CN117580568A - 多价流感疫苗 - Google Patents

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CN117580568A
CN117580568A CN202280043350.9A CN202280043350A CN117580568A CN 117580568 A CN117580568 A CN 117580568A CN 202280043350 A CN202280043350 A CN 202280043350A CN 117580568 A CN117580568 A CN 117580568A
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antigen
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T·阿莱凡蒂斯
S·齐伍库拉
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Sanofi Aventis France
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Sanofi Aventis France
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Abstract

本申请提供了包含八个mRNA的八价流感疫苗组合物，每个mRNA包含编码不同流感抗原的开放阅读框。本申请还提供了用于递送所述mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。

Description

多价流感疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月18日提交的美国临时申请号63/212,523、2021年11月5日提交的美国临时申请号63/276,243、2021年11月5日提交的PCT国际申请号PCT/US2021/058250和2021年10月13日提交的欧洲专利申请号21315198.8的权益，出于所有目的通过引用以其整体而并入。
背景技术
基于信使RNA(mRNA)的疫苗为传统亚基疫苗提供了有希望的替代品，后者含有源自病原体的抗原蛋白。抗原蛋白通常是重组制备的，并且需要细菌发酵和/或细胞培养以及复杂的纯化。基于mRNA的疫苗允许在接种疫苗的受试者中从头表达复杂的抗原，这进而允许抗原的正确的翻译后修饰和呈递处于其自然构象的抗原。与传统技术不同，mRNA疫苗的制造不需要复杂且昂贵的细菌发酵、组织培养和纯化过程。此外，一旦建立，mRNA疫苗的制造方法便可以用于各种抗原，使得能够快速开发和部署mRNA疫苗。进一步地，mRNA疫苗是固有的安全递送载体，因为它们仅瞬时表达抗原并不整合到宿主基因组中。因为由mRNA编码的抗原在接种疫苗的个体中体内地产生，所以mRNA疫苗特别有效地引发体液免疫和T细胞介导的免疫两者。
目前获批的流感疫苗要么是活的减毒流感疫苗，要么是灭活的流感疫苗，通常是在细胞培养物或鸡蛋中生产的。此外，每年可能有多种流感毒株在人群中流行，因此单一流感疫苗难以提供针对多种毒株的强效保护。因此，对基于mRNA的流感疫苗存在需求，所述基于mRNA的流感疫苗包括针对多种流感毒株的基于mRNA的多价流感疫苗。
发明内容
本公开文本提供了一种流感疫苗组合物，其包含八个信使RNA(mRNA)，每个mRNA包含编码不同流感抗原的开放阅读框(ORF)。
在某些实施方案中，所述组合物包含八个mRNA，其编码(i)一种或多种血凝素(HA)抗原，(ii)一种或多种神经氨酸酶(NA)抗原，或(iii)至少一种HA抗原和至少一种NA抗原。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种编码甲型、乙型和/或丙型流感病毒抗原的mRNA。
在某些实施方案中，所述抗原是甲型流感病毒和乙型流感病毒的HA和/或NA抗原。
在某些实施方案中，所述甲型流感病毒的NA抗原选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11亚型。
在某些实施方案中，所述乙型流感病毒的HA和NA抗原来自乙型流感/山形谱系或乙型流感/维多利亚谱系。
在某些实施方案中，所述HA抗原和NA抗原选自由以下组成的组：H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N9、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2和H10N7亚型和/或B/山形谱系和B/维多利亚谱系。
在某些实施方案中，所述组合物包含一个编码H3 HA抗原的mRNA、一个编码H1 HA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/山形谱系的HA抗原的mRNA和一个编码来自乙型流感/维多利亚谱系的HA抗原的mRNA。
