JP2024511346A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ ｍｒｎａドメインワクチンの治療的使用 - Google Patents

Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ ｍｒｎａドメインワクチンの治療的使用 Download PDF

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Abstract

コロナウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、ならびにこれらのワクチンを使用する方法、及びこれらのワクチンを含む組成物が本開示に記載される。これらのＲＮＡワクチンは、コロナウイルスのドメイン及びサブユニットをコードする。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０２１年３月１５日に出願された米国仮出願第６３／１６１，４２９号、及び２０２１年１１月１８日に出願された米国仮出願第６３／２８１，０２１号の利益を主張しており、当該仮出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提出した配列表の援用
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出した配列表を含んでおり、及び、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年３月１４日に作成したものであり、名称が、Ｍ１３７８７０１７５ＷＯ００－ＳＥＱ－ＪＸＶであり、４３２，６２２バイトの大きさである。
ヒトコロナウイルスは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の伝染性の高いエンベロープを持ったプラス鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の２つの亜科は、ヒトの疾患を引き起こすことが公知である。最も重要なのはβ－コロナウイルス（ベータコロナウイルス）である。いくつかの従前の公知のβ－コロナウイルスは、軽度から中等度の上気道感染症の一般的な病因である。しかし、近年、ＳＡＲＳやＭＥＲＳなど、より致命的なコロナウイルスが相次いで発生している。最新の新規コロナウイルスは、２０１９年１２月に中国の武漢市で最初に確認され、高い死亡率と関連している。この最近同定されたコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と呼ばれ（元は「２０１９新型コロナウイルス」または「２０１９－ｎＣｏＶ」と呼ばれていた）、何百万人もの人々に急速に感染し、世界的大流行を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが引き起こすパンデミック疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってＣＯＶＩＤ－１９（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（武漢－Ｈｕ－１；ＵＳＡーＷＡ１／２０２０分離株）の最初のゲノム配列は、２０２０年１月１０日に、北京の中国ＣＤＣの研究者により、ウイルス分子の進化及び疫学の分析及び解釈のための英国を拠点とするディスカッションフォーラムであるＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌでリリースされた。その後、この配列は、２０２０年１月１２日に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．１でＧｅｎＢａｎｋに寄託された。
最初の治療法とワクチンは、中国の武漢で最初に配列決定された初期株に基づいていた。しかし、パンデミックの間、ウイルスの進化が衰えることはなく、ワクチンは、パンデミックによって変化する性質に対応するために進化させないといけない。現在、ＣＯＶＩＤ－１９の特定の治療法またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するワクチンはない。コロナウイルス感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックに関連する継続的な健康問題及び死亡率は、国際的に大きな懸念事項である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされた公衆衛生危機は、これらのウイルスに対する効果的で安全なワクチン候補を迅速に開発することの重要性を強調している。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して強力な中和抗体応答を誘発し得る高度に免疫原性の抗原（複数可）をコードする１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む組成物（例えば、ワクチン）の治療用量を投与する方法である。本明細書に記載のｍＲＮＡ分子を使用して、天然ウイルスによる感染から人を保護するか、及び／または感染した場合の症状を軽減する、免疫原性組成物またはワクチンとして、個々にまたは組み合わせて使用される場合、防御免疫を誘導するのに効果的である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の重要な中和ドメインを発現する。
公知のベータコロナウイルスのエンベロープＳタンパク質は、ウイルスの宿主指向性及び宿主細胞への侵入を決定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に重要である。Ｓタンパク質の構成は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ－ＣｏＶ、及びＮＬ６３－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス間で類似しており、それぞれが、付着及び膜融合を媒介する２つのサブユニットＳ１及びＳ２を含む。Ｓ１サブユニットには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が含まれる。
サブユニット抗原の発現は、免疫応答を、他の関連するウイルスと共有される抗原の他のドメインに特異的なメモリーＢ及びＴ細胞の刺激を最小限に抑えつつ、特定のサブユニットに対して焦点を合わせる。
さらに、ＮＴＤ及びＲＢＤの両方とも、ウイルス活性を中和する抗体の結合部位であることが公知である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合のＲＢＤは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合するスパイクタンパク質の受容体結合部位である。ＮＴＤは、その機能が完全には理解されていないが、糖部分を結合すること、及びスパイクタンパク質の融合前から融合後の高次構造への高次構造変化を促進することに、役割を果たしているようである。とにかく、ＮＴＤドメイン及びＲＢＤドメインの両方とも、高結合抗体及び中和抗体力価を誘導する。
したがって、本開示のいくつかの態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも２つのドメイン、及び全長未満のスパイクタンパク質を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む、治療用量の組成物を、ヒト対象に投与する方法を提供するものであって、当該ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にある。
いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の２．５μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の５μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の３０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の１０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の１０μｇ～３０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の１０μｇ～２０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の少なくとも１０μｇかつ２５μｇ未満である。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の５μｇ～３０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満である。いくつかの実施形態において、治療用量は、組成物の１００μｇである。いくつかの実施形態において、当該方法は、組成物の少なくとも２つの用量（例えば、１０μｇ用量を２つ、３０μｇ用量を２つ）を、対象に対して投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物の第１の用量が対象に投与されてから少なくとも２８日後かつ第１の用量の１年以内に、対象に対して組成物の第２の用量を投与する。
いくつかの実施形態において、組成物は、トリス緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、トリス緩衝剤は、スクロース、及び酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、７５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬスクロース、及び５ｍＭ～１５ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭ～３０ｍＭトリス緩衝剤を含み、任意選択で、組成物のｐＨは、６～８である。いくつかの実施形態において、組成物は、８７ｍｇ／ｍＬスクロース、及び１０．７ｍＭ酢酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝剤を含み、任意選択で、組成物のｐＨは、７．５である。
いくつかの実施形態において、組成物は、０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、筋肉内、任意選択で、対象の腕の三角筋に投与される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９２の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号９１の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号９０の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は：イオン化可能なアミノ脂質、中性脂質、ステロール、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％ステロール、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は：４７ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１０．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び、２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１０ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、または５１ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、イオン化可能なアミノ脂質は、ヘプタデカン－９－イル８（（２ヒドロキシエチル）（６－オキソ６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）である。いくつかの実施形態において、中和脂質は、１，２－ジステアロイルｓｎグリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態において、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）を有する１－モノメトキシポリエチレングリコール－２，３－ジミリスチルグリセロールである。
いくつかの実施形態において、対象の年齢は、１８～５４歳、または５５歳以上である。いくつかの実施形態において、対象は、免疫不全症である。いくつかの実施形態では、対象は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息などの慢性肺疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、肥満、心疾患、糖尿病、及び肺疾患から任意選択で選択される基礎併存疾患を有する。
本開示のいくつかの態様は、脂質ナノ粒子内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメインをコードする用量のｍＲＮＡを含む組成物を提供するものであって、当該用量は、少なくも５μｇ、かつ、２０μｇ未満である。いくつかの実施形態において、用量は１０μｇである。
本開示のいくつかの態様は、脂質ナノ粒子内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメインをコードする３０μｇ用量のｍＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む。
本開示のいくつかの態様は、治療用量の本明細書に記載の組成物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメインに対する免疫応答を生成する有効量で、ヒト対象に対して投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、２回投与後の少なくとも４５日目、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、少なくとも１，０００である。いくつかの実施形態において、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価のＧＭＴは、２回投与後の少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日後では、少なくとも１１０である。
いくつかの実施形態では、二重プロリン安定化変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを投与した第２の対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導される中和抗体力価と比較して、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均比（ＧＭＲ）は、２回投与後の少なくとも４５日目、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、少なくとも１．０５である。
いくつかの実施形態では、組成物の投与前の対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）は、２回投与後の少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、少なくとも９０である。いくつかの実施形態では、組成物の投与前の対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価と比較して、２回投与して少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日後の対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価のＧＭＦＲでは、少なくとも８である。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の記述で説明される。本発明の他の特徴及び利点は、以下の図面、及びいくつかの実施形態の詳細な説明、ならびにまた添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
本発明のｍＲＮＡによってコードされる野生型及び２Ｐスパイクタンパク質抗原の概略図；シグナルペプチド（ＳＰ）、塗りつぶしなし、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、点線；受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、下向きの斜めの縞模様；サブドメイン１（ＳＤ１）、横縞；サブドメイン２（ＳＤ２）、ウェーブ；融合ペプチド（ＦＰ）、上向きの斜めの縞模様；ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ウィーブ；ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）斜めレンガ模様；（ＴＭ）、縦縞；及び細胞質テール（ＣＴ）、レンガ模様。 ｍＲＮＡ－１２８３（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメインを含む第１のドメインと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む第２のドメインとを含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ；配列番号９０；ＯＲＦ配列番号９１；コード配列番号９２）（２回投与）が、ｍＲＮＡ－１２７３（配列番号１２３；ＯＲＦ配列番号１２４；コード配列番号１２５）と比較して、全ての用量レベルで、典型的偽ウイルス中和抗体と匹敵するレベルを誘発していることを示すデータ。 ｍＲＮＡ－１２８３（２回投与）が、１２７３と比較して、全ての用量レベルで、Ｂ．１．３５１中和抗体と匹敵するレベルを誘発していることを示すデータ。 ｍＲＮＡ－１２８３（２回投与）が、１２７３と比較して、全ての用量レベルで、野生型スパイク結合抗体と匹敵するレベルを誘発していることを示すデータ。 ｍＲＮＡ－１２８３（２回投与）が、１２７３と比較して、全ての用量レベルで、野生型ＲＢＤ結合抗体と匹敵するレベルを誘発していることを示すデータ。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、罹患率と死亡率が高い、新たに出現した呼吸器ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年に出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び２０１２年に出現した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と比較して、世界中に急速に伝播している。世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によると、２０２１年３月の時点で、ＣＯＶＩＤ－１９の現在のアウトブレイクにより、世界中で約１億２０００万人の確定症例が発生し、２６５万人超が死亡している。ＣＯＶＩＤ－１９感染の新しい症例は増加しており、依然として急速に増加している。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を予防及び治療し、ＣＯＶＩＤ－１９が世界中に及ぼす深刻な影響を軽減するために、さまざまな安全かつ効果的なワクチン及び薬物を開発することが重要である。さまざまなモダリティを使用して製造されたワクチンと薬物、及び安全性と有効性が改善されたワクチンが不可欠である。コロナウイルス疾患（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチン及び治療薬の高度な設計及び開発を加速する必要が残っている。
２０２０年１月７日、中国湖北省武漢市で２０１９年１２月に発生した新規肺炎の病因として、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が特定された（Ｌｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．Ａｐｒ；９２（４）：４０１－４０２．）。その後まもなく、このウイルスは中国でアウトブレイクを引き起こし、世界中に伝播した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム構造の分析によれば、それはβ－コロナウイルス（ＣｏＶ）に属している（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．；９（１）：２２１－２３６）。
コロナウイルスの表面にある重要なタンパク質は、スパイクタンパク質である。多種多様なｍＲＮＡ構築物が設計されており、本明細書に開示されている。スパイク抗原をコードするｍＲＮＡを適切な送達ビヒクルに製剤化すると、そのサブユニット及びドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力な免疫応答を誘導し得るので、効果的かつ強力なｍＲＮＡワクチンが生成される。さまざまなスパイクタンパク質抗原、特にスパイクタンパク質サブユニット及びドメイン抗原をコードするｍＲＮＡの投与は、免疫組織及び免疫系の細胞へのｍＲＮＡの送達をもたらし、そこでｍＲＮＡは迅速にタンパク質抗原に翻訳される。次に、他の免疫細胞、例えばＢ細胞及びＴ細胞が認識してマウントし得、免疫応答が、コードされたタンパク質に対する免疫応答を発生させ、最終的にコロナウイルスに対する長期的な防御応答を生み出し得る。免疫原性の低さ、免疫系への不十分な提示または抗原の誤った折り畳みに起因するタンパク質ワクチン開発の欠点は、本明細書に開示されるスパイクタンパク質、サブユニット及びそのドメインをコードする非常に効果的なｍＲＮＡワクチンの使用によって回避される。
本開示は、コロナウイルス抗原に対する強力な中和抗体を誘発する組成物（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、またはそれ以上）のコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、スパイクタンパク質ドメイン、例えば、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、またはＲＢＤとＮＴＤとの組合せをコードする。
本開示は、かつては場合によっては治療量以下であると考えられていた低用量でコロナウイルス抗原に対して強力な中和抗体を誘発するワクチン組成物及びワクチン接種方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも２つのドメイン、及び全長未満のスパイクタンパク質を含む融合タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）などの高力価の中和抗体の誘導に関連するドメインを含む。
本明細書では、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質に対する中和抗体応答を誘導するための組成物（例えば、ワクチン組成物）を提供する。本明細書で提供する組成物は、治療的または予防的に使用することができる。本明細書で提供する組成物は、ＮＴＤ及びＲＢＤドメインなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも２つのドメイン、及び全長未満のスパイクタンパク質を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含み、当該ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子にある。
ＮＴＤとＲＢＤの双方は、ウイルス活性を中和する抗体の結合部位であることが知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の事例でのＲＢＤは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合するスパイクタンパク質の受容体結合部位である。ＮＴＤは、その機能は十分に解明されていないが、糖部分に結合し、スパイクタンパク質の融合前から融合後の立体配座への構造遷移を促す役割を果たしているようである。ＮＴＤ及びＲＢＤドメインの双方は、本明細書に開示している低用量で強力な結合抗体及び大きな中和抗体力価を誘導する。
例えば、膜結合ＲＢＤ抗原（ＲＢＤ－ＴＭ）または膜結合ＮＴＤ抗原（ＮＴＤ－ＴＭ）の融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの治療用量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１／Ｓ２スパイクタンパク質に対する免疫応答を生成させるために、本明細書では使用する。本明細書で使用する治療用量は、対象に中和抗体を誘導する、または存在を押し上げるのに十分な用量である。このような用量は、血清陽性または血清陰性の対象に対して投与することができる。例えば、対象はナイーブであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と反応する抗体を持っていない、または、対象が、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがある、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を誘導する用量のワクチン（例えば。ｍＲＮＡワクチン）を以前に投与していた可能性があるので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を事前に持ち得る。いくつかの実施形態において、治療用量は、２．５μｇ～１００μｇの用量、またはその間の任意の整数用量である。いくつかの実施形態では、非常に驚くべきことに、治療用量は、ヒト対象において中和抗体応答を誘導する上で十分であることが実証されたことのない低用量であり、例えば、２．５μｇ～３５μｇ未満、または５μｇ～２５μｇ未満、またはその間の任意の整数である。いくつかの実施形態において、用量は、２．５μｇ～３０μｇ、２．５μｇ～２５μｇ、２．５μｇ～２０μｇ、２．５μｇ～２．１５μｇ、２．５μｇ～１０μｇ、２．５μｇ～５μｇ、５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、約２．５μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、または約３０μｇである。いくつかの実施形態において、治療用量は、対象に対して投与される第１の用量、対象に対して投与される第２の用量、または対象に対して投与される第１及び第２の用量の両方である。
本開示のいくつかの態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びタンパク質膜貫通ドメイン、例えば、天然に存在するか、または異種の膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供する。
いくつかの実施形態では、タンパク質膜貫通ドメインは、インフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列を含む。
本開示の他の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメイン及び膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供する。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、インフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインである。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列を含む。
本開示のさらに他の態様は、任意選択でリンカーを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメインに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜貫通ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号９１のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号９１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、任意選択で配列番号１３１または２のヌクレオチド配列を含む、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、任意選択で配列番号１３２または４のヌクレオチド配列を含む、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ、任意選択で７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、任意選択で約１００ヌクレオチドの長さがある、ポリＡテールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾、任意選択で１－メチルシュードウリジンを含む。
本開示のいくつかの態様は、前の段落のいずれか１つのｍＲＮＡを含む組成物を提供する。
本開示の他の態様は、前の段落のいずれか１つのｍＲＮＡのうち少なくとも２つを含む組成物を提供する。
