬되고, 인간 IgG1 중쇄에 대해 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 것이다. 서열 또는 서열 내의 절편을 정렬하여 본 발명에 따른 아미노산 위치에 대한 서열 내의 상응하는 위치를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 것으로 간주된다.
본 발명의 문맥에서, 아미노산은 보존적 또는 비-보존적 부류에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 아미노산의 부류는 하기 표 중 1개 이상에 반영될 수 있다:
보존적 부류의 아미노산 잔기
아미노산 잔기의 대안적 물리적 및 기능적 분류
본 발명의 문맥에서, 단백질에서의 치환은 하기와 같이 표시된다:
원래의 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산에 대한 널리 인식되는 명명법을 참조하면, 임의의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 Xaa 및 X를 비롯한 3-문자 코드 또는 1-문자 코드가 사용된다. 따라서, 표기법 "L234F" 또는 "Leu234Phe"는 단백질이 야생형 단백질의 위치 234에서의 아미노산에 상응하는 단백질 아미노산 위치에서 류신의 페닐알라닌으로의 치환을 포함한다는 것을 의미한다.
주어진 위치에서의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환은 하기와 같이 지칭된다:
원래의 아미노산 - 위치; 또는 예를 들어 "L234".
원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이, 모든 아미노산(들)은 아니지만 1개 초과의 아미노산을 포함할 수 있는 변형의 경우에, 1개 초과의 아미노산은 "," 또는 "/"로 분리될 수 있다. 예를 들어, 위치 234에서 류신의 페닐알라닌, 아르기닌, 리신 또는 트립토판으로의 치환은 "Leu234Phe,Arg,Lys,Trp" 또는 "L234F,R,K,W" 또는 "L234F/R/K/W" 또는 "L234에서 F, R, K 또는 W"이다.
이러한 명칭은 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있지만, 동일한 의미 및 목적을 갖는다.
또한, 상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "치환" 또는 "돌연변이"는 다른 19개의 천연 아미노산 중 어느 하나로의, 또는 다른 아미노산, 예컨대 비-천연 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 234에서의 아미노산 L의 치환은 각각의 하기 치환을 포함한다: 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234P, 및 234Y. 이는 명칭 234X와 동등하며, 여기서 X는 원래의 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 이들 치환은 또한 L234A, L234C 등, 또는 L234A,C 등, 또는 L234A/C/등으로 나타내어질 수 있다. 동일한 방식이, 특히 이러한 치환 중 어느 하나가 본원에 포함되도록, 본원에서 언급된 각각의 및 모든 위치에 유사하게 적용된다. 아미노산 서열이 "X" 또는 "Xaa"를 포함하는 경우, 상기 X 또는 Xaa는 임의의 아미노산을 나타낸다는 것이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, X 또는 Xaa는 전형적으로 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 하기 아미노산 잔기 중 어느 하나를 지칭한다; 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 및 시스테인. 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들 프로그램에서 구현되는 바와 같은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정될 수 있다. 사용된 파라미터는 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "가장 긴 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)의 결과물은 퍼센트 동일성으로서 사용되고, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내의 갭의 총수).
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 개방 갭=11 및 연장된 갭=1을 사용하여 NCBI를 통해 이용가능한 BLAST 2.2.8)의 사용에 의해 결정된 바와 같은 유사성 점수에 의해 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 G236에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L, L 및 G가 아니다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개는 변형되고 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 위치는 EU 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 것인 단백질이 제공된다. 바람직하게는 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개에서 위치 L234, L235 및 G236의 상기 아미노산은 각각 F, E 및 R로 치환된다.
본원에 사용된 아미노산 위치와 관련하여, 이들은 Eu-넘버링에 따라 넘버링되고, 이는 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재된 바와 같은 Eu-넘버링 인덱스에 따른다. 본 발명에 따른 유용한 아미노산 서열의 서열은 또한 본원에서 볼드체로 나타낸 아미노산 변형과 함께 제공된다 (표 1 참조).
예를 들어 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질의 예는 2개의 동일한 중쇄 (제1 및 제2 폴리펩티드에 상응함) 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 항체일 수 있다. 그러나, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다가 동일한 치환을 가질 필요는 없으며, 예를 들어 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나는 L234, L235 및 G236 위치에서 상기 치환을 가질 수 있고, 다른 것은 예를 들어 상이한 치환을 가질 수 있다. 따라서, 다른 쇄는 예를 들어 또 다른 불활성 포맷, 예를 들어 FEA 포맷의 치환을 가질 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 다른 폴리펩티드가 상이한 불활성 포맷, 예컨대 FEA 포맷을 갖는 "비대칭" 방식으로 존재하는 경우에도 Fc-매개 이펙터 기능을 효과적으로 억제한다는 것은 위치 L234, L235 및 G236의 비-활성화 치환의 추가의 이점으로 간주된다. 이는 FER 불활성 포맷을 갖는 새로이 개발된 항체를 다른 비-활성화 치환, 예컨대 FEA 포맷을 갖는 이전에 생산된 항체와 조합함으로써 다중특이적 항체를 생산하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 추가 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나가 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 다른 것이 변형되고 위치 L234, L235, 및 D265의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A인, 본 발명에 따른 상기 단백질이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다는 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하며, 이는 바람직하게는 각각 F, E 및 R로의 치환이다.
추가 실시양태에서, 각각의 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 CH1 영역을 포함한다. 상기 CH1 영역은 바람직하게는 힌지 영역에 연결되고, 즉 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 각각의 CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 갖는 상기 폴리펩티드가 제공된다. 바람직하게는, CH1 영역은 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 것이다. 예를 들어, CH1 영역은 서열식별번호(SEQ ID NO): 4에 열거된 바와 같은 서열을 갖는 서열일 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역은 서열식별번호: 5에 열거된 바와 같은 서열일 수 있다. 이러한 서열은 본원에 기재된 바와 같은 치환을 가질 수 있고, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 FER 치환 및/또는 추가의 치환과 함께 제공될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 제1 및 제2 결합 영역을 포함한다. 임의의 결합 영역이 충분할 수 있지만, 결합 영역이 이뮤노글로불린 결합 영역, 예컨대 인간 또는 인간화 항체로부터 유래되는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합 영역" 또는 "결합 도메인"은 예를 들어 세포, 예를 들어 암 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 존재하는 항원, 예컨대 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질의 영역을 지칭한다. 결합 영역은 세포, 박테리아 또는 비리온에 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열, 예컨대 단백질, 단백질 리간드, 수용체, 항원-결합 영역, 또는 리간드-결합 영역일 수 있다. 구체적으로, 결합 영역은 항원-결합 영역이다. 결합 영역이 예를 들어 수용체인 경우, 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc-도메인 및 상기 수용체의 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 결합 영역이 항원-결합 영역인 경우에, 본 발명에 따른 단백질은 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 또는 인간 결합 영역 항체를 갖는 항체, 또는 중쇄 단독 항체 또는 ScFv-Fc-융합체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합"은 항체를 리간드로서 및 항원을 분석물로서 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정하였을 때, 전형적으로 1E-6 M 이하, 예를 들어 5E-7 M 이하, 1E-7 M 이하, 예컨대 5E-8 M 이하, 예컨대 1E-8 M 이하, 예컨대 5E-9 M 이하, 또는 예컨대 1E-9 M 이하의 KD에 상응하는 결합 친화도로 항체가 미리 결정된 항원 또는 표적에 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 10-배 더 낮은, 예컨대 적어도 100-배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000-배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000-배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000-배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합하는 것을 지칭한다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 각각 제1 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 및 제1 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 상기 제1 및 제2 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 결합 영역은 제2 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 영역은 바람직하게는 인간 또는 인간화 VH 및 VL 영역인 것으로 이해된다. 따라서, VH 및 VL 영역은 인간 또는 인간 유래의 프레임워크 영역을 갖고, 인간 또는 인간 유래의 또는 다른 종 기원, 예컨대 마우스 또는 래트의 CDR1-3 서열을 가질 수 있다. 따라서, 또 다른 추가 실시양태에서, 상기 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역이다.
언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질은 항체를 포함한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 중쇄이고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 중쇄는 인간 가변 영역을 포함하는 경우에 인간 중쇄 또는 인간화 중쇄인 것이 바람직할 수 있는 것으로 이해되고, 이는 인간 또는 인간화 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 상기 단백질은 제1 이뮤노글로불린 경쇄 불변 영역 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 단백질은 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하고, 상기 이뮤노글로불린 경쇄는 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 불변 경쇄 영역을 포함한다. 이러한 경쇄는 인간 경쇄, 또는 비-인간 유래 CDR 영역을 포함하는 경우에 인간화 경쇄인 것이 고도로 바람직한 것으로 이해된다. 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 인간 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 6에 열거된 바와 같다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 람다 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 7에 열거된 바와 같다. 이러한 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄, 또는 둘 다를 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서 단백질은, 본 발명에 따른 단백질이 2개의 상이한 경쇄를 포함할 수 있기 때문에, 1개의 카파 경쇄 및 1개의 람다 경쇄를 포함한다. 따라서, 이러한 경쇄는 인간 또는 인간화 카파 또는 람다 경쇄, 또는 둘 다일 수 있으며, 예를 들어 여기서 단백질은, 본 발명에 따른 단백질이 2개의 상이한 경쇄를 포함할 수 있기 때문에, 1개의 인간 카파 경쇄 및 1개의 인간 람다 경쇄를 포함한다.
인간 또는 인간화 중쇄 및 경쇄는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이에 더하여, 바람직한 특징을 제공하기 위한, 예를 들어 특정한 유용한 친화도 및 생화학적 특성을 제공하기 위한 추가의 변형, 예컨대 탈아미드화를 피하고/거나 이종이량체화를 증진시키고, 제조 및 분리를 개선시키는 등의 변형을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 단백질은 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 및 제1 및 제2 중쇄로 이루어지거나 또는 그를 포함하며, 후자는 제1 및 제2 폴리펩티드에 상응한다. 본 발명에 따른 이러한 단백질은 제1 이뮤노글로불린 경쇄가 디술피드 가교를 통해 상기 제1 이뮤노글로불린 중쇄와 연결되고, 상기 제2 이뮤노글로불린 경쇄가 디술피드 가교를 통해 상기 제2 이뮤노글로불린 중쇄와 연결되어, 각각 상기 제1 결합 영역 및 상기 제2 결합 영역을 형성할 수 있고, 여기서 상기 제1 및 제2이뮤노글로불린 중쇄는 또한 디술피드 가교를 통해 연결된다. 본원에 사용된 용어 "디술피드 가교"는 2개의 시스테인 잔기 사이의 공유 결합을 지칭하며, 즉 상기 상호작용은 또한 Cys-Cys 상호작용으로 나타내어질 수 있다.
바람직한 실시양태일 수 있는 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는 전장 항체인 항체이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 전장 항체는 인간 IgG1 이소형의 것이거나, 또는 그로부터 유래된다.
본 발명에 따르면, 상기 위치의 치환은, 예를 들어 항체에 포함되는 경우에 감소된 Fc-매개 이펙터 기능을 발생시키는 것으로 이해된다. 이러한 감소된 Fc-매개 이펙터 기능은 감소된 CDC 활성 (특히, 실시예 3 및 5 참조), 감소된 C1q-결합 (특히, 실시예 4), 감소된 ADCC (특히, 실시예 9), 인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)에 대한 검출가능한 결합 없음 (특히, 실시예 6) 및 인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)를 통한 검출가능한 활성화 및 신호전달 없음 (실시예 7), 및 CD3을 표적화하는 것과 관련하여 종양-연관-항원-비의존성 T-세포 활성화를 유도하지 않음 (특히, 실시예 10), 뿐만 아니라 특히 야생형 인간 IgG1과 유사한 인간 FcRn 결합 특성 및 야생형 인간 IgG1 항체와 고도로 유사한 글리코실화를 갖는 것 등으로 인해, 이러한 치환이 항체의 문맥에 포함되는 경우, 약동학을 갖는 것 (예를 들어, 실시예 12 및 14 참조)을 포함한다. 더욱이, 이들 치환은 낮은 pH에서 개선된 pH 안정성을 제공할 수 있다 (특히 실시예 20-23 참조). 고도로 바람직한 실시양태일 수 있는 항체와 관련하여 유용한 본 발명에 따른 단백질뿐만 아니라, 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 본 발명에 따른 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 가지며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개는 변형되고 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 EU 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 것인 다른 포맷의 단백질, 예컨대 융합 단백질이 또한 고려된다.
본원에 사용된 용어 "감소된" 또는 "비-검출가능한"은, Fc-매개 이펙터 기능을 언급하는 경우에, 이는 예를 들어 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 항체 등과 관련하여, 상기 이펙터 기능을 유도하는 완전한 능력을 갖는 야생형 IgG1 Fc-영역을 갖는 동일한 단백질 등과 비교하여, CDC 활성, ADCC, C1q 결합, FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V) 결합을 유도하고, FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)를 통해 활성화 및 신호를 전달하고, CD3을 표적화하는 것과 관련하여 T-세포를 활성화시키는 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체의 능력에 관한 것이다. 이들 특색에 대한 "감소된" 또는 "비-검출가능한 결합"을 결정하기 위한 예시적인 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 실시예 섹션 전반에 걸쳐 널리 기재되어 있다. 실시예 섹션은 항체, 예컨대 전장 항체와 관련하여 이들 특색의 특성을 기재한다. 본 발명에 따른 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 변형된 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 각각의 유리한 특성은 또한 다른 포맷, 예컨대 융합 단백질 등에서 유용할 수 있기 때문에, 고도로 바람직한 특성은 실시예 섹션에 기재된 것과 같은 문맥에서 결정되는 것으로 이해되며, 이는 본 발명에 따른 단백질이 항체로 제한되는 것으로 이해되어야 함을 의미하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 특히 항체와 관련하여 적용되는 경우의 용도를 발견하고, 이를 본원에 제시한다.
보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 단백질의 능력은 관련 기술분야에 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 간략하게, 비변형된 완전히 기능적 Fc 영역을 갖는 참조 단백질, 예를 들어 강력한 CDC 유도제인 IgG1 항체를 시험관내 검정에서 그의 세포-표면 상에 표적 항원을 제시하는 세포와 함께 인간 혈청의 존재 하에 인큐베이션하고, 후속적으로 세포 용해의 백분율을 결정하며, 이는 100%로 설정된다. 변형된 Fc 영역을 갖는 본 발명에 따른 단백질, 예를 들어 FER Fc 영역을 갖는 항체의 세포-용해의 백분율을 동일한 조건 하에 세포를 표적화하지 않는 또는 Fc 영역을 갖지 않는 (예컨대 예를 들어 F(ab')2) 대조군 단백질에 의해 발생하는 세포-용해와 비교한다. 백분율 용해를 100%로 설정된 비변형된 참조물과 비교하여 결정한다. 사용될 수 있는 적합한 방법의 예는 실시예 3 또는 실시예 5에 기재된 바와 같다. 본 발명에 따른 단백질은, 대신 FEA 포맷을 갖는 Fc 영역을 갖는 동일한 단백질과 비교 시 감소된 CDC 활성을 갖고/거나, 예를 들어 F(ab')2와 비교 시 유사한 CDC 활성을 갖는다.
감소된 C1q 결합을 갖는 단백질의 능력은 관련 기술분야에 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 간략하게, (비변형된) 완전히 기능적 Fc 영역을 갖는 단백질, 예를 들어 항체를 시험관내 검정에서 그의 세포-표면 상에 표적 항원을 제시하는 세포와 함께 인간 혈청의 존재 하에 인큐베이션하고, 후속적으로 C1q 결합의 백분율을 예를 들어 폴리클로날 토끼 항-인간 C1q 보체 FITC 항체 (다코(Dako), Cat # F0254, 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))와의 결합 및 제조업체의 지침에 따른 FACS 분석에 의해 결정한다. (비변형된) 완전히 기능적 FC 영역을 갖는 단백질의 검출된 신호를 변형된 Fc 영역을 갖는 단백질, 예를 들어 강력한 CDC 유도제인 IgG1 항체와 비교한다. 사용될 수 있는 본 발명에 따른 적합한 방법의 상세한 예는 실시예 4에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 단백질은, 대신 FEA 포맷을 갖는 Fc 영역을 갖는 동일한 단백질과 비교 시 감소된 CDC 활성을 갖고/거나, 예를 들어 비-결합 대조군 항체와 비교 시 유사한 CDC 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는, 예컨대 실시예 4에 기재된 바와 같이 FER이 존재하는 전장 IgG1 항체의 문맥에서 동일한 서열을 갖지만 FER이 부재하는 항체와 비교할 경우, 15% 이하의 C1q 결합 활성을 갖는다.
항원-의존성 세포성 세포독성을 감소시키는 능력은 관련 기술분야에 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 야생형 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 ADCC 능력을 결정하기 위해, 델피아® EuTDA TRF (시간-분해 형광) 세포독성 키트 (Cat # AD0116, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있다. 간략하게, 표적 항원을 제시하는 세포를, 예를 들어 비스(아세톡시메틸)2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실레이트 시약 용액 (델피아 BATDA 시약, Cat # C136-100, 퍼킨 엘머)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세포내 표지한다. 이들 세포를 후속적으로 (비변형된) 완전히 기능적 Fc 영역을 갖는 단백질, 예를 들어 표적 항원에 대한 야생형 항체 및 그의 비-활성화 변이체와 함께, PBMC의 존재 하에 그의 세포-표면 상에 표적 항원을 제시하는 세포 PBMC와 함께 인큐베이션한다. NK-매개 ADCC의 평가는 완전히 기능적 대조군 IgG1 항체 (100%로 설정됨) 및 비-결합 음성 IgG1 대조군 항체 (0%로 설정됨)를 참조하여 결정된다. 사용될 수 있는 적합한 방법의 상세한 예는 실시예 9에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 단백질은 바람직하게는, 예컨대 실시예 9에 기재된 바와 같이, 예를 들어 FER이 존재하는 전장 IgG1 항체를 동일한 서열을 갖지만 FER이 부재하는 항체와 비교할 경우, 35% 이하의 잔류 ADCC 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 단백질은, 대신 FEA 포맷을 갖는 Fc 영역을 갖는 동일한 단백질과 비교 시 유사한 감소된 ADCC 활성을 갖는다.
인간 FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)에 대한 결합과 관련하여, 이는 ELISA를 사용함으로써 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질의 결합은 ELISA 검정에서 His-태그부착된, C-말단 비오티닐화된 FcγR, FcγRIa의 단량체 ECD (서열식별번호: 15) (단량체), 또는 FcγRIIa 동종이형 131H (서열식별번호: 16), FcγRIIa 동종이형 131R (서열식별번호: 17), FcγRIIb (서열식별번호: 18), FcγRIIIa 동종이형 158F (서열식별번호: 19), 및 FcγRIIIa 동종이형 158V (서열식별번호: 20)의 이량체 ECD에 대한 결합을 결정함으로써 평가될 수 있다. 간략하게, 예를 들어, Fc 영역을 갖는 IgG1 항체를 항-인간 F(ab')2 항체로 코팅된 플레이트에 결합시키고, 후속적으로 각각의 세포외 도메인 각각과 함께 인큐베이션하고, 후속적으로 스트렙타비딘-폴리HRP (CLB, Cat # M2032, 1:10.000)를 사용하여 결합을 정량화한다. 사용될 수 있는 본 발명에 따른 적합한 방법의 상세한 예는 실시예 6에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 단백질, 예를 들어 항체는 상기 His-태그부착된, C-말단 비오티닐화된 FcγR, 단량체 ECD를 이용한 ELISA 검정에서 상기 Fcγ 수용체와 검출가능하게 결합하지 않는다. 본 발명에 따른 단백질은 예를 들어 실시예 6에 제시된 바와 같이 FER을 포함하는 Fc 영역을 갖는 IgG1 항체를 예를 들어 FEA를 포함하는 것과 비교할 경우에 관찰되는 바와 같이 상기 Fcγ 수용체에 대해 유사한 비-검출가능한 결합을 갖는다.
FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(F), 및 FcγRIIIa(V)를 통한 활성화 및 신호전달과 관련하여, 이는 상업적으로 입수가능한 리포터 검정에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 리포터 검정은 사용될 수 있는 표적-발현 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C08; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G9991; FcγRIIa 동종이형 131R: Cat # CS1781B08; FcγRIIb: Cat # CS1781E04; FcγRIIIa 동종이형 158F: Cat # G9790; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G7010)를 사용하여 본 발명에 따른 단백질의 활성화 및 결합을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CD20-표적화 항체의 경우, CD20-발현 Raji 세포가 표적 세포로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체는 예를 들어 실시예 7에 제시된 바와 같이 예를 들어 FER과 같은 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 FEA와 비교할 경우에 관찰되는 바와 같이 상기 Fcγ 수용체를 통해 유사한 비-검출가능한 활성화 및 신호전달을 갖는다.
CD3을 표적화하는 것과 관련하여 T-세포의 활성화의 감소와 관련하여, 이는 인간 T-세포 상의 인간 CD3에 결합하는 결합 영역을 포함하는 본 발명에 따른 단백질, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 인간 CD3에 결합하는 전형적인 2가 단일특이적 항체에 적용되는 것으로 이해된다. T-세포의 활성화의 감소는 예를 들어 각각 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역에 본 발명에 따른 2개의 폴리펩티드 둘 다에 EU-넘버링에 따른 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하는 항-CD3 항체의 용량-반응 시리즈를 새로이 단리된 PBMC와 함께 인큐베이션하고, 후속적으로 상기 세포를 마우스-항-인간 CD28-PE (Cat # 130-092-921; 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec); T-세포 마커) 및 마우스-항-인간 CD69-APC 항체 (Cat # 340560; 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 염색하는 것에 의해 결정될 수 있다. 이와 함께, T-세포 활성화의 척도인 T-세포의 CD69 상향조절이 결정된다. 이러한 검정의 세부사항은 실시예 10에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 단백질, 예를 들어 인간 CD3을 표적화하는 항체는 야생형 유사 Fc 영역을 갖는 인간 CD3을 표적화하는 IgG1 항체와 비교하여 CD69 상향조절을 방지하거나 또는 고도로 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른, 즉 적어도 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의, 바람직하게는 각각 F, E 및 R로의 치환을 갖는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 단백질과 관련하여, 이들은 바람직하게는 야생형 IgG1 서열과 매우 유사한 글리코실화를 가져야 한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질의 갈락토실화 및/또는 하전된 글리칸의 존재는 바람직하게는 동일한 세포주 및 동일한 생산 조건을 사용하여 생산된 야생형 IgG1 아미노산 서열에 대해 발견된 것과 동일한 범위이다. 제조를 위한 CHO 세포주를 포함하는 적합한 포유동물 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (특히 문헌 [Butler and Spearman, 2014, Curr Opin Biotechno, Dec;30:107-12] 참조). 갈락토실화의 총 백분율은 바람직하게는 야생형 IgG1 서열, 예컨대 서열식별번호: 1 등을 포함하는 동일한 단백질에서 관찰되는 갈락토실화의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 20%의 범위이다. 예를 들어, 야생형 IgG1 서열 등이 25%의 갈락토실화의 백분율을 갖는 경우에, 총 백분율은 5% - 45%의 범위일 수 있다. 갈락토실화의 총 백분율은 바람직하게는 FER 포맷을 포함하지 않는 본 발명에 따른 단백질에서 관찰되는 갈락토실화의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 20%의 범위이다. 하전된 글리칸의 총 백분율은 바람직하게는 야생형 IgG1 서열, 예컨대 서열식별번호: 1 등을 포함하는 단백질에서 관찰되는 하전된 글리칸의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 3%의 범위이다. 예를 들어, 야생형 IgG1 서열 등이 1%의 하전된 글리칸의 백분율을 갖는 경우에, 하전된 글리칸의 총 백분율은 0% - 4%의 범위일 수 있다. 하전된 글리칸의 총 백분율은 바람직하게는 FER 포맷을 포함하지 않는 본 발명에 따른 단백질에서 관찰되는 하전된 글리칸의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 3%의 범위이다. 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체의 하전된 글리칸의 총 백분율 및/또는 갈락토실화의 백분율은 바람직하게는 야생형 IgG1 서열, 예컨대 서열식별번호: 1 등을 포함하는 동일한 단백질에서 관찰된 바와 같은 하전된 글리칸의 총 백분율의 플러스 또는 마이너스 3% 및 갈락토실화의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 20%의 범위이다. 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체의 하전된 글리칸 및/또는 갈락토실화의 총 백분율은 바람직하게는 FER 포맷을 포함하지 않는 본 발명에 따른 단백질에서 관찰된 바와 같은 하전된 글리칸의 총 백분율의 플러스 또는 마이너스 3% 및 갈락토실화의 총 백분율과 비교하여 플러스 또는 마이너스 20%의 범위이다.
본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체의 갈락토실화 및/또는 하전된 글리칸의 백분율은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 실시예 14에 기재되어 있다. 적합한 방법은 예컨대 실시예 14에 기재된 2-아미노벤즈아미드표지 및 후속 HPLC 분석, 또는 오르비트랩 큐-익스트랙티브 플러스(Orbitrap Q-Extractive Pluss) 질량 분광계를 사용한 LC-MC를 포함한다. 여기서, 갈락토실화 및 하전된 글리칸의 백분율은 각각, A2F 글리칸 구조를 갖는 모든 글리칸 대비 올리고사카라이드에서의 갈락토스 또는 하전된 글리칸의 백분율 점유율로서 계산된다. 본원에서 백분율로서 지칭된 양은 몰량을 나타내며, 즉 질량이 아닌 분자의 수를 나타낸다. 하전된 글리칸 및/또는 갈락토실화의 백분율은, Expi293F 세포에서 생산된 경우, 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, 야생형 IgG1 서열을 갖는 Expi293F 세포에서 생산된 단백질의 하전된 글리칸의 백분율 및 갈락토실화의 백분율은 각각 약 0.5% 및 약 15% 내지 25%이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질은 Expi293F 세포에서 생산된 경우 바람직하게는 각각 0-4% 및 5-45%인 하전된 글리칸의 백분율 및 갈락토실화의 백분율을 바람직하게 갖는다.
위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의, 바람직하게는 각각 F, E 및 R로의 치환을 갖는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 본 발명에 따른 단백질과 관련하여, 이들은 바람직하게는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역과 유사한 인간 FcRn 결합을 가져야 한다. 본원에 선택된 바와 같은 치환은 FcRn 결합 기능에 영향을 미치지 않는 치환일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 단백질의 약동학은 특히 실시예 섹션에 기재된 것과 같은, 야생형 IgG1 Fc 영역을 갖는 상응하는 단백질의 약동학과 유사하다. 그러나, 예를 들어 FcRn 기능을 변형시키는 것, 예를 들어 반감기를 연장시키거나 반감기를 단축시키는 것이 유용해야 하는 것으로 이해되고, 이것이 유용할 시나리오에서, 이를 위한 추가의 치환을 포함하는 것이 고려될 수 있다. 항체, 예컨대 예를 들어 전장 단일특이적 및 이중특이적 항체에 대해, 한 실시양태에서, 인간 FcRn 결합 특성은 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 동일한 항체와 상이하지 않다. 이러한 결합 특성은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 따라서, pH 6.0에서의 FcRn 결합은 상응하는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역에 의해 관찰되는 것과 유사하게 발생하고, pH 7.4에서는 검출가능한 결합이 발생하지 않는다.
추가 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이는 숙주 세포에서 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 단일 발현 카세트로부터 생산된 단백질을 포함하는 것으로 이해되고, 즉 제1 및 제2 폴리펩티드는 그러한 하나의 폴리펩티드의 동종이량체일 수 있다. 이러한 단백질의 예는 항체, 예를 들어 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖고 (도 15a 참조) 여기서 2개의 중쇄 둘 다가 동일하고 또한 경쇄 둘 다가 동일한 항체를 포함한다. 이러한 항체는 2가이고, 각각 동일한 표적 항원, 즉 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 결합 영역을 갖는다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 아미노산 서열이 동일한 이뮤노글로불린 중쇄이고, 아미노산 서열이 동일한 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 추가로 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 추가의 치환을 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 추가의 치환은 이종이량체의 형성을 가능하게 하는, 즉 상이한 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 제공하도록 하는 변형을 포함한다. 이러한 단백질의 예는 이중특이적 항체, 예를 들어 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖고 여기서 적어도 2개의 중쇄는 동일하지 않아서 항체 내의 각각의 중쇄 및 경쇄 쌍이 상이한 항원을 표적화할 수 있는 항체 (도 15b 참조)를 포함한다. 제1 및 제2 폴리펩티드의 IgG1 서열의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 구별되는 변형을 도입하는 것이 반드시 요구되지는 않을 수 있고, 제1 및 제2 폴리펩티드 서열의 이들 영역은 동일할 수 있다. 이러한 방식으로, 동종이량체 및 이종이량체의 혼합물이 형성될 수 있으며, 그의 사용은 그 자체로 유리할 수 있거나, 또는 이종이량체 및 동종이량체는 (예를 들어 크기 및/또는 전하, 친화도 등에서의 차이를 통해) 그러한 혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있다. 그러나, 이중특이적 항체 등의 생성을 가능하게 하거나 그의 생성을 구동하는 추가의 변형을 도입하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질은 제1 및 제2 폴리펩티드의 IgG1 서열의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 추가의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, IgG1 서열의 힌지, CH2 및 CH3 영역과 관련하여 상이한 서열을 포함하는 제1 및 제2 폴리펩티드가 본 발명에 따른 단백질에서 유리하게 조합될 수 있다. 이러한 단백질, 즉 이러한 치환을 갖는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린 유사 단백질의 예는 상보적 CH3 도메인을 갖는 단백질, 예컨대 트리오맙(Triomab)/쿼드로마(Quadroma) (트리온 파마(Trion Pharma)/프레제니우스 바이오테크(Fresenius Biotech); 로슈(Roche), WO2011069104), 노브-인투-홀(Knobs-into-Holes) (제넨테크(Genentech), WO9850431), 크로스맙(CrossMAb) (로슈, WO2011117329) 및 정전기적으로-매칭되는 것 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO2010129304), LUZ-Y (제넨테크), DIG-바디 및 PIG-바디 (파맙신(Pharmabcine)), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디(SEEDbody)) (이엠디 세로노(EMD Serono), WO2007110205), 비클로닉스(Biclonics) (메루스(Merus)), FcΔAdp (레게네론(Regeneron), WO201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자(Pfizer)/리나트(Rinat), WO11143545), 아지메트릭 스캐폴드 (자임웍스(Zymeworks)/머크(Merck), WO2012058768), mAb-Fv (젠코르(Xencor), WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (로슈) 및 듀오바디(DuoBody) (젠맙 A/S, WO2011131746)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 추가의 아미노산 치환, 바람직하게는 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 치환, 예컨대 F405L 또는 K409R을 포함한다. 단백질이, 예를 들어 동일한 제1 및 제2 폴리펩티드를 갖는 동종이량체인 경우에, 둘 다는 동일한 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 이러한 단백질, 예를 들어 단일특이적 항체는, 예컨대 실시예 섹션 및 예를 들어 WO2011131746에 기재된 것과 같은 이중특이적 항체의 제조에 고도로 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 단일특이적 항체이다. 본 발명의 문맥에서, "단일특이적"은 그의 결합 영역과 동일한 에피토프에 결합하는, 즉 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다. 특히, 이러한 단일특이적 단백질 또는 항체는 바람직하게는 표적 분자, 세포 표적 및 병원체로부터 선택된 항원에 결합한다.
고려될 수 있는 표적 분자는 시토카인, 성장 인자, 리간드 등과 같은 분자를 포함한다. 세포 표면에, 예를 들어 암 세포, 종양 세포, 이펙터 세포 (예를 들어 대식세포, 단핵구, NK 세포 및 T 세포) 상에 존재하는 바와 같은 수용체 또는 부착 분자와 같은 분자를 포함하는 것으로 고려될 수 있는 세포 표적. 표적화될 수 있는 병원체는 바이러스, 박테리아, 원충, 기생충 등을 포함한다. 따라서, 고려될 수 있는 본 발명에 따른 단백질은 시토카인, 성장 인자, 리간드, 암 세포, 종양 세포, 이펙터 세포, 바이러스 및 박테리아의 군으로부터 선택된 항원 또는 표적에 대한 결합 영역을 갖는 단백질, 예컨대 단일특이적 항체를 포함한다.
그러나, 본 발명은 단일특이적 단백질, 예컨대 단일특이적 항체에 제한되지 않고, 또한 다중특이적 단백질, 예컨대 이중특이적 항체에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 이는 본 발명에 따른 단백질의 결합 영역이 동일한 에피토프 대신 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질의 제1 및 제2 결합 영역은, 예를 들어 아미노산 서열과 관련하여 상이하다. 상이한 에피토프는 동일한 표적 엔티티로부터의 것일 수 있고, 예를 들어 동일한 표적 분자에 의해 제시되고/거나 동일한 표적 세포에 의해 제시된 바와 같은 상이한 에피토프일 수 있지만, 또한 상이한 표적 엔티티로부터의 것일 수 있다.
본 발명에 따른 고도로 유리한 이중특이적 단백질, 예컨대 이중특이적 항체는 제1 및 제2 결합 영역 중 하나가 이펙터 세포를 표적화하고, 제1 및 제2 결합 영역 중 다른 것이 암 항원을 표적화하는 단백질을 수반한다. 이러한 다중특이적 항체를 사용함으로써, 특정 부류의 이펙터 세포가 암 세포와 결속하여, 예를 들어 이펙터 세포에 의한 암 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 결합 영역 중 하나가 암 항원에 결합하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 결합 영역 중 하나는 이펙터 세포, 예컨대 T-세포, NK 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 또는 호중구에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 결합 영역 중 하나는 이펙터 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포에 결합하고, 다른 결합 영역은 암 항원에 결합한다.
치료 항체의 Fc 영역의 이펙터 세포 또는 보체에 대한 Fc 결합이 요구되지 않거나 또는 심지어 원치않는 세포독성의 원인이 될 수 있기 때문에 바람직하지 않은, 이중특이적 항체에 의한 수용체 억제 또는 T-세포 동원과 같은 다양한 용도가 존재한다. 따라서, 하나의 결합 영역이 인간 T-세포 수용체에 결합하는 이중특이적 항체가 유리하게는 인간 세포독성 T-세포를 동원할 수 있다. 따라서, 하나의 결합 영역이 인간 CD3에 결합하고 세포독성 T-세포를 동원할 수 있는 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 활성화 IgG Fc 영역을 갖는 이중특이적 항체를 포함한 CD3 항체는 FcγR-발현 세포에 의한 가교, FcγR-발현 세포의 부적절한 활성화 및 후속 시토카인 폭풍 및 연관된 독성 효과, 또는 혈소판 응집을 통해 종양 세포의 부재 하에 원치않는 효능작용을 유도할 수 있다. 따라서, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 CD3 이중특이적 항체가 잠재적인 원치않는 세포 활성화를 방지하는 데 유리하다.