在某些实施方案中，所述组合物包含一个编码H3 HA抗原的mRNA、一个编码N2 NA抗原的mRNA、一个编码H1 HA抗原的mRNA、一个编码N1 NA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/山形谱系的HA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/山形谱系的NA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/维多利亚谱系的HA抗原的mRNA和一个编码来自乙型流感/维多利亚谱系的NA抗原的mRNA。
在某些实施方案中，所述ORF是经密码子优化的。
在某些实施方案中，所述mRNA分子包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(聚(A))序列。
在某些实施方案中，所述mRNA包含至少一种化学修饰。
在某些实施方案中，所述mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
在某些实施方案中，所述ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
在某些实施方案中，所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
在某些实施方案中，所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。
在某些实施方案中，所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
在某些实施方案中，所述mRNA在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。
在某些实施方案中，所述LNP包含至少一种阳离子脂质。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质可生物降解。在某些实施方案中，所述阳离子脂质不可生物降解。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质可裂解。在某些实施方案中，所述阳离子脂质不可裂解。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。
在某些实施方案中，所述LNP进一步包含聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。
在某些实施方案中，所述LNP包含：
摩尔比在35％至55％之间的阳离子脂质；
摩尔比在0.25％与2.75％之间的聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质；
摩尔比在20％与45％之间的胆固醇基脂质；和
摩尔比在5％与35％之间的辅助脂质，
其中所有摩尔比均相对于所述LNP的总脂质含量。
在某些实施方案中，所述LNP包含：
摩尔比为40％的阳离子脂质，
摩尔比为1.5％的PEG化的脂质，
摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质，和
摩尔比为30％的辅助脂质。
在某些实施方案中，所述PEG化的脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
在某些实施方案中，所述基于胆固醇的脂质是胆固醇。
在某些实施方案中，所述辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。
在某些实施方案中，所述LNP包含：
摩尔比为40％的阳离子脂质，其选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；
摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；
摩尔比为28.5％的胆固醇；和
摩尔比为30％的DOPE。
在某些实施方案中，所述LNP的平均直径为30nm至200nm。在某些实施方案中，所述LNP的平均直径为80nm至150nm。
在某些实施方案中，所述流感疫苗组合物包含1mg/mL至10mg/mL的LNP。
在某些实施方案中，所述LNP包含1至20个mRNA分子。在某些实施方案中，所述LNP包含5-10个或6-8个mRNA分子。
在某些实施方案中，所述LNP包含两个或更多个mRNA，其中每个mRNA编码不同的流感抗原。
在某些实施方案中，所述组合物包含八个LNP，其中每个LNP包含编码不同流感抗原的mRNA。
在某些实施方案中，所述组合物配制用于肌内注射。
在某些实施方案中，所述组合物包含磷酸盐缓冲盐水。
在一个方面，本公开文本提供了一种在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的上述流感疫苗组合物。
