CN116964085A - 非激活抗体变体 - Google Patents

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Abstract

本文描述了包含Fc区等的蛋白，例如单克隆、双特异性和多特异性抗体，其中所述Fc区已被修饰以消除或强烈降低Fc‑介导的效应子功能，同时允许良好的可开发性，用于治疗目的以及不期望这种效应子功能的场合。

Description

非激活抗体变体
发明领域
本发明涉及包含Fc区等的多肽，例如单克隆、双特异性和多特异性抗体，其中所述Fc区已被修饰以消除或强烈降低Fc-介导的效应子功能，同时允许即良好的可开发性，用于治疗目的以及不期望这种效应子功能的场合。
引言
抗体已被证明作为治疗用分子是成功的，特别是用于癌症治疗和免疫调谐。肿瘤靶特异性抗体可以实现肿瘤细胞的细胞毒性，一般经由Fc-介导的效应子功能，例如依赖补体的细胞毒性(CDC)、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)或依赖抗体的细胞介导的吞噬作用(ADCP)。免疫细胞靶向抗体可以增加免疫系统的细胞，例如T细胞和巨噬细胞，其本身又可以促进肿瘤细胞的细胞毒性。靶向免疫系统的组分的抗体可用于调谐免疫系统功能。
在某些情况下，通过抗体疗法激活免疫系统或其组分可能是不期望的，例如当应用于(i)系统性中和细胞因子、(ii)阻断特定免疫细胞受体或(iii)当使用双特异性抗体用于使效应细胞改方向到靶患病组织时(Kang等人，Exp.Mol.Med.2019；51(11):1-9)。例如，靶向免疫细胞的抗体经由其Fc区与补体成分C1q的接合可能起始经典补体系统的激活，从而导致例如靶免疫细胞的CDC，这是不期望的。同样，抗体Fc区还可能结合在许多免疫细胞上表达的Fc受体，从而导致效应细胞不必要的排除，或通过高水平细胞因子分泌诱导免疫相关的毒性。
为了避免不期望的Fc-介导的效应子功能，抗体已被人工改造以在Fc部分中携带突变(也称为非激活突变)，其抑制或消除一些或全部Fc-介导的效应子机制。
已经开发了大量不同的非激活抗体形式，其中氨基酸取代及其组合已被引入IgG1同种型抗体的恒定重链区中以消除Fc-介导的效应子功能(例如，Chiu等人,Antibodies2019年12月；8(4):55；Liu等人,Antibodies,2020年11月17日；9(4):64；29(10):457-66；Shields等人,JBiol Chem.,2001年3月2日；276(9):6591-604)。这种取代的实例包括N297G非激活突变的引入(Tao和Morrison,JImmunol1989；143(8):2595-601)、E233P-L234V-L235A-delG236-S267K非激活突变的引入(Moore等人,Methods2019；154:38-50)、L234A-L235A-P329G非激活突变的引入(Schlothauer等人,Protein Eng.Design and Selection2016；29(10):457-66)或L234F-L235E-D265A非激活突变(本文中也称为FEA或FEA形式，Engelberts等人,EBioMedicine2020；52:102625；US10590206B2)。使用IgG4(具有降低的效应子功能的IgG亚类之一)和抗体恒定重链区中的氨基酸取代结合开发了其他非激活形式，以进一步消除Fc-介导的效应子功能(例如WO2015/143079中描述的E233P-F234V-L235A-G236del非激活突变的引入，或由(Vafa等人，Methods 2014；65:114-126)描述的F234A-L235A非激活突变的引入。
然而，作为这种抗体工程的结果，可能出现可开发性和可制造性问题，其可能限制抗体作为疗法的可能开发。例如，病毒灭活构成开发可能的抗体疗法的关键步骤。标准病毒灭活规程需要保持低pH。然而，人工改造的蛋白(例如抗体)可能对低pH条件有不同的反应，从而可能导致蛋白不稳定性。例如，在抗体开发和可制造性中需要评估的其他条件是重复的冻融循环和贮藏温度的变化。因此，期望提供抗体疗法的人工改造，其允许在暴露于这种条件等时保持蛋白稳定性，这是因为其使得容易地制造和分配以及这种产品的临床用途成为可能。
因此，需要提供适合于缺乏Fc-介导的效应子功能且可以容易地开发和制造用于治疗用途的抗体的进一步的非激活形式。
发明概述
L234F-L235E-D265A非激活突变(在本文中也称为FEA或FEA形式)已被表明具有优异的安全性概况和强烈抑制Fc-介导的效应子功能的能力。然而，观察到对于作为依赖补体的细胞毒性(CDC)的有效诱导物的IgG1抗体，携带FEA突变可以显示一些残留的CDC(参见尤其实施例3和5)。此外，观察到与野生型IgG1 Fc区相比，作为其N-聚糖的额外加工的结果，具有FEA形式的重组表达的抗体可表现出增加的糖基化异质性(数据未显示，且也参见实施例14)并且还显示出更容易受到低pH条件诱导的聚集的影响(参见例如实施例20)。
因此，本发明人力图提供改进的非激活形式，其可以避免残留的CDC活性、可以提供野生型样糖基化概况和/或可以对低pH条件更加耐受。令人惊讶的是，当发明人将突变L234F、L235E和G236R(在本文中也称为FER或FER形式)组合在IgG1抗体中时，这产生了改进的惰性形式，其能够避免可能的残留CDC活性，从而提供野生型样糖基化并具有改善的对低pH条件的耐受性。因此，本发明人现在提供了高度有利的进一步的非激活抗体形式，其非常适合于临床开发和临床用途。如实施例部分中所示的，也可用于除抗体以外的背景如例如融合蛋白的所述进一步的非激活形式可被认为是同类最优(best-in-class)的非激活形式。
因此，本发明提供了具有人IgG1 Fc区的多肽的新惰性形式，所述区域根据Eu编号在位置234、235和236处具有取代，优选地分别具有取代F、E和R。所述惰性形式对于单特异性和双特异性抗体特别有用。这种多肽，例如具有根据本发明的这种取代的单特异性或双特异性抗体可被称为具有非激活IgG1 Fc区。
对于双特异性抗体，所述惰性形式还可以就惰性形式取代而论以异二聚体形式组合，例如，双特异性抗体可以由携带根据本发明的惰性形式取代的一条链组成，而另一条链可以包含不同的惰性形式取代，例如FEA。因此，根据本发明的惰性形式非常适合于在不需要重新设计和重做所有需要的测定的情况下例如与已经经历开发用于临床用途的现有候选抗体组合，从而允许随即利用诸如受控Fab-臂交换的技术快速生成双特异性抗体。
因此，在一个实施方案中，提供了包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一和第二多肽各自分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，其中所述第一和第二多肽中的至少一个被修饰并包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸取代，其中氨基酸位置如通过Eu编号所定义。如所述的，优选地，所述第一和第二多肽的至少一个中的位置L234、L235和G236处的氨基酸分别被F、E和R取代。
在另一个实施方案中，提供了根据本发明的所述蛋白，其中第一和第二多肽之一包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的所述取代，且另一个被修饰且包含对应于位置L234、L235和D265处的氨基酸的氨基酸的取代，其中优选地，所述取代分别是F、E和A。
在另一个进一步的实施方案中，提供了根据本发明的所述蛋白，其中第一和第二多肽两者均包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸的取代。
可以理解的是，根据本发明的蛋白可以是可受益于具有非激活Fc区的任何蛋白。这可以包括融合蛋白，其中例如功能结构域与Fc区融合，从而为功能结构域提供例如改善的血浆半衰期。
如所述的，根据本发明的蛋白优选包含第一和第二结合区。根据本发明的具有第一和第二结合区的示例性且优选的蛋白是抗体。
因此，在另一个进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白是抗体。在另一个进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白或抗体中蛋白的第一和第二多肽是相同的。在另一个实施方案中，这种抗体(因为这些一般可具有相同的结合结构域)是单特异性抗体。这种单特异性抗体接着可用于产生根据本发明的双特异性抗体。
因此，在又另一个进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白是双特异性抗体。优选地，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽在所述各自的CH2和CH3区中包含进一步的取代，从而使得来自所述第一和第二多肽的各自的CH2和CH3区的序列不同，所述取代允许获得包含所述第一和第二多肽的所述多肽。这种取代的优选实例包括使第一和第二多肽之一包含位置F405处的氨基酸被L取代，且另一个在位置K409处被R取代。另一方面，根据本发明可以预期允许提供异二聚体的其他取代或方法(尤其组合不同的第一和第二多肽以提供双特异性抗体)。
因此，在一个实施方案中，提供了用于制备根据本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)提供第一抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
b)提供第二抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含在下述的氨基酸的取代
-位置L234、L235和D265，其中优选地，所述取代分别是F、E和A，或者，
-包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
c)其中所述各自的第一和第二抗体的所述第一和第二CH3区的序列不同，并且是这样的，从而使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的同二聚体相互作用中的每一个；
d)在足以允许铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和
e)获得包含所述第一抗体的所述第一免疫球蛋白重链和所述第一免疫球蛋白轻链以及所述第二抗体的所述第二免疫球蛋白重链和所述第二免疫球蛋白轻链的所述双特异性抗体。
附图简述
图1显示了抗人CD20抗体变体的靶结合。显示了由在重链中携带非激活突变的IgG1和IgG4抗体变体与Raji细胞上存在的CD20的结合。结合表示为抗体浓度对中值MFI-PE(数据集分为A和B)。数据是从四次独立重复实验获得的平均值±SEM。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG1-b12、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图2显示了Raji细胞通过在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20抗体变体的CDC。使用NHS作为补体来源评估了由在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1-和IgG4_抗体变体诱导的CD20-阳性Raji细胞的CDC。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于非结合对照抗体IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从三次独立重复实验获得的平均值±SEM。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG1-b12、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图3显示了通过在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1-抗体变体的C1q结合。结合表示为抗体浓度对中值MFI-FITC。数据是从单个实验的三重测量获得的平均值(±SD)。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1、IgG1-b12，其中FEA:L234F-L235E-D265A以及FER:L234F-L235E-G236R。
图4显示了由在恒定重链区中携带非激活突变的抗人HLA-DR抗体变体诱导的Raji细胞的CDC。由在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1-HLA-DR-4(A)和IgG1-HLA-DR-1D09C3(B)抗体变体以及HLA-DR-靶向F(ab’)2片段诱导的Raji细胞的CDC使用NHS作为补体来源在体外CDC测定中进行评估。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于携带K409R突变的IgG1抗体(IgG1-K409R，100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据为来自五次(野生型和L234F-L235E-D265A-K409R变体)或两次(L234F-L235E-G236R-K409R变体，或F(ab’)2片段)独立重复实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-K409R、F(ab’)2，其中FEA:L234F-L235E-D265A以及FER:L234F-L235E-G236R。
图5显示了抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体到ELISA平板的捕获。通过抗人-IgG F(ab’)2片段将在重链区中具有非激活突变的IgG1和IgG4变体固定化至ELISA平板。结合表示为相对于野生型IgG1(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从三次独立重复实验获得的平均值(±SEM)。使用抗人-IgG-Fcγ-HRP和ABTS进行检测。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图6显示了在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体与FcγRIa、FcγRIIa(同种异型131H和131R)、FcγRIIb和FcγRIIIa(同种异型158F和158V)的结合。具有非激活突变的固定化IgG1和IgG4变体与FcγRIa(A)、FcγRIIa同种异型131H(B)、FcγRIIa同种异型131R(C)、FcγRIIb(D)、FcγRIIIa同种异型158F(E)和FcγRIIIa同种异型158V(F)的单体和二聚体标组氨酸的生物素化细胞外结构域(ECDs)的结合，如在ELISA测定中测试的。结合表示为相对于野生型IgG1(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从三次独立重复实验获得的平均值(±SEM)。使用链霉抗生物素蛋白-聚HRP(polyHRP)和ABTS进行检测。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图7显示了如使用表达靶的Raji细胞和表达FcyR的报道细胞测量的通过在重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体的FcγR激活。(A-F)稳定表达(A)FcγRIa、(B)FcγRIIa同种异型131H、(C)FcγRIIa同种异型131R、(D)FcγRIIb、(E)FcγRIIIa同种异型158F或(F)FcγRIIIa同种异型158V的Jurkat报道细胞系的激活，如通过与表达CD20的Raji细胞和不同浓度的IgG1和IgG4抗体变体共培养时的发光水平(RLU)所测量的。激活表示为每次实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。来自三次独立实验重复实验的数据平均值(±SEM)。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG1-b12、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图8显示了由在重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体诱导的ADCC，如使用EuTDA TRF细胞毒性测定所测量的。(A-B)在与外周血单核细胞(PBMC)和抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体共温育时，通过EuTDA试剂从BATDA标记的表达CD20的Raji细胞释放的水平来测量NK-细胞介导的ADCC。对于一些变体，ADCC表示为(A)每个实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从四次(野生型和K409R变体)或两次(L234F-L235E-D265A-K409R和L234F-L235E-G236R-K409R变体)独立重复实验获得的平均值(±SEM)。对于一些变体，ADCC表示为(B)每个实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)在10μg/ml抗体浓度的百分比裂解。数据是从2次独立实验的6个供体获得的平均值(±SEM)。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-AAG-K409R、IgG1-RR-K409R、IgG1lh2-S267K-K409R、IgG1-N297G-K409R、IgG1-AEASS-K409R、IgG1、IgG1-K409R、IgG1-b12、IgG4lh2-S228P、IgG4-PAA、IgG4、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图9显示了通过在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD3抗体IgG1-或IgG4-huCLB-T3/4的变体的T-细胞激活。(A-B)由携带所示突变的抗人CD3 IgG1和IgG4抗体变体诱导的PBMC共培养物中的T细胞上作为早期T-细胞激活的量度的CD69表达的上调(通过流式细胞术分析测量的)。CD69上调表示为(A)剂量反应对CD69+T细胞(CD28+)的百分比或(B)每个供体和实验重复实验相对于野生型抗体变体IgG1-F405L(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据为来自3次独立实验重复实验的平均值(±SEM)(每次实验重复实验2个独立供体)。测试的变体是IgG1-FEA-F405L、IgG1-FER-F405L、IgG1-AAG-F405L、IgG1-RR-F405L、IgG1lh2-S267K-F405L、IgG1-N297G-F405L、IgG1-AEASS-F405L、IgG1-F405L、IgG4lh2-S228P-F405L-R409K、IgG4-PAA-F405L-R409K、IgG4-S228P，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，IgG1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，IgG4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图10显示了通过非激活双特异性抗体变体的体外T-细胞介导的细胞毒性。(A-C)使用在恒定重链区中携带非激活突变的双特异性抗体变体CD3xHER2(A)、CD3xb12(B；不与靶细胞结合)或b12xHER2(C；不与T细胞结合)使用阿尔玛蓝(Alamarblue)评估PBMC共培养物中HER2-阳性SK-OV-3细胞的T-细胞介导的细胞毒性。使用Envision平板读数器测量590nm处的吸光度，并计算每个供体和实验重复实验的百分比活细胞，其中星形孢菌素处理的细胞代表100％细胞毒性且培养基对照(无抗体、无PBMC)代表0％细胞毒性。数据表示为剂量反应曲线对％活SK-OV-3细胞。数据是来自3次独立实验重复实验的平均值(±SEM)(每次实验重复实验2个独立供体)。测试的双特异性抗体变体是BisG1 F405LxK409R、BisG1FEA-F405LxFEA-K409R、BisG1 FER-F405LxFER-K409R、BisG1 AAG-F405LxAAG-K409R、BisG1 RR-F405LxRR-K409R、BisG1lh2 S267K-F405LxS267K-K409R、BisG4lh2 S228P-F405L-R409KxS228P、BisG1 N297G-F405LxN297G-K409R、BisG1 AEASS-F405LxAEASS-K409R、BisG4PAA-F405L-R409KxPAA，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，AAG:L234A-L235A-P329G，RR:G236R-L328R，G1lh2:E233P-L234V-L235A-G236del，AEASS:L234A-L235E-G237A-A330S-P331S，G4lh2:E233P-F234V-L235A-G236del，以及PAA:S228P-F234A-L235A。
图11显示了如在从注射了抗人CD20 IgG1或抗人CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的小鼠收集的血液样品中测量的总人IgG(hIgG)浓度。(A)在注射后不同时间点从注射了野生型抗人CD20 IgG1、IgG1-CD20-K409R、IgG1-CD20-L234F-L235E-D265A-K409R和IgG1-CD20-L234F-L235E-G236R-K409R的小鼠收集的血液样品中的总hIgG浓度。数据除IgG1-FER-K409R(2只小鼠)以外是从每组3只小鼠获得的平均值(±SEM)。(B)在注射后不同时间点从注射了野生型抗人CD3 IgG1、IgG1-CD3-F405L、IgG1-CD3-L234F-L235E-D265A-F405L和IgG1-CD3-L234F-L235E-G236R-F405L的小鼠收集的血液样品中的总hIgG浓度。数据是从每组3只小鼠获得的平均值(±SEM)。(C)按照公式D*1000/AUC测定直到抗体施用后第21天为止的清除，其中D为注射的剂量，且AUC为浓度-时间曲线的曲线下面积。在所有图中，虚线代表SCID小鼠中野生型IgG1抗体随着时间的推移预测的IgG1浓度。所表示的数据除了IgG1-FER-K409R(2只小鼠)以外是从每组三只小鼠获得的。测试的变体是IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-K409R、IgG1-K409R、IgG1-FEA-F405L、IgG1-FER-F405L、IgG1-F405L、IgG1，其中FEA:L234F-L235E-D265A以及FER:L234F-L235E-G236R。
图12显示了在实施例14中测试的IgG1抗体变体上检测到的不同聚糖种类的示意表示。
图13显示了用于生成bsAb变体的受控Fab-臂交换(cFAE)的效率。双特异性抗体(表示为BisG1)由cFAE产生，其中一种单特异性抗体(表示为IgG1-A)携带F405L突变，而另一种单特异性抗体(表示为IgG1-B)携带K409R突变。对于下述变体评估了cFAE生成bsAb变体的效率，其中(A；20个数据点)除F405L和K409R突变外，两种单特异性抗体都还携带L234F-L235E-G236R(FER)非激活突变，(B；16个数据点)第一单特异性抗体除F405L突变外还携带L234F-L235E-G236R(FER)突变，且第二单特异性抗体除K409R突变外还携带L234F-L235E-D265A(FEA)突变，(C；12个数据点)第一单特异性抗体除F405L突变外还携带L234F-L235E-D265A(FEA)突变，且第二单特异性抗体除K409R突变外还携带L234F-L235E-G236R(FER)突变。显示了bsAb或残留单特异性抗体变体(IgG1-A或IgG1-B)的百分比(％)，并通过使用Orbitrap Q-ExactivePlus质谱仪进行测定。FEA:L234F-L235E-D265A以及FER:L234F-L235E-G236R。
图14显示了除了F405L或K409R之外，在恒定重链区中携带L234F-L235E-G236R(FER)或L234F-L235E-D265A(FEA)非激活突变的抗体变体的生产水平。在Expi293F细胞中产生抗体变体。生产滴度在散点图(scatterdotplot)中表示为mg/L，其中指示了平均值(±SEM)。每个点代表携带指示的突变的特定抗体克隆的生产得率数据(如果对于所述特定克隆有更多生产数据可用，则为平均值)。为了允许进行比较，显示了L234F-L235E-D265A-F405L抗体变体(FEA-F405L；空心圆)和L234F-L235E-G236R-F405L抗体变体(FER-F405L；实心圆)的匹配克隆的生产滴度。类似地，显示了L235E-D265A-K409R抗体变体(FEA-K409R，空心正方形)和L234F-L235E-G236R-K409R抗体变体(FER-K409R，实心正方形)的匹配克隆的生产滴度。
图15显示了单特异性抗体(A)和双特异性抗体(B)的示例性示意图。(A)重链如黑色所描绘的；轻链如白色所描绘的。各个抗体重链和轻链结构域表示为CH1、CH2、CH3和VH(恒定重(H1、H2、H3)链和可变重(VH)链结构域)、CL和VL(CL、VL，恒定和可变轻链结构域)。(B)由2个半分子组成的双特异性抗体(1个半分子分别呈现为黑色和白色重链和轻链；1个半分子以重链和轻链的有条纹模式呈现)，例如通过受控Fab-臂交换产生的，具有Fab臂的两种不同特异性。铰链区、Fab臂和Fc结构域为如所示的。
图16显示了重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体的C1q结合。结合表示为相对于非结合对照抗体IgG1-b12(0％)和野生型IgG1-CD20(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从3次独立实验获得的平均值±SEM。测试的抗体变体是IgG1-CD20野生型(IgG1)及其变体IgG1-FEA-F405L、IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-F405L、IgG1-FER-K409R、BisG1 FEA-F405LxFEA-K409R、BisG1 FER-F405LxFER-K409R、BisG1 FER-F405LxFEA-K409R、BisG1 FEA-F405LxFER-K409R，其中FER:L234F-L235E-G236R以及FEA:L234F-L235E-D265A。
图17显示了通过在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体的Raji细胞的CDC。使用NHS作为补体来源评估由在重链恒定区中携带非激活突变的IgG1-CD20抗体变体诱导的CD20-阳性Raji细胞的CDC。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于非结合对照抗体IgG1-b12(0％)和野生型IgG1-CD20(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从三次独立重复实验获得的平均值±SEM。测试的抗体变体是IgG1-CD20野生型(IgG1)及其变体IgG1-FEA-F405L、IgG1-FEA-K409R、IgG1-FER-F405L、IgG1-FER-K409R、BisG1 FEA-F405LxFEA-K409R、BisG1 FER-F405LxFER-K409R、BisG1 FER-F405LxFEA-K409R、BisG1 FEA-F405LxFER-K409R，其中FER:L234F-L235E-G236R以及FEA:L234F-L235E-D265A。
图18显示了通过非激活双特异性抗体变体的体外T-细胞介导的细胞毒性。(A-B)使用阿尔玛蓝，使用在Fc区中携带不对称非激活突变的双特异性抗体变体CD3xHER2(A)或CD3xb12(B；不与靶细胞结合)评估PBMC共培养物中HER2-阳性SK-OV-3细胞的T-细胞介导的细胞毒性。使用Envision平板读数器，测量590nm处的吸光度，并计算每个供体和实验重复实验的百分比活细胞，其中星形孢菌素处理的SK-OV-3细胞代表100％细胞毒性且培养基对照(SK-OV-3细胞，无抗体、无PBMC)代表0％细胞毒性。数据表示为剂量反应曲线对百分比活SK-OV-3细胞。数据是从来自两次独立实验的四个供体获得的平均值±SEM(每次独立实验2个供体)。测试的CD3xHER2和CD3xb12双特异性抗体变体是BisG1F405LxK409R、BisG1 FER-F405LxK409R、BisG1 FER-F405LxFEA-K409R、BisG1 FER-F405LxAAG-K409R和BisG1 FER-F405LxN297G-K409R，其中FER:L234F-L235E-G236R，FEA:L234F-L235E-D265A，以及AAG:L234A-L235A-P329G。
图19显示了通过非激活双特异性CD3xHER2抗体变体的T-细胞激活。使用野生型样CD3xHer2双特异性抗体变体及其在Fc区中携带指示的对称或不对称非激活突变的变体来评估人PBMC共培养物中的T细胞上作为早期T-细胞激活的量度的CD69表达的上调(通过流式细胞术分析测量的)。CD69上调表示为每个供体和实验重复实验相对于对非结合阴性对照IgG1-b12(0％)和野生型样IgG1双特异性抗体变体(BisG1 F405LxK409R，100％)测量的AUC值归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据是在两次独立实验中从四个供体获得的平均值(±SEM)(每次独立实验2个供体)。测试的CD3xHER2双特异性抗体变体是BisG1F405LxK409R、BisG1 FER-F405LxK409R、BisG1 FER-F405LxFEA-K409R、BisG1 FER-F405LxAAG-K409R和BisG1 FER-F405LxN297G-K409R，其中FER:L234F-L235E-G236R，FEA:L234F-L235E-D265A，以及AAG:L234A-L235A-P329G。
图20显示了由在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20抗体变体诱导的Raji细胞的CDC，如在使用NHS作为补体来源的体外CDC测定中所评估的。比较了在重链恒定区中含有或缺乏C-末端赖氨酸所产生的变体之间诱导CDC的能力。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于野生型IgG1-CD20抗体(IgG1；100％)和无抗体对照样品(0％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是来自三次独立实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1、IgG1-delK、IgG1-FEA、IgG1-FEA-delK、IgG1-FER、IgG1-FER-delK，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，delK:HC C-末端赖氨酸的重组缺失。
图21显示了如使用表达靶的Raji细胞和表达FcγR的报道细胞测量的通过在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20抗体变体的人FcγR激活。比较了在重链恒定区中含有或缺乏C-末端赖氨酸所产生的变体之间诱导FcγR激活的能力。(A-D)稳定表达(A)FcγRIa、(B)FcγRIIa同种异型131H、(C)FcγRIIb或(D)FcγRIIIa同种异型158V的Jurkat报道细胞系的激活，如通过与表达CD20的Raji细胞和不同浓度的IgG1-CD20或IgG1-CD20-delK抗体变体共培养时的发光水平所测量的。激活表示为每次实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据显示为2次独立重复实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1、IgG1-delK、IgG1-FEA、IgG1-FEA-delK、IgG1-FER、IgG1-FER-delK，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，delK:HC C-末端赖氨酸的重组缺失。
图22显示了由野生型抗人CD20 IgG1抗体的同种异型变体及其在重链恒定区中携带非激活突变的变体诱导的Raji细胞的CDC，如在使用NHS作为补体来源的体外CDC测定中所评估的。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于野生型抗人CD20抗体(同种异型IgG1(f)；100％)和无抗体对照样品(0％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是来自三次独立实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1(fa)、IgG1(zax)、IgG1(zav)、IgG1(za)和IgG1(f)，其中FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R。
图23显示了如使用表达靶的Raji细胞和表达FcyR的报道细胞测量的通过在不同IgG1同种异型变体的重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体的人FcγR激活。(A-D)稳定表达(A)FcγRIa、(B)FcγRIIa同种异型131H、(C)FcγRIIb或(D)FcγRIIIa同种异型158V的Jurkat报道细胞系的激活，如通过与表达CD20的Raji细胞和不同浓度的IgG1-CD20抗体变体共培养时的发光水平所测量的。激活表示为每次实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(f)(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据显示为2次独立重复实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1(f)、IgG1(za)、IgG1(zav)、IgG1(zax)、IgG1(fa)及其携带FER或FEA突变的变体，其中FER:L234F-L235E-G236R以及FEA:L234F-L235E-D265A。
图24显示了由野生型抗人CD20抗体的亚类变体及其在重链恒定区中携带非激活突变的变体诱导的Raji细胞的CDC，如在使用NHS作为补体来源的体外CDC测定中所评估的。(A)由野生型抗人CD20 IgG1和IgG3抗体(同种异型IGHG3*01[IgG3]和IGHG3*04[IgG3rch2])及其非激活变体诱导的CDC。(B)由野生型抗人CD20 IgG1和IgG4抗体及其非激活变体诱导的CDC。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于野生型抗人CD20 IgG1抗体(IgG1；100％)和无抗体对照样品(0％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是来自三次独立实验的平均值±SEM。FEA:L234F-L235E-D265A，FER:L234F-L235E-G236R，EA:L235E-D265A，以及ER:L235E-G236R。
图25显示了如使用表达靶的Raji细胞和表达FcyR的报道细胞测量的通过在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1、IgG3和IgG4抗体变体的人FcγR激活。(A-D)稳定表达(A)FcγRIa、(B)FcγRIIa同种异型131H、(C)FcγRIIb或(D)FcγRIIIa同种异型158V的Jurkat报道细胞系的激活，如通过与表达CD20的Raji细胞和不同浓度的IgG-CD20抗体变体共培养时的发光水平所测量的。激活表示为每次实验重复实验相对于非结合对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据显示为2次独立重复实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG1、IgG3(IGHG3*01)、IgG3rch2(IGHG3*04)、IgG4及其携带ER、EA、FER或FEA突变的变体，其中ER:L235E-G236R、EA:L235E-D265A、FER:L234F-L235E-G236R以及FEA:L234F-L235E-D265A。
图26显示了如使用表达靶的Raji细胞和表达FcyR的报道细胞测量的通过在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20鼠IgG2a抗体变体的人FcγR激活。(A-D)稳定表达(A)FcγRIa、(B)FcγRIIa同种异型131H、(C)FcγRIIb或(D)FcγRIIIa同种异型158V的Jurkat报道细胞系的激活，如通过与表达CD20的Raji细胞和不同浓度的鼠IgG2a-CD20抗体变体共培养时的发光水平所测量的。激活表示为每次实验重复实验相对于非结合对照IgG2a-b12(0％)和野生型IgG2a-CD20(100％)归一化的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据显示为2次独立重复实验的平均值±SEM。测试的变体是IgG2a、IgG2a-FER、IgG2a-LALA和IgG2a-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，LALA:L234A-L235A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。
图27显示了在用正常人血清(NHS)作为C1q来源调理CD20-阳性Raji细胞时，在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20鼠IgG2a抗体变体的C1q结合。结合表示为相对于非结合对照抗体IgG2a-b12(0％)和野生型鼠IgG2a-CD20(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从3次独立实验获得的平均值±SEM。测试的抗体变体是野生型IgG2a、IgG2a-FER、IgG2a-LALA和IgG2a-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，LALA:L234A-L235A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。
图28显示了通过在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20鼠IgG2a抗体变体的Raji细胞的CDC。使用正常人血清(NHS)作为补体来源，评估由在重链恒定区中携带非激活突变的IgG2a-CD20抗体变体诱导的CD20-阳性Raji细胞的CDC。通过由流式细胞术分析PI-阳性细胞的百分比来确定细胞裂解。CDC表示为相对于非结合对照抗体IgG2a-b12(0％)和野生型鼠IgG2a-CD20(100％)归一化的曲线下面积(AUC)。数据是从三次独立重复实验获得的平均值±SEM。测试的抗体变体是野生型IgG2a、IgG2a-FER、IgG2a-LALA和IgG2a-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，LALA:L234A-L235A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。
详述
如本文所述的，抗体Fc区中氨基酸位置的特定修饰已被证明是非激活修饰，从而使得蛋白就Fc功能而论基本上呈惰性，同时从制造角度来看具有有利的性质。
如本文所用的术语“非激活”意图指抑制或消除根据本发明的蛋白与大量效应细胞如单核细胞上存在的Fc受体(FcRs)或与C1q的相互作用以激活补体途径。如本文所用的“非激活”包括降低的CDC活性，降低的C1q-结合，降低的ADCC，降低的或不存在与人FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的结合，降低的或不存在经由人FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的激活和信号传导。“非激活”还包括当用于靶向CD3的背景中时不诱导T-细胞激活(例如当用于靶向CD3的单特异性抗体中时，或用于以肿瘤相关抗原非依赖性方式的双特异性或多特异性抗体的背景中)。可以理解的是，这种“非激活”特征优选地相对于非“非激活”的蛋白进行评估，例如，将带有具有野生型样功能性的未修饰的Fc区的抗体与根据本发明的修饰的Fc区进行比较，例如本文中所描述的。如本文所用的术语“Fc区”意指在从N-到C-末端的方向上至少包含铰链区、CH2区和CH3区的区域。
如本文所用的术语“蛋白”意图指包含彼此共价连接的一条或多条氨基酸链的大生物分子。这种连接可以经由肽键和/或二硫键。单条氨基酸链也可称为“多肽”。因此，本发明上下文中的蛋白可以由一条或多条多肽组成。根据本发明的蛋白可以是任何类型的蛋白，例如抗体或亲本抗体的变体，或融合蛋白。
如本文所用的术语“抗体”意图指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有以显著的时间段的半衰期在典型生理条件下特异性结合抗原的能力，例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时，约24小时或更长，约48小时或更长，约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关功能限定的时间段(例如足以诱导、促进、增强、和/或调谐与抗体结合抗原有关的生理反应的时间和/或足以使抗体募集效应子活性的时间)。与抗原相互作用的结合区(或可用于本文的结合结构域，两者具有相同的含义)包含免疫球蛋白分子的重链和轻链两者的可变区。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分，例如C1q，补体激活的经典途径中的第一个成分。
如上文所示的，除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则本文中的术语抗体包括保留与抗原特异性相互作用(例如结合)的能力的抗体的片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。术语“抗体”内包括的结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007059782(Genmab A/S)中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Nature 341、544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成，且也称为结构域抗体(Holt等人；Trends Biotechnol.2003年11月；21(11):484-90)；(vi)骆驼科动物(camelid)或纳米抗体(nanobodies)(Revets等人；ExpertOpinBiolTher.2005年1月；5(1):111-24)和(vii)分离的互补性决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，这使得它们能够作为单个蛋白链制备，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人，Science 242、423-426(1988)和Huston等人，PNAS USA85、5879-5883(1988))。这种单链抗体包括在术语抗体内，除非另外指出或上下文明确指示。尽管这种片段通常包括在抗体的含义内，但它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学性质和效用。本文进一步讨论了本发明上下文中的这些和其他有用的抗体片段。还应当理解，术语抗体，除非另外具体说明，还包括通过任何已知技术提供的多克隆抗体，单克隆抗体(mAbs)，抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及保留特异性结合抗原的能力的抗体片段(抗原结合片段)，所述技术例如酶促切割、肽合成和重组技术。所生成的抗体可以具有任何同种型。
当抗体是片段，例如结合片段时，在本发明的上下文中应当理解，所述片段与如本文所述的Fc区融合。因此，抗体可以是落在本发明范围内的融合蛋白。因此，在一个实施方案中，蛋白是融合蛋白。
如本文在抗体的上下文中使用的术语“人源化的”是指基因工程非人抗体，其含有人抗体恒定结构域和经修饰以含有与人可变结构域高水平的序列同源性的非人可变结构域。这可以通过将非人抗体互补性决定区(CDRs)(它们一起形成抗原结合部位)嫁接到同源人接纳体构架区(FR)上来实现(参见尤其WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体结合区的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的构架残基取代到人构架区中(回复突变)。结构同源性建模可能有助于鉴定构架区中对于抗体结合区的结合性质重要的氨基酸残基。因此，人源化的可变区或抗体可以包含非人CDR序列，主要是人的构架区，任选地包含至非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变。任选地，可以应用额外的氨基酸修饰(其不必定是回复突变)以获得具有优选特征的人源化抗体或人源化可变区，例如特别有用的亲和力和生化性质，例如包括避免脱酰胺作用、提供“惰性Fc区”、增强异二聚化和/或改进制造的修饰。
如本文在抗体可变区和抗体的上下文中使用的术语“人”意图包括可以基因工程改造的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和构架区以及衍生自人免疫球蛋白恒定结构域的恒定结构域。本发明的人可变区或人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。“人抗体”可以并入已从人、转基因动物(例如描述于如Lee等人，NatureBiotech,32(4)2014pp 355-63和Macdonald等人，PNAS2014年4月8日111(14)5147-52中)等中的人种系免疫球蛋白序列产生的VH和VL序列。这种VH和VL序列被认为是人VH和VL序列，其可以与衍生自人免疫球蛋白恒定结构域的恒定结构域融合。任选地，可以应用额外的氨基酸修饰(其不必定是回复突变)以获得具有优选特征的人抗体或人可变区，例如特别有用的亲和力和生化性质，例如包括避免脱酰胺作用、提供“惰性Fc区”、增强异二聚化和/或改进制造的修饰。因此，“人抗体”可以包括人工改造的抗体。