따라서, 한 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 영역 중 적어도 하나가 CD3에 결합하고, 즉 CD3에 결합할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 결합 영역은 CD3에 결합하고, 상기 제2 결합 영역은 임의의 다른 관심 표적에 결합하며, 즉 결합할 수 있다. 이러한 다른 표적은 암 항원일 수 있다. 이러한 다른 표적은 종양-특이적 표적 또는 암-특이적 표적일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 단백질은 이중특이적 항체이다. 바람직하게는 CD3에 결합할 수 있는 제1 결합 영역을 갖고 암-특이적 표적에 결합할 수 있는 제2 결합 영역을 갖는 상기 단백질 이중특이적 항체.
단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함한 항체는 본 발명에 따른 인간 IgG1 항체의 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역 등을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 특히 하기 기재된 바와 같은 항체 포맷이 이러한 IgG1 Fc 영역을 포함하지 않는 경우에, 이러한 항체는, 예를 들어 이러한 항체의 Fc 영역을 본 발명에 따른 FER을 포함하는 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역으로 대체하는 것에 의해 제공될 수 있거나, 또는 이러한 항체가 Fc 영역을 포함하지 않는 경우에, 예를 들어 융합 및/또는 접합을 통해 이러한 항체가 제공될 수 있다. 따라서, 항체가 본 발명에 따른 인간 IgG1 항체의 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 한, 임의의 항체 포맷이 본 발명에 따라 고려될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 아암을 갖는 단일 항체, (ii) 예를 들어 여분의 펩티드 링커에 의해 탠덤으로 연결된 2개의 scFv를 통해 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 단일 쇄 항체; (iii) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 탠덤으로 2개의 가변 도메인을 함유하는 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로-연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 탠드Ab; (vi) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인 플렉시바디; (vii) Fab에 적용되는 경우에 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는, 단백질 키나제 A 내의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤 락" 분자; (viii) 예를 들어 인간 Fab-아암의 둘 다의 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온 분자; 및 (ix) 디아바디를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 본 발명에 기재된 바와 같은 제어된 Fab 아암 교환 (예컨대 WO 11/131746에 기재됨)을 통해 수득된 디아바디, 크로스-바디, 또는 이중특이적 항체이다.
상이한 부류의 이중특이적 항체의 예는 (i) 이종이량체화를 강제하는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 분자의 2개의 측면이 각각 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유하는, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자; (iii) 전장 IgG 항체가 여분의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합된 IgG 융합 분자; (iv) 단일 쇄 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 Fc 융합 분자; (v) 상이한 Fab-단편이 함께 융합되거나, 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 Fab 융합 분자; 및 (vi) 상이한 단일 쇄 Fv 분자 또는 상이한 디아바디 또는 상이한 중쇄 항체 (예를 들어 도메인 항체, 나노바디)가 서로 융합되거나 또는 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 또 다른 단백질 또는 담체 분자에 융합된, ScFv- 및 디아바디-기반 및 중쇄 항체 (예를 들어, 도메인 항체, 나노바디)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상보적 CH3 도메인 분자를 갖는 이중특이적 IgG-유사 분자 등의 예는 트리오맙/쿼드로마 (트리온 파마/프레제니우스 바이오테크; 로슈, WO2011069104), 노브-인투-홀 (제넨테크, WO9850431), 크로스맙 (로슈, WO2011117329) 및 정전기적으로-매칭되는 것 (암젠, EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이, US201000155133; 온코메드, WO2010129304), LUZ-Y (제넨테크), DIG-바디 및 PIG-바디 (파맙신), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디) (이엠디 세로노, WO2007110205), 비클로닉스 (메루스), FcΔAdp (레게네론, WO201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자/리나트, WO11143545), 아지메트릭 스캐폴드 (자임웍스/머크, WO2012058768), mAb-Fv (젠코르, WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (로슈) 및 듀오바디 (젠맙 A/S, WO2011131746)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예는 이중 표적화 (DT)-Ig (GSK/도만티스(Domantis)), 투-인-원 항체 (제넨테크), 가교 Mab (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), mAb2 (에프-스타(F-Star), WO2008003116), 지바디 (진제니아(Zyngenia)), 공통 경쇄를 갖는 접근법 (크루셀(Crucell)/메루스, US7,262,028), κλ바디 (노브이뮨(NovImmune)) 및 CovX-바디 (CovX/화이자)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IgG 융합 분자의 예는 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig (애보트(Abbott), US7,612,181), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923), IgG-유사 이중특이체 (임클론(ImClone)/일라이 릴리(Eli Lilly)), Ts2Ab (메드이뮨(MedImmune)/AZ) 및 BsAb (지모제네틱스(Zymogenetics)), 허큘레스(HERCULES) (바이오젠 아이덱(Biogen Idec), US007951918), scFv 융합체 (노파르티스(Novartis)), scFv 융합체 (창저우 아담 바이오테크 인크.(Changzhou Adam Biotech Inc.), CN 102250246) 및 TvAb (로슈, WO2012025525, WO2012025530)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Fc 융합 분자의 예는 ScFv/Fc 융합체 (아카데믹 인스티튜션(Academic Institution)), 스콜피온(SCORPION) (이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion), 지모제네틱스/BMS), 이중 친화도 재표적화 기술 (Fc-DART) (마크로제닉스(MacroGenics), WO2008157379, WO2010/080538) 및 이중(ScFv)2-Fab (국립 항체 의학 연구 센터 - 중국)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
Fab 융합 이중특이적 항체의 예는 F(ab)2 (메다렉스(Medarex)/암젠), 이중-작용 또는 비스-Fab (제넨테크), 독-앤-락(Dock-and-Lock) (DNL) (이뮤노메딕스(ImmunoMedics)), 2가 이중특이체 (바이오테크놀(Biotechnol)) 및 Fab-Fv (UCB-셀테크(UCB-Celltech))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
ScFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 예는 이중특이적 T 세포 결속체 (BiTE) (마이크로메트(Micromet), 탠덤 디아바디 (탠드Ab) (아피메드(Affimed)), 이중 친화도 재표적화 기술 (DART) (마크로제닉스), 단일-쇄 디아바디 (아카데믹), TCR-유사 항체 (AIT, 리셉터로직스(ReceptorLogics)), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체 (메리맥(Merrimack)) 및 콤바디(COMBODY) (에피겐 바이오테크(Epigen Biotech)), 이중 표적화 나노바디 (아블링스(Ablynx)), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 제1 및 제2 폴리펩티드로부터의 각각의 CH2 및 CH3 영역의 서열이 상이하도록 상기 각각의 CH2 및 CH3 영역에서 추가의 치환을 포함하며, 상기 치환은 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 상기 폴리펩티드를 수득하는 것을 가능하게 하는 것인, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 폴리펩티드의 상기 치환은 동일한 위치에 존재하지 않는다. 이와 관련하여, 용어 "치환된"은 또 다른 유형의 아미노산으로 치환된 특정 아미노산 위치의 아미노산을 지칭한다. 따라서, 인간 IgG1 중쇄에서의 위치에 상응하는 위치에서 "치환된" 아미노산은 특정한 위치의 아미노산이 IgG1 중쇄에서의 그러한 위치의 자연 발생 아미노산과 상이하다는 것을 의미한다.
또한, 상기 제1 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 폴리펩티드의 상기 치환은 동일한 위치에 존재하지 않는 것인 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
추가 실시양태에서, 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 폴리펩티드에서 L이고, 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 폴리펩티드에서 R이거나, 또는 그 반대이다.
또 다른 실시양태에서, F405에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제1 폴리펩티드에서 L이고, K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제2 폴리펩티드에서 R이거나, 또는 그 반대인 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, F405 및 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제1 폴리펩티드에서 각각 L 및 K이고, F405 및 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 상기 제2 폴리펩티드에서 각각 F 및 R이거나, 또는 그 반대인 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환 또는 그 반대를 포함하는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
한 실시양태에서, 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환 또는 그 반대를 포함하는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 F, E 및 A로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환을 포함하는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 F, E 및 A로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환을 포함하는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환 또는 그 반대로 이루어진, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
한 실시양태에서, 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환 또는 그 반대로 이루어진, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 F, E 및 A로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환으로 이루어진, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 F, E 및 A로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환으로 이루어진, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 변형을 갖는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
본 발명에 따른 상기 단백질은 서열식별번호: 1에 정의된 바와 같은 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 기초로 할 수 있다. 인간 IgG1의 상기 힌지, CH2 및 CH3 영역은 동종이형 IgG1m(f)에 상응한다. 물론, IgG1 이뮤노글로불린 부류 내의 임의의 다른 인간 IgG1 동종이형 (예를 들어 IgG1m(za), IgG1m(zax), IgG1m(zav), 또는 IgG1m(fa); 특히 문헌 [Vidarsson et al., 2014, Front. Immunol., 20 Oct]을 참조하고, IMGT 데이터베이스 (www.imgt.org)에 제공된 바와 같음)이 고려될 수 있고, 동등하게 적합하다.
Fc 영역은 그의 C-말단에 리신을 가질 수 있다. 이러한 리신의 기원은 이들 Fc 영역이 유래된 인간에서 발견되는 자연 발생 서열이다. 재조합 항체의 세포 배양 생산 동안, 이러한 말단 리신은 내인성 카르복시펩티다제(들)에 의한 단백질분해에 의해 절단되어, 동일한 서열을 갖지만 C-말단 리신이 결여된 불변 영역이 생성될 수 있다. 항체의 제조 목적을 위해, 이러한 말단 리신을 코딩하는 DNA는 항체가 리신 없이 생산되도록 서열로부터 생략될 수 있다. 말단 리신을 코딩하거나 코딩하지 않는 핵산 서열로부터 생산된 항체는, 예를 들어 CHO-기반 생산 시스템에서 생산된 항체를 사용할 때 말단 리신의 프로세싱 정도가 전형적으로 높기 때문에 서열 및 기능에 있어서 실질적으로 동일하다 (Dick, L.W. et al., Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143). 본원에 열거된 바와 같은 불변 영역 서열은 말단 리신 (K)을 열거하고 (특히, 서열식별번호: 1 참조), 말단 리신 (K)을 코딩하는 서열을 본원의 실시예 섹션에 사용하였다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체는 본원에서 서열식별번호: 1-3, 5, 및 9-14에 열거된 바와 같은 말단 리신을 코딩하지 않거나 또는 그의 부재 하에 생성될 수 있는 것으로 이해된다.
따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열식별번호: 1에 따른 본원에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제1 및 제2 단백질은 본원에 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 바람직하게는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에 포함되는 상기 아미노산 서열은 본원에 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는 것인, 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 이중특이적 항체. 또한, 본원에 정의된 바와 같은 치환을 갖는, 서열식별번호: 1에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 말단 리신을 포함하지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 전장 항체일 수 있는 단백질, 또는 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 힌지, CH2 및 CH3 영역 서열 내에서 L234, L235 및 G236의 F, E 및 R로의 상기 치환을 포함하는 것에 더하여, 그 안에 추가의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 치환의 수는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3 영역 내에서의 최대 5개의 추가의 치환의 범위 내이다. 따라서, 한 실시양태에서, 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 단백질은 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 상기 서열에서 추가의 치환을 포함하며, 여기서 추가의 치환의 수는 최대 5개의 치환으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 상기 서열에서 추가의 치환을 포함하며, 여기서 추가의 치환의 수는 최대 10개의 치환으로 이루어진 것인 본 발명에 따른 단백질이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 서열식별번호: 1에 정의된 바와 같은 서열, 또는 인간 IgG1의 또 다른 동종이형의 상응하는 서열을 포함할 수 있고, 그의 힌지, CH2 및 CH3 영역 서열 내에서 L234, L235 및 G236의 F, E 및 R로의 상기 치환이 제공될 수 있으며, 또한 치환을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어 최대 5개의 추가의 치환을 포함한다. 추가의 치환을 갖는, 예컨대 본원에 정의된 바와 같은 R/L 치환을 갖는 매우 적합한 추가의 치환을 갖는 서열식별번호: 2에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 바와 같은 이러한 단백질의 예는 서열식별번호: 11 및 12에 정의된 바와 같은 아미노산 서열에 정의된 바와 같다. 또한, 본원에 정의된 바와 같은 임의적인 추가의 치환을 갖는, 서열식별번호: 2, 또는 11 및 12에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 말단 리신 결실을 가질 수 있다.
또한, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다가 서열식별번호: 2, 11 또는 12에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 전장 항체일 수 있는 본 발명에 따른 단백질이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있는 단백질이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열식별번호: 2 및 3에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있는 단백질이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열식별번호: 11 및 12, 또는 11 및 14, 또는 12 및 13에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 힌지 영역에 인접한 CH1 영역, 예를 들어 서열식별번호: 4에 의해 정의된 바와 같은 인간 CH1 영역을 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질, 또는 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 서열식별번호: 2에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질, 또는 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 서열식별번호: 11에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 405에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 L이고; 아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질, 또는 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 서열식별번호: 12에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이고; 아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질 또는 이중특이적 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서
상기 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고,
상기 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 265에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 A이고;
아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질 또는 이중특이적 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서
상기 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 11에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 405에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 L이고,
상기 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 12에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이고;
아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질 또는 이중특이적 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서
상기 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 12에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이고,
상기 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 13에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 A이고, 405에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 L이고;
아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공된 단백질 또는 이중특이적 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서
상기 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 11에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 R이고, 405에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 L이고,
상기 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 14에 정의된 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 234, 235 및 265에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 F, E 및 A이고, 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이고;
아미노산 번호는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같다.
본원에서 서열식별번호: 2로서 확인되는 서열은 L234, L235 및 G236의 F, E 및 R로의 치환을 갖는, 인간 IgG1 동종이형 G1m(f)의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 그의 힌지, CH2 및 CH3 영역 서열 내에 L234, L235 및 G236의 F, E 및 R로의 상기 치환이 제공된 인간 IgG1의 다른 동종이형의 불변 영역 (각각 CH1 영역을 포함함)의 상응하는 서열은 서열식별번호: 27 (FER 치환을 갖는 인간 IgG1 동종이형 G1m(fa)의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역), 서열식별번호: 29 (FER 치환을 갖는 인간 IgG1 동종이형 G1m(za)의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역), 서열식별번호: 31 (FER 치환을 갖는 인간 IgG1 동종이형 G1m(zav)의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역), 서열식별번호: 33 (FER 치환을 갖는 인간 IgG1 동종이형 G1m(zax)의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역)으로서 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제공되며, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다는 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 가장 바람직하게는 위치 L234, L235 및 G236의 상기 치환은 각각 F, E 및 R에 의한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제공되며, 여기서 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드는 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 바람직하게는 위치 L234, L235 및 G236의 상기 치환은 각각 F, E 및 R에 의한다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제공되며, 여기서 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 11 또는 12에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 핵산은 힌지 영역에 인접한 CH1 영역, 예를 들어 서열식별번호: 4에 의해 정의된 바와 같은 CH1 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산은 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩한다. 이러한 이뮤노글로불린 중쇄는 가장 바람직하게는 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 가변 영역을 포함한다. 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 핵산은 코딩 서열로부터 말단 리신이 결실되어 있을 수 있다. 이들 핵산은 이뮤노글로불린 경쇄 등을 코딩하는 핵산과 조합될 수 있다.
한 실시양태에서,
a) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 발현을 위한 구축물 또는 구축물들을 제공하는 단계;
b) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 내의 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산을 코딩하는 상기 핵산 서열을, 이들이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형시키는 단계;
c) 이에 의해 비-활성화 Fc 영역을 갖는 단백질을 생산하기 위한 구축물, 구축물들을 제공하는 단계
를 포함하는, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 본 발명에 따른 단백질을 생산하기 위한 구축물을 제공하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 단백질은 예컨대 서열식별번호: 1 등에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서,
a) 서열식별번호: 1에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
b) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 내의 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산을 코딩하는 상기 핵산 서열을, 이들이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형시키는 단계;
c) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역의 아미노산 L234, L235 및 G236이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형된 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명에 따른 단백질의 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 발현을 위해 단계 b)에서 수득된 변형된 서열을 사용하여 구축물을 생성하여, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 본 발명에 따른 단백질을 생산하기 위한 구축물을 제공하는 단계
를 포함하는, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 단백질을 생산하기 위한 구축물을 제공하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 단백질은 예컨대 서열식별번호: 1 등에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함한다.
추가 실시양태에서,
a) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 항체의 중쇄의 발현을 위한 구축물을 제공하는 단계;
b) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 내의 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산을 코딩하는 상기 핵산 서열을, 이들이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형시키는 단계;
c) 이에 의해 비-활성화 Fc 영역을 갖는 항체를 생산하기 위한 구축물을 제공하는 단계
를 포함하는, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 항체를 생산하기 위한 구축물을 제공하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 항체는 예컨대 서열식별번호: 1 등에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 중쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에서,
a) 서열식별번호: 1에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
b) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 내의 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산을 코딩하는 상기 핵산 서열을, 이들이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형시키는 단계;
c) 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역의 아미노산 L234, L235 및 G236이 각각 F, E 및 R을 코딩하도록 변형된 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 항체의 중쇄의 발현을 위해 단계 b)에서 수득된 변형된 서열을 사용하여 구축물을 생성하여, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 항체를 생산하기 위한 구축물을 제공하는 단계
를 포함하는, 비-활성화 Fc 영역을 갖는 항체를 생산하기 위한 구축물을 제공하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 항체는 예컨대 서열식별번호: 1 등에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 중쇄를 포함한다.
상기 구축물을 제공하는 방법에서, 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 또는 중쇄는 본 발명에 따라 본원에 정의된 바와 같은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 임의의 이러한 Fc 영역일 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 방법은 FER 치환을 도입함으로써 항체의 안전성 프로파일을 개선시키거나 또는 Fc-매개 이펙터 기능을 억제하는 데 특히 유용하다. 이러한 방법은 상기 FER 치환을 도입함으로써 단백질, 항체 등의 안전성 프로파일을 개선시키는 데 유용하다. 이러한 방법은 또한 FER 치환을 도입함으로써 단백질, 항체 등의 Fc-매개 이펙터 기능을 억제하는 데 유용하다. 이러한 방법은 FER 치환을 도입함으로써 단백질, 항체 등의 안전성 프로파일을 개선시키고 Fc-매개 이펙터 기능을 억제하는 데 특히 유용하다. 상기 방법을 이용하여, 본 발명에 따라 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 갖는 단백질을 수득하기 위한 핵산을 제공할 수 있다.
이러한 핵산은 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 데 특히 유용하다. 이러한 항체는 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 예를 들어 항체의 서열을 코딩하는 발현 벡터에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제공된다. 따라서, 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 비롯한, 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체가 생산되고 임의로 회수되는 적절한 조건 하에 이러한 숙주 세포 또는 하이브리도마를 배양함으로써 이러한 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명에 따른 핵산을 갖는 숙주 세포가 제공될 수 있으며, 여기서 상기 핵산은 예를 들어 실시예 섹션 등에 기재된 바와 같이 발현 벡터에 혼입된다. 본 발명의 문맥에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (적합한 세트의 발현 제어 요소를 포함하는 핵산 서열)를 비롯한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 또는 비바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-코딩 핵산은 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 예컨대 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축된 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터, 예컨대 pcDNA3.3 (본원에 기재된 바와 같음), pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "midge" 최소 크기의 핵산 벡터 (예를 들어, 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 기재된 바와 같음) 내에, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaPO4 --침전된 구축물 (예를 들어, WO 00/46147, 문헌 [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기재된 바와 같음)로서 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 그의 용법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어 US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트(BlueScript) (스트라타진(Stratagene)), pIN 벡터 (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)), pET 벡터 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨) 등을 포함한다. 발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), 및 Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)]에서 검토됨).
핵산 및/또는 벡터는 또한 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄를 주변세포질 공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는 분비/국재화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드, 소기관-표적화 서열 (예를 들어, 핵 국재화 서열, ER 체류 신호, 미토콘드리아 수송 서열, 엽록체 수송 서열), 막 국재화/앵커 서열 (예를 들어, 정지 전달 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에서, 본 발명에 따른 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함할 수 있거나 또는 그와 회합될 수 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이(E. coli)에서의 플라스미드 생성물에 대한 복제 기점, 선택 마커로서의 항생제 저항성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 구성적 프로모터와 대조적으로 유도성 프로모터를 포함할 수 있다 (통상의 기술자는 이러한 용어가 실제로 특정 조건 하에서의 유전자 발현의 정도를 기재하는 것임을 인식할 것이다).
따라서, 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 상기 항체는 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는, 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄, 및 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다. 이러한 숙주 세포는 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 2개의 동일한 중쇄, 및 본원에 기재된 바와 같은 2개의 동일한 경쇄를 갖는 단일특이적 항체를 제조하는 데 특히 유용할 수 있다. 특히, 중쇄의 서열이 상이한 이러한 항체 중 2종이 제공되고, 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 아암의 교환이 허용되는 경우에, 이러한 2종의 항체는 이중특이적 항체의 제조를 위해 고도로 유리하게 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다가 위치 L234, L235 및 G236에서 F, E 및 R로의 동일한 치환을 가질 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 상이한 치환을 가질 수 있다. 이는 예를 들어 이중특이적 항체의 편리한 제조를 가능하게 하는 데, 이는 이중특이적 항체가 생성될 수 있고/거나 새로운 생성물로서 개발될 수 있는 항체의 상이한 조합을 스크리닝하기 위해 예를 들어 새로운 구축물 및/또는 세포주를 각각 및 매번 반드시 생성할 필요가 없기 때문이며, 이에 의해 상당한 시간 및 노력이 절약된다.
따라서, 한 실시양태에서,
a) a. 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는, 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
b. 이뮤노글로불린 경쇄
를 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계;
b) a.
- 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A이거나, 또는
- 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는
인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
b. 이뮤노글로불린 경쇄
를 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계;
c) 여기서 상기 각각의 제1 및 제2 항체의 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용 각각보다 더 강하도록 하는 것인 단계;
d) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
e) 상기 제1 항체의 상기 제1 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제1 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 제2 항체의 상기 제2 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 수득하는 단계
를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
추가 실시양태에서, 이중특이적 항체 대신, 다중특이적 항체가 생산될 수 있다.
단계 a) 및 b)에서 제공된 바와 같은 제1 및 제2 항체는 바람직하게는 단일특이적 항체인 것으로 이해된다. 보다 바람직하게는, 상기 단일특이적 항체는 전장 항체이다. 가장 바람직하게는, 상기 항체는 인간 또는 인간화 가변 영역을 포함하고, 본원에 정의된 바와 같은 치환을 포함하는 인간 불변 영역을 갖는다. 상기 방법에 고도로 적합한 예시적인 제1 및 제2 항체는 각각 서열식별번호: 11 및 12; 11 및 14, 또는 12 및 13에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 제1 및 제2 항체이다. 이중특이적 항체를 제조하는 이러한 방법은 특히 본원의 실시예에 기재되어 있고, 또한 문헌 [Labrijn et al., 2014, Nature Protocols Oct;9(10):2450-63]에 널리 기재되어 있다. 물론, 본원에 기재된 바와 같은 다른 적합한 차이가 단계 c)에서 고려될 수 있다.
제약 조성물
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 측면 및 실시양태 중 임의의 것에 정의된 바와 같은 단백질, 예컨대 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제약 조성물은 통상적인 기술, 예컨대 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 바에 따라 제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제와 함께 제제화될 수 있다.
제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제는 본 발명의 단백질, 변이체 또는 항체 및 선택된 투여 방식에 적합하여야 한다. 제약 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 항원 결합에 대한 본 발명의 선택된 화합물 또는 제약 조성물의 목적하는 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적 영향의 결여 (예를 들어, 실질적인 영향 미만 (10% 이하의 상대 억제, 5% 이하의 상대 억제 등))에 기초하여 결정된다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질-무함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 제약 조성물에 포함되기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
제약 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 단백질, 변이체 또는 항체를 생체내 및 시험관내 투여하는 적합한 경로는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로 투여된다.
본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 경장 및 국소 투여 이외의, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
주사용 제약 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로-에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 질서의 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 함유하는 수성 또는 비-수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을, 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 예를 들어 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
치료 용도
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 본 발명의 단백질, 예를 들어 항체 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 본 발명의 단백질, 예를 들어 항체 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 상기 질환의 치료는 암, 감염성 질환, 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 질환이 암인 용도에 관한 것이다. 이러한 용도는 인간에서의 용도를 수반하는 것이 고도로 바람직한 것으로 이해된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 본 발명의 단백질, 예를 들어 항체 또는 제약 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 본 발명의 단백질, 예를 들어 항체 또는 제약 조성물을 질환을 앓고 있는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 추가 측면에서, 상기 질환은 암, 염증성, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 질환은 암이다.
본 발명의 단백질, 변이체, 항체 또는 제약 조성물은 야생형 항체에서 발견되는 바와 같은 항체 IgG1 Fc 영역의 면역 이펙터 기능이 바람직하지 않은 치료에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 변이체 또는 항체는 암, 감염성 질환, 염증성 또는 자가면역 장애와 같은 장애를 치료 또는 예방하기 위해, 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 배양물 중 세포에 또는 예를 들어 생체내에서 인간 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 전형적으로 단백질, 변이체, 항체 또는 제약 조성물에 반응하는 인간이다. 대상체는 예를 들어 표적 기능을 조정함으로써 또는 세포의 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 유도함으로써 교정되거나 호전될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 T-세포의 동원이 치료 또는 예방에 기여할 장애, 예컨대 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 치료 유효량의 본 발명의 단백질, 변이체, 항체 또는 제약 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 이러한 단백질은 세포독성 T-세포와 결속할 것이고, 예를 들어 CD3 및 암 항원을 표적화하는 이중특이적 항체일 것이다. 단백질, 변이체 또는 항체의 2개의 결합 영역 중 하나에 의한 T-세포의 동원은 T-세포의 세포독성 활성을 촉발할 수 있기 때문에, 종양-특이적 표적을 과다발현하는 세포는 본 발명의 이러한 단백질, 변이체 또는 항체에 대한 특히 우수한 표적이다. 세포독성 활성의 촉발이 암 세포의 제거에서 적절하게 작용하지 않을 수 있기 때문에, 이러한 메카니즘은 통상적으로 수득하기 어렵다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 및 이중특이적 항체를 포함한 단백질은 또 다른 분자에 접합된다. 이러한 단백질은 다른 분자를 단백질 또는 항체 또는 그의 단편의 N-말단 측면 또는 C-말단 단부에 화학적으로 접합시킴으로써 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)] 참조). 이러한 접합된 항체 유도체는 또한 적절한 경우에 내부 잔기 또는 당에서의 접합에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 항체 및 이중특이적 항체를 포함한 단백질은 치료 분자에 접합된다. 적합한 치료 분자는 예를 들어 핵산, 예컨대 압타머, 리보자임, 안티센스 분자, 또는 RNAi 유도제를 포함할 수 있다. 고려될 수 있는 다른 치료 분자는 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제 또는 방사성동위원소를 포함한다. 이러한 접합체는 면역접합체로 지칭될 수 있다. 1종 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 면역독소로 지칭될 수 있다.
본 발명의 면역접합체를 형성하기 위한 적합한 치료 분자는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 항대사물 (예컨대 메토트렉세이트, 6 메르캅토퓨린, 6 티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5 플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴), 항생제 (예컨대 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대 디프테리아 A 쇄 및 활성 그의 단편 및 하이브리드 분자), 리신 독소 (예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화된 리신 A 쇄 독소), 콜레라 독소, 시가-유사 독소 (SLT I, SLT II, SLT IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 겔라닌, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 또는 에노마이신 독소를 포함할 수 있다.
방법은 전형적으로 대상체에게 단백질, 변이체 또는 항체를 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 수반한다.
단백질, 변이체 또는 항체에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 상태에 좌우되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 치료 용도를 위한 "유효량"은 질환의 진행을 안정화시키는 그의 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하는 화합물의 능력은, 예를 들어 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 통상의 진료의에게 공지된 시험관내 검정에 의해 세포 성장을 억제하거나 세포독성을 유도하는 단백질, 변이체 또는 항체의 능력을 검사하는 것에 의해 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 치료 화합물, 즉 치료 단백질, 변이체, 항체 또는 제약 조성물의 치료 유효량은 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 달리 증상을 호전시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 단백질, 항체 또는 변이체는 유지 요법에 의해, 예컨대 예를 들어 규정된 기간 동안 규칙적 간격으로, 또는 질환 진행까지 투여될 수 있다. 단백질, 항체 또는 변이체는 또한 암 발생 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서 사건 발생의 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 상태인 경우에 재발 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
단백질, 변이체, 항체 또는 항체는 또한 암 발생 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서 사건 발생의 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 상태인 경우에 재발 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
진단 용도
본 발명의 비-활성화 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 단백질을 포함하는 조성물을 사용하는 진단 목적에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 단백질을 사용하는 진단 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법 및 조성물은 순수하게 진단 목적, 예컨대 질환의 검출 또는 확인, 뿐만 아니라 치유적 치료의 진행의 모니터링, 질환 진행의 모니터링, 치료 후 상태의 평가, 질환의 재발의 모니터링, 질환 발생의 위험의 평가 등을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 이러한 단백질을 사용함으로써, 예를 들어 진단 용도를 방해할 수 있는 Fc 영역에 의해 발휘되는 임의의 원치않는 효과를 피하는 것이 가능하다.
한 측면에서, 본 발명의 단백질은 생체외에서, 예컨대 환자로부터 채취한 샘플에서 표적의 수준 또는 그의 세포 표면 상에 관심 표적을 발현하는 세포의 수준을 검출함으로써, 특이적 관심 표적을 발현하고 단백질이 결합하는 세포가 질환을 나타내거나 또는 발병기전에 수반되는 질환을 진단하는 데 사용된다. 이는 예를 들어 시험할 샘플을 임의로 대조군 샘플과 함께 표적에 대한 단백질의 결합을 허용하는 조건 하에 본 발명에 따른 단백질과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 이어서, 복합체 형성을 검출할 수 있다 (예를 들어, ELISA를 사용함). 대조군 샘플을 시험 샘플과 함께 사용할 때, 단백질 또는 단백질-표적 복합체의 수준은 둘 다의 샘플에서 분석되고, 시험 샘플에서의 단백질 또는 단백질-표적 복합체의 통계적으로 유의하게 보다 높은 수준은 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 표적의 보다 높은 수준을 나타낸다.
본 발명의 단백질이 사용될 수 있는 통상적인 면역검정의 예는 비제한적으로 ELISA, RIA, FACS 검정, 플라즈몬 공명 검정, 크로마토그래피 검정, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 및/또는 면역침전을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
- 샘플을 샘플 내의 표적에 대한 단백질의 결합을 허용하는 조건 하에 본 발명의 단백질과 접촉시키는 단계;
- 복합체가 형성되었는지 분석하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 표적 또는 표적을 발현하는 세포의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 샘플은 생물학적 샘플이다.
한 실시양태에서, 샘플은 특이적 표적 및/또는 표적을 발현하는 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 의심되는 조직 샘플이다. 예를 들어, 표적 발현의 계내 검출은 환자로부터 조직학적 시편을 떼어내고 본 발명의 단백질을 이러한 시편에 제공하는 것에 의해 달성될 수 있다. 단백질은 시편에 단백질을 적용하거나 오버레이하는 것에 의해 제공될 수 있고, 이는 이어서 적합한 수단을 사용하여 검출된다. 이어서, 표적 또는 표적-발현 세포의 존재 뿐만 아니라, 검사된 조직에서 표적 또는 표적-발현 세포의 분포를 결정하는 것이 가능하다 (예를 들어, 암 세포의 확산을 평가하는 것과 관련하여). 본 발명을 사용하여, 통상의 기술자는 이러한 계내 검출을 달성하기 위해 임의의 매우 다양한 조직학적 방법 (예컨대 염색 절차)이 변형될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
상기 검정에서, 단백질은 결합된 단백질이 검출되도록 하는 검출가능한 물질로 표지될 수 있다. 대안적으로, 결합된 (1차) 특이적 단백질은 검출가능한 물질로 표지되고 1차 특이적 단백질에 결합하는 항체에 의해 검출될 수 있다.
샘플 중 표적의 수준은 또한 검출가능한 물질로 표지된 표적 표준물 및 비표지된 표적-특이적 단백질을 이용하는 경쟁 면역검정에 의해 추정될 수 있다. 이러한 유형의 검정에서, 생물학적 샘플, 표지된 표적 표준물(들) 및 표적-특이적 단백질을 합하고, 비표지된 표적-특이적 단백질에 결합된 표지된 표적 표준물의 양을 결정한다. 생물학적 샘플 내의 표적의 양은 표적-특이적 단백질에 결합된 표지된 표적 표준물의 양에 반비례한다.
시험관내 진단 기술에 사용되는 표적-특이적 단백질, 2차 항체 및/또는 표적 표준물에 대한 적합한 표지는, 비제한적으로, 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β갈락토시다제, 및 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 및 3H를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 표적-특이적 단백질을 검출-촉진 방사선-비투과성 제제에 접합시키고, 접합된 단백질을 예컨대 혈류 내로의 주사에 의해 숙주에 투여하고, 숙주 내의 표지된 단백질의 존재 및 위치를 검정하는 생체내 영상화 방법을 제공한다. 이러한 기술 및 본원에 제공된 임의의 다른 진단 방법을 통해, 본 발명은 인간 환자 또는 인간 환자로부터 채취한 생물학적 샘플에서 질환-관련 세포의 존재에 대해 스크리닝하고/거나 표적-특이적 ADC 요법 전에 표적-특이적 단백질의 분포를 평가하는 방법을 제공한다.
진단 영상화를 위해, 방사성동위원소는 직접적으로 또는 중간 관능기를 사용하는 것에 의해 간접적으로 표적-특이적-단백질에 결합될 수 있다. 유용한 중간 관능기는 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산을 포함한다 (예를 들어 US 5,057,313 참조).
방사성동위원소 및 방사선-비투과성 제제에 더하여, 진단 방법은 자기 공명 영상화 (MRI)를 위한 염료 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘 복합체 사용), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 증진제 (예를 들어 상자성 이온)에 접합된 표적-특이적 단백질을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, MRI 기술 및 MRI 증진제에 접합된 단백질의 제조를 기재한 미국 특허 번호 6,331,175 참조). 이러한 진단제/검출제는 MRI에 사용하기 위한 작용제, 및 형광 화합물로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 진단 표적-특이적 단백질을 제공하며, 여기서 표적-특이적 단백질은 조영제 (예컨대, 자기 공명 영상화, 컴퓨터 단층촬영용, 또는 초음파 조영-증진제), 또는 예를 들어 감마-, 베타-, 알파-, 오거 전자- 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있는 방사성핵종에 접합된다.