在一个方面，本公开提供了一种预防流感感染或减轻流感感染的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的上述流感疫苗组合物。
在某些实施方案中，所述流感疫苗组合物引发针对一种或多种季节性和/或大流行性流感毒株的免疫应答。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用一剂或多剂的所述流感疫苗组合物，每剂包含约1μg至约250μg mRNA。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用一剂或多剂的所述流感疫苗组合物，每剂包含约2.5μg、5μg、15μg、45μg或135μg mRNA。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者以2-6周、任选地4周的间隔施用两剂的所述流感疫苗组合物。
在另一个方面，本公开文本提供了上述流感疫苗组合物用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用的药物的用途。
在某些实施方案中，所述流感疫苗组合物用于在治疗有需要的受试者中使用。
在另一个方面，本公开文本提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含含有单次使用或多次使用剂量的上述组合物的容器，任选地其中所述容器是小瓶或者预填充针筒或注射器。
在某些实施方案中，所述流感抗原包含具有从机器学习模型鉴定或设计的分子序列的流感病毒HA抗原和/或流感病毒NA抗原。
附图说明
图1A是一对图，其示出了人红细胞生成素(hEPO)在用hEPO mRNA的各种LNP配制品处理的小鼠中的表达。小图a)：与MC3相比的LNP配制品“脂质A”和“脂质B”。条表示平均值和标准差。小图b)：用阳离子脂质OF-02制备的配制品。PEG：DMG-PEG2000。Cholest：胆固醇。“脂质A”：除非另有指示，否则LNP组合物含有OF-02、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。“脂质B”：LNP组合物含有cKK-E10、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图1B是一对图，其示出了hEPO在使用LNP配制品脂质A和脂质B的小鼠和非人灵长类动物(NHP)中的表达。
图2A和图2B是一对图，其显示具有编码毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)(CA09)的血凝素(HA)的mRNA的脂质A和脂质B LNP配制品诱导稳健的功能性抗体(图2A)，并且当用流感病毒的大流行毒株激发时，保护小鼠免于死亡或严重体重减轻(超过20％)(图2B)。在研究第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第92天和第107天取的血清样品的血凝素抑制(HAI)效价报告为log10。条是几何平均值和几何标准差。在用4LD50的A/比利时/2009(H1N1)(Belgium09)鼻内激发(第93天)之后测量每日体重。体重呈现为从激发当天开始减轻的体重百分比。对减轻超过20％的起始体重的小鼠实施安乐死，并且在感染后14天(第107天)对所有小鼠实施安乐死。rHA：重组血凝素。AF03：水包油乳液佐剂。稀释剂＝PBS。LLOQ＝定量下限。1/40＝1/40最低目标，其是指与健康成年人的流感感染或疾病的风险降低50％相关的HAI抗体效价(Coudeville等人,BMC Med Res Methodol.(2010)10:18)。图2B中的虚线＝相对于在激发当天的体重体重减轻20％的截止线。
图3A和图3B是一对图，其显示用脂质A LNP配制的A/密歇根/45/2015(Mich15)神经氨酸酶(NA)mRNA诱导稳健的功能性抗体(图3A)，并且当用流感病毒的大流行毒株激发时，保护小鼠免于体重减轻和死亡(图3B)。在研究第14天、第28天、第42天、第56天、第88天和第114天取的血清样品的神经氨酸酶抑制(NAI)效价报告为log10。在用4LD50的Belgium09鼻内激发(对于一剂组为第89天，或对于两剂组为第117天)之后，观察每日体重。体重呈现为从激发当天开始减轻的体重百分比。对减轻超过20％的起始体重的小鼠实施安乐死，并且在感染后14天(对于1剂组为第103天，或对于2剂组为第131天)对所有小鼠实施安乐死。条是平均值和标准差。图3A中的上虚线＝定量上限。图3A中的下虚线＝定量下限。图3B中的虚线＝相对于在激发当天的体重体重减轻20％的截止线。所给药的mRNA：编码Mich15 NA的0.4或0.016μg mRNA。对照：编码hEPO的0.6μg mRNA或稀释剂(PBS)。