如本文所用的术语“依赖补体的细胞毒性”(“CDC”)意图指抗体介导的补体激活的过程，从而当抗体与细胞或病毒粒体上的其靶结合时，作为通过MAC装配产生的膜中的孔的结果导致细胞或病毒粒体裂解。
如本文所用的术语“依赖抗体的细胞毒性”(“ADCC”)意图指通过表达Fc受体的细胞杀伤抗体包被的靶细胞或病毒粒体的机制，所述Fc受体识别结合的抗体的恒定区。
如本文所用的术语“免疫球蛋白重链”或“免疫球蛋白的重链”意图指免疫球蛋白的重链之一。重链一般由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区(本文缩写为CH)组成，其限定了免疫球蛋白的同种型。重链恒定区一般由三个结构域组成：CH1、CH2和CH3。CH1和CH2一般经由铰链区连接。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”意图指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，所有四条链都可能通过二硫键互连。免疫球蛋白的结构已得到很好的表征(参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))。在免疫球蛋白的结构中，两条重链经由所谓的“铰链区”中的二硫键互连。与重链相同，每条轻链一般包含几个区域；轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区一般由一个结构域CL组成。此外，VH和VL区可进一步再分为超可变性区(或高变区，其在结构上限定的环的序列和/或形式中高变)，也称为互补性决定区(CDRs)，点缀着称为构架区(FRs)的更保守的区域。每个VH和VL一般由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见LefrancMP等人，Dev Comp Immunol Jan:27(1):55-77(2003))。
如本文所用的术语“第一多肽”和“第二多肽”指氨基酸序列可以相同或不同的一组多肽。因此，第一和第二多肽可以形成同二聚体或异二聚体。第一和第二多肽可以与进一步的多肽缔合。
如本文使用的术语“同种型”指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白同种型(例如IgG、IgD、IgA、IgE或IgM)或其亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其任何同种异型。IgG1的同种异型的实例包括IgG1m(za)和IgG1m(f)。因此，在一个实施方案中，蛋白包含IgG1类免疫球蛋白或其任何同种异型的重链。进一步地，每种重链同种型可以与kappa(κ)和/或lambda(λ)轻链或其任何同种异型组合。
如本文使用的术语“铰链区”指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据如Kabat中阐述的Eu编号的氨基酸216-230(描述于Kabat,E.A.等人，Sequences ofproteins of immunological interest.第5版–USDepartment ofHealthand Human Services,NIH publicationNo.91-3242,pp 662,680,689(1991))。
VH和VL区可以是“人VH和VL区”或“人源化VH和VL区”。可以理解的是，就人VH和/或人VL区而论，这种区域一般由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，如衍生自或发现于人种系序列中的。这种VH和VL区可衍生自人源化动物模型或人。例如，人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与无限增殖化的细胞融合的B细胞，所述B细胞获自转基因或转染色体(transchromosomal)非人动物，例如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。人单克隆抗体可以衍生自人B细胞或浆细胞。如本文所用的术语“人源化VH和VL区”指衍生自非人抗体的基因工程VH和VL区，其被修饰以包含与人可变结构域的高水平序列同源性。这可以通过将非人抗体互补性决定区(CDRs)(它们一起形成抗原结合部位)嫁接到同源人接纳体构架区(FR)上来实现(参见尤其WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的构架残基取代到人构架区中(回复突变)。结构同源性建模可能有助于鉴定构架区中对于抗体的结合性质重要的氨基酸残基。因此，人源化的VH和VL区可以包含非人CDR序列，主要是人的构架区，任选地包含至非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变。任选地，可以应用额外的氨基酸修饰(其不必定是回复突变)以获得具有优选特征的人源化或人VH和VL区，例如特别有用的亲和力和生化性质，例如包括避免脱酰胺作用和/或改进制造的修饰。
如本文使用的术语“CH2区”或“CH2结构域”指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据Eu编号系统的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是如本文所述的任何其他亚型。
如本文使用的术语“CH3区”或“CH3结构域”指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据Eu编号系统的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是如本文所述的任何其他亚型。
如本文使用的术语“全长抗体”指含有对应于正常在野生型抗体中发现的那些的所有重链和轻链恒定区和可变结构域的抗体(例如，亲本或变体抗体)，即，在重链中分别具有VH、CH1、接头、CH2、CH3区，并且在轻链中分别具有VL和CL区，如例如人(或人源化)IgG1重链等，或人(或人源化)κ或λ轻链。可以理解的是，双特异性抗体也可以是全长抗体，即包含不同的重链和/或轻链，例如正常在野生型抗体等中发现的。全长抗体可以被人工改造，包括例如根据本发明如本文中定义的取代或修饰。
如本文使用的术语“对应于位置的氨基酸”指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。除非另外陈述或与上下文矛盾，否则本文中恒定区序列的氨基酸根据Eu-编号索引进行编号(描述于Kabat,E.A.等人，Sequences ofproteins of immunological interest.第5版–USDepartment ofHealth andHuman Services,NIHpublicationNo.91-3242,pp 662,680,689(1991))。因此，一个序列中与另一序列中的氨基酸或区段“对应”的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序例如ALIGN、ClustalW或类似程序与另一个氨基酸或区段比对(一般在默认设置)且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或区段。如何比对序列或序列中的区段并由此确定序列中与根据本发明的氨基酸位置相对应的位置被认为是本领域众所周知的。
在本发明的上下文中，氨基酸可以通过保守或非保守类别来定义。因此，氨基酸的类别可以反映在下表中的一个或多个中：
保守类别的氨基酸残基
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水非荷电残基 S、T、N和Q
脂族非荷电残基 G、A、V、L和I
非极性非荷电残基 C、M和P
芳族残基 F、Y和W
氨基酸残基的备择物理和功能分类
在本发明的上下文中，蛋白中的取代表示为：
原始氨基酸-位置-取代的氨基酸；
提及公认的氨基酸命名法，使用三字母密码或单字母密码，包括代码Xaa和X来指示任何氨基酸残基。因此，符号“L234F”或“Leu234Phe”意指蛋白在对应于野生型蛋白中位置234的氨基酸的蛋白氨基酸位置中包含用苯丙氨酸对亮氨酸的取代。
将给定位置的氨基酸取代为任何其他氨基酸被称为：
原始氨基酸-位置；或例如“L234”。
对于其中一个或多个原始氨基酸和/或取代的氨基酸可以包含不止一种但不是所有氨基酸的修饰，可以通过“,”或“/”分隔不止一种氨基酸。例如在位置234处将亮氨酸取代为苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸或色氨酸是：
“Leu234Phe,Arg,Lys,Trp”或“L234F,R,K,W”或“L234F/R/K/W”或“L234至F、R、K或W”
这种名称在发明的上下文中可以互换使用，但具有相同的含义和目的。
此外，可互换使用的术语“取代”或“突变”包括取代为其他十九种天然氨基酸中的任何一种，或取代为其他氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，位置234中氨基酸L的取代包括以下取代的每一个：234A、234C、234D、234E、234F、234G、234H、234I、234K、234M、234N、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234P和234Y。顺便一提，这相当于名称234X，其中X指示除原始氨基酸之外的任何氨基酸。这些取代也可被称为L234A、L234C、等，或L234A,C,等，或L234A/C/等。上述情况照此类推也适用于本文提及的每个位置，以具体在这里包括任何一个这种取代。本领域中众所周知的是，当氨基酸序列包含“X”或“Xaa”时，所述X或Xaa代表任何氨基酸。因此，X或Xaa一般可以代表20种天然存在的氨基酸中的任何一种。如本文所用的术语“天然存在的”指以下氨基酸残基中的任一种；甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”可以互换使用。为了本发明起见，两个氨基酸序列之间的序列同一性可以使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)中实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定，优选版本5.0.0或之后。使用的参数是缺口开放(gap open)罚分10、缺口延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得的)用作百分比同一性，且计算如下：
(相同残基x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。
相似残基的保留还可以或备择地通过相似性分数来测量，如通过使用BLAST程序(例如，使用标准设置BLOSUM62、开放缺口＝11和延伸的缺口＝1的可通过NCBI获得的BLAST2.2.8)所确定的。
在一个实施方案中，在所述第一和第二多肽的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234、L235和G236的位置中的氨基酸分别不是L、L和G。提供了包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一和第二多肽各自分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，其中所述第一和第二多肽的至少一个被修饰并包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，其中氨基酸位置为如通过EU编号所定义的。优选地，所述第一和第二多肽的至少一个中的位置L234、L235和G236处的所述氨基酸分别被F、E和R取代。
就如本文中使用的氨基酸位置而论，它们根据Eu-编号进行编号，这与Kabat,E.A.等人，Sequences ofproteins ofimmunologicalinterest.第5版-USDepartmentofHealthandHuman Services,NIH publication No.91-3242,pp 662,680,689(1991年)中描述的Eu编号索引一致。本文还提供了根据本发明的有用氨基酸序列的序列，其中以粗体表示指示的氨基酸修饰(参见表1)。
如例如在实施例部分中所示的，根据本发明的蛋白的例子可以是抗体，其由两条相同的重链(其对应于第一和第二多肽)和两条相同的轻链组成。然而，不要求第一和第二多肽两者都具有相同的取代，例如第一和第二多肽之一可以在L234、L235和G236位置处具有所述取代，而另一个可以例如具有不同的取代。因此，另一条链可能具有例如另一种惰性形式的取代，例如FEA形式。在本发明的上下文中，认为在位置L234、L235和G236处的非激活取代的进一步的优点是，它们有效地抑制Fc-介导的效应子功能，即使当以“不对称”方式存在时，其中另一多肽具有不同的惰性形式，例如FEA形式。这使得能够通过将新开发的具有FER惰性形式的抗体与以前生产的具有其他非激活取代(例如FEA形式)的抗体相组合来生产多特异性抗体。
因此，在进一步的实施方案中，提供了根据本发明的蛋白，其中第一和第二多肽之一包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的所述氨基酸取代，并且另一个被修饰并且包含对应于位置L234、L235和D265处的氨基酸的氨基酸的取代，其中优选地，所述取代分别是F、E和A。
在另一个实施方案中，在根据本发明的蛋白中，所述第一和第二多肽两者均包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸取代，其优选分别为用F、E和R的取代。
在进一步的实施方案中，所述第一和第二多肽各自包含免疫球蛋白CH1区。所述CH1区优选连接至铰链区，即为所述多肽分别提供人IgG1免疫球蛋白重链的CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。优选地，CH1区是人IgG1免疫球蛋白重链的。例如，CH1区可以是具有SEQ IDNO:4中列出的序列的序列。如本文所定义的CH1区、铰链区、CH2区和CH3区可以是SEQ IDNO:5中列出的序列。这种序列可以具有如本文所述的取代，例如被提供了如本文所定义的FER取代和/或进一步的取代。
在另一个实施方案中，根据本发明的蛋白包含第一和第二结合区。任何结合区都可以是足够的，然而，可以优选的是，结合区衍生自免疫球蛋白结合区，例如衍生自人或人源化抗体。
如本文所用的术语“结合区”或“结合结构域”指蛋白区域，其能够结合抗原，例如多肽，例如存在于细胞上，例如癌细胞、细菌或病毒粒体上。结合区可以是能够结合细胞、细菌或病毒粒体的多肽序列，例如蛋白、蛋白配体、受体、抗原结合区或配体结合区。具体地，结合区是抗原结合区。如果结合区是例如受体，则所述蛋白可以被作为免疫球蛋白的Fc-结构域和所述受体的融合蛋白制备。如果结合区是抗原结合区，则根据本发明的蛋白可以是抗体、嵌合抗体、或具有人源化或人结合区抗体的抗体、或仅有重链的抗体或ScFv-Fc-融合物。
如本文使用的术语“结合”指抗体与预定抗原或靶的结合，当使用抗体作为配体和抗原作为分析物通过生物层(biolayer)干涉量度学测定时，一般具有对应于1E-6M或更低、例如5E-7M或更低、1E-7M或更低、例如5E-8M或更低、例如1E-8M或更低、例如5E-9M或更低或例如1E-9M或更低的KD的结合亲和力，且以这样的亲和力结合预定抗原，所述亲和力对应于其结合除预定抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力的至多1/10、例如至多1/100、例如至多1/1,000、例如至多1/10,000、例如至多1/100,000的KD。
因此，在进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白包含所述第一和第二结合区，其分别包含第一免疫球蛋白重链可变区(VH)和第一免疫球蛋白轻链可变区(VL)，并且其中所述第二结合区包含第二免疫球蛋白重链可变区和第二免疫球蛋白轻链可变区。可以理解的是，这些区域优选是人或人源化的VH和VL区。因此，VH和VL区具有人或人衍生的构架区，并且可以具有人或人衍生的或其他物种来源(例如小鼠或大鼠)的CDR1-3序列。因此，在另一个进一步的实施方案中，所述免疫球蛋白重链和轻链可变区是人或人源化免疫球蛋白重链和轻链可变区。
如所述的，根据本发明的蛋白包括抗体。因此，在另一个实施方案中，所述第一和第二多肽是免疫球蛋白重链，其中所述第一和第二多肽包含所述相应的第一和第二免疫球蛋白重链可变区。可以理解的是，当包含人可变区时，这种重链可以优选为人重链或人源化重链，其被理解为包含人或人源化可变区和人恒定区。此外，所述蛋白可包含第一免疫球蛋白轻链恒定区和第二免疫球蛋白轻链恒定区，更优选地其中所述蛋白包含第一和第二免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含所述相应的第一和第二免疫球蛋白轻链可变区以及所述相应的第一和第二免疫球蛋白恒定轻链区。可以理解的是，当包含非人衍生的CDR区时，这种轻链高度优选地为人轻链或人源化轻链。轻链可以具有轻链可变区和人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。在进一步的实施方案中，人κ轻链恒定区如SEQ ID NO:6中所列。在另一个进一步的实施方案中，人λ轻链恒定区如SEQ ID NO:7中所列。这种轻链可包含κ或λ轻链，或两者，例如其中所述蛋白包含一条κ轻链和一条λ轻链，这是因为根据本发明的蛋白可以包含两条不同的轻链。因此，这种轻链可以是人或人源化κ或λ轻链，或两者，例如其中所述蛋白包含一条人κ轻链和一条人λ轻链，这是因为根据本发明的蛋白可以包含两条不同的轻链。
可以理解的是，人或人源化重链和轻链除了如本文所述的突变之外还可以包含进一步的修饰以提供优选的特征，例如以提供特别有用的亲和力和生化性质，包括避免脱酰胺作用和/或增强异二聚化、改进制造和分离等的修饰。
因此，在优选的实施方案中，包含所述第一和第二多肽的根据本发明的蛋白由第一和第二免疫球蛋白轻链以及第一和第二重链组成或包含第一和第二免疫球蛋白轻链以及第一和第二重链，后者对应于第一和第二多肽。根据本发明的这种蛋白可以具有经由二硫键与所述第一免疫球蛋白重链连接的所述第一免疫球蛋白轻链，以及经由二硫键与所述第二免疫球蛋白重链连接的所述第二免疫球蛋白轻链，从而分别形成所述第一结合区和所述第二结合区，并且其中所述第一和第二免疫球蛋白重链也经由二硫键连接。如本文所用的术语“二硫键”指两个半胱氨酸残基之间的共价键，即所述相互作用也可被称为Cys-Cys相互作用。
在进一步的实施方案中，其可能是优选的实施方案，根据本发明的蛋白是抗体，其优选是全长抗体。在又另一个进一步的实施方案中，全长抗体属于或衍生自人IgG1同种型。
可以理解的是，根据本发明，所述位置的取代将导致降低的Fc-介导的效应子功能，例如，当包含在抗体中时。这种降低的Fc-介导的效应子功能包括降低的CDC活性(参见尤其实施例3和5)，降低的C1q-结合(尤其实施例4)，降低的ADCC(尤其实施例9)，与人FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)没有可检测的结合(尤其实施例6)和没有可检测的经由人FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的激活和信号传导(实施例7)，并且在靶向CD3的背景中不诱导肿瘤相关抗原非依赖性T-细胞激活(尤其实施例10)，以及当这种取代包含在抗体的背景中时，具有药物代谢动力学，尤其由于具有与野生型人IgG1相似的人FcRn结合性质和与野生型人IgG1抗体高度相似的糖基化等(参见尤其实施例12和14)。此外，这些取代可提供在低pH下改善的pH稳定性(参见尤其实施例20-23)。根据本发明的蛋白不仅在抗体(其可能是高度优选的实施方案)的背景中有用，而且也预期其他形式的蛋白，例如融合蛋白，其具有根据本发明的所述第一和第二多肽，其包含至少铰链区、CH2区和CH3区，其中所述第一和第二多肽中的至少一个被修饰并且包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，其中氨基酸位置如通过EU编号所定义的。
当提及Fc-介导的效应子功能时如本文所用的术语“降低的”或“不可检测的”涉及根据本发明的蛋白(例如抗体)诱导CDC活性，ADCC，C1q结合，FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)结合，经由FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)激活和信号传导，和在靶向CD3的背景中激活T-细胞的能力，如与具有野生型IgG1 Fc区等的相同蛋白相比的，其具有诱导所述效应子功能的完全能力，例如，在抗体等的背景中，例如实施例部分中描述的。用于确定这些特征的“降低的”或“不可检测的结合”的示例性测定是本领域已知的，并且例如在整个实施例部分中充分描述。实施例部分描述了在抗体(例如全长抗体)背景中的这些特征的性质。可以理解的是，高度优选的性质是在例如在实施例部分中描述的背景中测定的，这并不意味着根据本发明的蛋白被理解为限于抗体，这是因为根据本发明的人IgG1免疫球蛋白重链的分别修饰的铰链区、CH2区和CH3区的有利性质也可以以其他形式使用，例如融合蛋白等。然而，发现并且在本文中显示当应用于抗体的背景中时特别有用。
蛋白诱导依赖补体的细胞毒性(CDC)的能力可以用本领域已知的方法测定。简而言之，具有未修饰的完全功能的Fc区的参考蛋白，例如作为有效CDC诱导物的IgG1抗体在体外测定中与在其细胞表面上呈递靶抗原的细胞在有人血清的情况下一起温育，并且接着测定细胞裂解的百分比，其设定为100％。将具有修饰的Fc区的根据本发明的蛋白例如具有FER Fc区的抗体的细胞裂解百分比与在相同条件下使用不靶向细胞或不具有Fc区的对照蛋白(如例如F(ab’)2)发生的细胞裂解进行比较。百分比裂解是如与设定为100％的未修饰的参考进行比较而测定的。可以使用的合适方法的实例如实施例3或实施例5中所述。根据本发明的蛋白，当与具有相反具有FEA形式的Fc区的相同蛋白相比时具有降低的CDC活性，和/或当与例如F(ab’)2相比时具有相似的CDC活性)。
蛋白具有降低的C1q结合的能力可以用本领域已知的方法测定。简而言之，具有(未修饰的)完全功能的Fc区的蛋白，例如抗体，在体外测定中，在有人血清的情况下，与在其细胞表面呈递靶抗原的细胞一起温育，且接着根据制造商的说明书通过与例如多克隆兔抗人C1q补体FITC抗体(Dako,Cat#F0254,AgilentTechnologies)的结合和FACS分析来测定C1q结合的百分比。将具有(未修饰的)完全功能的Fc区的蛋白的检测到的信号与具有修饰的Fc区的蛋白相比，例如IgG1抗体，其是有效的CDC诱导物。可以使用的根据本发明的合适方法的详细实例在实施例4中描述。根据本发明的蛋白，当与具有相反具有FEA形式的Fc区的相同蛋白相比时具有降低的CDC活性，和/或当与例如非结合对照抗体相比时具有相似的CDC活性。当在具有FER的全长IgG1抗体的背景中与具有相同序列但不具有FER的抗体进行比较时，根据本发明的蛋白优选具有15％或更低的C1q结合活性，例如在实施例4中所描述的。
降低抗原依赖性细胞毒作用的能力可以用本领域已知的方法测定。例如，为了测定野生型抗体及其非激活变体的ADCC能力，可以根据制造商的说明书使用EuTDATRF(时间分辨荧光)细胞毒性试剂盒(Cat#AD0116,Perkin Elmer)。简而言之，呈递靶抗原的细胞被根据制造商的说明书进行细胞内标记，例如使用双(乙酰氧基甲基)2,2':6',2”-三联吡啶-6,6”-二羧酸酯试剂溶液(DELFIABATDA试剂，Cat#C136-100,Perkin Elmer)。接着在有PBMCs的情况下，将这些细胞与具有(未修饰的)完全功能的Fc区的蛋白例如抗靶抗原的野生型抗体及其非激活变体、与在其细胞表面呈递靶抗原的PBMCs细胞一起温育。NK-介导的ADCC的评估参考完全功能的对照IgG1抗体(设定为100％)和非结合阴性IgG1对照抗体(设定为0％)进行确定。可以使用的合适方法的详细实例在实施例9中描述。当将例如具有FER的全长IgG1抗体与具有相同序列但不具有FER的抗体比较时，根据本发明的蛋白优选具有35％或更低的残留ADCC活性，例如在实施例9中所描述的。当与具有相反具有FEA形式的Fc区的相同蛋白相比时，根据本发明的蛋白具有类似的降低的ADCC活性。
关于与人FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的结合，这可以通过使用ELISA来测定。根据本发明的蛋白的结合可以通过在ELISA测定中测定与标组氨酸的、C-末端生物素化的FcγR，FcγRIa的单体ECD(SEQ ID NO：15)(单体)或FcγRIIa同种异型131H(SEQ ID NO:16)、FcγRIIa同种异型131R(SEQ ID NO:17)、FcγRIIb(SEQ ID NO:18)、FcγRIIIa同种异型158F(SEQ ID NO:19)和FcγRIIIa同种异型158V(SEQ ID NO:20)的二聚体ECD的结合来评估。简言之，且例如，将具有Fc区的IgG1抗体结合至包被有抗人F(ab’)2抗体的平板，并接着与各个细胞外结构域中的每一个一起温育，接着使用链霉抗生物素蛋白-聚HRP(CLB,Cat#M2032,1:10.000)对其结合进行定量。可以使用的根据本发明的合适方法的详细实例在实施例6中描述。根据本发明的蛋白例如抗体在使用所述标组氨酸的、C-末端生物素化的FcγR单体ECDs的ELISA测定中未可检测地与所述Fcγ受体结合。根据本发明的蛋白具有相似的与所述Fcγ受体的不可检测的结合，如当将具有包含FER的Fc区的IgG1抗体与例如FEA进行比较时所观察到的，如例如在实施例6中所示的。
关于经由FcγRIa、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的激活和信号传导，这可以用可商业获得的报道测定来确定。例如，报道测定可用于确定根据本发明的蛋白的激活和结合，使用表达靶的细胞和可使用表达指示的FcγR的Jurkat报道细胞系(Promega,FcγRIa:Cat#CS1781C08；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G9991；FcγRIIa同种异型131R:Cat#CS1781B08；FcγRIIb:Cat#CS1781E04；FcγRIIIa同种异型158F:Cat#G9790；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G7010)。例如，对于靶向CD20的抗体，表达CD20的Raji细胞可以用作靶细胞。根据本发明的蛋白例如抗体具有类似的经由所述Fcγ受体的不可分离的激活和信号传导，如当将例如具有根据本发明的Fc区例如FER的抗体与FEA比较时所观察到的，如例如在实施例7中所示的。
关于在靶向CD3的背景中T-细胞激活的降低，可以理解的是，这适用于根据本发明的蛋白，其包含结合人T-细胞上的人CD3的结合区，例如典型的结合人CD3的二价单特异性抗体，例如本文实施例中描述的。T-细胞激活的降低可以通过下述确定：将剂量反应系列的例如根据本发明的抗-CD3抗体与新鲜分离的PBMCs温育，所述抗-CD3抗体在两条多肽两者中分别在人IgG1免疫球蛋白重链的铰链区、CH2区和CH3区中包含对应于根据EU-编号的位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，并且接着用小鼠抗人CD28-PE(Cat#130-092-921；Miltenyi Biotec；T-细胞标记)和小鼠抗人CD69-APC抗体(Cat#340560；BDBiosciences)对所述细胞进行染色。随即，确定T-细胞的CD69上调，其是T-细胞激活的量度。这种测定的细节在实施例10中描述。根据本发明的蛋白例如靶向人CD3的抗体与具有野生型样Fc区的靶向人CD3的IgG1抗体相比可以防止或高度降低CD69上调。
关于根据本发明的蛋白，即包含人IgG1免疫球蛋白重链的铰链、CH2和CH3区，具有至少对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，优选分别用F、E和R，这些优选具有与野生型IgG1序列非常相似的糖基化。更具体地，根据本发明的蛋白的半乳糖基化和/或荷电聚糖的存在优选与使用相同细胞系和相同生产条件产生的野生型IgG1氨基酸序列所发现的在相同范围。用于制造的合适的哺乳动物宿主细胞，包括CHO细胞系，是本领域众所周知的(参见尤其Butler和Spearman，2014，CurrOpinBiotechno，12月；30:107-12)。与在包含野生型IgG1序列例如SEQ ID NO.1等的相同蛋白中观察到的半乳糖基化总百分比相比，总百分比半乳糖基化优选在正或负20％的范围内。例如，如果野生型IgG1序列等具有25％的半乳糖基化百分比，则总百分比可以在5％-45％的范围内。与在不包含FER形式的根据本发明的蛋白中观察到的总百分比半乳糖基化相比，总百分比半乳糖基化优选在正或负20％的范围内。与在包含野生型IgG1序列例如SEQ ID NO.1等的蛋白中观察到的总百分比荷电聚糖相比，荷电聚糖的总百分比优选在正或负3％的范围内。例如，如果野生型IgG1序列等具有1％的荷电聚糖百分比，则荷电聚糖的总百分比可以在0％-4％的范围内。与在不包含FER形式的根据本发明的蛋白中观察到的总百分比荷电聚糖相比，荷电聚糖的总百分比优选在正或负3％的范围内。根据本发明的蛋白例如抗体的荷电聚糖的总百分比和/或半乳糖基化的百分比优选在荷电聚糖的总百分比的正或负3％和与在包含野生型IgG1序列例如SEQ ID NO.1等的相同蛋白中观察到的总百分比半乳糖基化相比正或负20％的范围内。根据本发明的蛋白例如抗体的荷电聚糖和/或半乳糖基化的总百分比优选在荷电聚糖的总百分比的正或负3％和与在不包含FER形式的根据本发明的蛋白中观察到的总百分比半乳糖基化相比正或负20％的范围内。
根据本发明的蛋白例如抗体的百分比半乳糖基化和/或荷电聚糖可以使用本领域已知的方法测定。这种方法描述于例如实施例14中。合适的方法包括2-氨基苯甲酰胺标记和后来的HPLC分析，例如在实施例14中所述的，或者使用Orbitrap Q-Extractive Pluss质谱仪的LC-MC。这里，半乳糖基化和荷电聚糖的百分比分别计算为寡糖中半乳糖或荷电聚糖相对于所有具有A2F聚糖结构的聚糖的百分比占用(occupancy)。本文中作为百分比提及的量代表摩尔量，即代表分子数而不是质量。可以测定当在Expi293F细胞中产生时根据本发明的蛋白例如抗体的荷电聚糖和/或半乳糖基化的百分比。例如，如实施例部分中所示的，在具有野生型IgG1序列的在Expi293F细胞中产生的蛋白的荷电聚糖的百分比和半乳糖基化的百分比分别为约0.5％和约15％至25％。因此，当在Expi293F细胞中产生时，根据本发明的蛋白优选具有优选分别为0-4％和5-45％的荷电聚糖的百分比和半乳糖基化的百分比。
关于根据本发明的蛋白，其包含人IgG1免疫球蛋白重链的铰链、CH2和CH3区，具有至少对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，优选分别用F、E和R，这些优选地具有与野生型人IgG1 Fc区类似的人FcRn结合。可以理解的是，本文选择的取代可以是不影响FcRn结合功能的取代。因此，这种蛋白的药物代谢动力学与具有野生型IgG1Fc区的相应蛋白的药物代谢动力学相似，例如尤其在实施例部分中描述的。然而，可以理解的是，倘若例如修饰FcRn功能是有用的，例如在其中这种将有用的情况下延长半衰期或缩短半衰期，则可以预期包括对其的进一步取代。对于抗体，如例如全长单特异性和双特异性抗体，在一个实施方案中，人FcRn结合性质与具有野生型人IgG1 Fc区的相同抗体没有不同。这种结合性质是本领域已知的并且可以如本文在实施例部分中所述来确定。因此，在pH 6.0下发生的FcRn结合与用相应的野生型人IgG1 Fc区观察到的相似，并且在pH 7.4下没有发生可检测的结合。
在进一步的实施方案中，包含所述第一和第二多肽的根据本发明的蛋白具有相同的氨基酸序列。可以理解的是，这包括在宿主细胞中由编码一种多肽的单个表达盒产生的蛋白，即第一和第二多肽可以是所述一种多肽的同二聚体。这种蛋白的实例包括抗体，例如具有两条重链和两条轻链的抗体(参见图15A)，其中两条重链都是相同的，并且两条轻链也都是相同的。这种抗体是二价的并且具有两个结合区，其各自可以结合相同的靶抗原，即相同的表位。因此，在进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白包含第一和第二多肽，其中所述第一和第二多肽是氨基酸序列相同的免疫球蛋白重链，并且进一步包含第一和第二免疫球蛋白轻链，它们的氨基酸序列相同。
在进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白包含进一步的取代。优选的根据本发明的进一步取代包括允许形成异二聚体的修饰，即允许提供包含第一和第二多肽的蛋白，其中所述第一和第二多肽不同。这种蛋白的实例包括双特异性抗体，例如具有两条重链和两条轻链的抗体(参见图15B)，其中至少两条重链不相同，从而使得抗体中的每个重链和轻链对可以靶向不同的抗原。可能不必定需要在第一和第二多肽的IgG1序列的铰链、CH2和CH3区中引入差异性修饰，第一和第二多肽序列的这些区域可以是相同的。那样的话，可以形成同二聚体和异二聚体的混合物，其用途本身可能是有利的，或者异二聚体和同二聚体可以容易地从所述混合物中分离(例如经由大小和/或电荷、亲和力等的差异)。然而，优选引入使得能够或驱动双特异性抗体等的产生的进一步修饰。因此，根据本发明的蛋白可以在第一和第二多肽的IgG1序列的铰链、CH2和CH3区中包含进一步的取代。那样的话，包含就IgG1序列的铰链、CH2和CH3区而论不同的序列的第一和第二多肽可以有利地组合在根据本发明的蛋白中。这种蛋白，即具有这种取代的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的实例包括但不限于具有互补CH3结构域的蛋白，例如三功能抗体/四源杂交瘤(Triomab/Quadroma)(Trion Pharma/FreseniusBiotech；Roche，WO2011069104)、杵臼结构(Knobs-into-Holes)(Genentech，WO9850431)、CrossMAbs(Roche，WO2011117329)和静电匹配的(Amgen，EP1870459和WO2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304)、LUZ-Y(Genentech)、DIG-body和PIG-body(Pharmabcine)、链交换人工改造的结构域体(StrandExchangeEngineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono，WO2007110205)、Biclonics(Merus)、FcΔAdp(Regeneron，WO201015792)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat，WO11143545)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck，WO2012058768)、mAb-Fv(Xencor，WO2011028952)、二价双特异性抗体(Roche)和DuoBody(GenmabA/S，WO2011131746)。
在特定实施方案中，根据本发明的蛋白，所述第一和第二多肽包含进一步的氨基酸取代，优选选自T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的氨基酸的取代，例如F405L或K409R。可以理解的是，当蛋白是同二聚体时，例如，具有相同的第一和第二多肽，两者可以具有相同的取代。根据本发明的这种蛋白，例如，单特异性抗体，可以高度有利地用于制备双特异性抗体，例如在实施例部分中和例如在WO2011131746中所描述的。
因此，在进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白是单特异性抗体。在本发明的上下文中，“单特异性”指由其结合区结合(即能够结合)相同表位的蛋白。特别地，这种单特异性蛋白或抗体优选结合选自靶分子、细胞靶和病原体的抗原。
可以预期的靶分子包括诸如细胞因子、生长因子、配体等的分子。可以预期的细胞靶包括在细胞表面的分子，例如受体或黏着分子，例如存在于癌细胞、肿瘤细胞、效应细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞)上。可以被靶向的病原体包括病毒、细菌、原生动物、寄生物等。因此，可以预期的根据本发明的蛋白包括具有针对选自细胞因子、生长因子、配体、癌细胞、肿瘤细胞、效应细胞、病毒和细菌的抗原或靶的结合区的蛋白，例如单特异性抗体。
然而，本发明不限于单特异性蛋白，例如单特异性抗体，而且还涉及多特异性蛋白，例如双特异性抗体。在进一步的实施方案中，根据本发明的蛋白是双特异性或多特异性抗体。这意味着根据本发明的蛋白的结合区结合不同的表位，而不是相同的表位。因此，根据本发明的蛋白的第一和第二结合区是不同的，例如就氨基酸序列而论。不同的表位可以来自相同的靶实体，例如由相同靶分子呈递和/或由相同靶细胞呈递的不同表位，但也可以来自不同靶实体。
根据本发明的高度有利的双特异性蛋白，例如双特异性抗体，涉及这样的蛋白，其中第一和第二结合区之一靶向效应细胞，并且第一和第二结合区中的另一个靶向癌抗原。通过使用这种多特异性抗体，特定类别的效应细胞可以由此与癌细胞接合，从而例如诱导效应细胞杀伤癌细胞。在一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述结合区之一结合癌抗原。在另一个实施方案中，所述结合区之一结合效应细胞，例如T-细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞。在又另一个实施方案中，所述结合区之一结合效应细胞，例如T-细胞或NK细胞，而另一个结合区结合癌抗原。
存在许多应用，例如通过双特异性抗体的受体抑制或T-细胞募集，其中治疗用抗体的Fc区与效应细胞或补体的Fc结合不是需要的或甚至是不期望的，这是因为其可能促使不需要的细胞毒性。因此，由一个结合区与人T-细胞受体结合的双特异性抗体可以有利地募集人细胞毒性T-细胞。因此，本文提供了双特异性抗体，其由一个结合区与人CD3结合并且其可以募集细胞毒性T-细胞。具有活化IgG Fc区的CD3抗体包括双特异性抗体可通过表达FcγR的细胞的交联、表达FcγR的细胞的不适当激活以及后来的细胞因子风暴(cytokine storm)和相关的毒性作用或血小板聚集在没有肿瘤细胞的情况下诱导不需要的激动作用。因此，具有非激活Fc区的CD3双特异性抗体有利于防止潜在的不需要的细胞激活。
因此，在一个实施方案中，第一和第二结合区中的至少一个结合CD3，即能够结合CD3。在特定实施方案中，所述第一结合区结合CD3并且所述第二结合区结合(即能够结合)任何其他感兴趣的靶。这种其他靶可以是癌抗原。这种其他靶可以是肿瘤特异性靶或癌症特异性靶。优选地，根据本发明的所述蛋白是双特异性抗体。所述蛋白双特异性抗体优选具有能够结合CD3的第一结合区和能够结合癌症特异性靶的第二结合区。
可以理解的是，包括单特异性、双特异性或多特异性抗体的抗体可以包含Fc区等，其包含根据本发明的人IgG1抗体的铰链区、CH2和CH3区。如果抗体形式如尤其下文所描述的将不包含这种IgG1 Fc区，那么可以例如通过用包含根据本发明的FER的铰链区、CH2和CH3区置换这种抗体的Fc区随即提供这种抗体，或者，在这种抗体不包含Fc区的情况下，例如经由融合和/或缀合随即提供这种抗体。因此，根据本发明可以预期任何抗体形式，只要所述抗体包含根据本发明的人IgG1抗体的铰链区、CH2和CH3区。
可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单一抗体，(ii)例如经由通过额外的肽接头串联连接的两个scFvs对两个不同表位具有特异性的单链抗体；(iii)双重可变结构域(dual-variable-domain)抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链都含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu等人，Generation andCharacterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其是两个单链双抗体的融合物，从而结果产生四价双特异性抗体，其对每个靶抗原具有两个结合部位；(vi)flexibody，其是scFvs与双抗体的组合，从而结果产生多价分子；(vii)所谓的“对接和锁定(dockandlock)”分子，其基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，其当应用于Fab时，可以产生由与不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如融合至人Fab-臂的两个末端的两个scFvs；和(ix)双抗体。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、cross-body或经由受控Fab臂交换获得的双特异性抗体(例如WO 11/131746中所述的)，如本发明中所述的那些。
不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以促进异二聚化的IgG-样分子；(ii)重组IgG-样双重靶向分子，其中分子两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc-区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab-片段融合在一起，融合至重链恒定结构域、Fc-区或其部分；和(vi)基于ScFv和双抗体的和重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)彼此融合，或与融合至重链恒定结构域、Fc-区或其部分的另一种蛋白或载体分子融合。
具有互补CH3结构域分子的双特异性IgG-样分子等的实例包括但不限于三功能抗体/四源杂交瘤(TrionPharma/FreseniusBiotech；Roche，WO2011069104)、杵臼结构(Genentech，WO9850431)、CrossMAbs(Roche，WO2011117329)和静电匹配的(Amgen，EP1870459和WO2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304)、LUZ-Y(Genentech)、DIG-body和PIG-body(Pharmabcine)、链交换人工改造的结构域体(SEEDbody)(EMD Serono，WO2007110205)、Biclonics(Merus)、FcΔAdp(Regeneron，WO201015792)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat，WO11143545)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck，WO2012058768)、mAb-Fv(Xencor，WO2011028952)、二价双特异性抗体(Roche)和DuoBody(GenmabA/S，WO2011131746)。
重组IgG-样双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、Two-in-one抗体(Genentech)、交联的Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star，WO2008003116)、Zybodies(Zyngenia)、采用共同轻链的方法(Crucell/Merus，US7,262,028)、κλBodies(NovImmune)和CovX-body(CovX/Pfizer)。
IgG融合分子的实例包括但不限于双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott，US7,612,181)、双重结构域双头抗体(Dual domain double head antibodies)(Unilever；SanofiAventis，WO20100226923)、IgG-样双特异性(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(BiogenIdec，US007951918)、scFv融合物(Novartis)、scFv融合物(常州亚当生物技术有限公司，CN 102250246)和TvAb(Roche，WO2012025525、WO2012025530)。
Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合物(Academic Institution)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion、Zymogenetics/BMS)、双重亲和力再靶向技术(DualAffinity RetargetingTechnology)(Fc-DART)(MacroGenics，WO2008157379、WO2010/080538)和双重(ScFv)2-Fab(国家抗体医学研究中心(NationalResearchCenterforAntibodyMedicine)–中国)。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、双重作用或Bis-Fab(Genentech)、对接和锁定(Dock-and-Lock)(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
基于ScFv、双抗体的和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞衔接器(Engager)(BiTE)(Micromet、串联双抗体(Tandem Diabody)(Tandab)(Affimed)、双重亲和力再靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双抗体(Academic)、TCR-样抗体(AIT、ReceptorLogics)、人血清清蛋白ScFv融合物(Merrimack)和COMBODY(EpigenBiotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)、双重靶向仅重链结构域抗体。
在进一步的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽在所述各自的CH2和CH3区中包含进一步的取代，从而使得来自所述第一和第二多肽的各自的CH2和CH3区的序列是不同的，所述取代允许获得包含所述第一和第二多肽的所述多肽。在特定实施方案中，在所述第一多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，其中所述第一和所述第二多肽的所述取代不在相同位置。在所述上下文中，术语“取代的”指已被另一种类型的氨基酸取代的特定氨基酸位置中的氨基酸。因此，在对应于人IgG1重链中的位置的位置中的“取代的”氨基酸意指在所述特定位置处的氨基酸不同于在IgG1重链中的所述位置处的天然存在的氨基酸。