추가 측면에서, 본 발명은
- 본 발명의 표적-특이적 항체; 및
- 키트의 사용에 대한 지침서
를 포함하는, 샘플에서 표적 항원 또는 표적을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 표적-특이적 단백질, 및 표적에 대한 표적-특이적 단백질의 결합을 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는 용기를 포함하는, 암 진단용 키트를 제공한다. 시약은 예를 들어 형광 태그, 효소 태그, 또는 다른 검출가능한 태그를 포함할 수 있다. 시약은 또한 2차 또는 3차 항체 또는 효소적 반응을 위한 시약을 포함할 수 있고, 여기서 효소적 반응은 시각화될 수 있는 생성물을 생산한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 적합한 용기(들) 내의 표지된 또는 비표지된 형태의 본 발명의 1종 이상의 표적-특이적 단백질, 간접 검정을 위한 인큐베이션용 시약, 및 표지의 성질에 따라 상기 검정에서의 검출을 위한 기질 또는 유도체화제를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 대조군 시약(들) 및 사용에 대한 지침서가 또한 포함될 수 있다.
진단 키트는 또한 조직 샘플 또는 숙주에서 표적의 존재의 검출을 위해 표적-특이적 단백질, 예컨대 표지된 표적-특이적 단백질과 함께 사용하기 위해 공급될 수 있다. 이러한 진단 키트, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 치료 용도를 위한 키트에서, 표적-특이적 단백질은 전형적으로 단독으로 또는 표적 세포 또는 펩티드에 특이적인 추가의 항체와 함께 용기 내에 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체 (예를 들어, 불활성 희석제) 및/또는 그의 성분, 예컨대 트리스, 포스페이트, 또는 카르보네이트 완충제, 안정화제, 보존제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 등이 또한 (전형적으로 혼합을 위해 개별 용기 내에) 포함되고, 추가의 시약이 (또한 전형적으로 개별 용기(들) 내에) 포함된다. 특정 키트에서, 전형적으로 개별 용기 내에 존재하는 표적-특이적 단백질에 결합할 수 있는 2차 항체가 또한 포함된다. 제2 항체는 전형적으로 표지에 접합되고, 본 발명의 표적-특이적 단백질과 유사한 방식으로 제제화된다. 상기 및 본원의 다른 곳에 기재된 방법을 사용하여, 표적-특이적 단백질은 암/종양 세포의 하위세트를 규정하고 이러한 세포 및 관련 종양 조직을 특징화하는 데 사용될 수 있다.
표 1
서열 목록
실시예
도입
야생형 IgG1은 보체-매개 세포독성 (CDC)을 유도하는 데 매우 효율적이기 때문에, IgG1 이소형의 항체에 FEA 불활성 포맷 (L234F-L235E-D265A)을 사용하는 경우 CDC 활성은 강하게 억제된다. 그러나, 탐색적 실험에서, FEA 치환을 보유하는 IgG1 항체는 때때로 여전히 낮은 잔류 CDC 활성을 유지하는 것으로 나타났으며, 이는 구상된 치료 항체의 유해 효과 또는 용량-제한 독성이 Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 CDC에 고도로 좌우될 수 있는 경우에 바람직하지 않을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 야생형 유사 포맷과 비교하여, FEA 불활성 포맷을 보유하는 항체에서 글리코실화 불균질성이 증가되었을 뿐만 아니라 갈락토실화 및 하전된 글리칸의 존재에서의 증가를 또한 관찰하였다. 글리코실화 프로파일의 변화는 효능 및 약동학적 특성에 영향을 미칠 수 있고, 이는 제조 시 모니터링되고 제어될 필요가 있다. FEA 불활성 포맷을 함유하는 항체의 글리칸 프로파일의 평가 시, 본 발명자들은 증가된 글리코실화 불균질성, 증가된 갈락토실화 수준, 및 증가된 하전된 글리칸 수준이 D265A 치환으로 인한 것일 수 있음을 관찰하였다. FEA의 가능한 잔류 CDC 활성의 관점에서, 및 FEA의 글리코실화 프로파일의 관점에서, 본 발명자들은 개선된 포맷을 제공하고자 하였다.
개선을 추구하는 데 있어서, L234F, L235E 및 G236R 치환을 조합하는 것이 고려되었다. 그러나, 특정 돌연변이의 임의의 선택은 물론, 임의의 돌연변이를 조합하는 것은 본질적으로 예측불가능하다. 더욱이, L234F, L235E, 및 G236R 돌연변이를 조합하는 것, 즉 다중 변형을 함께 근접하게 패킹하는 것은 이러한 다수의 변화의 구조적 및/또는 기능적 영향이 예측될 수 없기 때문에 간단하지 않다. 따라서, 본 발명자들은 파일럿 실험에서 CDC를 침묵시키는 능력뿐만 아니라 항체의 글리코실화 프로파일에 대한 조합 L234F, L235E 및 G236R (FER)의 효과가 무엇인지 시험하였다. 놀랍게도, 이들 초기 실험은 FER 돌연변이의 도입에 의해 CDC를 침묵시키는 능력이 개별 치환과 비교하여 및 FEA 치환과 비교하여 고도로 개선되었음을 나타내었다. 또한, 글리코실화 프로파일의 평가는 FER 불활성 포맷을 보유하는 항체에 상응하는 야생형 유사 항체와 유사한 글리칸 프로파일이 제공되었음을 본 발명에 이르러 밝혀내었다. 따라서, 이들 초기 실험은 본 발명자들이 FER 불활성 포맷의 임상 적합성을 완전히 분석하도록 촉구하였고, 이는 하기 실시예에서 기재된다. 놀랍게도, 시험된 모든 특색에 대하여, FER 불활성 포맷은 FEA 불활성 포맷과 비교한 경우뿐만 아니라 다른 불활성 포맷과 비교한 경우에도 고도로 유리한 특성이 관찰되었다. 이는 새로운 FER 포맷이 임상 개발 및 임상 용도에 매우 적합함을 나타낸다. 예를 들어 융합 단백질과 같은, 항체 이외의 문맥에서 또한 유용할 수 있는 이러한 비-활성화 포맷은 고도로 유리하고 부류-중-최고의 비-활성화 포맷인 것으로 간주될 수 있다.
실시예 1: 항체 변이체의 생산 및 정제 및 이중특이적 항체 변이체의 생성
항체를 위한 발현 구축물
인간 또는 인간화 결합 도메인을 갖는 항체의 발현을 위해, 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인의 서열을 포함하는 항체 구축물을 신생 유전자 합성 (진아트 진 신테시스(GeneArt Gene Synthesis); 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 독일)에 의해 제조하고, 선택된 결합 도메인에 대해 적절한, 인간 IgG1m(f) 동종이형 (또한 본 출원의 실시예 섹션 전반에 걸쳐 IgG1로 지칭됨; 서열식별번호: 5), 또는 인간 IgG1m(fa) 동종이형 (서열식별번호: 23), 또는 인간 IgG1m(za) 동종이형 (서열식별번호: 24), 또는 인간 IgG1m(zax) 동종이형 (서열식별번호: 25), 또는 인간 IgG1m(zav) 동종이형 (서열식별번호: 26), 또는 C-말단 리신의 재조합 결실을 갖는 인간 IgG1m(f) 동종이형 (또한 IgG1-delK로 지칭됨; 서열식별번호: 35)의 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (즉, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역) 또는 그의 변이체; 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 (힌지, CH2, CH3, 서열식별번호: 8; CH1, 힌지, CH2, CH3, 서열식별번호: 46) 또는 그의 변이체; 인간 IgG3 동종이형 IGHG3*01 (서열식별번호: 40) 또는 인간 IgG3 동종이형 IGHG3*04 (또한 IgG3rch2로도 지칭됨; 서열식별번호: 41)의 인간 IgG3 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체; 뮤린 IgG2a 중쇄 불변 영역 (서열식별번호: 38) 또는 그의 변이체; 또는 인간 카파 경쇄 (LC; 서열식별번호: 6), 또는 인간 람다 LC (서열식별번호: 7), 또는 뮤린 카파 LC (서열식별번호: 49)의 불변 영역을 함유하는 pcDNA3.3 발현 벡터 (써모피셔 사이언티픽, 미국) 내로 클로닝하였다. 변이체를 생성하기 위한 목적하는 치환을 유전자 합성에 의해 도입하였고, 이를 하기 기재한다. 본 출원에서 CD20 항체 변이체는 이전에 기재된 (Engelberts et al., 2020) 유형 I 항-인간 CD20 항체로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 갖는다. 본 출원에서 HLA-DR 항체 변이체는 이전에 기재된 HLA-DR 항체 IgG1-HLA-DR-4 (US6894149 B2) 및 IgG1-HLA-DR-1D09C3 (US7521047 B2)으로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 갖는다. 본 출원에서의 CD3 항체, 뿐만 아니라 그의 변이체는 이전에 기재된 CD3 항체로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 갖는다 (즉, CD3-huCLB-T3/4: Labrijn et al., PNAS, 2013 Mar 26;110(13):5145-50, 및 Engelberts et al., 2020). 본 출원에서 HER2 항체 변이체는 IgG1-HER2-1014-169 (WO2012143524)로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 포함한다. HIV1 gp120-특이적 항체인 b12의 VH/VL을 포함하는 인간 IgG1 항체를 일부 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다 (Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-2).
비-활성화 항체 변이체
F405L 돌연변이 (서열식별번호: 9) 또는 K409R 돌연변이 (서열식별번호: 10)를 보유하는 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (즉, 힌지, CH2 및 CH3 영역) 또는 그의 야생형-유사 변이체를 나타낸 바와 같이 대조군 항체에 사용한다. 일부 예에서, IgG4의 불변 영역을 갖는 야생형 항체 변이체 (서열식별번호: 8) 또는 서열식별번호: 8에서 S228P 돌연변이를 보유하는 그의 IgG4 변이체가 대조군으로서 사용된다.
비-활성화 Fc 도메인은 항체가 면역 세포 상에 존재하는 Fc-수용체 또는 C1q와 상호작용하여 전형적 보체 경로를 활성화시키는 것을 방지한다. 본원의 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 여러 비-활성화 항체 변이체를 생성하고, Fc 기능을 침묵시키는 능력에 대해 시험하였다. 일부 예에서, 비-활성화 항체 변이체의 하위세트를 약동학적 특성, 면역원성 또는 개발가능성에 대해 시험하였다.
다양한 비-활성화 항체 변이체를 상기 나타내고 기재한 바와 같은 상이한 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성하였다. 하기 치환 (여기서 아미노산은 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같음)을 서열식별번호: 1의 IgG1m(f) HC 영역에, 또한 F405L 또는 K409R 돌연변이와 조합하여 도입하여, 이중특이적 비-활성화 항체 변이체의 생성을 가능하게 하였다: L234F-L235E-D265A (특히, US10590206B2) 단독 (서열식별번호: 3), 또는 F405L (서열식별번호: 13) 또는 K409R (서열식별번호: 14)과 조합하여, L234F-L235E-G236R 단독 (서열식별번호: 2), 또는 F405L (서열식별번호: 11) 또는 K409R (서열식별번호: 12)과 조합하여, L234A-L235A-P329G (Schlothauer et al., 2016, Protein Eng. Design and Selection) 단독, 또는 F405L 또는 K409R과 조합하여, G236R-L328R (US2006/0235208 A1, Moore et al., 2011, MAbs)을 F405L 또는 K409R과 조합하여, E233P-L234V-L235A-delG236-S267K (Moore et al., 2019, Methods)를 F405L 또는 K409R과 조합하여, N297G (Tao and Morrison, 1989, JI)를 F405L 또는 K409R과 조합하여, 및 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S (US8613926k)를 F405L 또는 K409R과 조합하여. 하기 돌연변이를 IgG1m(f) HC 영역에 서열식별번호: 35의 HC C-말단 리신의 재조합 결실 (또한 IgG1-delK로도 지칭됨)과 함께 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 36), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 37). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 23의 IgG1m(fa) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 27), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 28). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 24의 IgG1m(za) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 29), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 30). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 25의 IgG1m(zax) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 33), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 34). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 26의 IgG1m(zav) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 31), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 32). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 40의 IgG3 (IGHG3*01) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 42), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 43). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 41의 IgG3 (IGHG3*04; 또한 IgG3rch2로도 지칭됨) HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 44), 및 L234F-L235E-D265A (서열식별번호: 45). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 8의 IgG4 HC 영역에 단독으로 또는 F405L-R409K 돌연변이와 조합하여 도입하여 이중특이적 비-활성화 항체 변이체의 생성을 가능하게 하였다: S228P-E233P-F234V-L235A-delG236 (WO2015/143079) 또는 F405L-R409K와 조합하여, S228P-F234A-L235A (Allegre et al., Transplantation, 1994, Jun 15;57(11):1537-43 및 Angal et al., Mol Immunol, 1993, Jan;30(1):105-8) 또는 F405L-R409K와 조합하여, L235E-G236R (서열식별번호: 47), 및 L235E-D265A (서열식별번호: 48). 하기 돌연변이를 서열식별번호: 38의 뮤린 IgG2a HC 영역에 도입하였다: L234F-L235E-G236R (서열식별번호: 39), L234A-L235A (Arduin et al., Mol Immunol, 2015 Feb;63(2):456-63), 및 L234A-L235A-P329G (Lo et al., J Biol Chem, 2017 Mar 3;292(9):3900-3908).
일시적 발현
항체는 인간 IgG1κ, IgG1λ, IgG3κ, IgG4κ, 또는 뮤린 IgG2aκ로서 발현되었다. 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 플라스미드 DNA 혼합물을 엑스피펙타민(ExpiFectamine)™ (써모 피셔 사이언티픽, Cat # A14525)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 엑스피293F™ 세포 (써모 피셔 사이언티픽, Cat # A14527)에 일시적으로 형질감염시켰다. 간략하게, DNA (1:1 HC/LC 비) 및 엑스피펙타민 둘 다를 각각 Opti-MEM I (써모 피셔 사이언티픽, Cat # 51985034) 중에 개별적으로 20 μg/ml 및 5.4% (v/v)로 희석한다. 둘 다의 용액을 5분 동안 인큐베이션하고, 혼합하고, 10-20분 동안 인큐베이션한 후, pen/strep가 보충된 신선한 Opti-MEM 중 3x106개 Expi293F 세포/ml로 첨가한다 (최종 DNA 농도 1 μg/ml). 형질감염 후 대략 16-24시간에, 엑스피펙타민 293 형질감염 인핸서 I (0.5 (v/v)%) 및 II (5 (v/v)%)를 첨가한다. 상청액은 전형적으로 형질감염 5일 후에 수거한다. 상청액 중 항체 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 항체를 하기 기재된 바와 같이 정제하였다.
항체 정제 및 품질 평가
항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 배양물 상청액을 0.20 μM 데드-엔드 필터 상에서 여과하고, 5 mL 맙셀렉트 슈어 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)/시티바(Cytiva)) 상에 로딩하고, 0.02 M 시트르산나트륨-NaOH pH 5.0으로 세척하고, 0.02 M 시트르산나트륨-NaOH, pH 3으로 용리시켰다. 용리액을 PBS (8.65 mM Na2HPO4 무수, 1.9 mM NaH2PO4 1수화물, 140.3 mM NaCl, pH 7.4 완충제, 하이클론(HyClone)/시티바에 의해 젠맙을 위해 제조됨)에 대해 투석하였다. 필요한 경우에, 단백질을 정제용 크기-배제-크로마토그래피 (SEC) 상에서 추가로 정제하여 응집체를 제거하였다. 완충제 교환 또는 SEC 후에, 샘플을 0.2 μm 데드-엔드 필터 상에서 멸균 여과하였다. 정제된 단백질의 품질을 질량 분광측정법, 모세관 전기영동 (비-환원 및 환원 CE-SDS) 및 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 분석하였다. 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 2-8℃에서 저장하였다.
이중특이적 항체의 생성
본질적으로 이전에 보고된 바와 같이 (Labrijn et al., 2014, Nature Protocols Oct;9(10):2450-63), 상기 열거된 바와 같은 비-활성화 돌연변이에 더하여 CH3 도메인에 F405L 돌연변이를 보유하는 단일특이적 항체와 CH3 도메인에 K409R 돌연변이를 보유하는 단일특이적 항체 사이의 제어된 Fab-아암 교환 (cFAE)에 의해 IgG1 이중특이적 항체를 생성하였다. IgG4 이중특이적 변이체의 경우, 하나의 단일특이적 항체는 위치 409에 천연 아르기닌 (R)을 보유하고, 다른 단일특이적 항체는 항체의 CH3 도메인에 F405L-R409K 돌연변이를 보유하였다. 간략하게, 둘 다의 단일특이적 항체를 등몰 농도로 혼합하고, 75 mM 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA)과 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 2-MEA를 슬라이드-에이-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트 (10K MWCO; 써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 4℃에서 밤새 PBS에 대해 완충제-교환하여 제거하였다. 투석 완충제를 2회 교환하였다. 생성된 이중특이적 항체를 카세트로부터 수집하고, 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 이중특이적 항체를 2-8℃에서 저장하고, 전형적으로 CE-SDS 및 HP-SEC에 의해 분석하여 생성된 이중특이적 항체의 단량체 상태를 평가하고, 오비트랩 큐-이그잭티브 플러스 질량 분광계 (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 질량 분광측정 분석에 의해 분석하여 cFAE의 효율 및 이중특이적 항체 함량을 결정하였다.
F(ab')2 단편의 생성
FragIT 키트 (제노비스 아베(Genovis AB))를 본질적으로 제조업체의 권고에 따라 사용하여 HLA-DR을 표적화하는 F(ab')2 단편을 생성하였다. 간략하게, 힌지 영역 아래의 특정 부위에서 IgG를 소화시켜 아가로스 비드에 커플링되는 F(ab')2 및 Fc/2 단편의 균질한 풀을 생성하는 FabRICATOR 효소를 갖는 수지인 FragIT를 함유하는 스핀 칼럼을 소화 완충제 (게노비스 아베)로 평형화시킨다. 후속적으로, E430G 돌연변이를 갖는 항-인간 HLA-DR 항체 변이체 IgG1-HLA-DR-1D09C3을 칼럼에 적용하고, 실온 (RT)에서 15분 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 용리시키고, 칼럼으로부터 수집하였다. 정제된 F(ab')2 단편을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 (CE-SDS) 상에서 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 2: Raji 세포에 대한 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 표적 결합
야생형 Fc를 갖는 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 K409R, L234F-L235E-D265A-K409R, L234F-L235E-G236R-K409R, L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R, N297G-K409R, L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R을 보유하는 변이체, 야생형 Fc를 갖는 IgG4 항체 및 S228P, S228P-F234A-L235A, 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del을 보유하는 변이체의 표적 결합을 CD20을 발현하는 Raji 세포를 사용하여 평가하였다. 항-HIV1 gp120 IgG1 야생형 항체 (IgG1-b12)를 비-결합 대조군으로서 사용하였다.
이를 위해, FACS 완충제 (1x PBS, Cat # BE17-517Q, 론자(Lonza); 0.1% 소 혈청 알부민, BSA, Cat # 10735086001, 머크(Merck); 0.02% NaN3, Cat # 41920044-3, 바이오-월드(Bio-world)) 중 Raji 세포 (3x104개 세포, Cat # CCL-86, ATCC)를 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트 (Cat # 650180, 그라이너 바이오-원(Greiner bio-one))에서 CD20을 표적화하는 일련의 농도의 정제된 항체 (0.0013-20 μg/mL 최종 농도; 5-배 희석)와 함께 50 μL의 총 부피로 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 150 μL FACS 완충제의 첨가에 의해 2회 세척하고, 이어서 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 결합된 항체를 50 μL의 염소 F(ab')2 항-인간 카파-PE (최종 농도 2.5 μg/mL, Cat # 2062-09, 서던 바이오테크(Southern Biotech))를 30분 동안 4℃에서 첨가하여 염색하였다. 후속적으로, 세포를 150 μL FACS 완충제의 첨가에 의해 2회 세척하고, 이어서 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 인간 CD20에 대한 항체 변이체의 결합을 인텔리사이트 아이큐 스크리너(Intellicyt iQue screener) (사르토리우스(Sartorius)) 상에서 유동 세포측정법에 의해 중앙 형광 강도를 측정함으로써 검출하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하였다. 데이터는 4회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체의 표적 결합의 평가는 중쇄 불변 영역에 돌연변이를 보유하는 모든 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 대한 유사한 표적 결합을 밝혀내었다 (도 1a-b). 중쇄 불변 영역에 S228P-F234A-L235A 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 비-활성화 돌연변이를 보유하는 것을 포함한 모든 항-인간 CD20 IgG4 항체 변이체는 IgG1 항체 변이체와 비교하여 다소 감소된 표적 결합을 나타내었다.
요약하면, 항-인간 CD20 IgG1- 및 IgG4 항체의 중쇄에서의 비-활성화 돌연변이의 도입은 그의 표적 CD20에 결합하는 그의 능력에 영향을 미치지 않았다.
실시예 3: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 보체-의존성 세포독성
치료 효과가 면역계의 이펙터 분자 (예컨대 보체 단백질 C1q 및 Fcγ 수용체)와의 상호작용에 비의존적이고 유해 효과 또는 용량-제한 독성이 이러한 상호작용에 고도로 의존적인 치료 모노클로날 항체에 대해, 비-활성화 Fc 도메인은 치료 범위를 증가시키는 것으로 간주될 수 있다. 항체와 C1q 단백질의 결속은 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 이어지는 전형적 보체 경로를 개시한다. 여기서는, CDC를 유도하는 능력을 CDC의 효율적이고 강력한 유도를 위해 선택된 유형 I 항-인간 CD20 항체 (Glennie et al., Mol Immunology, 2007, Sep;44(16):3823-37), 뿐만 아니라 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이러한 항체의 변이체에 대해 평가하였다.
야생형으로서 또는 K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 또는 L234F-L235E-D265A-K409R, L234F-L235E-G236R-K409R, L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R, N297G-K409R, L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체, 뿐만 아니라 야생형으로서, 돌연변이 S228P를 보유하는 항-인간 CD20 IgG4 항체 및 S228P-F234A-L235A, 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 돌연변이를 보유하는 비-활성화 변이체를, 보체의 공급원으로서 20% 정상 인간 혈청 (NHS, Cat # M0008, 산퀸(Sanquin))을 사용하여 Raji 세포에 대한 시험관내 CDC 검정에서 다양한 농도 (0.0024-10 μg/mL 최종 농도; 4-배 희석)에서 시험하였다. 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA, Cat # 10735086001, 머크) 및 페니실린-스트렙토마이신 (Pen/Strep, 최종 농도 50 단위/mL 칼륨 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트, Cat # DE17-603E, 론자)을 함유하는 RPMI-1640 배지 (Cat # BE12-115F, 론자) 중 Raji 세포 (웰당 3x104개 세포)를 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트 (Cat # 650180, 그라이너 바이오-원)에서 CD20을 표적화하는 일련의 농도의 정제된 항체와 함께 80 μL의 총 부피로 15분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 20 μL NHS (최종 농도 20% (v/v))를 첨가하고, 세포를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 얼음 상에 위치시켜 반응을 정지시킨 후, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 상청액을 PBS (Cat # SH3A3830.03, 지이 헬스케어) 중 2 μg/mL 아이오딘화프로피듐 (PI, Cat # P4170, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 30 μL로 대체하였다. PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포 용해의 백분율에 상응하는 PI-양성 세포의 백분율을 (PI-양성 세포의 수 /세포의 총수) x 100%로서 계산하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 IgG1 항체 변이체 (항-인간 CD20 IgG1, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 변이체의 CDC 능력의 평가는 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 도입함으로써 CDC를 제거하는 능력이 2개의 군으로 나뉠 수 있음을 밝혀내었다. K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R, L234A-L235A-P329G, G236R-L328R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K, N297G, 및 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체, 뿐만 아니라 S228P-F234A-L235A, 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG4 항체 변이의 경우, CDC를 유도하는 능력이 제거되었다. 그러나, 야생형 IgG1과 비교하여, 돌연변이 L234F-L235E-D265A-K409R을 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 잔류 CDC가 관찰되었다 (도 2).
결론적으로, 신규 변이체 L234F-L235E-G236R 및 K409R 돌연변이를 갖는 IgG1 항체는 전형적 보체 경로의 활성화의 거의 완전한 부재를 나타내었다. 유사한 효과가 신규 L234F-L235E-G236R 돌연변이만을 갖고 K409R 돌연변이를 갖지 않는 항체에서 관찰되었다. 이는 특히 잔류 CDC가 관찰되는 L234F-L235E-D265A 및 K409R 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체에 비해 유의한 진전을 나타낸다.
실시예 4: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 대한 C1q 결합의 평가
실시예 3에서, CDC를 유도하는 효력은 Fc-매개 이펙터 기능을 억제하는 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의해 강하게 감소된 것으로 나타났다. 여기서는, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 대한 보체 단백질 C1q의 결합을 CD20을 발현하는 Raji 세포를 사용하여 평가하였다.
C1q의 공급원으로서 20% 정상 인간 혈청 (NHS, M0008, 산퀸)을 사용하는 Raji 세포에 대한 C1q 결합 검정을 사용하고, 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체를 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA, Cat # 10735086001, 머크) 및 페니실린-스트렙토마이신 (Pen/Strep, 최종 농도 50 단위/mL 칼륨 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트, Cat # DE17-603E, 론자)을 함유하는 RPMI-1640 배지 (Cat # BE12-115F, 론자) 중 Raji 세포 (웰당 1x105개 세포)를 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트 (Cat # 650180, 그라이너 바이오-원)에서 CD20을 표적화하는 일련의 농도의 정제된 항체와 함께 80 μL의 총 부피로 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NHS의 첨가 시 CDC의 활성화를 방지하기 위해, 플레이트를 얼음 상에 위치시켜 세포를 냉각시켰다. 후속적으로, 20 μL NHS (최종 농도 20% (v/v))를 첨가하고, 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 다음에, 세포를 150 μL FACS 완충제 (1x PBS, Cat # BE17-517Q, 론자; 0.1% 소 혈청 알부민, BSA; 0.02% NaN3, Cat # 41920044-3, 바이오-월드)의 첨가에 의해 2회 세척하고, 이어서 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 결합된 C1q를 50 μL의 폴리클로날 토끼 항-인간 C1q 보체-FITC (최종 농도 20 μg/mL, 다코, Cat # F0254, 애질런트 테크놀로지스)를 30분 동안 4℃에서 첨가하여 염색하였다. 후속적으로, 세포를 150 μL FACS 완충제의 첨가에 의해 2회 세척하고, 이어서 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 항체 변이체에 대한 C1q 결합을 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 중앙 형광 강도-FITC를 측정함으로써 검출하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하였다. 데이터는 단일 실험의 삼중 측정으로부터 수득된 평균 값 (± SD)이다.
항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대한 C1q의 결합의 평가는 K409R 돌연변이를 갖는 항-인간 CD20 IgG1이 표적 Raji 세포 상의 CD20에의 결합 시 보체 단백질 C1q와 효율적으로 결속하는 반면, 항-HIV1 gp120 항체 (IgG1-b12; CD20 비-결합 대조군)는 C1q와 결속하지 않았음을 밝혀내었다. L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입은 C1q 결합을 극적으로 감소시켰다 (도 3). C1q의 결합은 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체와 비교하여 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 보다 강하게 감소된다. 이는 실시예 3에 제시된 바와 같이, 이들 비-활성화 돌연변이의 CDC의 활성화에 대한 효과와 일치한다.
결론적으로, L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 비-활성화 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 CDC의 관찰된 감소와 일치하게 강하게 감소된 C1q 결합을 보여준다.
실시예 5: 항-인간 HLA-DR 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 보체-의존성 세포독성
실시예 3에서, 불변 중쇄에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 전형적 보체 경로의 활성화를 시험관내 CDC 검정을 사용하여 평가하였다. 실시예 3에서의 데이터는 신규 L234F-L235E-G236R 및 K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체가 전형적 보체 경로의 활성화를 방지하였음을 밝혀내었다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 IgG1 백본과 함께 사용될 때 CDC의 강력한 유도제인 인간 HLA-DR을 표적화하는 2가지의 항체를 사용하여 비-활성화 항체 변이체의 CDC 능력을 추가로 평가하였다.
시험관내 CDC 검정을, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이, 보체의 공급원으로서 20% NHS를 사용하여 Raji 세포에 대해 수행하였다. 간략하게, 불변 중쇄 영역에 K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 HLA-DR 항체 IgG1-HLA-DR-4 및 IgG1-HLA-DR-1D09C3, 또는 K409R과 조합된 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R을 보유하는 그의 변이체, 뿐만 아니라 HLA-DR-표적화 F(ab')2 단편을 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. 세포 용해에 대한 척도로서 PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1 항체 변이체에 대해 측정된 AUC 값 (100%)에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 5회 (야생형 및 L234F-L235E-D265A-K409R 변이체) 또는 2회 (L234F-L235E-G236R-K409R 변이체, 또는 F(ab')2 단편)의 독립적 실험에 기초한다.
항-인간 HLA-DR 항체 변이체의 CDC 능력의 평가는 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 항체 변이체가 Raji 세포의 CDC를 유도하는 능력을 유지하였음을 밝혀내었다 (도 4a, b). 그러나, IgG1-HLA-DR-4-K409R 및 IgG1-HLA-DR-1D09C3-K409R 항체 변이체에서의 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이의 도입은 CDC를 유도하는 효력을 극적으로 감소시켰다. 또한, IgG1-HLA-DR-1D09C3에 대해 관찰된 바와 같이, L234F-L235E-G236R-K409R 항체 변이체에 의한 CDC를 유도하는 효력은 Fc 영역이 결여되고 따라서 보체 단백질 C1q와 상호작용하지 않는 HLA-DR-표적화 F(ab')2 단편에 의해 유도되는 CDC와 동일한 수준이다 (도 4b).
요약하면, L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는 CDC를 인간 보체계와 결속할 수 없는 F(ab')2 단편에 의해 유도된 CDC와 유사한 수준으로 효율적으로 감소시켰다.
실시예 6: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합
언급된 바와 같이, 치료 효과가 면역계의 이펙터 분자 (예컨대 보체 단백질 C1q 및 Fcγ 수용체)와의 상호작용에 비의존적이고 유해 효과 또는 용량-제한 독성이 이러한 상호작용에 고도로 의존적인 치료 모노클로날 항체에 대해, 비-활성화 Fc 도메인은 치료 범위를 증가시키는 것으로 간주될 수 있다. 실시예 3-5의 데이터는 항체의 불변 중쇄 영역 내의 비-활성화 돌연변이의 도입이 보체 단백질 C1q와 결속하는 능력을 감소시키고 CDC의 유도를 감소시켰음을 보여주었다. 여기서, 본 발명자들은 IgG1 또는 IgG4 항-인간 CD20 항체 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 항체 변이체의 인간 FcγRIa (서열식별번호: 15)의 단량체 세포외 도메인 (ECD), 또는 인간 FcγRIIa 동종이형 131H (서열식별번호: 16), 인간 FcγRIIa 동종이형 131R (서열식별번호: 17), 인간 FcγRIIb (서열식별번호: 18), 인간 FcγRIIIa 동종이형 158F (서열식별번호: 19), 및 인간 FcγRIIIa 동종이형 158V (서열식별번호: 20)의 이량체 ECD에 대한 결합을 ELISA 검정에서 평가하였다.
이를 위해, 항-인간 CD20 항체 IgG1 야생형, IgG1-K409R, L234F-L235E-D265A-K409R, L234F-L235E-G236R-K409R, L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R, N297G-K409R, L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체, 뿐만 아니라 IgG4 야생형, IgG4-S228P, 및 S228P-F234A-L235A 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 돌연변이를 보유하는 비-활성화 변이체를 인간 Fcγ 수용체에의 결합에 대해 다양한 농도 (0.0013-20 μg/mL, 5-배 희석 단계)에서 시험하였다. 단량체 및 이량체 FcγR 변이체에 대한 결합을 검출하기 위해, 96-웰 마이크로론(Microlon) ELISA 플레이트 (그라이너(Greiner), 독일)를 PBS 중 1μg/mL 염소-F(ab')2-항-인간-IgG-F(ab')2 (잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory), Cat # 109-006-097)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 후속적으로 세척하고, 0.2% BSA가 보충된 PBS (PBS/0.2% BSA) 200μL/웰로 1시간 동안 실온 (RT)에서 차단하였다. 인큐베이션 사이에 세척하면서 (0.05% 트윈 20 (Cat # P1379, 시그마)이 보충된 PBS; PBST; 플러스 0.2% BSA; PBST/0.2% BSA), 플레이트를 PBST/0.2% BSA 중 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체의 일련의 희석물 100 μl/웰과 함께 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST/0.2% BSA 중 단량체 또는 이량체, His-태그부착된, C-말단 비오티닐화 FcγR ECD 변이체 (1 μg/mL) 100 μL/웰과 함께 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 상기 기재된 바와 같이 세척한 후, 플레이트를 검출 항체로서 PBST/0.2% BSA 중 100 μL/웰 스트렙타비딘-폴리HRP (CLB, Cat # M2032, 1:10.000)와 함께 진탕하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1 mg/mL ABTS (Cat # 11112422001 및 11112597001, 로슈(Roche))를 사용한 발색을 약 10분 (Ia), 15분 (IIa-131H, IIa-131R, IIIa-158V, IIIa-158F), 또는 30분 (IIb) 동안 수행하였다. 후속적으로, 100 μL/웰의 2% 옥살산 (리델 드 하엔(Riedel de Haen), Cat # 33506)을 사용하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍(BioTek), 버몬트주 위누스키)를 사용하여, 흡광도를 405 nm에서 측정하였다.
항체 변이체의 고정화를 측정하고, 도입된 비-활성화 돌연변이가 ELISA 플레이트에의 포획에 영향을 미치는지 평가하기 위해, 96-웰 마이크로론 ELISA 플레이트 (Cat # 655092, 그라이너)를 PBS 중 1 μg/mL 염소-F(ab')2-항-인간-IgG-F(ab')2 (Cat # 109-006-097, 잭슨 래보러토리)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 후속적으로, ELISA 플레이트를 세척하고, 0.2% BSA가 보충된 PBS (PBS/0.2% BSA) 200 μL/웰로 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 상이한 인큐베이션 단계 사이에 세척하면서 (0.05% 트윈 20이 보충된 PBS (PBST) 플러스 0.2% BSA; PBST/0.2% BSA), 플레이트를 PBST/0.2% BSA 중 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체의 일련의 희석물 100 μl/웰 (0.0013-20 μg/mL, 5-배 희석 단계)과 함께 진탕하면서 실온에서 1시간 동안, 및 검출 항체로서 PBST/0.2% BSA 중 HRP-표지된 염소-항-인간-IgG-Fcγ (Cat # 109-035-098, 잭슨 래보러토리; 1:10,000) 100 μL/웰과 함께 진탕하면서 실온에서 30분 동안 순차적으로 인큐베이션하였다. 1 mg/mL ABTS (Cat # 11112422001 및 11112597001, 로슈)를 사용한 발색을 약 5분 동안 수행하고, 후속적으로 100 μL/웰의 2% 옥살산을 사용하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 흡광도를 405 nm에서 측정하였다.