图4是这样的图，其显示具有CA09 HA mRNA(10μg)的脂质A和脂质B LNP配制品在食蟹猴中诱导稳健的功能性抗体。在研究第0天、第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的HAI效价报告为log2。
图5A-图5C示出了编码流感病毒A/新加坡/INFIMH160019/2016(Sing16；H3N2)HA血凝素的MRT1400 mRNA。图5A：HA抗原的野生型(WT)基因和经密码子优化的基因(MRT10279)的比对。图5B：mRNA的结构。图5C：mRNA的序列。
图6是一对图，其显示具有MRT1400或NA mRNA的脂质A和脂质B LNP配制品在小鼠中诱导稳健的功能性抗体。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。左小图：在研究第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的HAI效价报告为log10。右小图：在研究第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的NAI效价报告为log10。条是几何平均值和几何标准差。虚线＝定量下限。
图7A是这样的图，其显示具有MRT 1400的脂质A和脂质B LNP配制品在NHP中诱导稳健的功能性抗体。在研究第0天、第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的HAI效价报告为log2。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。条是平均值和标准差。上虚线＝1/40最低目标。下虚线＝检测下限。
图7B和图7C是一对图，其显示在以下四种剂量水平下在食蟹猴中，含有MRT1400mRNA的脂质A LNP配制品(MRT5400)诱导功能性抗体(图7B)和稳健的ELISA效价(图7C)：15、45、135和250μg的mRNA。在研究第0天、第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的HAI和ELISA效价报告为log2。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。条是平均值和标准差。虚线＝1/40最低目标。
图8A和图8B是一组图，其示出了在三种剂量水平组(250μg、135μg和45μg的mRNA)中，在用脂质A LNP配制品MRT5400第二次疫苗接种之后食蟹猴的T细胞细胞因子应答。通过ELISPOT测定在第42天在外周血单个核细胞(PMBC)中评估通过用重组HA(rHA)蛋白(左小图)或合并的肽(右小图)再刺激诱导的IFN-γ和IL-13。分泌IFN-γ(图8A)或IL-13(图8B)的PBMC的频率计算为每百万PBMC的斑点形成细胞(SFC)。每个符号表示单独的样品，并且条表示标准差。
图9A是一对图，其显示含有经修饰的和未经修饰的CA09 HA mRNA的脂质A LNP配制品是相当的，如通过接种疫苗的小鼠中的HAI效价所指示的。在研究第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的HAI效价报告为log2。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。条是平均值和标准差。上虚线＝1/40最低目标。下虚线＝定量下限。
图9B是一对图，其显示含有经修饰的和未经修饰的CA09 HA mRNA的脂质A LNP配制品是相当的，如通过小鼠中的ELISA效价所指示的。在研究第14天、第28天、第42天和第56天取的血清样品的总IgG ELISA效价报告为log10。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。虚线＝定量下限。
图10A和图10B是一对图，其显示在0.4μg的总mRNA的剂量下在Balb/c小鼠中，具有CA09 HA mRNA和Sing16 HA mRNA的二价脂质A LNP配制品诱导稳健的功能性抗体，如通过HAI效价(CA09(图10A)和Sing16(图10B))所评估的。将0.4μg mRNA作为共包封的mRNA-LNP配制品给药，或者将每种HA mRNA分开施用，其中每条腿施用0.2μg。还将每种HA mRNA与非编码mRNA一起共包封成配制品，以控制包装到LNP中的总mRNA。稀释剂组接受mRNA-LNP稀释剂缓冲液。报告在研究第-2天(基线)、第14天、第28天和第42天取的血清样品的HAI效价。图10B仅示出了研究第-2天(来自合并的血清的基线)和第42天。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。条是几何平均值和几何标准差。虚线＝定量下限。