此外，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中在所述第一多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，且其中所述第一和所述第二多肽的所述取代不在相同位置。
在进一步的实施方案中，在所述第一多肽中对应于人IgG1重链中F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二多肽中对应于人IgG1重链中K409的位置中的氨基酸是R，或反之亦然。
在另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中在所述第一多肽中对应于F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二多肽中对应于K409的位置中的氨基酸是R，或反之亦然。在另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中在所述第一多肽中对应于F405和K409的位置中的氨基酸分别是L和K，并且在所述第二多肽中对应于F405和K409的位置中的氨基酸分别是F和R，或反之亦然。
在又另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽两者中具有修饰，其包含在所述第一多肽中用F、E和R取代位置L234、L235和G236处的氨基酸和用L取代位置F405处的氨基酸，以及在所述第二多肽中K409处用R取代，或反之亦然。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽之一中具有修饰，其包含在所述第一多肽中用F、E和R取代位置L234、L235和G236处的氨基酸和用L取代位置F405处的氨基酸，以及在所述第二多肽中K409处用R取代，或反之亦然。
在仍然另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽中具有修饰，其包含在所述第一第二多肽中在位置L234、L235和G236处的氨基酸用F、E和R的取代，以及在所述第二多肽中在位置L234、L235和D265处的氨基酸用F、E和A的取代，以及在所述第一多肽中在位置F405处的氨基酸用L的取代，以及在所述第二多肽中K409用R的取代。
在又另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽中具有修饰，其包含在所述第一第二多肽中在位置L234、L235和G236处的氨基酸用F、E和R的取代，以及在所述第二多肽中在位置L234、L235和D265处的氨基酸用F、E和A的取代，以及在所述第二多肽中在位置F405处的氨基酸用L的取代，以及在所述第一多肽中K409用R的取代。
在又另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽两者中具有修饰，其由下述组成：在所述第一多肽中用F、E和R取代位置L234、L235和G236处的氨基酸和用L取代位置F405处的氨基酸，以及在所述第二多肽中K409处用R取代，或反之亦然。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽之一中具有修饰，其由下述组成：在所述第一多肽中用F、E和R取代位置L234、L235和G236处的氨基酸和用L取代位置F405处的氨基酸，以及在所述第二多肽中K409处用R取代，或反之亦然。
在仍然另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽中具有修饰，其由下述组成：在所述第一第二多肽中在位置L234、L235和G236处的氨基酸用F、E和R的取代，以及在所述第二多肽中在位置L234、L235和D265处的氨基酸用F、E和A的取代，以及在所述第一多肽中在位置F405处的氨基酸用L的取代，以及在所述第二多肽中K409用R的取代。
在又另一个实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽中具有修饰，其由下述组成：在所述第一第二多肽中在位置L234、L235和G236处的氨基酸用F、E和R的取代，以及在所述第二多肽中在位置L234、L235和D265处的氨基酸用F、E和A的取代，以及在所述第二多肽中在位置F405处的氨基酸用L的取代，以及在所述第一多肽中K409用R的取代。
根据本发明的所述蛋白可以基于如SEQ ID NO:1中所定义的人IgG1的铰链、CH2和CH3区。人IgG1的所述铰链区、CH2区和CH3区对应于同种异型IgG1m(f)。当然，IgG1免疫球蛋白类别内的任何其他人IgG1同种异型(例如，IgG1m(za)、IgG1m(zax)、IgG1m(zav)或IgG1m(fa)；参见尤其Vidarsson等人，2014,Front.Immunol.,10月20日且如在IMGT数据库(www.imgt.org)中所提供的)都可以预期并且同样合适。
Fc区可在其C-末端具有赖氨酸。所述赖氨酸的起源是在这些Fc区所衍生自的人中发现的天然存在的序列。在重组抗体的细胞培养生产期间，所述末端赖氨酸可以通过一种或多种内源性羧肽酶的蛋白酶解被切割掉，从而结果产生具有相同序列但缺乏C-末端赖氨酸的恒定区。为了抗体制造的目的，可以从序列中省略编码所述末端赖氨酸的DNA，从而使得产生没有赖氨酸的抗体。由编码或不编码末端赖氨酸的核酸序列产生的抗体在序列和功能上基本相同，这是因为当例如使用基于CHO的生产系统生产的抗体时末端赖氨酸的加工程度一般是高的((Dick,L.W.等人，Biotechnol.Bioeng.2008；100:1132–1143)。本文列出的恒定区序列列出了末端赖氨酸(K)(参见尤其SEQ ID NO.1)且在本文的实施例部分中使用编码末端赖氨酸(K)的序列。因此，可以理解的是，根据本发明的蛋白，例如抗体，可以在不编码或不具有末端赖氨酸的情况下产生，例如本文在SEQ ID NO.1-3、5和9-14中所列的。
因此，根据本发明的蛋白或根据本发明的双特异性抗体可以包含第一和第二多肽，所述第一和第二多肽包含如本文中根据SEQ ID NO:1所定义的氨基酸序列，其中所述第一和第二蛋白具有如本文所定义的氨基酸取代。根据本发明的蛋白或根据本发明的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽优选包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包含在所述第一和第二多肽中的所述氨基酸序列具有如本文所定义的氨基酸取代。此外，具有如本文所定义的取代的如SEQ ID NO：1所定义的所述氨基酸序列可以不包含末端赖氨酸。
因此，根据本发明的蛋白或单特异性或双特异性抗体(其可以是全长抗体)可以包含如SEQ ID NO:2中所定义的氨基酸序列。根据本发明的蛋白，除了在铰链、CH2和CH3区序列内包含用F、E和R对L234、L235和G236进行的所述取代之外，可以在其中包含进一步的取代。优选地，进一步取代的数目在人IgG1免疫球蛋白重链的铰链、CH2和CH3区内最多到5个额外取代的范围内。因此，在一个实施方案中，包含如SEQ ID NO:2所定义的序列的蛋白在如SEQ ID NO:2所定义的所述序列中包含进一步的取代，其中进一步的取代的数目由最多到5个取代组成。在另一个实施方案中，提供了根据本发明的蛋白，其包含如SEQ ID NO:2所定义的序列，在如SEQ ID NO:2所定义的所述序列中包含进一步的取代，其中进一步取代的数目由最多到10个取代组成。在另一个实施方案中，根据本发明的蛋白可以包含如SEQ IDNO:1中所定义的序列，或人IgG1的另一种同种异型的相应序列，并且具备在其铰链、CH2和CH3区序列内用F、E和R对L234、L235和G236的所述取代，并且也可以进一步包含取代，例如包括最多到5个进一步的取代。包含具有高度适合的进一步的取代的如SEQ ID NO:2中所定义的多肽的这种蛋白的实例是如在如SEQ ID NO：11和12中定义的氨基酸序列中所定义的，其具有进一步的取代，例如具有如本文所定义的R/L取代。此外，具有如本文所定义的任选的进一步取代的如SEQ ID NO：2或11和12所定义的所述氨基酸序列可以已缺失了末端赖氨酸。
此外，提供了根据本发明的蛋白，其可以是如本文所定义的抗体或全长抗体，其中第一和第二多肽两者均包含如SEQ ID NO:2、11或12中所定义的氨基酸序列。。
在另一个实施方案中，提供了如本文定义的蛋白，其可以是双特异性抗体，其中第一和第二多肽包含分别如SEQ ID NO：2和3中所定义的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了如本文定义的蛋白，其可以是双特异性抗体，其中第一和第二多肽包含分别如SEQID NO:11和12、或11和14、或12和13中所定义的氨基酸序列。这种多肽可包含与铰链区相邻的CH1区，例如如SEQ ID NO:4所定义的人CH1区。
在进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白、或单特异性或双特异性抗体包含与SEQ ID NO:2中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于如由Eu编号所定义的234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R。
在进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白、或单特异性或双特异性抗体包含与SEQ ID NO:11中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于405的位置处的氨基酸残基是L；氨基酸编号如由Eu编号所定义。
在进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白、或单特异性或双特异性抗体包含与SEQ ID NO:12中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于409的位置处的氨基酸残基是R；氨基酸编号如由Eu编号所定义。
在一些实施方案中，根据本发明提供的蛋白或双特异性抗体包含第一和第二多肽，其中
所述第一多肽包含与SEQ ID NO:2中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R，
且
所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和265的位置处的氨基酸残基分别是F、E和A；
氨基酸编号如由Eu编号所定义。
在仍然进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白或双特异性抗体包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于405的位置处的氨基酸残基是L，
且
所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于409的位置处的氨基酸残基是R；
氨基酸编号如由Eu编号所定义。
在仍然进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白或双特异性抗体包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:12中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于409的位置处的氨基酸残基是R，
且
所述第二多肽包含与SEQ ID NO:13中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和A且对应于405的位置处的氨基酸残基是L；
氨基酸编号如由Eu编号所定义。
在仍然进一步的实施方案中，根据本发明提供的蛋白或双特异性抗体包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和236的位置处的氨基酸残基分别是F、E和R且对应于405的位置处的氨基酸残基是L，
且
所述第二多肽包含与SEQ ID NO:14中所定义的序列具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或具有100％序列同一性的氨基酸序列，其中对应于234、235和265的位置处的氨基酸残基分别是F、E和A且对应于409的位置处的氨基酸残基是R；
氨基酸编号如由Eu编号所定义。
本文中鉴定为SEQ ID NO:2的序列包含人IgG1同种异型G1m(f)的铰链、CH2和CH3区，其中L234、L235和G236被F、E和R取代。在其铰链、CH2和CH3区序列中具备用F、E和R对L234、L235和G236的所述取代的人IgG1的其他同种异型的恒定区(各自包含CH1区)的相应序列作为SEQ ID NO:27(具有FER取代的人IgG1同种异型G1m(fa)的CH1、铰链、CH2和CH3区)、SEQ ID NO:29(具有FER取代的人IgG1同种异型G1m(za)的CH1、铰链、CH2和CH3区)、SEQID NO:31(具有FER取代的人IgG1同种异型G1m(zav)的CH1、铰链、CH2和CH3区)、SEQ ID NO：33(具有FER取代的人IgG1同种异型G1m(zax)的CH1、铰链、CH2和CH3区)提供。在另一个实施方案中，提供了编码如本文所定义的所述第一或第二多肽的核酸，其中所述第一和第二多肽两者均包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸的取代，最优选其中所述位置L234、L235和G236的取代分别为由F、E和R。在另一个进一步的实施方案中，提供了编码如本文所定义的所述第一或第二多肽的核酸，其中所述第一或第二多肽包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸的取代，优选其中所述位置L234、L235和G236的取代分别为由F、E和R。
在一个实施方案中，提供了编码第一或第二多肽的核酸，其中所述第一或第二多肽包含如SEQ ID NO:2、11或12所定义的氨基酸序列。这种核酸可进一步编码包含与铰链区相邻的CH1区的多肽，例如如SEQ ID NO:4所定义的CH1区。优选地，所述核酸编码免疫球蛋白重链。这种免疫球蛋白重链最优选包含人或人源化免疫球蛋白可变区。编码第一或第二多肽的这种核酸可以从编码序列中缺失末端赖氨酸。这些核酸可以与编码免疫球蛋白轻链的核酸等组合。
在一个实施方案中，提供了用于提供用于产生根据本发明的具有非激活Fc区的蛋白的构建体的方法，其中所述蛋白包含第一和第二多肽，其具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区，例如SEQ ID NO：1等中所定义的，所述方法包括以下步骤：
a)提供用于表达第一和/或第二多肽的构建体或多个构建体，其包含编码包含铰链区、CH2区和CH3区的第一和/或第二多肽序列的核酸序列；
b)修饰编码对应于铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236的氨基酸的所述核酸序列，从而使得它们分别编码F、E和R；
c)从而提供用于产生具有非激活Fc区的蛋白的构建体、多个构建体。
在另一个实施方案中，提供了用于提供用于产生具有非激活Fc区的蛋白的构建体的方法，其中所述蛋白包含第一和第二多肽，其具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区，例如SEQ ID NO：1等中所定义的，所述方法包括以下步骤：
a)提供编码铰链区、CH2区和CH3区的核酸序列，如SEQ ID NO：1等中所定义的；
b)修饰编码对应于铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236的氨基酸的所述核酸序列，从而使得它们分别编码F、E和R；
c)使用步骤b)中获得的修饰的序列产生构建体，用于表达根据本发明的蛋白的第一和/或第二多肽，其包含编码所述第一和/或第二多肽的核酸序列，所述第一和/或第二多肽包含铰链区，CH2区和CH3区，其中在铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236被修饰以分别编码F、E和R，从而提供用于产生具有非激活Fc区的根据本发明的蛋白的构建体。
在进一步的实施方案中，提供了用于提供用于产生具有非激活Fc区的抗体的构建体的方法，其中所述抗体包含具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区的重链，例如SEQ ID NO：1等中所定义的，所述方法包括以下步骤：
a)提供用于表达抗体的重链的构建体，其包含编码包含铰链区、CH2区和CH3区的抗体的重链序列的核酸序列；
b)修饰编码对应于铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236的氨基酸的所述核酸序列，从而使得它们分别编码F、E和R；
c)从而提供用于产生具有非激活Fc区的抗体的构建体。
在又另一个实施方案中，提供了用于提供用于产生具有非激活Fc区的抗体的构建体的方法，其中所述抗体包含具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区的重链，例如SEQ ID NO：1等中所定义的，所述方法包括以下步骤：
a)提供编码铰链区、CH2区和CH3区的核酸序列，如SEQ ID NO：1等中所定义的；
b)修饰编码对应于铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236的氨基酸的所述核酸序列，从而使得它们分别编码F、E和R；
c)使用步骤b)中获得的修饰的序列产生构建体，用于表达抗体的重链，其包含编码抗体的重链序列的核酸序列，所述抗体的重链序列包含铰链区，CH2区和CH3区，其中在铰链区、CH2区和CH3区中的氨基酸L234、L235和G236被修饰以分别编码F、E和R，从而提供用于产生具有非激活Fc区的抗体的构建体。
可以理解的是，在提供上述构建体的方法中，具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区的多肽或重链可以是任何这种包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区，例如根据本发明在本文中定义的。这种方法对于通过引入FER取代来改善抗体的安全性概况或抑制Fc-介导的效应子功能特别有用。这种方法对于通过引入所述FER取代来改善蛋白、抗体等的安全性概况是有用的。这种方法对于通过引入FER取代来抑制蛋白、抗体等的Fc-介导的效应子功能也是有用的。这种方法对于通过引入FER取代来改善蛋白、抗体等的安全性概况并抑制Fc-介导的效应子功能特别有用。利用所述方法，人们可以提供核酸，利用所述核酸以获得根据本发明的具有包含铰链区、CH2和CH3区的Fc区的蛋白。
这种核酸对于产生根据本发明的蛋白特别有用，如例如包含重链和轻链的抗体，所述重链和轻链包含如本文所定义的根据本发明的第一和第二多肽。这种抗体可以是单特异性抗体或双特异性抗体。因此，在另一个方面，提供了编码根据本发明的所述第一或第二多肽的核酸，其供编码例如抗体的序列的表达载体之用。因此，提供了包含这种表达载体的宿主细胞，包括可以产生抗体的杂交瘤，以及通过在适当条件下培养这种宿主细胞或杂交瘤来产生这种抗体的方法，由此产生并且任选地收回根据本发明抗体的蛋白，例如抗体。
因此，可以向宿主细胞提供根据本发明的核酸，其中所述核酸并入表达载体中，例如描述于例如实施例部分等中。在本发明的上下文中的表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体和合成核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。这种载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体以及病毒或非病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码抗体的核酸包含在裸DNA或RNA载体中，所述裸DNA或RNA载体包括例如线性表达元件(如在例如Sykes和Johnston，NatBiotech17,355-59(1997)中所述的)，紧实核酸载体(compactednucleic acidvector)(如在例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述的)，质粒载体例如pcDNA3.3(如本文所述的)、pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119，“midge”最小尺寸的核酸载体(如在例如Schakowski等人，MolTher3,793-800(2001)中所述的)或作为沉淀的核酸载体构建体，例如CaPO4 --沉淀的构建体(如在例如WO 00/46147、Benvenisty和Reshef，PNAS USA83,9551-55(1986)、Wigler等人，Cell14,725(1978)和Coraro和Pearson，Somatic CellGenetics 7,603(1981)中所述的)。这种核酸载体及其使用是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施方案中，载体适合于在细菌细胞中表达。这种载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(VanHeeke&Schuster,JBiolChem264,5503-5509(1989))、pET载体(Novagen,Madison WI)等。表达载体还可以或备择地是适合于在酵母系统中表达的载体。可以采用适合于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel等人，编.Current Protocols inMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterScienceNewYork(1987)和Grant等人，Methods in Enzymol 153,516-544(1987))。
核酸和/或载体还可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以将多肽如新生多肽链靶向周质间隙或进入细胞培养基内。这种序列是本领域已知的，并且包括分泌前导序列或信号肽、细胞器靶向序列(例如，核定位序列、ER保留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如，终止转移序列、GPI锚定序列)等。
在本发明的表达载体中，根据本发明的核酸可以包含任何合适的启动子、增强子和其它表达促进元件，或者与之有关。这种元件的实例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子，以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIVLTR启动子)、有效的聚腺苷酸终止序列、用于在大肠杆菌(E.coli)中的质粒产物的复制起点、作为选择标记的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如，多接头)。与组成型启动子例如CMVIE相反，核酸还可以包含诱导型启动子(技术人员将认识到这种术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述符)。
因此提供了包含编码根据本发明的抗体的核酸序列的宿主细胞，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，其包含在L234、L235和G236位置处的氨基酸分别被F、E和R的取代。这种宿主细胞对于制造单特异性抗体特别有用，其具有两条相同的包含所述第一和第二多肽的重链和两条相同的轻链，例如本文所述的。特别地，当提供两种这种抗体时，其中重链的序列不同并且允许交换臂，例如在实施例部分中所描述的，这样的两种抗体可以高度有利地用于制备双特异性抗体。
如所述的，可能不需要双特异性抗体的第一和第二多肽两者将具有在位置L234、L235和G236处用F、E和R的相同取代。例如，一个可以具有不同的取代。这便于例如双特异性抗体的方便制造，这是因为人们不必要每次都产生例如用于筛选不同抗体组合的新构建体和/或细胞系，由其可作为新产物产生和/或开发双特异性抗体，从而节省相当大的时间和精力。
因此，在一个实施方案中，提供了制备根据本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)提供第一抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
b)提供第二抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含在下述的氨基酸的取代
-位置L234、L235和D265，其中优选地，所述取代分别是F、E和A，
或者，
-包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
c)其中所述各自的第一和第二抗体的所述第一和第二CH3区的序列不同，并且是这样的，从而使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的同二聚体相互作用中的每一个；
d)在足以允许铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和
e)获得包含所述第一抗体的所述第一免疫球蛋白重链和所述第一免疫球蛋白轻链以及所述第二抗体的所述第二免疫球蛋白重链和所述第二免疫球蛋白轻链的所述双特异性抗体。
在进一步的实施方案中，可以产生多特异性抗体而不是双特异性抗体。
可以理解的是，如步骤a)和b)中所提供的第一和第二抗体优选是单特异性抗体。更优选地，所述单特异性抗体是全长抗体。最优选地，所述抗体包含人或人源化可变区并具有人恒定区，其包含如本文所定义的取代。高度适合上述方法的示例性第一和第二抗体是包含分别如SEQ ID NO:11和12；11和14，或12和13中定义的氨基酸序列的第一和第二抗体。制备双特异性抗体的这种方法描述于尤其本文的实施例中，并且在(Labrijn等人，2014,Nature Protocols 10月；9(10):2450-63)中也有充分的描述。当然，在步骤c)中可以预期其他合适的差异，例如本文中所描述的。
药物组合物
在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文描述的任何方面和实施方案中所定义的蛋白例如抗体和药学上可接受的载体。
药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版,Gennaro,Ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA,1995中公开的那些。
药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂应当适合于本发明的蛋白、变体或抗体以及所选择的施用模式。药物组合物的载体和其他组分的适合性是基于对本发明的所选化合物或药物组合物的所期望的生物性质没有显著的负面影响来确定的(例如，对抗原结合小于实质性影响(10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等))。
本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充物、盐、缓冲剂、去污剂(例如，非离子型去污剂，诸如吐温-20或吐温-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、加溶剂和/或适合包含在药物组合物中的其他材料。
可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述量在不对患者有毒性的情况下对于特定患者、组合物和施用模式有效地实现期望的治疗应答。选择的剂量水平将取决于医学领域众所周知的多种药物代谢动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物或其酰胺的活性，施用途径，施用时间，待采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和既往病史，以及类似因素。
药物组合物可以通过任何合适的途径和模式进行施用。体内和体外施用本发明的蛋白、变体或抗体的合适途径是本领域众所周知的并且可以由本领域普通技术人员选择。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是肠胃外施用的。
如本文所使用的，短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注进行施用。
用于注射的药物组合物一般必须是无菌的并且在制造和贮藏条件下稳定。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与如所需要的一种成分或成分的组合(例如，如上文所列举的)并入适当的溶剂中继之以灭菌微量过滤来制备。通常，分散体是通过将活性化合物并入含有基本分散介质和所需的其他成分(例如，来自上面列举的那些)的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外所期望的成分的粉末。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与如所需要的上文所列举的一种成分或成分的组合并入适当的溶剂中继之以灭菌微量过滤来制备。通常，分散体是通过将活性化合物并入含有基本分散介质和所需的来自上面列举的那些的其他成分的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外所期望的成分的粉末。
治疗应用
在另一个方面，本发明涉及用作药物的如本文描述的任何方面或实施方案中所定义的本发明的蛋白，例如抗体，或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及供治疗疾病之用的如本文描述的任何方面或实施方案中所定义的本发明的蛋白，例如抗体，或药物组合物。
在进一步的方面，所述疾病的治疗包括癌症、传染病、炎性疾病或自身免疫性疾病的治疗。在另一个方面，本发明涉及其中疾病是癌症的用途。可以理解的是，高度优选这种用途涉及在人中的用途。
在另一个方面，本发明涉及治疗方法，其包括对人主体施用如本文描述的任何方面或实施方案中所定义的本发明的蛋白，例如抗体，或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及治疗方法，其包括对患有疾病的人主体施用如本文描述的任何方面或实施方案中所定义的本发明的蛋白，例如抗体，或药物组合物。在进一步的方面，所述疾病包括癌症、炎性疾病、传染病或自身免疫性疾病。在另一个方面，所述疾病是癌症。
本发明的蛋白、变体、抗体或药物组合物可用于治疗，其中不期望如在野生型抗体中所发现的抗体IgG1 Fc区的免疫效应子功能。例如，可以将蛋白、变体或抗体施用至培养物中的细胞，例如，体外或先体外后体内，或施用至人主体，例如，体内，以治疗或预防病症，例如癌症、传染病、炎性疾病或自身免疫性疾病。如本文所用的，术语“主体”一般是对蛋白、变体、抗体或药物组合物起反应的人。主体可以例如包括患有可通过直接或间接调节靶功能或通过导致细胞杀伤来校正或改善的病症的人患者。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防病症例如癌症的方法，其中T-细胞的募集将有助于治疗或预防，所述方法包括向有需要的主体施用治疗有效量的本发明的蛋白、变体、抗体或药物组合物。例如，根据本发明的这种蛋白将能够接合细胞毒性T-细胞，例如靶向CD3和癌抗原的双特异性抗体。超表达肿瘤特异性靶的细胞是本发明的这种蛋白、变体或抗体的特别好的靶，这是因为通过蛋白、变体或抗体的两个结合区之一募集T-细胞可以触发所述T-细胞的细胞毒性活性。所述机制正常难以获得，这是因为细胞毒性活性的触发在消除癌细胞中可能不能正确地起作用。
在另一个方面，例如本文所述的根据本发明的蛋白，包括抗体和双特异性抗体，与另一分子缀合。这种蛋白可以通过将另一种分子化学缀合至蛋白或其抗体或其片段的N-末端侧或C-末端来产生(参见，例如，Antibody Engineering Handbook，由Osamu Kanemitsu编辑，由Chijin Shokan出版(1994))。在适当的场合，这种缀合的抗体衍生物还可以通过在内部残基或糖处缀合来产生。在优选的方面，根据本发明的蛋白，包括抗体和双特异性抗体，与治疗用分子缀合。合适的治疗用分子可以包括例如核酸，例如适配体、核酶、反义分子或RNAi诱导剂。可以预期的其他治疗用分子包括细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。这种缀合物可被称为免疫缀合物。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物可被称为免疫毒素。
用于形成本发明的免疫缀合物的合适的治疗用分子可包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素、抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(如氮芥、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物如卡铂)、抗生素(如放线菌素D(以前称为放线菌素))、博莱霉素、柔红霉素(原柔毛霉素)、阿霉素、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、蒽霉素(AMC))、白喉毒素及相关分子(如白喉A链及其活性片段和杂合分子)、蓖麻毒蛋白(例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化的蓖麻毒蛋白A链毒素)、霍乱毒素、志贺样毒素(SLT I、SLT II、SLT IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺菌毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、alorin、皂草毒蛋白、塑莲根毒蛋白II、gelanin、相思豆素A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美国商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAPS)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素或依诺霉素毒素。
所述方法一般包括向主体施用有效治疗或预防病症的量的蛋白、变体或抗体。
蛋白、变体或抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或状况并且可以由本领域技术人员确定。
例如，用于治疗用途的“有效量”可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。例如，可以在预测人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制癌症的能力。另一方面，可以通过熟练的专业人员已知的体外测定通过检查蛋白、变体或抗体抑制细胞生长或诱导细胞毒性的能力来评价组合物的所述性质。治疗有效量的治疗用化合物，即根据本发明的治疗用蛋白、变体、抗体或药物组合物，可以减小主体中的肿瘤大小，或以其他方式改善症状。
在一个实施方案中，蛋白、抗体或变体可以通过维持疗法施用，如例如以规则的间隔达限定的时间段内，或者直到疾病进展为止。还可以预防性施用蛋白、抗体或变体，以降低发展癌症的风险、延迟癌症进展中事件发生的开始和/或降低当癌症处于缓和中时复发的风险。
还可以预防性施用蛋白、变体、抗体或抗体，以降低发展癌症的风险、延迟癌症进展中事件发生的开始和/或降低当癌症处于缓和中时复发的风险。
诊断应用
使用包含如本文所述蛋白的组合物，本发明的非激活蛋白还可对于诊断目的有用。因此，本发明提供了使用本文描述的蛋白的诊断方法和组合物。这种方法和组合物可用于纯粹的诊断目的，例如检测或鉴定疾病，以及用于监控治疗性治疗的进展、监控疾病进展、评估治疗后状态、监控疾病复发、评价发展疾病的风险等。通过使用根据本发明的这种蛋白，这允许例如避免由Fc区发挥的任何可能干扰诊断应用的不需要的作用。
在一个方面，本发明的蛋白被先体外后体内使用，例如通过检测取自患者的样品中的靶水平或在其细胞表面上表达感兴趣的靶的细胞的水平来诊断疾病，其中表达感兴趣的特定靶并且与蛋白结合的细胞指示疾病或与发病机理有关。这可以例如通过将待测试的样品(任选地与对照样品一道)与根据本发明的蛋白在允许蛋白与靶结合的条件下接触来实现。然后可以检测复合物的形成(例如，使用ELISA)。当与测试样品一道使用对照样品时，对两种样品中的蛋白或蛋白-靶复合物的水平都进行分析，并且测试样品中统计学显著更高水平的蛋白或蛋白-靶复合物表明与对照样品相比测试样品中更高水平的靶。
其中可以使用本发明的蛋白的常规免疫测定的实例包括但不限于ELISA、RIA、FACS测定、等离振子共振测定、层析测定、组织免疫组织化学、蛋白印迹和/或免疫沉淀法。
在一个实施方案中，本发明涉及用于检测样品中靶或表达靶的细胞的存在的方法，包括：
-在允许所述蛋白与所述样品中的靶结合的条件下使所述样品与本发明的蛋白接触；和-分析复合物是否已形成。一般，样品是生物样品。
在一个实施方案中，样品是已知或怀疑含有特定靶和/或表达所述靶的细胞的组织样品。例如，靶表达的原位检测可以通过从患者取出组织学样品并向所述样品提供本发明的蛋白来完成。可以通过将蛋白施加或覆盖到样品上来提供蛋白，其然后使用合适的手段进行检测。然后不仅可能测定靶或表达靶的细胞的存在，而且可能测定靶或表达靶的细胞在检查的组织中的分布(例如，在评估癌细胞扩散的背景中)。使用本发明，本领域技术人员将容易地理解可以修改多种组织学方法中的任何一种(例如染色程序)以实现这种原位检测。
在上述测定中，可以用可检测物质标记蛋白以允许结合的蛋白被检测。另一方面，可以通过用可检测物质标记并与初级特异性蛋白结合的抗体来检测结合的(初级)特异性蛋白。
样品中靶的水平还可以通过利用用可检测物质标记的靶标准物和未标记的靶特异性蛋白的竞争免疫测定来估计。在这种类型的测定中，将生物样品、一种或多种标记的靶标准物和靶特异性蛋白组合，并测定与未标记的靶特异性蛋白结合的标记的靶标准物的量。生物样品中靶的量与结合至靶特异性蛋白的标记的靶标准物的量成反比。
用于体外诊断技术中的靶特异性蛋白、第二抗体和/或靶标准物的合适标记包括，但不限于，各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S和3H。
在一个实施方案中，本发明提供了体内成像方法，其中本发明的靶特异性蛋白与促进检测的不透射线剂缀合，将缀合的蛋白施用于宿主，例如通过注射到血流中，并分析宿主中标记的蛋白的存在和位置。通过所述技术和本文提供的任何其他诊断方法，本发明提供了用于筛选人患者或取自人患者的生物样品中疾病相关细胞的存在和/或用于在靶特异性ADC疗法之前评估靶特异性蛋白的分布的方法。
对于诊断成像，放射性同位素可以通过使用中间官能团直接或间接结合至靶特异性蛋白。有用的中间官能团包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸(参见例如US 5,057,313)。
除了放射性同位素和不透射线剂之外，还可以使用与染料(例如与生物素-链霉抗生物素蛋白复合物)、造影剂、荧光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增强剂(enhancing agents)(例如顺磁离子)缀合的靶特异性蛋白来进行诊断方法(参见，例如，美国专利No.6,331,175，其描述了MRI技术以及与MRI增强剂缀合的蛋白的制备)。这种诊断/检测剂可以选自供MRI之用的试剂和荧光化合物。因此，本发明提供了诊断用靶特异性蛋白，其中所述靶特异性蛋白与造影剂(例如用于磁共振成像、计算机X线断层扫描术或超声造影增强剂)或放射性核素缀合，所述放射性核素可以是，例如，发射γ、β、α、俄歇电子或正电子的同位素。
在进一步的方面，本发明涉及用于检测样品中靶抗原或表达靶的细胞的存在的试剂盒，其包括：
-本发明的靶特异性抗体；和
-用于使用试剂盒的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断癌症的试剂盒，其包括容器，所述容器包含靶特异性蛋白和一种或多种用于检测所述靶特异性蛋白与靶的结合的试剂。试剂可以包括例如荧光标签、酶标签或其他可检测标签。试剂还可以包括用于酶促反应的第二或第三抗体或试剂，其中酶促反应产生可以显示的产物。在一个实施方案中，本发明提供了诊断试剂盒，其包括在一个或多个合适的容器中标记的或未标记的形式的一种或多种本发明的靶特异性蛋白、用于间接测定的温育的试剂以及取决于标记的特性用于这种测定中的检测的底物或衍生化剂(derivatizing agents)。还可以包括一种或多种对照试剂和使用说明书。
还可以提供供靶特异性蛋白例如标记的靶特异性蛋白使用的诊断试剂盒，用于检测组织样品或宿主中靶的存在。在这种诊断试剂盒中，以及在本文别处描述的用于治疗用途的试剂盒中，靶特异性蛋白一般可以以冻干形式在容器中单独地或与对靶细胞或肽具有特异性的额外的抗体一起提供。一般，药学上可接受的载体(例如，惰性稀释剂)和/或其组分，例如三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或碳酸盐缓冲剂，稳定剂，防腐剂，杀生物剂，惰性蛋白，例如血清清蛋白等，也可以包括(一般在单独的容器中用于和额外的试剂(也一般在一个或多个单独的容器中)混合)。在某些试剂盒中，还包括能够与靶特异性蛋白结合的第二抗体，其一般存在于单独的容器中。第二抗体一般与标记缀合并以类似于本发明的靶特异性蛋白的方式配制。使用如上文和本文别处所述的方法，靶特异性蛋白可用于定义癌症/肿瘤细胞的亚型并表征这种细胞和相关肿瘤组织。
表1
序列表
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实施例
介绍
当在IgG1同种型的抗体中使用FEA惰性形式(L234F-L235E-D265A)时，所述IgG1同种型抗体作为野生型IgG1在诱导补体介导的细胞毒性(CDC)中非常有效，CDC活性被强烈抑制。然而，在探索性实验中，显示携带FEA取代的IgG1抗体偶尔仍然保留低残留CDC活性，当设想的治疗用抗体的副作用或剂量限制性毒性可能高度随Fc-介导的效应子功能如CDC而定时，这可能是不期望的。此外，我们还观察到，与野生型样形式相比，携带FEA惰性形式的抗体中的糖基化异质性增加，以及半乳糖基化增加和存在荷电聚糖。糖基化概况的变化可能对功效和药物代谢动力学性质具有影响，且这需要在生产中进行监控和控制。在评价含有FEA惰性形式的抗体的聚糖概况时，我们观察到增加的糖基化异质性、增加的半乳糖基化水平以及增加的荷电聚糖水平可能归因于D265A取代。鉴于FEA可能残留的CDC活性，并鉴于FEA的糖基化概况，我们试图提供一种改进的形式。
在寻求改进时，预期组合L234F、L235E和G236R取代。然而，组合任何突变，更不用说任何特定突变的选择，内在地都是不可预测的。此外，组合L234F、L235E和G236R突变，即将多个修饰紧密组合在一起，并不直截了当，这是因为不能预测如此众多的变化的结构和/或功能的影响。我们因此在一项中试实验中测试了L234F、L235E和G236R(FER)组合对其沉默CDC的能力以及对抗体的糖基化概况有什么影响。令人惊讶地，这些初始实验表明，与单独取代以及与FEA取代相比，通过引入FER突变以沉默CDC的能力被高度地改进。此外，对糖基化概况的评价揭示，携带FER惰性形式的抗体现在具备与相应野生型样抗体相似的聚糖概况。因此，这些初始实验促进我们彻底分析FER惰性形式的临床适合性，其在下面的实施例中进行描述。令人惊讶地，在所有测试的特征上，当与FEA惰性形式以及与其他惰性形式相比时，都观察到FER惰性形式的高度有利的性质。这表明所述新的FER形式十分适合于临床开发和临床使用。可能也在除抗体以外的背景如例如融合蛋白中有用的这种非激活形式可以被认为是高度有利的并且同类最优的非激活形式。
实施例1：抗体变体的产生和纯化以及双特异性抗体变体的产生
抗体的表达构建体
为了表达具有人或人源化结合结构域的抗体，通过从头基因合成(GeneArt GeneSynthesis；ThermoFisher Scientific，德国)制备包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链结构域的序列的抗体构建体，并且克隆到pcDNA3.3表达载体(ThermoFisher Scientific，美国)中，所述pcDNA3.3表达载体含有人IgG1m(f)同种异型(在本申请的实施例部分中自始至终也称为IgG1；SEQ ID NO:5)、或人IgG1m(fa)同种异型(SEQ ID NO:23)、或人IgG1m(za)同种异型(SEQ ID NO:24)、或人IgG1m(zax)同种异型(SEQ ID NO:25)、或人IgG1m(zav)同种异型(SEQ ID NO:26)、或具有C-末端赖氨酸的重组缺失的人IgG1m(f)同种异型(也称为IgG1-delK；SEQ ID NO:35)的人IgG1重链恒定区(即CH1、铰链、CH2和CH3区)、或其变体；人IgG4重链恒定区(铰链、CH2、CH3，SEQ ID NO:8；CH1、铰链、CH2、CH3，SEQ ID NO:46)或其变体；人IgG3同种异型IGHG3*01(SEQ ID NO:40)或人IgG3同种异型IGHG3*04(也称为IgG3rch2；SEQID NO:41)的人IgG3重链恒定区、或其变体；鼠IgG2a重链恒定区(SEQ ID NO:38)或其变体；或人κ轻链(LC；SEQ ID NO:6)、或人λLC(SEQ ID NO:7)、或鼠κLC(SEQ ID NO:49)的恒定区，如对于选择的结合结构域所合适的。通过基因合成且如下文所述的引入期望的取代以产生变体。所述申请中的CD20抗体变体具有衍生自以前描述的I型抗人CD20抗体的VH和VL序列(Engelberts等人，2020)。所述申请中的HLA-DR抗体变体具有衍生自以前描述的HLA-DR抗体IgG1-HLA-DR-4(US6894149B2)和IgG1-HLA-DR-1D09C3(US7521047 B2)的VH和VL序列。所述申请中的CD3抗体及其变体具有衍生自以前描述的CD3抗体的VH和VL序列(即，CD3-huCLB-T3/4：Labrijn等人，PNAS,2013年3月26日；110(13):5145-50和Engelberts等人，2020)。所述申请中的HER2抗体变体包含衍生自IgG1-HER2-1014-169的VH和VL序列(WO2012143524)。包含b12的VH/VL的人IgG1抗体，HIV1 gp120-特异性抗体，在一些实验中用作阴性对照(Barbas等人，JMol Biol.1993年4月5日；230(3):812-2)。
非激活抗体变体
在对照抗体中使用野生型人IgG1重链恒定区(即，铰链、CH2和CH3区)或其携带F405L突变(SEQ ID NO:9)或K409R突变(SEQ ID NO:10)的野生型样变体，如所示的。在一些实施例中，使用具有IgG4的恒定区(SEQ ID NO:8)的野生型抗体变体或其在SEQ ID NO:8中携带S228P突变的IgG4变体作为对照。