데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 ELISA 배경 신호 (항체 부재 대조군)를 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1 항체 변이체에 대해 측정된 AUC 값 (항-인간 CD20 IgG1, 100%)에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 반복을 기초로 한다.
모든 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체를 유사한 방식으로 ELISA 플레이트에 고정시켰으며, IgG4 백본을 갖는 항체 변이체에 대해 약한 감소가 관찰되었다 (도 5). 따라서, 항-인간 CD20 IgG1- 및 IgG4 항체 변이체의 중쇄 영역에서의 비-활성화 돌연변이의 도입은 항-인간-IgG-F(ab')2 단편에 의한 고정화에 영향을 미치지 않는 것으로 결론지어졌다. ELISA에 의한 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa에 대한 항-인간 CD20 IgG1 변이체의 결합의 평가는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 모든 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체가 Fcγ 수용체와 상호작용하지 않음을 밝혀내었다 (도 6a-f). 또한, FcγRIIa-131R에 대한 잔류 결합을 나타낸 S228P-E233P-F234V-L235A-delG236 돌연변이를 보유하는 IgG4 항체 변이체를 제외하고, 비-활성화 IgG4 변이체는 또한 Fcγ 수용체와 상호작용하는 데 실패하였다 (도 6c).
요약하면, L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체는 이전에 기재된 비-활성화 Fc 변이체, 예컨대 L234F-L235E-D265A 및 L234A-L235A-P329G와 유사하게 FcγR 결합을 나타내지 않았다.
실시예 7: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 Fcγ 수용체를 통한 활성화 및 신호전달
실시예 6에서, 항-인간 CD20 IgG1 또는 IgG4 항체 및 불변 중쇄에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa에 대한 결합을 연구하였다. 시험된 모든 비-활성화 항체 변이체는 FcγRIIa-131R에 대한 잔류 결합을 나타낸 S228P-E233P-F234V-L235A-delG236 돌연변이를 보유하는 IgG4 항체 변이체를 제외하고, 시험된 FcγR에 대한 결합을 나타내지 않았다. 그러나, ELISA 결합 검정에서는 직접 결합에 대한 효과만이 평가된다. 이펙터 세포에 대한 Fc-수용체의 항원-결합, 표적-매개 항체 클러스터링 및 후속 표적-매개 클러스터링의 효과는 부재한다. 여기서, 본 발명자들은 실시예 6에 언급된 바와 같이 항-인간 CD20 IgG1 또는 IgG4 항체의 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 도입하는 것이 표적-발현 Raji 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주를 사용하는 프로메가 리포터 검정에서 FcγR 활성화 및 신호전달에 영향을 미치는지 연구하였다.
상기 언급된 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 변이체에 의한 FcγR-매개 신호전달의 활성화를 리포터 생물검정 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C08; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G9991; FcγRIIa 동종이형 131R: Cat # CS1781B08; FcγRIIb: Cat # CS1781E04; FcγRIIIa 동종이형 158F: Cat # G9790; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G7010)을 사용하여 표적 세포로서 CD20-발현 Raji 세포를 사용하여 정량화하였다. 이펙터 세포로서, 리포터 세포 키트는 표시된 FcγR 및 반딧불이 루시페라제의 발현을 구동하는 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT)-반응 요소를 안정하게 발현하도록 조작된 Jurkat 인간 T 세포를 함유한다. 검정은 제조업체의 권장사항에 따라 수행한다. 간략하게, Raji 세포 (5,000개 세포/웰)를 384-웰 백색 옵티플레이트 (퍼킨 엘머, Cat # 6007290)에서 12% 낮은 IgG 혈청 (프로메가, Cat # G711A)으로 보충된 검정 완충제 (프로메가, Cat # G719A) 중에 시딩하고, 항체 농도 시리즈 (FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa, 0.001-15 μg/mL 최종 농도, 5-배 희석; FcγRIa, 0.00000006-15 μg/mL 최종 농도, 25-배 희석) 및 해동된 프로메가 생물검정 이펙터 세포 (30,000개 세포/웰)를 함유하는 총 부피 30 μL로 37℃/5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 플레이트를 실온 (RT)에서 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 30 μL 바이오 글로 검정 루시페라제 시약을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 루시페라제 생산을 엔비전 다중표지 판독기 (퍼킨 엘머) 상에서 발광 판독에 의해 정량화하였다. 배지-단독 (Raji 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음) 샘플로부터 결정된 배경 발광 신호를 사용하여 발광 신호를 정규화하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군 (오직 Raji 세포 및 이펙터 세포)을 사용하여 계산하였다. 실험당, AUC 값을 비-결합 대조군 IgG1-b12와 함께 인큐베이션한 세포에 대해 관찰된 리포터 활성 (0%) 및 야생형 항-인간 CD20 IgG1의 활성 (100%)에 대해 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 반복을 기초로 한다.
프로메가 리포터 검정을 사용한 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb- 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 평가는 IgG1의 중쇄 불변 영역에의 K409R 돌연변이와 조합된 L234F-L235E-G236R의 도입이 항-인간 CD20 IgG1 비-활성화 변이체 L234F-L235E-D265A-K409R, L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R 및 E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R과 유사하게 FcγR-매개 활성화를 방지하였음을 밝혀내었다 (도 7a-f). N297G 및 K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 FcγRIa를 통해 매개되는 부분적 활성화 (도 7a), 및 S228P-F234A-L235A 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 돌연변이를 보유하는 IgG4 항체 변이체에 의한, 및 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 부분적 FcγRIIa- 및 FcγRIIb-매개되는 활성화 (도 7b-d)를 제외하고, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 다른 IgG1- 또는 IgG4 항체 변이체에 대해서도 FcγR-매개 활성화의 부재가 또한 관찰되었다. 대조군으로서, 항체 변이체 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD20 IgG1-K409R은 시험된 모든 FcγR의 활성화를 유도한 한편, 항체 변이체 IgG4 및 IgG4-S228P는 FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIa-매개 활성화를 유도하였지만 FcγRIIIa-매개 활성화는 결여되었다 (도 7a-f).
여러 변이체, 즉 N297G-K409R 또는 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이를 보유하는 IgG1 변이체, 및 S228P-F234A-L235A 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 돌연변이를 보유하는 IgG4 항체 변이체에 대해, Fcγ 수용체 중 1종 이상에 대해 부분적 FcγR-매개 활성화가 관찰된 반면, 유리하게는 K409R 돌연변이에 더하여 중쇄 불변 영역에 신규 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체에 의한 FcγR-매개 활성화를 유도하는 능력은 효율적으로 제거되었다.
실시예 8: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 신생아 Fc 수용체에 대한 결합
신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 IgG를 분해로부터 보호함으로써 IgG의 긴 혈장 반감기를 담당한다. 항체의 내재화 시, FcRn은 엔도솜에서 항체 Fc 영역과 결속하고, 여기서 상호작용은 약산성 환경 (pH 6.0)에서 안정하다. 환경이 중성 (pH 7.4)인 원형질막으로 재순환 시, 상호작용은 파괴되고, 항체는 순환계로 다시 방출된다. 이는 IgG의 혈장 반감기에 영향을 미친다. 여기서는, ELISA를 수행하여 실시예 6 및 7에 언급된 바와 같은 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG4 항체 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 함유하는 그의 변이체의 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하였다.
스트렙타웰 96 웰 플레이트 (로슈, Cat # 1734776001)를 0.05% 트윈 20으로 보충된 PBS (PBST) 플러스 0.2% BSA 중에 희석된, 베타2마이크로글로불린 (B2M; 서열식별번호: 22)과의 이량체로서 C-말단 His 태그를 갖는 인간 FcRn의 세포외 도메인 (FcRnECDHis; 서열식별번호: 21), 즉 재조합적으로 생산된 인간 FcRn의 비오티닐화된 세포외 도메인 (FcRnECDHis-B2M-BIO) 5 μg/mL (100 μL/웰)로 실온 (RT)에서 진탕하면서 2시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 후속적으로 PBST로 3회 세척하였다. 연속 희석된 항체 샘플 (PBST/0.2% BSA, pH 6.0 또는 pH 7.4 중 5-배 희석된 0.0013-20 μg/mL 최종 농도)을 첨가하고, 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST/0.2% BSA, pH 6.0 또는 pH 7.4로 세척하였다. PBST/0.2% BSA, pH 6.0 또는 pH 7.4 중에 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 폴리클로날 염소-항-인간 카파 경쇄 (1:5,000; 시그마, Cat # A-7164)를 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST/0.2% BSA, pH 6.0 또는 pH 7.4로 세척한 후, 100 μL 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산 (ABTS; 1 mg/mL; 로슈, Cat # 11112422001 및 11112597001)을 기질로서 첨가하고, 플레이트를 광으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL 2% 옥살산 (리델 드 하엔, Cat # 33506)을 사용하여 반응을 정지시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키)를 사용하여, 흡광도를 405 nm에서 판독하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 ELISA 배경 신호 (항체 부재 대조군)를 사용하여 계산하였다. 데이터는 3회의 독립적 반복을 기초로 한다.
FcRn 결합 ELISA 검정은 항-인간 CD20 IgG1 또는 IgG4 항체의 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 도입하는 것이 pH 6.0에서 FcRn 결합을 억제하지 않았음을 보여주었다. 반대로, pH 7.4에서, 항-인간 CD20 항체 IgG1 및 IgG4 야생형을 비롯한 모든 시험된 IgG1 또는 IgG4 항체 변이체는 인간 FcRn에 대해 어떠한 결합도 나타내지 않았다.
종합하면, 이들 결과는, 시험된 다른 변이체와 유사하게, 신규 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 IgG1 변이체가 야생형 IgG1 항체와 유사한 FcRn 결합 특성을 유지하였음을 보여준다.
실시예 9: 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 항체-의존성 세포성 세포독성의 유도
비-활성화 항-인간 CD20 항체에 대한 FcγR 결합 및 그에 의한 활성화 및 신호전달을 각각 실시예 6 및 7에서 평가하였다. 자연 킬러 (NK) 세포-매개 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)은 FcγRIIIa와의 결속에 의존적이다. 여기서는, 항-인간 CD20 IgG1 야생형, IgG1-K409R, L234F-L235E-D265A-K409R, L234F-L235E-G236R-K409R, L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R, N297G-K409R, L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체, 뿐만 아니라 IgG4 야생형, IgG4-S228P, 및 S228P-F234A-L235A, 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 돌연변이를 보유하는 비-활성화 변이체에 의한 ADCC를 유도하는 능력을 퍼킨 엘머 델피아® EuTDA TRF (시간-분해 형광) 세포독성 검정을 사용하여 NK 세포에 대한 공급원으로서 CD20-발현 Raji 세포 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 평가하였다.
백혈구 연층 (산퀸 혈액 은행(Sanquin Blood Bank))을 건강한 지원자로부터 채취한 전혈로부터 수득하고, 응고 활성화를 방지하기 위해 시트레이트 포스페이트 덱스트로스 (20% 최종 농도 (v/v))로 항응고시키고, 포스페이트-완충 염수 용액 (PBS, Cat # SH3A3830.03, 지이 헬스케어) 중에 3.6-배 희석하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 PBS-희석된 백혈구 연층으로부터 림프구 분리 배지 (Cat # 25-072-Cl, 코닝(Corning))를 함유하는 류코셉(Leucosep)™ 튜브 (Cat # 227290, 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One))를 사용하여, 제조업체의 지침서에 기재된 바와 같이 일부 변형하여 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 간략하게, 3으로 설정된 원심분리기의 브레이크를 사용하여 실온 (RT)에서 800 x g로 20분 동안 원심분리에 의해 밀도 구배 원심분리를 수행하였다. 풍부화된 세포 분획을 후속적으로 50 mL의 PBS로 3회 세척한 후, 300 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 단리된 PBMC를 배양 배지 (2mM L-글루타민 및 25 mM Hepes를 갖는 RPMI-1640, Cat # BE12-115F, 론자; 철과 함께 10% 공여자 소 혈청으로 보충됨, DBSI, Cat # 20371, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 중에 재현탁시켰다. 항-CD20 야생형 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 ADCC 능력을 결정하기 위해, 델피아® EuTDA TRF (시간-분해 형광) 세포독성 키트 (Cat # AD0116, 퍼킨 엘머)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 2개의 별개의 실험 세트를 수행하였다.
제1 실험 세트의 경우, Raji 세포를 배양 배지 중에 1x106개 세포/mL의 농도로 재현탁시키고, 0.16% (v/v) 비스(아세톡시메틸)2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실레이트 시약 용액 (델피아 BATDA 시약, Cat # C136-100, 퍼킨 엘머)으로 37℃의 수조에서 20분 동안 표지하였다. 소수성 바트다 표지는 세포막을 자유롭게 통과할 수 있고, 더 이상 세포막을 통과하지 못하는 친수성 TDA 표지 (2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실산)로 세포내 전환된다. 표지된 세포를 후속적으로 배양 배지로 3회 세척하여 과량의 BATDA 시약을 제거하였다. 후속적으로, 세포를 소정의 농도 범위의 야생형 항-CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체 (0.01-10000 ng/mL 최종 농도; 10-배 희석)와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 새로이 단리된 PBMC를 V-바닥 96-웰 플레이트 (Cat # 651101, 그라이너 바이오-원)에서 200 μL의 총 부피로 배양 배지 중 100:1의 E:T 비로 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2가 존재하는 가습 (85%) 공기 분위기에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 0% ADCC를 나타내는 표지된 세포로부터의 자발적 BATDA 방출을 PBMC 및 항체의 부재 하에 결정하고, 100% ADCC를 나타내는 최대 BATDA 방출을 표지된 세포를 델피아® 용해 완충제 (5% 최종 농도 (v/v), Cat # 4005-0010, 퍼킨 엘머)와 함께 인큐베이션함으로써 결정하였다. 2시간 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 회전 침강시키고, 20 μL의 무세포 상청액을 편평 바닥 96-웰 백색 불투명 옵티플레이트 (Cat # 6005290, 퍼킨 엘머)로 옮겼다. 후속적으로, 200 μL의 델피아 유로퓸 용액 (Cat # C135-100, 퍼킨 엘머)을 옮겨 둔 상청액에 첨가하고, 샘플을 암실에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 방출된 TDA 표지로부터 형성된 EuTDA 킬레이트의 형광을 엔비전 멀티라벨 플레이트 리더 (퍼킨 엘머)로 측정하였다. ADCC에 대한 척도로서의 백분율 특이적 방출을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
% 특이적 방출 = ((형광 샘플 - 형광 자발적 방출) / (형광 최대 - 형광 자발적 방출)) x 100%
데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 배경 염색 (항체 부재 대조군)을 사용하여 계산한 후, 비-결합 음성 대조군 IgG1-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 IgG1 항체 변이체 (항-인간 CD20 IgG1, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 4명 (야생형 및 K409R 변이체) 또는 2명 (L234F-L235E-D265A-K409R 및 L234F-L235E-G236R-K409R 변이체)의 독립적인 공여자로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다.
제2 실험 세트를 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행하고 분석하였다. 그러나, 농도 범위 대신, 항-인간 CD20 IgG1 또는 IgG4 항체 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의해 ADCC를 유도하는 능력을 10 ug/mL 최종 항체 농도에서 평가하였다. 데이터를 비-결합 음성 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 IgG1 항체 변이체 (항-인간 CD20 IgG1, 100%)에 대해 실험 반복당 정규화하고, 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 시각화하였다. 데이터는 2회의 독립적 실험으로부터 6명의 공여자로부터 수득된 평균 값 (± SEM)이다.
퍼킨 엘머 델피아® EuTDA TRF 세포독성 키트를 사용한 NK-세포-매개 ADCC의 평가는 야생형 항-인간 CD20 IgG1 또는 K409R 돌연변이를 보유하는 변이체가 CD20-발현 Raji 세포의 ADCC를 효율적으로 유도하였음을 밝혀내었다 (도 8). 대조적으로, FcγRIIIa에 대한 결합 및 그를 통한 활성화 및 신호전달의 부재와 일치하게 (실시예 6 및 7), 항-인간 CD20 야생형 IgG4 항체 또는 S228P 힌지 안정화 돌연변이를 보유하는 변이체는 NK-세포-매개 ADCC를 유도하지 않는다 (도 8b). 비-활성화 항체 변이체에 의한 ADCC를 유도하는 능력의 평가는 항-인간 CD20 IgG1의 중쇄 불변 영역에서의 L234F-L235E-G236R 및 K409R 돌연변이의 도입이 항-인간 CD20 IgG1 비-활성화 변이체 L234F-L235E-D265A-K409R (도 8a, b), 및 항-인간 CD20 IgG1 비-활성화 변이체 L234A-L235A-P329G-K409R, G236R-L328R-K409R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R, N297G-K409R, L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R 돌연변이 (도 8b)와 유사하게 CD20-발현 Raji 세포의 ADCC를 ~69-98%만큼 감소시켰음을 밝혀내었다. 또한, 야생형 IgG4와 유사하게, IgG4 비-활성화 항체 변이체 S228P-F234A-L235A 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del은 또한 ADCC를 유도하는 데 실패하였다 (도 8b).
결론적으로, ADCC를 유도하는 능력은 중쇄 불변 영역에 신규 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체에 의해 효율적으로 제거되었다.
실시예 10: 항-인간 CD3 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 PBMC 배양물에서의 T-세포 활성화
T 세포 상의 CD69의 상향조절을 항-인간 CD3 huCLB-T3/4 IgG1 및 IgG4 항체 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 T 세포의 초기 활성화에 대한 척도로서 FACS 분석에 의해 평가하였다.
PBMC를 실시예 9에 기재된 바와 같은 밀도 구배 분리에 의해 백혈구 연층으로부터 단리하고, PBS로 세척하고, 배양 배지 (2mM L-글루타민 및 25 mM Hepes를 갖는 RPMI-1640, Cat # BE12-115F, 론자; 철과 함께 10% 공여자 소 혈청으로 보충됨, DBSI, Cat # 20371, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 중에 재현탁시켰다. F405L에 더하여 L234F-L235E-D265A, L234F-L235E-G236R, L234A-L235A-P329G, G236R-L328R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K, 또는 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1-F405L 및 그의 비-활성화 변이체의 용량 반응 시리즈, 뿐만 아니라 F405L 및 R409K에 더하여 힌지 안정화 돌연변이 S228P를 갖는 항-인간 CD3 IgG4 또는 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del 또는 S228P-F234A-L235A 돌연변이를 보유하는 비-활성화 변이체를 배양 배지에서 제조하고 (0.001 - 1000 ng/ml 최종 농도, 10-배 희석), 배양 배지 중 PBMC (1.5x105개 세포/웰)를 함유하는 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 16-24시간 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 후속적으로, 세포를 이어서 FACS 완충제 (1x PBS, Cat # BE17-517Q, 론자; 0.1% 소 혈청 알부민, BSA; 0.02% NaN3, Cat # 41920044-3, 바이오-월드)로 세척하고, 30분 동안 4℃에서 마우스-항-인간 CD28-PE (Cat # 130-092-921; 밀테니 바이오텍; T-세포 마커) 및 마우스-항-인간 CD69-APC 항체 (Cat # 340560; 비디 바이오사이언시스)로 염색하였다. FACS 완충제로 2회 세척함으로써 미결합 항체를 제거하고, 후속적으로 세포를 FACS 완충제 (150 μL/웰) 중에 재현탁시키고, PBMC 혼합물에서의 CD28-양성 세포 중 CD69-양성 세포의 백분율을 포르테사 유동 세포측정기 (BD) 상에서 측정하였다. 데이터를 용량 반응 대 CD28+ 세포 중 백분율 CD69+로서 시각화하고, 각각의 실험 반복의 PBMC 공여자당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 배경 염색 (항체 부재 대조군)을 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1 항체 변이체 (IgG1-F405L, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 각각의 공여자에 대해 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 6명의 공여자로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
초기 T-세포 활성화에 대한 척도로서 T 세포 상에서의 CD69 상향조절의 평가는 F405L 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 항체 IgG1이 시험된 다른 변이체, 즉 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A, L234A-L235A-P329G, G236R-L328R, E233P-L234V-L235A-G236del-S267K, 또는 L234A-L235E-G237A-A330S-P331S를 포함하는 항-인간 CD3 IgG1-F405L 변이체, 뿐만 아니라 비-활성화 돌연변이 S228P-E233P-F234V-L235A-G236del을 포함하는 항-인간 CD3 IgG4-F405L-R409K 변이체와 유사하게 PBMC 공동-배양물에서 T 세포 상에서의 CD69의 상향조절을 방지하였음을 보여준다 (도 9a, b). 대조적으로, F405L 돌연변이와 함께 N297G를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체 및 F405L-R409K 돌연변이와 함께 S228P-F234A-L235A를 보유하는 항-인간 CD3 IgG4 항체 변이체는 PBMC 공동-배양물에서 T 세포 상에서의 CD69 상향조절을 방지하는 데 실패하였다.
요약하면, PBMC 공동-배양물에서 CD69 상향조절에 의해 측정된 바와 같은 T 세포의 활성화는 항-인간 CD3 IgG1 유형 항체에서 신규 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이의 도입에 의해 방지될 수 있다.
실시예 11: 비-활성화 항체 변이체에 의해 유도된 시험관내 T-세포-매개 세포독성
실시예 10에서, CD3-표적화 항체의 IgG1 변이체의 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R을 도입하는 것이 T-세포 활성화를 효율적으로 방지할 수 있는 것으로 제시되었다. 여기서는, T-세포-매개 세포독성을 CD3xHER2, CD3xb12, 및 b12xHER2 이중특이적 야생형 IgG1 및 IgG4 항체 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 대해 평가하였다.
이중특이적 분자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제어된 Fab-아암 교환 (cFAE)에 의해 생성하였다. 야생형 이중특이적 항체 CD3xHER2 (항-인간 CD3 (huCLB-T3/4) IgG1 또는 IgG4 및 항-인간 HER2 IgG1 또는 IgG4), CD3xb12 (항-인간 CD3 (huCLB-T3/4) IgG1 또는 IgG4 및 비-결합 대조군 항체 항-HIV1 gp120 (b12) IgG1 또는 IgG4), 또는 b12xHER2 (비-결합 대조군 항체 항-HIV1 gp120 (b12) IgG1 또는 IgG4 및 항-인간 HER2 IgG1 또는 IgG4) 및 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 T-세포-매개 세포독성을 평가하였다. PBMC를 실시예 9에 기재된 바와 같은 밀도 구배 분리에 의해 건강한 공여자로부터 유래된 백혈구 연층으로부터 단리하고, PBS로 세척하고, 배양 배지 (2mM L-글루타민 및 25 mM Hepes를 갖는 RPMI-1640; 철과 함께 10% 공여자 소 혈청 (DBSI)으로 보충됨) 중에 재현탁시켰다. HER2-발현 SK-OV-3 세포 (Cat # HTB-77, ATCC)를 10% (vol/vol) 열 불활성화된 DBSI 및 페니실린-스트렙토마이신 (Pen/Strep, 최종 농도 50 단위/mL 포타슘 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트 (론자, Cat # DE17-603E))으로 보충된 맥코이 5A 배지 (론자, Cat # BE12-168F)에서 배양하고, 5% (vol/vol) CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 유지시켰다. SK-OV-3 세포를 거의 전면생장률로 배양하였다. 세포를 트립신처리하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 후속적으로 세포 스트레이너를 통해 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 2.5x104개 SK-OV-3 세포를 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 인큐베이션하여 플레이트에 부착되도록 하였다. 후속적으로, 1x105개 PBMC를 SK-OV-3 표적 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 4:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비를 생성하였다. 후속적으로, 상기 언급된 바와 같은 이중특이적 CD3xHER2, CD3xb12, 및 b12xHER2 야생형 및 그의 비-활성화 변이체의 용량 반응 시리즈를 배양 배지에서 제조하고 (0.001 - 1000 ng/mL 최종 농도, 10-배 희석), SK-OV-3 세포 및 PBMC를 함유하는 96-웰 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. SK-OV-3 표적 세포와 2 μM 스타우로스포린 (Cat # S6942-200, 시그마)의 인큐베이션을 100% 종양 세포 사멸에 대한 참조로서 사용하였다. 배지 대조군 (SK-OV-3 세포, 항체 없음, PBMC 없음)을 0% 종양 세포 사멸에 대한 참조로서 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 10% 알라마르 블루 (인비트로젠(Invitrogen), Cat # DAL1100)를 함유하는 150 μL 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 590 nm에서 흡광도를 측정하였다 (엔비전, 퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬). 데이터를 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 용량 반응 대 백분율 생존 SK-OV-3 세포로서 시각화하였고, 이는 실험 반복당 각각의 공여자에 대해 계산하였다. 데이터는 3회의 독립적 반복으로부터 6명의 공여자로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 모든 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체는 야생형-유사 기능을 갖는 Fc 영역을 보유하며 따라서 비-활성화 돌연변이가 없는 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체와 대등한 효율로 SK-OV-3 세포의 용량-의존성 세포독성을 유도하였다 (도 10a). 야생형-유사 이중특이적 CD3xb12 항체는 야생형 유사 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체보다 더 적은 정도이지만 SK-OV-3 세포의 비-특이적 사멸을 유도하였다. 대조적으로, L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체는 시험된 다른 비-활성화 이중특이적 CD3xb12 변이체와 유사하게 SK-OV-3 세포의 세포독성을 나타내지 않았으며, 단 N297G 돌연변이를 보유하는 CD3xb12 이중특이적 항체는 시험된 최고 농도에서 SK-OV-3 세포의 부분적 비-특이적 세포독성을 여전히 나타내었다 (도 10b). 이는 이러한 변이체에 대해 실시예 10에서 관찰된 바와 같은 PBMC 배양물에서의 T 세포의 관찰된 활성화 (CD69의 상향조절)와 일치한다. SK-OV-3 세포의 약한 수준의 비-특이적 세포독성이 야생형-유사 이중특이적 b12xHER2 항체 변이체에 대해 관찰되었다. E233P-L234V-L235A-G236del-S267K 돌연변이를 보유하는 이중특이적 b12xHER2 변이체에 의한 잔류 비-특이적 세포독성을 제외하고는 시험된 다른 이중특이적 b12xHER2 항체 변이체에 대해서는 비-특이적 세포독성이 관찰되지 않았다 (도 10c).
전반적으로, 암 항원 및 T-세포를 표적화하는 이중특이적 항체 변이체의 불변 중쇄 영역에의 신규 L234F-L235E-G236R 돌연변이의 도입은 비-특이적 세포독성을 효율적으로 피하고 특이적 T-세포-매개 세포독성을 유도하는 능력을 유지시키는 것을 가능하게 한다.
실시예 12: 비-활성화 항체 변이체의 약동학 (PK) 분석
불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 (huCLB-T3/4) 및 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체의 약동학적 특성을 마우스 연구에서 분석하였다.
본 연구용 마우스를 중앙 실험실 동물 시설 (네덜란드 위트레흐트)에 수용하였다. 모든 마우스를 먹이 및 물을 자유롭게 제공하면서 환기 케이지에서 개별적으로 유지시켰다. 모든 실험은 지침 (2010/63/EU)으로부터 해석된 네덜란드 동물 보호법 (WoD)을 준수하였고, 네덜란드 동물 실험 중앙 위원회 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았다. SCID 마우스 (C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, 엔비고(Envigo))에 군당 3마리의 마우스를 사용하여 500 μg 항체 (야생형 항-인간 CD3 IgG1, F405L 돌연변이를 단독으로 또는 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R과 조합하여 보유하는 그의 변이체, 야생형 항-인간 CD20 IgG1, 및 K409R 돌연변이를 단독으로 또는 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R과 조합하여 보유하는 변이체)를 정맥내로 주사하였다. 혈액 샘플 (50 μL)을 항체 투여 10분, 4시간, 1일, 2일, 8일, 14일 및 21일 후에 안면 정맥으로부터 수집하였다. 혈액을 헤파린을 함유하는 바이알 내로 수집하고, 후속적으로 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 혈장을 항체 농도의 결정까지 -20℃에서 저장하였다.
총 hIgG ELISA에 의해, 특이적 인간 IgG 농도를 결정하였다. 96-웰 마이크로론 ELISA 플레이트 (그라이너, 독일) 상에 2 μg/mL의 농도로 코팅된 항-인간 IgG (Cat # M9105, 로트# 8000260395, 네덜란드 산퀸)를 포획 항체로서 사용하였다. 플레이트를 후속적으로 0.2% BSA로 보충된 PBS로 차단하고, 이어서 샘플을 첨가하고, ELISA 완충제 (0.05% 트윈 20 및 0.2% 소 혈청 알부민으로 보충된 PBS) 중에 연속 희석하고, 플레이트 진탕기 상에서 1시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 플레이트를 염소 항-인간 IgG 이뮤노글로불린 (Cat # 109-035-098, 잭슨)과 함께 인큐베이션하고, 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산; ABTS; 로슈)로 발색시켰다. 2% 옥살산 (리델 드 하엔, Cat # 33506)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 주사에 사용된 각각의 물질을 참조 곡선으로서 사용하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키)에서 405 nm에서 측정하였다.
항-인간 CD20 IgG1 항체 및 K409R, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 그의 변이체의 혈청 IgG 농도 (도 11a)뿐만 아니라 항-인간 CD3 IgG1 항체 및 F405L, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 그의 변이체의 혈청 IgG 농도 (도 11b)는 대등하였다. 마우스에 주사된 모든 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 혈장에서 측정된 IgG 농도는 SCID 마우스에서 야생형 인간 IgG1에 대한 2-구획 모델 약동학에 의해 예측된 농도와 일치하였다. 모든 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 계산된 클리어런스 값은 그의 야생형 대응물과 유사하였다 (도 11c; 주사 후 제21일). 군 사이의 변동은 주로, 배치 사이의 글리코실화에서의 차이에 의해 유발될 수 있고 포맷과 관련되지 않을 수 있는 분포 상에서의 차이를 반영한다. t1/2베타는 모든 돌연변이에 대해 대등한 것으로 보였다.
요약하면, 신규 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 포함한 비-활성화 돌연변이의 도입은 마우스에서 IgG1 항체 변이체의 약동학에 영향을 미치지 않는다.
실시예 13: Fc 영역에 L234F-L235A-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 면역원성 평가
L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체 (IgG1-FER)의 불변 도메인의 임상 면역원성의 위험을 아브제나 아이토프(Abzena's iTope)™ 및 TCED™ 인실리코 기술을 사용하여 평가하였다.
아이토프™ 소프트웨어는 시험 단백질 서열 내의 모든 가능한 9-량체 펩티드의 아미노산 측쇄와 34가지의 인간 MHC 부류 II 대립유전자의 개방-말단 결합 홈 사이의 유리한 상호작용을 예측한다 (Perry et al., 2008, Drugs RD 9(6), pp.385-96). 선택된 대립유전자는 전세계적으로 발견되는 가장 흔한 HLA-DR 대립유전자를 나타내며, 임의의 특정한 민족 집단에서 가장 보편적으로 발견되는 것에 귀속되는 가중치는 없다. 이들 예측을 야생형 인간 IgG1(m)f 참조물에 존재하는 MHC 부류 II 결합 서열과 비교함으로써, 신규 결합 서열을 확인하는 것이 가능하다. ≥50% MHC 부류 II 대립유전자에 중간 정도 및 높은 친화도로 결합하는 것으로 예측된 펩티드는 T-세포 에피토프의 존재와 상관관계가 있는 것으로 생각된다 (Hill et al., 2003, Arthritis Res Ther 5(1), pp.R40-8). TCED™는 다양한 단백질, 주로 항체를 사용하는 생체외 면역원성 연구에 의해 확인된 공지된 T 세포 에피토프의 데이터베이스이다 (Bryson et al., 2010, BioDrugs 24(1), pp.1-8). 데이터베이스는 예측되는 혼재적인 중간 정도 또는 높은 친화도를 갖는 펩티드가 또한 데이터베이스에 존재하는지를 확인하기 위해 BLAST 검색에 의해 조사된다.
각각의 9-량체를 잠재적 '피트' 및 MHC 부류 II 분자와의 상호작용에 기초하여 점수화하였다. 소프트웨어에 의해 계산된 펩티드 점수는 0 내지 1이다. 높은 평균 결합 점수 (아이토프™ 점수화 함수에서 >0.55)를 생성한 펩티드가 강조표시되었고, MHC 부류 II 결합 펩티드 중 ≥50% (즉, 34가지의 대립유전자 중 17가지)가 높은 결합 친화도 (점수 >0.6)를 갖는 경우에, 이러한 펩티드는 CD4+ T 세포 에피토프를 함유할 높은 위험으로 간주되는 '혼재적인 높은 친화도' MHC 부류 II 결합 펩티드로 정의되었다. 혼재적인 중간 정도의 친화도 MHC 부류 II 결합 펩티드는 ≥50% 대립유전자에 결합 점수 >0.55 (그러나 대다수는 >0.6이 아님)로 결합한다. 서열의 추가의 분석을 TCED™를 사용하여 수행하였다. 이들 기준은 34가지의 대립유전자 중 20가지의 개방 p1 포켓이 대형 방향족 잔기의 결합을 허용하는 p1 앵커 위치에서 발생한 대형 방향족 아미노산 (즉, F, W, Y)의 경우에 변경되었다. 이것이 발생하는 경우에, 혼재적인 펩티드는 20가지의 대립유전자의 하위세트 중 10가지 이상에 결합하는 것으로서 정의된다. 서열을 사용하여 BLAST 검색에 의해 TCED™를 조사하여, 이전의 생체외 연구에서 T 세포 반응을 자극한 비관련 단백질/항체로부터의 펩티드 (T-세포 에피토프) 사이의 임의의 높은 서열 상동성을 확인하였다.
아이토프™ 분석은 IgG1-FER에는 존재하고 야생형 IgG1(m)f에는 부재하는 임의의 혼재적인 중간 정도 또는 높은 친화도 MHC 부류 II 결합 서열을 확인하지 못했다. 따라서, 이러한 분석에 기초하면, IgG1-FER을 기초로 하는 항체에 대한 임상 면역원성의 명백한 증가된 위험이 없다.
실시예 14: 비-활성화 항체 변이체의 당-분석
IgG 분자는 CH2 영역에 (IgG1의 경우 위치 N297에) 단일 보존된 Asn (N)-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 이러한 Asn-연결된 글리칸의 코어 구조는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 만노스 잔기로 구성된다. 갈락토스, 시알산, 코어 푸코실화, 및 양분성 GlcNAc를 사용하여 추가의 연장을 수행하여 (Vidarsson et al., 2014, Front. Immunology Oct 20;5:520), N297에서 불균질하게 글리코실화된 IgG1 분자를 생성할 수 있다. 글리칸은 단백질 입체형태, 안정성 및 생물학적 기능에서 중요한 역할을 한다 (Costa et al., Crit Rev Biotechnol 34(4): 281-99 (2014)). 따라서, IgG1 분자에서의 글리코실화 변화는 효능 및 약동학적 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 요구되지 않는다. 또한, 글리칸 불균질성은 제조 동안 분석되고 제어될 필요가 있고, 하전된 글리칸은 방출 시험 또는 특징화에 사용되는 전하-기반 분석 검정, 예컨대 이미지 모세관 등전 포커싱 (iCIEF)의 복잡성을 추가로 증가시킬 수 있다.