本開示の他の態様は、以下：（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びタンパク質膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）；ならびに（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメイン及び膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡ、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）のｍＲＮＡ、対（ｂ）のｍＲＮＡの比は、約１：１、例えば、１：２、１：３、２：１、または３：１である。いくつかの実施形態では、組成物のｍＲＮＡの少なくとも５０％は、（ａ）のｍＲＮＡである。例えば、組成物のｍＲＮＡのうち少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％が（ａ）のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、組成物のｍＲＮＡの少なくとも５０％は、（ｂ）のｍＲＮＡである。例えば、組成物のｍＲＮＡのうち少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％が（ｂ）のｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、タンパク質膜貫通ドメインは、インフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、（ａ）の融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）の融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）の融合タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）のオープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）のオープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）のオープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）の融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）の融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）の融合タンパク質は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）のオープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）のオープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）のオープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中で製剤化される。
いくつかの実施形態では、組成物はさらに脂質ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）のｍＲＮＡは脂質ナノ粒子中に製剤化され、（ｂ）のｍＲＮＡは脂質ナノ粒子中に製剤化される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なアミノ脂質である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性の脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ステロールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質、中性脂質、ステロール、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、ヘプタデカン－９－イル８（（２ヒドロキシエチル）（６オキソ６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）である。
いくつかの実施形態では、中性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、以下を含む：４７ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１１．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１１ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１０．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１０ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；または５１ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；９．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、以下を含む：４７ｍｏｌ％の化合物１；１１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；４８ｍｏｌ％の化合物１；１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；４９ｍｏｌ％の化合物１；１０．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；５０ｍｏｌ％の化合物１；１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；または５１ｍｏｌ％の化合物１；９．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ。
本開示のさらなる態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体応答を対象に誘導するのに有効な量の、前述の請求項のいずれか１つのｍＲＮＡまたは組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示の他の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞免疫応答を対象に誘導するのに有効な量の、前述の請求項のいずれか１つのｍＲＮＡまたは組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示のいくつかの態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体応答などの免疫応答を誘導し得るコロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を提供し、この抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質フラグメントまたは機能性タンパク質ドメインを含み、任意選択で、ＲＮＡは脂質ナノ粒子中で製剤化される。
いくつかの実施形態では、抗原は、機能的なタンパク質ドメインである。
いくつかの実施形態では、タンパク質ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）である。
いくつかの実施形態では、ＮＴＤは、膜貫通ドメイン、任意選択でインフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに連結されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号４６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。
いくつかの実施形態では、ＲＢＤは可溶性である。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号６１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号６１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＢＤは、膜貫通ドメイン、任意選択でインフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに連結されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号７７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号７６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号７６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＴＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤに連結されて、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合タンパク質を形成する。
いくつかの実施形態では、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合物は、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、任意選択でインフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに連結されて、ＮＴＤ－ＲＢＤ－ＴＭタンパク質を形成する。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号９１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号９１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合物は、Ｃ末端短縮を含む。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１０７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号１０６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号１０６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＴＤ及び／またはＲＢＤには拡張領域が含まれる。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号５９、８６、８９、１１６、１１９または１２２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号５９、８６、８９、１１６、１１９または１２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号５８、８５、８８、１１５、１１８または１２１のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号５８、８５、８８、１１５、１１８または１２１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１サブユニットドメインである。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは可溶性である。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、膜貫通ドメイン、任意選択でインフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに連結されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号１６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、Ｓタンパク質のＲＢＤまたはＲＢＤの一部を除去するように改変されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２または３５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号２０、２３、２６、２９、３２または３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号１９、２２、２５、２８、４１または３４のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号１９、２２、２５、２８、３１または３４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、Ｓタンパク質のＳ２サブユニットに連結されている。
いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、ＨＫＵ１ Ｓタンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号３７のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、ＯＣ４３ Ｓタンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４０のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号４０のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗原は、フェリチン、ルマジンシンテターゼ及びフォールドンから任意選択で選択される足場ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、足場ドメインはフェリチンである。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号８または６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号８または６５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号７または６４のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号７または６４のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、足場ドメインは、ルマジンシンテターゼである。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１１、１４、６８または７１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号１１、１４、６８または７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号１０、１３、６７、または７０のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号１０、１３、６７、または７０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、足場ドメインはフォールドンである。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号４４、５０、７４、８０、８３、１０１、１０４または１１３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号４４、５０、７４、８０、８３、１０１、１０４または１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号４３、４９、７３、７９、８２、１００、１０３、または１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号４３、４９、７３、７９、８２、１００、１０３、または１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗原はさらに、マクロファージマーカー、任意選択でＣＤ８６、ＣＤ１１Ｂ及び／またはＶＳＶＧｃｔから任意選択で選択される輸送シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号９５、９８、または１１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、この抗原は、配列番号９５、９８、または１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号９４、９７、または１０９のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、任意選択で、このオープンリーディングフレームは配列番号９４、９７、または１０９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、任意選択でイオン化可能なアミノ脂質、中性脂質、ステロール、及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。イオン化可能なアミノ脂質は、本明細書では、イオン化可能なアミノ脂質及びイオン化可能なカチオン性脂質と交換可能に使用され、イオン化可能な脂質を指す。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、任意選択で４５～５０ｍｏｌ％、例えば、４５～４６ｍｏｌ％、４６～４７ｍｏｌ％、４７～４８ｍｏｌ％、４８～４９ｍｏｌ％、または４９～５０ｍｏｌ％、例えば約４５ｍｏｌ％、４５．５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４６．５ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４７．５ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４８．５ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または４９．５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、任意選択で３５～４０ｍｏｌ％、例えば、３０～３１ｍｏｌ％、３１～３２ｍｏｌ％、３２～３３ｍｏｌ％、３３～３４ｍｏｌ％、３５～３５ｍｏｌ％、３５～３６ｍｏｌ％、３６～３７ｍｏｌ％、３８～３８ｍｏｌ％、３８～３９ｍｏｌ％、または３９～４０ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％のヘルパー脂質、任意選択で１０～１２ｍｏｌ％、例えば、５～６ｍｏｌ％、６～７ｍｏｌ％、７～８ｍｏｌ％、８～９ｍｏｌ％、９～１０ｍｏｌ％、１０～１１ｍｏｌ％、１１～１２ｍｏｌ％、１２～１３ｍｏｌ％、１３～１４ｍｏｌ％、または１４～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～５％のＰＥＧ脂質、任意選択で１～３ｍｏｌ％、例えば、１．５～２．５ｍｏｌ％、１～２ｍｏｌ％、２～３ｍｏｌ％、３～４ｍｏｌ％、または４～５ｍｏｌ％を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、ヘプタデカン－９－イル８（（２ヒドロキシエチル）（６オキソ６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）であり、中性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールはコレステロールであり、及び／またはＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び約０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、以下を含む：４７ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１１．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１１ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１０．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；１０ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質；または５１ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質；９．５ｍｏｌ％の中性脂質；３８．５ｍｏｌ％のステロール；及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、以下を含む：４７ｍｏｌ％の化合物１；１１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；４８ｍｏｌ％の化合物１；１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；４９ｍｏｌ％の化合物１；１０．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；５０ｍｏｌ％の化合物１；１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ；または５１ｍｏｌ％の化合物１；９．５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；３８．５ｍｏｌ％のコレステロール；及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００ ＤＭＧ。
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７（公報番号ＷＯ２０１７／０７０６２６）及び国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２７７７（公報番号ＷＯ２０１８／１７０３４７）の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）であり、約９８６０アミノ酸をコードする２９．８～３０ｋｂのサイズである（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０００，上掲；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｃｅｌｌ，Ｍａｙ １４；１８１（４）：９１４－９２１．ｅ１０．）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、５’キャップ及び３’ポリＡテールを有するポリシストロン性ｍＲＮＡである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、構造タンパク質及び非構造タンパク質（Ｎｓｐ）をコードする特定の遺伝子に編成されている。ゲノム内の構造タンパク質の順序は、５’－レプリカーゼ（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１／ａｂ）－構造的タンパク質［スパイク（Ｓ）－エンベロープ（Ｅ）－メンブレン（Ｍ）－ヌクレオカプシド（Ｎ）］－３’である。コロナウイルスのゲノムとしては、アクセサリータンパク質、非構造タンパク質、及び構造タンパク質をコードするさまざまな数のオープンリーディングフレームが挙げられる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｖｉｒｕｓｅｓ；１１（１）：ｐ．５９）。ほとんどの抗原ペプチドは構造タンパク質に位置する（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７（３）：１８１－１９２）。スパイク表面糖タンパク質（Ｓ）、小さなエンベロープタンパク質（Ｅ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）は、４つの主要な構造タンパク質である。Ｓタンパク質は細胞指向性に寄与して、中和抗体（ＮＡｂ）及び防御免疫を誘導し得るので、他の全ての構造タンパク質の中でコロナウイルスワクチン開発における最も重要な標的の１つと見なされ得る。さらに、アミノ酸配列分析は、Ｓタンパク質がコロナウイルスの中で保存された領域を含むことを示しており、これは、普遍的なワクチン開発の基礎となり得る。
抗原
本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、目的の抗原、例えば、ベータコロナウイルス構造タンパク質に由来する抗原、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来する抗原をコードするように設計された核酸、特に、ｍＲＮＡを特徴とする。本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、それ自体が抗原を含まず、むしろ、細胞、組織、または対象に一旦送達されると抗原または抗原配列をコードする核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）を含む。核酸分子、特にｍＲＮＡ（複数可）の送達は、細胞、組織または対象への投与時に核酸が細胞によって取り込まれるように、適切な担体または送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）中に当該核酸分子を製剤化することによって達成され、次に、細胞が、核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（複数可）を発現する。本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する、例えば、対象に存在する場合（例えば、ヒトまたは哺乳動物の対象に存在する場合）に免疫応答を誘発する、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、ポリペプチド、ペプチドなどの物質を指す。本発明は、少なくとも部分的に、細胞または対象に投与されたｍＲＮＡから発現される場合、ｍＲＮＡにコードされる抗原が、発現された抗原に対する免疫応答を免疫系に生じ得、例えば、発現された抗原に対する抗体の産生を誘発し得、例えば結合抗体及び／または中和抗体は、発現された抗原に特異的なＢ細胞及び／またはＴ細胞の応答を引き起こし得、最終的には、抗原または抗原が関連する病原体とのその後の遭遇に対して防御的または予防的応答を引き起こし得るという理解に基づく。好ましいｍＲＮＡにコードされた抗原は「ウイルス抗原」である。本明細書で使用される場合、「ウイルス抗原」という用語は、ウイルス、例えば病原性ウイルスに由来する抗原を指す。本明細書で使用される抗原という用語は、全長タンパク質、例えば、全長ウイルスタンパク質を指し得、またはタンパク質のフラグメント（例えば、ポリペプチドまたはペプチドフラグメント）、タンパク質のサブユニットまたはドメイン、例えば、ウイルスタンパク質のサブユニットまたはドメインを指し得る。
多くのタンパク質は、オリゴマー分子に会合する複数のポリペプチドまたはいくつかのポリペプチド鎖からなる四次構造または三次元構造を有する。本明細書で使用される場合、「サブユニット」という用語は、単一のタンパク質分子、例えば、発生期のタンパク質分子のプロセシングから生じるポリペプチドまたはポリペプチド鎖を指し、このサブユニットは、他のタンパク質分子（例えば、サブユニットまたは鎖）とアセンブル（または「同時アセンブル」して）タンパク質複合体を形成する。タンパク質は、比較的少数のサブユニットを有し得るので、「オリゴマー」として説明されてもよく、または多数のサブユニットからなり得、したがって「マルチマー」として記述されてもよい。オリゴマーまたはマルチマータンパク質のサブユニットは、同一、相同、または完全に異なって、異なるタスク専用である場合もある。
タンパク質またはタンパク質サブユニットは、さらにドメインを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質内の別個の機能及び／または構造単位を指す。通常、「ドメイン」は特定の機能または相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に貢献する。ドメインは、さまざまな生物学的状況で存在し得る。類似のドメイン（すなわち、構造的、機能的及び／または配列相同性を共有するドメイン）は、単一のタンパク質内に存在してもよく、または類似もしくは異なる機能を有する別個のタンパク質内に存在してもよい。タンパク質ドメインは、多くの場合、特定のタンパク質の三次構造または配列の保存された部分であり、残りのタンパク質またはそのサブユニットとは独立して機能し、存在し得る。
構造生物学及び分子生物学では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノム配列の公開直後に行われたように、同一、相同、または類似のサブユニットまたはドメインが、新たに同定されたタンパク質または新規タンパク質の分類に役立ち得る。