非激活Fc结构域防止抗体与免疫细胞上存在的Fc-受体或与C1q相互作用以激活经典补体途径。如下文实施例中所述的，产生了几种非激活抗体变体并测试了沉默Fc功能的能力。在一些实施例中，测试了非激活抗体变体亚群的药物代谢动力学性质、免疫原性或可开发性。
如上文所示且所述的，产生了具有不同的VH和VL序列的各种非激活抗体变体。将下述取代(其中氨基酸如通过Eu编号所定义的)也与F405L或K409R突变组合引入SEQ IDNO:1的IgG1m(f)HC区中，以允许产生双特异性非激活抗体变体：单独L234F-L235E-D265A(尤其US10590206B2)(SEQ ID NO:3)、或与F405L(SEQ ID NO:13)或K409R(SEQ ID NO:14)组合，单独L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:2)、或与F405L(SEQ ID NO:11)或K409R(SEQ IDNO:12)组合，单独L234A-L235A-P329G(Schlothauer等人，2016,Protein Eng.DesignandSelection)、或与F405L或K409R组合，G236R-L328R(US2006/0235208A1，Moore等人，2011，MAbs)与F405L或K409R组合，E233P-L234V-L235A-delG236-S267K(Moore等人，2019，Methods)与F405L或K409R组合，N297G(Tao和Morrison，1989，JI)与F405L或K409R组合，以及L234A-L235E-G237A-A330S-P331S(US8613926k)与F405L或K409R组合。在SEQ ID NO：35的具有HC C-末端赖氨酸的重组缺失的IgG1m(f)HC区(也称为IgG1-delK)中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:36)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:37)。在SEQ ID NO:23的IgG1m(fa)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:27)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:28)。在SEQ ID NO:24的IgG1m(za)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:29)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:30)。在SEQ ID NO:25的IgG1m(zax)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:33)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:34)。在SEQ ID NO:26的IgG1m(zav)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:31)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:32)。在SEQ ID NO:40的IgG3(IGHG3*01)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:42)和L234F-L235E-D265A(SEQID NO:43)。在SEQ ID NO:41的IgG3(IGHG3*04；也称为IgG3rch2)HC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:44)和L234F-L235E-D265A(SEQ ID NO:45)。单独或与F405L-R409K突变组合在SEQ ID NO:8的IgG4 HC区中引入下述突变，以允许产生双特异性非激活抗体变体：S228P-E233P-F234V-L235A-delG236(WO2015/143079)或与F405L-R409K组合，S228P-F234A-L235A(Allegre等人，Transplantation,1994年6月15日；57(11):1537-43和Angal等人，Mol Immunol,1993年1月；30(1):105-8)或与F405L-R409K组合，L235E-G236R(SEQ ID NO:47)，和L235E-D265A(SEQ ID NO:48)。在SEQ ID NO:38的鼠IgG2aHC区中引入下述突变：L234F-L235E-G236R(SEQ ID NO:39)、L234A-L235A(Arduin等人，MolImmunol,2015年2月；63(2):456-63)和L234A-L235A-P329G(Lo等人，JBiolChem,2017年3月3日；292(9):3900-3908)。
瞬时表达
抗体作为人IgG1κ、IgG1λ、IgG3κ、IgG4κ或鼠IgG2aκ进行表达。根据制造商的说明书，使用ExpiFectamineTM(Thermo Fisher Scientific，Cat#A14525)将编码抗体重链和轻链两者的质粒DNA混合物瞬时转染到Expi293FTM细胞((ThermoFisher Scientific，Cat#A14527)中。简而言之，DNA(1:1HC/LC比例)和ExpiFectamine两者在Opti-MEM I(ThermoFisher Scientific，Cat#51985034)中分别单独稀释至20μg/ml和5.4％(v/v)。将两种溶液温育5分钟，混合并在添加到补加有pen/strep的新鲜Opti-MEM中的3x106 Expi293F细胞/ml中(最终DNA浓度1μg/ml)之前温育10-20分钟。转染后约16-24小时，添加ExpiFectamine293转染强化因子(TransfectionEnhancer)I(0.5(v/v)％)和II(5(v/v)％)。一般在转染后5天收获上清液。通过280nm处的吸光度测量上清液中的抗体浓度。如下所述纯化抗体。
抗体纯化和质量评估
通过A蛋白亲和层析纯化抗体。培养物上清液在0.20μM死端过滤器上过滤，并加样到5mL MabSelect SuRe柱(GEHealthcare/Cytiva)上，用0.02M柠檬酸钠-NaOHpH5.0洗涤，并用0.02M柠檬酸钠-NaOH，pH 3洗脱。将洗脱物针对PBS(由HyClone/Cytiva为Genmab制备的8.65mM Na2HPO4无水，1.9mM NaH2PO4一水合物，140.3mM NaCl，pH 7.4缓冲液)透析。当需要时，通过制备型尺寸排阻层析(SEC)进一步纯化蛋白以去除聚集体。缓冲液更换或SEC后，样品在0.2μm死端过滤器上进行无菌过滤。通过质谱分析法、毛细管电泳(非还原型和还原型CE-SDS)和高效尺寸排阻层析(HP-SEC)分析纯化发蛋白的质量。通过280nm处的吸光度测量浓度。纯化的抗体贮藏于2-8℃。
双特异性抗体的产生
IgG1双特异性抗体是通过除了上面列出的非激活突变之外在CH3结构域中携带F405L突变的单特异性抗体和在CH3结构域中携带K409R突变的单特异性抗体之间的受控Fab-臂交换(cFAE)产生的，基本上如以前所报道的(Labrijn等人，2014,NatureProtocolsOct；9(10):2450-63)。对于IgG4双特异性变体，一种单特异性抗体在位置409上带有天然精氨酸(R)，而另一种单特异性抗体在抗体的CH3结构域中携带F405L-R409K突变。简而言之，将两种单特异性抗体以等摩尔浓度混合，并与75mM2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)于31℃温育5小时。接着，通过使用Slide-A-Lyzer透析盒(10K MWCO；ThermoFisher Scientific)于4℃针对PBS缓冲液更换过夜去除2-MEA。透析缓冲液更换两次。从盒中收集生成的双特异性抗体并通过280nm处的吸光度测量浓度。纯化的双特异性抗体贮藏于2-8℃，且一般通过CE-SDS和HP-SEC进行分析，以评估生成的双特异性抗体的单体状态，并使用Orbitrap Q-ExactivePlus质谱仪(ThermoFischer Scientific)进行质谱分析法分析以确定cFAE的效率和双特异性抗体含量。
F(ab’)2片段的生成
基本上根据制造商的建议，使用FragIT试剂盒(Genovis AB)生成靶向HLA-DR的F(ab’)2片段。简而言之，具有与琼脂糖珠偶联的FragIT的旋转柱用消化缓冲液(GenovisAB)平衡，所述FragIT是具有FabRICATOR酶的树脂，所述FabRICATOR酶可在铰链区下方的特定位点消化IgG，从而生成F(ab')2和Fc/2片段的均质集合体。接着，将具有E430G突变的抗人HLA-DR抗体变体IgG1-HLA-DR-1D09C3应用于柱并于室温(RT)温育15分钟。温育后，从柱中洗脱并收集样品。通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上的毛细管电泳(CE-SDS)分析纯化的F(ab’)2片段。通过280nm处的吸光度测量浓度。纯化的抗体贮藏于2-8℃。
实施例2：抗人CD20抗体及其非激活变体在Raji细胞上的靶结合具有野生型Fc的抗人CD20 IgG1抗体及携带K409R、L234F-L235E-D265A-K409R、L234F-L235E-G236R-K409R、L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R、N297G-K409R、L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R的变体，具有野生型Fc的IgG4抗体及携带S228P、S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del的变体的靶结合使用表达CD20的Raji细胞进行评估。使用抗-HIV1 gp120IgG1野生型抗体(IgG1-b12)作为非结合对照。
为此，FACS缓冲液(1xPBS，Cat#BE17-517Q，Lonza；0.1％牛血清清蛋白，BSA，Cat#10735086001，Merck；0.02％NaN3，Cat#41920044-3，Bio-world)中的Raji细胞(3x104个细胞，Cat#CCL-86，ATCC)与总体积为50μL的一系列浓度的靶向CD20的纯化的抗体(0.0013-20μg/mL终浓度；5-倍稀释)在聚苯乙烯圆底96-孔平板(Cat#650180，Greinerbio-one)中于4℃温育30分钟。接着，通过添加150μL FACS缓冲液洗涤细胞两次，继之以通过离心沉淀细胞并除去上清液。通过添加50μL山羊F(ab’)2抗人κ-PE(终浓度2.5μg/mL，Cat#2062-09，Southern Biotech)于4℃将结合的抗体染色30分钟。接着，通过添加150μL FACS缓冲液洗涤细胞两次，继之以通过离心沉淀细胞并除去上清液。通过测量中值荧光强度(MedianFluorescence Intensity)，通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上检测抗体变体与人CD20的结合。使用GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中的非线性激动剂剂量反应模型对数据进行分析。数据是从四次独立实验获得的平均值±SEM。
抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体的靶结合的评估揭示了对于重链恒定区中携带突变的所有抗人CD20 IgG1抗体变体的相似的靶结合(图1A-B)。所有抗人CD20 IgG4抗体变体，包括在重链恒定区中携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del非激活突变的那些，与IgG1抗体变体相比，都显示出稍微降低的靶结合。
总之，在抗人CD20 IgG1-和IgG4抗体的重链中引入非激活突变并不影响它们结合其靶CD20的能力。
实施例3：抗人CD20抗体及其非激活变体的依赖补体的细胞毒性对于在治疗效果不依赖与免疫系统的效应分子(例如补体蛋白C1q和Fcγ受体)的相互作用并且副作用或剂量限制性毒性高度依赖于这种相互作用的场合的治疗用单克隆抗体，可以考虑非激活Fc结构域以增加治疗窗。抗体与C1q蛋白的接合起始经典补体途径，从而导致依赖补体的细胞毒性(CDC)。在此，评估了由于其有效且强有力的CDC诱导而选择的I型抗人CD20抗体(Glennie等人，Mol Immunology,2007年9月；44(16):3823-37)以及在恒定重链区中携带非激活突变的这种抗体的变体诱导CDC的能力。
抗人CD20 IgG1抗体，或者作为野生型，或者携带K409R突变，或者其携带L234F-L235E-D265A-K409R、L234F-L235E-G236R-K409R、L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R、N297G-K409R、L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变的非激活变体，以及抗人CD20 IgG4抗体，或者作为野生型，携带突变S228P和携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del突变的非激活变体在许多浓度(0.0024-10μg/mL终浓度；4-倍稀释)中在Raji细胞上在体外CDC测定中使用20％正常人血清(NHS，Cat#M0008，Sanquin)作为补体来源进行了测试。在含有0.1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA，Cat#10735086001，Merck)和青霉素-链霉素(Pen/Strep，终浓度为50单位/mL青霉素钾和50μg/mL硫酸链霉素，Cat#DE17-603E，Lonza)的RPMI-1640培养基(Cat#BE12-115F，Lonza)中的Raji细胞(每孔3x104个细胞)在聚苯乙烯圆底96-孔平板(Cat#650180，Greiner bio-one)中与总体积为80μL的一系列浓度的纯化的靶向CD20的抗体于室温(RT)温育15分钟。接着，添加20μLNHS(终浓度20％(v/v))并将细胞于37℃温育45分钟。通过将平板置于冰上来停止反应，然后通过离心沉淀细胞并用30μLPBS(Cat#SH3A3830.03，GE Healthcare)中的2μg/mL的碘化丙啶(PI，Cat#P4170，Sigma Aldrich)置换上清液。PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在Intellicyt iQue筛分机(Sartorius)上测定。对应于细胞裂解的百分比的PI-阳性细胞的百分比计算为(PI-阳性细胞数/细胞总数)x100％。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对非结合对照抗体IgG1-b12(0％)测量的AUC值和对野生型IgG1抗体变体(抗人CD20 IgG1，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立实验获得的平均值±SEM。
抗人CD20 IgG1和IgG4变体的CDC能力的评估揭示，通过在重链恒定区中引入非激活突变来消除CDC的能力可分为两组。对于除了K409R突变之外还携带L234F-L235E-G236R、L234A-L235A-P329G、G236R-L328R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K、N297G和L234A-L235E-G237A-A330S-P331S非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体，以及携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del非激活突变的IgG4抗体变体，诱导CDC的能力被消除。然而，与野生型IgG1相比，对于携带突变L234F-L235E-D265A-K409R的抗人CD20IgG1变体观察到残留的CDC(图2)。
总之，具有新变体L234F-L235E-G236R和K409R突变的IgG1抗体显示出几乎完全不存在经典补体途径的激活。使用仅具有新的L234F-L235E-G236R突变且不具有K409R突变的抗体观察到类似的效果。这代表了比起尤其携带L234F-L235E-D265A和K409R突变的IgG1抗体变体来显著的进步，对于所述抗体变体观察到残留的CDC。
实施例4：C1q与抗人CD20抗体及其非激活变体的结合的评价在实施例3中，显示了诱导CDC的效力被携带抑制Fc-介导的效应子功能的突变的抗人CD20IgG1和IgG4抗体变体强烈降低。这里，使用表达CD20的Raji细胞评估补体蛋白C1q与在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体的结合。
使用以20％正常人血清(NHS，M0008，Sanquin)作为C1q来源的Raji细胞上的C1q结合测定，并在许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3-倍稀释)测试抗人CD20抗体及其非激活变体。在含有0.1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA，Cat#10735086001，Merck)和青霉素-链霉素(Pen/Strep，终浓度为50单位/mL青霉素钾和50μg/mL硫酸链霉素，Cat#DE17-603E，Lonza)的RPMI-1640培养基(Cat#BE12-115F，Lonza)中的Raji细胞(每孔1x105个细胞)在聚苯乙烯圆底96-孔平板(Cat#650180，Greinerbio-one)中与总体积为80μL的一系列浓度的纯化的靶向CD20的抗体于37℃温育15分钟。为了防止添加NHS时CDC的激活，通过将平板置于冰上来冷却细胞。接着，添加20μLNHS(终浓度20％(v/v))并将细胞于4℃温育45分钟，继之以通过离心沉淀细胞并去除上清液。接着，通过添加150μLFACS缓冲液(1xPBS，Cat#BE17-517Q，Lonza；0.1％牛血清清蛋白，BSA；0.02％NaN3，Cat#41920044-3，Bio-world)洗涤细胞两次，继之以通过离心沉淀细胞并去除上清液。通过添加50μL多克隆兔抗人C1q补体-FITC(终浓度20μg/mL，Dako，Cat#F0254，AgilentTechnologies)于4℃将结合的C1q染色30分钟。接着，通过添加150μL FACS缓冲液洗涤细胞两次，继之以通过离心沉淀细胞并除去上清液。通过测量中值荧光强度-FITC(Median Fluorescence Intensity-FITC)，通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上检测C1q与抗体变体结合。使用GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中的非线性激动剂剂量反应模型对数据进行分析。数据是从单个实验的三次重复测量获得的平均值(±SD)。
对C1q与抗人CD20 IgG1变体的结合的评估揭示，具有K409R突变的抗人CD20 IgG1在与靶Raji细胞上的CD20结合时有效地与补体蛋白C1q接合，而抗-HIV1 gp120抗体(IgG1-b12；CD20非结合对照)不与C1q接合。L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的引入急剧降低了C1q结合(图3)。与携带L234F-L235E-D265A突变的抗人CD20IgG1变体相比，C1q与携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD20 IgG1变体的结合更强烈地降低。这与这些非激活突变对CDC激活的影响一致，如实施例3中所示的。
总之，携带L234F-L235E-G236R非激活突变的非激活抗人CD20 IgG1变体显示出强烈降低的C1q结合，与观察到的CDC中的降低一致。
实施例5：抗人HLA-DR抗体及其非激活变体的依赖补体的细胞毒性在实施例3中，使用体外CDC测定评估在恒定重链中携带非激活突变的抗人CD20抗体变体对经典补体途径的激活。实施例3中的数据揭示，含有新的L234F-L235E-G236R和K409R突变的抗人CD20IgG1变体阻止经典补体途径的激活。在所述实施例中，我们使用两种靶向人HLA-DR的抗体进一步评估了非激活抗体变体的CDC能力，其当与IgG1主链一起使用时是CDC的有效诱导物。
基本上如实施例3中所述，用20％NHS作为补体来源在Raji细胞上进行了体外CDC测定。简言之，携带K409R突变的抗人HLA-DR抗体IgG1-HLA-DR-4和IgG1-HLA-DR-1D09C3或其在恒定重链区中携带与K409R组合的非激活突变L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R的变体以及HLA-DR-靶向F(ab’)2片段在许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3-倍稀释)进行了测试。作为细胞裂解的量度的PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上测定。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对野生型IgG1抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据基于五次(野生型和L234F-L235E-D265A-K409R变体)或两次(L234F-L235E-G236R-K409R变体或F(ab’)2片段)独立实验。
对抗人HLA-DR抗体变体的CDC能力的评估揭示，除了K409R突变之外还携带L234F-L235E-D265A突变的抗体变体保留了诱导Raji细胞的CDC的能力(图4A、B)。然而，在IgG1-HLA-DR-4-K409R和IgG1-HLA-DR-1D09C3-K409R抗体变体中引入L234F-L235E-G236R非激活突变急剧降低了诱导CDC的效力。此外，如对于IgG1-HLA-DR-1D09C3所观察到的，L234F-L235E-G236R-K409R抗体变体诱导CDC的效力与HLA-DR-靶向F(ab’)2片段诱导的CDC处于相同水平，所述片段缺乏Fc区，且因此不与补体蛋白C1q相互作用(图4B)。
总之，携带L234F-L235E-G236R突变的抗体变体有效地将CDC降低至与由F(ab’)2片段诱导的CDC相似的水平，所述片段不能与人补体系统接合。
实施例6：抗人CD20抗体及其非激活变体与Fcγ受体的结合如所述的，对于在治疗效果不依赖与免疫系统的效应分子(例如补体蛋白C1q和Fcγ受体)的相互作用并且副作用或剂量限制性毒性高度依赖于这种相互作用的场合的治疗用单克隆抗体，可以考虑非激活Fc结构域以增加治疗窗。实施例3-5中的数据表明，在抗体的恒定重链区中引入非激活突变降低了与补体蛋白C1q接合的能力并降低了CDC的诱导。在此，我们在ELISA测定中评估了IgG1或IgG4抗人CD20抗体及其在恒定重链区中携带非激活突变的抗体变体与人FcγRIa(SEQ ID NO:15)的单体细胞外结构域(ECD)，或人FcγRIIa同种异型131H(SEQ ID NO:16)、人FcγRIIa同种异型131R(SEQ ID NO:17)、人FcγRIIb(SEQ ID NO:18)、人FcγRIIIa同种异型158F(SEQ ID NO:19)和人FcγRIIIa同种异型158V(SEQ ID NO：20)的二聚体ECDs的结合。
为此，抗人CD20抗体IgG1野生型，IgG1-K409R，其携带L234F-L235E-D265A-K409R、L234F-L235E-G236R-K409R、L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R、N297G-K409R、L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变的非激活变体，以及IgG4野生型，IgG4-S228P和携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del突变的非激活变体在许多浓度(在5-倍稀释步骤中0.0013-20μg/mL)进行了与人Fcγ受体的结合的测试。为了检测与单体和二聚体FcγR变体的结合，将96-孔Microlon ELISA平板(Greiner，德国)于4℃用在PBS中的1μg/mL山羊-F(ab’)2-抗人-IgG-F(ab’)2(JacksonLaboratory，Cat#109-006-097)包被过夜，且接着用200μL/孔补加了0.2％BSA的PBS(PBS/0.2％BSA)于室温(RT)洗涤和封闭1小时。在温育之间进行洗涤的情况下(补加了0.05％吐温20(Cat#P1379，Sigma)的PBS；PBST；加0.2％BSA；PBST/0.2％BSA)，将平板与在PBST/0.2％BSA中的100μl/孔的抗-人CD20 IgG1和IgG4抗体变体的稀释系列于室温在振荡的同时温育1小时，继之以与在PBST/0.2％BSA中100μL/孔的单体或二聚体、标组氨酸的、C-末端生物素化的FcγR ECD变体(1μg/mL)于室温在振荡的同时温育1小时。最后，如上所述洗涤后，将平板与作为检测抗体的在PBST/0.2％BSA中的100μL/孔的链霉抗生物素蛋白-聚HRP(CLB，Cat#M2032，1:10.000)于室温在振荡的同时温育30分钟。进行使用1mg/mLABTS(Cat#11112422001和11112597001，Roche)的显象达约10分钟(Ia)、15分钟(IIa-131H、IIa-131R、IIIa-158V、IIIa-158F)或30分钟(IIb)。接着，使用100μL/孔的2％草酸(Riedel de Haen，Cat#33506)停止反应。使用小平板读数器(BioTek，Winoosky，VT)在405nm处测量吸光度。
为了测量抗体变体的固定并评估引入的非激活突变是否影响向ELISA平板的捕获，将96-孔MicrolonELISA平板(Cat#655092，Greiner)于4℃用在PBS中的1μg/mL山羊-F(ab’)2-抗人-IgG-F(ab’)2(Cat#109-006-097，JacksonLaboratory)包被过夜。接着，用200μL/孔补加了0.2％BSA的PBS(PBS/0.2％BSA)于室温(RT)洗涤和封闭1小时。在不同温育步骤之间进行洗涤的情况下(补加了0.05％吐温20的PBS(PBST)加0.2％BSA；PBST/0.2％BSA)，将平板顺序与在PBST/0.2％BSA中的100μl/孔的抗-人CD20 IgG1和IgG4抗体变体的稀释系列(在5-倍稀释步骤中0.0013-20μg/mL)于室温在振荡的同时温育1小时，以及与作为检测抗体的在PBST/0.2％BSA中的100μL/孔的HRP-标记的山羊抗人IgG-Fcγ(Cat#109-035-098，Jackson Laboratory；1:10,000)于室温在振荡的同时温育30分钟。进行使用1mg/mLABTS(Cat#11112422001和11112597001，Roche)的显象达约5分钟，且接着，使用100μL/孔的2％草酸停止反应。使用小平板读数器在405nm处测量吸光度。
使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以ELISA背景信号(无抗体对照)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对野生型IgG1抗体变体(抗人CD20 IgG1，100％)测量的AUC值的归一化。数据基于三次独立重复实验。
所有抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体都以类似的方式固定至ELISA平板，其中对于具有IgG4主链的抗体变体观察到较小的减少(图5)。因此，得出的结论是，在抗人CD20IgG1-和IgG4抗体变体的重链区中引入非激活突变不影响通过抗人IgG-F(ab’)2片段的固定。通过ELISA评估抗人CD20 IgG1变体与FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa的结合揭示，在恒定重链区中携带非激活突变的所有抗人CD20 IgG1抗体变体都不与Fcγ受体相互作用(图6A-F)。此外，除了显示出与FcγRIIa-131R的残留结合的携带S228P-E233P-F234V-L235A-delG236突变的IgG4抗体变体之外，非激活IgG4变体也未能与Fcγ受体相互作用(图6C)。
总之，携带L234F-L235E-G236R非激活突变的IgG1抗体变体显示没有FcγR结合，类似于先前描述的非激活Fc变体例如L234F-L235E-D265A和L234A-L235A-P329G。
实施例7：通过抗人CD20抗体及其非激活变体经由Fcγ受体的激活和信号传导在实施例6中，研究了抗人CD20 IgG1或IgG4抗体及其在恒定重链中携带非激活突变的变体与FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa的结合。除了显示与FcγRIIa-131R的残留结合的携带S228P-E233P-F234V-L235A-delG236突变的IgG4抗体变体之外，测试的所有非激活抗体变体均未显示与测试的FcγRs的结合。然而，在ELISA结合测定中，仅评价对直接结合的影响。不存在抗原结合、靶介导的抗体簇集和后来的靶介导的Fc受体的簇集对效应细胞的影响。在此，我们研究了如实施例6中所述在抗人CD20 IgG1或IgG4抗体的重链恒定区中引入非激活突变是否影响使用表达靶的Raji细胞和表达所示FcγR的Jurkat报道细胞系的Promega报道测定中的FcγR激活和信号传导。
使用报道生物测定(BioAssays)(Promega，FcγRIa:Cat#CS1781C08；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G9991；FcγRIIa同种异型131R:Cat#CS1781B08；FcγRIIb:Cat#CS1781E04；FcγRIIIa同种异型158F:Cat#G9790；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G7010)以表达CD20的Raji细胞作为靶细胞对通过上述抗人CD20 IgG1和IgG4抗体变体的FcγR-介导的信号传导的激活进行了定量。作为效应细胞，报道细胞试剂盒含有Jurkat人T细胞，其被人工改造以稳定表达指示的FcγR和驱动萤火虫萤光素酶表达的活化T细胞核因子(NFAT)反应元件。测定是根据制造商的建议进行的。简而言之，将Raji细胞(5,000个细胞/孔)在384-孔白色OptiPlates(Perkin Elmer，Cat#6007290)中接种到补加了12％低IgG血清(Promega，Cat#G711A)的测定缓冲液(Promega，Cat#G719A)中并在含有抗体浓度系列(FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa，在5-倍稀释中0.001-15μg/mL终浓度；FcγRIa，在25-倍稀释中0.00000006-15μg/mL终浓度)和解冻的PromegaBioAssay效应细胞(30,000个细胞/孔)的30μL的总体积中于37℃/5％ CO2温育5小时。接着，将平板于室温(RT)温育15分钟，继之以添加30μL Bio Glo Assay萤光素酶试剂。然后将平板于室温温育5分钟。通过EnVision多标记读数器(Multilabel Reader)(Perkin Elmer)上的发光读出数据来定量萤光素酶的产生。使用从仅仅培养基(无Raji细胞、无抗体、无效应细胞)样品测定的背景发光信号以归一化发光信号。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照(仅Raji细胞和效应细胞)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。每个实验，相对于与非结合对照IgG1-b12(0％)温育的细胞观察到的报道分子活性和野生型抗人CD20 IgG1(100％)的活性，将AUC值归一化。数据基于三次独立重复实验。
使用Promega报道测定对FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活的评估揭示，IgG1重链恒定区中与K409R突变组合的L234F-L235E-G236R的引入阻止了FcγR-介导的激活，类似于抗人CD20 IgG1非激活变体L234F-L235E-D265A-K409R、L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R和E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R(图7A-F)。除了通过携带N297G和K409R突变的抗人CD20 IgG1抗体变体经由FcγRIa介导的部分激活(图7A)以及通过携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del突变的IgG4抗体变体和通过携带L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变的抗人CD20IgG1抗体变体的部分FcγRIIa-和FcγRIIb-介导的激活(图7B-D)之外，对于在重链恒定区中携带非激活突变的其他IgG1-或IgG4抗体变体，也观察到不存在FcγR-介导的激活。作为对照，抗体变体抗人CD20 IgG1和抗人CD20 IgG1-K409R诱导所有测试的FcγRs的激活，而抗体变体IgG4和IgG4-S228P诱导FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIa-介导的激活但缺乏FcγRIIIa-介导的激活(图7A-F)。
而对于几种变体，对于一种或多种Fcγ受体，观察到部分FcγR-介导的激活，即携带N297G-K409R或L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变的IgG1变体和携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del突变的IgG4抗体变体，有利地，通过除了K409R突变之外在重链恒定区中还携带新的L234F-L235E-G236R非激活突变的IgG1抗体变体诱导FcγR-介导的激活的能力被有效地消除。
实施例8：抗人CD20抗体及其非激活变体与新生儿Fc受体的结合新生儿Fc受体(FcRn)通过保护IgG免遭降解而负责IgG的长血浆半衰期。抗体内化时，FcRn与内体中的抗体Fc区接合，在所述内体中相互作用在弱酸性环境(pH6.0)中稳定。再循环到质膜时，在那里环境为中性(pH7.4)，相互作用被破坏，且抗体被释放回循环中。这影响IgG的血浆半衰期。这里，进行ELISA以评价抗人CD20 IgG1和IgG4抗体及其如实施例6和7中所述在恒定重链区中含有非激活突变的变体与人FcRn的结合。
将Streptawell96孔平板(Roche，Cat#1734776001)用在补加了0.05％吐温20的PBS(PBST)加0.2％BSA中稀释的作为与β2微球蛋白(B2M；SEQ ID NO:22)的二聚体的5μg/mL(100μL/孔)重组产生的生物素化的人FcRn细胞外结构域(FcRnECDHis-B2M-BIO)，即具有C-末端His标签的人FcRn细胞外结构域(FcRnECDHis；SEQ ID NO:21)在振荡的同时于室温(RT)包被2小时。接着用PBST洗涤平板3次。添加系列稀释的抗体样品(在PBST/0.2％BSA，pH6.0或pH 7.4中5-倍稀释中的0.0013-20μg/mL终浓度)，并于RT在振荡的同时温育1小时。用PBST/0.2％BSA，pH 6.0或pH 7.4洗涤平板。添加在PBST/0.2％BSA，pH 6.0或pH7.4中稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的多克隆山羊抗人κ轻链(1:5,000；Sigma，Cat#A-7164)，并将平板于RT在振荡的同时温育1小时。用PBST/0.2％BSA，pH6.0或pH7.4洗涤后，添加100μL2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS；1mg/mL；Roche，Cat#11112422001和11112597001)作为底物并将平板于RT避光温育15分钟。使用100μL2％草酸(Riedel deHaen，Cat#33506)停止反应，于RT温育10分钟。使用小平板读数器(BioTek，Winoosky，VT)在405nm处读取吸光度。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以ELISA背景信号(无抗体对照)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。数据基于三次独立重复实验。
FcRn结合ELISA测定表明在抗人CD20 IgG1或IgG4抗体的恒定重链区中引入非激活突变在pH 6.0不抑制FcRn结合。相反，在pH 7.4，所有测试的IgG1或IgG4抗体变体，包括抗人CD20抗体IgG1和IgG4野生型，都显示不与人FcRn结合。
合起来看，这些结果表明，与所测试的其他变体类似，携带新L234F-L235E-G236R非激活突变的抗体IgG1变体保留了与野生型IgG1抗体类似的FcRn结合性质。
实施例9：通过抗人CD20抗体及其非激活变体诱导抗体依赖性细胞毒作用分别在实施例6和7中评估了FcγR与非激活抗人CD20抗体的结合以及通过非激活抗人CD20抗体的激活和信号传导。天然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)依赖于与FcγRIIIa的接合。这里，使用Perkin Elmer EuTDATRF(时间分辨荧光)细胞毒性测定以表达CD20的Raji细胞和外周血单核细胞(PBMC)作为NK细胞来源评估通过抗人CD20 IgG1野生型，IgG1-K409R，其携带L234F-L235E-D265A-K409R、L234F-L235E-G236R-K409R、L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R、N297G-K409R、L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变的非激活变体，以及IgG4野生型，IgG4-S228P和携带S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del突变的非激活变体诱导ADCC的能力。/>
血沉棕黄层(SanquinBloodBank)获自从健康志愿者抽取的全血，用柠檬酸磷酸葡萄糖(20％终浓度(v/v))抗凝以防止凝血激活，并在磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS，Cat#SH3A3830.03，GE Healthcare)中3.6-倍稀释。使用含有淋巴细胞分离介质(Cat#25-072-Cl，Corning)的LeucosepTM管(Cat#227290，GreinerBio-One)通过密度梯度离心从PBS-稀释的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMCs)，如制造商的说明书中所述，其中有一些修改。简而言之，密度梯度离心通过于室温(RT)以800xg离心20分钟进行，其中离心机刹车(brakes)设置为3。接着用50mL PBS洗涤富集的细胞级分3次，继之以以300xg离心10分钟。将分离的PBMCs重悬浮于培养基(具有2mML-谷氨酰胺和25mMHepes的RPMI-1640，Cat#BE12-115F，Lonza；补加有10％具有铁的供体牛血清，DBSI，Cat#20371，Life Technologies)中。为了确定抗-CD20野生型抗体及其非激活变体的ADCC能力，根据制造商的说明书，使用EuTDA TRF(时间分辨荧光)细胞毒性试剂盒(Cat#AD0116，Perkin Elmer)。进行了两组独立的实验。
对于第一组实验，将Raji细胞以1x106个细胞/mL的浓度重悬浮于培养基中并用0.16％(v/v)双(乙酰氧基甲基)2,2':6',2”-三联吡啶-6,6”-二羧酸酯试剂溶液(DELFIABATDA试剂，Cat#C136-100，PerkinElmer)在水浴中于37℃标记20分钟。疏水性BATDA标记可以自由通过细胞膜，并在细胞内转化为不再通过细胞膜的亲水性TDA标记(2,2':6',2"-三联吡啶-6,6"-二羧酸)。接着用培养基洗涤标记的细胞3次以除去过量的BATDA试剂。接着，将细胞与一定浓度范围的野生型抗-CD20抗体及其非激活变体(0.01-10000ng/mL终浓度；10-倍稀释)混合，于RT温育15分钟，并且在V-底96-孔平板(Cat#651101，Greinerbio-one)中在200μL总体积的培养基中将新鲜分离的PBMCs以100:1的E:T比添加到混合物中。将平板在具有5％CO2的湿润(85％)空气气氛中于37℃温育2小时。在没有PBMCs和抗体的情况下测定代表0％ADCC的BATDA从标记的细胞的自发释放，且通过将标记的细胞与裂解缓冲液(5％终浓度(v/v)，Cat#4005-0010，PerkinElmer)温育来测定代表100％ADCC的最大BATDA释放。两小时后，将平板以500xg离心(spundown)5分钟，并将20μL无细胞上清液转移至平底96-孔白色不透明OptiPlate(Cat#6005290，PerkinElmer)中。接着，将200μL DELFIA铕溶液(Cat#C135-100，Perkin Elmer)添加到转移的上清液中，并将样品在黑暗中于RT温育15分钟。使用EnVision多标记平板读数器(Perkin Elmer)测量由释放的TDA标记形成的EuTDA螯合物的荧光。作为ADCC的量度的百分比比释放使用以下公式计算：
％比释放＝((荧光样品-荧光自发释放)/(荧光最大-荧光自发释放))x100％
使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以背景染色剂(无抗体对照)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对非结合阴性对照IgG1-b12(0％)测量的AUC值和对野生型IgG1抗体变体(抗人CD20 IgG1，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从四个(野生型和K409R变体)或两个(L234F-L235E-D265A-K409R和L234F-L235E-G236R-K409R变体)独立供体获得的平均值(±SEM)。
基本上如上所述进行和分析第二组实验。然而，在10ug/mL最终抗体浓度而不是浓度范围下评估了抗人CD20 IgG1或IgG4抗体及其在恒定重链区中携带非激活突变的变体诱导ADCC的能力。每个实验重复实验将数据相对于非结合阴性对照IgG1-b12(0％)和野生型IgG1抗体变体(抗人CD20 IgG1，100％)进行归一化，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中显示。数据是从来自2次独立实验的6个供体获得的平均值(±SEM)。
使用Perkin ElmerEuTDATRF细胞毒性试剂盒对NK-细胞介导的ADCC的评估揭示，野生型抗人CD20 IgG1或携带K409R突变的变体有效诱导表达CD20的Raji细胞的ADCC(图8)。相比之下，与不存在与FcγRIIIa的结合和经由FcγRIIIa的激活和信号传导(实施例6和7)一致，抗人CD20野生型IgG4抗体或携带S228P铰链稳定突变的变体不诱导NK-细胞介导的ADCC(图8B)。对非激活抗体变体诱导ADCC的能力的评估揭示，类似于抗人CD20IgG1非激活变体L234F-L235E-D265A-K409R(图8A、B)和抗人CD20 IgG1非激活变体L234A-L235A-P329G-K409R、G236R-L328R-K409R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K-K409R、N297G-K409R、L234A-L235E-G237A-A330S-P331S-K409R突变(图8B)，在抗人CD20 IgG1的重链恒定区中引入L234F-L235E-G236R和K409R突变将表达CD20的Raji细胞的ADCC降低～69-98％。此外，与野生型IgG4类似，IgG4非激活抗体变体S228P-F234A-L235A或S228P-E233P-F234V-L235A-G236del也未能诱导ADCC(图8B)。
总之，诱导ADCC的能力被在重链恒定区中携带新L234F-L235E-G236R非激活突变的抗体变体有效消除。
实施例10：抗人CD3抗体及其非激活变体在PBMC培养物中的T-细胞激活通过FACS分析，评价作为T细胞的早期激活的量度的通过抗人CD3 huCLB-T3/4IgG1和IgG4抗体及其在恒定重链区中携带非激活突变的变体对T细胞上CD69的上调。
PBMCs如实施例9所述通过密度梯度分离从血沉棕黄层分离，用PBS洗涤，并重悬浮于培养基(具有2mM L-谷氨酰胺和25mM Hepes的RPMI-1640，Cat#BE12-115F，Lonza；补加有10％具有铁的供体牛血清，DBSI，Cat#20371，LifeTechnologies)中。在培养基中制备抗人CD3 IgG1-F405L及其除F405L之外还携带L234F-L235E-D265A、L234F-L235E-G236R、L234A-L235A-P329G、G236R-L328R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K或L234A-L235E-G237A-A330S-P331S突变的非激活变体，以及具有铰链稳定突变S228P的抗人CD3 IgG4或除F405L和R409K之外还携带S228P-E233P-F234V-L235A-G236del或S228P-F234A-L235A突变的非激活变体的剂量反应系列(0.001-1000ng/ml终浓度，10-倍稀释)，并添加到在培养基中含有PBMCs(1.5x105个细胞/孔)的96-孔圆底平板的孔中。16-24小时温育后，通过离心沉淀细胞。接着，然后用FACS缓冲液(1xPBS，Cat#BE17-517Q，Lonza；0.1％牛血清清蛋白，BSA；0.02％NaN3，Cat#41920044-3，Bio-world)洗涤细胞并于4℃用小鼠抗人CD28-PE(Cat#130-092-921；Miltenyi Biotec；T-细胞标记物)和小鼠抗人CD69-APC抗体(Cat#340560；BDBiosciences)染色30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤两次去除未结合的抗体，且接着将细胞重悬浮于FACS缓冲液(150μL/孔)中，并在Fortessa流式细胞仪(BD)上测量PBMC混合物中CD28-阳性细胞中的CD69-阳性细胞的百分比。数据作为剂量反应对CD28+细胞中CD69+的百分比显示，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以背景染色剂(无抗体对照)作为基线计算每个实验重复实验每个PBMC供体的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以对于每个实验重复实验的每个供体相对于对野生型IgG1抗体变体(IgG1-F405L，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立重复实验的6个供体获得的平均值±SEM。