본 실시예에서, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체에 대해 N-연결된 글리칸 프로파일링을 수행하였다. 또한, L234F-L235E-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 (huCLB-T3/4) IgG1 항체 또는 D265A 또는 G236R 돌연변이를 추가로 보유하는 그의 변이체에 대해 글리칸 프로파일링을 수행하였다.
IgG1 N-연결된 글리코실화의 평가를 표시된 바와 같은 2가지의 상이한 방법에 의해 수행하였다 (표 2). 항-인간 CD20 IgG1 야생형, L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1, 및 L234F-L235E-F405L 또는 L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체를 2-아미노벤즈아미드 (2-AB) 표지화에 의해 분석하였다. N-연결된 글리칸 프로파일링을 2-AB-표지된 글리칸의 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2695 분리 모듈 (워터스)을 사용하여 정상 HPLC 분석에 의해 수행하였다. N-연결된 글리칸은 펩티드-N-글리코시다제 F (Cat # GKE-5006D, 프로자임(PROzyme))와의 인큐베이션에 의해 항체로부터 방출되었다. 후속적으로, 항체를 에탄올-침전시키고 (빙냉), 제거하였다. 방출된 글리칸을 함유하는 상청액을 진공-건조시켰다. 수득된 글리칸을 가용화하고, 후속적으로 HPLC 분석을 위해 환원성 아미노화에 의해 환원 말단 상에 형광단 2-AB (루드게르태그(LudgerTag) 2-AB 글리칸 라벨링 키트, Cat # LT-KAB-A2, 루드게르) 표지로 표지하였다. 이어서, HPLC 프로파일을 형광 검출과 함께 구배 용리로 수득하였다. HPLC 피크 강도의 적분은 총 올리고사카라이드 집단 대비 개별 N-연결된 글리칸 (예를 들어 G0F, G1F, G2F 등)의 몰 존재비의 백분율에 대한 척도이다. 피크를 외부 글리칸 표준 믹스 (루드게르로부터의 개별 글리칸을 혼합하는 것에 의해 제조됨: NGA2 (=G0, #CN-NGA2-20U), NGA2F (=G0F, #CN-NGA2F-20U), NA2 (=G2, #CN-NA2-20U), NA2F (=G2F, #CN-NA2F-20U), MAN5 (#CN-MAN5-20U), MAN6 (#CN-MAN6-20U), MAN8 (#CN-MAN8-20U), MAN9 (#CN-MAN9-20U), A1 (#CN-A1-20U), A1F (#CN-A1F-20U), A2 (#CN-A2-20U), A2F (#CN-A2F-20U)에 기초하여 할당하였다.
K409R에 더하여 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체 및 F405L에 더하여 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체를 오비트랩 큐-이그잭티브 플러스 질량 분광계 (써모 피셔)를 사용하여 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS) 분석에 의해 분석하였다. N-연결된 글리코실화의 확인 및 상대적 정량화를 환원된 글리코실화된 항체 중쇄에 대해 수행하였다. 중쇄의 공지된 1차 아미노산 서열을 고려하여, 부착된 N-연결된 글리칸의 질량 동일성을 확인할 수 있었다. 간략하게, 항체 샘플을 PBS pH 7.4 (Cat # 3623140, 비. 브라운) 중에 200μg/mL로 50μL의 총 부피로 희석하였다. 다음에, 1μL 1M 디티오트레이톨 (DTT; Cat # D9163, 시그마)을 50μL 샘플에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 샘플을 유리 Qsert 바이알 (Cat # 186001128c, 워터스)로 옮기고, LC-MS에 넣고, 1μL를 LC 칼럼 상에 주입하고, 이동상 A (0.1% 포름산 함유 밀리-큐 물, Cat # 56302-50ml-F, 플루카(Fluka)) - 이동상 B (아세토니트릴 중 0.1% 포름산, Cat # 0001934101BS, 바이오 솔브(Bio Solve)) 구배 23% (B)에서 95% (B)를 사용하여 2분 내에 0.2 mL/분 유량으로 항체를 용리시켰다. 수득된 미가공 m/z 스펙트럼을 단백질 디컨볼루션 4.0 (써모 피셔) 소프트웨어로 디컨볼루션하였다. 그 결과, 디컨볼루션된 스펙트럼은 감소된 글리코실화된 중쇄 질량을 제공하였다. 수득된 피크 강도 (스펙트럼 디컨볼루션 후)는 총 올리고사카라이드 집단 대비 개별 N-연결된 글리칸 (예를 들어 G0F, G1F, G2F 등)의 몰 존재비의 계산된 백분율에 대한 척도이다. 도 12는 검출된 글리칸 종의 개략적 표현을 보여준다.
상이한 올리고사카라이드의 상대 존재비의 지식을 그의 구조에 대한 지식과 커플링시키는 것은 (도 12 참조) A2F 구조 내의 양 대비 갈락토실화 및 하전된 글리칸의 총량의 계산을 가능하게 한다. 여기서 백분율로서 계산된 양은 몰량을 나타내며, 즉 질량이 아닌 분자의 수를 나타낸다. 표 2로부터, 야생형 IgG1 서열이 각각 0-1% 내지 15-25%의 하전된 글리칸의 존재비의 백분율 및 갈락토실화의 백분율을 갖는 것으로 계산된다. 비-활성화 L234F-L235E-D265A 돌연변이의 하전된 글리칸 및 갈락토실화의 백분율은 약 10% 및 약 60%였다.
항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체의 글리코실화의 평가 (표 2)는 K409R 돌연변이와 조합된 비-활성화 L234F-L235E-D265A 돌연변이의 도입이 항-인간 CD20 IgG1 야생형 항체와 비교하여 G1 또는 G2 및 그의 변이체 (G: 갈락토스)로 표시되는 갈락토실화를 증가시켰고, A1 또는 A2 및 그의 변이체 (A: 시알산)로 표시되는 하전된 글리칸의 존재를 증가시켰음을 밝혀내었다. F405L 돌연변이에 더하여 비-활성화 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 유사한 패턴이 관찰되었다. L234F-L235E-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체가 항-인간 CD20 IgG1 야생형 항체와 유사한 글리코실화 패턴을 나타내었기 때문에, 증가된 갈락토실화 및 하전된 글리칸의 존재는 D265A 돌연변이의 존재로 인한 것일 수 있다. 이와 일치하게, 항-인간 CD20 IgG1-K409R 또는 항-인간 CD3 IgG1-F405L에의 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R의 도입은 또한 갈락토실화 증가 및 하전된 글리칸의 존재 증가를 발생시키지 않았다.
요약하면, IgG1 항체의 불변 중쇄 영역에 비-활성화 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 도입하는 것이 갈락토실화의 증가 및 하전된 글리칸의 존재의 증가와 함께 항체 글리코실화 불균질성을 증가시키는 반면, IgG1 항체에 비-활성화 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 도입하는 것은 IgG1의 야생형 불변 영역과 대등한 글리칸 프로파일의 유지를 가능하게 한다.
표 2
1 글리칸 종의 개략적 도면을 도 12에 제시한다.
2 2-AB 표지화에 의해 분석됨. G2, Man6, A2F, Man9는 개별적으로 검출될 수 없고 (적용가능하지 않음, na), 둘 다의 쌍의 합계가 제시된다. G0F-GN, G1F-GN 및 Man7은 본 방법에 의해 평가되지 않았다 (적용가능하지 않음; na).
3 오르비트랩 질량 분광측정법에 의해 분석됨. G2, Man6, A2F, 및 Man9는 개별적으로 검출되었다. 합계: G2/Man6 및 A2F/Man9는 적용가능하지 않다 (na)
표 2는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대한 글리코실화의 분석을 보여준다. 항-인간 CD20 IgG1 야생형 (wt) 또는 L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 갖는 변이체, 뿐만 아니라 L234F-L235E-F405L 또는 L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1을 2-AB 표지화 방법에 의해 분석하였다. 각각 L234F-L235E-G236R-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체의 글리칸 프로파일을 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 평가하였다. 오르비트랩 LC-MS 방법과 대조적으로, 2-AB 표지화 방법은 G2 및 만노스 6뿐만 아니라 A2F 및 만노스 9를 개별적으로 할당할 수 없고 (적용가능하지 않음; na), 따라서 둘 다의 합계가 제시된다. G0F-GN, G1F-GN, 및 Man7은 2-AB 방법으로 평가되지 않았고, 적용가능하지 않은 것으로 언급된다 (na). 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-FER-K409R, IgG1-FEA-K409R, IgG1-FE-F405L, IgG1-FER-F405L, IgG1-FEA-F405L이며, 여기서 FER: L234F-L235A-G236R, FE: L234F-L235E, 및 FEA: L234F-L235E-D265A이다. 검출된 글리칸 종의 개략적 표현을 도 12에 제시한다.
실시예 15: 비-활성화 항체 변이체에 의한 제어된 Fab-아암-교환의 효율
특정 용도, 예컨대 실시예 11에 제시된 바와 같은 표적 세포의 T-세포-매개 세포독성은 하나의 F(ab) 아암이 표적 A와 결속할 수 있고 다른 F(ab) 아암이 표적 B와 결속할 수 있는 이중특이적 항체 (bsAb) 변이체의 생성 및 사용을 필요로 한다.
여기서, 본 발명자들은 효율적인 이종이량체 형성을 위해 요구되는, 단일특이적 항체 중 하나에 각각 존재하는 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 모 단일특이적 항체의 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이의 도입 시, 실시예 1에 기재된 바와 같은 제어된 Fab-아암-교환 (cFAE)에 의해 bsAb 변이체가 생성되는 효율을 평가하였다. 간략하게, 항체를 등몰 농도로 혼합하고, 75 mM 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA; Cat # 30078, 시그마 알드리치)과 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로 PBS에 대한 완충제-교환을 실시예 1에 기재된 바와 같이 달성하고, 나노드롭 ND-2000-EU 분광광도계 (써모 피셔)를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 농도를 측정하였다. 질량 분광측정 분석을 수행하여 오르비트랩 큐-이그잭티브 플러스 질량 분광계 (써모 피셔)를 사용하여 이중특이적 및 잔류 동종이량체 함량을 결정하였다.
cFAE의 효율의 평가는, 단일특이적 항체 중 하나에 각각 존재하는 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R의 도입이 효율적인 cFAE를 발생시켰으며, 집단의 적어도 95%가 IgG1 bsAb (BisG1)이고, 나머지 집단은 하나 또는 둘 다의 단일특이적 항체 (도면에 IgG1-A 및 IgG1-B로서 표시됨; 도 13a)라는 것을 밝혀내었다. 또한, 비-활성화 돌연변이의 비대칭 분포, 즉 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 하나의 단일특이적 항체 변이체에 존재하는 L234F-L235E-G236R, 및 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 다른 단일특이적 항체 변이체에 존재하는 L234F-L235E-D265A로 bsAb 변이체를 생성한 경우의 cFAE의 효율을 평가하였다. 분석은 단일특이적 항체 중 하나에 각각 존재하는 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 bsAb의 둘 다의 아암에 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 제시된 바와 같이 (도 13a), bsAb 변이체를 생성하는 데 있어서 유사한 효율을 밝혀내었다 (도 13b, c).
요약하면, IgG1 불변 중쇄 영역에 신규 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는, 단일특이적 항체 중 하나에 각각 존재하는 F405L 및 K409R 돌연변이를 사용하여 제어된 Fab-아암-교환에 의해 bsAb 변이체를 효율적으로 형성하는 능력을 유지하여, 이종이량체화를 가능하게 하고 단일특이적 동종이량체의 형성을 방지한다.
실시예 16: 비-활성화 항체 변이체의 생산 수준
본 실시예에서, F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 불변 중쇄 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 생산 수준을 평가하였다.
모든 항체 변이체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 Expi293F 세포에서 생산하였다. 하나의 비-활성화 항체 변이체에 대해서는 특정한 클론을 사용하고 다른 것에 대해서는 그렇지 않음으로 인한 생산 역가의 차이를 피하기 위해, 및 불변 중쇄 영역에 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 생산 역가의 직접 비교를 가능하게 하기 위해, 동일한 항체 클론을 각각의 군, 즉 F405L 항체 변이체 또는 K409R 항체 변이체 내에 제시한다.
생산 수준의 분석은 F405L 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 비-활성화 항체 변이체 (흑색 원형)가 F405L 돌연변이에 더하여 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A를 보유하는 항체 변이체 (백색 원형; 도 14)와 유사한 수준으로 생산되었음을 밝혀내었다. K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체 (흑색 사각형)의 생산 수준은 비-활성화 돌연변이에 더하여 F405L 돌연변이를 포함하는 항체 변이체와 유사한 반면, K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항체 변이체 (백색 사각형; 도 14)에 대해서는 평균 생산 수준에서 작은 증가가 관찰되었다.
요약하면, F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 변이체와 비교하여 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 비-활성화 항체 변이체의 생산 수준에서 주요 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 17: PEG 중간점, DLS 및 DSF 분석에 의한 IgG1 비-활성화 항체 변이체의 안정성 및 용해도의 평가
불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-CD20 및 항-CD3 IgG1 항체 변이체의 단백질 안정성 및 용해도 특징을 PEG-유도된 침전 검정, 시차 주사 형광측정법 (DSF) 및 동적 광 산란 (DLS) 검정을 사용하여 평가하였다.
항-인간 CD20 및 항-인간 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 대략 20 mg/mL의 농도로 제제화하였다 (농도 범위 18.7 - 21.6 mg/mL; 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 여과가 적용됨). 단백질 안정성을 보다 잘 비교하도록 PBS를 비-최적 제제로서 사용하였다.
입체형태적 단백질 안정성을 평가하기 위해, 변성된 IgG에 의해 노출된 소수성 영역에 대한 외인성 염료 시프로-오렌지 (DMSO 중 5000x 농축물, Cat # S5692, 시그마-알드리치)의 결합에 의해 유발된 형광 강도에서의 변화를 검출할 수 있는 iQ5 멀티컬러 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오-라드)에서 DSF를 수행하였다. 시프로-오렌지를 PBS (하이클론 지이 헬스케어, Cat # SH3A383.03) pH 7.4 또는 30 mM 아세트산나트륨 pH 4 (Cat # 25022-1KG-R, 시그마-알드리치) 중에 75 mM의 농도로 320-배 희석하였다. 분석되는 IgG의 제어된, 단계적 열 변성 동안 증가하는 형광을 측정하는 것으로부터 열 용융 곡선이 유도될 수 있다. 따라서, 20 μL의 75 mM 시프로-오렌지 (PBS pH 7.4 또는 30 mM 아세트산나트륨 pH 4 중)와 혼합된, K409R 돌연변이, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체, 또는 F405L 돌연변이, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체의 5 μL 샘플 (PBS 중에 희석됨; 농도 범위 1 mg/mL +/- 10%)을 아이사이클러 아이큐(iCycler iQ) 96-웰 PCR 플레이트에서 이중으로 제조하였다. 형광 (여기 485 nm, 방출 575 nm)을 25℃ 내지 95℃ 범위의 증가하는 온도에서, 증분당 0.5℃의 단계적 증분 및 15초 지속기간 플러스 모든 웰의 형광을 기록하는 데 필요한 시간으로 기록하였다. 데이터를 바이오-라드 CFX 매니저 소프트웨어 3.0을 사용하여 분석하고, 소프트웨어에 의해 형광 대 온도 그래프로부터 융점을 결정하였다.
DLS 분석을 수행하여 상기 언급된 항체 변이체가 용액 중에서 응집하는 성향을 콜로이드 안정성의 척도로서 평가하였다. PBS pH 7.4 중 상기 언급된 항체 변이체 (농도 범위 1 mg/mL +/- 10%) 20 μL를 다이나믹스(Dynamics) 7 소프트웨어가 구비된 다이나프로(DynaPro) 플레이트 판독기 II (와이어트 테크놀로지(Wyatt Technology))를 사용하여 분석하였다. 샘플을 둥근 384-웰 IQ-LV 플레이트 (오로라 바이오테크놀로지스(Aurora Biotechnologies), Cat # 1011-00110)에 삼중으로 적용하고, 2,111 xg에서 3분 동안 원심분리하고, 파라핀 오일로 덮었다. 측정 전에, 플레이트를 다시 2,111 xg에서 3분 동안 원심분리하였다. 열 스캔 측정을 실험 전반에 걸쳐 연속적으로 증가하는 온도 (각각의 특정 샘플에 대해 1℃ 증가/데이터 포인트)로 수행하였다. 누적률 피트 절차를 사용하여 데이터를 분석하여, 겉보기 반경을 결정하였다. 소프트웨어 아티펙트에 의해 종종 유발되고 각각의 획득에서 일관되게 관찰되지 않는 보다 낮은 반경을 갖는 피크는 제외하고, 2.1 nm의 컷-오프 값을 사용하였다. 25℃에서 PBS 완충제에 대해 1.333의 굴절률 및 1.019 cP의 점도를 사용하였다 (표준 값은 다이나믹스 소프트웨어에 공급됨). 데이터를 마이크로소프트 엑셀에서 처리하여 응집의 개시를 결정하였다 (Tagg). Tagg는 모든 웰에 대해 반경의 평균 및 표준 편차 (n=10, 처음 10회 측정)를 계산함으로써 결정하였다. 각각의 측정에 대해 개별적으로 99.99%-신뢰 구간을 설정함으로써, 신뢰 구간을 벗어나는 제1 순차적 값 (25℃에서 출발하여 80℃까지)을 Tagg로서 태그부착하였다. 5회 연속 측정을 실험당 삼중으로 수행하였다.
PEG-유도된 침전 검정을 수행하여 상대적 단백질 용해도를 평가하였다. 2종의 완충제를 제조하였다; 완충제 A: 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.0 (일염기성 인산나트륨; 플루카, Cat # 17844 + 이염기성 인산나트륨 2수화물, 플루카 Cat # 71633); 완충제 B: 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.0 + 40% (w/v) PEG 8000 (시그마-알드리치, Cat # P5413). 상이한 양의 완충제 B를 완충제 A와 혼합하여 0% 내지 40% PEG 범위의 일련의 11종의 상이한 PEG 농도를 생성하였다. 각각의 PEG 농도 완충제의 분취물 (80 μL)을 96-웰 플레이트 (UV 스타® 96 웰 플레이트, 절반 면적, 그라이너 바이오-원, Cat # 675801)의 상이한 웰에 첨가하였다. 각각의 항체 샘플 (PBS 중에 1 mg/mL로 희석됨) 중에서, 20 μL를 일련의 PEG-함유 완충제를 함유하는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여 덮고, 750 rpm에서 5분 동안 진탕하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 방치하고, 후속적으로 5분 동안 진탕하였다. 이어서, 플레이트를 20분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여 침전된 항체를 제거하였다. 각각의 웰로부터, 80 μL를 원심분리된 침전물을 방해하지 않으면서 새로운 UV 스타 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮겼다. 280 nm에서의 흡광도 (A280, 가용화된 단백질의 양과 상관됨)를 시너지(Synergy)™ 2 다중-모드 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍 인스트루먼츠(Biotek Instruments), 바이오SPX) 상에서 측정하고, 100 μL의 부피로 재계산하고 (경로 길이 교정), 블랭크 값 (항체가 없는 PEG)을 차감하였다. 교정된 A280 값을 그래프패드 프리즘 8에서 PEG 농도에 대해 플롯팅하였다. 데이터를 비-선형 회귀를 사용하여 분석하였으며, 여기서 PEG 중간점 (%)은 항체의 50%가 침전된 (즉, 0% PEG와 비교하여 A280에서 50% 손실) 시험 샘플의 농도를 반영한다. PEG 중간점은 용해도의 척도로서 사용되며, 보다 높은 PEG 중간점은 보다 우수한 용해도에 상응한다.
상기 기재된 검정의 결과를 표 3, 4에 요약한다. DSF 분석은 pH 7.4에서 68.0℃의 용융 온도 (Tm)를 밝혀내었고, 이는 pH 4.0에서 56.0℃의 Tm1 및 62.0℃의 Tm2로 감소하였다. pH 7.4에서 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-G236R-K409R에 대해 기록된 Tm은 K409R-함유 변이체와 대등하였다 (각각 67.8℃ vs 68.0℃). pH 4.0에서, L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체는 58.0℃에서 1개의 Tm을 입증하였다. 대조적으로, L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 pH 7.4에서 63.3℃의 감소된 Tm1 및 68.5℃의 Tm2를 가졌고, pH 4.0에서는 3개의 Tm, 즉 48.5℃, 57.0℃ 및 61.0℃가 기록되었다. 항-인간 CD3 IgG1 항체의 경우에, F405L 돌연변이 단독 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체는 pH 7.4에서 동일한 Tm (68.0℃) 및 pH 4.0에서 고도로 유사한 Tm1 및 Tm2를 가졌다 (F405L: 53.5 및 70.5℃; L234F-L235E-G236R-F405L: 54.5 및 70.8℃). pH 7.4에서, IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L 항체 변이체의 Tm은 F405L- 및 L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체와 비교하여 감소하였다 (63.0℃). 또한, pH 4.0에서, 변이체 IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L에 대해 기록된 제1 Tm은 다른 IgG1-huCLB-T3/4 변이체와 비교하여 감소되었고 (48.5℃), 다른 IgG1-huCLB-T3/4 변이체와 일치하는 71.0℃의 제2 Tm이 IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L에 대해 관찰되었다.
항-인간 CD20 IgG1-K409R 및 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R 항체 변이체는 최저 응집 온도 (Tagg; 각각 57.9℃ 및 58.5℃)를 나타냈고, 이어서 L234F-L235E-G236R-K409R-함유 변이체가 뒤따랐다 (59.9℃). IgG1-huCLB-T3/4 변이체의 경우, 최저 Tagg는 L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 관찰되었고 (58.7℃), 이어서 F405L-함유 및 L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체가 뒤따랐다 (각각 61.7℃ 및 62.0℃).
K409R 돌연변이, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체는 PEG-유도된 침전 검정을 통해 결정된 바와 같이 대등한 상대 용해도 프로파일을 입증하였다. 전반적으로, 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 항-인간 CD20 IgG1 변이체와 비교하여 더 낮은 상대 용해도를 입증하였다. L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L2345F-L23E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 용해도의 관점에서 대등하였다. 이들 변이체 둘 다는 항-인간 CD3 IgG1-F405L 변이체보다 상대적으로 약간 덜 가용성이었다.
종합하면, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체는 K409R-함유 대조군 변이체와 비교하여 용해도 및 응집 성향의 측면에서 대등한 프로파일을 입증하였다. 그러나, L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체는 K409R-함유 대조군 변이체와 대등한 단백질 안정성 프로파일을 나타내었고, 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R 변이체는 보다 낮은 단백질 안정성 프로파일을 입증하였다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체의 경우, F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체는 응집 및 단백질 안정성 프로파일에 대해 대등한 성향을 나타내었다. 둘 다의 비-활성화 변이체의 용해도는 F405L-함유 대조군 변이체와 비교하여 감소하였다. L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체는 F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체와 비교하여 감소된 단백질 안정성 및 약간 더 높은 응집 성향을 입증하였다. L234F-L235E-D265A-F405L-함유 변이체의 용해도는 L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체와 대등하였다.
결론적으로, PBS 중에서 고농도로 제제화한 경우, L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 변이체는 L234F-L235E-D265A-함유 변이체보다 더 강건한 단백질 안정성 프로파일을 입증하였다. 또한, L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 L234F-L235E-D265A-함유 변이체보다 약간 더 낮은 응집 성향을 나타내었다.
표 3은 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체에 대한, DSF 분석을 통해 결정된 바와 같은 단백질 입체형태적 안정성을 보여준다. DSF: 시차 주사 형광측정법; Tm: 용융 온도.
표 4는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대한, PEG 중간점 결정 검정을 통해 결정된 바와 같은 단백질 용해도 및 DLS 분석을 통해 결정된 바와 같은 응집 성향을 보여준다. Tagg: 응집 온도; PEG: 폴리에틸렌 글리콜; DLS: 동적 광 산란.
표 3
1 시차 주사 형광측정법
2 검정에서의 IgG 농도 ~ 0.2 mg/mL
표 4
1 동적 광 산란
2 검정에서의 IgG 농도 ~ 1 mg/mL
3 폴리에틸렌 글리콜
4 검정에서의 IgG 농도 ~ 0.2 mg/mL
실시예 18: 상이한 온도에서 1 또는 4개월 동안 저장 후 IgG1 비-활성화 항체 변이체의 단백질 안정성에 대한 영향
실시예 17에서, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-CD20 및 항-CD3 IgG1 항체 변이체의 단백질 안정성 및 용해도 프로파일을 평가하였다. 여기서는, 이러한 항체 변이체의 단백질 안정성을 상이한 검정을 사용하여 2-8℃ 또는 40℃에서 1 또는 4개월 동안 저장한 후에 평가하였다.
항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 대략 20 mg/mL의 농도로 제제화하였다 (농도 범위 18.7 - 21.6 mg/mL; 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 여과가 적용됨). 단백질 안정성을 보다 잘 비교하도록 PBS를 비-최적 제제로서 사용하였다. 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 K409R 돌연변이, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 한편, 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체는 F405L 돌연변이, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하였다. 샘플을 2-8℃에서 1개월, 40℃에서 1개월, 2-8℃에서 4개월, 40℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 후속적으로 고성능 크기-배제 크로마토그래피 (HP-SEC), 모세관 등전 포커싱 (cIEF), 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의해 분석하였다.
HP-SEC 분석은 TSK 칼럼 (G3000SWxl; 도소 바이오사이언시스(Tosoh Biosciences), Cat # 6095006) 및 TSK-겔 SWxl 가드 칼럼 (도소 바이오사이언시스, Cat # 6095007)을 사용하여, 워터스 2487 이중 λ 흡광도 검출기 (워터스)가 장착된 워터스 얼라이언스 2795 분리 모듈 (워터스)을 사용하여 수행하였다. 샘플 (PBS pH 7.4 중에 5 mg/mL로 희석됨)을 이동상 0.1 M 황산나트륨 (Na2SO4, 시그마-알드리치, Cat # 31481)/0.1 M 인산나트륨 pH 6.8 (NaH2PO4, 시그마-알드리치 Cat # 17844/Na2HPO4.2H2O, 시그마-알드리치 Cat # 71633)을 사용하여 1 mL/분으로 실행시켰다. 결과를 엠파워(Empower) 3 소프트웨어를 사용하여 처리하고, 총 피크 높이의 백분율로서 피크당 표현하였다.
ICE3 분석기 (프로테인심플(ProteinSimple))를 사용하여 cIEF 분석을 수행하였다. 각각의 항-인간 CD20 IgG1 변이체를 궁극적으로 0.3 mg/mL 항체, 0.35% 메틸 셀룰로스 (프로테인심플, Cat # 101876); 2% 파마라이트 3-10 (지이 헬스케어, Cat # 17-0456-01); 6% 파마라이트 8-10.5 (지이 헬스케어, Cat # 17-0455-01); 0.5% pI 마커 7.65 및 0.5% pI 마커 10.10 (각각 프로테인심플, Cat # 102407 및 Cat # 102232)을 함유하는 검정 믹스와 혼합하였다. 1500 V에서 1분 동안 (사전포커싱) 및 3000 V에서 7분 동안 포커싱을 수행하였다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체를 궁극적으로 0.3 mg/mL 항체, 3.2M 우레아 (시그마-알드리치, Cat #33247-1kg), 0.35% 메틸 셀룰로스; 2% 파마라이트 3-10; 6% 파마라이트 8-10.5; 0.5% pI 마커 7.65 및 0.5% pI 마커 10.10을 함유하는 검정 믹스와 혼합하였다. 1500 V에서 2분 동안 (사전포커싱) 및 3000 V에서 9분 동안 포커싱을 수행하였다. 전체-모세관 흡수 영상을 전하-커플링된 장치 카메라에 의해 캡쳐하였다. 피크 프로파일의 보정 후에, 데이터를 엠파워 3 소프트웨어 (워터스)에 의해 pI 및 면적 (%)에 대해 분석하였다.
거의 변형 없이 HT 단백질 발현 시약 키트 (퍼킨 엘머, Cat # CLS960008)를 사용하여 HT 단백질 발현 랩칩 (퍼킨 엘머, Cat # 760499) 상에서 랩칩® GXII 터치 (퍼킨 엘머, Cat # CLS138160)를 사용하여 CE-SDS를 수행하였다. 샘플을 PBS pH 7.4 중에 1 mg/mL로 희석하고, 샘플을 2 μL 희석된 샘플 + 7 μL 변성 용액 + 35 μL 밀리큐 물에 의해 제조하였다. 샘플을 96-웰 바이오-라드 HSP9601 플레이트 (Cat # 4TI-0960)에서 제조하였다. 분석을 비-환원 및 환원 조건 (DTT의 첨가) 둘 다 하에 수행하였다. 샘플을 70℃에서 3분 동안 인큐베이션하여 변성시켰다. 칩을 제조업체의 지침에 따라 제조하고, 샘플을 HT 항체 분석 200 고감도 설정으로 실행시켰다. 단백질 크기 (kDa) 및 순도 (%)를 랩칩 GXII 소프트웨어 V5.3.2115.0을 사용하여 분석하였다.
동적 광 산란 (DLS)을 본질적으로 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였으나, 여기서는 DLS를 25℃의 일정한 온도에서 수행하여 평균 입자 크기를 결정하였다.
모든 결과를 표 5-7에 요약한다. HP-SEC에 의해 검출된 바와 같이, 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG1-huCLB-T3/4 항체 변이체를 2-8℃에서 4개월 동안 저장하는 것은 1개월 노출과 비교하여 샘플에서 검출된 다량체의 백분율에 상당한 영향을 미치지 않았다. 존재하는 다량체의 백분율은 40℃에 4개월 동안 적용한 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에서 가장 높았고, 40℃에 1개월 동안 적용한 경우는 더 적은 정도였다. 40℃에서의 항-인간 CD20 IgG1 샘플 중에서, L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체의 샘플은 K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체의 샘플보다 더 높은 백분율의 다량체를 함유하였다. 게다가, 항-인간 CD20 IgG1 변이체를 함유하는 샘플 사이에서 분해 백분율의 차이는 관찰되지 않았다. 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체의 경우, L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체의 샘플에서, 샘플을 40℃에 4개월 동안 적용한 후에 다량체의 증진된 백분율이 검출되었고, 40℃에 1개월 동안 적용한 후는 더 적은 정도였고, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 F405L 돌연변이를 보유하는 변이체의 샘플에 대해서는 다량체의 백분율이 대등하였다. 항-인간 CD3 IgG1-L234F-L235E-G236R-F405L 변이체를 40℃에 1개월 동안 노출시켰을 때, 상대적으로 높은 백분율의 단백질이 분해되었고, 노출 4개월 후에 점점 더 분해되었다.
cIEF 분석을 사용하여 상이한 스트레스 조건에 반응한 항체 변이체의 산성, 중성 및 염기성 피크의 백분율에서의 변경을 연구하였다. 샘플에 존재하는 산성 단백질의 백분율에서의 변화는 탈아미드화에 대한 대용물 척도로서 사용된다. 중요한 것으로, 중성 피크는 어느 하나의 온도에서 1개월 동안 저장한 샘플의 경우 2개의 피크로 분할되었고, 이는 중성 단백질의 백분율로서 합산되었다. 산성 단백질의 백분율의 증가가 40℃에서 1 및 4개월 사이로 저장한 모든 샘플에서 관찰된 한편, 2-8℃에서 저장한 샘플의 경우, 1 및 4개월 사이로 저장한 산성 단백질의 백분율의 이러한 증가는 관찰되지 않았다. 산성 단백질의 백분율은 모든 시험된 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 대해 대등하였다. F405L 돌연변이 단독, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 또한 모든 시험된 조건에서 대등한 백분율의 산성 단백질을 나타내었고, 40℃에서 4개월 저장 후 최대 79% 산성 단백질에 도달한 F405L-함유 변이체를 제외하고, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 변이체는 이러한 조건에서 각각 98% 및 96%에 도달하였다.
CE-SDS에 의해 검출된 무손상 단백질의 백분율은 시험된 스트레스 조건에 반응한 단백질 완전성 및 분해에 대한 척도로서의 역할을 하였다. 항-인간 CD20 IgG1 변이체는, 샘플을 2-8℃에서 1 또는 4개월 동안 저장하거나 또는 40℃에서 1개월 동안 저장한 후, 그의 무손상 구조를 대체로 유지하였다. 그러나, 검출된 무손상 IgG의 백분율은 모든 항-인간 CD20 IgG1 변이체의 경우 샘플을 40℃에 4개월 동안 노출시킨 후에 감소되었고, K409R-함유 변이체에 대해 가장 강한 분해가 관찰되었다. HC 및 LC의 백분율을 연구했을 때 유사한 패턴이 관찰되었지만, K409R 돌연변이 또는 L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체가 유사한 백분율의 HC 및 LC를 나타내었음을 제외하면 더 적은 정도였다. 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체는 유사한 분해 패턴을 입증하였고, L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체는 40℃에의 노출 후에 최저 백분율의 무손상 IgG 단백질을 나타내었다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체의 HC 및 LC의 백분율은 전반적으로 유사한 패턴을 나타내었지만, L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 최저 백분율의 HC 및 LC가 검출되었다.
DLS 분석을 수행하여, 표시된 스트레스 조건에 항체 변이체 샘플을 적용한 후, 응집 수준에 대한 대용물 척도인 평균 입자 크기 (반경)를 결정하였다. 모든 항-인간 CD20 IgG1 변이체의 경우, 샘플을 40℃에 4개월 동안 노출시키는 것은 시험된 다른 조건과 비교하여 평균 입자 반경을 실질적으로 증가시켰다. 최고 평균 입자 반경이 모든 시험된 조건에서 K409R 및 L234F-L235E-D265A-K409R 변이체와 비교하여 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 검출되었다. 입자는 L234F-L235E-G236R-K409R-함유 변이체를 함유하는 샘플의 출발 물질에 이미 존재하였다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체의 경우, 상대적으로 큰 평균 입자 크기가 모든 시험된 조건에서 항-인간 CD3 IgG1-F405L 변이체에 대해 검출되었다. 이들 보다 큰 반경의 원인은 아마도 입자가 출발 물질에 이미 존재하였기 때문에 적용된 스트레스 조건과 관련이 없을 것이다. 스트레스 후 평균 입자 크기의 증가는 관찰되지 않았다. 실질적으로 보다 낮은 평균 입자 크기가 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L을 보유하는 변이체에 대해 검출되었다.