本明細書で使用される場合、抗原という用語は、抗原の下部構造、例えば、抗原結合部位によって認識され得るが免疫応答を誘導するには不十分であるポリペプチドまたは炭水化物構造である「エピトープ」という用語とは異なる。当該技術分野は、単離された形態で対象または免疫細胞に送達されるタンパク質抗原、例えば、単離されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド抗原を記載しているが、タンパク質抗原の設計、試験、検証、及び産生は、特にタンパク質を大規模に生産する場合、費用及び時間がかかる場合がある。対照的に、ｍＲＮＡテクノロジーは、さまざまな抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の迅速な設計及び試験に適している。さらに、適切な送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）での製剤と組み合わせたｍＲＮＡの迅速な産生は、迅速に進行し得、大規模でｍＲＮＡワクチンを迅速に産生し得る。本発明のｍＲＮＡによってコードされる抗原が対象の細胞によって発現され、例えば、人体によって発現され、したがって、対象、例えば、人体は、「工場」として機能して、抗原を生成し、それが次に、所望の免疫応答を誘発するという事実からも潜在的な利益が生じる。
好ましい態様では、抗原とは、免疫応答を誘導する（例えば、抗原に対する抗体を免疫系に産生させる）ことが可能なタンパク質である。本明細書において、「抗原」という用語の使用は、免疫原性タンパク質、ならびに免疫原性タンパク質に由来するポリペプチドまたはペプチド、例えば、免疫原性フラグメント（別段述べない限り、抗原に対する免疫応答を誘導する（または誘導することができる）免疫原性フラグメント）を包含する。「タンパク質」という用語がポリペプチド及びペプチドを包含し、「抗原」という用語が抗原フラグメントを包含することを理解されたい。他の分子は、細菌多糖類またはタンパク質と多糖構造との組合せなどの抗原性である可能性があるが、本明細書に含まれるウイルスワクチンの場合、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質のフラグメント、及びベータコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する設計及び／または変異タンパク質が本明細書の特色となる抗原である。
核酸／ｍＲＮＡ
本明細書に記載のワクチン技術は、核酸、特に目的の抗原、例えば、ベータコロナウイルススパイクタンパク質抗原、それらのサブユニット、ドメインまたはフラグメント（例えば、抗原フラグメント）をコードするように設計されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を特徴とする。本発明の核酸、例えば、ｍＲＮＡは、好ましくは、核酸、例えば、ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適しているように、適切な担体または送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に処方される。適切に処方された場合、核酸、例えば、ｍＲＮＡは、対象、例えば、ヒト対象の細胞及び／または組織に送達されて、これらの核酸によってコードされるタンパク質の翻訳を達成し得る。
核酸分子は、遺伝子情報を運ぶ連結されたヌクレオチドで構成される高分子であり、タンパク質合成のプロセスを指示することにより、全てではないにしてもほとんどの細胞機能を指示する。核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチド単量体）のポリマーを含む。したがって、核酸はポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド鎖とも呼ばれる）とも呼ばれる。核酸の２つの主要なクラスは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。ＤＮＡは、全ての自由生活性生物及びほとんどのウイルスの遺伝物質を構成している。ＲＮＡは特定のウイルスの遺伝物質であるが、全ての生細胞にも見られ、細胞プロセス、特にタンパク質の生成に重要な役割を果たしている。
ヌクレオシドは、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸の構造サブユニットである。ヌクレオシドは、窒素塩基（核酸塩基）、通常はピリミジン（シトシン、チミン、またはウラシル）またはプリン（アデニンまたはグアニン）のいずれかで構成され、五炭素炭水化物リボースまたはリボースもしくはデオキシリボースである「糖」に共有結合されている。ヌクレオチドは、窒素塩基、糖（リボースまたはデオキシリボース）、及び１～３つのリン酸基からなる。本質的に、ヌクレオチドは、追加のリン酸基（複数可）を有する単なるヌクレオシドである。
核酸分子であるＤＮＡ及びＲＮＡは、あるヌクレオチドの糖塩基と隣接するヌクレオチドのリン酸基との間のエステル結合と呼ばれる化学結合によって鎖状に互いに連結されているヌクレオチドで構成されている。この糖は３’末端であり、リン酸は各ヌクレオチドの５’末端である。あるヌクレオチドの糖の５’炭素に結合したリン酸基は、次のヌクレオチドの３’炭素の遊離ヒドロキシルとのエステル結合を形成する。これらの結合は、ホスホジエステル結合と呼ばれ、糖リン酸骨格は、分子が合成されるときに５’から３’の方向に伸びるか、または成長するものとして記述される。
核酸の核酸塩基部分は、プリン塩基、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、シトシン（Ｃ）、ＤＮＡのチミン（Ｔ）、及びＲＮＡのウラシル（Ｕ）を特徴としている。核酸の糖部分は、ＤＮＡのデオキシリボース、ＲＮＡのリボースを特徴としている。５つのヌクレオシドは、通常、それぞれ１文字のコードＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵと略される。ただし、チミジンは、ウリジンに見られるリボフラノース環ではなく２’－デオキシリボフラノース部分を含むので、より一般的には「ｄＴ」（「ｄ」は「デオキシ」を表す）と表記される。これは、チミジンがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出されるからである。逆に、ウリジンはＤＮＡではなくＲＮＡに見出される。残りの３つのヌクレオシドはＲＮＡ及びＤＮＡの両方に見出され得る。ＲＮＡでは、それらはＡ、Ｃ、及びＧとして表されるが、ＤＮＡでは、それらはｄＡ、ｄＣ、及びｄＧとして表される。
当業者であれば、別段の記載がある場合を除き、本出願に記載の核酸配列が代表的なＤＮＡ配列内で「Ｔ」を列挙し得るが、配列が、ｍＲＮＡに相当する場合、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられることを理解しよう。したがって、本明細書で開示され、特定の配列識別番号によって特定される任意のＤＮＡは、そのＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列も開示しており、その場合、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられる。
核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ類、例としては、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはこれらのキメラ及び／または組合せであってもよく、これらを含んでもよい。
本発明において特徴とされるのは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、特に目的の抗原、例えば、ベータコロナウイルススパイクタンパク質抗原、サブユニット、ドメインまたはそれらのフラグメント（例えば、抗原フラグメント）をコードするように設計されたｍＲＮＡである。ＲＮＡのサブタイプであるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ある遺伝子の遺伝子配列に対応するＲＮＡの一本鎖分子である。ｍＲＮＡは転写の過程で作られ、ＤＮＡの一本鎖がＲＮＡポリメラーゼによって解読され、ｍＲＮＡが合成され、すなわち、転写される。ｍＲＮＡは、タンパク質を合成する過程、すなわち翻訳の過程でリボソームによって読み取られる。したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とは、（少なくとも１つの）タンパク質（アミノ酸の天然、非天然、または修飾ポリマー）をコードするＲＮＡであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏで翻訳されてコードされたタンパク質を産生し得る。
本開示の組成物は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらに、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップもしくはキャップ類似体を含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、もしくはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示する配列はさらに、追加のエレメント（例えば、５’及び３’ＵＴＲ）を含んでもよいが、これらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のｍＲＮＡには必ずしも存在する必要はないことが理解されよう。また、本発明の、例えば、本開示のベータコロナウイルスワクチン中で特徴づけられるｍＲＮＡが、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることも理解されたい。例示的なＵＴＲ配列は、配列表に示されている（例えば、配列番号２、４、１３１及び１３２）；しかし他のＵＴＲ配列を使用してもよいし、または本明細書に記載の任意のＵＴＲ配列と交換してもよい。また、ＵＴＲは、本明細書で提供するｍＲＮＡから省いてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４５、７５、または９０のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表１～１５の配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４６、７６または９１のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、表１～１５の配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む。
本開示の組成物のコロナウイルス抗原の例示的な配列及びコロナウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを表１～１５に示す。
本明細書に記載のｍＲＮＡによってコードされる抗原のいずれか１つがシグナル配列を含む場合も含まない場合もあることを理解されたい。
コードされたコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質抗原
公知のベータコロナウイルスのエンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルスの宿主指向性及び宿主細胞への侵入を決定する。コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計に最適な抗原である。Ｓタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に重要である。Ｓタンパク質の構成は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ－ＣｏＶ、及びＮＬ６３－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス間で類似している。
本明細書で使用される場合、「スパイクタンパク質」という用語は、ベータコロナウイルスを含むウイルスのエンベロープ（ウイルス表面）から突出するホモ三量体を形成する糖タンパク質を指す。三量体化したスパイクタンパク質は、宿主細胞の表面にある受容体に結合し、続いてウイルス膜と宿主細胞膜を融合させることにより、ビリオンの宿主細胞への侵入を促進する。Ｓタンパク質は、ウイルスの種類に応じて１，１６０～１，４００のアミノ酸で構成される、高度にグリコシル化された大きなＩ型膜貫通型融合タンパク質である。ベータコロナウイルススパイクタンパク質は、約１１００～１５００アミノ酸を含み、図１に示すような構造（すなわち、ドメインの組成及び構成）を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、中和抗体及び防御免疫を誘導し得るので、ワクチン設計に最適な抗原である。本発明のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパクを産生するように（すなわち、ｍＲＮＡが細胞または組織、例えば対象の細胞または組織に送達されるときにスパイクタンパク質が発現されるようにスパイクタンパク質をコードする）、同様にその抗原変異体を産生するように、設計されている。当業者は、ウイルス、例えばベータコロナウイルスが宿主細胞へのウイルス侵入を促進するという意図された機能を実行するために、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質が必要であり得るが、スパイクタンパク質の構造及び／または配列におけるある量の変動が、主にスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘発しようとする場合、許容されることを理解するであろう。例えば、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大５または最大１０のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原の１～数個、おそらく最大５または最大１０アミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質の抗原特性を変えることなく許容され得る。例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、表１～１５の配列のいずれか１つに示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１２５として示されるアミノ酸配列に由来する）を有する。他の実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、表１～１５の配列のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する（例えば、配列番号１２５として示されるアミノ酸配列に由来する）スパイクタンパク質と比較した場合（それと配列した場合）１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または５以下のアミノ酸の置換及び／または欠失を有する。コードされたスパイクタンパク質配列にわずかな変化が生じる場合、バリアントは、好ましくは、参照スパイクタンパク質配列と同じ活性を有するか、及び／または例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ））で決定されるとおり、参照スパイクタンパク質と同じ免疫特異性を有する。
コロナウイルスのＳタンパク質は、２つの重要な機能サブユニットに分けられ得、そのうち、Ｓタンパク質の球状頭部を形成するＮ末端Ｓ１サブユニット、及びタンパク質の茎を形成するＣ末端Ｓ２領域があり、ウイルスエンベロープに直接埋め込まれている。潜在的な宿主細胞と相互作用すると、Ｓ１サブユニットは宿主細胞上の受容体、特にアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を認識して結合するが、Ｓタンパク質の最も保存された成分であるＳ２サブユニットは、ウイルスのエンベロープを宿主細胞膜と融合させることを担う。（例えば、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０２０ Ｍａｒ；１６（３）：ｅ１００８３９２を参照のこと）。三量体Ｓタンパク質三量体の各モノマーには、付着及び膜融合をそれぞれ媒介する２つのサブユニットＳ１及びＳ２が含まれている。例えば、図１を参照のこと。インビボでの感染プロセスの一部として、２つのサブユニットは酵素的切断プロセスによって互いに分離される。Ｓタンパク質は、感染細胞のＳ１／Ｓ２部位で、インビボで、フューリンを介した切断によって最初に切断され、その後のセリンプロテアーゼ媒介性切断事象が、Ｓ１内のＳ２’部位で起こる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２では、Ｓ１／Ｓ２切断部位は
にある（配列番号１２７を参照）。Ｓ２’切断部位はアミノ酸８１１－ＫＰＳＫＲ／ＳＦＩ－８１８（配列番号１２６を参照）にある。
本明細書で使用される場合、例えば、本発明の核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質抗原を設計する文脈において、「Ｓ１サブユニット」（例えば、Ｓ１サブユニット抗原）という用語は、Ｓタンパク質のＮ末端で始まり、Ｓ１／Ｓ２切断部位で終わるスパイクタンパク質のＮ末端サブユニットを指し、一方で「Ｓ２サブユニット」（例えば、Ｓ２サブユニット抗原）という用語は、Ｓ１／Ｓ２切断部位で開始し、スパイクタンパク質のＣ末端で終了するスパイクタンパク質のＣ末端サブユニットを指す。上記のように、当業者は、本質的に全長または完全なスパイクタンパク質Ｓ１またはＳ２サブユニットがそれぞれ受容体結合または膜融合に必要であるが、Ｓ１またはＳ２の構造及び／または配列におけるある程度の変動は、スパイクタンパク質サブユニットに対する免疫応答を主に誘発しようとする場合、許容されることを理解する。例えば、コードされたサブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原のＮ末端またはＣ末端からの、例えば、１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸というわずかな短縮は、タンパク質の抗原特性を変化することなく許容され得る。同様に、コードされたスパイクタンパク質サブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原の１～数個、おそらく最大４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸（またはそれ以上）の変動（例えば、保存的置換）は、タンパク質（複数可）の抗原特性を変えることなく許容され得る。例示的な実施形態では、スパイクタンパク質、例えば、コードされたスパイクタンパク質抗原は、表１～１５の配列のいずれか１つに示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１２５として示されるアミノ酸配列に由来する）を有する。他の実施形態では、スパイクタンパク質サブユニット、例えば、コードされたＳ１またはＳ２タンパク質抗原は、配列番号１２５に示されるようなアミノ酸配列を有する、スパイクタンパク質のアミノ酸１～６８５を含むかもしくはそれからなるスパイクタンパク質Ｓ１サブユニット、またはアミノ酸６８６～１２７３を含むかもしくはそれからなるスパイクタンパク質Ｓ２サブユニットと比較した場合（またはそれと整列させた場合）、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または５以下のアミノ酸置換及び／または欠失を有する。コードされたスパイクタンパク質サブユニット配列にわずかな変化が生じる場合、そのバリアントは、好ましくは、参照スパイクタンパク質サブユニット配列と同じ活性を有するか、及び／または例えば、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ））で決定されるとおり、参照スパイクタンパク質サブユニットと同じ免疫特異性を有する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットは、構造及び機能によって容易に識別可能なドメインをさらに含み、これは、次に、核酸ワクチン、特に本発明のｍＲＮＡワクチンによってコードされる抗原を設計する際に特徴づけられ得る。Ｓ１サブユニット内で、ドメインは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、当該ＲＢＤドメインは、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）をさらに含んでいる。野生型Ｓ１サブユニットには、シグナルペプチド（ＳＤ）、ＮＴＤドメインのＮ末端、ならびに及び第１サブドメイン（ＳＤ１）及び第２サブドメイン（ＳＤ２）も含まれる。Ｓ２サブユニット内のドメインには、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テール（ＣＴ）としても公知の細胞質ドメインが含まれる（Ｌｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒ ２０２０，９４（７）ｅ００１２７－２０）。ＨＲ１及びＨＲ２ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の「融合コア領域」と呼ばれることもある（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２０ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊａｎ；１７（１）：１－１２．）。図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメイン構造を示している。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、リンカー領域、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、第１のサブドメイン（ＳＤ１）、及び第２のサブドメイン（ＳＤ２）を含む。Ｓ１サブユニットは、Ｃ末端膜貫通ドメイン（ＴＭ）を追加するように改変してもよく、可溶性であってもよい。Ｓ２サブユニットは、とりわけ、第１のヘプタッドリピート（ＨＲ１）、第２のヘプタッドリピート（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質テールを含む。可溶性Ｓ２サブユニットはＴＭドメインなしで生成されてもよい。
Ｓ１のＮＴＤ及びＲＢＤは、これらのドメインがベータコロナウイルス感染個体における中和抗体の標的であることが示されているので、本発明のワクチン設計アプローチのための優れた抗原である。本明細書で使用される場合、例えば、抗原設計（本発明のｍＲＮＡによってコードされ、例えば、本発明のｍＲＮＡワクチンから発現される当該抗原）の文脈において、「Ｎ末端ドメイン」または「ＮＴＤ」という用語は、配列番号１２５として示されるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質のＳ１サブユニットのアミノ酸１～２９０と同一性を有する、長さが約２９０アミノ酸を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット内のドメインを指す。本明細書で使用される場合、例えば、抗原設計（本発明のｍＲＮＡによってコードされ、例えば、本発明のｍＲＮＡワクチンから発現される当該抗原）の文脈において、「受容体結合ドメイン」または「ＲＢＤ」という用語は、配列番号１２５として示されるアミノ酸配列を有するスパイクタンパク質のＳ１サブユニットのアミノ酸３１６～５１７と同一性を有する、長さが約１７５～２２５のアミノ酸を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニット内のドメインを指す。本明細書で使用される場合、「受容体結合モチーフ」という用語は、ＡＣＥ２受容体に直接接触するＲＢＤの部分を指す。発現したＲＢＤは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に対してその受容体として特異的に結合するか、及び／またはＲＢＤ結合及び／または中和抗体、例えば、ＣＲ３０２２と特異的に反応すると予測されている。
本明細書で提供される組成物は、いずれか１つ以上の全長または部分的（配列の短縮または他の欠失）Ｓタンパク質サブユニット（例えば、Ｓ１またはＳ２サブユニット）、Ｓタンパク質サブユニットの１つ以上のドメインまたはドメインの組合せ（例えば、ＮＴＤ、ＲＢＤ、またはＮＴＤ－ＲＢＤ融合物、ＳＤ１及び／またはＳ２が有りまたは無し）、または全長もしくは部分的及びＳ２タンパク質サブユニットのキメラ、をコードし得るｍＲＮＡを含む。その他のＳタンパク質サブユニット及び／またはドメイン構成は、本明細書で企図されている。
コードされたサブユニット抗原
本開示のいくつかの態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の（少なくとも１つの）サブユニットをコードするｍＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｓ１サブユニット（例えば、全長または部分的）をコードする。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｓ２サブユニット（例えば、全長または部分的）をコードする。さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡはキメラＳ１－Ｓ２タンパク質をコードし、サブユニットの１つはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来し、他のサブユニットは別の生物、例えば、インフルエンザウイルスなどのウイルスに由来する。本開示のｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニット（Ｓ１及び／またはＳ２）は、可溶性または膜結合型（例えば、膜貫通ドメインに連結されている）であり得る。
可溶性サブユニット抗原
可溶性タンパク質は、細胞の細胞質に存在するか、細胞から分泌される（例えば、膜に結合しない）。細胞によって分泌される可溶性抗原は、補体によってオプソニン化され、リンパ節の濾胞樹状細胞によって捕捉され、発現されたタンパク質に存在するエピトープに特異的なＢ細胞によって認識され得る。サブユニット抗原の発現によってさらに、特定のサブユニットに対する免疫応答に焦点を合わせることが可能になり、他の関連するウイルスと共有される抗原の他のドメインに特異的なメモリーＢ及びＴ細胞の刺激は最小限に抑えられている。理論に拘束されることはないが、ＮＴＤ、ＲＢＤ、及び場合によっては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットの介在ポリペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットの可溶性形態での提示は、Ｓ１サブユニット特異的免疫応答を生成することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原及び／または可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２サブユニット抗原をコードする。可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原及びそれをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表１Ａ及び１Ｂに示す。可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニット抗原の他の例が本明細書に示されている。
膜結合サブユニット抗原
膜結合タンパク質は膜貫通ドメインを有する細胞膜に固定されており、及び、それ故に、可溶性ではない。理論に拘束されるものではないが、抗原提示細胞は埋め込まれた抗原を流入領域リンパ節に運び、強力な免疫応答を生成すると考えられている。流入領域リンパ節で発生する胚中心反応には、ＣＤ４＋ ＴＦＨ細胞とＢ細胞との間の長期接触が含まれ、提示された抗原に特異的なＢ細胞の複製及びＩｇＧ１の産生へのクラスのスイッチを促進するＩＬ－４及びＩＬ－２１などの共刺激及び局所サイトカインシグナルが可能になり、それぞれが長寿命の形質細胞及びメモリーＢ細胞の生成を促進し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原及び／または膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２サブユニット抗原をコードする。いくつかの実施形態では、膜結合抗原（例えば、Ｓ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ、またはそれらの任意の組合せ）は、膜貫通ドメイン、例えば、天然に存在する膜貫通ドメインまたは異種膜貫通ドメイン（異種タンパク質由来）に連結され、これは細胞膜にタンパク質を固定する役割を果たす。膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２サブユニット抗原の非限定的な例及びそれらをコードするｍＲＮＡを以下の表２Ａ及び２Ｂに提供する。他の膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原が本明細書で企図されている。
サブユニット抗原の短縮及びＲＢＤの欠失
いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＢＤまたはＲＢＤの一部を除去するように改変されたＳ１サブユニットをコードするｍＲＮＡを含む。Ｓ１サブユニットの短縮は、免疫系が認識するエピトープを少なくし、それによって残りのエピトープに対する免疫応答にバイアスをかけ、これにより、ウイルス中和に重要な特定のエピトープに対する抗体が選択され得る。ＲＢＤの短縮または部分的な欠失は、発現したタンパク質またはそれを運ぶ細胞が受容体ＡＣＥ２と相互作用することを妨げ得、リンパ節に到達して所望の免疫応答を刺激する可能性を高める。さらに、ＲＢＤを除去すると、関連するウイルスに対して以前に生成された交差反応性抗体によるエピトープマスキングが防止される可能性があり、したがって、誘発された免疫応答を目的の抗原に特異的に集中し得る。さらに、ＲＢＤの除去は、発現されたサブユニットの高次構造を変化させ得、これらの代替高次構造エピトープに特異的なＢ細胞が線状ペプチドを取り込んで、Ｔ細胞に提示することを可能にし、それによってＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、天然の構成にまだ存在するこれらのエピトープに対して間接的に増強する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＢＤまたはＲＢＤの一部を除去するように改変されたＳ１サブユニット（ここでＳ２サブユニットはグリカンを含む）をコードするｍＲＮＡを含む。グリカンは、アスパラギン残基を介したＮ－結合型グリコシル化、またはセリンもしくはスレオニン残基のＯ－結合型グリコシル化によってタンパク質に結合される。タンパク質の一部の成分にグリカンシールドが存在すると、ペプチドエピトープがマスクされ得、それによって抗体応答が他の露出したペプチドエピトープに集中し得る。さらに、グリコシル化タンパク質は、コーティンググリカンを認識する抗体も誘発する。グリカンエピトープを認識するＢ細胞は、線形ペプチドエピトープを取り込み、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に提示し、それによって、タンパク質全体に見られる線状エピトープに対するＣＤ４＋ Ｔ細胞の応答を促進する。
短縮型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット抗原及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表３Ａ及び３Ｂに示す。
ＲＢＤ欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例は、以下の表４Ａ及び４Ｂに示す。
キメラＳ１－Ｓ２サブユニット抗原
いくつかの実施形態では、組成物は、キメラタンパク質、例えば、１つのウイルスのＳタンパク質由来のＳ１サブユニット及び別の異なるウイルスのＳタンパク質由来のＳ２サブユニットを有するキメラＳ１－Ｓ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。例えば、Ｓ２サブユニットはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する場合があり、Ｓ１サブユニットはＨＫＵ１に由来する場合がある。別の例として、Ｓ２サブユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する場合があるが、Ｓ１サブユニットはＯＣ４３に由来する場合がある。これらのキメラタンパク質は、以前の曝露によって生成されたＨＫＵ１またはＯＣ４３のＳ１サブユニットに特異的な循環抗体によってオプソニン化される可能性が高く、マクロファージ及び樹状細胞による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２サブユニットペプチドのＣＤ４＋ Ｔ細胞への効率的な取込み及び交差提示を促進する。循環抗体によるオプソニン作用はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２サブユニットエピトープに特異的な受容体を有するＢ細胞への提示のための濾胞樹状細胞による捕捉を促進する。キメラＳ１／Ｓ２サブユニット構築物及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を以下の表５Ａ及び５Ｂに示す。
コードされたドメイン抗原
本開示の他の態様は、Ｓタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットの（少なくとも１つの）サブドメインをコードするｍＲＮＡを含む組成物を提供する。サブドメインは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）であっても、または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（ＳＤ１及び／またはＳＤ２有りまたは無し）であってもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＴＤ及びＲＢＤ（ＳＤ１及び／またはＳＤ２有りまたは無し）の組合せ（例えば、非天然の組合せ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＮＴＤ及び／またはＲＢＤは、膜貫通ドメインに連結されている（ＳＤ１及び／またはＳＤ２有りまたは無し）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、システイン残基を含むように変異されたＳタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットの２つのサブドメイン（ＮＴＤ及びＲＢＤ）をコードする。いくつかの実施形態では、そのような変異は、ジスルフィド結合の形成をもたらす。一例として、ｍＲＮＡは、Ｆ４３Ｃ変異を含むＮＴＤ及びＱ５６３Ｃ変異を含むＲＢＤをコードし得、最終的に、ジスルフィド結合を介してＲＢＤに連結されたＮＴＤをもたらす。
Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）構築物
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットのＮＴＤをコードする。特定のベータコロナウイルスのＮＴＤは、防御レベルの抗体を誘発する。ＭＥＲＳなどの他のベータコロナウイルスのＮＴＤに特異的な抗体は、膜融合及びウイルス侵入を防ぐことによって作用し（Ｚｈｏｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９；３０６８）、ＡＣＥ２へのウイルス付着を防ぐこととは異なる中和の第２の機構を提供する。本開示のｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＴＤは、可溶性であってもまたは膜結合性であってもよい。膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＴＤ抗原及びそれをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表６Ａ及び６Ｂに示す。
受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）構築物
他の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットのＲＢＤをコードする。ＲＢＤは、宿主細胞のＡＣＥ２受容体に結合し、細胞へのウイルスの付着を媒介する。ウイルスが細胞に侵入して複製するには、付着が必要である。したがって、細胞へのウイルスの付着を阻止するＲＢＤ標的抗体応答は、細胞外ウイルス粒子を効果的に中和し、増殖を防ぎ、中和されたウイルス粒子の他の成分に対するさらなる免疫応答を促進する。本開示のｍＲＮＡによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤは、可溶性であっても、または膜結合型（例えば、膜貫通ドメインに連結されている）であってもよい。
可溶性ＲＢＤ抗原
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする。樹状細胞は飲作用によって可溶性タンパク質をサンプリングし、流入領域リンパ節に移動する際に、サンプリングされたタンパク質を構成する線状ペプチドをＣＤ４＋ Ｔ細胞に提示する。これらのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＲＢＤ由来のエピトープを認識し、取り込み、そして提示したＢ細胞に増殖シグナルを提供するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の他の成分を含まないＲＢＤを特異的に投与すると、免疫応答をＲＢＤに存在するエピトープに向けて集中させると予想される。可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を以下の表７Ａ及び７Ｂに示す。
膜結合ＲＢＤ抗原
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、膜結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする。膜結合ＲＢＤを発現する細胞は、これらの膜結合抗原を流入領域リンパ節に運び、ＲＢＤ特異的Ｂ細胞によるエピトープの効率的な認識を促進すると期待される。Ｂ細胞表面には多くの表面結合抗体が含まれ、発現細胞には膜結合ＲＢＤのコピーが多数含まれているので、Ｂ細胞による抗原の最初の認識に続いてＢ細胞受容体が架橋し、親和性効果を通じて強力な応答が刺激されると期待される。膜結合型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を以下の表８Ａ及び８Ｂに示す。
ドメイン融合抗原
さらに他の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＴＤ－ＲＢＤ融合タンパク質をコードする。例えば、Ｓタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットのＮＴＤ及びＲＢＤは、短いアミノ酸（例えば、グリシン－セリン）リンカーなどのリンカーを介して互いに連結されて、ドメイン間の可塑性／ヒンジ化及びスペースが可能になる場合がある。別の実施形態では、抗原性エピトープ、例えば、ＰＡＤＲＥなどのクラスＩＩユニバーサルＴ細胞エピトープを含むリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、例えば、可塑性のために、そして膜と抗原との間の合理的な距離を可能にするために、別の短いアミノ酸（例えば、グリシン－セリンまたはＰＡＤＲＥ）リンカーを通じて、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合物に連結される。理論に拘束されることはないが、この膜結合タンデム構成は、全てではないにしても、ほとんどの既知の中和エピトープ及び保護エピトープを１つのオープンリーディングフレームで提示すると考えられている。次に、この融合タンパク質の投与により、免疫応答が既知の保護エピトープに向かって集中し、非保護エピトープに特異的な抗体及びＴ細胞の不必要な生成が減少するはずである。さらに、異なるドメインに対する抗体は、宿主細胞への付着をブロックすること、または結合したウイルスが膜融合を受けて宿主細胞に侵入するのを防ぐことなど、異なる機構を通じてウイルス粒子を中和し得る。したがって、異なるドメインを含む融合タンパク質によって誘発される幅広い応答は、より進化的にロバストであり、ワクチン誘発免疫を回避するために複数の別個の変異を必要とする場合がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＴＤ－ＲＢＤ融合タンパク質及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例は、以下の表９Ａ及び９Ｂに示している。
リンカー
本開示に従って、さまざまなリンカーを使用してもよい。本明細書で提供されるリンカーは、他の２つのアミノ酸配列を人工的に一緒に連結する単なるアミノ酸配列である。本明細書で使用されるリンカーは、切断可能であっても、または切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーは、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを可能にし、その後、リンカーの切断によって、個々の成分が独立して放出されることが可能になる。切断不可能なリンカーは、１つ以上のタンパク質サブユニットの接続を維持し、タンパク質全体がコンポーネントサブユニットの近接を必要とする機能を実行することを可能にする。そのようなリンカーの非限定的な例としては、グリシン－セリン（ＧＳ）リンカー（切断不可能）；及びＦ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、及びＥ２Ａリンカー（切断可能）が挙げられる。本明細書では他のリンクを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカーである。ＧＳリンカーは、グリシン及びセリンのアミノ酸リピートを含むポリペプチドリンカーである。それらは可塑性かつ親水性の残基を含み、タンパク質ドメインの折り畳み及び機能に干渉することもなく、また二次構造を形成することもなく、タンパク質サブユニットの融合を実行するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３から２０アミノ酸長であるＧＳリンカーを含む融合タンパク質をコードする。例えば、ＧＳリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さを有してもよい（または少なくともその長さを有してもよい）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、１５アミノ酸長（例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１３３））である（または少なくとも１５アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、８アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３４））である（または少なくとも８アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、７アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１３５））である（または少なくとも７アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、４アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１３６））である（または少なくとも４アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３６）を含み、ここで、ｎは、１～５の任意の整数である。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、４アミノ酸長（例えば、ＧＳＧＧ（配列番号１５２）である（または少なくとも４アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＳＧＧ）ｎ（配列番号１５２）を含み、ここで、ｎは、１～５の任意の整数である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、３アミノ酸（例えば、ＧＧＧ）の長さ（または少なくとも３アミノ酸の長さ）を有するグリシンリンカーである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンによってコードされるタンパク質は、２つ以上のリンカーを含み、これらは、同じであっても、またはお互いに異なってもよい（例えば、同じＳタンパク質構築物におけるＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１３５）及びＧＧＧＳ（配列番号１３６）。
いくつかの実施形態では、リンカーは、汎ＨＬＡ ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）（例えば、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１４８））をコードするｍＲＮＡを含む。ＰＡＤＲＥは、免疫優勢ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞エピトープであり、強力な免疫原である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１６４（３）：１６２５－３３を参照のこと）。
輸送シグナル
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ゴルジ輸送シグナルに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ドメイン（例えば、ＮＴＤ、ＲＢＤ、またはＮＴＤ－ＲＢＤ融合物）をコードする。このようなシグナルの非限定的な例としては、高度に発現しており、細胞内領域がゴルジ装置から細胞表面への効率的な輸送を制御し得る、ＣＤ８６及び／またはＣＤ１１ｂなどのマクロファージマーカーが挙げられる。他の細胞輸送シグナル（配列）、例えば、ＶＳＶ－Ｇ細胞質テール（ＶＳＶＧｃｔ）を本明細書で使用してもよい。コードされたタンパク質の細胞表面へのより効率的な輸送は、Ｂ細胞認識のための抗原の利用可能性を高め、したがって、コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質ドメインに対する抗体の生成を促進すると予想される。輸送シグナルに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表１０Ａ及び１０Ｂに示す。
ドメイン融合Ｃ末端の短縮
他の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、Ｃ末端ドメインの一部が短縮／欠失されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＴＤ－ＲＢＤ融合タンパク質をコードする。一実施形態では、１３個（または少なくとも１３個）のアミノ酸が、ＮＴＤ－ＲＢＤ融合タンパク質のＣ末端ドメインから欠失されている。これらのアミノ酸の欠失は、抗体へのエピトープの曝露を増加させ、それにより、ＮＴＤ及びＲＢＤドメインに存在する保護エピトープに対する、よりロバストな免疫応答を刺激することが予想される。
Ｃ末端短縮を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ドメイン融合抗原及びそれをコードするｍＲＮＡの非限定的な例は、以下の表１１Ａ及び１１Ｂに示されている。
ドメイン拡張
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ドメイン抗原は、当該技術分野でＮＴＤドメインまたはＲＢＤドメインであると理解されているものに隣接するか、及び／または隣り合う配列を含む「拡張」領域を含む。ＲＢＤ＿ＥＸＴシリーズにはＳＤ１（サブドメイン１）が含まれる。ＮＴＤ＿ＥＸＴシリーズには、ＮＴＤのＣ末端ヘリックスを含む。一部のＢ細胞及び抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ＮＴＤ及びＲＢＤの適切に折り畳まれた、ただし変性されていない形態でのみ見られる立体構造エピトープを認識する。ＮＴＤ及びＲＢＤドメインに隣接するか及び／または隣り合う配列の包含は、抗原に追加のＢ細胞エピトープを提供できるだけでなく、潜在的にこれらのドメインのより最適な折り畳みをもたらし、いずれかのドメインの端に見出され得るエピトープに特異的な抗体でＢ細胞を刺激し得る。さらに、これらの伸長配列を含めると、ＮＴＤまたはＲＢＤと発現細胞膜との間の距離が長くなり、発現タンパク質が細胞表面に近すぎる場合に結合効率が低下し得る抗体への両方のドメインの曝露が増大する。最後に、伸長配列を含めると、ＮＴＤまたはＲＢＤエピトープを認識したＢ細胞による、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される可能性のあるペプチドのプールが増大し、次いで、抗原提示のためにタンパク質全体がプロセシングされ、それによってＮＴＤまたはＲＢＤ特異的Ｂ細胞が十分なＴ細胞の助けを得る機会が増大する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ドメイン伸長及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例は、以下の表１２Ａ及び１２Ｂに提供されている。

ドメイン混合物
本開示は、いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質サブドメインをコードするｍＲＮＡの混合物を含む組成物を提供する。一例では、組成物は、ＮＴＤをコードするｍＲＮＡ（ＳＤ１、ＳＤ２、及び／または膜貫通ドメイン有りまたは無し）及びＲＢＤをコードするｍＲＮＡ（ＳＤ１、ＳＤ２、及び／または膜貫通ドメイン有りまたは無し）の混合物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４７）に連結されたＮＴＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号４５または４６）及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７７）に連結されたＲＢＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号７５または７６）を含む。
組成物中のあるｍＲＮＡと別のｍＲＮＡの濃度の比率は、１：１（５０：５０）、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。いくつかの実施形態では、この比率は１：１である。例えば、組成物は、１：１の比率の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４７）に連結されたＮＴＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号４５または４６）対、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７７）に連結されたＲＢＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号７５または７６）を含み得る。いくつかの実施形態では、比率は１：２である。例えば、組成物は、１：２の比率の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４７）に連結されたＮＴＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号４５または４６）対、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７７）に連結されたＲＢＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号７５または７６）を含み得る。別の実施例、組成物は、１：２の比率の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７７）に連結されたＲＢＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号７５または７６）対、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４７）に連結されたＮＴＤをコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号４５または４６）を含み得る。異なる抗原をコードする異なるｍＲＮＡは、さまざまな強度の免疫応答を刺激し得る（Ｍａｇｉｎｉ Ｄｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１６；１１：ｅ０１６１１９３）、そして、２つの異なる抗原をコードする２つのｍＲＮＡの等モル比の投与は、一方に対して免疫応答をもたらし得るが、他方に対しては免疫応答をもたらさない場合がある（Ｊｏｈｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１８；３６：１６８９－１６９９）。同時送達されたｍＲＮＡの比率の操作は、同等の効力で所望の抗原を標的とする幅広い免疫応答を誘発するために有用であり得る。
コードされたナノ粒子抗原
本明細書で提供されるｍＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、足場ドメインに連結されたコロナウイルス抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、足場ドメインは、本開示のｍＲＮＡによってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場ドメインは、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取込み及びプロセシングを変更すること、及び／または抗原を別の分子に結合させることによって、抗原の免疫原性を改善し得る。いくつかの実施形態では、抗原に連結された足場ドメインは、ウイルスナノ粒子またはより大きなタンパク質折り畳み免疫原への抗原の自己集合を促進する。本明細書で提供されるように使用され得る足場ドメインの非限定的な例としては、フェリチンドメイン、ルマジンシンテターゼドメイン、フォールドンドメイン、及びエンカプスリンドメインが挙げられる。他の足場ドメインを使用してもよい。
フェリチン
いくつかの実施形態では、フェリチンドメインは、足場ドメインとして使用される。フェリチンはタンパク質であり、その主な機能は細胞内の鉄の貯蔵である。フェリチンは二十四（２４）個のサブユニットで構成されており、各サブユニットは、正八面体対称性を有する四次構造に自己組織化する４つのアルファヘリックスバンドルで構成されている（Ｃｈｏ Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８；（Ｇｒａｎｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；及びＬａｗｓｏｎ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、ロバストな熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己集合する。このようにフェリチンナノ粒子内に抗原を封入すると、抗原の分解を遅らせ、かつ個々の抗原を凝集させることが期待され、各ナノ粒子は二十四（２４）個の抗原サブユニットを含んでいる。同じ抗原の複数のコピーの凝集は、樹状細胞による抗原の取込み及び移動の両方、ならびによりロバストなＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強する（Ｋａｓｔｅｎｍｕｌｌｅｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１（５）：１７８２－９６）。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原提示及びワクチン開発に最適なプラットフォームである。
本明細書で提供されるｍＲＮＡは、いくつかの実施形態では、例えば、グリシン（例えば、ＧＧＧ）リンカードメインを通じて、フェリチンドメインに連結されたＲＢＤをコードする。他のリンカーを使用してもよい。
他の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、例えば、グリシン（例えば、ＧＧＧ）リンカーを通じて、フェリチンドメインに連結されたＳタンパク質のＳ１ドメインをコードする。本明細書の他の場所に示されているように、他のリンカーを使用してもよい。
フェリチンドメインに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表１３Ａ及び１３Ｂに示す。
ルマジンシンテターゼ
いくつかの実施形態では、ルマジンシンテターゼドメインは、足場ドメインとして使用される。ルマジンシンテターゼは、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真正細菌などのさまざまな生物体におけるリボフラビンの生合成の最後から２番目の触媒ステップを担う酵素である。ルマジンシンテターゼはホモオリゴマーで構成されており、これは、その起源の種に応じて、五量体、十量体、及び二十面体の６０量体など、サイズ及びサブユニット数が異なる。ルマジンシンテターゼモノマーは１５０アミノ酸の長さで、隣接するタンデムアルファヘリックスのベータシートが含まれている。ルマジンシンテターゼについては、さまざまな四次構造が報告されており、その形態学的多様性を示している（ホモ五量体から、直径１５０Åのキャプシドを形成する十二（１２）個の五量体の対称アセンブリまで）。ルマジンシンテターゼの表面に抗原が提示されると、局所的に高い濃度の抗原が規則正しい配列で表示される。このような反復構造は、Ｂ細胞受容体の架橋を可能にし、親和性効果を通じて強力な免疫応答をもたらす。
本明細書で提供されるｍＲＮＡは、いくつかの実施形態では、例えば、グリシン－セリン（例えば、ＧＧＳ）を介して、ルマジンシンテターゼドメインに連結されたＲＢＤをコードする。他のリンカーを使用してもよい。
他の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡは、例えば、グリシン－セリン（例えば、ＧＧＳ）リンカーを介して、ルマジンシンテターゼドメインに連結されたＳタンパク質のＳ１ドメインをコードする。本明細書の他の場所に示されているように、他のリンカーを使用してもよい。
フォールドンドメインに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表１４Ａ及び１４Ｂに示す。
フォールドン