作为早期T-细胞激活的量度的T细胞上CD69上调的评估表明，除F405L突变之外还携带L234F-L235E-G236R非激活突变的抗人CD3抗体IgG1阻止了PBMC共培养物中T细胞上CD69的上调，类似于测试的其他变体，即包括非激活突变L234F-L235E-D265A、L234A-L235A-P329G、G236R-L328R、E233P-L234V-L235A-G236del-S267K或L234A-L235E-G237A-A330S-P331S的抗人CD3 IgG1-F405L变体，以及包括非激活突变S228P-E233P-F234V-L235A-G236del的抗人CD3 IgG4-F405L-R409K变体(图9A、B)。相比之下，具有F405L突变的携带N297G的抗人CD3 IgG1抗体变体和具有F405L-R409K突变的携带S228P-F234A-L235A的抗人CD3 IgG4抗体变体未能阻止PBMC共培养物中T细胞上的CD69上调。
总之，通过在抗人CD3 IgG1型抗体中引入新L234F-L235E-G236R非激活突变，可以防止PBMC共培养物中如通过CD69上调所测量的T细胞的激活。
实施例11：由非激活抗体变体诱导的体外T-细胞介导的细胞毒性在实施例10中，显示在CD3-靶向抗体的IgG1变体的恒定重链区中引入非激活突变L234F-L235E-G236R可以有效地防止T-细胞激活。这里，评估了CD3xHER2、CD3xb12和b12xHER2双特异性野生型IgG1和IgG4抗体及其在恒定重链区中携带非激活突变的变体的T-细胞介导的细胞毒性。
如实施例1中所述，通过受控Fab-臂交换(cFAE)产生双特异性分子。评价了通过野生型双特异性抗体CD3xHER2(抗人CD3(huCLB-T3/4)IgG1或IgG4和抗人HER2 IgG1或IgG4)、CD3xb12(抗人CD3(huCLB-T3/4)IgG1或IgG4和非结合对照抗体抗-HIV1 gp120(b12)IgG1或IgG4)或b12xHER2(非结合对照抗体抗-HIV1 gp120(b12)IgG1或IgG4和抗人HER2 IgG1或IgG4)及其在恒定重链区中携带非激活突变的变体的T-细胞介导的细胞毒性。从通过如实施例9中所述的密度梯度分离来源于健康供体的血沉棕黄层分离PBMCs，用PBS洗涤，并重悬浮于培养基(具有2mM L-谷氨酰胺和25mMHepes的RPMI-1640；补加有10％具有铁的供体牛血清(DBSI))中。表达HER2的SK-OV-3细胞(Cat#HTB-77，ATCC)在补加有10％(体积/体积)热灭活的DBSI和青霉素-链霉素(Pen/Strep，终浓度为50单位/mL青霉素钾和50μg/mL硫酸链霉素(Lonza，Cat#DE17-603E)的McCoy’s 5A培养基(Lonza，Cat#BE12-168F)中培养，并在5％(体积/体积)CO2湿润培养箱中维持于37℃。SK-OV-3细胞培养至接近汇合。将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于培养基中，且接着通过细胞渗滤器以获得单细胞悬浮液。将2.5x104个SK-OV-3细胞接种至96-孔培养平板的每个孔中，并将细胞于37℃、5％CO2温育4小时以允许黏附于平板。接着，将1x105个PBMCs添加到含有SK-OV-3靶细胞的96-孔平板的每个孔中，从而导致4:1的效应物与靶(E:T)比。接着，在培养基中制备如上文所提及的双特异性CD3xHER2、CD3xb12和b12xHER2野生型及其非激活变体的剂量反应系列(0.001-1000ng/mL终浓度，10-倍稀释)并添加到含有SK-OV-3细胞和PBMCs的96-孔培养平板的孔中。SK-OV-3靶细胞与2μM星形孢菌素(Cat#S6942-200，Sigma)的温育用作100％肿瘤细胞杀伤的参考。培养基对照(SK-OV-3细胞，无抗体，无PBMC)用作0％肿瘤细胞杀伤的参考。将平板于37℃、5％CO2温育3天。三天后，用PBS洗涤平板两次，并向每孔中添加150μL含有10％阿尔玛蓝(Invitrogen，Cat#DAL1100)的培养基。将平板于37℃、5％CO2温育4小时。测量590nm处的吸光度(Envision，PerkinElmer，Waltham，MA)。数据在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中作为对于每个实验重复实验的每个供体计算的剂量反应对百分比活SK-OV-3细胞显示。数据是从三次独立重复实验的6个供体获得的平均值±SEM。
所有在恒定重链区中携带非激活突变的双特异性CD3xHER2抗体变体均诱导SK-OV-3细胞的剂量依赖性细胞毒性，其效率与携带具有野生型样功能的Fc区因而没有非激活突变的双特异性CD3xHER2抗体变体类似(图10A)。野生型样双特异性CD3xb12抗体诱导SK-OV-3细胞的非特异性杀伤，尽管在比野生型样双特异性CD3xHER2抗体变体较低的程度上。相比之下，除了在测试的最高浓度仍显示SK-OV-3细胞的部分非特异性细胞毒性的携带N297G突变的CD3xb12双特异性抗体外，携带L234F-L235E-G236R非激活突变的双特异性CD3xb12抗体变体没有显示出SK-OV-3细胞的细胞毒性，与测试的其他非激活双特异性CD3xb12变体相似(图10B)。这与如实施例10中针对所述变体所观察到的PBMC培养物中所观察到的T细胞的激活(CD69的上调)一致。对于野生型样双特异性b12xHER2抗体变体，观察到SK-OV-3细胞的较小水平的非特异性细胞毒性。除了通过携带E233P-L234V-L235A-G236del-S267K突变的双特异性b12xHER2变体的残留非特异性细胞毒性外，对于测试的其他双特异性b12xHER2抗体变体，未观察到非特异性细胞毒性(图10C)。
总的说来，在靶向癌抗原和T-细胞的双特异性抗体变体的恒定重链区中引入新的L234F-L235E-G236R突变允许有效避免非特异性细胞毒性并保留诱导特异性T-细胞介导的细胞毒性的能力。
实施例12：非激活抗体变体的药物代谢动力学(PK)分析
在小鼠研究中分析了在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD3(huCLB-T3/4)和抗人CD20IgG1抗体变体的药物代谢动力学性质。
所述研究中的小鼠安置在中央实验室动物设施(Central Laboratory AnimalFacility)(Utrecht，荷兰)中。将所有小鼠单独保持在通风的笼子中，其中无限制地提供食物和水。所有实验均遵守从指令(2010/63/EU)翻译而来的荷兰动物保护法(WoD)，并得到荷兰中央动物实验委员会(Dutch Central Commission for animal experiments)和地方伦理委员会(the local Ethical committee)的批准。使用每组3只小鼠，向SCID小鼠(C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid，Envigo)静脉内注射500μg抗体(野生型抗人CD3 IgG1，其单独或与非激活突变L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R组合携带F405L突变的变体，野生型抗人CD20 IgG1，和单独或与非激活突变L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R组合携带K409R突变的变体)。在抗体施用后10分钟、4小时、1天、2天、8天、14天和21天从面静脉收集血液样品(50μL)。将血液收集到含有肝素的小瓶中，且接着以10,000g离心5分钟。将血浆贮藏于-20℃一直到测定抗体浓度为止。
通过总hIgG ELISA，测定了特定的人IgG浓度。使用以2μg/mL的浓度包被在96-孔MicrolonELISA平板(Greiner，德国)上的抗人IgG(Cat#M9105，Lot#8000260395Sanquin，荷兰)作为捕获抗体。接着用补加有0.2％BSA的PBS封闭平板，继之以添加样品，在ELISA缓冲液(补加有0.05％吐温20和0.2％牛血清清蛋白的PBS)中系列稀释，并于室温(RT)在平板摇床上温育1小时。接着，将平板与山羊抗人IgG免疫球蛋白(Cat#109-035-098，Jackson)温育，并用2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸；ABTS；Roche)显象。通过添加2％草酸(Riedel deHaen，Cat#33506)停止反应。用于注射的各种材料用作参考曲线。在小平板读数器(Biotek，Winooski，VT)中在405nm处测量吸光度。
抗人CD20 IgG1抗体及其携带K409R、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体的血清IgG浓度(图11A)以及抗人CD3 IgG1抗体及其携带F405L、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的变体的血清IgG浓度(图11B)是类似的。注射到小鼠中的所有抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体的血浆中测量的IgG浓度与通过SCID小鼠中野生型人IgG1的2-区室模型药物代谢动力学预测的浓度一致。所有抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体的计算的清除率值与其野生型对应物相似(图11C；注射后第21天)。各组之间的变异主要反映了分布相中的差异，其可能是由批次之间的糖基化差异引起的，且可能与形式无关。所有突变的t1/2β看来似乎都是类似的。
总之，非激活突变包括新的L234F-L235E-G236R突变的引入不影响小鼠中IgG1抗体变体的药物代谢动力学。
实施例13：Fc区中携带L234F-L235A-G236R非激活突变的抗体变体的免疫原性评估使用Abzena的iTopeTM和TCEDTM计算机(insilico)技术评估携带L234F-L235E-G236R突变的IgG1抗体变体(IgG1-FER)的恒定结构域的临床免疫原性风险。
iTopeTM软件预测测试蛋白序列中所有可能的9-聚体肽的氨基酸侧链与34个人MHCII类等位基因的开口结合沟之间的有利相互作用(Perry等人，2008,Drugs RD 9(6),pp.385–96)。选择的等位基因代表了全世界发现的最常见的HLA-DR等位基因，其中没有将权重赋予发现在任何特定种族群体中最普遍的那些等位基因。通过将这些预测与野生型人IgG1(m)f参考中存在的MHC II类结合序列进行比较，可能鉴定新的结合序列。预测以中和高亲和力与≥50％MHC II类等位基因结合的肽被认为与T-细胞表位的存在相关(Hill等人，2003,Arthritis Res Ther 5(1),pp.R40–8)。TCEDTM是通过使用多种蛋白(主要是抗体)进行先体外后体内免疫原性研究鉴定的已知T细胞表位的数据库(Bryson等人，2010,BioDrugs 24(1),pp.1–8)。通过BLAST搜索询问数据库，以确认数据库中是否也存在具有预测的混杂中或高亲和力的肽。
每个9-聚体都基于潜在的‘适合(fit)’以及与MHC II类分子的相互作用进行评分。通过软件计算的肽分数处于0-1。产生高平均结合分数(在iTopeTM评分函数中>0.55)的肽被突出显示，并且如果≥50％的MHC II类结合肽(即34个等位基因中的17个)具有高结合亲和力(分数>0.6)，则这种肽被定义为‘混杂的高亲和力’MHC II类结合肽，其被认为含有CD4+T细胞表位的高风险。混杂的中亲和力MHC II类结合肽以结合分数>0.55(但没有多数>0.6)结合≥50％的等位基因。使用TCEDTM对序列进行进一步分析。在大芳族氨基酸(即，F、W、Y)存在于p1锚定位置的情况下，其中34个等位基因中的20个的开放p1口袋允许结合大的芳族残基，这些标准被改变。当发生所述情况时，混杂肽被定义为与20个等位基因子集中的10个或更多结合。这些序列用于通过BLAST搜索来询问TCEDTM，以鉴定来自以前先体外后体内研究中刺激T细胞应答的不相关蛋白/抗体的肽(T-细胞表位)之间的任何高序列同源性。
iTopeTM分析没有鉴定出存在于IgG1-FER中而在野生型IgG1(m)f中不存在的任何混杂的中或高亲和力MHC II类结合序列。因此，基于所述分析，基于IgG1-FER的抗体没有明显增加的临床免疫原性风险。
实施例14：非激活抗体变体的糖分析(Glyco-analysis)
IgG分子在CH2区中具有单个保守的Asn(N)-连接的糖基化位点(对于IgG1在位置N297)。所述Asn-连接的聚糖的核心结构由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖残基组成。可以由半乳糖、唾液酸、核心岩藻糖基化和等分GlcNAc发生进一步的延伸(Vidarsson等人，2014,Front.Immunology 10月20日；5:520)，从而导致N297处异质糖基化的IgG1分子。聚糖在蛋白构象、稳定性和生物功能中发挥重要作用(Costa等人，CritRev Biotechnol 34(4):281-99(2014))。因此，IgG1分子中的糖基化变化是不需要的，这是因为功效和药物代谢动力学性质可能受到影响。此外，在制造过程中需要分析和控制聚糖的异质性，且荷电聚糖可能进一步增加基于电荷的分析测定的复杂性，例如用于释放测试或表征的成像毛细管等电聚焦(iCIEF)。
在所述实施例中，对野生型抗人CD20 IgG1抗体及其除K409R突变外还携带L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R突变的非激活变体进行N-联聚糖概况分析。此外，对携带L234F-L235E-F405L突变的抗人CD3(huCLB-T3/4)IgG1抗体或其进一步携带D265A或G236R突变的变体进行聚糖概况分析。
IgG1 N-联糖基化的评估通过如所示的两种不同方法进行(表2)。抗人CD20 IgG1野生型、携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的抗人CD20 IgG1、以及携带L234F-L235E-F405L或L234F-L235E-D265A-F405L突变的抗人CD3 IgG1变体通过2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记进行分析。使用Waters Alliance 2695分离模块(Separations Module)(Waters)，通过2-AB标记的聚糖的正相HPLC分析进行N-联聚糖概况分析。通过与肽-N-糖苷酶F(Cat#GKE-5006D，PROzyme)温育从抗体中释放N-联聚糖。接着，将抗体进行乙醇沉淀(用冰预冷的)并去除。将含有释放的聚糖的上清液真空干燥。将获得的聚糖溶解，且接着通过还原胺化在还原端用荧光团2-AB(来自LudgerTag 2-AB聚糖标记试剂盒，Cat#LT-KAB-A2，Ludger)标记进行标记用于HPLC分析。然后以梯度洗脱连同荧光检测一起获得HPLC概况。HPLC峰强度的积分是相对于总寡糖群体个别N-联聚糖(例如，G0F、G1F、G2F等)的摩尔丰度百分比的量度。基于外部聚糖标准混合物(通过混合来自Ludger的单独聚糖制备的)分配峰：NGA2(＝G0，#CN-NGA2-20U)、NGA2F(＝G0F，#CN-NGA2F-20U)、NA2(＝G2，#CN-NA2-20U)、NA2F(＝G2F，#CN-NA2F-20U)、MAN5(#CN-MAN5-20U)、MAN6(#CN-MAN6-20U)、MAN8(#CN-MAN8-20U)、MAN9(#CN-MAN9-20U)、A1(#CN-A1-20U)、A1F(#CN-A1F-20U)、A2(#CN-A2-20U)、A2F(#CN-A2F-20U)。
使用Orbitrap Q-ExactivePlus质谱仪(ThermoFischer)通过液相层析-质谱分析法(LC-MS)分析除了K409R之外还携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD20 IgG1变体和除了F405L之外还携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD3 IgG1变体。对还原的糖基化抗体重链进行N-联糖基化的鉴定和相对定量。考虑到已知重链的一级氨基酸序列，可以鉴定所附着的N-联聚糖的质量身份(mass identity)。简而言之，将抗体样品在PBSpH7.4(Cat#3623140，B.Braun)中稀释至200μg/mL，至50μL的总体积。接着，将1μL 1M二硫苏糖醇(DTT；Cat#D9163，Sigma)添加到50μL样品中并于37℃温育1小时。接着，将样品转移至玻璃Qsert小瓶(Cat#186001128c，Waters)中并放置到LC-MS中。将1μL注射到LC柱上，并使用从23％(B)到95％(B)的流动相A(具有0.1％甲酸的Milli-Q水，Cat#56302-50ml-F，Fluka)-流动相B(乙腈中的0.1％甲酸，Cat#0001934101BS，Bio Solve)梯度在2分钟内以0.2mL/分钟的流速洗脱抗体。获得的原始m/z谱用Protein Deconvolution 4.0(Thermo Fisher)软件进行去褶合。结果，去褶合的谱提供了减少的糖基化重链质量。获得的峰强度(谱去褶合后)是相对于总寡糖群体个别N-联聚糖(例如，G0F、G1F、G2F等)的摩尔丰度的计算的百分比的量度。图12显示了检测的聚糖种类的示意表示。
不同寡糖的相对丰度的知识与其结构的知识相结合(参见图12)允许计算相对于A2F结构中的量的半乳糖基化和荷电聚糖的总量。这里作为百分比计算的量代表摩尔量，即代表分子数而不是质量。根据表2，计算出野生型IgG1序列具有分别为0-1％和15-25％的荷电聚糖丰度百分比和半乳糖基化百分比。非激活L234F-L235E-D265A突变的荷电聚糖和半乳糖基化的百分比为约10％和约60％。
抗人CD20 IgG1抗体变体的糖基化评价(表2)揭示，引入与K409R突变组合的非激活L234F-L235E-D265A突变增加了半乳糖基化，表示为G1或G2及其变体(G：半乳糖)，且增加了荷电聚糖的存在，表示为A1或A2及其变体(A：唾液酸)，如与抗人CD20 IgG1野生型抗体相比的。对于除了F405L突变之外还携带非激活L234F-L235E-D265A突变的抗人CD3 IgG1抗体变体观察到类似的模式。增加的半乳糖基化和荷电聚糖的存在可归因于D265A突变的存在，这是因为携带L234F-L235E-F405L突变的抗人CD3 IgG1抗体变体显示出与抗人CD20 IgG1野生型抗体相似的糖基化模式。与此一致，在抗人CD20 IgG1-K409R或抗人CD3 IgG1-F405L中引入非激活突变L234F-L235E-G236R也不导致增加的半乳糖基化和增加的荷电聚糖的存在。
总之，尽管在IgG1抗体的恒定重链区中引入非激活L234F-L235E-D265A突变增加了具有半乳糖基化的增加和荷电聚糖的存在的增加的抗体糖基化异质性，但在IgG1抗体中引入非激活L234F-L235E-G236R突变允许保留与IgG1的野生型恒定区类似的聚糖概况。
表2显示了对恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体的糖基化的分析。通过2-AB标记方法分析抗人CD20 IgG1野生型(wt)或具有L234F-L235E-D265A-K409R突变的变体，以及携带L234F-L235E-F405L或L234F-L235E-D265A-F405L突变的抗人CD3 IgG1。通过液相层析-质谱分析法(LC-MS)评估分别携带L234F-L235E-G236R-K409R或L234F-L235E-G236R-F405L突变的抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体的聚糖概况。与Orbitrap LC-MS方法相对比，2-AB标记方法不能单独分配G2和甘露糖6以及A2F和甘露糖9(不适用；na)，且因此显示两者的和。G0F-GN、G1F-GN和Man7未使用2-AB方法进行评估，并陈述为不适用(na)。测试的变体是IgG1、IgG1-FER-K409R、IgG1-FEA-K409R、IgG1-FE-F405L、IgG1-FER-F405L、IgG1-FEA-F405L，其中FER:L234F-L235A-G236R、FE:L234F-L235E且FEA:L234F-L235E-D265A。检测的聚糖种类的示意表示在图12中显示。
实施例15：非激活抗体变体的受控Fab-臂交换的效率
某些应用，例如如实施例11中所示的靶细胞的T-细胞介导的细胞毒性，需要产生和使用双特异性抗体(bsAb)变体，其中一个F(ab)臂可以与靶A接合，而另一个F(ab)臂可以与靶B接合。
在此，我们评价了除了有效异二聚体形成所需要的各自存在于单特异性抗体之一中的F405L或K409R突变外还在亲本单特异性抗体的恒定重链区中引入非激活突变时，通过如实施例1中所述的受控Fab-臂交换(cFAE)产生bsAb变体的效率。简而言之，将抗体以等摩尔浓度混合并与75mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA；Cat#30078，SigmaAldrich)于31℃温育5小时。接着如实施例1所述实现针对PBS的缓冲液更换，并使用NanoDropND-2000-EU分光光度计(Thermo Fisher)通过280nm处的吸光度测量浓度。使用Orbitrap Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Fischer)进行质谱分析法分析以确定双特异性和残留同二聚体含量。
对cFAE效率的评价揭示，除了各自存在于单特异性抗体之一中的F405L或K409R突变之外还引入非激活突变L234F-L235E-G236R结果产生有效的cFAE，其中至少95％的群体是IgG1 bsAb(BisG1)，而剩余的群体是一种或两种单特异性抗体(在图中表示为IgG1-A和IgG1-B)；图13A)。此外，评估了当使用非激活突变的不对称分布产生bsAb变体时的cFAE的效率，即，除了F405L或K409R突变之外L234F-L235E-G236R还存在于一种单特异性抗体变体中，并且除了F405L或K409R突变之外L234F-L235E-D265A还存在于另一种单特异性抗体变体中。分析揭示了生成bsAb变体的相似效率(图13B、C)，如对于除了各自存在于单特异性抗体之一中的F405L或K409R突变之外在bsAb的两个臂中还携带L234F-L235E-G236R非激活突变的变体所示的(图13A)。
总之，在IgG1恒定重链区中携带新L234F-L235E-G236R非激活突变的抗体变体保留了通过使用各自存在于单特异性抗体之一中的F405L和K409R突变的受控Fab-臂交换来有效形成bsAb变体的能力，从而允许异二聚化并防止单特异性同二聚体的形成。
实施例16：非激活抗体变体的生产水平
在所述实施例中，评估了除了F405L或K409R突变之外在恒定重链区中还携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的抗体变体的生产水平。
所有抗体变体均在Expi293F细胞中产生，如实施例1中所述的。为了避免归因于使用一种非激活抗体变体而不是另一种的特定克隆的生产滴度(production titer)的差异，并且允许直接比较在恒定重链区中携带L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R非激活突变的抗体变体的生产滴度，每组内体现相同的抗体克隆，即F405L抗体变体或K409R抗体变体。
对生产水平的分析揭示，除F405L突变外还携带L234F-L235E-G236R突变的非激活抗体变体(实心圆)以与除F405L突变外还携带非激活突变L234F-L235E-D265A的抗体变体(空心圆；图14)相似的水平生产。尽管除K409R突变外还携带L234F-L235E-G236R非激活突变的抗体变体(实心正方形)的生产水平与除非激活突变外还包括F405L突变的抗体变体相似，但对于除K409R突变外还携带L234F-L235E-D265A非激活突变的抗体变体(空心正方形；图14)观察到平均生产水平的小的增加。
总之，没有观察到与除F405L或K409R突变外还携带L234F-L235E-D265A非激活突变的变体相比，除F405L或K409R突变外还携带L234F-L235E-G236R突变的非激活抗体变体的生产水平中的较大差异。
实施例17：通过PEG中点、DLS和DSF分析评估IgG1非激活抗体变体的稳定性和溶解度使用PEG-诱导的沉淀测定、差示扫描荧光测定法(DSF)和动态光散射(DLS)测定评估在恒定重链区中携带非激活突变的抗-CD20和抗-CD3 IgG1抗体变体的蛋白稳定性和溶解度特征。
将抗人CD20和抗人CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的样品以约20mg/mL的浓度配制在PBS pH 7.4中(浓度范围18.7-21.6mg/mL；过滤应用于抗人CD3 IgG1抗体变体)。PBS用作非最佳制剂以允许更好地比较蛋白稳定性。
为了评估构象蛋白稳定性，在iQ5多色实时(MulticolorReal-Time)PCR检测系统(Bio-Rad)中进行DSF，所述系统能够检测由外源染料Sypro-Orange(DMSO中的5000x浓缩物，Cat#S5692，Sigma-Aldrich)与由变性的IgG暴露的疏水区域结合引起的荧光强度中的变化。Sypro-Orange在PBS(Hyclone GE Healthcare，Cat#SH3A383.03)pH 7.4或30mM乙酸钠pH4(Cat#25022-1KG-R，Sigma-Aldrich)中稀释320-倍至75mM的浓度。可以从测量所分析的IgG的受控、逐步热变性期间逐渐增加的荧光得到热解链曲线。因此，在iCycler iQ 96-孔PCR平板中一式两份制备与20μL 75mM Sypro-Orange(在PBS pH 7.4或30mM乙酸钠pH4中)混合的携带K409R突变、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变的抗人CD20 IgG1抗体变体，或携带F405L突变、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的抗人CD3 IgG1抗体变体的5μL样品(在PBS中稀释的；浓度范围1mg/mL+/-10％)。在以每次增量0.5℃的逐步增量范围从25℃一直到95℃的逐渐增加的温度和15秒的持续时间加上记录所有孔的荧光所需的时间记录荧光(激发485nm，发射575nm)。使用Bio-Rad CFX Manager Software 3.0分析数据，并通过所述软件根据荧光对温度图确定解链温度。
进行DLS分析以评估上述抗体变体在溶液中聚集的倾向，作为胶态稳定性的量度。使用具有Dynamics 7软件的DynaPro平板读数器(Plate Reader)II(Wyatt Technology)分析PBSpH7.4中的20μL上述抗体变体(浓度范围1mg/mL+/-10％)。将样品一式三份应用于圆形384-孔IQ-LV平板(Aurora Biotechnologies，Cat#1011-00110)中，以2,111xg离心3分钟，并用石蜡油覆盖。测量之前，将平板再次以2,111xg离心3分钟。在整个实验过程中，以连续逐渐增加的温度(1℃增加/每个特定样品的数据点)进行热扫描测量。使用累积量拟合程序(cumulant fit procedure)以分析数据，从而导致确定表观半径。使用2.1nm的截止值，从而排除具有较小半径的峰，其经常由软件赝象引起，并且在每次采集中不一致地观察到。对于25℃的PBS缓冲液使用1.333的折射率和1.019cP的黏度(Dynamics软件中提供的标准值)。在MicrosoftExcel中处理数据以确定聚集的开始(Tagg)。Tagg是通过计算每个孔的半径的平均值和标准差(n＝10，前10次测量)来确定的。通过为每次测量单独设置99.99％-置信区间，第一个将落在置信区间之外的连续值(从25℃开始到80℃)被标记为Tagg。每个实验一式三份进行五次连续测量。
进行PEG-诱导的沉淀测定以评估相对蛋白溶解度。制备两种缓冲液；缓冲液A：50mM磷酸盐缓冲液pH 7.0(磷酸二氢钠；Fluka，Cat#17844+磷酸氢二钠二水合物，FlukaCat#71633)；缓冲液B：50mM磷酸盐缓冲液pH7.0+40％(w/v)PEG8000(Sigma-Aldrich，Cat#P5413)。将不同量的缓冲液B与缓冲液A混合，以生成一系列11种不同的PEG浓度，范围从0％一直到40％PEG。将每种PEG浓度缓冲液的等分试样(80μL)添加到96-孔平板(UV96孔平板，半面积，GreinerBio-one，Cat#675801)的不同孔中。将每种抗体样品(在PBS中稀释至1mg/mL)中的20μL添加至含有一系列含PEG的缓冲液的孔中。将平板用密封装置覆盖并以750rpm振荡5分钟。将平板于RT放置过夜，并接着振荡5分钟。然后将平板以4000rpm离心20分钟以除去沉淀的抗体。在不干扰离心的沉淀的情况下将80μL从每个孔中小心地转移至新UVStar96-孔平板中。在SynergyTM2多模式小平板读数器(Multi-mode Microplate Reader)(Biotek Instruments，BioSPX)上测量280nm处的吸光度(A280，与溶解的蛋白的量相关)，并重新计算到100μL的体积(光程长度校正)且减去空白值(不含抗体的PEG)。在GraphpadPrism 8中绘制校正的A280值对PEG浓度的图。使用非线性回归分析数据，其中PEG中点(％)反映了50％的抗体沉淀时的测试样品的浓度(即与0％PEG相比，A280的50％丧失)。PEG中点用作溶解度的量度，其中更高的PEG中点对应于更好的溶解度。
上述测定的结果总结于表3、4中。DSF分析揭示了pH7.4时68.0℃的解链温度(Tm)，其在pH 4.0降低至56.0℃的Tm1和62.0℃的Tm2。在pH 7.4对于抗人CD20 IgG1-L234F-L235E-G236R-K409R记录的Tm与含有K409R的变体类似(分别为67.8℃对68.0℃)。在pH4.0，携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体表现出一个58.0℃的Tm。相比之下，携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的抗人CD20 IgG1变体在pH 7.4具有降低的63.3℃的Tm1和68.5℃的Tm2，而在pH 4.0记录了三个Tm，即48.5℃、57.0℃和61.0℃。对于抗人CD3IgG1抗体，携带单独F405L突变或L234F-L235E-G236R-F405L突变的变体具有相同的在pH7.4的Tm(68.0℃)和在pH4.0高度相似的Tm1和Tm2(F405L：53.5和70.5℃；L234F-L235E-G236R-F405L：54.5和70.8℃)。在pH 7.4，与含有F405L和L234F-L235E-G236R-F405L的变体相比，IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L抗体变体的Tm降低(63.0℃)。同样，在pH4.0，与其他IgG1-huCLB-T3/4变体相比，对于变体IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L记录的第一个Tm降低(48.5℃)，而对于IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L观察到71.0℃的第二个Tm，这与其他IgG1-huCLB-T3/4变体一致。
抗人CD20 IgG1-K409R和抗人CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R抗体变体显示最低的聚集温度(Tagg；分别为57.9℃和58.5℃)，后面是含有L234F-L235E-G236R-K409R的变体(59.9℃)。对于IgG1-huCLB-T3/4变体，对于携带L234F-L235E-D265A-F405L突变的变体观察到最低的Tagg(58.7℃)，后面是含有F405L和含有L234F-L235E-G236R-F405L的变体(分别为61.7℃和62.0℃)。
携带K409R突变、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变的抗人CD20 IgG1抗体变体显示出类似的相对溶解度概况，如通过PEG-诱导的沉淀测定所测定的。总的说来，如与抗人CD20 IgG1变体相比的，抗人CD3 IgG1变体显示出较低的相对溶解度。携带L234F-L235E-D265A-F405L或L2345F-L23E-G236R-F405L突变的抗人CD3IgG1变体在溶解度方面是类似的。这两种变体都比抗人CD3 IgG1-F405L相对稍微较不可溶。
合起来看，如与含有K409R的对照变体相比的，携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体在溶解度和聚集倾向方面显示出类似的概况。然而，虽然携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体显示出与含有K409R的对照变体类似的蛋白稳定性概况，但抗人CD20IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R变体显示出较低的蛋白稳定性概况。对于抗人CD3IgG1变体，携带F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的变体显示出类似的聚集倾向和蛋白稳定性概况。如与含有F405L的对照变体相比的，两种非激活变体的溶解度均降低。如与携带F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的变体相比的，携带L234F-L235E-D265A-F405L突变的变体显示出降低的蛋白稳定性和稍微较高的聚集倾向。含有L234F-L235E-D265A-F405L的变体的溶解度与含有L234F-L235E-G236R-F405L的变体类似。
总之，当在PBS中以高浓度配制时，携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD20和CD3IgG1变体显示出比含有L234F-L235E-D265A的变体更稳健的蛋白稳定性概况。此外，携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD3 IgG1变体显示出比含有L234F-L235E-D265A的变体稍微较低的聚集倾向。
表3显示了如通过DSF分析所测定的、在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20IgG1和抗-CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的蛋白构象稳定性。DSF：差示扫描荧光测定法；Tm：解链温度。
表4显示了对于在恒定重链中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体，如通过PEG中点确定测定所测定的蛋白溶解度和如通过DLS分析所测定的聚集倾向。Tagg：聚集温度；PEG：聚乙二醇；DLS：动态光散射。
表3
1差示扫描荧光测定法
2测定中的IgG浓度～0.2mg/mL
表4
1动态光散射
2测定中的IgG浓度～1mg/mL
3聚乙二醇
4测定中的IgG浓度～0.2mg/mL
实施例18：于不同温度贮藏1或4个月后对IgG1非激活抗体变体的蛋白稳定性的影响在实施例17中，评估了在恒定重链区中携带非激活突变的抗-CD20和抗-CD3 IgG1抗体变体的蛋白稳定性和溶解度概况。在此，使用不同的测定于2-8℃或40℃贮藏1或4个月后评估这种抗体变体的蛋白稳定性。
将抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的样品以约20mg/mL的浓度配制在PBS pH 7.4中(浓度范围18.7-21.6mg/mL；过滤应用于抗人CD3 IgG1抗体变体)。PBS用作非最佳制剂以允许更好地比较蛋白稳定性。抗人CD20 IgG1变体携带K409R突变、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变，而抗人CD3 IgG1抗体变体携带F405L突变、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变。样品于2-8℃温育1个月，于40℃温育1个月，于2-8℃温育4个月，于40℃温育4个月。接着通过高效尺寸排阻层析(HP-SEC)、毛细管等电聚焦(cIEF)、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和动态光散射(DLS)对所有样品进行分析。
HP-SEC分析使用装备有Waters 2487双重λ吸光度检测器(Waters)的WatersAlliance2795分离模块(Waters)，使用TSK柱(G3000SWxl；TosohBiosciences，Cat#6095006)和TSK-凝胶SWxl保护柱(Tosoh Biosciences，Cat#6095007)进行。样品(在PBS pH7.4中稀释至5mg/mL)使用流动相0.1M硫酸钠(Na2SO4，Sigma-Aldrich，Cat#31481)/0.1M磷酸钠pH6.8(NaH2PO4，Sigma-AldrichCat#17844/Na2HPO4.2H2O，Sigma-AldrichCat#71633)以1mL/分钟运行。使用Empower 3软件处理结果，并且每个峰表示为总峰高度的百分比。
使用ICE3分析仪(ProteinSimple)进行cIEF分析。将每种抗人CD20 IgG1变体与最终含有0.3mg/mL抗体，0.35％甲基纤维素(ProteinSimple，Cat#101876)；2％Pharmalytes3-10(GEHealthcare，Cat#17-0456-01)；6％Pharmalytes 8-10.5(GEHealthcare，Cat#17-0455-01)；0.5％pI标记物7.65和0.5％pI标记物10.10(分别为ProteinSimple，Cat#102407和Cat#102232)的测定混合物混合。聚焦在1500V进行1分钟(预聚焦(prefocusing))并在3000V进行7分钟。将抗人CD3 IgG1变体与最终含有0.3mg/mL抗体，3.2M尿素(Sigma-Aldrich，Cat#33247-1kg)，0.35％甲基纤维素；2％Pharmalytes 3-10；6％Pharmalytes 8-10.5；0.5％pI标记物7.65和0.5％pI标记物10.10的测定混合物混合。聚焦在1500V进行2分钟(预聚焦)并在3000V进行9分钟。通过电荷耦合摄像装置照相机捕获全毛细管吸收图像。校准峰概况后，通过Empower 3软件(Waters)分析数据的pI和面积(％)。
CE-SDS使用GXII Touch(Perkin Elmer，Cat#CLS138160)在HT ProteinExpress LabChip(PerkinElmer，Cat#760499)上使用HTProteinExpressReagent试剂盒(Perkin Elmer，Cat#CLS960008)进行，其中有少量修改。将样品在PBSpH7.4中稀释至1mg/mL，并通过2μL稀释的样品+7μL变性溶液+35μL MilliQ水制备样品。样品在96-孔Bio-RadHSP9601平板(Cat#4TI-0960)中制备。分析在非还原和还原条件(添加DTT)下进行。通过于70℃温育3分钟使样品变性。根据制造商的说明书制备芯片，并使用HT抗体分析200高灵敏度设置运行样品。使用Labchip GXII软件V5.3.2115.0分析蛋白大小(kDa)和纯度(％)。
动态光散射(DLS)基本上如实施例17中所述进行，然而这里，DLS于25℃的恒温进行以确定平均颗粒大小。
所有结果总结于表5-7中。如通过HP-SEC所检测的，如与1个月暴露相比的，抗人CD20 IgG1和IgG1-huCLB-T3/4抗体变体于2-8℃贮藏4个月不显著影响样品中检测到的多聚体的百分比。存在的多聚体的百分比在经受40℃达4个月以及在较小程度上经受40℃达1个月的含有抗人CD 20和CD3 IgG1变体的样品中最高。在40℃的抗人CD20 IgG1样品中，携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的变体的样品含有比携带K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体的样品更高百分比的多聚体。此外，在含有抗人CD20 IgG1变体的样品之间没有观察到降解百分比的差异。对于抗人CD3 IgG1抗体变体，在使样品经受40℃达4个月以及在较小程度上经受40℃达1个月后，在含有L234F-L235E-G236R-F405L的变体的样品中检测到增加的多聚体百分比，而携带L234F-L235E-D265A-F405L或F405L突变的变体的样品的多聚体的百分比是类似的。将抗人CD3 IgG1-L234F-L235E-G236R-F405L变体暴露于40℃达1个月时，相对高百分比的蛋白被降解，并且在暴露4个月后逐渐增加地降解。
cIEF分析用于研究响应于不同应激条件的抗体变体的酸性、中性和碱性峰百分比的变化。样品中存在的酸性蛋白百分比的变化用作脱酰胺作用的替代量度。值得注意的是，对于在任一温度贮藏1个月的样品，中性峰被分成两个峰，其被总括为中性蛋白的百分比。在于40℃贮藏1至4个月的所有样品中均观察到酸性蛋白百分比的增加，而对于于2-8℃贮藏的样品，没有观察到这种在贮藏1至4个月的酸性蛋白百分比的增加。对于所有测试的抗人CD20 IgG1抗体变体，酸性蛋白的百分比是类似的。携带单独的F405L突变、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的抗人CD3 IgG1变体在所有测试的条件下也显示出类似的酸性蛋白百分比，除了于40℃贮藏4个月后达到79％酸性蛋白的最大值的含有F405L的变体之外，而携带非激活突变的变体在所述条件下分别达到98％和96％。
通过CE-SDS检测的完整蛋白的百分比充当响应于测试的应激条件的蛋白完整性和降解的量度。将样品于2-8℃贮藏1或4个月或于40℃贮藏1个月后，抗人CD20 IgG1变体大致上保留了其完整结构。然而，对于所有抗人CD20 IgG1变体，在将样品暴露于40℃达4个月后，检测的完整IgG的百分比降低，其中对于含有K409R的变体观察到最强的降解。在研究HC和LC的百分比时观察到类似的模式，尽管在较小程度上，并且例外情况是携带K409R突变或L234F-L235E-D265A-K409R突变的变体显示出相似的HC和LC百分比。抗人CD3IgG1抗体变体显示出类似的降解模式，其中含有L234F-L235E-G236R-F405L的变体在暴露于40℃后显示出最低百分比的完整IgG蛋白。虽然抗人CD3 IgG1变体的HC和LC百分比总的说来显示出相似的模式，但对于携带L234F-L235E-D265A-F405L突变的变体检测到最低的HC和LC百分比。
在使抗体变体样品经受指示的应激条件后，进行DLS分析以确定平均颗粒大小(半径)，其是聚集水平的替代量度。对于所有抗人CD20 IgG1变体，如与其他测试的条件相比的，将样品暴露于40℃达4个月显著增加了平均颗粒半径。在所有测试的条件下，如与K409R和L234F-L235E-D265A-K409R变体相比的，对于携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体检测到最高平均颗粒半径。颗粒已经存在于含有含L234F-L235E-G236R-K409R变体的样品的原材料中。对于抗人CD3 IgG1变体，在所有测试的条件下对于抗人CD3 IgG1-F405L变体检测到相对大的平均颗粒大小。这些较大半径的原因很可能与所施加的应激条件无关，这是因为颗粒已经存在于原材料中。应激后没有观察到平均颗粒大小的增加。对于携带非激活突变L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L的变体，检测到显著较低的平均颗粒大小。
总之，如与于2-8℃贮藏的变体相比的，在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20和CD3 IgG1抗体变体于40℃温育1至4个月导致增加的多聚化。虽然对于携带L234F-L235E-D265A-K409R的抗人CD20 IgG1变体观察到比携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体更多的多聚化，但是携带L234F-L235E-G236R-F405L的抗人CD3 IgG1变体显示比携带L234F-L235E-D265A-F405L突变的变体更多的多聚化。一般说来，当于2-8℃贮藏1或4个月时，对于任何测试的抗体变体都没有观察到用作脱酰胺的蛋白的替代量度的酸性蛋白百分比的增加。虽然如与于2-8℃贮藏相比的，于40℃贮藏1个月的样品含有相对更多的酸性蛋白，但于40℃贮藏4个月后，对于所有测试的变体都观察到酸性蛋白百分比的进一步增加。于40℃贮藏后，所有抗体变体均检测到较少的完整蛋白，这在贮藏4个月后最为明显。抗人CD3 IgG1-L234F-L235E-G236R-F405L变体显示于40℃贮藏4个月后检测到的完整蛋白的百分比稍微更强的降低。最后，当于40℃贮藏4个月时，对于所有抗人CD20 IgG1变体都观察到更多的聚集。在抗人CD3 IgG1变体中，携带非激活突变的两种变体都含有比含有F405L的变体显著较少的聚集体。
对于携带L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R非激活突变的抗人CD20和CD3IgG1变体两者都观察到可接受的稳定性概况。于40℃贮藏4个月导致所有测试的抗体变体的较低稳定性概况。
表5显示了在已于2-8℃或40℃贮藏1或4个月的含有在恒定重链区中携带非激活突变或单个异二聚化促进突变的抗人CD20和CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的样品中如通过HP-SEC分析所检测的多聚体、单体和降解的蛋白的百分比。HP-SEC：高效尺寸排阻层析。
表6显示了在已于2-8℃或40℃贮藏1或4个月的含有在恒定重链区中携带非激活突变或单个异二聚化促进突变的抗人CD20和CD3 IgG1变体的样品中存在的酸性、中性和碱性同种型的百分比，如由cIEF分析所确定的。样品中存在的酸性同种型的百分比的变化是样品脱酰胺作用水平的替代物。CIEF：毛细管等电聚焦。