图11示出了mRNA-LNP配制品的功能验证。小图(a)是这样的图，其示出了萤火虫(FF)萤光素酶在BALB/c小鼠中的表达：在小鼠(n＝4)中通过IM途径注射单次剂量的萤光素酶FF mRNA-LNP(5、1、0.1、0.05μg)。在整个动物成像(使用IVIS Spectrum(Perkin Elmer)记录生物发光强度)时注射萤光素(3mg)。采集注射后6、24、48和72h的整个动物平均辐射的图像。在图中示出了为Luc mRNA-LNP的1、0.5、0.1和0.05μg剂量施用而记录的辐射率。小图(b)示出了在6至72小时的指示发光总通量的整个动物图像。示出了接受0.1μg剂量的FF-LNP的小鼠(n＝4)的组中的发光总通量。小图(c)示出了hEPO在BALB/c小鼠中的表达。在BALB/c小鼠中通过IM途径注射单次剂量的hEPO mRNA-LNP(0.1μg)。使用ELISA在施用后6小时和24小时在血清中定量hEPO表达。条表示平均值和标准差。小图(d)示出了hEPO在NHP中的表达。在食蟹猴中通过IM途径注射单次剂量的hEPO mRNA-LNP(10μg)。使用ELISA在施用后6、24、48、72和96小时在血清中定量hEPO表达。条表示平均值和标准差。
图12示出了HA mRNA-LNP疫苗在小鼠中的血清学评价。将BALB/c小鼠(n＝8/组)用2、0.4、0.08和0.016μg的Cal09 HA mRNA-LNP或Sing16 HA mRNA-LNP IM免疫两次，间隔4周。示出了针对CA09(Cal09)H1N1流感病毒重组HA(左小图)和Sing16H3N2流感病毒重组HA(右小图)为在第14天、第28天、第42天、第56天采集的血清而记录的ELISA效价。
图13示出了HA mRNA-LNP疫苗在小鼠中的血清学评价。将BALB/c小鼠(n＝8/组)用2、0.4、0.08和0.016μg的CA09 HA mRNA-LNP或Sing16 HA mRNA-LNP IM免疫两次，间隔4周。示出了针对CA09 H1N1流感病毒(左小图)和Sing16 H3N2流感病毒(右小图)而记录的Log10HAI效价。
图14示出了NA mRNA-LNP疫苗在小鼠中的血清学评价。将BALB/c小鼠(n＝8/组)用2、0.4、0.08和0.016μg的Mich15 NA mRNA-LNP或Sing16 NA mRNA-LNP IM免疫两次，间隔4周。示出了针对Mich15 N1流感病毒重组NA(左小图)和Sing16 N2病毒重组NA(右小图)为在第0天、第14天、第28天、第42天、第56天采集的血清而记录的总IgG效价。
图15示出了NA mRNA-LNP疫苗在小鼠中的血清学评价。将BALB/c小鼠(n＝8/组)用2、0.4、0.08和0.016μg的Mich15 NA mRNA-LNP或Sing16 NA mRNA-LNP IM免疫两次，间隔4周。示出了针对Mich2015(N1):A/野鸭/瑞典/2002(H6)嵌合流感病毒(左小图)和Sing16(N2):A/野鸭/瑞典/2002(H6)嵌合病毒(右小图)为血清而记录的Log10NAI(ELLA)效价。
图16A和图16B示出了在致死A/比利时/2009H1N1病毒激发之后，CA09 HA mRNA-LNP疫苗在小鼠中的保护功效。小鼠(n＝8)在第0天和第28天接受两次IM剂量的CA09 HAmRNA-LNP(每次0.4μg)。对照动物在第0天和第28天接受两次IM剂量的稀释剂。图16A示出了在研究第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第92天和第107天取的血清样品的报告为Log10的HAI效价。图16B示出了在第93天用4LD50的A/比利时/2009H1N1毒株激发之后的每日体重。体重呈现为从激发当天开始减轻的体重百分比。单独的线表示每只动物。
图17A-图17B示出了在致命A/比利时/2009H1N1病毒激发之后，单次剂量的未经修饰的Mich15 NA mRNA-LNP在小鼠中的保护功效。通过IM途径为小鼠(n＝16)注射0.4μg或0.016μg的Mich15 NA mRNA-LNP。一半小鼠仅在研究第0天接受一次注射(1剂)，而另外一半(2剂)接受在研究第0天和第28天给予的两次注射。对照动物在第0天和第28天接受两次IM剂量的hEPO mRNA-LNP(0.6μg)。图17A示出了在研究第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第88天和第114天取的血清样品的报告为Log10的NAI效价。图17B示出了在第89天(对于单剂组)和第117天(第二剂后89天)(对于两剂组)用4LD50的Belgium09 H1N1鼻内激发之后的每日体重变化。体重呈现为从激发当天开始减轻的体重百分比。单独的线表示每只动物。
图18示出了HA Sing16 HA mRNA-LNP疫苗在NHP中的血清学评价。通过IM途径为食蟹猴(n＝6/组)注射两次15、45或135μg的Sing16 HA mRNA-LNP，间隔4周。在第-6天、第14天、第28天、第42天和第56天采集血清样品。示出了针对Sing16病毒的重组HA蛋白的Log10IgG效价。