いくつかの実施形態では、フォールドンドメインは、足場ドメインとして使用される。Ｔ４フィブリチン（フォールドン）のＣ末端ドメインは、フィブリチン三量体構造の形成に必須であり、人工三量体化ドメインとして使用され得る（例えば、Ｍｅｉｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４ Ｄｅｃ ３；３４４（４）：１０５１－１０６９；Ｔａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９７ Ｊｕｎ １５；５（６）：７８９－９８を参照のこと）。Ｓタンパク質のエクトドメインに融合すると、フォールドンドメインはＳタンパク質の正しい三量体化を促進し、タンパク質の誤った折り畳みを回避する。Ｓタンパク質の融合前高次構造の生成をもたらすそのようなプロセスは、発現の増大、高次構造の均一性、及び強力な中和抗体応答の誘発をもたらす。
理論に拘束されるものではないが、この構成は、タンパク質の細胞内領域で主に免疫原的にサイレントであるフォールドンをもたらすと考えられている。フォールドンドメインに連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びそれらをコードするｍＲＮＡの非限定的な例を、以下の表１５Ａ及び１５Ｂに示す。
エンカプスリン
いくつかの実施形態では、エンカプスリンドメインは、足場ドメインとして使用される。エンカプスリンは、好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから分離されたタンパク質ケージナノ粒子である。エンカプスリンは、薄い正二十面体のＴ＝１対称ケージ構造（内径及び外径がそれぞれ２０ｎｍと２４ｎｍを有する）を有する同一の３１ｋＤａモノマーの６０コピーからアセンブルされる（Ｓｕｔｔｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能はまだ明確に理解されていないが、その結晶構造は最近解明され、その機能は、ＤｙＰ（色素脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）（酸化ストレス応答３０に関与している）などのタンパク質をカプセル化する細胞内コンパートメントとして仮定された（Ｒａｈｍａｎｐｏｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３；２８０：２０９７－２１０４）。ナノ粒子の構築物にエンカプスリンを使用すれば、ナノ粒子の表面にタンパク質抗原を表示することと、ナノ粒子自体の中にｍＲＮＡなどのカーゴを封入することの両方が可能になる。以前のエンカプスリンナノ粒子ベースのワクチンは、表面に表示された抗原及びカーゴタンパク質自体の両方に対して強い免疫応答を誘発した（Ｌａｇｏｕｔｔｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１８；３６（２５）：３６２２－３６２８）。
本明細書で提供されるｍＲＮＡは、いくつかの実施形態では、エンカプスリンドメインに連結されているＳタンパク質ドメイン（例えば、Ｓ１、Ｓ２、ＲＢＤ、及び／またはＮＴＤ）をコードする。
融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。したがって、コードされた抗原（複数可）は、一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質フラグメント）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合しているタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進するのではなく、コロナウイルス抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の起源のタンパク質からの機能的特性を保持している。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質からの受容体結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質からのＮ末端ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではないウイルスに由来し得る。例えば、膜貫通ドメインは、インフルエンザ血球凝集素膜貫通ドメインに由来し得、これは、タンパク質を細胞表面に効果的に固定することが実証されている。
バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、コロナウイルス抗原バリアントをコードするＲＮＡを含む。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、多数の望ましい特性、例えば、その免疫原性を強化する、その発現を強化する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する特性のいずれかを付与するアミノ酸変化を含んでもよい。バリアント抗原／ポリペプチドは、慣用的な変異誘発技法を用いて作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するか否かを評価し得る。発現レベル及び免疫原性を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例示的なそのようなアッセイは実施例のセクションに記載されている。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性も、当該技術分野で認識されている技法を用いて（例えば、ワクチン接種した対象内の抗原の発現を経時的に評価することにより、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することにより）測定し得る。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定してもよく、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を用いて測定してもよい。このような実験及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供する配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む（例えば、配列表を参照）ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ ＯＲＦを含むか、または本明細書で提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係であって、これらの配列を比較することにより決定される関係を指す。また、同一性とは、配列間のまたは配列内の配列関連性の程度であって、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間のマッチ数により決定される配列関連性の程度を指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処される、ギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致のパーセントを測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、候補アミノ酸または核酸の配列内で、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列内の残基と同一である残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージであって、その配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野では周知されている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、この計算に導入されるギャップ及びペナルティーのために値が異なる場合があることが理解されている。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され当業者に公知である配列アラインメントプログラム及びパラメーターによる定量において、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対し、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ただし１００％未満の配列同一性を有する。このようなアラインメント用のツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のツールが挙げられる。別のよく知られたローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されており、これは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含めた他の最適グローバルアラインメント法よりも速く、ヌクレオチド及びタンパク質配列を網羅的にアラインメントするとされている。
そのため、参照配列、とりわけ本明細書で開示するポリペプチド（例えば、抗原）配列に関する置換、挿入、及び／または付加、欠失、及び共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（例えば、１つ以上のリジン）をペプチド配列に（例えば、そのＮ末端またはＣ末端に）付加してもよい。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または局在化に使用し得る。リジンを使用して、ペプチド溶解性を増大してもよいし、またはビオチン化を可能にしてもよい。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の用途に応じて欠失させてもよい（例えば、溶解性である、より大きな配列の一部としてのまたは固体支持体に結合した配列の発現）。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置き換えてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することにより、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋没した（ｂｕｒｉｅｄ）水素結合ネットワークは、安定性を改善するために疎水性残基で置き換えてもよい。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。このような配列は、当業者には容易に識別可能である。また、本明細書で提供する配列のいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に、欠失させ得る配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含むことも理解されたい。
当業者には認識されるように、タンパク質フラグメント、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的のコロナウイルス抗原の範囲内であると考えられる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の任意のタンパク質フラグメント（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、免疫原性であり、コロナウイルスに対する防御免疫応答を付与することを条件とする、タンパク質フラグメントを提供する。参照タンパク質と同一であるが短縮されているバリアントに加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及するいずれかの配列に対し２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの範囲をとり得る。
安定化エレメント
天然の真核ｍＲＮＡ分子は、他の構造的特徴（例えば、５’キャップ構造または３’ポリ（Ａ）テール）に加えて、安定化エレメント（限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／またはその３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む）を含み得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲはいずれも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ、少なくとも１つの５’末端キャップを含み、脂質ナノ粒子内で製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャップは、以下の化学ＲＮＡキャップアナログ：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了させて、製造業者のプロトコルに従って５’グアノシンキャップ構造を生成してもよい（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了させて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成し得る（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、次に２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて５’末端から３番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより、生成し得る。キャップ３構造は、キャップ２構造から、次に２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて５’末端から４番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより、生成し得る。酵素は、組換え供給源に由来し得る。
３’ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドのストレッチである。これは、場合によっては最大約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対し少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域と、少なくとも１つのヒストンステムループと、任意選択でポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルとを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを強化するはずである。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）でもなく、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））でもない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組合せを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組合せによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にある約１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。
ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック塩基対）が結果的に生じ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチの配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス抗原と融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断した転位に必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に侵入するのを普遍的に制御している。真核生物においては、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドが、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。また、シグナルペプチドは、タンパク質を細胞膜に標的化するのも促進し得る。
シグナルペプチドは１５～６０アミノ酸の長さであってもよい。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。
異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上コロナウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で公知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。
配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化されている。コドン最適化の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書で提供する配列のいずれか１つ以上のＯＲＦがコドン最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、コドン最適化を用いて、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確保するか；ＧＣ含量にバイアスをかけてｍＲＮＡの安定性を増加するか、もしくは二次構造を低減するか；遺伝子構成もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンもしくは塩基の連続を最小にするか；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズし：タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するか；コードされるタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するか；タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはシャッフルするか；制限酵素認識部位を挿入もしくは欠失させるか；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するか；翻訳速度を調節してタンパク質のさまざまなドメインが適切に折り畳まれるようにするか；またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは取り除いてもよい。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）のサービス、及び／または独自方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるコロナウイルス抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃレベルが強化されたＲＮＡであり得る。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含むｍＲＮＡより機能的に安定している場合がある。例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む医薬組成物を開示している。遺伝子コードの縮退に起因して、この修飾は、既存のコドンを、得られるアミノ酸を変更することなく、より高いＲＮＡ安定性を促進するコドンに置き換えることによって機能する。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基、例えば、転写ＲＮＡ内に存在する残基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ内に存在するデオキシリボヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ））を含む。
化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＮＡを含み、当該核酸は、標準的（非修飾）であっても当該技術分野で知られているように修飾されてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。このような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよく、または天然には存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。このような修飾としては、当該技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当該技術分野で一般に知られているかまたは認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の非天然の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当該技術分野で一般的に公知であるか、または認識されているものである。このような天然には存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開された米国特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７（これらの全てが参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、さまざまな（２つ以上の）異なるタイプの標準及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で異なる）タイプの標準的及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物体に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸に比べて、それぞれ細胞または生物体において免疫原性の低減を呈し得る（例えば、生得的応答の低減）。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、核酸の合成中または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成により導入されてもよく、または鎖の末端もしくは鎖の他の箇所にあるポリメラーゼ酵素により、導入されてもよい。核酸の任意の領域を化学的に修飾してもよい。
本開示は、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸））の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、任意の有用な方法によって（例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に）合成して、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めてもよい。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含んでもよい。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、この核酸はヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的アデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、このとき、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学的修飾を有する核酸内で、非標準的塩基と標準的塩基との間、または２つの相補的な非標準的塩基構造間の水素結合が可能となる。このような非標準的塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せを本開示の核酸に組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾された核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾されてもよく、これは、ｍＲＮＡ配列内の全てのウリジン残基が１－メチル－シュードウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、核酸は、修飾残基（例えば、上記の残基）で置き換えることにより、配列内に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について一様に修飾されてもよい。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内（例えば、ポリ（Ａ）テールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つ以上または全てまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）が一様に修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）内の全てのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つであってもよく、または以下の組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってもよい。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上）に関して）、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。任意の残りのパーセンテージが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されよう。
ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含み得る。例えば、核酸は、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシルまたはシトシン）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、核酸内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよいし、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが少なくとも１つの目的抗原をコードするように設計されている場合、核酸はこれらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡでは、５’ＵＴＲは転写開始点で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から開始して転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲが核酸分子の安定性及び翻訳に関して調節的役割を担っていることについてのエビデンスが増えている。ＵＴＲの調節機能は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の機能も組み込むことができる。さまざまな５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が公知であり、当該技術分野で利用可能である。
５’ＵＴＲは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているＫｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを有する。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２８）を有し、Ｒは開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、自然界には存在しない。合成ＵＴＲとしては、その特性を改善する（例えば、遺伝子発現を増大する）ために変異させたＵＴＲ、及び完全に合成のＵＴＲが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）、ヒトシトクロムｂ－２４５ ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号）が挙げられる。ＣＭＶ早初期１（ＩＥ１）遺伝子（米国特許出願公開第２０１４０２０６７５３号、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号１２９）（ＷＯ２０１４１４４１９６）も使用してもよい。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ／２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。
いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号１３１及び配列番号２から選択される配列を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（ノンコーディングである）。天然または野生型の３’ＵＴＲには、アデノシン及びウリジンのストレッチが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類することができ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）、クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤはクラスＩ ＡＲＥを含む。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号１３０）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを含む分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩ ＡＲＥはそれほど十分には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎはこのクラスで十分に研究されている２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定にすることが公知であり、一方ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲはｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むと、ＨｕＲ結合が生じ、これによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージが安定する。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少し得る。同様に、ＡＲＥを特定して除去または変異させることで、細胞内の安定性を増大し、これによって、結果として得られるタンパク質の翻訳及び産生を増大し得る。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連する細胞株で実施し得、タンパク質産生は、トランスフェクション後のさまざまな時点でアッセイされ得る。例えば、細胞にさまざまなＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを関連タンパク質に使用して、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイしてもよい。
３’ＵＴＲは、異種であっても合成であってもよい。３’ＵＴＲについては、グロビンＵＴＲ（Ｘｅｎｏｐｕｓ β－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲを含む）が当該技術分野で公知である（米国特許第８２７８０６３号、同第９０１２２１９号、米国特許出願公開第２０１１００８６９０７号）。２つの連続したヒトβグロビン３’ＵＴＲをヘッドトゥーテールでクローニングすることにより、いくつかの細胞タイプでの安定性が強化された修飾βグロビン構築物が開発されており、当該技術分野で周知である（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号、ＷＯ２０１４／０７１９６３）。加えて、ａ２－グロビン、ａ１－グロビン、ＵＴＲ及びこれらの変異体も当該技術分野で公知である（ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７）。非特許文献においてｍＲＮＡ構築物で説明されている他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモン（野生型または修飾）（ＷＯ２０１３／１８５０６９、米国特許出願公開第２０１４０２０６７５３号、ＷＯ２０１４１５２７７４）、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＵＴＲが挙げられ、αグロビン３’ＵＴＲ及びウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列も当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（ＷＯ２０１４１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（ＷＯ２０１５１０１４１４）、ＦＩＧ４（ＷＯ２０１５１０１４１５）、及びヒトアルブミン７（ＷＯ２０１５１０１４１５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号１３２及び配列番号４から選択される配列を含む。
当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列と共に使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、合成３’ＵＴＲと、異種３”ＵＴＲと共に使用してもよい。
非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用されてもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を本開示の核酸の領域に組み込んでもよい。イントロン配列を組み込むと、タンパク質の産生と核酸の発現レベルを増大し得る。
特徴の組合せを隣接する領域に含めてもよく、他の特徴の中に含めてもよい。例えば、ＯＲＦには、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含み得る５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールを鋳型的に付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチドフラグメント及び第２のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲ）。
任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが核酸の領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された転写産物と同じ方向に配置してもよく、または方向もしくは位置を変更してもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されても、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作成されてもよい。本明細書で使用される場合、ＵＴＲ配列に関連する「変更された」という用語は、ＵＴＲが参照配列に関連して何らかの方法で変更されたことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上記のように配向もしくは位置の変化によって野生型またはネイティブＵＴＲと比較して変化されてもよいし、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換または転位によって変化されてもよい。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’）を生成するこれらの変更のいずれかは、バリアントＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲを使用してもよい。本明細書で使用される場合、「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列のいずれかでコードされているＵＴＲである。例えば、二重ベータグロビン３’ＵＴＲは、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載されているように使用してもよく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
パターン化されたＵＴＲを有することもまた、本開示の範囲内である。本明細書で使用される場合「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回を超えて繰り返されるような繰り返しパターンまたは交互のパターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、隣接する領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織、または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。任意のこれらの遺伝子由来のＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新しいポリヌクレオチドを作成してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドを含むグループを指すために最も広い意味で使用される。
非翻訳領域には、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含まれてもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で公知のＴＥＥを含み得る。
ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）システムを用いて転写され得る。ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は当該技術分野で公知であり、国際公開第ＷＯ ２０１４／１５２０２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０５３２０９及びＷＯ ２０１９／０３６６８２（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法のいずれか１つ以上に従って調製される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡ鋳型を用いて生成される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ、例えば、限定されるものではないが、コロナウイルスのｍＲＮＡの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞に、プラスミドＤＮＡ鋳型を用いてトランスフェクションする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、プラスミドＤＮＡを複製するために培養し、次いで単離及び精製する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、目的遺伝子の５’側に位置し、目的遺伝子に作用可能に連結されているＴ７プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」ＵＴＲとは、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモーター配列を含んでもよい。このようなプロモーター配列は、当該技術分野で公知である。本開示のワクチンにはこのようなプロモーター配列が存在しないことを理解されたい。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）とは、ポリペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のからすぐ下流（すなわち３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続的なストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリ（Ａ）テール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリ（Ａ）テールは、（例えば、細胞質での）酵素分解からｍＲＮＡを保護し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助するように機能する。
いくつかの実施形態では、核酸は２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは、社内で製造されてもよく、供給業者から選択されてもよく、または本明細書に記載されるように合成されてもよい。ＮＴＰは、限定するものではないが、天然及び非天然（改変）ＮＴＰを含む、本明細書に記載されているものから選択されてもよい。
本開示の方法では、いずれの数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを使用してもよい。ポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ及び／または変異型ポリメラーゼ、例えば、限定するものではないが、化学的に修飾された核酸及び／またはヌクレオチドを含む修飾された核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介しキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子が固体支持体に固定化され、反応物溶液中で段階的に合成される自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。
液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続添加による本開示の核酸の合成は、液相で実施され得る。
合成法の組合せ。上記で考察した合成方法には、それぞれ独自の利点及び制限がある。これらの方法を組み合わせて制限を克服する試みが行われてきた。このような組合せ方法もまた本開示の範囲内である。固相または液相の化学合成を酵素的ライゲーションと組み合わせて使用すると、化学合成だけでは得られない長鎖核酸が効率的に生成される。
核酸領域またはサブ領域のライゲーション
リガーゼによる核酸のアセンブリもまた使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じて、ポリヌクレオチド鎖の５’及び３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチドなどの核酸及び／または環状核酸は、１つ以上の領域またはサブ領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントは、リガーゼ触媒反応によって結合され、さまざまな機能を有する組換えＤＮＡを作成し得る。一方は５’ホスホリル基を有し、もう一方は遊離３’ヒドロキシル基を有する、２つのオリゴデオキシヌクレオチドがＤＮＡリガーゼの基質として機能する。
精製
本明細書に記載の核酸の精製には、限定するものではないが、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得る。クリーンアップは、当該技術分野で公知の方法、例えば、限定するものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ｐｏｌｙ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などで実施され得る。「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合の「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。「汚染物質、混入物」とは、別の物質を不適合、不純、または劣悪にする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界に見られるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理チェックは、限定するものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施され得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、逆転写酵素－ＰＣＲを含むがこれに限定されない方法によって配列決定され得る。
定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群より選択される器官から回収され得る。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実行してもよく、一方、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学的方法を使用して単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノメンブレン限外濾過、免疫吸収剤捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せによっても単離され得る。
これらの方法により、研究者は、残っているかまたは送達された核酸のレベルをリアルタイムでモニターする能力が得られる。本開示の核酸は、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾に起因して内因性形態とは異なるので、これが可能である。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定するものではないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸を分析して、核酸が適切なサイズであるか否かを決定し、核酸の分解が起こっていないことを確認してもよい。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的の核酸カーゴと共に含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に公知である構成要素、組成物、及び方法（例えば、全てその全体が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照）を用いて生成され得る。
本開示のワクチンは、通常は、脂質ナノ粒子内に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質を、任意選択で４５～５０ｍｏｌ％、例えば、４５～４６ｍｏｌ％、４６～４７ｍｏｌ％、４７～４８ｍｏｌ％、４８～４９ｍｏｌ％、または４９～５０ｍｏｌ％、例えば約４５ｍｏｌ％、４５．５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４６．５ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４７．５ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４８．５ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、または４９．５ｍｏｌ％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３０～４５ｍｏｌ％のステロール、任意選択で３５～４０ｍｏｌ％、例えば、３０～３１ｍｏｌ％、３１～３２ｍｏｌ％、３２～３３ｍｏｌ％、３３～３４ｍｏｌ％、３５～３５ｍｏｌ％、３５～３６ｍｏｌ％、３６～３７ｍｏｌ％、３８～３８ｍｏｌ％、３８～３９ｍｏｌ％、または３９～４０ｍｏｌ％を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％のヘルパー脂質、任意選択で１０～１２ｍｏｌ％、例えば、５～６ｍｏｌ％、６～７ｍｏｌ％、７～８ｍｏｌ％、８～９ｍｏｌ％、９～１０ｍｏｌ％、１０～１１ｍｏｌ％、１１～１２ｍｏｌ％、１２～１３ｍｏｌ％、１３～１４ｍｏｌ％、または１４～１５ｍｏｌ％を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～５％のＰＥＧ脂質、任意選択で１～３ｍｏｌ％、例えば、１．５～２．５ｍｏｌ％、１～２ｍｏｌ％、２～３ｍｏｌ％、３～４ｍｏｌ％、または４～５ｍｏｌ％を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の中性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）：
の化合物またはその塩もしくは異性体を有し、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－Ｙ－Ｒ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるならば（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５の場合、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または、（ｉｉ）ｎが１もしくは２の場合、Ｑは５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有し、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱはＣ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、及び各ｎが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、及びＱが５～１４員の複素環であり、（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２である場合、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１である場合、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員の複素環式アルキルであり、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合される原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ，－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルから選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ２－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－Ｙ－Ｒ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱは－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットとしては、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され、
Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、式中、Ｑが－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ６が、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒが、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ’が、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群より選択され、
各Ｒ”が、独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群より選択され、
各Ｒ＊が、独立して、Ｃ１－１２アルキル、及びＣ１－１２アルケニルからなる群より選択され、
各Ｙが、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物、
またはそれらの塩もしくは異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、式（Ｘ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＡ）：
の化合物またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、Ｉは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩ）：
の化合物またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中Ｉは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキルであるか、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、２、３、または４であり、かつＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；かつＲ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）：
またはその塩もしくは異性体が挙げられ、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩｄ）：
の化合物、またはその塩もしくは異性体が挙げられ、式中、ｎは、２、３、または４であり、かつｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物：
を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物：
を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、このとき、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、構造脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセント（ｍｏｌ％）のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０ｍｏｌ％のコレステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５または４０ｍｏｌ％のコレステロールを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～２ｍｏｌ％、１～３ｍｏｌ％、１～４ｍｏｌ％、または１～５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、２、２．５、３または３．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、２．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、２．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なアミノ脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約１０：１～約１００：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なアミノ脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約２０：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰが含むイオン化可能なアミノ脂質構成要素、対ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は約１０：１である。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
多価ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なるウイルス種の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡを含んでも、または複数のＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のコロナウイルス抗原をコードする１つのｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のコロナウイルス抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化してもよい。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。脂質ナノ粒子は、次に、組み合わせて単一のワクチン組成物（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含むワクチン組成物）として投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。
併用ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なるウイルス株の２つ以上の抗原をコードする１つのｍＲＮＡを含んでも、または複数のＲＮＡを含んでもよい。１つ以上のコロナウイルス及び異なる生物の１つ以上の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンも本明細書で提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つ以上の抗原、または異なる株／種の１つ以上の抗原、例えば、コロナウイルス感染のリスクが高い同じ地理的地域に見られる生物体、またはコロナウイルスに曝露されたときに個人が曝露される可能性が高い生物体に対する免疫を誘導する抗原、を標的とする併用ワクチンであり得る。
医薬製剤
本明細書では、例えば、ヒト及び他の哺乳動物におけるコロナウイルスの予防及び／または処置のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬を提供する。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。これらは、コロナウイルス感染を予防及び／または処置するための医薬で使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含むコロナウイルスワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与してもよく、ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて抗原ポリペプチド（抗原）が産生される。