表7显示了在已于2-8℃或40℃贮藏1或4个月的含有在恒定重链区中携带非激活突变或单个异二聚化促进突变的抗人CD20和CD3 IgG1变体的样品中检测到的如通过非还原和还原CE-SDS分析所测定的完整蛋白及HC和LC总和的百分比，以及如通过DLS分析所测定的颗粒的平均半径(以nm为单位)。CE-SDS：毛细管电泳十二烷基硫酸钠；DLS：动态光散射。
表5
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
表6
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
2由于技术赝象，中性峰被分裂。将两个峰的峰％加和。
表7
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
2带有肩部的完整IgG
3多模式：检测到具有不同半径的几个群体
m：月
c.i.：复杂的解释
实施例19：冻/融对IgG1非激活抗体变体稳定性的影响
使用实施例18中描述的测定评估冻/融循环对在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1抗体变体的稳定性的影响。
将抗人CD20和CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的样品以约20mg/mL的浓度配制在PBS pH 7.4中(浓度范围18.7-21.6mg/mL；过滤应用于抗人CD3 IgG1抗体变体)。PBS用作非最佳制剂以允许更好地比较蛋白稳定性。抗人CD20 IgG1变体携带K409R突变、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变，而抗人CD3 IgG1抗体变体携带F405L突变、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变。将两个独立的相同样品于<-65℃冷冻，并以三个循环解冻至室温(RT)。接着，如实施例18中所述，使用HP-SEC、cIEF、CE-SDS和DLS研究蛋白稳定性。
在三个冷冻和解冻循环后，如通过HP-SEC所测定的，在含有抗人CD20 IgG1变体的样品中观察到多聚体百分比的增加，尽管样品中存在的多聚体的百分比是低的(范围对于参考样品为从0.7％一直到1.2％，对于冻融样品为从1.8％一直到2.8％)。对于抗人CD3IgG1抗体变体，检测到的范围从0.2％一直到0.7％的多聚体的百分比被认为太低以致于无法允许可靠的结论。
如通过cIEF分析所测定的，在冷冻和解冻抗人CD20和CD3 IgG1抗体变体时没有检测到酸性蛋白百分比的显著差异。总的说来，携带与K409R或F405L组合的L234F-L235E-D265A突变的变体显示出最高百分比的酸性蛋白，在参考样品中也如此，很可能是由于D265A的唾液酸化(sialylation)。
抗体变体样品的冷冻和解冻也不影响任何IgG1变体的完整蛋白的百分比，其中完整蛋白的百分比范围从99％一直到100％。类似地，HC和LC的百分比也不受样品冷冻和解冻的影响。
如通过DLS分析所评估的平均颗粒大小(半径)不受样品冷冻和解冻的影响。对于携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体，检测到相对更多的抗人CD20 IgG1变体的聚集体，而对于抗人CD3 IgG1变体，对于含有F405L的变体，检测到相对最多的聚集体。
总之，如与参考样品相比的，含有携带与K409R或F405L组合的非激活突变L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R的抗人CD20和CD3 IgG1抗体变体的样品的冷冻和解冻不导致多聚化、脱酰胺作用或蛋白降解的相关增加。因此，得出的结论是，携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A突变的抗体变体类似地能够在重复冻/融循环后保持蛋白稳定性。
表8显示了在已经受3个冻/融循环的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗人CD3 IgG1抗体变体的样品中如通过HP-SEC分析所检测的多聚体和单体的百分比。所示值是经受3个冻/融循环的2个个别样品的平均值。HP-SEC：高效尺寸排阻层析。
表9显示了在已经受1或2个冻/融循环的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20和CD3 IgG1抗体变体的样品中存在的酸性、中性和碱性同种型的百分比，如通过cIEF分析所测定的。样品中存在的酸性蛋白百分比的变化用作脱酰胺作用的替代量度。所示值是经受3个冻/融循环的2个个别样品的平均值。CIEF：毛细管等电聚焦。
表10显示了在已经受3个冻/融循环的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20和CD3 IgG1抗体变体的样品中检测到的如通过CE-SDS分析所测定的完整蛋白和HC+LC总和的百分比，以及如通过DLS分析所测定的平均半径(以nm为单位)。所示值是经受3个冻/融循环的2个个别样品的平均值。CE-SDS：毛细管电泳十二烷基硫酸钠；DLS：动态光散射。
表8
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
表9
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
表10
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
实施例20：低pH-诱导的应激对IgG1非激活抗体变体稳定性的影响
在实施例18中，使用许多蛋白稳定性测定评估在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1抗体变体的低或高温度贮藏的影响。在实施例19中应用相同的测定以评估冻/融循环对这种IgG1抗体变体的稳定性的影响。这里，使用实施例18中描述的测定来评估低pH-诱导的应激的影响，这是因为抗体疗法开发期间的病毒灭活经常在低pH条件下进行。
将抗人CD20 IgG1和抗人CD3(huCLB-T3/4)IgG1抗体变体的样品以约20mg/mL的浓度配制在PBSpH7.4中(浓度范围18.7-21.6mg/mL；过滤应用于抗人CD3抗体变体)。抗人CD20IgG1变体携带K409R突变、L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变，而抗人IgG1抗体变体携带F405L突变、L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变。指示的抗体变体在PBS(参考)中配制，并缓冲液更换为0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0；Sigma-Aldrich，Cat#C1909-500G)达1小时(于室温)或24小时(于2-8℃)，继之以另一次缓冲液更换回PBS。接着，如实施例18中所述，使用HP-SEC、cIEF、CE-SDS和DLS研究蛋白稳定性。
虽然如通过HP-SEC分析所测定的，对于携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的变体，抗人CD20 IgG1样品中存在的多聚体百分比在pH3.0显著增加，但含有K409R和L234F-L235E-G236R-K409R的变体两者均显示多聚体百分比较低增加。在pH 3.0条件下保持1小时或24小时的样品中观察到的多聚体的百分比是相似的。对于抗人CD3 IgG1变体，含有携带L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变的变体的样品两者均显示在pH 3.0多聚体的存在的增加(1小时和24小时)。这些百分比高于在含有F405L的变体的样品中检测到的百分比。
通过cIEF分析产生的数据显示对于在pH 3.0温育1或24小时的所有抗人CD20IgG1变体在中性峰的碱性侧的拖尾。携带非激活突变L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L的抗人CD3 IgG1变体在pH 3.0显示出酸性蛋白百分比的增加，其对于含有F405L的变体没有观察到。虽然如与参考样品(pH7.4)相比的，对于含有L234F-L235E-D265A-F405L和L234F-L235E-G236R-F405L的变体两者在pH 3.0均观察到酸性蛋白的增加，但含有L234F-L235E-D265A-F405L的变体在pH 7.4已经含有比含有L234F-L235E-G236R-F405L的变体更高百分比的酸性蛋白，很可能是由于D265A的唾液酸化。值得注意的是，含有携带非激活突变的抗人CD3 IgG1变体的样品中增加的酸性蛋白百分比可能反映了在pH3.0这些样品中观察到的峰的增加，其可能是由于样品中形成的聚集体的增加。
CE-SDS分析没有揭示在PBS或pH 3.0的缓冲液中配制的样品之间在完整IgG1或HC+LC总和的百分比方面的任何差异。此外，在将抗人CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R在pH3.0保持1小时或24小时时，观察到平均颗粒大小的增加，如使用DLS分析所检测的。含有抗人CD20 IgG1-L234F-L235E-G236R-K409R变体的PBS参考样品和含有抗人CD3 IgG1-F405L变体的样品中较大的平均颗粒大小可以通过缓冲液更换期间聚集体的去除来解释。除了这些观察结果之外，在单独PBS中或在pH 3.0温育后在PBS中配制的样品之间没有观察到颗粒大小的显著差异。
总之，如与在生理pH在PBS中配制的样品相比的，当样品在pH3.0温育时，在含有在恒定重链区中携带F405L或K409R突变和/或非激活突变的抗人CD20或CD3 IgG1抗体变体的样品中检测到多聚体的存在的增加。携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的抗人CD20IgG1变体显示出比携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体更大的多聚化增加。在pH3.0对于所有测试的抗人CD20 IgG1变体都观察到碱性侧的中性峰拖尾，而对于携带非激活突变的抗人CD3 IgG1抗体变体的结果由于在保持在pH 3.0的样品中检测到的峰而是不确定的。虽然酸性条件(pH 3.0)不影响蛋白完整性，但在pH 3.0温育后对于抗人CD20 IgG1-L234F-L235E-D265A-K409R检测到平均颗粒大小的相对增加。
因此，当在低pH温育时，携带L234F-L235E-G236R突变的抗人CD20 IgG1抗体变体显示出比携带L234F-L235E-D265A突变的变体更少的聚集。这表明在低pH的病毒灭活程序期间，包含L234F-L235E-G236R的抗体变体可能比包含L234F-L235E-D265A的变体更优选。
表11显示了在PBS中配制的或在0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)中温育1或24小时时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20和CD3 IgG1(huCLB-T3/4)抗体变体的样品中如通过HP-SEC分析所检测的多聚体和单体的百分比。
表12显示了在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)中配制1或24小时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗-CD3 IgG1(-huCLB-T3/4)抗体变体的样品中存在的酸性、中性和碱性同种型的百分比，如通过cIEF分析所测定的。
表13显示了在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)中配制1或24小时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗-CD3 IgG1-huCLB-T3/4抗体变体的样品中检测到的如通过CE-SDS分析所测定的完整IgG和HC+LC总和的百分比，以及如通过DLS分析所测定的平均颗粒半径(以nm为单位)。
表11
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
表12
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
2峰的存在
3酸性侧额外种类的存在
表13
/>
1在IgG浓度～20mg/mL测试的应激条件
2多模式
实施例21：IgG1非激活抗体变体在低pH的稳定性的评估
在实施例20中，使用许多蛋白稳定性测定评估低pH对在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1抗体变体的稳定性的影响。这里，使用实施例18中描述的测定在RT0.5、1和4小时后评估低pH-诱导的应激(pH 3.5)的影响。
将抗人CD20和人CD3(huCLB-T3/4)抗体变体的样品以约5mg/mL的浓度配制在PBSpH7.4中(浓度范围4.98-5.3mg/mL)。IgG1-CD20变体携带L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变，而IgG1-CD3抗体变体携带L234F-L235E-D265A-F405L或L234F-L235E-G236R-F405L突变。为了评估暴露于低pH(3.5)条件的影响，将含有抗体变体的样品于室温用0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)缓冲液更换0.5小时、1小时和4小时，继之以另一次缓冲液更换回PBS。如实施例19中所述，使用HP-SEC、CE-SDS和DLS研究蛋白稳定性。
如通过HP-SEC分析所测定的，当样品在pH 3.5温育时，在0.5小时、1小时和4小时时间点没有观察到在含有携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体的样品中的多聚体百分比的增加。携带L234F-L235E-G236R-F405L突变的抗人CD3 IgG1变体的多聚体百分比随着时间的推移稍微增加。在pH 3.5，在含有IgG1-huCLB-T3/4-L234F-L235E-D265A-F405L变体的样品中，检测到的多聚体的百分比随着时间的推移强烈增加。
当样品在pH 7.4(PBS)或pH 3.5温育时，CE-SDS分析未揭示任何测试的样品中完整IgG或HC+LC总和的百分比的任何变化。同样，如通过DLS所分析的，在保持在pH7.4或pH3.5的任何样品之间均未检测到平均颗粒大小的显著差异。对于IgG1-CD20-L234F-L235E-G236R-K409R的参考样品测量的增加的颗粒大小可以通过在应用的参考批次中聚集的颗粒的存在来解释，其在缓冲液更换过程期间被去除，且因此在pH-应激的样品中未被检测到。
总之，在暴露于pH 3.5达0.5小时、1小时或4小时后，对于在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1抗体变体，没有观察到多聚化的增加。虽然携带L234F-L235E-G236R-F405L突变的抗人CD3 IgG1变体在pH 3.5显示出多聚化的稍微增加，但所述增加对于携带L234F-L235E-D265A-F405L突变的变体更为明显。因此，证实了，与实施例20中提供的数据一致并且尽管测定结果存在克隆依赖性差异，含有L234F-L235E-G236R的抗体变体可在低pH的病毒灭活程序方面比含有L234F-L235E-D265A的变体具有优点。
表14显示了在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)中溶解0.5小时、1小时或4小时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20和抗人CD3抗体变体的样品中如通过HP-SEC分析所检测的多聚体和单体的百分比(所有样品中的降解<0.2％)以及如通过CE-SDS分析所测定的完整IgG和HC+LC总和的百分比。
表14还显示了在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)中溶解0.5小时、1小时或4小时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1-CD20和IgG1-CD3抗体变体的样品中检测到的如通过DLS分析所测定的平均颗粒半径(以nm为单位)。
表14
1在IgG浓度～5mg/mL测试的应激条件
2IgG1-CD20-FERR参考的半径和单体％质量中的差异是由于在批次中存在的颗粒，其在缓冲液更换程序期间被去除，且因此对于pH应激的样品未被检测到
实施例22：携带非激活突变的双特异性IgG1抗体变体在低pH的稳定性的评估
在实施例21中，在0.5、1小时和4小时后评估低pH-诱导的应激(pH3.5)对在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1抗体变体的稳定性的影响。这里，使用实施例18中描述的测定在0.5、1和4小时后评估低pH-诱导的应激(pH 3.5)对携带非激活突变的抗-CD3/CD20双特异性抗体的稳定性的影响。
使用实施例1中描述的受控Fab-臂交换程序，从除仅在受控还原条件下促进与互补半分子进行半分子异二聚化的K409R或F405L突变外还携带非激活突变L234F-L235E-D265A或L234F-L235E-G236R的抗人CD3和抗人CD20 IgG1抗体产生双特异性抗体(bsAb)。这产生了在两个臂中携带L234F-L235E-D265A或在两个臂中携带L234F-L235E-G236R的bsIgG1-CD3xCD20抗体(下文表示为对称主链)，或携带一个臂中的L234F-L235E-D265A突变和另一个臂中的L234F-L235E-G236R突变的组合的双特异性抗体(下文表示为不对称主链)。bsIgG1-CD3xCD20抗体变体的样品以约5mg/mL的浓度配制在PBS(pH7.4)中(浓度范围3.209-5.304mg/mL)。为了评估暴露于低pH(3.5)条件的影响，将含有bsIgG1-CD3xCD20抗体的样品于室温用0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)缓冲液更换0.5小时、1小时和4小时，继之以另一次缓冲液更换回PBS。接着，如实施例18中所述，使用HP-SEC、CE-SDS和DLS研究蛋白稳定性。
如与它们各自的参考样品相比的，对于任何测试的时间点在将任何携带非激活突变的bsIgG1-CD3xCD20抗体变体暴露于pH 3.5时，HP-SEC分析没有揭示对多聚化的显著影响。使用CE-SDS，对于任何测试的bsAb变体也没有观察到pH 3.5暴露的影响，从而表明所有bsAbs在暴露于pH 3.5时仍保持完整。通过DLS对平均大小进行的分析显示，携带L234F-L235E-D265A突变的对称bsAb以及在含有F405L的臂中携带L234F-L235E-G236R突变的不对称bsAb暴露于pH 3.5不诱导改变的聚集水平。对于携带L234F-L235E-G236R突变的对称bsAb和在含有K409R的臂中携带L234F-L235E-G236R突变的不对称bsAb在任何分析的时间点在pH3.5观察到的平均大小中的小的降低可能是由于在缓冲液更换过程期间聚集体的去除。
总之，在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1 bsAb变体保留了其完整的结构，并且在约5mg/mL的浓度暴露于低pH条件达最多到4小时后对多聚化不越来越敏感。这些结果表明，携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的双特异性抗体变体在暴露于低pH条件时同样地能够保留单体性(monomericity)，这是于低pH进行的病毒灭活程序中的疗法开发过程中有利的性质。
表15显示了在含有从在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗人CD3抗体产生的双特异性抗体(bsAb)的样品中检测到的如通过HP-SEC分析所检测的多聚体和单体的百分比，以及如通过CE-SDS分析所测定的完整IgG和HC+LC总和的百分比。生成了携带两个臂中的L234F-L235E-D265A非激活突变，或两个臂中的L234F-L235E-G236R非激活突变，或一个臂中的L234F-L235E-D265A突变和另一个臂中的L234F-L235E-G236R突变的组合的BsAbs。在分析前将抗体变体溶解在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)中达0.5小时、1小时或4小时。
表16显示了在含有在恒定重链区中携带非激活突变的bsIgG1-CD3xCD20抗体变体的样品中检测到的如通过DLS分析所测定的平均半径(以nm为单位)和单体质量的百分比。生成了携带两个臂中的L234F-L235E-D265A非激活突变，或两个臂中的L234F-L235E-G236R非激活突变，或一个臂中的L234F-L235E-D265A突变和另一个臂中的L234F-L235E-G236R突变的组合的BsAbs。在分析前将抗体变体溶解在PBS或0.02M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)中达0.5小时、1小时或4小时。
表15
1在IgG浓度～5mg/mL测试的应激条件
表16
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1在IgG浓度～5mg/mL测试的应激条件
实施例23：携带非激活突变的抗-CD20和抗-gp120 IgG1抗体变体在低pH的稳定性的评估在实施例21中，在0.5小时、1小时和4小时后评估低pH-诱导的应激(pH 3.5)对在恒定重链区中携带非激活突变的IgG1抗体变体的稳定性的影响。这里，使用实施例18中描述的HP-SEC测定在0.5、1小时、2小时、4小时和24小时后评估低pH-诱导的应激(pH 3.5)对与K409R突变组合在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗-gp120(HIV1)IgG1-b12抗体的稳定性的影响。对这些抗体变体在低pH条件下的多聚化程度进行了分析，作为蛋白不稳定性的量度，这在抗体疗法开发过程中的病毒灭活程序的背景中是重要的。
将抗人CD20 IgG1和IgG1-b12抗体变体的样品以约0.5mg/mL的浓度配制在PBS中(浓度范围0.435-0.5mg/mL)。抗人CD20 IgG1和IgG1-b12变体携带L234F-L235E-D265A-K409R或L234F-L235E-G236R-K409R突变。为了评估暴露于低pH(3.5)条件的影响，通过滴加2M乙酸(Fluka，Cat#33209)将PBS中含有抗体变体的样品酸化至pH 3.5，且接着于RT使用平板摇床温育0.5小时、1小时、2小时、4小时或24小时。温育后，将来自每个样品管的样品转移至含有2MTris-HCl(pH9.0；Sigma-Aldrich，Cat#T6066)的管中以将pH恢复至7.4。接着，如实施例18中所述，使用HP-SEC研究蛋白稳定性。
HP-SEC分析揭示，在含有携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的抗人CD20 IgG1变体的样品中响应于在pH 3.5的温育发生了多聚化的快速增加，其在温育2小时后达到顶部，其中在样品中检测到35.2％的多聚体。相比之下，将携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的抗人CD20 IgG1变体暴露于pH 3.5导致多聚化随着时间的推移稳定且相对慢的增加，其中在温育24小时后在分析的样品中检测到10.8％的多聚体的最大值。
对于携带非激活突变的IgG1-b12变体观察到高度相似的模式。虽然携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的变体显示出多聚化的快速增加，其中在pH 3.5温育2小时后检测到27.6％的多聚体的最大值，但在pH 3.5对于携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体观察到多聚化的较慢且较低的增加，其中在pH 3.5温育24小时后检测到18％的多聚体的最大值。
总之，HP-SEC分析揭示，在携带L234F-L235E-D265A-K409R突变的抗体变体中多聚化过程发生得比携带L234F-L235E-G236R-K409R突变的变体更快且更广泛。因此，得出的结论是，携带L234F-L235E-G236R非激活突变的其他抗体克隆变体也具有比含有L234F-L235E-D265A的变体更高的在低pH条件下保留单体性的能力。在低pH进行的病毒灭活程序过程中，在低pH的单体性的保留是有利的特征。
表17显示了在PBS或乙酸钠缓冲液(pH 3.5)中溶解0.5小时、1小时、2小时、4小时或24小时的含有在恒定重链区中携带非激活突变的抗人CD20 IgG1和抗-gp120(HIV1)IgG1-b12抗体变体的样品中如通过HP-SEC分析所检测到的多聚体、单体和降解的百分比。
表17
1在IgG浓度～0.5mg/mL测试的应激条件对于参考0.5mg/ml，对于pH 3.50.435mg/ml)FER的抗体疗法可开发性方面
在实施例15-23中，评估了与抗体疗法可开发性相关的许多方面。首先，在使用携带L234F-L235E-D265A(FEA)或L234F-L235E-G236R(FER)突变的抗体变体形成双特异性抗体的能力中没有观察到明显差异。同样，携带FEA或FER突变的抗体变体的生产水平相似。如与携带FEA突变的抗体变体相比的，携带FER突变的抗体变体的高度浓缩样品显示出提高的蛋白稳定性和较少的聚集倾向。将抗体变体暴露于40℃达4个月导致所有测试的变体的多聚化增加，其程度是抗体克隆依赖性的。此外，冻融循环不影响携带FEA或FER突变的抗体变体的蛋白稳定性。重要的是，如与携带FEA突变的变体相比的，携带FER突变的抗体变体显示出对低pH-诱导的应激条件的更高的抗性。
在IgG1抗体的Fc区中引入FEA突变导致可以容易地开发的抗体变体，并且这种抗体变体目前对于临床产品开发和临床使用是被广泛接受的。考虑到上述情况，当期望惰性形式时，反而可以通过引入FER突变来进一步改善抗体变体的蛋白稳定性概况和可开发性。因此，含有FER的变体可以优选用于开发用于临床使用的单特异性或多特异性抗体。特别地，携带FER突变的抗体变体被表明对暴露于低pH条件较不敏感，这是在开发用于人使用的治疗用抗体期间经常应用和需要的病毒灭活程序中的有益的性质。
实施例24：抗人CD20抗体及其在每条重链中都含有不同组的非激活突变的变体的C1q结合和依赖补体的细胞毒性
在实施例3和5中，显示在野生型样IgG1抗人CD20和HLA-DR抗体的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R(FER)突变导致几乎完全消除了诱导CDC的能力。这与携带FER突变的抗体变体的C1q结合的减少一致，如实施例4中所示的。这里，评估了含有在两个HCs中都携带L234F-L235E-D265A(FEA)或FER突变的两个HCs的抗人CD20抗体以及含有在一个HC中的FEA突变和在另一个HC中的FER突变的变体的结合补体因子C1q的能力。同样，评估了上述抗体变体诱导CDC的能力。
野生型抗人CD20抗体IgG1-CD20及其除了K409R或F405L突变之外在两个HCs中都还携带FEA或FER非激活突变的变体，或还含有在一个HC中的FEA突变和在另一个HC中的FER突变的变体(下文称为“不对称变体”)按照实施例4中描述的程序，用20％正常人血清(NHS，M0008，Sanquin)作为C1q来源，在Raji细胞上，在C1q结合测定中进行测试。基本上如实施例1中所述，通过受控的Fab-臂交换产生抗人CD20抗体的不对称变体。C1q与抗体变体的结合通过流式细胞术在Intellicyt iQue筛分机(Sartorius)上通过测量中值荧光强度-FITC来检测。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对非结合对照抗体IgG1-b12(0％)测量的AUC值和对野生型IgG1抗体变体(IgG1-CD20，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立实验获得的平均值±SEM。
在体外CDC测定中测试了在C1q结合测定中测试的相同抗体变体。基本上如实施例3中进一步描述的，使用每孔5x104个Raji细胞以许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3倍稀释)测试抗体变体。PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在Intellicyt iQue筛分机(Sartorius)上测定。对应于细胞裂解的百分比的PI-阳性细胞的百分比计算为(PI-阳性细胞数/细胞总数)x100％。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对非结合对照抗体IgG1-b12(0％)测量的AUC值和对野生型IgG1抗体变体(IgG1-CD20，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立实验获得的平均值±SEM。
对C1q与IgG1-CD20变体的结合的评估揭示野生型IgG1-CD20抗体在与靶Raji细胞上的CD20结合时有效地与补体蛋白C1q接合。与F405L或K409R突变组合的FEA或FER非激活突变的引入显著降低了C1q结合(图16)。不管HCs两者都含有K409R或F405L突变，还是一个HC含有K409R突变而另一个HC含有F405L突变，C1q与携带FER突变的IgG1-CD20变体的结合都比与携带FEA突变的IgG1-CD20变体更强烈地降低。对于不对称变体BisG1-CD20FEA-F405LxFER-K409R，观察到C1q结合的完全取消，而对于另一不对称变体BisG1-CD20 FER-F405LxFEA-K409R，观察到C1q结合的强烈减少(图16)。
对相同IgG1-CD20变体的CDC-诱导能力的评估揭示，不管两个HCs都含有K409R或F405L突变，还是一个HC含有K409R突变而另一个HC含有F405L突变，通过引入FER突变最强烈地抑制了消除CDC的能力(图17)。如与野生型IgG1-CD20相比的，对于含有突变FEA-K409R的IgG1-CD20变体并且在较小程度上对于IgG1-CD20-FEA-F405L观察到残留的CDC。对于不对称变体BisG1-CD20 FEA-F405LxFER-K409R观察到低残留CDC。BisG1-CD20FER-F405LxFEA-K409R的CDC-诱导能力的降低与对于BisG1-CD20FEA-F405LxFEA-K409R观察到的降低类似。
总之，通过在两个HCs都中引入FER突变，或者在进一步含有K409R突变的一个HC中引入这些突变并且在另一个HC中引入FEA-F405L突变时，抗人CD20 IgG1抗体与C1q的结合被最强烈地抑制。通过引入FER突变比引入FEA突变更强烈地抑制了诱导CDC的能力。含有在一个HC中的FER突变和在另一个HC中的FEA突变的不对称变体也显示出低至在两个HCs中都携带FER或FEA突变的变体的中间水平的CDC-诱导能力的强烈降低。
实施例25：由每条重链中含有不同组的非激活突变的抗体变体诱导的体外T-细胞介导的细胞毒性
实施例11表明，在靶向癌抗原和T-细胞的双特异性抗体变体的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R(FER)突变有效地避免了非特异性细胞毒性，但保留了诱导特异性T-细胞介导的细胞毒性的能力。在这些实验中，非激活突变以对称方式存在，即除了F405L或K409R突变之外，两个HCs都还携带FER非激活突变。这里，评估了在Fc区中携带不对称非激活突变的CD3xHER2和CD3xb12双特异性IgG1抗体的T-细胞介导的细胞毒性，即一个HC携带FER突变，而另一个HC携带备择的非激活突变(例如，L234F-L235E-D265A[FEA]、L234A-L235A-P329G[AAG]或N297G)。
双特异性抗体变体，包括携带不对称非激活突变的那些，通过受控Fab-臂交换(cFAE)产生，如实施例1中所述的。评价了通过野生型双特异性抗体CD3xHER2(抗人CD3[huCLB-T3/4]IgG1-F405L和抗人HER2 IgG1-K409R)或CD3xb12(抗人CD3[huCLB-T3/4]IgG1-F405L和非结合对照抗体抗-HIV1 gp120[b12]IgG1-K409R)及其在Fc区中携带不对称非激活突变的变体的T-细胞介导的细胞毒性。测试的双特异性变体携带一个HC中的除了F405L突变外的FER非激活突变，其与第二个HC中的除了K409R突变外的FEA、AAG或N279G非激活突变组合。此外，测试了双特异性抗体变体，其携带一个HC中的除了F405L突变外的FER非激活突变，其与不携带非激活突变但仅携带K409R突变(有效生成双特异性抗体变体所需要的)的第二个HC组合。作为对照，测试了HC中不具有非激活突变的双特异性抗体变体以及非结合对照抗体IgG1-b12。从通过如实施例9中所述的密度梯度分离来源于健康供体的血沉棕黄层分离PBMCs，用PBS洗涤，并重悬浮于培养基(具有2mML-谷氨酰胺和25mM HEPES的RPMI-1640；补加有10％具有铁的供体牛血清(DBSI))。接着，通过将PBMCs重悬浮于冷冻保护培养基中，将PBMCs以30-50x106个细胞/ml的浓度于-150℃冷冻，冷冻保护培养基由一份培养基(具有2mM L-谷氨酰胺和25mMHEPES的RPMI-1640；补加有10％具有铁的供体牛血清(DBSI))和一份80％DBSI和20％二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，Cat#41644)的混合物组成；冷冻保护培养基中DMSO的终浓度为10％)。表达HER2的SK-OV-3细胞(Cat#HTB-77，ATCC)在补加有10％(体积/体积)热灭活的DBSI和青霉素-链霉素(Pen/Strep，终浓度为50单位/mL青霉素钾和50μg/mL硫酸链霉素[Lonza，Cat#DE17-603E])的McCoy’s 5A培养基(Lonza，Cat#BE12-168F)中培养，并在5％(体积/体积)CO2湿润培养箱中维持于37℃。SK-OV-3细胞培养至接近汇合。将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于培养基中，且接着通过细胞渗滤器以获得单细胞悬浮液。将2.5x104个SK-OV-3细胞接种至96-孔培养平板的每个孔中，并将细胞于37℃、5％CO2温育4小时以允许黏附于平板。将如上所述分离后冷冻的PBMCs解冻。然后用PBS洗涤PBMCs两次，继之以重悬浮于培养基中。接着，将1x105个PBMCs添加到含有SK-OV-3靶细胞的96-孔平板的每个孔中，从而导致4:1的效应物与靶(E:T)比。接着，在培养基中制备如上文所提及的双特异性CD3xHER2和CD3xb12野生型及其非激活变体的剂量反应系列(0.001-1000ng/mL终浓度，10-倍稀释)并添加到含有SK-OV-3细胞和PBMCs的96-孔培养平板的孔中。SK-OV-3靶细胞与2μM星形孢菌素(Sigma-Aldrich，Cat#S6942-200，Sigma)的温育用作100％肿瘤细胞杀伤的参考。培养基对照(SK-OV-3细胞，无抗体，无PBMC)用作0％肿瘤细胞杀伤的参考。将平板于37℃、5％CO2温育3天。三天后，用PBS洗涤平板两次，并向每孔中添加150μL含有10％阿尔玛蓝(Invitrogen，Cat#DAL1100)的培养基。将平板于37℃、5％CO2温育4小时。测量590nm处的吸光度(Envision，PerkinElmer，Waltham，MA)。数据在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中作为对于每个实验重复实验的每个供体计算的剂量反应对百分比活SK-OV-3细胞显示。数据是从两次独立实验的4个供体获得的平均值±SEM。
所有双特异性CD3xHER2抗体变体，包括在Fc区中携带不对称非激活突变的那些，均诱导SK-OV-3细胞的剂量依赖性细胞毒性，其效率与携带具有野生型样功能的Fc区因而没有非激活突变的双特异性CD3xHER2抗体变体类似(图18A)。与实施例11中显示的数据类似，野生型样双特异性CD3xb12抗体(BisG1 F405LxK409R)诱导SK-OV-3细胞的非特异性杀伤，尽管在比野生型样双特异性CD3xHER2抗体变体较低的程度上(图18B)。携带与另一个HC中的FEA(BisG1 FER-F405LxFEA-K409R)或AAG(BisG1 FER-F405LxAAG-K409R)突变组合的在一个HC中的FER非激活突变的双特异性CD3xb12抗体变体没有表现出SK-OV-3细胞的细胞毒性(图18B)，类似于携带对称分布的FER、FEA或AAG突变的双特异性CD3xb12变体(图10B)。相比之下，携带与携带N297G非激活突变的另一个HC组合的在一个HC中的FER非激活突变的双特异性CD3xb12抗体变体(BisG1 FER-F405LxN297G-K409R)诱导SK-OV-3细胞的非特异性杀伤，尽管在比野生型样双特异性CD3xb12抗体变体较低的程度上(图18B)。所述结果与具有对称N297G非激活突变的双特异性CD3xb12抗体变体也诱导SK-OV-3细胞的部分非特异性杀伤的观察结果一致(图10B)。此外，携带与具有野生型样功能的另一个HC区组合的在一个HC中的FER非激活突变的双特异性CD3xb12抗体变体(BisG1 FER-F405LxK409R)也以与CD3xb12变体BisG1 FER-F405LxN297G-K409R相似的水平诱导非特异性杀伤(图18B)。
总的说来，在Fc区中具有不对称非激活突变的靶向癌抗原和T-细胞的双特异性抗体变体，即一个HC中的FER非激活突变和携带FEA或AAG非激活突变的另一个HC，保留了诱导特异性T-细胞介导的细胞毒性的能力，但有效避免了非特异性细胞毒性。
实施例26：由在每条重链中含有不同组的非激活突变的抗体变体诱导的PBMC培养物中的T-细胞激活
实施例10表明，在抗人CD3 IgG1抗体的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R(FER)突变阻止了人PBMC共培养物中的T-细胞的激活，如通过CD69的上调所测量的。在这些实验中，非激活突变以对称方式存在，即，除了F405L或K409R突变之外，两个HCs都还携带FER非激活突变。这里，评估了Fc区中携带不对称非激活突变的CD3xHER2双特异性IgG1抗体的T-细胞激活，即，一个HC携带FER突变，另一个HC携带不同的非激活突变。
评价了通过野生型双特异性IgG1抗体CD3xHER2及其如实施例25中所示在Fc区中携带不对称非激活突变的变体的PBMC共培养物中T细胞的激活。作为对照，测试了在HC中携带对称非激活FER突变的双特异性抗体变体、在HC中不具有非激活突变的双特异性抗体变体以及非结合对照抗体IgG1-b12。基本上按照实施例10中描述的程序评估通过这些抗体变体的T细胞上CD69的上调，作为T-细胞激活的量度。简而言之，在培养基中制备如上文所提及的双特异性CD3xHER2和CD3xb12野生型及其非激活变体的剂量反应系列(0.001-1000ng/mL终浓度，10-倍稀释)并添加到在培养基中含有PBMCs(1.5x105个细胞/孔)的96-孔圆底平板的孔中。16-24小时温育后，在Fortessa流式细胞仪(BD)上测量PBMC混合物中CD28-阳性细胞的CD69-阳性细胞的百分比。数据作为剂量反应对CD28-阳性细胞的CD69-阳性百分比进行分析。在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以背景染色剂(无抗体对照)作为基线计算每个实验重复实验的每个PBMC供体的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以对于每个实验重复实验的每个供体相对于对非结合阴性对照IgG1-b12(0％)和野生型样IgG1双特异性抗体变体(BisG1 F405LxK409R，100％)测量的AUC值的归一化。数据是从两次独立的重复实验的4个供体获得的平均值±SEM。
对作为早期T-细胞激活的量度的T细胞上CD69上调的评估表明，如与野生型样CD3xHER2双特异性抗体变体(BisG1 F405LxK409R)相比的，在HC中携带对称非激活FER突变的双特异性抗体变体阻止了PBMC共培养物中T细胞上CD69的上调(图19)。这与实施例10中对于除了F405L突变之外还携带FER非激活突变的抗人CD3 IgG1抗体所描述的数据一致。携带与另一个HC中的FEA(BisG1 FER-F405LxFEA-K409R)或AAG(BisG1 FER-F405LxAAG-K409R)突变组合的在一个HC中的FER非激活突变的双特异性CD3xHER2抗体变体也表现出PBMC共培养物中T细胞上CD69上调的几乎完全消除(图19)。相比之下，携带与携带N297G非激活突变的另一个HC组合的(BisG1 FER-F405LxN297G-K409R)或与具有野生型样功能的另一个HC区组合的(BisG1 FER-F405LxK409R)在一个HC中的FER非激活突变的双特异性CD3xHER2抗体变体诱导残留的T细胞的激活，尽管在比野生型样双特异性CD3xHER2抗体变体较低的程度上(图19)。
总之，在Fc区中具有不对称非激活突变的靶向癌抗原和T细胞的双特异性抗体变体，即一个HC中的FER非激活突变和携带FEA或AAG非激活突变的另一个HC，有效地阻止了人PBMC共培养物中如通过CD69上调所测量的T细胞的激活。
实施例27：通过生物层干涉量度学测量的抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体与人Fcγ受体的结合亲和力
实施例6中的数据表明，在重链(HC)恒定区中引入非激活L234F-L235E-G236R(FER)突变阻止了与FcγRIa的单体细胞外结构域(ECD)或人FcγRIIa同种异型131H、人FcγRIIa同种异型131R、人FcγRIIb、人FcγRIIIa同种异型158F和人FcγRIIIa同种异型158V的二聚体ECDs的结合，如通过ELISA测定所测量的。
在此，我们在OctetHTX仪器(FortéBio)上使用生物层干涉量度学(BLI)定量了野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的单体细胞外结构域(ECD)的结合亲和力。测试的非激活变体携带突变L234F-L235E-D265A、L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G。所有步骤均于30℃进行。对于人FcγRIa，在Ni-NTA生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5101)以及在样品稀释剂(SampleDiluent)(FortéBio，cat.no.18-1104)中稀释的蛋白适应(acclimatization)(于30℃600秒)后，通过将NiNTA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的人FcγRIa(SinoBiological，10256-H08S-B，1μg/ml)固定在Ni-NTA生物传感器上达600秒。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20IgG1抗体及其非激活变体的缔合(300秒)和解离(1000秒)。使用1.56-100nM(对于IgG1野生型；2-倍稀释)或15.6-1000nM(对于IgG1-L234F-L235E-D265A、IgG1-L234F-L235E-G236R和IgG1-L234A-L235A-P329G；2-倍稀释)的浓度范围测试抗体与人FcγRIa的结合。使用数据分析软件(DataAnalysis Software)v11.1(FortéBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线(datatraces)，将Y-轴与测量的基线的最后10秒对齐，且应用步骤间(interstep)校正以及Savitzky-Golay过滤。为了确定KD(M)以及kon(1/Ms)和koff(1/s)，选择了使用全局(Global)(完全(Full))拟合的1:1模型。从分析中排除<0.05的反应值。400秒解离被用作分析所有抗体变体的感兴趣的窗口。通过>0.99的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，全局(完全)拟合基于>3的曲线拟合(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
对于人FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V，在链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5019)以及在样品稀释剂中稀释的蛋白适应(于30℃600秒)后，通过将SA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的生物素化人FcγRIIa同种异型131H(Sino Biological，10374-H27H1-B，1μg/ml)、FcγRIIb(SinoBiological，10259-H27H-B，1μg/ml)或FcγRIIIa同种异型158V(Sino Biological，10389-H27H1-B，3μg/ml)固定在SA生物传感器上达65秒(FcγRIIa或FcγRIIb)或600秒(FcγRIIIa)。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20IgG1抗体及其非激活变体的缔合(50秒，FcγRIIa或FcγRIIb；300秒，FcγRIIIa)和解离(1000秒)。使用许多浓度(FcγRIIa，156.25-10000nM，2-倍稀释；FcγRIIb，250-16000nM，2-倍稀释；FcγRIIIa，125-8000nM，2-倍稀释)测试抗体与FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合。使用数据分析软件v11.1(FortéBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线，将Y-轴与测量的基线的最后10秒对齐，并应用步骤间校正。由于人IgG1和低亲和力Fcγ受体FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V之间的低亲和力，选择稳态分析(SteadyState Analysis)(SSA)以测定KD(M)。简而言之，从分析中排除<0.05的反应值。使用数据分析软件的R-平衡(Req)函数计算不同抗体浓度的稳态反应(其中传感图在缔合相中达到平台)，接着将稳态反应针对抗体浓度绘图，且最后使用Langmuir模型以计算KD(M)。通过>0.99的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，SSA基于>3的缔合曲线拟合，并且每个抗体浓度绘制的稳态反应达到平台，从而允许正确计算最大结合反应(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