图19A和图19B示出了HA Sing16 HA mRNA-LNP疫苗在NHP中的血清学评价。通过IM途径为食蟹猴(n＝6/组)注射两次15、45或135μg的Sing16 HA mRNA-LNP，间隔4周。在第0天、第14天、第28天、第42天和第56天采集血清样品。示出了针对Sing2016病毒的Log10 HAI效价(图19A)和Log10微量中和(MN)效价(图19B)。
图20A和图20B示出了在用Sing16 HA mRNA-LNP疫苗接种的NHP中的T细胞应答。通过IM途径为食蟹猴(n＝6/组)注射两次45、135或250μg的Sing16 HA mRNA-LNP，间隔4周。通过ELISPOT在第42天在用代表整个HA开放阅读框的肽合并物体外刺激的PBMC中测定T细胞。示出了计算为每百万PBMC的斑点形成细胞(SFC)的分泌IFN-γ(图20A)或IL-13(图20B)的PBMC的应答。每个符号表示单独的样品，并且条表示组的几何平均值。
图21示出了在用Sing16 HA mRNA-LNP疫苗接种的NHP中在第180天记忆B细胞的Sing16 H3特异性IgG的分泌。通过IM途径为食蟹猴(n＝6/组)注射两次15或45μg的Sing16HA mRNA-LNP，间隔4周。使用人IgG单色记忆B细胞ELISPOT试剂盒(目录号NC1911372，CTL)来测量Sing16/H3特异性和总IgG+抗体分泌细胞(ASC)。通过使用由试剂盒提供的刺激混合物在第180天收集的PBMC中进行MBC到ASC的分化。计算每只动物的每百万PBMC的IgG+ASC的数量和Sing16/H3特异性ASC的数量，并且示出了抗原特异性ASC的频率。
图22示出了流感疫苗的二价组合在小鼠中的递送。将BALB/c小鼠(n＝8/组)用总量为0.4μg的共包封的mRNA转录物的二价组合(1:1wt/wt，每条腿一半体积)或0.2μg的每种单价物(其分开配制并且免疫不同的腿)IM免疫两次，间隔4周。在第0天、第14天、第28天、第42天采集的血清中针对相应的病毒测试构成为CA09 HA mRNA-LNP、Sing16 HA mRNA-LNP的H1H3组合；Sing16 HA mRNA-LNP和Sing16 NA mRNA-LNP的H3N2组合；以及Mich15 NA mRNA-LNP和Perth09 NA mRNA-LNP的N1N2组合。小图(a)示出了针对CA09 H1N1流感病毒和Sing2016 H3N2而记录的HAI效价。小图(b)示出了分别针对Sing2016 H3N2和A/野鸭/瑞典/2002(H6)嵌合流感病毒以及H6N2 A/佩斯/09病毒F1919D(N2)病毒而记录的HAI和NAI效价。小图(c)示出了针对Mich15(N1):A/野鸭/瑞典/2002(H6)嵌合流感病毒和H6N2 A/佩斯/09病毒F1919D(N2)病毒而记录的NAI效价。
图23示出了流感疫苗的四价组合在NHP中的递送。将食蟹猴(n＝6/组)用总量为10μg的共包封的mRNA转录物的四价组合(1:1:1:1wt/wt)IM免疫两次，间隔4周。H2H3N1N2组合由CA09 HA mRNA、Sing16 HA mRNA、Mich15 NA mRNA和Perth09NA mRNA组成。H1H3组合构成为CA09 HA mRNA、Sing16 HA mRNA和2x非编码mRNA(ncmRNA)；H3N2组合由Sing16 HA mRNA和Perth09 NA mRNA和2x非编码mRNA组成。N1N2组合由Mich15 NA mRNA、Perth09 NA mRNA-LNP和2x非编码mRNA组成。H1由CA09 HA mRNA和3x非编码mRNA组成。H3由Sing16 HA mRNA和3x非编码mRNA组成。N1由Mich15 NA mRNA和3x非编码mRNA组成。N2由Perth09 NA mRNA和3x非编码mRNA组成。在第0天、第14天、第28天、第42天采集的血清中针对相应的病毒测试抑制效价。小图(a)示出了针对CA09 H1N1流感病毒和Sing16 H3N2而记录的HAI效价。小图(b)示出了针对Mich15(N1):A/野鸭/瑞典/2002(H6)嵌合流感病毒和H6N2佩斯/09病毒F1919D(N2)病毒而记录的NAI效价。
图24描绘了这样的图，其示出了人红细胞生成素(hEPO)在用hEPO mRNA的各种LNP配制品处理的小鼠中的表达。示出了LNP配制品“脂质A”、“脂质B”、“脂质C”、“脂质D”和“脂质E”。条表示平均值和标准差。LNP组合物含有阳离子脂质、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图25描绘了这样的图，其示出了hEPO在用hEPO mRNA的各种LNP配制品处理的非人灵长类动物(NHP)中的表达。示出了LNP配制品“脂质A”、“脂质B”、“脂质C”、“脂质D”和“脂质E”。条表示平均值和标准差。LNP组合物含有阳离子脂质、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图26描绘了这样的图，其示出了在注射HA mRNA的各种LNP配制品后的第28天和第42天的HAI效价。