組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞タイプ、投与手段、ＲＮＡの物理的特性（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子、例えば、対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的健康状態に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または促進された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するｍＲＮＡを含む組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療用途に特に適したものにする、不活性または活性の担体との組合せを指す。「医薬的に許容される担体」は、対象に投与した後でもまたは投与した際にも、望ましくない生理学的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための医薬担体として利用してもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な医薬用担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示に従う組成物（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを含む）は、コロナウイルス感染症の処置または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
組成物は、他の予防または治療化合物と共に投与され得てもよい。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントであっても、または追加免疫（ブースター）であってもよい。本明細書で使用する場合、予防組成物（例えば、ワクチン）に言及する場合、「追加免疫（ブースター）」という用語は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。追加免疫（ブースター）（またはブースターワクチン）は、予防組成物を先に投与した後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの追加のブースター用量、例えば、対象が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のブースター用量を投与されるように、投与される。予防組成物の最初の投与と追加免疫との間（またはブースター用量の間）の投与時間は、限定するものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分 ３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であってもよい。例示的な実施形態では、予防的組成物の最初の投与と追加免疫との間の投与時間は、限定するものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であってもよい。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、組成物の第１用量を対象に対して投与してから少なくとも２８日後かつ第１用量から１年以内に投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内、例えば、対象の三角筋に投与される。
組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、さまざまな設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、さまざまな感染性疾患を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。
本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む医薬組成物である。
ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、組成物は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成要素を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、組成物はアジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。
ＲＮＡは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組合せなどの少なくとも１つの追加の活性物質を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリーであっても、または無菌かつパイロジェンフリーの両方であってもよい。医薬薬剤、例えば、ワクチン組成物の製剤化及び／または製造における全般的考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照によりその全体が本明細書に援用される）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的において、「有効成分」という表現は、概して、ＲＮＡワクチンまたはそれに含まれるポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするｍＲＮＡを指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、このような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡ）を、賦形剤及び／または１つ以上の補助成分と会合させるステップと、次いで必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらにはその組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、（１）安定性を高めるために、（２）細胞トランスフェクションを増大するために、（３）（例えば、デポ剤からの）持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）体内分布を変化させる（例えば、特定の組織もしくは細胞タイプに標的化する）ために、（５）コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増大するために、及び／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏでのコードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルを変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化される。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組合せが挙げられる。
投薬／投与
本明細書では、ヒト及び他の哺乳類におけるコロナウイルス感染症の予防及び／または治療のための組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬を提供する。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス感染からの予防的保護を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、コロナウイルス感染を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫エフェクター細胞のプライミングで、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで活性化し、次にこれを対象に注入（再注入）するために、使用される。
対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒトを含む）であってもよい。典型的には、対象とはヒト対象である。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。コロナウイルス抗原をコードするＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで発現及び翻訳されて抗原が産生され、次にこれが対象における免疫応答を刺激する。
コロナウイルスからの予防的保護は、本開示の組成物の投与後に達成され得る。免疫化組成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分であり得る（任意選択で１回の追加免疫が続く）。望ましいものではないが、感染した個体にある組成物を投与して治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。
コロナウイルス抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法を、本開示の態様で提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、１つのコロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する１つのｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含み、それにより、対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導し、対象内の抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、その抗原に対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象における抗抗原抗体力価よりも増大される。「抗抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用する場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象内の抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増大している。いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価よりも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増大している。
対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、本開示の他の態様で提供される。本方法は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含み、それにより、対象においてコロナウイルスに特異的な免疫応答を誘導し、この対象での免疫応答は、この組成物に対し２倍～１００倍の薬用量レベルで、コロナウイルスに対する従来のワクチンを接種した対象での免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し３倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１０倍～１０００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１００倍～１０００倍の薬用量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルスを中和する能力に対して試験する。他の実施形態では、ロバストなＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を用いて測定される。
本開示の他の態様は、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与して、対象においてコロナウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導することにより、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を引き出す方法を提供し、この対象における免疫応答は、コロナウイルスに対する従来のワクチンの予防有効量を接種した対象において誘導される免疫応答よりも２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍～１００倍の薬用量レベルで従来のワクチンの予防有効用量を接種した対象において誘導される。
また、本明細書では、第１の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを対象に投与することにより、コロナウイルスに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと同時製剤化または同時投与されない、方法を提供する。
組成物は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路で投与され得る。このような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することを、それを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び概況、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び薬用量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。ただし、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。いかなる特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルも、治療する障害、障害の重症度、用いる具体的化合物の活性、用いる具体的組成物、患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事、用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率、治療の期間、用いる具体的化合物と組合せでまたは同時に使用する薬物、ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めたさまざまな因子に依存する。
本明細書で提供されるように、有効量（例えば、治療用量）のＲＮＡは、本明細書で提供するように、２０μｇ程度の少量であり、例えば、単回投与または１０μｇを２回投与し得る。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、治療用量）は、１０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、治療用量）は、５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または、２５μｇ～３００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、治療用量（例えば、有効量）は、組成物の少なくとも１０μｇ及び２５μｇ未満である。いくつかの実施形態では、治療用量（例えば、有効量）は、組成物の少なくとも５μｇ及び２５μｇ未満である。例えば、有効量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇの総用量であってもよい。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇ（例えば、１０μｇ用量を２回）の総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６０μｇの総用量（例えば、３０μｇ用量を２回）である。いくつかの実施形態では、有効量は、７５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。
本明細書に記載のＲＮＡは、本明細書に記載の剤形、例えば、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）の剤形で製剤化され得る。
ワクチン有効性
本開示のいくつかの態様は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、コロナウイルス抗原に特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。
本明細書で使用する場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）コロナウイルスタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的において、「液性」免疫応答とは、抗体分子（例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む）によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性」免疫応答とは、Ｔ－リンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質と共に提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子と共にその表面に提示した細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のこのような分子の産生も引き起こす。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供する組成物を投与された対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価を測定することにより、特性評価される。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
さまざまな血清学的検査を使用して、コードされた目的の抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲ－ＣｏＶ－２ウイルス抗原、例えば、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクまたはＳタンパク質（そのドメインの）に対する抗体を測定し得る。これらの試験には、赤血球凝集阻害試験、補体結合試験、蛍光抗体試験、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）が含まれる。これらの各試験は、さまざまな抗体活性を測定する。例示的な実施形態では、プラーク減少中和試験、またはＰＲＮＴ（例えば、ＰＲＮＴ５０またはＰＲＮＴ９０）は、保護の血清学的相関物として使用される。ＰＲＮＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス中和の生物学的パラメーターを測定し、特定のクラスのウイルスの中で最も血清学的にウイルス特異的な試験であり、ウイルス感染からの保護の血清レベルとよく相関する。
ＰＲＮＴの基本設計では、試験管またはマイクロタイタープレートでウイルスと抗体の相互作用を行うことを可能にし、これによってウイルス感受性細胞、好ましくは哺乳類由来の細胞に混合物をプレーティングすることで、ウイルス感染性に対する抗体の影響を測定する。細胞は、子孫ウイルスの伝播を制限する半固体培地で覆われている。生産的な感染を開始する各ウイルスは、さまざまな方法で検出され得る局所的な感染領域（プラーク）を生成する。プラークを数え、ウイルスの開始濃度に戻って比較して、ウイルスの総感染力の低下率を決定する。ＰＲＮＴでは、通常、試験される血清試料は、標準化された量のウイルスと混合する前に段階希釈される。ウイルスの濃度は一定に保たれているため、感受性の高い細胞に添加して半固形培地をかぶせると、個々のプラークを識別して数えることができる。このようにして、ＰＲＮＴエンドポイント力価は、ウイルス活性の任意の選択されたパーセント減少で各血清試料に対して計算され得る。
ワクチンの免疫原性を評価することを目的とした機能アッセイでは、抗体滴定の血清試料希釈系列は、理想的には「血清防御」閾値力価未満で開始する必要がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に関しては、「血清防御」閾値力価は不明のままである。しかし、１：１０という血清陽性の閾値は、特定の実施形態では、血清保護閾値と見なすことができる。
ＰＲＮＴエンドポイント力価は、プラーク数の望ましい減少率を示す最後の血清希釈の逆数として表される。ＰＲＮＴ力価は、プラーク数の５０％以上の減少（ＰＲＮＴ５０）に基づいて計算できる。ＰＲＮＴ５０力価は、ワクチン血清に対してより高いカットオフ（例えば、ＰＲＮＴ９０）を使用する力価よりも優先され、滴定曲線の線形部分からより正確な結果を提供する。
ＰＲＮＴ力価を計算する方法にはいくつかある。力価を計算するための最も簡単で最も広く使用されている方法は、プラークを数え、最後の血清希釈の逆数として力価を報告して、入力プラークの逆滴定に基づく入力プラーク数の５０％超の減少を示すことである。いくつかの血清希釈からのカーブフィッティング法を使用すると、より正確な結果を計算できる場合がある。これに利用可能なさまざまなコンピューター分析プログラムがある（例えば、ＳＰＳＳまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、追加免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを定量するために使用してもよい。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、または少なくとも３ｌｏｇ増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～３ｌｏｇ増大される。例えば、対象に産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増大され得る。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、コロナウイルスに対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）とは、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。
いくつかの実施形態では対照は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗コロナウイルス抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、通常、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、組成物を、マウスモデルに投与してもよく、マウスモデルを中和抗体力価の誘導について評価してもよい。また、ウイルスチャレンジ研究も、本開示のワクチンの効果を評価するために使用してもよい。例えば、組成物をマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価してもよい。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」とは、科学的根拠に基づいた適切な治療及び所与の条件の治療に関与する医療従事者間の協力を規定する。それは、医師／臨床医がある特定のタイプの患者、疾患、及び臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、コロナウイルス感染、または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量の組成物を投与された対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または弱毒生もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与された対照の対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価と同等である。
ワクチン効果は、標準的な解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定することができる。ワクチン有効性は、ワクチン非接種試験コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種試験コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表してもよく、以下の式を用いてワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出することができる。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００；及び
有効性＝（１－ＲＲ）×１００
同様に、ワクチン有効性は標準的解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照）。ワクチンの有効性とは、ワクチン（高いワクチン効果を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく自然のフィールド条件下で、ワクチン自体にとどまらず、ワクチン接種プログラムの利益及び有害作用の本質的なバランスを評価し得る。ワクチン有効性はワクチンの有効性（効力）に比例するが、集団内の標的群がどの程度免疫化しているか、及び「実世界」の転帰に影響を及ぼすワクチンとは無関係な要因（例えば、入院、外来受診、または費用）による影響も受ける。例えば、レトロスペクティブなケースコントロール解析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較してもよい。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６０％である。例えば、組成物の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。
殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する固有の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、本開示の組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、対照よりも少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、有効量は、対照よりも少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量でも対象における殺菌免疫をもたらすのに十分であり得る。
検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、検出可能なレベルのコロナウイルス抗原を産生するのに十分である。
力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗コロナウイルス抗原）に特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、コロナウイルス抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００中和単位／ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗コロナウイルス抗原抗体力価は、対照よりも少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。
いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特性評価するために使用される。
対照とは、例えば、ワクチン接種されていない対象、または弱毒化生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であってもよい。
実施例１．第Ｉ相臨床試験
試験研究の設計と方法論
この研究は、健康で、かつ全ての適格要件を満たしている１８歳～５５歳の健常成人参加者を対象とした第１相無作為化オブザーバーブラインド試験である。この研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンの安全性、反応原性、及び免疫原性を評価するために使用する（配列番号９０；ＯＲＦは配列番号９１；配列番号９２をコードする；本明細書では「ｍＲＮＡワクチン」と称する）。全ての参加者は、スクリーニング期間、治療期間、及びフォローアップ期間に参加する。