요약하면, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 항체 변이체를 40℃에서 1 내지 4개월 동안 인큐베이션하는 것은 2-8℃에서 저장한 변이체와 비교하여 증가된 다량체화를 유발하였다. L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체보다 L234F-L235E-D265A-K409R을 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 더 많은 다량체화가 관찰되었지만, L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1의 변이체는 L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체보다 더 많은 다량체화를 나타내었다. 일반적으로, 2-8℃에서 1 또는 4개월 동안 저장한 경우에 시험된 항체 변이체 중 어떠한 것에 대해서도 탈아미드화된 단백질의 대용물 척도로서 사용된 산성 단백질의 백분율의 증가가 관찰되지 않았다. 40℃에서 1개월 동안 저장한 샘플은 2-8℃에서 저장한 것과 비교하여 상대적으로 더 많은 산성 단백질을 함유하였고, 40℃에서 4개월 동안의 저장 후에 모든 시험된 변이체에 대해 산성 단백질의 백분율의 추가의 증가가 관찰되었다. 40℃에서의 저장 후, 모든 항체 변이체에서 적은 무손상 단백질이 검출되었고, 이는 4개월 저장 후에 가장 현저하였다. 항-인간 CD3 IgG1-L234F-L235E-G236R-F405L 변이체는 40℃에서 4개월 동안 저장 후에 검출된 무손상 단백질의 백분율에서 약간 더 강한 감소를 나타내었다. 최종적으로, 40℃에서 4개월 동안 저장한 경우에 모든 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 보다 많은 응집이 관찰되었다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체 중에서, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 둘 다의 변이체는 F405L-함유 변이체보다 실질적으로 더 적은 응집체를 함유하였다.
L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 변이체 둘 다에 대해 허용되는 안정성 프로파일이 관찰되었다. 40℃에서 4개월 동안의 저장은 모든 시험된 항체 변이체의 보다 낮은 안정성 프로파일을 발생시켰다.
표 5는 2-8℃ 또는 40℃에서 1 또는 4개월 동안 저장한, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이 또는 단일 이종이량체화 촉진 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 HP-SEC 분석을 통해 검출된 바와 같은 다량체, 단량체 및 분해된 단백질의 백분율을 보여준다. HP-SEC: 고성능 크기 배제 크로마토그래피.
표 6은 cIEF 분석에 의해 결정된 바와 같은, 2-8℃ 또는 40℃에서 1 또는 4개월 동안 저장한, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이 또는 단일 이종이량체화 촉진 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에 존재하는 산성, 중성 및 염기성 이소형의 백분율을 보여준다. 샘플에 존재하는 산성 이소형의 백분율 변화는 샘플 탈아미드화의 수준에 대한 대용물이다. CIEF: 모세관 등전 포커싱.
표 7은 2-8℃ 또는 40℃에서 1 또는 4개월 동안 저장한, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이 또는 단일 이종이량체화 촉진 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된, 비-환원 및 환원 CE-SDS 분석에 의해 결정된 바와 같은 무손상 단백질 및 합계 HC 및 LC의 백분율, 및 DLS 분석에 의해 결정된 바와 같은 입자의 평균 반경 (nm)을 보여준다. CE-SDS: 모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트; DLS: 동적 광 산란.
표 5
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
표 6
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
2 중성 피크는 기술적 문제로 인해 분할되었다. 둘 다의 피크의 피크 %를 합하였다.
표 7
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
2 숄더를 갖는 무손상 IgG
3 다중모드: 검출된 다양한 반경을 갖는 여러 집단
m: 개월
c.i.: 복잡한 해석
실시예 19: IgG1 비-활성화 항체 변이체의 안정성에 대한 동결/해동의 영향
불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체의 안정성에 대한 동결/해동 주기의 영향을 실시예 18에 기재된 검정을 사용하여 평가하였다.
항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 대략 20 mg/mL의 농도로 제제화하였다 (농도 범위 18.7 - 21.6 mg/mL; 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대해 여과가 적용됨). 단백질 안정성을 보다 잘 비교하도록 PBS를 비-최적 제제로서 사용하였다. 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 K409R 돌연변이, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 한편, 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체는 F405L 돌연변이, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하였다. 2개의 독립적인 동일한 샘플을 3 주기로 <-65℃에서 동결시키고 실온 (RT)으로 해동시켰다. 후속적으로, 단백질 안정성을 실시예 18에 기재된 바와 같이 HP-SEC, cIEF, CE-SDS 및 DLS를 사용하여 연구하였다.
3 주기의 동결 및 해동 후에, HP-SEC에 의해 결정된 바와 같이 항-인간 CD20 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에서 다량체의 백분율의 증가가 관찰되지만, 샘플에 존재하는 다량체의 백분율은 낮다 (참조 샘플의 경우 0.7% 내지 1.2%, 및 동결-해동된 샘플의 경우 1.8% 내지 2.8%의 범위). 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체의 경우, 0.2% 내지 0.7% 범위의 검출된 다량체의 백분율은 신뢰할 수 있는 결론을 허용하기에는 너무 낮은 것으로 간주되었다.
cIEF 분석에 의해 결정된 바와 같이, 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 항체 변이체를 동결 및 해동시켰을 때 산성 단백질의 백분율에서 실질적인 차이는 검출되지 않았다. 전반적으로, K409R 또는 F405L과 조합된 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 변이체는, 참조 샘플에서도, 아마도 D265A의 시알릴화로 인한 것일, 가장 높은 산성 단백질 백분율을 나타내었다.
항체 변이체 샘플의 동결 및 해동은 또한 IgG1 변이체 중 임의의 것에 대해 무손상 단백질의 백분율에 영향을 미치지 않았으며, 무손상 단백질의 백분율은 99% 내지 100% 범위였다. 유사하게, HC 및 LC의 백분율도 또한 샘플의 동결 및 해동에 의해 영향을 받지 않았다.
DLS 분석에 의해 평가된 바와 같은 평균 입자 크기 (반경)는 샘플의 동결 및 해동에 의해 영향을 받지 않았다. 항-인간 CD20 IgG1 변이체의 상대적으로 더 많은 응집체가 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 검출된 한편, 항-인간 CD3 IgG1 변이체에 대해서는 상대적으로 대부분의 응집체가 F405L-함유 변이체에 대해 검출되었다.
요약하면, K409R 또는 F405L과 조합된 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R을 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플의 동결 및 해동은 참조 샘플과 비교하여 다량체화, 탈아미드화 또는 단백질 분해의 관련 증진을 유발하지 않았다. 따라서, L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는 반복된 동결/해동 주기 시에 단백질 안정성을 유사하게 유지할 수 있는 것으로 결론지어졌다.
표 8은 3회의 동결/해동 주기에 적용된 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 HP-SEC 분석에 의해 검출된 바와 같은 다량체 및 단량체의 백분율을 보여준다. 표시된 값은 3회의 동결/해동 주기에 적용된 2개의 개별 샘플의 평균이다. HP-SEC: 고성능 크기 배제 크로마토그래피.
표 9는 cIEF 분석에 의해 결정된 바와 같은, 1 또는 2회의 동결/해동 주기에 적용된 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플에 존재하는 산성, 중성 및 염기성 이소형의 백분율을 보여준다. 샘플에 존재하는 산성 단백질의 백분율에서의 변화는 탈아미드화에 대한 대용물 척도로서 사용된다. 표시된 값은 3회의 동결/해동 주기에 적용된 2개의 개별 샘플의 평균이다. CIEF: 모세관 등전 포커싱.
표 10은 3회의 동결/해동 주기에 적용된 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된, CE-SDS 분석에 의해 결정된 바와 같은 무손상 단백질 및 합계 HC + LC의 백분율, 및 DLS 분석에 의해 결정된 바와 같은 평균 반경 (nm)을 보여준다. 표시된 값은 3회의 동결/해동 주기에 적용된 2개의 개별 샘플의 평균이다. CE-SDS: 모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트; DLS: 동적 광 산란.
표 8
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
표 9
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
표 10
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
실시예 20: IgG1 비-활성화 항체 변이체의 안정성에 대한 낮은 pH-유도된 스트레스의 영향
실시예 18에서, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체의 저온 또는 고온 저장의 영향을 다양한 단백질 안정성 검정을 사용하여 평가하였다. 동일한 검정을 실시예 19에 적용하여 이러한 IgG1 항체 변이체의 안정성에 대한 동결/해동 주기의 영향을 평가하였다. 여기서는, 항체 치료 개발 동안 바이러스 불활성화가 종종 낮은 pH 조건 하에 수행되기 때문에, 낮은 pH-유도된 스트레스의 영향을 실시예 18에 기재된 검정을 사용하여 평가한다.
항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 (huCLB-T3/4) IgG1 항체 변이체의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 대략 20 mg/mL의 농도로 제제화하였다 (농도 범위 18.7 - 21.6 mg/mL; 항-인간 CD3 항체 변이체에 대해 여과가 적용됨). 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 K409R 돌연변이, L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 한편, 항-인간 IgG1 항체 변이체는 F405L 돌연변이, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하였다. 표시된 항체 변이체를 PBS (참조물) 중에서 제제화하고, 완충제를 0.02 M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.0; 시그마-알드리치, Cat # C1909-500G)로 1시간 동안 (실온에서) 또는 24시간 동안 (2-8℃에서) 교환한 후, 또 다른 완충제를 다시 PBS로 교환하였다. 후속적으로, 단백질 안정성을 실시예 18에 기재된 바와 같이 HP-SEC, cIEF, CE-SDS 및 DLS를 사용하여 연구하였다.
HP-SEC 분석에 의해 결정된 바와 같이, 항-인간 CD20 IgG1 샘플에 존재하는 다량체의 백분율은 L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체의 경우 pH 3.0에서 실질적으로 증가하였지만, K409R- 및 L234F-L235E-G236R-K409R-함유 변이체는 둘 다 다량체의 백분율에서 보다 낮은 증가를 나타내었다. pH 3.0 조건 하에 1시간 또는 24시간 동안 유지시킨 샘플에서 관찰된 다량체의 백분율은 유사하였다. 항-인간 CD3 IgG1 변이체의 경우, L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체를 함유하는 샘플은 둘 다 pH 3.0 (1시간 및 24시간)에서 다량체의 존재의 증가를 나타내었다. 이들 백분율은 F405L-함유 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된 것보다 더 높았다.
cIEF 분석에 의해 생성된 데이터는 1 또는 24시간 동안 pH 3.0에서 인큐베이션한 모든 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 중성 피크의 염기성 측에서의 테일링을 나타내었다. 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L을 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 pH 3.0에서 산성 단백질의 백분율의 증가를 나타내었고, 이는 F405L-함유 변이체에 대해서는 관찰되지 않았다. 참조 샘플 (pH 7.4)과 비교하여 L234F-L235E-D265A-F405L- 및 L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체 둘 다에 대해 pH 3.0에서 산성 단백질의 증가가 관찰되었고, L234F-L235E-D265A-F405L-함유 변이체는, 아마도 D265A의 시알릴화로 인해, L234F-L235E-G236R-F405L-함유 변이체보다 pH 7.4에서 이미 더 높은 백분율의 산성 단백질을 함유하였다. 중요한 것으로, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에서 산성 단백질의 증가된 백분율은, 샘플에서 형성된 응집체의 증가로 인한 것일 수 있는, pH 3.0에서 이들 샘플에서 관찰된 스파이크의 증가를 반영할 수 있다.
CE-SDS 분석은 무손상 IgG1 또는 합계 HC + LC의 백분율에서 PBS 중에 또는 pH 3.0의 완충제 중에 제제화된 샘플 사이의 어떠한 차이도 밝혀내지 않았다. 또한, 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R을 pH 3.0에서 1시간 또는 24시간 동안 유지시켰을 때, DLS 분석을 사용하여 검출된 바와 같이 평균 입자 크기의 증가가 관찰되었다. 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-G236R-K409R 변이체를 함유하는 PBS 참조 샘플 및 항-인간 CD3 IgG1-F405L 변이체를 함유하는 샘플에서의 보다 큰 평균 입자 크기는 완충제 교환 동안 응집체의 제거에 의해 설명될 수 있다. 이들 관찰 이외에도, PBS 단독에서 또는 pH 3.0에서의 인큐베이션 후 PBS에서 제제화된 샘플 사이에 입자 크기의 실질적인 차이는 관찰되지 않았다.
요약하면, 생리학적 pH의 PBS 중에서 제제화된 샘플과 비교하여 샘플을 pH 3.0에서 인큐베이션한 경우에, 불변 중쇄 영역에 F405L 또는 K409R 돌연변이 및/또는 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 또는 CD3 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 다량체의 존재의 증가가 검출되었다. L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체보다 다량체화에서 더 큰 증가를 나타내었다. 염기성 측에서의 중성 피크의 테일링은 pH 3.0에서 모든 시험된 항-인간 CD20 IgG1 변이체에 대해 관찰된 한편, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체 변이체에 대한 결과는 pH 3.0으로 유지시킨 샘플에서 검출된 스파이크로 인해 결론지어지지 않았다. 산성 조건 (pH 3.0)은 단백질 완전성에 영향을 미치지 않았지만, pH 3.0에서의 인큐베이션 후에 항-인간 CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R에 대해 평균 입자 크기의 상대적 증가가 검출되었다.
따라서, 낮은 pH에서 인큐베이션한 경우에, L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체는 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 변이체보다 더 적은 응집을 나타내었다. 이는 L234F-L235E-G236R-함유 항체 변이체가 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화 절차 동안 L234F-L235E-D265A-함유 변이체보다 바람직할 수 있음을 나타낸다.
표 11은 PBS 중에 제제화한, 또는 0.02 M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.0) 중에서 1 또는 24시간 동안 인큐베이션 시, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 CD3 IgG1 (huCLB-T3/4) 항체 변이체를 함유하는 샘플에서의 HP-SEC 분석에 의해 검출된 바와 같은 다량체 및 단량체의 백분율을 보여준다.
표 12는 cIEF 분석에 의해 결정된 바와 같은, PBS 또는 1 또는 24시간 동안 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.0) 중에 제제화한, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-CD3 IgG1(-huCLB-T3/4) 항체 변이체를 함유하는 샘플에 존재하는 산성, 중성 및 염기성 이소형의 백분율을 보여준다.
표 13은 PBS 또는 1 또는 24시간 동안 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.0) 중에 제제화한, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-CD3 IgG1-huCLB-T3/4 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된, CE-SDS 분석에 의해 결정된 바와 같은 무손상 IgG 및 합계 HC + LC의 백분율, 및 DLS 분석에 의해 결정된 바와 같은 평균 입자 반경 (nm)을 보여준다.
표 11
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
표 12
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
2 스파이크의 존재
3 산성 측 상의 추가의 종의 존재
표 13
1 IgG 농도 ~ 20 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
2 다중모드
실시예 21: 낮은 pH에서의 IgG1 비-활성화 항체 변이체의 안정성의 평가
실시예 20에서, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체의 안정성에 대한 낮은 pH의 영향을 다양한 단백질 안정성 검정을 사용하여 평가하였다. 여기서는, 낮은 pH-유도된 스트레스 (pH 3.5)의 영향을 실시예 18에 기재된 검정을 사용하여 실온에서 0.5, 1 및 4시간 후에 평가한다.
항-인간 CD20 및 인간 CD3 (huCLB-T3/4) 항체 변이체의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 대략 5 mg/mL의 농도 (농도 범위 4.98 - 5.3 mg/mL)로 제제화하였다. IgG1-CD20 변이체는 L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 한편, IgG1-CD3 항체 변이체는 L234F-L235E-D265A-F405L 또는 L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하였다. 낮은 pH (3.5) 조건에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해, 항체 변이체를 함유하는 샘플을 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5)로 실온에서 0.5시간, 1시간 및 4시간 동안 완충제-교환한 후, 또 다른 완충제를 다시 PBS로 교환하였다. 실시예 19에 기재된 바와 같이 HP-SEC, CE-SDS 및 DLS를 사용하여 단백질 안정성을 연구하였다.
비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체를 함유하는 샘플에서는, HP-SEC 분석에 의해 결정된 바와 같이 샘플을 pH 3.5에서 인큐베이션한 경우에 0.5시간, 1시간 및 4시간의 시점에 다량체의 백분율의 증가가 관찰되지 않았다. L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체에 대한 다량체의 백분율은 시간에 따라 약간 증가하였다. 검출된 다량체의 백분율은 pH 3.5에서 IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L 변이체를 함유하는 샘플에서 시간에 따라 강하게 증가하였다.
CE-SDS 분석은 샘플을 pH 7.4 (PBS) 또는 pH 3.5에서 인큐베이션한 경우에 시험된 샘플 중 임의의 것에서 무손상 IgG 또는 합계 HC + LC의 백분율의 어떠한 변화도 밝혀내지 않았다. 또한, DLS에 의해 분석된 바와 같이 pH 7.4 또는 pH 3.5에서 유지시킨 샘플 중 임의의 것 사이에서 평균 입자 크기의 실질적인 차이는 검출되지 않았다. IgG1-CD20-L234F-L235E-G236R-K409R의 참조 샘플에 대해 측정된 증진된 입자 크기는 완충제 교환 과정 동안 제거되었고 따라서 pH-스트레스 샘플에서 검출되지 않은 적용된 참조 배치에서의 응집된 입자의 존재에 의해 설명될 수 있다.
요약하면, pH 3.5에 0.5시간, 1시간 또는 4시간 동안 노출시킨 후, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 대해서는 다량체화의 증가가 관찰되지 않았다. L234F-L235E-G236R-F405L 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 변이체는 pH 3.5에서 다량체화의 약간의 증가를 입증하였고, 이러한 증가는 L234F-L235E-D265A-F405L 돌연변이를 보유하는 변이체의 경우 보다 현저하였다. 따라서, 실시예 20에 제시된 데이터와 일치하게, 검정 결과에서의 클론-의존성 차이에도 불구하고, L234F-L235E-G236R-함유 항체 변이체는 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화 절차와 관련하여 L234F-L235E-D265A-함유 변이체에 비해 이점을 가질 수 있는 것으로 확인되었다.
표 14는 PBS 또는 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5) 중에 0.5시간, 1시간 또는 4시간 동안 용해시킨, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 및 항-인간 CD3 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 HP-SEC 분석에 의해 검출된 바와 같은 다량체 및 단량체의 백분율 (모든 샘플에서 분해 < 0.2%) 및 CE-SDS 분석에 의해 결정된 바와 같은 무손상 IgG 및 합계 HC + LC의 백분율을 보여준다.
표 14는 또한 PBS 또는 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5) 중에 0.5시간, 1시간 또는 4시간 동안 용해시킨, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD20 및 IgG1-CD3 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된, DLS 분석에 의해 결정된 바와 같은 평균 입자 반경 (nm 단위)을 보여준다.
표 14
1 IgG 농도 ~ 5 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
2 IgG1-CD20-FERR 참조물에 대한 반경 및 단량체 % 질량에서의 차이는 배치에 존재하는 입자로 인한 것으로, 이는 완충제 교환 절차 동안 제거되었고 따라서 pH 스트레스 샘플에 대해 검출되지 않았다.
실시예 22: 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 IgG1 항체 변이체의 낮은 pH에서의 안정성의 평가
실시예 21에서, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체의 안정성에 대한 낮은 pH-유도된 스트레스 (pH 3.5)의 영향을 0.5, 1시간 및 4시간 후에 평가하였다. 여기서는, 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-CD3/CD20 이중특이적 항체의 안정성에 대한 낮은 pH-유도된 스트레스 (pH 3.5)의 영향을 실시예 18에 기재된 검정을 사용하여 0.5, 1 및 4시간 후에 평가한다.
실시예 1에 기재된 제어된 Fab-아암 교환 절차를 사용하여, 제어된 환원 조건 하에서만 상보적 절반-분자와 절반-분자 이종-이량체화를 촉진하는 K409R 또는 F405L 돌연변이에 더하여, 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 또는 L234F-L235E-G236R을 보유하는 항-인간 CD3 및 항-인간 CD20 IgG1 항체로부터 이중특이적 항체 (bsAb)를 생성하였다. 이는 양쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 또는 양쪽 아암에 L234F-L235E-G236R을 보유하는 bsIgG1-CD3xCD20 항체 (이하 대칭 백본으로 나타냄), 또는 한쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 돌연변이 및 다른쪽 아암에 L234F-L235E-G236R 돌연변이의 조합을 보유하는 이중특이적 항체 (이하 비대칭 백본으로 나타냄)를 발생시켰다. bsIgG1-CD3xCD20 항체 변이체의 샘플을 PBS (pH 7.4) 중에 대략 5 mg/mL의 농도 (농도 범위 3.209 - 5.304 mg/mL)로 제제화하였다. 낮은 pH (3.5) 조건에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해, bsIgG1-CD3xCD20 항체를 함유하는 샘플을 0.02 M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5)로 실온에서 0.5시간, 1시간 및 4시간 동안 완충제-교환한 후, 또 다른 완충제를 다시 PBS로 교환하였다. 후속적으로, 단백질 안정성을 실시예 18에 기재된 바와 같이 HP-SEC, CE-SDS 및 DLS를 사용하여 연구하였다.
HP-SEC 분석은 비-활성화 돌연변이를 보유하는 bsIgG1-CD3xCD20 항체 변이체 중 임의의 것을 pH 3.5에 임의의 시험된 시점 동안 노출시켰을 때 그의 각각의 참조 샘플과 비교하여 다량체화에 대한 주목할 만한 효과를 밝혀내지 못했다. CE-SDS 사용 시에도, 시험된 bsAb 변이체 중 어떠한 것에 대해서도 pH 3.5 노출의 영향이 관찰되지 않았고, 이는 모든 bsAb가 pH 3.5에의 노출 시 무손상으로 유지되었음을 나타낸다. DLS에 의한 평균 크기의 분석은 F405L-함유 아암에 L234F-L235E-D265A 돌연변이를 보유하는 대칭 bsAb 뿐만 아니라 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 비대칭 bsAb의 pH 3.5에 대한 노출이 변경된 수준의 응집을 유도하지 않았음을 보여주었다. K409R-함유 아암에 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 대칭 bsAb 및 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 비대칭 bsAb에 대해 pH 3.5에서 임의의 분석된 시점에 관찰된 평균 크기의 작은 감소는 완충제 교환 과정 동안 응집체의 제거로 인한 것일 수 있다.
요약하면, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 bsAb 변이체는, 대략 5 mg/mL의 농도에서 최대 4시간 동안 낮은 pH 조건에 노출된 후, 그의 무손상 구조를 유지하며, 다량체화에 대해 점점 더 감수성이지 않다. 이들 결과는 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체가 낮은 pH 조건에의 노출 시 동등하게 단량체성을 유지할 수 있었으며, 이는 낮은 pH에서 수행되는 바이러스 불활성화 절차에서의 치료 개발 동안 유리한 특성임을 제시한다.
표 15는 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-인간 CD3 항체로부터 생성된 이중특이적 항체 (bsAb)를 함유하는 샘플에서 검출된, HP-SEC 분석에 의해 검출된 바와 같은 다량체 및 단량체의 백분율, 및 CE-SDS 분석에 의해 결정된 바와 같은 무손상 IgG 및 합계 HC + LC의 백분율을 보여준다. 양쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이, 또는 양쪽 아암에 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이, 또는 한쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 돌연변이 및 다른쪽 아암에 L234F-L235E-G236R 돌연변이의 조합을 보유하는 BsAb를 생성하였다. 항체 변이체를 PBS 또는 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5) 중에 0.5시간, 1시간 또는 4시간 동안 용해시킨 후 분석하였다.
표 16은 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 bsIgG1-CD3xCD20 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 검출된, DLS 분석에 의해 결정된 바와 같은 평균 반경 (nm) 및 단량체 질량의 백분율을 보여준다. 양쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이, 또는 양쪽 아암에 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이, 또는 한쪽 아암에 L234F-L235E-D265A 돌연변이 및 다른쪽 아암에 L234F-L235E-G236R 돌연변이의 조합을 보유하는 BsAb를 생성하였다. 항체 변이체를 PBS 또는 0.02M 시트르산나트륨 완충제 (pH 3.5) 중에 0.5시간, 1시간 또는 4시간 동안 용해시킨 후 분석하였다.
표 15
1 IgG 농도 ~ 5 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
표 16
1 IgG 농도 ~ 5 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건
실시예 23: 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-CD20 및 항-gp120 IgG1 항체 변이체의 낮은 pH에서의 안정성의 평가
실시예 21에서, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 변이체의 안정성에 대한 낮은 pH-유도된 스트레스 (pH 3.5)의 영향을 0.5시간, 1시간 및 4시간 후에 평가하였다. 여기서는, K409R 돌연변이와 조합된, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-gp120 (HIV1) IgG1-b12 항체의 안정성에 대한 낮은 pH-유도된 스트레스 (pH 3.5)의 영향을 실시예 18에 기재된 HP-SEC 검정을 사용하여 0.5, 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후에 평가한다. 낮은 pH 조건 하에서의 다량체화의 정도를 단백질 불안정성의 척도로서 이들 항체 변이체에 대해 분석하였고, 이는 항체 치료 개발 동안 바이러스 불활성화 절차와 관련하여 중요하다.
항-인간 CD20 IgG1 및 IgG1-b12 항체 변이체의 샘플을 PBS 중에 대략 0.5 mg/mL의 농도 (농도 범위 0.435 - 0.5 mg/mL)로 제제화하였다. 항-인간 CD20 IgG1 및 IgG1-b12 변이체는 L234F-L235E-D265A-K409R 또는 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하였다. 낮은 pH (3.5) 조건에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해, PBS 중 항체 변이체를 함유하는 샘플을 2M 아세트산 (플루카(Fluka), Cat # 33209)의 적가에 의해 pH 3.5로 산성화하고, 후속적으로 플레이트 진탕기를 사용하여 실온에서 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 샘플 튜브로부터의 샘플을 2M 트리스-HCl (pH 9.0; 시그마-알드리치, Cat # T6066)을 함유하는 튜브로 옮겨 pH를 7.4로 회복시켰다. 후속적으로, 단백질 안정성을 실시예 18에 기재된 바와 같이 HP-SEC를 사용하여 연구하였다.
HP-SEC 분석은 pH 3.5에서의 인큐베이션에 반응하여 L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체를 함유하는 샘플에서 발생한 다량체화의 급속한 증가를 밝혀내었으며, 이는 2시간 인큐베이션 후에 최고조에 도달하였고 샘플에서 35.2%의 다량체가 검출되었다. 대조적으로, L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 변이체의 pH 3.5에 대한 노출은 시간에 따라 다량체화의 꾸준하고 상대적으로 느린 증가를 유발하였으며, 24시간 인큐베이션 후에 분석된 샘플에서 최대 10.8%의 다량체가 검출되었다.
비-활성화 돌연변이를 보유하는 IgG1-b12 변이체에 대해 고도로 유사한 패턴이 관찰되었다. L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체는 pH 3.5에서의 2시간 인큐베이션 후에 최대 27.6%의 다량체가 검출되어 다량체화의 빠른 증가를 나타냈지만, L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해서는 pH 3.5에서의 24시간 인큐베이션 후에 최대 18%의 다량체가 검출되어 pH 3.5에서 다량체화의 보다 느리고 보다 낮은 증가가 관찰되었다.
요약하면, HP-SEC 분석은 다량체화의 과정이 L234F-L235E-G236R-K409R 돌연변이를 보유하는 변이체보다 L234F-L235E-D265A-K409R 돌연변이를 보유하는 항체 변이체에서 보다 신속하고 보다 광범위하게 발생한다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 또한 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 다른 항체 클론 변이체가 L234F-L235E-D265A-함유 변이체보다 낮은 pH 조건에서 더 높은 단량체성 유지 능력을 갖는 것으로 결론지어졌다. 낮은 pH에서의 단량체성의 유지는 낮은 pH에서 수행되는 바이러스 불활성화 절차 동안의 유리한 특징이다.
표 17은 PBS 또는 아세트산나트륨 완충제 (pH 3.5) 중에 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 용해시킨, 불변 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 및 항-gp120 (HIV1) IgG1-b12 항체 변이체를 함유하는 샘플에서 HP-SEC 분석에 의해 검출된 바와 같은 다량체, 단량체 및 분해의 백분율을 보여준다.
표 17
1 IgG 농도 ~ 0.5 mg/mL에서 시험된 스트레스 조건 0.5 mg/ml (참조용), 0.435 mg/ml (pH 3.5)
FER의 항체 치료 개발가능성 측면
실시예 15-23에서, 항체 치료 개발가능성과 관련된 다양한 측면을 평가하였다. 첫째로, L234F-L235E-D265A (FEA) 또는 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 보유하는 항체 변이체를 사용하여 이중특이적 항체를 형성하는 능력에서는 어떠한 명백한 차이도 관찰되지 않았다. 또한, FEA 또는 FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 생산 수준은 유사하였다. FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 고도로 농축된 샘플은 FEA 돌연변이를 보유하는 항체 변이체와 비교하여 개선된 단백질 안정성 및 보다 적은 응집 성향을 입증하였다. 항체 변이체를 40℃에 4개월 동안 노출시키는 것은 모든 시험된 변이체의 증가된 다량체화를 발생시켰고, 그의 정도는 항체 클론-의존성이었다. 또한, 동결-해동 주기는 FEA 또는 FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체의 단백질 안정성에 영향을 미치지 않았다. 중요한 것으로, FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는 FEA 돌연변이를 보유하는 변이체와 비교하여 낮은 pH-유도된 스트레스 조건에 대해 보다 높은 저항성을 입증하였다.
IgG1 항체의 Fc 영역에의 FEA 돌연변이의 도입은 용이하게 개발될 수 있는 항체 변이체를 생성하며, 이러한 항체 변이체는 현재 임상 제품 개발 및 임상 용도를 위해 널리 허용된다. 상기의 관점에서, 불활성 포맷을 원하는 경우 항체 변이체의 단백질 안정성 프로파일 및 개발가능성은 FER 돌연변이를 대신 도입하는 것에 의해 추가로 개선될 수 있다. 따라서, FER-함유 변이체가 임상 용도를 위한 단일특이적 또는 다중특이적 항체의 개발에 바람직할 수 있다. 특히, FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체는 인간 사용을 위한 치료 항체의 개발 동안 종종 적용되고 요구되는 바이러스 불활성화를 위한 절차에서 유익한 특성인, 낮은 pH 조건에의 노출에 대해 덜 감수성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 24: 각각의 중쇄에 상이한 세트의 비-활성화 돌연변이를 함유하는 항-인간 CD20 항체 및 그의 변이체에 의한 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성
실시예 3 및 5에서, 야생형-유사 IgG1 항-인간 CD20 및 HLA-DR 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역에 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 도입하면, CDC를 유도하는 능력의 거의 완전한 제거를 발생시켰음이 밝혀졌다. 이는 실시예 4에 제시된 바와 같이 FER 돌연변이를 보유하는 항체 변이체에 의한 C1q 결합의 감소와 일치하였다. 여기서는, 둘 다의 HC에 L234F-L235E-D265A (FEA) 또는 FER 돌연변이를 보유하는 2개의 HC를 함유하는 항-인간 CD20 항체, 및 하나의 HC에 FEA 돌연변이 및 다른 HC에 FER 돌연변이를 함유하는 변이체에 대해 보체 인자 C1q에 결합하는 능력을 평가하였다. 또한, CDC를 유도하는 상기 항체 변이체의 능력을 평가하였다.
야생형 항-인간 CD20 항체 IgG1-CD20, 및 K409R 또는 F405L 돌연변이에 더하여 양쪽 HC에 FEA 또는 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체, 또는 하나의 HC에 FEA 돌연변이 및 다른 HC에 FER 돌연변이를 함유하는 변이체 (이하 "비대칭 변이체"로 지정됨)를 실시예 4에 기재된 절차에 따라, C1q의 공급원으로서 20% 정상 인간 혈청 (NHS, M0008, 산퀸)의 존재 하에 Raji 세포에 대한 C1q 결합 검정에서 시험하였다. 항-인간 CD20 항체의 비대칭 변이체는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제어된 Fab-아암 교환을 통해 생성하였다. 항체 변이체에 대한 C1q 결합을 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 중앙 형광 강도-FITC를 측정함으로써 검출하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 IgG1 항체 변이체 (IgG1-CD20, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
C1q 결합 검정에서 시험된 동일한 항체 변이체를 시험관내 CDC 검정에서 시험하였다. 항체 변이체를 본질적으로 실시예 3에 추가로 기재된 바와 같이, 웰당 5x104개의 Raji 세포를 사용하여 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포 용해의 백분율에 상응하는 PI-양성 세포의 백분율을 (PI-양성 세포의 수 /세포의 총수) x 100%로서 계산하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 IgG1 항체 변이체 (IgG1-CD20, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
IgG1-CD20 변이체에 대한 C1q의 결합의 평가는 야생형 IgG1-CD20 항체가 표적 Raji 세포 상의 CD20에의 결합 시 보체 단백질 C1q와 효율적으로 결속한다는 것을 밝혀내었다. F405L 또는 K409R 돌연변이와 조합된 FEA 또는 FER 비-활성화 돌연변이의 도입은 C1q 결합을 극적으로 감소시켰다 (도 16). C1q의 결합은, HC 둘 다가 K409R 또는 F405L 돌연변이를 함유하였는지, 또는 하나의 HC가 K409R 돌연변이를 함유하고 다른 HC가 F405L 돌연변이를 함유하였는지에 관계없이, FEA 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD20 변이체보다 FER 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD20 변이체에 대해 더 강하게 감소되었다. C1q 결합의 완전한 제거가 비대칭 변이체 BisG1-CD20 FEA-F405LxFER-K409R에 대해 관찰된 한편, C1q 결합의 강한 감소가 다른 비대칭 변이체 BisG1-CD20 FER-F405LxFEA-K409R에 대해 관찰되었다 (도 16).
동일한 IgG1-CD20 변이체의 CDC-유도 능력의 평가는 CDC를 제거하는 능력이 둘 다의 HC가 K409R 또는 F405L 돌연변이를 함유하였는지, 또는 하나의 HC가 K409R 돌연변이를 함유하고 다른 HC가 F405L 돌연변이를 함유하였는지에 관계없이, FER 돌연변이의 도입에 의해 가장 강하게 억제되었음을 밝혀내었다 (도 17). 야생형 IgG1-CD20과 비교하여, 돌연변이 FEA-K409R을 함유하는 IgG1-CD20 변이체에 대해 잔류 CDC가 관찰되었고, IgG1-CD20-FEA-F405L에 대해서는 더 적은 정도로 관찰되었다. 비대칭 변이체 BisG1-CD20 FEA-F405LxFER-K409R에 대해 낮은 잔류 CDC가 관찰되었다. BisG1-CD20 FER-F405LxFEA-K409R의 CDC-유도 능력의 감소는 BisG1-CD20 FEA-F405LxFEA-K409R에 대해 관찰된 것과 대등하였다.