示出了LNP配制品“脂质A”、“脂质B”、“脂质C”、“脂质D”和“脂质E”。条表示平均值和标准差。LNP组合物含有阳离子脂质、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图27描绘了这样的图，其示出了在注射HA mRNA的各种LNP配制品后的第28天和第42天的Cal09 H1 HAI效价。示出了LNP配制品“脂质A”、“脂质B”、“脂质C”、“脂质D”和“脂质E”。条表示平均值和标准差。LNP组合物含有阳离子脂质、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图28描绘了这样的图，其示出了在注射HA mRNA的各种LNP配制品后的第28天和第42天的Sing16 H3 HAI效价。示出了LNP配制品“脂质A”、“脂质B”、“脂质C”、“脂质D”和“脂质E”。条表示平均值和标准差。LNP组合物含有阳离子脂质、DMG-PEG2000、胆固醇和DOPE，按此顺序的摩尔比为40:1.5:28.5:30。
图29描绘了向小鼠施用的四价和八价mRNA-LNP疫苗对4种不同流感毒株的HAI效价。
图30描绘了向雪貂施用的四价和八价mRNA-LNP疫苗对4种不同流感毒株的HINT值。
图31描绘了向小鼠施用的四价和八价mRNA-LNP疫苗对4种不同流感毒株的NAI效价。
图32描绘了向雪貂施用的四价和八价mRNA-LNP疫苗对4种不同流感毒株的NAI效价。在第二剂疫苗后第20天(D20)获得样品。
图33描绘了向雪貂施用的四价和八价mRNA-LNP疫苗对4种不同流感毒株的NAI效价。在第二剂疫苗后第42天(D42)获得样品。
具体实施方式
本公开文本提供了用于体内递送mRNA疫苗的新型脂质纳米颗粒(LNP)配制品以及制备所述疫苗的方法。LNP由以下四种脂质的混合物制成：阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)缀合的脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。LNP包封mRNA分子。所包封的mRNA分子可以由天然存在的核糖核苷酸、经化学修饰的核苷酸或其组合组成，并且可以各自或共同编码一种或多种蛋白质。
诸位发明人已经通过筛选脂质组分的组合文库发现了本发明的配制品。本发明的LNP包封并保护mRNA有效载荷免于降解，并且促进所包封的mRNA的细胞摄取。本文所述的LNP具有增强的转染效率，促进mRNA的内体逃逸，并且因此当与在文献中所述的工业配制品相比时，具有改善的效力，如通过增强的体内和体外表达所证明的。例如，与已知的LNP例如三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(亦称DLin-MC3-DMA或MC3；Semple等人,Nat Biotechnol.(2010)28:172-6)或二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(亦称L319；Maier等人,Mol Ther.(2013)21(8):1570-8)相比，本文公开的LNP具有优异的稳定性和/或效力概况。如下文进一步所述的，当在体内递送时，包封编码hEPO的mRNA的本发明的配制品在6小时和24小时导致高水平的在血液中循环的红细胞生成素，其中相对于工业标准品MC3 LNP配制品，增加高达12倍。类似地，在鼠和非人灵长类动物模型两者中，已经在其他mRNA(如编码流感抗原的那些)的情况下发现了高效力。
如本文配制的mRNA疫苗可以用于诱导平衡的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫两者。因为本发明的LNP配制品的优势是不具有序列特异性，所以可以使用这些配制品来递送编码各种抗原的mRNA，允许在流行或大流行情况下进行快速部署。进一步地，本发明的LNP配制的mRNA疫苗具有高度免疫原性，并且因此提供了显著的剂量节省可能性。
I.脂质纳米颗粒(LNP)
本公开文本的LNP包含四类脂质：(i)可电离的脂质(例如，阳离子脂质)；(ii)PEG化的脂质；(iii)基于胆固醇的脂质；和(iv)辅助脂质。
A.可电离的脂质
可电离的脂质促进mRNA包封，并且可以是阳离子脂质。阳离子脂质在低pH下提供带正电荷的环境，以促进带负电荷的mRNA药物的有效包封。
在一些实施方案中，阳离子脂质是OF-02：
OF-02是OF-Deg-Lin的不可降解的结构类似物。OF-Deg-Lin含有可降解的酯键联以连接二酮哌嗪核和双不饱和尾，而OF-02含有不可降解的1,2-氨基-醇键联以连接相同的二酮哌嗪核和双不饱和尾(Fenton等人,Adv Mater.(2016)28:2939；美国专利10,201,618)。本文的示例性LNP配制品脂质A含有OF-2。