使用生物层干涉量度学评估抗人CD20人IgG1抗体变体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合揭示野生型IgG1显示出以对于FcγRIa为1.8nM、对于FcγRIIa同种异型131H为1.9μM、对于FcγRIIb为7.3μM以及对于FcγRIIIa同种异型158V为0.6μM的结合亲和力与所有测试的Fcγ受体结合(表18)。相比之下，在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R、L234F-L235E-D265A或L234A-L235A-P329G非激活突变的人IgG1抗体变体没有表现出与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合(表18)。
表18：通过生物层干涉量度学测量的在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20IgG1抗体变体的人FcγR结合亲和力。对于高亲和力受体FcγRIa，KD(M)、kon(1/Ms)和koff(1/s)基于使用全局(完全)拟合的1:1模型显示。对于低亲和力受体FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V，基于稳态分析显示KD(M)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。测试的变体是IgG1、IgG1-FER、IgG1-FEA和IgG1-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，FEA:L234F-L235E-D265A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。SSA：稳态分析，BLI：生物层干涉量度学，nb：无结合，n/a：不适用。
实施例28：通过生物层干涉量度学测量的抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体与鼠Fcγ受体的结合亲和力
实施例27中的数据显示了如通过生物层干涉量度学所测量的抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合亲和力或缺乏结合亲和力。然而，当在鼠模型中评估人抗体的体内治疗效果时，取决于所选择的鼠模型，人Fcγ受体可能不存在。相反，对人抗体的治疗效果的评估可能依赖于内源表达的鼠Fcγ受体的存在。在这种情况下，如果治疗用抗体受益于非激活Fc结构域，那么关键的是要确保不存在非激活抗体变体与鼠Fcγ受体的结合。
在此，我们在OctetHTX仪器(FortéBio)上使用生物层干涉量度学(BLI)评估了野生型抗人CD20 IgG1抗体及其携带L234F-L235E-D265A、L234F-L235E-G236R、L234A-L235A-P329G突变的非激活变体与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的单体细胞外结构域(ECD)的结合亲和力。所有步骤均于30℃进行。对于鼠FcγRI，在Ni-NTA生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5101)以及在样品稀释剂(FortéBio，cat.no.18-1104)中稀释的蛋白适应(于30℃600秒)后，通过将Ni-NTA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的鼠FcγRI(SinoBiological，cat.no.50086-M27H-B，2μg/ml)固定在Ni-NTA生物传感器上达600秒的持续时间。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体的缔合(300秒)和解离(1000秒)。使用浓度范围(15.6-1000nM；2-倍稀释)测试抗体与鼠FcγRI的结合。使用数据分析软件v11.1(FortéBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线，继之以Y-轴与基线的最后10秒的对齐。最后，应用步骤间校正以及Savitzky-Golay过滤。为了确定KD(M)以及kon(1/Ms)和koff(1/s)，选择了使用全局(完全)拟合的1:1模型。从分析中排除<0.05的反应值。100秒解离被用作分析所有抗体变体的感兴趣的窗口。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，全局(完全)拟合基于>3的曲线拟合(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
对于鼠FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV，在链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5019)以及在样品稀释剂中稀释的蛋白适应(于30℃600秒)后，通过将SA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的生物素化鼠FcγRIIb(SinoBiological，cat.no.50030-M27H-B，1μg/ml)、FcγRIII(SinoBiological，cat.no.50326-M27H-B，1μg/ml)或FcγRIV(Sino Biological，cat.no.50036-M27H-B，1μg/ml)固定在SA生物传感器上达90秒(FcγRIIb)或250秒(FcγRIII和FcγRIV)。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体的缔合(50秒，FcγRIIb或FcγRIII；300秒，FcγRIV)和解离(1000秒)。使用许多浓度(FcγRIIb，187.5-12000nM，2-倍稀释；FcγRIII，156.25-10000nM，2-倍稀释；FcγRIV，78.13-5000nM，2-倍稀释)测试抗体与鼠FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合。使用数据分析软件v11.1(FortéBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线，将Y-轴与基线测量的最后10秒对齐，并应用步骤间校正。由于人IgG1和低亲和力鼠Fcγ受体FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV之间的低亲和力，选择稳态分析(SSA)以测定KD(M)。简而言之，从分析中排除<0.05的反应值。使用数据分析软件的R-平衡(Req)函数计算不同抗体浓度的稳态反应(其中传感图在缔合相中达到平台)，接着将稳态反应针对抗体浓度绘图，且最后使用Langmuir模型以计算KD(M)。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，SSA基于>3的缔合曲线拟合，并且每个抗体浓度绘制的稳态反应达到平台，从而允许正确计算最大结合反应(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
使用生物层干涉量度学评估抗人CD20人IgG1抗体变体与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合揭示野生型人IgG1显示出以对于FcγRIa为0.12μM、对于FcγRIIb为2.8μM、对于FcγRIII为7.5μM以及对于FcγRIV为1μM的结合亲和力与所有测试的鼠Fcγ受体结合(表19)。相比之下，在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R、L234F-L235E-D265A或L234A-L235A-P329G非激活突变的人IgG1抗体变体没有表现出与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合(表19)。
表19：如通过生物层干涉量度学所测量的在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20人IgG1抗体变体的鼠FcγR结合亲和力。对于高亲和力受体FcγRI，KD(M)、kon(1/Ms)和koff(1/s)基于使用全局(完全)拟合的1:1模型显示。对于低亲和力受体FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV，基于稳态分析显示KD(M)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。测试的变体是IgG1、IgG1-FER、IgG1-FEA和IgG1-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，FEA:L234F-L235E-D265A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。SSA：稳态分析，BLI：生物层干涉量度学，nb：无结合，n/a：不适用。
实施例29：通过生物层干涉量度学测量的抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体与食蟹猴Fcγ受体的结合亲和力在临床前开发过程中，可能会发起涉及非人类灵长类动物(食蟹猴，食蟹猴(Macaca fascicularis))的研究或涉及衍生自非人类灵长类动物的生物样品的实验，以研究抗体疗法候选物的治疗效果以及安全性和药物代谢动力学。实施例27中的数据显示了如通过生物层干涉量度学所测量的携带非激活L234F-L235E-G236R突变的抗人CD20 IgG1抗体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合亲和力或缺乏结合亲和力。尽管人和食蟹猴Fcγ受体之间具有很强的序列相似性，但未显示出与人Fcγ受体结合的特定非激活变体可能仍然显示出与食蟹猴Fcγ受体的结合。因此，为了将不需要的不利事件和剂量限制性毒性的风险减至最低，我们在OctetHTX仪器(FortéBio)上使用生物层干涉量度学(BLI)评估了野生型抗人CD20 IgG1抗体及其携带L234F-L235E-D265A、L234F-L235E-G236R、L234A-L235A-P329G突变的非激活变体与食蟹猴FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的单体细胞外结构域(ECD)的结合亲和力。
所有步骤均于30℃进行。对于食蟹猴FcγRI，在Ni-NTA生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5101)以及在样品稀释剂(FortéBio，cat.no.18-1104)中稀释的蛋白适应(于30℃600秒)后，通过将Ni-NTA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的食蟹猴FcγRI(R&D Systems，cat.no.CF9239-Fc，1μg/ml)固定在Ni-NTA生物传感器上达600秒的持续时间。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体的缔合(300秒)和解离(1000秒)。使用1.56-100nM(对于IgG1野生型；2-倍稀释)或15.6-1000nM(对于IgG1-L234F-L235E-D265A、IgG1-L234F-L235E-G236R和IgG1-L234A-L235A-P329G；2-倍稀释的浓度范围测试抗体与食蟹猴FcγRI的结合。使用数据分析软件v11.1(ForteBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线，继之以y-轴与基线的最后10秒的对齐。最后，应用步骤间校正以及Savitzky-Golay过滤。为了确定KD(M)以及kon(1/Ms)和koff(1/s)，选择了使用全局(完全)拟合的1:1模型。从分析中排除<0.05的反应值。400秒解离被用作分析所有抗体变体的感兴趣的窗口。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，除非不同地指出，否则全局(完全)拟合基于>3的浓度曲线拟合(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
对于食蟹猴FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII，在链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器(FortéBio，cat.no.18-5019)以及在样品稀释剂中稀释的蛋白适应(于30℃600秒)后，通过将SA生物传感器在样品稀释剂中温育100秒来进行最初的基线测量。接着，将标组氨酸的生物素化食蟹猴FcγRIIa(SinoBiological，cat.no.90015-C27H-B，1μg/ml)、FcγRIIb(Sino Biological，cat.no.90014-C27H-B，1μg/ml)或FcγRIII(ACROBiosystems，cat.no.FC6-C82E0，1μg/ml)固定在SA生物传感器上达80秒(FcγRIIa和FcγRIIb)或100秒(FcγRIII)。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，测定野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体的缔合(50秒，FcγRIIa或FcγRIIb；300秒，FcγRIII)和解离(1000秒)。使用许多浓度(FcγRIIa，156.25-10000nM，2-倍稀释；FcγRIIb，187.5-12000nM，2-倍稀释；FcγRIII，31.25-2000nM，2-倍稀释)测试抗体与食蟹猴FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的结合。使用数据分析软件v11.1(FortéBio)分析数据。简而言之，通过减去参考曲线(传感器上的FcγR，仅使用样品稀释剂的测量)来校正数据迹线，将y-轴与基线测量的最后10秒对齐，并应用步骤间校正。由于人IgG1和低亲和力食蟹猴Fcγ受体FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII之间的低亲和力，选择稳态分析(SSA)以测定KD(M)。简而言之，从分析中排除<0.05的反应值。使用数据分析软件的R-平衡(Req)函数计算不同抗体浓度的稳态反应(其中传感图在缔合相中达到平台)，接着将稳态反应针对抗体浓度绘图，且最后使用Langmuir模型以计算KD(M)。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，SSA基于>3的缔合曲线拟合，并且每个抗体浓度绘制的稳态反应达到平台，从而允许正确计算最大结合反应(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
使用生物层干涉量度学评估抗人CD20人IgG1抗体变体与食蟹猴FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的结合揭示野生型人IgG1显示出以对于FcγRIa为0.6nM、对于FcγRIIa为4.3μM、对于FcγRIIb为3.9μM以及对于FcγRIII为0.4μM的结合亲和力与所有测试的食蟹猴Fcγ受体结合(表20)。相比之下，在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的人IgG1抗体变体没有表现出与食蟹猴FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的结合(表20)。非激活变体IgG1-L234A-L235A-P329G没有表现出与低亲和力受体FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的结合。相比之下，虽然全局(完全)拟合分析不是最佳的(仅3个浓度曲线拟合)，但所述分析的确表明IgG1-L234A-L235A-P329G以约2.2μM的结合亲和力与高亲和力受体FcγRI的残留但大大减少(约1/3500)的结合(表20)。
总之，类似于以前描述的非激活Fc变体L234F-L235E-D265A，携带L234F-L235-G236R非激活突变的人IgG1抗体变体未显示食蟹猴FcγR结合。相比之下，未显示任何人或鼠FcγR结合的L234A-L235A-P329G的确显示与食蟹猴FcγRI而不是FcγRIIa、FcγRIIb或FcγRIII的残留结合。
表20：如通过生物层干涉量度学所测量的在重链恒定区中携带非激活突变的抗人CD20人IgG1抗体变体的食蟹猴FcγR结合亲和力。对于高亲和力受体FcγRI，KD(M)、kon(1/Ms)和koff(1/s)基于使用全局(完全)拟合的1:1模型显示。对于低亲和力受体FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII，基于稳态分析显示KD(M)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。测试的变体是IgG1、IgG1-FER、IgG1-FEA和IgG1-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，FEA:L234F-L235E-D265A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。SSA：稳态分析，BLI：生物层干涉量度学，nb：无结合，n/a：不适用。
1IgG1-LALAPG与FcγRI结合-非最佳的分析，对于全局(完全)拟合分析<4拟合实施例30：包括或排除C-末端赖氨酸的编码序列的基因序列对通过抗人CD20抗体及其在重链区中含有非激活突变的变体诱导依赖补体的细胞毒性的能力的影响
IgG抗体的基因序列编码重链C-末端的赖氨酸，所述赖氨酸(部分地)在培养基或循环中被羧肽酶从产生的IgG抗体切割掉(VandenBremer等人，MAbs；2015；7(4):672-80)，从而导致终产物疗法中潜在的异质性。此外，HC C-末端赖氨酸的存在已被表明消极地影响诱导CDC的能力。在此，评估了在重链恒定区中含有非激活L234F-L235E-D265A(FEA)或L234F-L235E-G236R(FER)突变的抗人CD20抗体诱导CDC的能力，比较了基于编码HC C-末端赖氨酸的基因序列的抗体变体和基于其中HC C-末端赖氨酸被重组缺失的基因序列的变体。理论上，C-末端赖氨酸可能在生产过程中或生产后从前一变体中切割掉。
基本上如实施例3中所述，用20％NHS作为补体来源在Raji细胞上进行体外CDC测定。简言之，在许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3-倍稀释)使用50,000个Raji细胞/孔测试了抗人CD20抗体IgG1-CD20或其在重链恒定区中携带非激活突变FEA或FER的变体。作为细胞裂解的量度的PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上测定。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对野生型IgG1-CD20抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据是从3次独立实验获得的平均值±SEM。
如图20中所示的，在基于含有或缺乏编码HC C-末端赖氨酸的核苷酸序列的基因序列产生的抗体变体之间没有观察到在Raji细胞上诱导CDC的能力中的差异。对于野生型IgG1-CD20抗体和含有FEA或FER非激活突变的变体两者都显示了这一点。
实施例31：具有HC C末端赖氨酸的重组缺失的抗人CD20抗体及其非激活变体通过Fcγ受体的激活和信号传导
实施例30评估了野生型抗人CD20 IgG1抗体及其非激活变体的重链(HC)C-末端赖氨酸的重组缺失(delK)对诱导或抑制CDC的诱导的能力的影响。在此，我们在使用表达靶的Raji细胞和表达所示FcγR的Jurkat报道细胞系的Promega报道测定中评估了通过如实施例30中所述的这些抗人CD20 IgG1抗体及其变体的人FcγR激活和信号传导。
按照实施例7中描述的程序，使用报道生物测定(Promega，FcγRIa:Cat#CS1781C01；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G988A；FcγRIIb:Cat#CS1781E01；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G701A)以表达CD20的Raji细胞作为靶细胞对通过实施例30中所示的抗人CD20 IgG1抗体变体的人FcγR-介导的信号传导的激活进行了定量。在进一步分析之前从所有样品减去如由仅仅培养基对照样品(无Raji细胞、无抗体、无效应细胞)所测定的背景发光信号。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照(仅Raji细胞和效应细胞)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。每个实验，相对于与非结合对照IgG1-b12(0％)温育的细胞观察到的报道分子活性和野生型IgG1(100％)的活性，将AUC值归一化。数据是来自两次独立重复实验的平均值±SEM。
使用Promega报道测定对人FcγR激活的评估揭示，在重组缺失了HC C-末端赖氨酸的变体(IgG1-delK)或在生产过程中或生产后切割掉所述C-末端赖氨酸的变体(IgG1；图21)之间在诱导FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活中没有差异。此外，非激活变体L234F-L235E-G236R(FER)和L234F-L235E-D265A(FEA)消除FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活的能力也不受影响(图21)。
总之，当与其中C-末端赖氨酸在生产过程中或生产后被切割掉的变体相比时，抗人IgG1-CD20抗体及其非激活变体的HC C-末端赖氨酸的重组缺失不影响这些抗体诱导CDC的能力或所述能力的缺乏。
实施例32：通过抗人CD20 IgG1抗体的同种异型变体及其非激活变体的依赖补体的细胞毒性在以前的实施例中，评估了属于同种异型IgG1(f)的抗人CD20 IgG1抗体变体诱导CDC的能力。这里，我们评估了抗人CD20 IgG1抗体的不同同种异型及其在重链(HC)恒定区中携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的变体的能力。
基本上如实施例3中所述，用20％NHS作为补体来源在Raji细胞上进行体外CDC测定。测试了抗人CD20 IgG1抗体变体的不同同种异型，包括IgG1(fa)、IgG1(zax)、IgG1(zav)、IgG1(za)和IgG1(f)。简言之，在许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3-倍稀释)使用50,000个Raji细胞/孔测试了抗人CD20 IgG1抗体的同种异型变体或其携带非激活突变的变体。作为细胞裂解的量度的PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上测定。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对野生型IgG1(f)-CD20抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据是从3次独立实验获得的平均值±SEM。
如图22中所示的，在野生型同种异型IgG1变体之间没有观察到在Raji细胞上诱导CDC的能力的差异。在引入FER或FEA非激活突变时，所有测试的同种异型诱导CDC的能力都大大降低，其中在所有测试的同种异型中，FER突变导致比FEA突变更强的CDC的抑制。
实施例33：具有不同IgG1同种异型恒定区的抗人CD20抗体及其非激活变体通过Fcγ受体的激活和信号传导
实施例32评估了在具有不同IgG1同种异型恒定区的抗人CD20抗体的重链(HC)中引入L234F-L235E-G236R非激活突变对诱导CDC的能力的影响。在此，我们在使用表达靶的Raji细胞和表达所示FcγR的Jurkat报道细胞系的Promega报道测定中评估了通过这些不同的IgG1同种异型抗人CD20抗体及其在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变的变体的人FcγR激活和信号传导。
按照实施例7中描述的程序，使用报道生物测定(Promega，FcγRIa:Cat#CS1781C01；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G988A；FcγRIIb:Cat#CS1781E01；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G701A)以表达CD20的Raji细胞作为靶细胞对通过实施例32中所示的抗人CD20抗体变体的人FcγR-介导的信号传导的激活进行了定量。在进一步分析之前从所有样品减去如由仅仅培养基对照样品(无Raji细胞、无抗体、无效应细胞)所测定的背景发光信号。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中使用对数变换的浓度以无抗体对照(仅Raji细胞和效应细胞)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。每个实验，相对于与非结合对照IgG1-b12(0％)温育的细胞观察到的报道分子活性和野生型IgG1(f)(100％)的活性，将AUC值归一化。数据是来自两次独立重复实验的平均值±SEM。
使用Promega报道测定对人FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活的评估揭示，尽管观察到一些变异，但测试的所有野生型抗人CD20 IgG1同种异型抗体变体均显示出有效的人FcγR激活(图23)。此外，在不同IgG1同种异型变体的重链恒定区中引入L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变有效地消除了FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活(图23)。
总之，非激活突变L234F-L235E-G236R有效地消除了通过具有不同IgG1同种异型恒定区的抗人CD20抗体变体的FcγR-介导的激活。
实施例34：IgG1、IgG3和IgG4抗人CD20抗体及其非激活变体的依赖补体的细胞毒性在此，我们评估了在抗人CD20 IgG1或IgG3抗体的HC中引入L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变时以及在抗人CD20 IgG4抗体(其在位置234天然具有苯丙氨酸(F))的HC中引入L235E-G236R或L235E-D265A非激活突变时诱导CDC的能力。
基本上如实施例3中所述，用20％NHS作为补体来源进行在Raji细胞上的体外CDC测定。将野生型抗人CD20 IgG1、IgG3(同种异型IGHG3*01和IGHG3*04[IgG3rch2])和IgG4抗体与其携带上文提及的非激活突变的变体进行比较。简言之，在许多浓度(0.014-10μg/mL终浓度；3-倍稀释)使用50,000个Raji细胞/孔测试了抗体变体。作为细胞裂解的量度的PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上测定。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对野生型IgG1-CD20抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据是从3次独立实验获得的平均值±SEM。
如图24A中所示的，野生型抗人CD20 IgG1抗体诱导比IgG3的两种野生型同种异型更强的CDC。非激活突变L234F-L235E-D265A和L234F-L235E-G236R的引入在IgG1和IgG3变体两者中都强烈抑制了诱导CDC的能力，其中对于携带L234F-L235E-G236R突变的变体观察到最强的CDC活性的抑制。野生型IgG4显示出非常低的诱导CDC的内在能力，其没有被L235E-G236R或L235E-D265A非激活突变的引入进一步抑制(图24B)。
总之，在IgG1和IgG3亚类的抗人CD20抗体中引入L234F-L235E-G236R非激活突变比L234F-L235E-D265A非激活突变更强烈地降低了诱导Raji细胞的CDC的能力。
实施例35：IgG1、IgG3和IgG4抗人CD20抗体及其非激活变体通过Fcγ受体的激活和信号传导在实施例34中，在IgG3的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A非激活突变时或在IgG4(其在位置234天然具有苯丙氨酸(F))的HC恒定区中引入L235E-G236R或L235E-D265A非激活突变时评估了由抗人CD20抗体诱导CDC的能力。在此，我们在使用表达靶的Raji细胞和表达所示FcγR的Jurkat报道细胞系的Promega报道测定中评估了通过抗人CD20 IgG1、IgG3和IgG4抗体及其在HC恒定区中携带非激活突变的变体的人FcγR激活和信号传导。
按照实施例7中描述的程序，使用报道生物测定(Promega，FcγRIa:Cat#CS1781C01；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G988A；FcγRIIb:Cat#CS1781E01；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G701A)以表达CD20的Raji细胞作为靶细胞对通过如实施例34中所示的抗人CD20抗体变体的人FcγR激活和信号传导进行了定量。在进一步分析之前从所有样品减去如由仅仅培养基对照样品(无Raji细胞、无抗体、无效应细胞)所测定的背景发光信号。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中使用对数变换的浓度以无抗体对照(仅Raji细胞和效应细胞)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。每个实验，相对于与非结合对照IgG1-b12(0％)温育的细胞观察到的报道分子活性和野生型IgG1(100％)的活性，将AUC值归一化。数据是来自两次独立重复实验的平均值±SEM。
使用Promega报道测定评估人FcγR-介导的激活揭示野生型人IgG1有效诱导FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活(图25)。当与IgG1相比时，通过野生型人IgG4的FcγR-介导的激活的评估揭示了增加的FcγRIa-和FcγRIIb-介导的激活(图25A、C)、减少的FcγRIIa-介导的激活(图25B)和缺乏FcγRIIIa-介导的激活(图25D)。通过人IgG3同种异型IGHG3*01(IgG3)野生型抗体变体的FcγR-介导的激活的评估揭示缺乏FcγRIIa-和FcγRIIb-介导的激活(图25B、C)以及仅仅较小的FcγRIa-和FcγRIIIa-介导的激活的诱导(图25A、D)。相比之下，当与通过人IgG3同种异型IGHG3*01的FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活相比时，人IgG3同种异型IGHG3*04(IgG3rch2)野生型抗体变体表现出增加的FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活，尽管FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa的FcγR-介导的激活的水平与野生型人IgG1相比仍然降低(图25)。通过抗人CD20 IgG1、IgG3或IgG4抗体变体的FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活的评估揭示在重链恒定区中L234F-L235E-G236R或L234F-L235E-D265A(IgG1、IgG3和IgG3rch2)的引入或L235E-G236R或L235E-D265A(IgG4)非激活突变的引入有效地消除了所有测试的FcγRs的激活(图25)。
总之，非激活突变L234F-L235E-G236R(或对于IgG4的L235E-G236R)有效地消除了通过抗人CD20抗体变体的FcγR-介导的激活，无论这些非激活突变被引入到IgG1、IgG3还是IgG4重链恒定区中。
实施例36：通过生物层干涉量度学测量的抗人CD20鼠IgG2a抗体及其非激活变体与人Fcγ受体的结合亲和力使用免疫缺陷小鼠的临床前异种移植模型经常用于确立使用肿瘤特异性抗体的治疗概念。然而，更复杂的治疗问题需要使用准确捕获治疗用抗体的生物学和功效的免疫活性小鼠。在这种情况下，需要替代小鼠抗体以允许抗体与鼠效应分子的天然相互作用。尽管在实施例27-29中评估了人IgG1抗体及其非激活变体与人、鼠和食蟹猴Fcγ受体的结合亲和力，但在此我们研究了在鼠IgG2a抗体的重链(HC)恒定区中引入非激活突变L234F-L235E-G236R是否阻止与人FcγRs的结合。这些变体与鼠FcγRs的结合亲和力将在实施例37中评估。
在此，我们在OctetHTX仪器(FortéBio)上使用生物层干涉量度学(BLI)评估了野生型鼠抗人CD20 IgG2a抗体及其携带L234A-L235A、L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G突变的非激活变体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的单体细胞外结构域(ECD)的结合亲和力，基本上如实施例27中所述的。简言之，对于人FcγRIa，在用人FcγRIa装载Ni-NTA传感器后，进行在样品稀释剂中的基线测量(100秒)。接着，测定野生型鼠抗人CD20 IgG2a抗体其非激活变体的缔合(300秒)和解离(1000秒)。使用1.56-100nM(对于野生型IgG2a；2-倍稀释)或15.6-1000nM(对于IgG2a-L234A-L235A、IgG2a-L234F-L235E-G236R和IgG2a-L234A-L235A-P329G；2-倍稀释)的浓度范围测试抗体与人FcγRIa的结合。如实施例27中所述分析数据，其中从分析中排除<0.05的反应值。400秒解离被用作分析除了IgG2a-L234A-L235A之外的所有抗体变体的感兴趣的窗口，对于IgG2a-L234A-L235A，50秒解离被用作感兴趣的窗口。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，除非不同地指出，否则全局(完全)拟合基于>3的曲线拟合(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
基本上如实施例27中所述进行与人FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合的评估。简而言之，在用人FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb或FcγRIIIa同种异型158V装载链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器后，进行在样品稀释剂中的基线测量(100秒)。接着，测定鼠抗人CD20抗体IgG2a野生型及其非激活变体的缔合(50秒，FcγRIIa或FcγRIIb；300秒，FcγRIIIa)和解离(1000秒)。使用许多浓度(FcγRIIa，156.25-10000nM，2-倍稀释；FcγRIIb，250-16000nM，2-倍稀释；FcγRIIIa，125-8000nM，2-倍稀释)测试抗体与FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合。如实施例27中所述分析数据。由于鼠IgG2a和低亲和力Fcγ受体FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V之间的低亲和力，选择稳态分析(SSA)以测定KD(M)。简而言之，从分析中排除<0.05的反应值。使用数据分析软件的R-平衡(Req)函数计算不同抗体浓度的稳态反应(其中传感图在缔合相中达到平台)，接着将稳态反应针对抗体浓度绘图，且最后使用Langmuir模型以计算KD(M)。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，除非不同地指出，否则SSA基于>3的缔合曲线拟合，并且每个抗体浓度绘制的稳态反应达到平台，从而允许正确计算最大结合反应(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
使用生物层干涉量度学评估鼠抗人CD20 IgG2a抗体变体与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合揭示野生型鼠IgG2a显示出以对于FcγRIa为1.27nM、对于FcγRIIa同种异型131H为1.85μM、对于FcγRIIb为17μM以及对于FcγRIIIa同种异型158V为1.95μM的结合亲和力与所有测试的人Fcγ受体结合(表21)。相比之下，在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G非激活突变的鼠IgG2a抗体变体没有表现出与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合(表21)。在重链恒定区中携带L234A-L235A非激活突变的鼠IgG2a未显示与人FcγRIIa同种异型131H和FcγRIIb的结合。分析表明IgG2a-L234A-L235A与人FcγRIa(KD＝3.6μM；基于仅3个浓度曲线拟合的全局(完全)拟合分析)和人FcγRIIIa同种异型158V(KD＝13.8μM；稳态反应没有达到平台)的低的残留结合(表21)。
总之，在鼠IgG2a抗体的重链恒定区中引入L234F-L235-G236R非激活突变阻止了与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合，类似于携带L234A-L235A-P329G非激活突变的鼠IgG2a抗体。
表21：如通过生物层干涉量度学所测量的在重链恒定区中携带非激活突变的鼠抗人CD20 IgG2a抗体变体的人FcγR结合亲和力。对于高亲和力受体FcγRIa，KD(M)、kon(1/Ms)和koff(1/s)基于使用全局(完全)拟合的1:1模型显示。对于低亲和力受体FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V，基于稳态分析显示KD(M)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。测试的变体是IgG2a、IgG2a-FER、IgG2a-LALA和IgG2a-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，LALA:L234A-L235A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。SSA：稳态分析，BLI：生物层干涉量度学，nb：无结合，n/a：不适用。
1IgG2a-LALA与FcγRIa结合-非最佳的分析，对于全局(完全)拟合分析<4拟合2IgG2a-LALA与FcγRIIIa(V)结合-非最佳的分析，稳态反应没有达到平台
实施例37：通过生物层干涉量度学测量的抗人CD20鼠IgG2a抗体及其非激活变体与鼠Fcγ受体的结合亲和力在实施例36中，评价了抗人CD20鼠IgG2a非激活抗体与人FcγRs的亲和力结合。在此，我们研究了在鼠IgG2a抗体的重链(HC)恒定区中引入非激活突变L234F-L235E-G236R是否阻止与鼠FcγRs的结合。
在Octet HTX仪器(FortéBio)上使用生物层干涉量度学(BLI)评估了实施例36中所述的鼠抗人CD20抗体与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的单体细胞外结构域(ECD)的结合亲和力，基本上如实施例28中所述的。简言之，对于鼠FcγRI，在用鼠FcγRI装载Ni-NTA传感器后，进行在样品稀释剂中的基线测量(100秒)。接着，测定野生型鼠抗人CD20IgG2a抗体及其携带L234A-L235A、L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G突变的非激活变体的缔合(300秒)和解离(1000秒)。使用1.56-100nM(对于野生型IgG2a；2-倍稀释)或15.6-1000nM(对于IgG2a-L234A-L235A、IgG2a-L234F-L235E-G236R和IgG2a-L234A-L235A-P329G；2-倍稀释)的浓度范围测试抗体与鼠FcγRI的结合。如实施例28中所述分析数据，其中从分析中排除<0.05的反应值。400秒解离被用作分析所有抗体变体的感兴趣的窗口。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，除非不同地指出，否则全局(完全)拟合基于>3的曲线拟合(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
基本上如实施例28中所述进行与鼠FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合亲和力的评估。简而言之，在用鼠FcγRIIb、FcγRIII或FcγRIV装载链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器后，进行在样品稀释剂中的基线测量(100秒)。接着，测定野生型鼠抗人CD20 IgG2a抗体及其携带L234A-L235A、L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G突变的非激活变体的缔合(50秒，FcγRIIb或FcγRIII；300秒，FcγRIV)和解离(1000秒)。使用许多浓度(FcγRIIb，187.5-12,000nM，2-倍稀释；FcγRIII，156.25-10,000nM，2-倍稀释；FcγRIV，对于IgG2a、IgG2a-L234F-L235E-G236R和IgG2a-L234A-L235A-P329G为15.63-1,000nM或对于IgG2a-L234A-L235A为156.3-10,000nM，2-倍稀释)测试抗体与鼠FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合。如实施例28中所述分析数据。由于鼠IgG2a和低亲和力Fcγ受体FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV之间的低亲和力，选择稳态分析(SSA)以测定KD(M)。简而言之，从分析中排除<0.05的反应值。使用数据分析软件的R-平衡(Req)函数计算不同抗体浓度的稳态反应(其中传感图在缔合相中达到平台)，接着将稳态反应针对抗体浓度绘图，且最后使用Langmuir模型以计算KD(M)。通过>0.98的完全R2值确定最佳拟合，从而表明拟合和实验数据显著相关。此外，除非不同地指出，否则SSA基于>3的缔合曲线拟合，并且每个抗体浓度绘制的稳态反应达到平台，从而允许正确计算最大结合反应(可靠的分析)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。
使用生物层干涉量度学评估鼠抗人CD20 IgG2a抗体变体与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合揭示野生型鼠IgG2a显示出以大约对于FcγRI为3.8nM、对于FcγRIIb为6.4μM、对于FcγRIII为6.9μM以及对于FcγRIV为0.15μM的结合亲和力与所有测试的鼠Fcγ受体结合(表22)。相比之下，在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R或L234A-L235A-P329G非激活突变的鼠IgG2a抗体变体没有表现出与鼠FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV的结合(表22)。此外，与野生型IgG2a相比，IgG2a-L234F-L235E-G236R或IgG2a-L234A-L235A-P329G与鼠FcγRI的结合亲和力大大降低(1/100)，尽管分析不是最佳的(对于全局(完全)拟合分析<4拟合)(表22)。鼠IgG2a-L234A-L235A不显示与鼠FcγRIIb和FcγRIII的结合，但的确显示对鼠FcγRI(与wt IgG2a相比减少到1/100-1/150)和FcγRIV(与wtIgG2a相比减少到1/100)的低残留结合(表22)。
总之，携带L234F-L235-G236R非激活突变的鼠IgG2a抗体变体表现出没有(FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV)或大大降低的(FcγRI)鼠FcγR结合，类似于携带L234A-L235A-P329G非激活突变的鼠IgG2a抗体。
表22：如通过生物层干涉量度学所测量的在重链恒定区中携带非激活突变的鼠抗人CD20 IgG2a抗体变体的鼠FcγR结合亲和力。对于高亲和力受体FcγRI，KD(M)、kon(1/Ms)和koff(1/s)基于使用全局(完全)拟合的1:1模型显示。对于低亲和力受体FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV，基于稳态分析显示KD(M)。显示的数据是2次独立重复实验的平均值±SD。测试的变体是IgG2a、IgG2a-FER、IgG2a-LALA和IgG2a-LALAPG，其中FER:L234F-L235E-G236R，LALA:L234A-L235A，以及LALAPG:L234A-L235A-P329G。SSA：稳态分析，BLI：生物层干涉量度学，nb：无结合，n/a：不适用。
1IgG2a-FER&-LALAPG与FcγRI结合-非最佳的分析，对于全局(完全)拟合分析<4拟合
2IgG2a-LALA与FcγRIV结合-非最佳的分析，稳态反应没有达到平台