ｍＲＮＡワクチンの３つの用量レベル（１０μｇ、３０μｇ、及び１００μｇ）（アーム１～３）、及び、ｍＲＮＡワクチンの１用量レベル（１００μｇ）（アーム５）を、それぞれ２回投与のレジメンで評価を行い、それらの用量で、２８日間隔で投与する。ｍＲＮＡワクチンの１回の投与レベル（１００μｇ）は、単回投与レジメンで評価する（アーム４）。約１２５名の参加者を、１：１：１：１：１の比率で無作為化して、治験薬（ＩＰ）を与えて、約２５名の参加者を無作為に各研究群に分ける。全ての研究アームは、並行して登録する。参加者は、１日目及び／または２９日目に、０．５ｍＬの筋肉内（ＩＭ）注射でＩＰを２回投与されるが、アーム４（ｍＲＮＡワクチンの単回投与）の参加者は、１日目にプラセボ注射を行い、２９日目にＩＰを注射する点が異なる。それぞれの注射は、０．５ｍＬの量を、三角筋に筋肉内注射する。投与スケジュールを以下に示す。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを使う非臨床試験では、結合抗体（ｂＡｂ）及び中和抗体（ｎＡｂ）応答、ならびにＴｈ１指向性ＣＤ４＋及びｍＲＮＡワクチンが誘発するＣＤ８＋応答を評価することにより免疫原性を評価した。ｍＲＮＡワクチンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスで免疫原性を示しており、このことは、ｂＡｂ応答と中和活性を実証している。Ｓ１またはＳ２ペプチドプールで再刺激したｍＲＮＡワクチン誘発ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、特に、より高い免疫原用量で、Ｔｈ１優性応答（インターフェロン－γ、インターロイキン－２、腫瘍壊死因子－αの産生）を示した。スパイク１とＳ２の組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質全体に及ぶペプチドプールを表している；これらのペプチドは、安定性を高めるために２つのプールに分割した。さらに、ｍＲＮＡワクチンは、Ｓ１ペプチドプールに対するロバストなＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導した。これらの結果は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＴｈ１指向性ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導したサイトカイン発現プロファイルを示す。これらのデータは、ｍＲＮＡワクチンの臨床的進歩を裏付けている。
ワクチン、用量、及び投与経路
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン（配列番号９０；ＯＲＦは配列番号９１；配列番号９２をコードする）は、４つの脂質（５０ｍｏｌ％ イオン化可能な脂質ヘプタデカン－９－イル８（（２－ヒドロキシエチル）（６オキソ６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）；１０ｍｏｌ％ １，２ジステアロイルｓｎグリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；３８．５ｍｏｌ％ コレステロール；及び、平均分子量が２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）を有する１－モノメトキシポリエチレングリコール－２，３－ジミリスチルグリセロール １．５ｍｏｌ％）からなるＬＮＰ中ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）分散液である。当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンは、注射用無菌液体として提供され、外観は白色からオフホワイトの分散液であり、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、８７ｍｇ／ｍＬのスクロースと１０．７ｍＭの酢酸ナトリウムを含む２０ｍＭトロメタモール（トリス）緩衝剤、ｐＨ ７．５に含まれている。
希釈剤は、０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水）注射、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）である。このＵＳＰグレードの０．９％ＮａＣｌまたは注射用生理食塩水は、無菌、非発熱性の等張溶液である。ｍＬあたり９ｍｇのＮａＣｌが含まれている。静菌剤、抗菌剤、防腐剤、または添加緩衝剤は含まれておらず、単回投与容器でしか供給されない。この溶液は、ｐＨ調整（ｐＨ５．３、範囲４．５～７．０）のための塩酸及び／または水酸化ナトリウムを含み得る。この物質は、ワクチンを、所望の濃度に希釈するために使用すべきである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンは、１日目と２９日目の２回のワクチン接種スケジュールで、三角筋へ筋肉内注射して投与を行い、投与の間は、少なくとも２８日間あける。各ワクチン接種には、注射用０．９％ＮａＣｌ（ＵＳＰ）で希釈した０．５ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンが含まれており、０．５ｍＬ用量ごとに、１０μｇ、３０μｇ、または１００μｇのｍＲＮＡワクチンが含まれる。
目的
主な目的は、ｍＲＮＡワクチン（配列番号９０；ＯＲＦは配列番号９１；配列番号９２をコードする）を２回投与するワクチン接種スケジュールを、２８日間隔で、３つの用量（１０μｇ、３０μｇ、または１００μｇ）で与える；及び、健康な成人に単回用量で１つの高用量レベル（１００μｇ）のｍＲＮＡワクチンを与えた場合の安全性と反応原性を評価することにある。
二次的目的は、中和抗体と結合抗体の力価またはレベルを評価することであり、３つの異なる投与スケジュールでのｍＲＮＡワクチンの免疫原性を評価することにある。
探索的目的は、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに特異的な細胞媒介性応答を評価すること；（２）体液性免疫応答の特徴をさらに決定すること；及び、（３）当該研究の期間内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した参加者の免疫応答の特徴決定を行うこと、である。
研究の全体的構成は、予定した研究施設での８回の診察：スクリーニング、１日目、８日目、２９日目（１ヶ月目）、３６日目、５７日目（２ヶ月目）、２０９日目（７ヶ月目）、及び３９４日目（１３ヶ月目）からなる。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスの存在を試験するために、１日目、２９日目、５７日目、２０９日目、及び３９４日目に、綿棒で試料を得る。参加者は、イムノアッセイで検出された抗ヌクレオカプシド抗体に関する後続の試験のために、スクリーニング時と、１日目、２９日目、５７日目、及び３９４日目に、血清を回収した。全ての参加者は、安全性と反応原性について観察を受け、ＩＰの最後の投与後の１２ヶ月を通して免疫原性に関する注射前後の血液検体を提供する。
免疫原性は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２ Ｓタンパク質、及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する血清結合抗体レベルを測定して測定する。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する血清中和抗体レベルは、偽ウイルス及び／または生ウイルス中和アッセイで測定する。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の血清学的マーカーの検査は、イムノアッセイで検出した抗ヌクレオカプシド抗体を測定して行う。
参加者からは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験のために、１、２９、５７、２０９、及び３９４日目に鼻咽頭（ＮＰ）試料も得た。参加者が、次のいずれかの兆候：ＣＤＣが定めたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の兆候または症状；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染が確認された個人への曝露；診察を要した有害事象（ＭＡＡＥ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示唆している場合には、逆転写酵素ＰＣＲを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を確認するために、ＮＰまたは鼻腔スワブ試料を得て、２４時間以内に、または可及的速やかに、研究の病気の診察または相談を行う。加えて、臨床情報を収集して、臨床症事例の重症度を評価する。
実施例２．中間解析結果
無作為化した参加者１０４名について中間解析を実施した。プロトコルごとの免疫原性分析では、研究用ワクチンを２回接種し、５７日目の診察で完了する８６名が参加しており、ベースライン時に抗ＮＰ抗体陰性、及びＲＴ－ＰＣＲ陰性であり、プロトコルに大きな偏差は無かった。安全性の追跡調査は、２回投与して１２７日（＞４ヶ月）後の中央値で行った。これまでにＳＡＥまたはＡＥＳＩは報告されておらず、及び、研究一時停止規則にも該当していない。５７日目の免疫原性の結果は、２８日間隔で、２回投与するｍＲＮＡ－１２８３の全ての用量レベル（１０、３０、及び１００μｇ）が、プロトタイプＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）のｍＲＮＡ－１２７３と比較して、同様の中和及び結合抗体力価またはレベルを誘導し、Ｂ．１．３５１（ベータ）変異体に対して同様の偽ウイルス中和抗体力価を誘導することを示している。特に発熱と悪寒に対する全身性の有害事象が、ｍＲＮＡ－１２７３と比較して高用量レベルのｍＲＮＡ－１２８３用量で頻繁に認められた。しかしながら、１０μｇのｍＲＮＡ－１２８３は、ｍＲＮＡ－１２７３よりも耐性が大きいようである。これらの結果は、ｍＲＮＡ－１２８３が、ｍＲＮＡ－１２７３よりも強力であり、より低い用量レベルで同様の有効性を達成し得ることを示している。結果を、以下の表１６及び１７にまとめる。

追加の配列
本明細書に記載の任意のｍＲＮＡ配列が５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることを理解されたい。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択してもよいが、その他の既知のＵＴＲ配列を使用してもよい。また、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡ構築物はさらに、ポリＡテール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含んでもよいことも理解のこと。さらに、本明細書に記載の多数のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列がシグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略されてもよいことを理解されたい。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３１）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号２）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１３２）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）
オープンリーディングフレームのいずれか１つ及び／または本明細書に記載の対応するアミノ酸配列は、シグナル配列を含んでもよいし、または除外してもよいことも理解されるべきである。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用されている主題に関し、参照によって本明細書に援用され、場合によってはそれが文書全体を包含することもある。
本明細書において、明細書中及び請求項中の「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。
また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されるとは限らない。
請求項及び上記明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「保有する」「有する」「含有する」「伴う」「保持する」「～から構成される」などはオープンエンドであること、すなわち後に続くものを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。
数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が示される場合、範囲の上端と下端との間の各値は、本明細書において具体的に企図され記載されている。
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３４８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８２９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１９、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (45)

  1. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも２つのドメイン、及び全長未満のスパイクタンパク質を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む、治療用量の組成物をヒト対象に対して投与する方法であって、前記ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子内にある、前記方法。
  2. 前記治療用量が、前記組成物の３０μｇである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記治療用量が、前記組成物の１０μｇである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記治療用量が、前記組成物の５０μｇである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記治療用量が、前記組成物の１００μｇである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記治療用量が、前記組成物の２．５μｇである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記治療用量が、前記組成物の少なくとも１０μｇかつ２５μｇ未満である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記治療用量が、前記組成物の少なくとも５μｇかつ３０μｇ未満である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記治療用量が、前記組成物の少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記方法が、前記対象に対して前記組成物を少なくとも２回投与することを含む、請求項３～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記組成物の第１の用量を前記対象に対して投与して少なくとも２８日後かつ前記第１用量の１年以内に、前記組成物の第２の用量を投与する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記組成物が、トリス緩衝剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  13. トリス緩衝剤を含む前記組成物が、スクロース及び酢酸ナトリウムをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記組成物が、７５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び５ｍＭ～１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭ～３０ｍＭのトリス緩衝剤を含み、任意選択で、前記組成物は、６～８のｐＨを有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記組成物が、８７ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び１０．７ｍＭの酢酸ナトリウムを含む約２０ｍＭのトリス緩衝剤を含み、任意選択で、前記組成物は、７．５のｐＨを有する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記組成物が、約０．５ｍｇ／ｍＬの前記ｍＲＮＡを含む請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記組成物を、前記対象の腕の筋肉内、任意選択で、三角筋に投与する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記融合タンパク質が、配列番号９２の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記融合タンパク質が、配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＯＲＦが、配列番号９１の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ＯＲＦが、配列番号９１のヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ｍＲＮＡが、配列番号９０の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ｍＲＮＡが、配列番号９０のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能なアミノ脂質、中性脂質、ステロール、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記脂質ナノ粒子が、４０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のステロール、及び１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記脂質ナノ粒子が、
    ４７ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、
    ４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、
    ４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１０．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、
    ５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１０ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、または
    ５１ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９．５ｍｏｌ％の中性脂質、３８．５ｍｏｌ％のステロール、及び１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記イオン化可能なアミノ脂質が、ヘプタデカン－９－イル８（（２ヒドロキシエチル）（６オキソ６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（化合物１）である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記中性脂質が、１，２ジステアロイルｓｎグリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、平均分子量２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）を有する１－モノメトキシポリエチレングリコール－２，３－ジミリスチルグリセロールである、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記対象の年齢が、１８～５４歳または５５歳以上である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記対象が、免疫不全症である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記対象が、慢性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記対象が、肥満、心疾患、糖尿病、及び肺疾患から任意選択で選択される基礎併存疾患を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  35. 脂質ナノ粒子内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメインをコードする用量のｍＲＮＡを含む組成物であって、前記用量は、少なくとも５μｇかつ２０μｇ未満である、前記組成物。
  36. 前記用量が、１０μｇである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 脂質ナノ粒子内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のドメインをコードする３０μｇ用量のｍＲＮＡを含む組成物。
  38. 前記ドメインが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ（Ｎ）末端ドメインを含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 前記ドメインが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 治療用量の請求項３５～３９のいずれか１項に記載の組成物を、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の前記ドメインに対する免疫応答を生成する有効量でヒト対象に対して投与することを含む、方法。
  41. 前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、２回投与後の少なくとも４５日目、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、少なくとも１，０００である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価のＧＭＴは、２回投与後の少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日後では、少なくとも１１０である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  43. 二重プロリン安定化変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを投与した第２の対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導される中和抗体力価と比較して、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均比（ＧＭＲ）は、２回投与後の少なくとも４５日目、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、１．０５である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記組成物の投与前の前記対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価と比較して、前記対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）に対して誘導された中和抗体力価の幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）は、２回投与後の少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日目では、少なくとも９０である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記組成物の投与前の前記対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価と比較して、２回投与して少なくとも４５日後、任意選択で、２回投与後の４５～１００日後の前記対象でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．３５１）に対して誘導された中和抗体力価のＧＭＦＲは、少なくとも８である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA48047A (fr) 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc Réduction ou élimination de réponses immunitaires à des protéines thérapeutiques administrées par voie non intraveineuse, par exemple par voie sous-cutanée
WO2023019309A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Monash University Vaccine compositions

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10121252A1 (de) 2001-04-30 2002-11-07 Christos C Zouboulis Behandlung der Akne
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
WO2009003222A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods for degrading toxic compounds
RU2524431C2 (ru) 2007-09-26 2014-07-27 Интрексон Корпорейшн Синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии
CA2904904A1 (en) 2007-12-11 2009-06-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
DK2459231T3 (en) 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
EP4043025A1 (en) 2011-06-08 2022-08-17 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
CN104519915A (zh) 2012-06-08 2015-04-15 夏尔人类遗传性治疗公司 肺部递送mRNA至非肺靶细胞
WO2014071963A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Biontech Ag Method for cellular rna expression
MX2015011947A (es) 2013-03-14 2015-12-01 Shire Human Genetic Therapies Metodos y composiciones para administrar anticuerpos codificados por arnm.
ES2795249T3 (es) 2013-03-15 2020-11-23 Translate Bio Inc Mejora sinérgica de la administración de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
EP3578663A1 (en) 2013-03-15 2019-12-11 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
SG11201510747RA (en) 2013-08-21 2016-03-30 Curevac Ag Method for increasing expression of rna-encoded proteins
ES2806575T3 (es) 2013-11-01 2021-02-18 Curevac Ag ARN modificado con propiedades inmunoestimuladoras disminuidas
CN105874072A (zh) 2013-12-30 2016-08-17 库瑞瓦格股份公司 人工核酸分子
CA2927254C (en) 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
PL3146924T3 (pl) 2015-09-24 2023-03-20 Medinice S.A. Krioaplikator do mało-inwazyjnej ablacji kardiochirurgicznej
EP4349404A2 (en) 2015-10-22 2024-04-10 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
CN116837052A (zh) 2016-09-14 2023-10-03 摩登纳特斯有限公司 高纯度rna组合物及其制备方法
US20200030432A1 (en) 2017-03-17 2020-01-30 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
CA3170150A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines

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