결론적으로, C1q에 대한 항-인간 CD20 IgG1 항체 결합은 둘 다의 HC에 FER 돌연변이를 도입하는 것에 의해, 또는 K409R 돌연변이를 추가로 함유하는 하나의 HC에 이들 돌연변이를 도입하고 다른 HC에 FEA-F405L 돌연변이를 도입 시 가장 강하게 억제되었다. CDC를 유도하는 능력은 FEA 돌연변이보다 FER 돌연변이를 도입하는 것에 의해 더 강하게 억제되었다. 하나의 HC에 FER 돌연변이 및 다른 HC에 FEA 돌연변이를 함유하는 비대칭 변이체는 또한 둘 다의 HC에 FER 또는 FEA 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 중간 수준까지 CDC-유도 능력의 강한 감소를 입증하였다.
실시예 25: 각각의 중쇄에 상이한 세트의 비-활성화 돌연변이를 함유하는 항체 변이체에 의해 유도된 시험관내 T-세포-매개 세포독성
실시예 11은 암 항원 및 T-세포를 표적화하는 이중특이적 항체 변이체의 중쇄 (HC) 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이의 도입이 비-특이적 세포독성을 효율적으로 피하지만 특이적 T-세포-매개 세포독성을 유도하는 능력은 유지시켰음을 보여주었다. 이들 실험에서, 비-활성화 돌연변이는 대칭 방식으로 존재하였고, 즉 둘 다의 HC는 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하였다. 여기서는, T-세포-매개 세포독성을 Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는, 즉 하나의 HC는 FER 돌연변이를 보유하고 다른 HC는 대안적 비-활성화 돌연변이 (예를 들어 L234F-L235E-D265A [FEA], L234A-L235A-P329G [AAG], 또는 N297G)를 보유하는 CD3xHER2 및 CD3xb12 이중특이적 IgG1 항체에 대해 평가하였다.
비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는 것을 포함한 이중특이적 항체 변이체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제어된 Fab-아암 교환 (cFAE)에 의해 생성하였다. 야생형 이중특이적 항체 CD3xHER2 (항-인간 CD3 [huCLB-T3/4] IgG1-F405L 및 항-인간 HER2 IgG1-K409R) 또는 CD3xb12 (항-인간 CD3 [huCLB-T3/4] IgG1-F405L 및 비-결합 대조군 항체 항-HIV1 gp120 [b12] IgG1-K409R) 및 Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 T-세포-매개 세포독성을 평가하였다. 시험된 이중특이적 변이체는 제2 HC에서의 K409R 돌연변이에 더하여 FEA, AAG 또는 N279G 비-활성화 돌연변이와 조합된, 1개의 HC에서의 F405L 돌연변이에 더하여 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하였다. 또한, 비-활성화 돌연변이를 보유하지 않지만 K409R 돌연변이 (이중특이적 항체 변이체의 효율적인 생성을 위해 요구됨)만을 보유하는 제2 HC와 조합된, 하나의 HC에서 F405L 돌연변이에 더하여 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체를 시험하였다. 대조군으로서, HC에 비-활성화 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항체 변이체, 뿐만 아니라 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12를 시험하였다. PBMC를 실시예 9에 기재된 바와 같은 밀도 구배 분리에 의해 건강한 공여자로부터 유래된 백혈구 연층으로부터 단리하고, PBS로 세척하고, 배양 배지 (2mM L-글루타민 및 25 mM HEPES를 갖는 RPMI-1640; 철과 함께 10% 공여자 소 혈청 (DBSI)으로 보충됨) 중에 재현탁시켰다. 후속적으로, PBMC를 배양 배지 (2mM L-글루타민 및 25 mM HEPES를 함유하는 RPMI-1640; 10% 철을 함유하는 공여자 소 혈청 (DBSI)으로 보충됨) 1부 및 80% DBSI 및 20% 디메틸 술폭시드 (DMSO; 시그마-알드리치, Cat # 41644; 동결보호 배지 중 DMSO의 최종 농도는 10%임)의 혼합물 1부로 이루어진 동결보호 배지 중에 재현탁시킴으로써 30-50x106개 세포/ml의 농도로 PBMC를 -150℃에서 동결시켰다. HER2-발현 SK-OV-3 세포 (ATCC, Cat # HTB-77)를 10% (vol/vol) 열 불활성화된 DBSI 및 페니실린-스트렙토마이신 (Pen/Strep, 최종 농도 50 단위/mL 포타슘 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트 [론자, Cat # DE17-603E])으로 보충된 맥코이 5A 배지 (론자, Cat # BE12-168F)에서 배양하고, 5% (vol/vol) CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 유지시켰다. SK-OV-3 세포를 거의 전면생장률로 배양하였다. 세포를 트립신처리하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 후속적으로 세포 스트레이너를 통해 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 2.5x104개 SK-OV-3 세포를 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 인큐베이션하여 플레이트에 부착되도록 하였다. 상기 기재된 바와 같이 단리 후에 동결된 PBMC를 해동시켰다. 이어서, PBMC를 PBS로 2회 세척하고, 이어서 배양 배지 중에 재현탁시켰다. 후속적으로, 1x105개 PBMC를 SK-OV-3 표적 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 4:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비를 생성하였다. 후속적으로, 상기 언급된 바와 같은 이중특이적 CD3xHER2 및 CD3xb12 야생형 및 그의 비-활성화 변이체의 용량 반응 시리즈를 배양 배지에서 제조하고 (0.001 - 1000 ng/mL 최종 농도, 10-배 희석), SK-OV-3 세포 및 PBMC를 함유하는 96-웰 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. SK-OV-3 표적 세포와 2 μM 스타우로스포린 (시그마-알드리치, Cat # S6942-200, 시그마)의 인큐베이션을 100% 종양 세포 사멸에 대한 참조로서 사용하였다. 배지 대조군 (SK-OV-3 세포, 항체 없음, PBMC 없음)을 0% 종양 세포 사멸에 대한 참조로서 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 10% 알라마르 블루 (인비트로젠(Invitrogen), Cat # DAL1100)를 함유하는 150 μL 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 590 nm에서 흡광도를 측정하였다 (엔비전, 퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬). 데이터를 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 용량 반응 대 백분율 생존 SK-OV-3 세포로서 시각화하였고, 이는 실험 반복당 각각의 공여자에 대해 계산하였다. 데이터는 2회의 독립적 실험으로부터 4명의 공여자로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는 것을 포함하여 모든 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체는 야생형-유사 기능을 갖는 Fc 영역을 보유하며 따라서 비-활성화 돌연변이가 없는 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체와 대등한 효율로 SK-OV-3 세포의 용량-의존성 세포독성을 유도하였다 (도 18a). 실시예 11에 제시된 데이터와 유사하게, 야생형-유사 이중특이적 CD3xb12 항체 (BisG1 F405LxK409R)는 야생형-유사 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체보다 더 적은 정도이지만 SK-OV-3 세포의 비-특이적 사멸을 유도하였다 (도 18b). 다른 HC에서의 FEA (BisG1 FER-F405LxFEA-K409R) 또는 AAG (BisG1 FER-F405LxAAG-K409R) 돌연변이와 조합된 하나의 HC에서 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체는, 대칭적으로 분포된 FER, FEA 또는 AAG 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xb12 변이체 (도 10b)와 유사하게, SK-OV-3 세포의 세포독성을 나타내지 않았다 (도 18b). 대조적으로, N297G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 다른 HC와 조합된 하나의 HC에 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체 (BisG1 FER-F405LxN297G-K409R)는 야생형-유사 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체보다 더 적은 정도이지만 SK-OV-3 세포의 비-특이적 사멸을 유도하였다 (도 18b). 이러한 결과는 대칭 N297G 비-활성화 돌연변이를 갖는 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체가 또한 SK-OV-3 세포의 부분적 비-특이적 사멸을 유도하였다는 관찰과 일치한다 (도 10b). 또한, 야생형-유사 기능을 갖는 다른 HC 영역과 조합된 하나의 HC에 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xb12 항체 변이체 (BisG1 FER-F405LxK409R)는 또한 CD3xb12 변이체 BisG1 FER-F405LxN297G-K409R과 유사한 수준으로 비-특이적 사멸을 유도하였다 (도 18b).
전반적으로, Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 갖는, 즉 하나의 HC에 FER 비-활성화 돌연변이 및 다른 HC에 FEA 또는 AAG 비-활성화 돌연변이를 보유하는, 암 항원 및 T-세포를 표적화하는 이중특이적 항체 변이체는 특이적 T-세포-매개 세포독성을 유도하는 능력을 유지하였지만, 비-특이적 세포독성은 효율적으로 회피하였다.
실시예 26: 각각의 중쇄에 상이한 세트의 비-활성화 돌연변이를 함유하는 항체 변이체에 의해 유도된 PBMC 배양물에서의 T-세포 활성화
실시예 10은 항-인간 CD3 IgG1 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이의 도입이 인간 PBMC 공동-배양물에서 CD69의 상향조절에 의해 측정된 바와 같이 T 세포의 활성화를 방지하였음을 보여주었다. 이들 실험에서, 비-활성화 돌연변이는 대칭 방식으로 존재하였고, 즉 둘 다의 HC는 F405L 또는 K409R 돌연변이에 더하여 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하였다. 여기서는, T-세포 활성화를 Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는, 즉 하나의 HC는 FER 돌연변이를 보유하고 다른 HC는 상이한 비-활성화 돌연변이를 보유하는 CD3xHER2 이중특이적 IgG1 항체에 대해 평가하였다.
야생형 이중특이적 IgG1 항체 CD3xHER2 및 Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 보유하는, 실시예 25에 나타낸 바와 같은 그의 변이체에 의한 PBMC 공동-배양물에서의 T 세포의 활성화를 평가하였다. 대조군으로서, HC에 대칭 비-활성화 FER 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체, HC에 비-활성화 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항체 변이체, 뿐만 아니라 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12를 시험하였다. 이들 항체 변이체에 의한 T-세포 활성화에 대한 척도로서 T 세포 상의 CD69의 상향조절을 본질적으로 실시예 10에 기재된 절차에 따라 평가하였다. 간략하게, 상기 언급된 바와 같은 이중특이적 CD3xHER2 및 CD3xb12 야생형 및 그의 비-활성화 변이체의 용량 반응 시리즈를 배양 배지에서 제조하고 (0.001 - 1000 ng/mL 최종 농도, 10-배 희석), 배양 배지 중 PBMC를 함유하는 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다 (1.5x105개 세포/웰). 16-24시간 인큐베이션 후에, PBMC 혼합물에서의 CD28-양성 세포 중 CD69-양성 세포의 백분율을 포르테사 유동 세포측정기 (BD) 상에서 측정하였다. 데이터를 용량-반응 대 CD28-양성 세포 중 백분율 CD69-양성으로서 분석하였다. 각각의 실험 반복의 PBMC 공여자당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 배경 염색 (항체 부재 대조군)을 사용하여 계산한 후, 비-결합 음성 대조군 IgG1-b12 (0%) 및 야생형 유사 IgG1 이중특이적 항체 변이체 (BisG1 F405LxK409R, 100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 각각의 공여자에 대해 정규화하였다. 데이터는 2회의 독립적 반복 실험에서 4명의 공여자로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
초기 T-세포 활성화에 대한 척도로서 T 세포 상의 CD69 상향조절의 평가는 HC에 대칭 비-활성화 FER 돌연변이를 보유하는 이중특이적 항체 변이체가 야생형-유사 CD3xHER2 이중특이적 항체 변이체 (BisG1 F405LxK409R)와 비교하여 PBMC 공동-배양물에서 T 세포 상의 CD69의 상향조절을 방지하였음을 보여준다 (도 19). 이는 F405L 돌연변이에 더하여 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD3 IgG1 항체에 대한 실시예 10에 기재된 데이터와 일치한다. 다른 HC에서의 FEA (BisG1 FER-F405LxFEA-K409R) 또는 AAG (BisG1 FER-F405LxAAG-K409R) 돌연변이와 조합된 하나의 HC에서 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체는 또한 PBMC 공동-배양물에서 T 세포 상의 CD69 상향조절의 거의 완전한 제거를 나타내었다 (도 19). 대조적으로, N297G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 다른 HC와 조합되거나 (BisG1 FER-F405LxN297G-K409R) 또는 야생형-유사 기능을 갖는 또 다른 HC 영역과 조합된 (BisG1 FER-F405LxK409R), 하나의 HC에 FER 비-활성화 돌연변이를 보유하는 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체는 야생형-유사 이중특이적 CD3xHER2 항체 변이체보다 더 적은 정도이지만 T 세포의 잔류 활성화를 유도하였다 (도 19).
요약하면, Fc 영역에 비대칭 비-활성화 돌연변이를 갖는, 즉 하나의 HC에 FER 비-활성화 돌연변이 및 다른 HC에 FEA 또는 AAG 비-활성화 돌연변이를 보유하는, 암 항원 및 T 세포를 표적화하는 이중특이적 항체 변이체는 인간 PBMC 공동-배양물에서 CD69 상향조절에 의해 측정된 바와 같이 T 세포의 활성화를 효율적으로 방지하였다.
실시예 27: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 인간 Fcγ 수용체에 대한 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도
실시예 6의 데이터는 중쇄 (HC) 불변 영역에 비-활성화 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 도입하는 것이, ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같이, FcγRIa의 단량체 세포외 도메인 (ECD), 또는 인간 FcγRIIa 동종이형 131H, 인간 FcγRIIa 동종이형 131R, 인간 FcγRIIb, 인간 FcγRIIIa 동종이형 158F, 및 인간 FcγRIIIa 동종이형 158V의 이량체 ECD에의 결합을 방지하였음을 제시하였다.
여기서, 본 발명자들은 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오(ForteBio)) 상에서 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V의 단량체 세포외 도메인 (ECD)에 대한 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도를 정량화하였다. 시험된 비-활성화 변이체는 돌연변이 L234F-L235E-D265A, L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G를 보유하였다. 모든 단계는 30℃에서 수행하였다. 인간 FcγRIa의 경우, Ni-NTA 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5101) 뿐만 아니라 샘플 희석제 (포르테바이오, cat. no. 18-1104) 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, NiNTA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 인간 FcγRIa (시노 바이올로지칼(Sino Biological), 10256-H08S-B, 1 μg/ml)를 Ni-NTA 바이오센서 상에 600초 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (300초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 인간 FcγRIa에 대한 항체의 결합을 1.56 - 100 nM (IgG1 야생형의 경우; 2-배 희석) 또는 15.6 - 1000 nM (IgG1-L234F-L235E-D265A, IgG1-L234F-L235E-G236R, 및 IgG1-L234A-L235A-P329G의 경우; 2-배 희석)의 농도 범위를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정하고, Y-축을 측정된 기준선의 마지막 10초에 정렬하고, 단계간 교정뿐만 아니라 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. KD (M), 뿐만 아니라 kon (1/Ms) 및 koff (1/s)를 결정하기 위해, 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델을 선택하였다. 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 400초 해리를 모든 항체 변이체에 대한 분석을 위한 관심 윈도우로서 사용하였다. 최적 피트는 >0.99의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, 전반적 (전체) 피트는 >3 곡선 피트 (신뢰성 있는 분석)에 기초한다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
인간 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V의 경우, 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5019) 뿐만 아니라 샘플 희석제 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, SA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 비오티닐화된 인간 FcγRIIa 동종이형 131H (시노 바이올로지칼, 10374-H27H1-B, 1 μg/ml), FcγRIIb (시노 바이올로지칼, 10259-H27H-B, 1 μg/ml), 또는 FcγRIIIa 동종이형 158V (시노 바이올로지칼, 10389-H27H1-B, 3 μg/ml)를 SA 바이오센서 상에 65초 (FcγRIIa 또는 FcγRIIb) 또는 600초 (FcγRIIIa) 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (50초, FcγRIIa 또는 FcγRIIb; 300초, FcγRIIIa) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 항체의 결합을 다양한 농도 (FcγRIIa, 156.25 - 10000 nM, 2-배 희석; FcγRIIb, 250 - 16000 nM, 2-배 희석; FcγRIIIa, 125 - 8000 nM, 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정하고, Y-축을 측정된 기준선의 마지막 10초에 정렬하고, 단계간 교정을 적용하였다. 인간 IgG1과 낮은 친화도 Fcγ 수용체 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V 사이의 낮은 친화도로 인해, 정상 상태 분석 (SSA)을 선택하여 KD (M)를 결정하였다. 간략하게, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 R-평형 (Req) 함수를 사용하여 상이한 항체 농도에 대한 정상-상태 반응 (센소그램이 회합 단계에서 플래토에 도달한 경우)을 계산하고, 후속적으로 정상-상태 반응을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 최종적으로 랭뮤어 모델을 사용하여 KD (M)를 계산하였다. 최적 피트는 >0.99의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, SSA는 >3 회합 곡선 피트에 기초하며, 각각의 항체 농도에 대해 플롯팅된 정상-상태 반응은 최대 결합 반응의 적절한 계산을 허용하는 플래토에 도달하였다 (신뢰할 수 있는 분석). 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
생물층 간섭측정법을 사용한 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체 변이체의 결합의 평가는 야생형 IgG1이 FcγRIa에 대해 1.8 nM, FcγRIIa 동종이형 131H에 대해 1.9 μM, FcγRIIb에 대해 7.3 μM, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대해 0.6 μM의 결합 친화도로 모든 시험된 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내었음을 밝혀내었다 (표 18). 대조적으로, 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R, L234F-L235E-D265A, 또는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 항체 변이체는 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 결합을 나타내지 않았다 (표 18).
표 18: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 결합 친화도. 높은 친화도 수용체 FcγRIa에 대해, KD (M), kon (1/Ms), 및 koff (1/s)가 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델에 기초하여 제시된다. 낮은 친화도 수용체 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대해, KD (M)는 정상 상태 분석에 기초하여 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-FER, IgG1-FEA 및 IgG1-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, FEA: L234F-L235E-D265A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다. SSA: 정상 상태 분석, BLI: 생물층 간섭측정법, nb: 결합 없음, n/a: 적용가능하지 않음.
실시예 28: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도
실시예 27의 데이터는 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도 또는 그의 결여를 보여주었다. 그러나, 뮤린 모델에서 인간 항체의 생체내 치료 효과를 평가할 경우, 선택된 뮤린 모델에 따라 인간 Fcγ 수용체는 존재하지 않을 수 있다. 대신, 인간 항체의 치료 효과의 평가는 내인성으로 발현된 뮤린 Fcγ 수용체의 존재에 의존할 수 있다. 이러한 경우에, 치료 항체가 비-활성화 Fc 도메인으로부터 이익을 얻는 경우에, 이는 비-활성화 항체 변이체에 의한 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 결합의 부재를 보장하는 핵심이다.
여기서, 본 발명자들은 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체, 및 뮤린 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV의 단량체 세포외 도메인 (ECD)에 대한 L234F-L235E-D265A, L234F-L235E-G236R, L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도를 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 평가하였다. 모든 단계는 30℃에서 수행하였다. 뮤린 FcγRI의 경우, Ni-NTA 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5101) 뿐만 아니라 샘플 희석제 (포르테바이오, cat. no. 18-1104) 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, Ni-NTA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 뮤린 FcγRI (시노 바이올로지칼, cat. no. 50086-M27H-B, 2 μg/ml)를 Ni-NTA 바이오센서 상에 600초의 지속기간 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (300초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 뮤린 FcγRI에 대한 항체의 결합을 농도 범위 (15.6 - 1000 nM; 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정한 후, Y-축을 기준선의 마지막 10초에 정렬하였다. 최종적으로, 단계간 교정뿐만 아니라 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. KD (M), 뿐만 아니라 kon (1/Ms) 및 koff (1/s)를 결정하기 위해, 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델을 선택하였다. 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 100초 해리를 모든 항체 변이체에 대한 분석을 위한 관심 윈도우로서 사용하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, 전반적 (전체) 피트는 >3 곡선 피트 (신뢰성 있는 분석)에 기초한다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
뮤린 FcγRIIb, FcγRIII, 및 FcγRIV의 경우, 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5019) 뿐만 아니라 샘플 희석제 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, SA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 비오티닐화된 뮤린 FcγRIIb (시노 바이올로지칼, cat. no. 50030-M27H-B, 1 μg/ml), FcγRIII (시노 바이올로지칼, cat. no. 50326-M27H-B, 1 μg/ml), 또는 FcγRIV (시노 바이올로지칼, cat. no. 50036-M27H-B, 1 μg/ml)를 SA 바이오센서 상에 90초 (FcγRIIb) 또는 250초 (FcγRIII 및 FcγRIV) 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (50초, FcγRIIb 또는 FcγRIII; 300초, FcγRIV) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 뮤린 FcγRIIb, FcγRIII, 및 FcγRIV에 대한 항체의 결합을 다양한 농도 (FcγRIIb, 187.5 - 12000 nM, 2-배 희석; FcγRIII, 156.25 - 10000 nM, 2-배 희석; FcγRIV, 78.13 - 5000 nM, 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정하고, Y-축을 기준선 측정의 마지막 10초에 정렬하고, 단계간 교정을 적용하였다. 인간 IgG1과 낮은 친화도 뮤린 Fcγ 수용체 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV 사이의 낮은 친화도로 인해, 정상 상태 분석 (SSA)을 선택하여 KD (M)를 결정하였다. 간략하게, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 R-평형 (Req) 함수를 사용하여 상이한 항체 농도에 대한 정상-상태 반응 (센소그램이 회합 단계에서 플래토에 도달한 경우)을 계산하고, 후속적으로 정상-상태 반응을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 최종적으로 랭뮤어 모델을 사용하여 KD (M)를 계산하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, SSA는 >3 회합 곡선 피트에 기초하며, 각각의 항체 농도에 대해 플롯팅된 정상-상태 반응은 최대 결합 반응의 적절한 계산을 허용하는 플래토에 도달하였다 (신뢰할 수 있는 분석). 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
생물층 간섭측정법을 사용한 뮤린 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체 변이체의 결합의 평가는 야생형 인간 IgG1이 FcγRIa에 대해 0.12 μM, FcγRIIb에 대해 2.8 μM, FcγRIII에 대해 7.5 μM 및 FcγRIV에 대해 1 μM의 결합 친화도로 모든 시험된 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내었음을 밝혀내었다 (표 19). 대조적으로, 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R, L234F-L235E-D265A 또는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 항체 변이체는 뮤린 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 결합을 나타내지 않았다 (표 19).
표 19: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체 변이체에 의한 뮤린 FcγR 결합 친화도. 높은 친화도 수용체 FcγRI에 대해, KD (M), kon (1/Ms), 및 koff (1/s)가 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델에 기초하여 제시된다. 낮은 친화도 수용체 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대해, KD (M)는 정상 상태 분석에 기초하여 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-FER, IgG1-FEA 및 IgG1-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, FEA: L234F-L235E-D265A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다. SSA: 정상 상태 분석, BLI: 생물층 간섭측정법, nb: 결합 없음, n/a: 적용가능하지 않음.
실시예 29: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도
전임상 개발 동안, 비-인간 영장류 (시노몰구스 원숭이, 마카카 파시쿨라리스)를 수반하는 연구 또는 비-인간 영장류로부터 유래된 생물학적 샘플을 수반하는 실험을 개시하여 항체 치료 후보의 치료 효과, 뿐만 아니라 안전성 및 약동학을 조사할 수 있다. 실시예 27의 데이터는 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 비-활성화 L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체의 결합 친화도 또는 그의 결여를 보여주었다. 인간과 시노몰구스 Fcγ 수용체 사이의 강한 서열 유사성에도 불구하고, 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내지 않는 특정한 비-활성화 변이체는 여전히 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타낼 수 있다. 따라서, 원치 않는 유해 사건의 위험 및 용량-제한 독성을 최소화하기 위해, 본 발명자들은 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체, 및 시노몰구스 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII의 단량체 세포외 도메인 (ECD)에 대한 L234F-L235E-D265A, L234F-L235E-G236R, L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도를 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 평가하였다.
모든 단계는 30℃에서 수행하였다. 시노몰구스 FcγRI의 경우, Ni-NTA 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5101) 뿐만 아니라 샘플 희석제 (포르테바이오, cat. no. 18-1104) 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, Ni-NTA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 시노몰구스 FcγRI (알앤디 시스템즈(R&D Systems), cat. no. CF9239-Fc, 1 μg/ml)를 Ni-NTA 바이오센서 상에 600초의 지속기간 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (300초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 시노몰구스 FcγRI에 대한 항체의 결합을 1.56 - 100 nM (IgG1 야생형의 경우; 2-배 희석) 또는 15.6 - 1000 nM (IgG1-L234F-L235E-D265A, IgG1-L234F-L235E-G236R, 및 IgG1-L234A-L235A-P329G의 경우; 2-배 희석)의 농도 범위를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정한 후, y-축을 기준선의 마지막 10초에 정렬하였다. 최종적으로, 단계간 교정뿐만 아니라 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. KD (M), 뿐만 아니라 kon (1/Ms) 및 koff (1/s)를 결정하기 위해, 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델을 선택하였다. 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 400초 해리를 모든 항체 변이체에 대한 분석을 위한 관심 윈도우로서 사용하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, 전반적 (전체) 피트는 달리 나타내지 않는 한 >3 농도 곡선 피트 (신뢰성 있는 분석)에 기초한다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
시노몰구스 FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIII의 경우, 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서 (포르테바이오, cat. no. 18-5019) 뿐만 아니라 샘플 희석제 중에 희석된 단백질의 순응 (30℃에서 600초) 후에, SA 바이오센서를 샘플 희석제 중에서 100초 동안 인큐베이션함으로써 초기 기준선 측정을 수행하였다. 후속적으로, His-태그부착된 비오티닐화된 시노몰구스 FcγRIIa (시노 바이올로지칼, cat. no. 90015-C27H-B, 1 μg/ml), FcγRIIb (시노 바이올로지칼, cat. no. 90014-C27H-B, 1 μg/ml), 또는 FcγRIII (아크로바이오시스템즈, cat. no. FC6-C82E0, 1 μg/ml)을 SA 바이오센서 상에 80초 (FcγRIIa 및 FcγRIIb) 또는 100초 (FcγRIII) 동안 고정시켰다. 샘플 희석제에서의 기준선 측정 (100초) 후에, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (50초, FcγRIIa 또는 FcγRIIb; 300초, FcγRIII) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 시노몰구스 FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIII에 대한 항체의 결합을 다양한 농도 (FcγRIIa, 156.25 - 10000 nM, 2-배 희석; FcγRIIb, 187.5 - 12000 nM, 2-배 희석; FcγRIII, 31.25 - 2000 nM, 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어 v11.1 (포르테바이오)로 분석하였다. 간략하게, 데이터 트레이스를 참조 곡선 (센서 상 FcγR, 샘플 희석제만으로 측정)의 차감에 의해 교정하고, y-축을 기준선 측정의 마지막 10초에 정렬하고, 단계간 교정을 적용하였다. 인간 IgG1과 낮은 친화도 시노몰구스 Fcγ 수용체 FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIII 사이의 낮은 친화도로 인해, 정상 상태 분석 (SSA)을 선택하여 KD (M)를 결정하였다. 간략하게, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 R-평형 (Req) 함수를 사용하여 상이한 항체 농도에 대한 정상-상태 반응 (센소그램이 회합 단계에서 플래토에 도달한 경우)을 계산하고, 후속적으로 정상-상태 반응을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 최종적으로 랭뮤어 모델을 사용하여 KD (M)를 계산하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, SSA는 >3 회합 곡선 피트에 기초하며, 각각의 항체 농도에 대해 플롯팅된 정상-상태 반응은 최대 결합 반응의 적절한 계산을 허용하는 플래토에 도달하였다 (신뢰할 수 있는 분석). 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
생물층 간섭측정법을 사용한 시노몰구스 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체 변이체의 결합의 평가는 야생형 인간 IgG1이 FcγRIa에 대해 0.6 nM, FcγRIIa에 대해 4.3 μM, FcγRIIb에 대해 3.9 μM, 및 FcγRIII에 대해 0.4 μM의 결합 친화도로 모든 시험된 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내었음을 밝혀내었다 (표 20). 대조적으로, 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 항체 변이체는 시노몰구스 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 결합을 나타내지 않았다 (표 20). 비-활성화 변이체 IgG1-L234A-L235A-P329G는 낮은 친화도 수용체 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 결합을 나타내지 않았다. 대조적으로, 전반적 (전체) 피트 분석은 최적은 아니었지만 (단지 3개의 농도 곡선 피트), 분석은 대략 2.2 μM의 결합 친화도로의 높은 친화도 수용체 FcγRI에 대한 IgG1-L234A-L235A-P329G의 잔류하나 크게 감소된 (~ 3500-배) 결합을 나타낸다 (표 20).
요약하면, L234F-L235-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 항체 변이체는 이전에 기재된 비-활성화 Fc 변이체 L234F-L235E-D265A와 유사하게 시노몰구스 FcγR 결합을 나타내지 않았다. 대조적으로, 어떠한 인간 또는 뮤린 FcγR 결합도 나타내지 않은 L234A-L235A-P329G는 시노몰구스 FcγRI에 대해 잔류 결합을 나타내었지만, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIII에 대해서는 그렇지 않았다.
표 20: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체 변이체에 의한 시노몰구스 FcγR 결합 친화도. 높은 친화도 수용체 FcγRI에 대해, KD (M), kon (1/Ms), 및 koff (1/s)가 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델에 기초하여 제시된다. 낮은 친화도 수용체 FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIII에 대해, KD (M)는 정상 상태 분석에 기초하여 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다. 시험된 변이체는 IgG1, IgG1-FER, IgG1-FEA 및 IgG1-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, FEA: L234F-L235E-D265A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다. SSA: 정상 상태 분석, BLI: 생물층 간섭측정법, nb: 결합 없음, n/a: 적용가능하지 않음.
1 FcγRI에 대한 IgG1-LALAPG 결합 - 분석은 최적이 아니고, 전반적 (전체) 피트 분석의 경우 <4 피트
실시예 30: 중쇄 영역에 비-활성화 돌연변이를 함유하는 항-인간 CD20 항체 및 그의 변이체에 의한 보체-의존성 세포독성을 유도하는 능력에 대한, C-말단 리신에 대한 코딩 서열이 포함된 또는 제외된 유전자 서열의 영향
IgG 항체의 유전자 서열은 중쇄의 C-말단에서 리신을 코딩하고, 이는 배양 배지에서 생산된 IgG 항체로부터 (부분적으로) 절단되거나 또는 카르복시펩티다제에 의해 순환되어 (Van den Bremer et al., MAbs; 2015;7(4):672-80), 최종 생성물 치료제에서 잠재적 불균질성을 야기한다. 또한, HC C-말단 리신의 존재는 CDC를 유도하는 능력에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 여기서는, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 L234F-L235E-D265A (FEA) 또는 L234F-L235E-G236R (FER) 돌연변이를 함유하는 항-인간 CD20 항체에 의한 CDC를 유도하는 능력을 평가하여, HC C-말단 리신을 코딩하는 유전자 서열에 기초한 항체 변이체 및 HC C-말단 리신이 재조합적으로 결실된 유전자 서열에 기초한 변이체를 비교하였다. 이론적으로, C-말단 리신은 생산 동안 또는 생산-후 이전 변이체로부터 절단될 수 있다.
시험관내 CDC 검정을, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이, 보체의 공급원으로서 20% NHS를 사용하여 Raji 세포에 대해 수행하였다. 간략하게, 항-인간 CD20 항체 IgG1-CD20 또는 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이 FEA 또는 FER을 보유하는 그의 변이체를 50,000개의 Raji 세포/웰을 사용하여 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. 세포 용해에 대한 척도로서 PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1-CD20 항체 변이체에 대해 측정된 AUC 값 (100%)에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
도 20에 제시된 바와 같이, HC C-말단 리신을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 또는 그것이 결여된 유전자 서열에 기초하여 생산된 항체 변이체 사이에서 Raji 세포에 대해 CDC를 유도하는 능력의 차이는 관찰되지 않았다. 이는 야생형 IgG1-CD20 항체 및 FEA 또는 FER 비-활성화 돌연변이를 함유하는 변이체 둘 다에 대해 나타났다.
실시예 31: HC C-말단 리신의 재조합 결실을 갖는 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 Fcγ 수용체를 통한 활성화 및 신호전달
실시예 30은 CDC를 유도하는 능력 또는 그의 유도를 억제하는 능력에 대한 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 중쇄 (HC) C-말단 리신의 재조합 결실 (delK)의 영향을 평가하였다. 여기서, 본 발명자들은 프로메가 리포터 검정에서 표적-발현 Raji 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주를 사용하여, 실시예 30에 기재된 바와 같이 이들 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화 및 신호전달을 평가하였다.
실시예 30에 표시된 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 의한 인간 FcγR-매개 신호전달의 활성화를 리포터 생물검정 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C01; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G988A; FcγRIIb: Cat # CS1781E01; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G701A)을 사용하여 실시예 7에 기재된 절차에 따라 표적 세포로서 CD20-발현 Raji 세포를 사용하여 정량화하였다. 배지-단독 대조군 샘플 (Raji 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음)에 의해 결정된 바와 같은 배경 발광 신호를 추가의 분석 전에 모든 샘플로부터 차감하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군 (오직 Raji 세포 및 이펙터 세포)을 사용하여 계산하였다. 실험당, AUC 값을 비-결합 대조군 IgG1-b12와 함께 인큐베이션한 세포에 대해 관찰된 리포터 활성 (0%) 및 야생형 IgG1의 활성 (100%)에 대해 정규화하였다. 데이터는 2회의 독립적 반복으로부터의 평균 값 ± SEM이다.
프로메가 리포터 검정을 사용한 인간 FcγR 활성화의 평가는 HC C-말단 리신이 재조합적으로 결실된 변이체 (IgG1-delK) 또는 생산 동안 또는 생산-후 이러한 C-말단 리신이 절단된 변이체 (IgG1; 도 21) 사이에 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화를 유도하는 효율에서 어떠한 차이도 밝혀내지 못했다. 또한, FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화를 제거하는 비-활성화 변이체 L234F-L235E-G236R (FER) 및 L234F-L235E-D265A (FEA)의 능력도 또한 영향을 받지 않았다 (도 21).
요약하면, 항-인간 IgG1-CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 HC C-말단 리신의 재조합 결실은 생산 동안 또는 생산-후 C-말단 리신이 절단된 변이체와 비교할 경우 CDC를 유도하는 이들 항체의 능력 또는 그의 결여에 영향을 미치지 않는다.
실시예 32: 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 동종이형 변이체에 의한 보체-의존성 세포독성
이전의 실시예에서, CDC를 유도하는 능력을 동종이형 IgG1(f)에 속하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체에 대해 평가하였다. 여기서, 본 발명자들은 중쇄 (HC) 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 항-인간 CD20 IgG1 항체 및 그의 변이체의 상이한 동종이형의 능력을 평가하였다.