实施例38：抗人CD20鼠IgG2a抗体及其非激活变体通过人Fcγ受体的激活和信号传导实施例36表明，如通过生物层干涉量度学所测量的，在鼠IgG2a抗体的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R非激活突变有效地阻止了与人FcγRIa、FcγRIIa同种异型131H、FcγRIIb和FcγRIIIa同种异型158V的结合。然而，在这种测定中，不存在抗原结合、靶介导的抗体簇集和后来的靶介导的Fc-受体的簇集对效应细胞的影响。在此，我们在使用表达靶的Raji细胞和表达所示FcγR的Jurkat报道细胞系的Promega报道测定中评估了通过野生型抗人CD20鼠IgG2a抗体及其在重链恒定区中携带L234F-L235E-G236R、L234A-L235A或L234A-L235A-P329G非激活突变的变体的人FcγR激活和信号传导。
按照实施例7中描述的程序，使用报道生物测定Promega，FcγRIa:Cat#CS1781C01；FcγRIIa同种异型131H:Cat#G988A；FcγRIIb:Cat#CS1781E01；FcγRIIIa同种异型158V:Cat#G701A)以表达CD20的Raji细胞作为靶细胞对通过上文提及的鼠IgG2a抗人CD20抗体变体的人FcγR-介导的信号传导的激活进行了定量。在进一步分析之前从所有样品减去如由仅仅培养基对照样品(无Raji细胞、无抗体、无效应细胞)所测定的背景发光信号。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPadSoftware)中使用对数变换的浓度以无抗体对照(仅Raji细胞和效应细胞)作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)。每个实验，相对于与非结合对照IgG2a-b12(0％)温育的细胞观察到的报道分子活性和野生型IgG2a-CD20(100％)的活性，将AUC值归一化。数据是来自两次独立重复实验的平均值±SEM。
使用Promega报道测定对人FcγRIa-、FcγRIIa-、FcγRIIb-和FcγRIIIa-介导的激活的评估揭示，在鼠IgG2a抗体的重链恒定区中引入L234F-L235E-G236R非激活突变有效抑制FcγR-介导的激活，类似于IgG2a非激活变体L234A-L235A-P329G(图26)。除了通过FcγRIa介导的部分激活(图26A)之外，对于IgG2a-L234A-L235A也观察到缺乏FcγR-介导的激活(图26B-D)，这与如通过生物层干涉量度学所测量的对于IgG2a-L234A-L235A观察到的与人FcγRIa的低残留结合一致(实施例36)。
总之，类似于非激活抗体变体IgG2a-L234A-L235A-P329G，在抗人CD20鼠IgG2a抗体的重链恒定区中引入L234F-L235E-G236R非激活突变有效地消除了人FcγR-介导的激活。
实施例39：抗人CD20鼠IgG2a抗体及其非激活变体的C1q结合和依赖补体的细胞毒性在以前的实施例中，显示在抗人CD20人IgG1抗体的重链(HC)恒定区中引入L234F-L235E-G236R(FER)非激活突变导致与补体因子C1q接合的能力以及诱导CDC的能力的几乎完全消除。这里，评估了野生型抗人CD20鼠IgG2a抗体及其在HC中携带FER、L234A-L235A或L234A-L235A-P329G突变的非激活变体结合人补体因子C1q的能力以及诱导CDC的能力。
如上所述的野生型抗人CD20鼠IgG2a抗体及其在HC中携带非激活突变的变体基本上按照实施例4中描述的程序，用20％正常人血清(NHS，cat.no.M0008，Sanquin)作为C1q来源，在Raji细胞(3x104个细胞/孔)上使用许多浓度(0.0024-10μg/mL终浓度；4-倍稀释)在C1q结合测定中进行测试。C1q与抗体变体的结合通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上通过测量中值荧光强度-FITC来检测。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPadPRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的剂量反应曲线下面积(AUC)，继之以每个实验重复实验相对于对非结合对照抗体IgG2a-b12(0％)测量的AUC值和对野生型抗人CD20 IgG2a抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立实验获得的平均值±SEM。
在体外CDC测定中测试了在C1q结合测定中测试的相同抗体变体。基本上如实施例3中进一步描述的，使用每孔3x104个Raji细胞以许多浓度(0.0024-10μg/mL终浓度；4-倍稀释)测试抗体变体。PI-阳性细胞的数目通过流式细胞术在IntellicytiQue筛分机(Sartorius)上测定。对应于细胞裂解的百分比的PI-阳性细胞的百分比计算为(PI-阳性细胞数/细胞总数)x100％。使用非线性激动剂剂量反应模型分析数据，并在GraphPad PRISM(版本8.4.1，GraphPad Software)中使用对数变换的浓度以无抗体对照作为基线计算每个实验重复实验的AUC，继之以每个实验重复实验相对于对非结合对照抗体IgG2a-b12(0％)测量的AUC值和对野生型抗人CD20 IgG2a抗体变体(100％)测量的AUC值的归一化。数据是从三次独立实验获得的平均值±SEM。
对C1q与鼠IgG2a-CD20变体的结合的评估揭示野生型IgG2a-CD20在与靶Raji细胞上的CD20结合时有效地与补体蛋白C1q接合(图27)。在HC中携带L234A-L235A-P329G突变的非激活变体有效地消除了与补体蛋白C1q的结合(图27)。然而，在鼠IgG2a抗体的HC中引入L234F-L235E-G236R或L234A-L235A非激活突变时，观察到减少的但残留的与C1q的结合(图27)。
对相同IgG2a-CD20变体的CDC-诱导能力的评估揭示了与C1q结合的结果一致的结果。在鼠IgG2a抗体的HC中引入非激活L234A-L235A-P329G突变导致诱导CDC的能力的几乎完全消除(图28)。此外，在鼠IgG2a抗体的HC中引入L234F-L235E-G236R或L234A-L235A非激活突变导致CDC减少，然而，仍然观察到残留的CDC(图28)。
总之，在鼠IgG2a抗体中引入非激活突变L234F-L235E-G236R导致与补体因子C1q接合的能力以及诱导CDC的能力减少但没有完全抑制。因此得出的结论是，FER非激活突变的引入降低了人和鼠IgG抗体两者的与人C1q接合并诱导CDC的能力。
序列表
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<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 1
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 2
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FER
<400> 2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FEA
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 6
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 7
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 8
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 8
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 9
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F405L
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K409R
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FERL
<400> 11
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 12
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FERR
<400> 12
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 13
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FEAL
<400> 13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 14
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FEAR
<400> 14
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 15
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 15
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Pro Gly Ser Ser Ser His His His His His His Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His
305 310 315 320
Glu
<210> 16
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 16
Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu Trp Leu
1 5 10 15
Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ser Gln
20 25 30
Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile
35 40 45
Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg
50 55 60
Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile
65 70 75 80
Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp
85 90 95
Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro
100 105 110
Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His
115 120 125
Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp
130 135 140
Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser
145 150 155 160
Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn
165 170 175
His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr
180 185 190
Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met
195 200 205
Gly Ser Ser Ser Pro Val Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu
210 215 220
Pro Pro Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys
225 230 235 240
Gln Gly Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala
260 265 270
Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser
275 280 285
Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu
290 295 300
Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg
305 310 315 320
Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln
325 330 335
Asn Gly Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile
340 345 350
Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn
355 360 365
Ile Gly Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
370 375 380
Val Pro Ser Met Gly Pro Gly Ser Ser Ser His His His His His His
385 390 395 400
Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
405 410 415
His Glu
<210> 17
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 17
Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile
20 25 30
Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile
50 55 60
Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp
65 70 75 80
Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro
85 90 95
Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His
100 105 110
Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp
115 120 125
Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser
130 135 140
Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn
145 150 155 160
His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr
165 170 175
Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu
195 200 205
Pro Pro Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys
210 215 220
Gln Gly Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn
225 230 235 240
Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala
245 250 255
Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser
260 265 270
Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu
275 280 285
Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg
290 295 300
Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln
305 310 315 320
Asn Gly Lys Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile
325 330 335
Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn
340 345 350
Ile Gly Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
355 360 365
Val Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Ser His His His
370 375 380
His His His Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
385 390 395 400
Ile Glu Trp His Glu
405
<210> 18
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 18
Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile
20 25 30
Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile
50 55 60
Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp
65 70 75 80
Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro
85 90 95
Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His
100 105 110
Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp
115 120 125
Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser
130 135 140
Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn
145 150 155 160
His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr
165 170 175
Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Pro Met Gly Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu
195 200 205
Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys
210 215 220
Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn
225 230 235 240
Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala
245 250 255
Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser
260 265 270
Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu
275 280 285
Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg
290 295 300
Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln
305 310 315 320
Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile
325 330 335
Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn
340 345 350
Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
355 360 365
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Pro Gly Ser Ser Ser His His His
370 375 380
His His His Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
385 390 395 400
Ile Glu Trp His Glu
405
<210> 19
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 19
Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Ser
1 5 10 15
Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr
20 25 30
Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr
35 40 45
Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp
65 70 75 80
Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro
85 90 95
Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg
100 105 110
Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp
115 120 125
Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly
130 135 140
Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe Gly Ser Lys
165 170 175
Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Pro Ser
180 185 190
Met Gly Ser Ser Ser Pro Ser Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe
195 200 205
Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu
210 215 220
Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe
225 230 235 240
His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp
245 250 255
Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu
260 265 270
Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu
275 280 285
Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His
290 295 300
Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe
325 330 335
Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg
340 345 350
Gly Leu Phe Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr
355 360 365
Ile Thr Gln Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Gly Pro Gly Ser
370 375 380
Ser Ser His His His His His His Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile
385 390 395 400
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
405 410
<210> 20
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 20
Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Ser
1 5 10 15
Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr
20 25 30
Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr
35 40 45
Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp
65 70 75 80
Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro
85 90 95
Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg
100 105 110
Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp
115 120 125
Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly
130 135 140
Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys
165 170 175
Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Pro Ser
180 185 190
Met Gly Ser Ser Ser Pro Ser Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe
195 200 205
Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu
210 215 220
Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe
225 230 235 240
His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp
245 250 255
Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu
260 265 270
Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu
275 280 285
Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His
290 295 300
Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe
325 330 335
Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg
340 345 350
Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr
355 360 365
Ile Thr Gln Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Gly Pro Gly Ser
370 375 380
Ser Ser His His His His His His Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile
385 390 395 400
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
405 410
<210> 21
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C-末端组氨酸标签的细胞外结构域FcGR
<400> 21
Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp
35 40 45
Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val
65 70 75 80
Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr
100 105 110
Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val
115 120 125
Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp
130 135 140
Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile
145 150 155 160
Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr
165 170 175
Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg
180 185 190
Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys
195 200 205
Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe
210 215 220
Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His
260 265 270
Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val
275 280 285
Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Pro Gly Ser Ser Ser His His
290 295 300
His His His His Pro Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
305 310 315 320
Lys Ile Glu Trp His Glu
325
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β2微球蛋白
<400> 22
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER 取代的人IgG1同种异型G1m(fa)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA 取代的人IgG1同种异型G1m(fa)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER 取代的人IgG1同种异型G1m(za)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA 取代的人IgG1同种异型G1m(za)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 31
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER 取代的人IgG1同种异型G1m(zav)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA 取代的人IgG1同种异型G1m(zav)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER 取代的人IgG1同种异型G1m(zax)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 34
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA 取代的人IgG1同种异型G1m(zax)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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195 200 205
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 35
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有K447的缺失的人IgG1同种异型G1m(f)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 36
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有K447的缺失且具有FER取代的人IgG1同种异型G1m(f)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 37
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有K447的缺失且具有FEA取代的人IgG1同种异型G1m(f)的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 38
<211> 330
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 38
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val Leu Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER取代的鼠IgG2a的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 39
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val Leu Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 41
<211> 347
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 42
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER取代的IgG3同种异型IGHG3*01的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 43
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA取代的IgG3同种异型IGHG3*01的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 44
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FER取代的IgG3同种异型IGHG3*04的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 45
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEA取代的IgG3同种异型IGHG3*04的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 46
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 47
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L235E-G236R取代的人IgG4的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 48
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L235E-D265A取代的人IgG4的恒定区的CH1、铰链、CH2和CH3区
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 49
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105

Claims (39)

1.包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一和第二多肽各自分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，其中所述第一和第二多肽的至少一个被修饰并包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的氨基酸的取代，其中氨基酸位置为如通过Eu编号所定义的。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽的至少一个中的位置L234、L235和G236处的所述氨基酸分别被F、E和R取代。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽之一包含对应于位置L234、L235和G236处的氨基酸的所述氨基酸取代，并且另一个被修饰并且包含对应于位置L234、L235和D265处的氨基酸的氨基酸的取代，其中优选地，所述取代分别是F、E和A。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽两者均包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸的取代。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽的每一个都包含免疫球蛋白CH1区域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含第一和第二结合区。
7.根据权利要求6所述的蛋白，其中所述第一和第二结合区分别包含第一免疫球蛋白重链可变区和第一免疫球蛋白轻链可变区，并且其中所述第二结合区包含第二免疫球蛋白重链可变区和第二免疫球蛋白轻链可变区。
8.根据权利要求7所述的蛋白，其中所述免疫球蛋白重链和轻链可变区是人或人源化免疫球蛋白重链和轻链可变区。
9.根据权利要求7或8所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽是免疫球蛋白重链，且其中所述第一和第二多肽包含所述相应的第一和第二免疫球蛋白重链可变区。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含第一免疫球蛋白轻链恒定区和第二免疫球蛋白轻链恒定区。
11.根据权利要求10所述的蛋白，其中所述蛋白包含第一和第二免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含所述相应的第一和第二免疫球蛋白轻链可变区以及所述相应的第一和第二免疫球蛋白恒定轻链区。
12.根据权利要求11所述的蛋白，其中所述第一免疫球蛋白轻链经由二硫键与所述第一免疫球蛋白重链连接，且所述第二免疫球蛋白轻链经由二硫键与所述第二免疫球蛋白重链连接，从而分别形成所述第一结合区和所述第二结合区，并且其中所述第一和第二免疫球蛋白重链经由二硫键连接。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的蛋白，其是抗体。
14.根据权利要求4-12中任一项所述的蛋白，其是单特异性抗体。
15.根据权利要求4-14所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽具体相同的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的蛋白，其中所述第一和第二多肽包含进一步的氨基酸取代，优选选自T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的氨基酸的取代，例如F405L或K409R。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的蛋白，其中所述单特异性抗体结合选自细胞靶、细胞因子、毒素、病原体、癌抗原、血浆蛋白的抗原。
18.根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是双特异性抗体。
19.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽在所述各自的CH2和CH3区中包含进一步的取代，从而使得来自所述第一和第二多肽的各自的CH2和CH3区的序列是不同的，所述取代允许获得包含所述第一和第二多肽的所述多肽。
20.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其中在所述第一多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二多肽中，在对应于选自人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，且其中所述第一和所述第二多肽的所述取代不在相同位置。
21.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其中在所述第一多肽中对应于F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二多肽中对应于K409的位置中的氨基酸是R，或反之亦然。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在所述第一和第二多肽两者中具有修饰，其由下述组成：在所述第一多肽中用F、E和R取代位置L234、L235和G236处的氨基酸和用L取代位置F405处的氨基酸，以及在所述第二多肽中K409处用R取代，或反之亦然。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽具有由如权利要求1-4和19-22中任一项所定义的取代组成的取代。
24.根据权利要求1-17中任一项所述的蛋白或根据权利要求18-23中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包含在所述第一和第二多肽中的所述氨基酸序列具有如权利要求1-4和18-22中所定义的氨基酸取代。
25.根据权利要求24所述的蛋白或双特异性抗体，其中所述根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列不包含末端赖氨酸。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合区之一结合癌抗原。
27.根据权利要求18-25中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合区之一结合效应细胞，例如T-细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
28.根据权利要求18-25中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合区之一结合效应细胞，例如T-细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞，且另一个结合区结合癌抗原。
29.编码如权利要求4-17和24-25中任一项所定义的所述第一或第二多肽的核酸，其中所述第一或第二多肽包含对应于氨基酸L234、L235和G236的所述氨基酸的取代，优选其中所述位置L234、L235和G236的取代分别为由F、E和R。
30.根据权利要求29所述的核酸，其中所述第一或第二多肽是免疫球蛋白重链。
31.包含根据权利要求29或30所述的核酸的宿主细胞。
32.包含根据权利要求1-17中任一项所述的蛋白或根据权利要求18-28中任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
33.根据权利要求1-17中任一项所述的蛋白、或根据权利要求18-28中任一项所述的双特异性抗体、或根据权利要求32所述的药物组合物，其供治疗疾病之用。
34.根据权利要求33所述的供使用的蛋白、双特异性抗体或药物组合物，其中所述用途包括治疗癌症、传染病或自身免疫性疾病。
35.治疗方法，其包括将根据权利要求1-17中任一项所述的蛋白、或根据权利要求18-28中任一项所述的双特异性抗体、或根据权利要求32所述的药物组合物施用于主体。
36.根据权利要求35所述的治疗方法，其中所述主体患有疾病，例如癌症、传染病或自身免疫性疾病。
37.制备双特异性抗体的方法，包括：
f)提供第一抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
g)提供第二抗体，其包含
a.免疫球蛋白重链，其分别包含人IgG1免疫球蛋白重链的至少铰链区、CH2区和CH3区，包含在下述的氨基酸的取代
-位置L234、L235和D265，其中优选地，所述取代分别是F、E和A，
或者，
-包含分别用F、E和R在位置L234、L235和G236处的氨基酸的取代，
b.免疫球蛋白轻链；
h)其中所述各自的第一和第二抗体的所述第一和第二CH3区的序列不同，并且是这样的，从而使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的同二聚体相互作用中的每一个；
i)在足以允许铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和
j)获得包含所述第一抗体的所述第一免疫球蛋白重链和所述第一免疫球蛋白轻链以及所述第二抗体的所述第二免疫球蛋白重链和所述第二免疫球蛋白轻链的所述双特异性抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在步骤c)中，所述序列中的不同与权利要求19-25中任一项一致。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其用于制备如权利要求18-28中任一项所定义的双特异性抗体。
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