시험관내 CDC 검정을, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이, 보체의 공급원으로서 20% NHS를 사용하여 Raji 세포에 대해 수행하였다. IgG1(fa), IgG1(zax), IgG1(zav), IgG1(za), 및 IgG1(f)을 포함한 항-인간 CD20 IgG1 항체 변이체의 상이한 동종이형을 시험하였다. 간략하게, 항-인간 CD20 IgG1 항체의 동종이형 변이체 또는 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체를 50,000개의 Raji 세포/웰을 사용하여 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. 세포 용해에 대한 척도로서 PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1(f)-CD20 항체 변이체에 대해 측정된 AUC 값 (100%)에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
도 22에 제시된 바와 같이, 야생형 동종이형 IgG1 변이체 사이에서 Raji 세포에 대해 CDC를 유도하는 능력의 차이는 관찰되지 않았다. CDC를 유도하는 능력은 FER 또는 FEA 비-활성화 돌연변이의 도입 시 모든 시험된 동종이형에 대해 크게 감소되었고, FER 돌연변이는 모든 시험된 동종이형에서 FEA 돌연변이보다 CDC의 더 강한 억제를 발생시켰다.
실시예 33: 상이한 IgG1 동종이형 불변 영역을 갖는 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 Fcγ 수용체를 통한 활성화 및 신호전달
실시예 32는 상이한 IgG1 동종이형 불변 영역을 갖는 항-인간 CD20 항체의 중쇄 (HC)에 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 도입하는 것의 CDC를 유도하는 능력에 대한 영향을 평가하였다. 여기서, 본 발명자들은 프로메가 리포터 검정에서 표적-발현 Raji 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주를 사용하여, 이들 상이한 IgG1 동종이형 항-인간 CD20 항체 및 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화 및 신호전달을 평가하였다.
실시예 32에 표시된 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 인간 FcγR-매개 신호전달의 활성화를 리포터 생물검정 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C01; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G988A; FcγRIIb: Cat # CS1781E01; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G701A)을 사용하여 실시예 7에 기재된 절차에 따라 표적 세포로서 CD20-발현 Raji 세포를 사용하여 정량화하였다. 배지-단독 대조군 샘플 (Raji 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음)에 의해 결정된 바와 같은 배경 발광 신호를 추가의 분석 전에 모든 샘플로부터 차감하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군 (오직 Raji 세포 및 이펙터 세포)을 사용하여 계산하였다. 실험당, AUC 값을 비-결합 대조군 IgG1-b12와 함께 인큐베이션한 세포에 대해 관찰된 리포터 활성 (0%) 및 야생형 IgG1(f)의 활성 (100%)에 대해 정규화하였다. 데이터는 2회의 독립적 반복으로부터의 평균 값 ± SEM이다.
프로메가 리포터 검정을 사용한 인간 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 평가는, 일부 변동이 관찰되긴 하였지만, 시험된 모든 야생형 항-인간 CD20 IgG1 동종이형 항체 변이체가 효율적인 인간 FcγR 활성화를 나타냈다는 것을 밝혀내었다 (도 23). 또한, 상이한 IgG1 동종이형 변이체의 중쇄 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입은 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화를 효율적으로 제거하였다 (도 23).
요약하면, 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R은 상이한 IgG1 동종이형 불변 영역을 갖는 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 FcγR-매개 활성화를 효율적으로 제거하였다.
실시예 34: IgG1, IgG3, 및 IgG4 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 보체-의존성 세포독성
여기서, 본 발명자들은 항-인간 CD20 IgG1 또는 IgG3 항체의 HC에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입 시, 및 위치 234에 자연적으로 페닐알라닌 (F)을 갖는 항-인간 CD20 IgG4 항체의 HC에 L235E-G236R 또는 L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입 시 CDC를 유도하는 능력을 평가하였다.
Raji 세포에 대한 시험관내 CDC 검정을, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이, 보체의 공급원으로서 20% NHS를 사용하여 수행하였다. 야생형 항-인간 CD20 IgG1, IgG3 (동종이형 IGHG3*01 및 IGHG3*04 [IgG3rch2]), 및 IgG4 항체를 상기 언급된 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체와 비교하였다. 간략하게, 항체 변이체를 50,000개의 Raji 세포/웰을 사용하여 다양한 농도 (0.014-10 μg/mL 최종 농도; 3-배 희석)에서 시험하였다. 세포 용해에 대한 척도로서 PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 야생형 IgG1-CD20 항체 변이체에 대해 측정된 AUC 값 (100%)에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
도 24a에 제시된 바와 같이, 야생형 항-인간 CD20 IgG1 항체는 IgG3의 둘 다의 야생형 동종이형보다 더 강한 CDC를 유도하였다. 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-D265A 및 L234F-L235E-G236R의 도입은 IgG1 및 IgG3 변이체 둘 다에서 CDC를 유도하는 능력을 강력하게 억제하였으며, L234F-L235E-G236R 돌연변이를 보유하는 변이체에 대해 CDC 활성의 가장 강한 억제가 관찰되었다. 야생형 IgG4는 CDC를 유도하는 매우 낮은 고유 능력을 나타내었고, 이는 L235E-G236R 또는 L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입에 의해 추가로 억제되지 않았다 (도 24b).
요약하면, IgG1 및 IgG3 하위부류의 항-인간 CD20 항체에의 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이의 도입은 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이보다 더 강하게 Raji 세포의 CDC를 유도하는 능력을 감소시켰다.
실시예 35: IgG1, IgG3, 및 IgG4 항-인간 CD20 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 Fcγ 수용체를 통한 활성화 및 신호전달
실시예 34에서, IgG3의 중쇄 (HC) 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입 시 또는 위치 234에 자연적으로 페닐알라닌 (F)을 갖는 IgG4의 HC 불변 영역에 L235E-G236R 또는 L235E-D265A 비-활성화 돌연변이의 도입 시 항-인간 CD20 항체에 의한 CDC를 유도하는 능력을 평가하였다. 여기서, 본 발명자들은 프로메가 리포터 검정에서 표적-발현 Raji 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주를 사용하여, 항-인간 CD20 IgG1, IgG3 및 IgG4 항체 및 HC 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화 및 신호전달을 평가하였다.
실시예 34에 표시된 바와 같이, 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화 및 신호전달을 리포터 생물검정 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C01; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G988A; FcγRIIb: Cat # CS1781E01; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G701A)을 사용하여 실시예 7에 기재된 절차에 따라 표적 세포로서 CD20-발현 Raji 세포를 사용하여 정량화하였다. 배지-단독 대조군 샘플 (Raji 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음)에 의해 결정된 바와 같은 배경 발광 신호를 추가의 분석 전에 모든 샘플로부터 차감하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군 (오직 Raji 세포 및 이펙터 세포)을 사용하여 계산하였다. 실험당, AUC 값을 비-결합 대조군 IgG1-b12와 함께 인큐베이션한 세포에 대해 관찰된 리포터 활성 (0%) 및 야생형 IgG1의 활성 (100%)에 대해 정규화하였다. 데이터는 2회의 독립적 반복으로부터의 평균 값 ± SEM이다.
프로메가 리포터 검정을 사용한 인간 FcγR-매개 활성화의 평가는 야생형 인간 IgG1이 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화를 효율적으로 유도하였음을 밝혀내었다 (도 25). IgG1과 비교하여, 야생형 인간 IgG4에 의한 FcγR-매개 활성화의 평가는 증가된 FcγRIa- 및 FcγRIIb-매개 활성화 (도 25a, c), 감소된 FcγRIIa-매개 활성화 (도 25b), 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 결여 (도 25d)를 밝혀내었다. 인간 IgG3 동종이형 IGHG3*01 (IgG3) 야생형 항체 변이체에 의한 FcγR-매개 활성화의 평가는 FcγRIIa- 및 FcγRIIb-매개 활성화의 결여 (도 25b, c) 및 FcγRIa- 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 단지 약간의 유도 (도 25a, d)를 밝혀내었다. 대조적으로, 인간 IgG3 동종이형 IGHG3*04 (IgG3rch2) 야생형 항체 변이체는 인간 IgG3 동종이형 IGHG3*01에 의한 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화와 비교할 경우 증가된 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화를 나타내었지만, FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa의 경우 FcγR-매개 활성화의 수준은 야생형 인간 IgG1과 비교하여 여전히 감소되었다 (도 25). 항-인간 CD20 IgG1, IgG3, 또는 IgG4 항체 변이체에 의한 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb-, 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 평가는 중쇄 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R 또는 L234F-L235E-D265A (IgG1, IgG3, 및 IgG3rch2)의 도입 또는 L235E-G236R 또는 L235E-D265A (IgG4) 비-활성화 돌연변이의 도입이 모든 시험된 FcγR의 활성화를 효율적으로 제거하였음을 밝혀내었다 (도 25).
요약하면, 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R (또는 IgG4의 경우 L235E-G236R)은, 이들 비-활성화 돌연변이가 IgG1, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역에 도입되었는지에 관계없이, 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 FcγR-매개 활성화를 효율적으로 제거하였다.
실시예 36: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 인간 Fcγ 수용체에 대한 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도
면역결핍 마우스를 사용하는 전임상 이종이식편 모델은 종종 종양-특이적 항체를 사용하는 치료 개념을 확립하는 데 사용된다. 그러나, 보다 복잡한 치료 의문은 치료 항체의 생물학 및 효능을 정확하게 포획하는 면역적격 마우스의 사용을 필요로 한다. 이러한 경우에, 뮤린 이펙터 분자와 항체의 자연 상호작용을 가능하게 하기 위해 대용물 마우스 항체가 요구된다. 실시예 27-29에서는 인간, 뮤린 및 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG1 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도를 평가한 반면, 여기서 본 발명자들은 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역에 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R을 도입하는 것이 인간 FcγR에 대한 결합을 방지하는지 조사하였다. 뮤린 FcγR에 대한 이들 변이체의 결합 친화도는 실시예 37에서 평가될 것이다.
여기서, 본 발명자들은 본질적으로 실시예 27에 기재된 바와 같이 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 동종이형 158V의 단량체 세포외 도메인 (ECD)에 대한 야생형 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 및 L234A-L235A, L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도를 평가하였다. 간략하게, 인간 FcγRIa에 대해, Ni-NTA 센서에 인간 FcγRIa를 로딩한 후에, 샘플 희석제 중 기준선 측정 (100초)을 수행하였다. 후속적으로, 야생형 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 그의 비-활성화 변이체의 회합 (300초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 인간 FcγRIa에 대한 항체의 결합을 1.56 - 100 nM (야생형 IgG2a의 경우; 2-배 희석) 또는 15.6 - 1000 nM (IgG2a-L234A-L235A, IgG2a-L234F-L235E-G236R, 및 IgG2a-L234A-L235A-P329G의 경우; 2-배 희석)의 농도 범위를 사용하여 시험하였다. 데이터를 실시예 27에 기재된 바와 같이 분석하였고, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 50초 해리가 관심 윈도우로서 사용된 IgG2a-L234A-L235A를 제외하고, 모든 항체 변이체에 대한 분석을 위해 400초 해리를 관심 윈도우로서 사용하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, 전반적 (전체) 피트는 달리 나타내지 않는 한 >3 곡선 피트 (신뢰성 있는 분석)에 기초한다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
인간 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 결합의 평가를 본질적으로 실시예 27에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서에 인간 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 또는 FcγRIIIa 동종이형 158V를 로딩한 후, 샘플 희석제 중 기준선 측정 (100초)을 수행하였다. 후속적으로, 뮤린 항-인간 CD20 항체 IgG2a 야생형 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (50초, FcγRIIa 또는 FcγRIIb; 300초, FcγRIIIa) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 항체의 결합을 다양한 농도 (FcγRIIa, 156.25 - 10000 nM, 2-배 희석; FcγRIIb, 250 - 16000 nM, 2-배 희석; FcγRIIIa, 125 - 8000 nM, 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 실시예 27에 기재된 바와 같이 분석하였다. 뮤린 IgG2a와 낮은 친화도 Fcγ 수용체 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V 사이의 낮은 친화도로 인해, 정상 상태 분석 (SSA)을 선택하여 KD (M)를 결정하였다. 간략하게, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 R-평형 (Req) 함수를 사용하여 상이한 항체 농도에 대한 정상-상태 반응 (센소그램이 회합 단계에서 플래토에 도달한 경우)을 계산하고, 후속적으로 정상-상태 반응을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 최종적으로 랭뮤어 모델을 사용하여 KD (M)를 계산하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, SSA는 >3 회합 곡선 피트에 기초하며, 각각의 항체 농도에 대해 플롯팅된 정상-상태 반응은 달리 나타내지 않는 한 최대 결합 반응의 적절한 계산을 허용하는 플래토에 도달하였다 (신뢰할 수 있는 분석). 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
생물층 간섭측정법을 사용한 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체의 결합의 평가는 야생형 뮤린 IgG2a가 FcγRIa에 대해 1.27 nM, FcγRIIa 동종이형 131H에 대해 1.85 μM, FcγRIIb에 대해 17 μM, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대해 1.95 μM의 결합 친화도로 모든 시험된 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내었음을 밝혀내었다 (표 21). 대조적으로, 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a 항체 변이체는 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 결합을 나타내지 않았다 (표 21). 중쇄 불변 영역에 L234A-L235A 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a는 인간 FcγRIIa 동종이형 131H 및 FcγRIIb에 대한 결합을 나타내지 않았다. 분석은 IgG2a-L234A-L235A의 인간 FcγRIa (KD = 3.6 μM; 단지 3개의 농도 곡선 피트에 기초한 전반적 (전체) 피트 분석) 및 인간 FcγRIIIa 동종이형 158V (KD = 13.8 μM; 정상-상태 반응은 플래토에 도달하지 않았음)에 대한 낮은 잔류 결합을 나타내었다 (표 21).
요약하면, 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 불변 영역에 L234F-L235-G236R 비-활성화 돌연변이를 도입하는 것은, L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a 항체와 유사하게, 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 결합을 방지하였다.
표 21: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체에 의한 인간 FcγR 결합 친화도. 높은 친화도 수용체 FcγRIa에 대해, KD (M), kon (1/Ms), 및 koff (1/s)가 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델에 기초하여 제시된다. 낮은 친화도 수용체 FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대해, KD (M)는 정상 상태 분석에 기초하여 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다. 시험된 변이체는 IgG2a, IgG2a-FER, IgG2a-LALA 및 IgG2a-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, LALA: L234A-L235A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다. SSA: 정상 상태 분석, BLI: 생물층 간섭측정법, nb: 결합 없음, n/a: 적용가능하지 않음.
1 FcγRIa에 대한 IgG2a-LALA 결합 - 분석은 최적이 아니고, 전반적 (전체) 피트 분석의 경우 <4 피트
2 FcγRIIIa(V)에 대한 IgG2a-LALA 결합 - 분석은 최적이 아니고, 정상-상태 반응은 플래토에 도달하지 않았다
실시예 37: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된, 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 결합 친화도
실시예 36에서, 인간 FcγR에 대한 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 비-활성화 항체의 결합 친화도를 평가하였다. 여기서, 본 발명자들은 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역에 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R을 도입하는 것이 뮤린 FcγR에 대한 결합을 방지하는지를 조사하였다.
뮤린 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, 및 FcγRIV의 단량체 세포외 도메인 (ECD)에 대한 실시예 36에 기재된 뮤린 항-인간 CD20 항체의 결합 친화도를 본질적으로 실시예 28에 기재된 바와 같이 옥텟 HTX 기기 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 평가하였다. 간략하게, 뮤린 FcγRI에 대해, Ni-NTA 센서에 뮤린 FcγRI를 로딩한 후에, 샘플 희석제 중 기준선 측정 (100초)을 수행하였다. 후속적으로, L234A-L235A, L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 야생형 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 및 그의 비-활성화 변이체의 회합 (300초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 뮤린 FcγRI에 대한 항체의 결합을 1.56 - 100 nM (야생형 IgG2a의 경우; 2-배 희석) 또는 15.6 - 1000 nM (IgG2a-L234A-L235A, IgG2a-L234F-L235E-G236R, 및 IgG2a-L234A-L235A-P329G의 경우; 2-배 희석)의 농도 범위를 사용하여 시험하였다. 데이터를 실시예 28에 기재된 바와 같이 분석하였고, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 400초 해리를 모든 항체 변이체에 대한 분석을 위한 관심 윈도우로서 사용하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, 전반적 (전체) 피트는 달리 나타내지 않는 한 >3 곡선 피트 (신뢰성 있는 분석)에 기초한다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
뮤린 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 결합 친화도의 평가를 본질적으로 실시예 28에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서에 뮤린 FcγRIIb, FcγRIII 또는 FcγRIV를 로딩한 후, 샘플 희석제 중 기준선 측정 (100초)을 수행하였다. 후속적으로, 야생형 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 및 L234A-L235A, L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체의 회합 (50초, FcγRIIb 또는 FcγRIII; 300초, FcγRIV) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 뮤린 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 항체의 결합을 다양한 농도 (FcγRIIb, 187.5 - 12,000 nM, 2-배 희석; FcγRIII, 156.25 - 10,000 nM, 2-배 희석; FcγRIV, IgG2a, IgG2a-L234F-L235E-G236R 및 IgG2a-L234A-L235A-P329G의 경우 15.63 - 1,000 nM 또는 IgG2a-L234A-L235A의 경우 156.3 - 10,000 nM, 2-배 희석)를 사용하여 시험하였다. 데이터를 실시예 28에 기재된 바와 같이 분석하였다. 뮤린 IgG2a와 낮은 친화도 Fcγ 수용체 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV 사이의 낮은 친화도로 인해, 정상 상태 분석 (SSA)을 선택하여 KD (M)를 결정하였다. 간략하게, 반응 값 < 0.05는 분석에서 제외하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 R-평형 (Req) 함수를 사용하여 상이한 항체 농도에 대한 정상-상태 반응 (센소그램이 회합 단계에서 플래토에 도달한 경우)을 계산하고, 후속적으로 정상-상태 반응을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 최종적으로 랭뮤어 모델을 사용하여 KD (M)를 계산하였다. 최적 피트는 >0.98의 전체 R2 값에 의해 결정되었고, 이는 피트 및 실험 데이터가 유의하게 상관되었음을 나타낸다. 또한, SSA는 >3 회합 곡선 피트에 기초하며, 각각의 항체 농도에 대해 플롯팅된 정상-상태 반응은 달리 나타내지 않는 한 최대 결합 반응의 적절한 계산을 허용하는 플래토에 도달하였다 (신뢰할 수 있는 분석). 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다.
생물층 간섭측정법을 사용한 뮤린 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체의 결합의 평가는 야생형 뮤린 IgG2a가 FcγRI에 대해 대략 3.8 nM, FcγRIIb에 대해 6.4 μM, FcγRIII에 대해 6.9 μM, 및 FcγRIV에 대해 0.15 μM의 결합 친화도로 모든 시험된 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타내었음을 밝혀내었다 (표 22). 대조적으로, 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a 항체 변이체는 뮤린 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 결합을 나타내지 않았다 (표 22). 또한, 뮤린 FcγRI에 대한 IgG2a-L234F-L235E-G236R 또는 IgG2a-L234A-L235A-P329G의 결합 친화도는 야생형 IgG2a와 비교하여 크게 감소되었지만 (100-배), 분석은 최적이 아니었다 (전반적 (전체) 피트 분석의 경우 <4 피트) (표 22). 뮤린 IgG2a-L234A-L235A는 뮤린 FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 결합을 나타내지 않았지만, 뮤린 FcγRI (wt IgG2a와 비교하여 100-150-배 감소) 및 FcγRIV (wt IgG2a와 비교하여 100-배 감소)에 대한 낮은 잔류 결합을 나타내었다 (표 22).
요약하면, L234F-L235-G236R 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a 항체 변이체는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 IgG2a 항체와 유사하게 뮤린 FcγR 결합을 나타내지 않거나 (FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV) 또는 크게 감소된 결합을 나타내었다 (FcγRI).
표 22: 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은, 중쇄 불변 영역에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 뮤린 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체에 의한 뮤린 FcγR 결합 친화도. 높은 친화도 수용체 FcγRI에 대해, KD (M), kon (1/Ms), 및 koff (1/s)가 전반적 (전체) 피트를 사용하여 1:1 모델에 기초하여 제시된다. 낮은 친화도 수용체 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대해, KD (M)는 정상 상태 분석에 기초하여 제시된다. 제시된 데이터는 2회의 독립적 반복의 평균 값 ± SD이다. 시험된 변이체는 IgG2a, IgG2a-FER, IgG2a-LALA 및 IgG2a-LALAPG이며, 여기서 FER: L234F-L235E-G236R, LALA: L234A-L235A 및 LALAPG: L234A-L235A-P329G이다. SSA: 정상 상태 분석, BLI: 생물층 간섭측정법, nb: 결합 없음, n/a: 적용가능하지 않음.
1 FcγRI에 대한 IgG2a-FER & -LALAPG 결합 - 분석은 최적이 아니고, 전반적 (전체) 피트 분석의 경우 <4 피트
2 FcγRIV에 대한 IgG2a-LALA 결합 - 분석은 최적이 아니고, 정상-상태 반응은 플래토에 도달하지 않았다
실시예 38: 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 의한 인간 Fcγ 수용체를 통한 활성화 및 신호전달
실시예 36은 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역에 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이를 도입하는 것이 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같이 인간 FcγRIa, FcγRIIa 동종이형 131H, FcγRIIb 및 FcγRIIIa 동종이형 158V에 대한 결합을 효율적으로 방지하였다는 것을 보여주었다. 그러나, 이러한 검정에서, 이펙터 세포에 대한 Fc-수용체의 항원-결합, 표적-매개 항체 클러스터링 및 후속 표적-매개 클러스터링의 효과는 부재하였다. 여기서, 본 발명자들은 프로메가 리포터 검정에서 표적-발현 Raji 세포 및 표시된 FcγR을 발현하는 Jurkat 리포터 세포주를 사용하여, 야생형 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 중쇄 불변 영역에 L234F-L235E-G236R, L234A-L235A, 또는 L234A-L235A-P329G 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체에 의한 인간 FcγR 활성화 및 신호전달을 평가하였다.
상기 언급된 뮤린 IgG2a 항-인간 CD20 항체 변이체에 의한 인간 FcγR-매개 신호전달의 활성화를 리포터 생물검정 (프로메가, FcγRIa: Cat # CS1781C01; FcγRIIa 동종이형 131H: Cat # G988A; FcγRIIb: Cat # CS1781E01; FcγRIIIa 동종이형 158V: Cat # G701A)을 사용하여 실시예 7에 기재된 절차에 따라 표적 세포로서 CD20-발현 Raji 세포를 사용하여 정량화하였다. 배지-단독 대조군 샘플 (Raji 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음)에 의해 결정된 바와 같은 배경 발광 신호를 추가의 분석 전에 모든 샘플로부터 차감하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 사용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군 (오직 Raji 세포 및 이펙터 세포)을 사용하여 계산하였다. 실험당, AUC 값을 비-결합 대조군 IgG2a-b12와 함께 인큐베이션한 세포에 대해 관찰된 리포터 활성 (0%) 및 야생형 IgG2a-CD20의 활성 (100%)에 대해 정규화하였다. 데이터는 2회의 독립적 반복으로부터의 평균 값 ± SEM이다.
프로메가 리포터 검정을 사용한 인간 FcγRIa-, FcγRIIa-, FcγRIIb- 및 FcγRIIIa-매개 활성화의 평가는 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이의 도입이 IgG2a 비-활성화 변이체 L234A-L235A-P329G와 대등하게 FcγR-매개 활성화를 효율적으로 억제하였음을 밝혀내었다 (도 26). FcγR-매개 활성화의 결여가 또한 IgG2a-L234A-L235A에 대해 관찰되었고 (도 26b-d), 단 FcγRIa를 통해 매개된 부분적 활성화 (도 26a)는 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같은 인간 FcγRIa에 대한 IgG2a-L234A-L235A에 대해 관찰된 낮은 잔류 결합과 일치한다 (실시예 36).
요약하면, 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체의 중쇄 불변 영역에의 L234F-L235E-G236R 비-활성화 돌연변이의 도입은 비-활성화 항체 변이체 IgG2a-L234A-L235A-P329G와 대등하게 인간 FcγR-매개 활성화를 효율적으로 제거하였다.
실시예 39: 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 그의 비-활성화 변이체에 대한 C1q 결합 및 그에 의한 보체-의존성 세포독성
이전의 실시예에서, 항-인간 CD20 인간 IgG1 항체의 중쇄 (HC) 불변 영역 내에의 L234F-L235E-G236R (FER) 비-활성화 돌연변이의 도입은 보체 인자 C1q와 결속하는 능력, 뿐만 아니라 CDC를 유도하는 능력의 거의 완전한 제거를 발생시켰음이 제시되었다. 여기서는, 야생형 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 HC에 FER, L234A-L235A, 또는 L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 그의 비-활성화 변이체의 인간 보체 인자 C1q에 결합하는 능력, 뿐만 아니라 CDC를 유도하는 능력을 평가하였다.
상기 기재된 바와 같은 야생형 항-인간 CD20 뮤린 IgG2a 항체 및 HC에 비-활성화 돌연변이를 보유하는 그의 변이체를, 본질적으로 실시예 4에 기재된 절차에 따라, C1q의 공급원으로서 20% 정상 인간 혈청 (NHS, cat. no. M0008, 산퀸)의 존재 하에 다양한 농도 (0.0024 - 10 μg/mL 최종 농도; 4-배 희석)를 사용하여 Raji 세포 (3x104개 세포/웰)에 대한 C1q 결합 검정에서 시험하였다. 항체 변이체에 대한 C1q 결합을 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 중앙 형광 강도-FITC를 측정함으로써 검출하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 용량-반응 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 비-결합 대조군 항체 IgG2a-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체 (100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
C1q 결합 검정에서 시험된 동일한 항체 변이체를 시험관내 CDC 검정에서 시험하였다. 항체 변이체를 본질적으로 실시예 3에 추가로 기재된 바와 같이, 웰당 3x104개의 Raji 세포를 사용하여 다양한 농도 (0.0024-10 μg/mL 최종 농도; 4-배 희석)에서 시험하였다. PI-양성 세포의 수를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 (사르토리우스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포 용해의 백분율에 상응하는 PI-양성 세포의 백분율을 (PI-양성 세포의 수 /세포의 총수) x 100%로서 계산하였다. 데이터를 비-선형 효능제 용량-반응 모델을 이용하여 분석하고, 실험 반복당 AUC를 그래프패드 프리즘 (버전 8.4.1, 그래프패드 소프트웨어)에서 로그-변환된 농도를 사용하여 기준선으로서 항체 부재 대조군을 사용하여 계산한 후, 비-결합 대조군 항체 IgG2a-b12에 대해 측정된 AUC 값 (0%) 및 야생형 항-인간 CD20 IgG2a 항체 변이체 (100%)에 대해 측정된 AUC 값에 대해 실험 반복당 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험으로부터 수득된 평균 값 ± SEM이다.
뮤린 IgG2a-CD20 변이체에 대한 C1q의 결합의 평가는 야생형 IgG2a-CD20이 표적 Raji 세포 상의 CD20에의 결합 시 보체 단백질 C1q와 효율적으로 결속한다는 것을 밝혀내었다 (도 27). HC에 L234A-L235A-P329G 돌연변이를 보유하는 비-활성화 변이체는 보체 단백질 C1q에 대한 결합을 효율적으로 제거하였다 (도 27). 그러나, 뮤린 IgG2a 항체의 HC에 L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A 비-활성화 돌연변이의 도입 시, C1q에 대한 감소되었지만 잔류하는 결합이 관찰되었다 (도 27).
동일한 IgG2a-CD20 변이체의 CDC-유도 능력의 평가는 C1q 결합에 대한 결과와 일치하는 결과를 밝혀내었다. 뮤린 IgG2a 항체의 HC에의 비-활성화 L234A-L235A-P329G 돌연변이의 도입은 CDC를 유도하는 능력의 거의 완전한 제거를 발생시켰다 (도 28). 또한, 뮤린 IgG2a 항체의 HC에의 L234F-L235E-G236R 또는 L234A-L235A 비-활성화 돌연변이의 도입은 CDC의 감소를 발생시켰지만, 잔류 CDC는 여전히 관찰되었다 (도 28).
요약하면, 뮤린 IgG2a 항체에의 비-활성화 돌연변이 L234F-L235E-G236R의 도입은 보체 인자 C1q와 결속하는 능력뿐만 아니라 CDC를 유도하는 능력의 감소를 발생시켰지만 완전한 억제는 발생시키지 않았다. 따라서, FER 비-활성화 돌연변이의 도입은 인간 C1q와 결속하고 인간 및 뮤린 IgG 항체 둘 다의 CDC를 유도하는 능력을 감소시킨 것으로 결론지어졌다.
SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S de Kreuk, Bart-Jan Hibbert, Richard G Schuurman, Janine Labrijn, Aran Frank <120> NON-ACTIVATING ANTIBODY VARIANTS <130> P/0172-WO-PCT <150> EP 21162341.8 <151> 2021-03-12 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 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<212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CH1, hinge, CH2 and CH3 region of human IgG1 allotype G1m(fa) with FER substitution <400> 27 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 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allotype G1m(zav) with FER substitution <400> 31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 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Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp 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Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CH1, hinge, CH2 and CH3 region of human IgG1 allotype G1m(zax) with FEA substitution <400> 34 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly 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Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 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IgG3 allotype IGHG3*01 with FER substitution <400> 42 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 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Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys 165 170 175 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 180 185 190 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 195 200 205 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 210 215 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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys 165 170 175 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 180 185 190 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 195 200 205 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 210 215 220 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 225 230 235 240 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 245 250 255 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 47 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CH1, hinge, CH2 and CH3 region of human IgG4 with L235E-G236R substitution <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 48 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CH1, hinge, CH2 and CH3 region of constant region of human IgG4 with L235E-D265A substitution <400> 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105

Claims (39)

  1. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단백질로서, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개는 변형되고 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 위치는 Eu 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 것인 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 1개에서 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산이 각각 F, E 및 R로 치환된 것인 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 중 하나가 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 다른 것이 변형되고 위치 L234, L235, 및 D265의 아미노산에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A인 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다가 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하는 것인 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 CH1 영역을 포함하는 것인 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 결합 영역을 포함하는 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 영역이 각각 제1 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 제1 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 결합 영역이 제2 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역인 단백질.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 중쇄이고, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 이뮤노글로불린 경쇄 불변 영역 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 불변 영역을 포함하는 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하며, 상기 이뮤노글로불린 경쇄는 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 상기 각각의 제1 및 제2 이뮤노글로불린 불변 경쇄 영역을 포함하는 것인 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 이뮤노글로불린 경쇄가 디술피드 가교를 통해 상기 제1 이뮤노글로불린 중쇄와 연결되고, 상기 제2 이뮤노글로불린 경쇄가 디술피드 가교를 통해 상기 제2 이뮤노글로불린 중쇄와 연결되어, 각각 상기 제1 결합 영역 및 상기 제2 결합 영역을 형성하고, 상기 제1 및 제2 이뮤노글로불린 중쇄가 디술피드 가교를 통해 연결된 것인 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 단백질.
  14. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체인 단백질.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 추가의 아미노산 치환, 바람직하게는 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 치환, 예컨대 F405L 또는 K409R을 포함하는 것인 단백질.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체가 세포 표적, 시토카인, 독소, 병원체, 암 항원, 혈장 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 것인 단백질.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 제1 및 제2 폴리펩티드로부터의 각각의 CH2 및 CH3 영역의 서열이 상이하도록 상기 각각의 CH2 및 CH3 영역에서 추가의 치환을 포함하며, 상기 치환은 상기 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 상기 폴리펩티드를 수득하는 것을 가능하게 하는 것인 이중특이적 항체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 폴리펩티드에서 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 폴리펩티드의 상기 치환은 동일한 위치에 존재하지 않는 것인 이중특이적 항체.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드에서 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 L이고, 상기 제2 폴리펩티드에서 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 R이거나, 또는 그 반대인 이중특이적 항체.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 F, E 및 R로의 치환, 및 상기 제1 폴리펩티드에서 위치 F405의 아미노산의 L로의 치환, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 K409의 아미노산의 R로의 치환 또는 그 반대로 이루어진, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다에서 변형을 갖는 이중특이적 항체.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 제1항 내지 제4항 및 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 치환으로 이루어진 치환을 갖는 것인 이중특이적 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에 포함된 상기 아미노산 서열이 제1항 내지 제4항 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는 것인 단백질 또는 이중특이적 항체.
  25. 제24항에 있어서, 서열식별번호: 1에 따른 상기 아미노산 서열이 말단 리신을 포함하지 않는 것인 단백질 또는 이중특이적 항체.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역 중 하나가 암 항원에 결합하는 것인 이중특이적 항체.
  27. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역 중 하나가 이펙터 세포, 예컨대 T-세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포 또는 호중구에 결합하는 것인 이중특이적 항체.
  28. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 영역 중 하나가 이펙터 세포, 예컨대 T-세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포 또는 호중구에 결합하고, 다른 결합 영역이 암 항원에 결합하는 것인 이중특이적 항체.
  29. 제4항 내지 제17항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로서, 여기서 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드는 아미노산 L234, L235 및 G236에 상응하는 아미노산의 상기 치환을 포함하고, 바람직하게는 여기서 위치 L234, L235 및 G236의 상기 치환은 각각 F, E 및 R에 의한 것인 핵산.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 중쇄인 핵산.
  31. 제29항 또는 제30항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  33. 제1항 내지 제28항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료에 사용하기 위한 단백질, 또는 이중특이적 항체, 또는 제약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 사용이 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 포함하는 것인 단백질, 이중특이적 항체, 또는 제약 조성물.
  35. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 또는 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제32항에 따른 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 대상체가 질환, 예컨대 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 것인 치료 방법.
  37. 하기를 포함하는, 이중특이적 항체를 제조하는 방법:
    f) a. 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는, 인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
    b. 이뮤노글로불린 경쇄
    를 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계;
    g) a.
    - 위치 L234, L235 및 D265의 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서 바람직하게는 상기 치환은 각각 F, E 및 A이거나, 또는
    - 위치 L234, L235 및 G236의 아미노산의 각각 F, E 및 R로의 치환을 포함하는
    인간 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄의 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 각각 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄,
    b. 이뮤노글로불린 경쇄
    를 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계;
    h) 여기서 상기 각각의 제1 및 제2 항체의 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용 각각보다 더 강하도록 하는 것인 단계;
    i) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
    j) 상기 제1 항체의 상기 제1 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제1 이뮤노글로불린 경쇄 및 상기 제2 항체의 상기 제2 이뮤노글로불린 중쇄 및 상기 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 상기 이중특이적 항체를 수득하는 단계.
  38. 제37항에 있어서, 단계 c)에서 상기 서열에서의 차이가 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 것인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법.
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