在一些实施方案中，阳离子脂质是cKK-E10(Dong等人,PNAS(2014)111(11):3955-60；美国专利9,512,073)：
本文的示例性LNP配制品脂质B含有cKK-E10。
在一些实施方案中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(2-(4-(2-((3-(双((Z)-2-羟基十八-9-烯-1-基)氨基)丙基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基癸基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式III：
本文的示例性LNP配制品脂质C含有GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1。脂质C具有与脂质A或脂质B相同的组成，如果没有阳离子脂质的差异的话。
在一些实施方案中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(2-(4-(2-((4-(双(2-羟基癸基)氨基)丁基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基十二基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式IV：
本文的示例性LNP配制品脂质D含有GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10。脂质D具有与脂质A或脂质B相同的组成，如果没有阳离子脂质的差异的话。
在一些实施方案中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(2-(4-(2-((3-(双(2-羟基十四基)氨基)丙基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基十二基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式V：
本文的示例性LNP配制品脂质E含有GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。脂质E具有与脂质A或脂质B相同的组成，如果没有阳离子脂质的差异的话。
阳离子脂质GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(III)、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(IV)和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(V)可以根据方案1所述的一般程序合成：
方案1：式(III)、(IV)和(V)的脂质的一般合成方案
在某些实施方案中，所述阳离子脂质是MC3，其具有式VI：
在一些实施方案中，所述阳离子脂质是SM-102(9-十七烷基8-{(2-羟基乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}辛酸酯)，其具有式VII：
在一些实施方案中，所述阳离子脂质是ALC-0315[(4-羟基丁基)氮杂二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，其具有式VIII：
在一些实施方案中，所述阳离子脂质可选自包括以下的组：[ckkE10]/[OF-02]、[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基]4-(二甲基氨基)丁酸酯(D-Lin-MC3-DMA)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLin-DMA)；二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；9-十七烷基8-{(2-羟基乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸酯(SM-102)；(4-羟基丁基)氮杂二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；[3-(二甲基氨基)-2-[(Z)-十八碳-9-烯酰基]氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯(DODAP)；2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-[2-[二(十七烷基)氨基]-2-氧代乙基]戊酰胺(DOGS)；[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3-基]N-[2-(二甲基氨基)乙基]氨基甲酸酯(DC-Chol)；四(8-甲基壬基)3,3',3”3”'-(((甲基氮杂二基)双(丙-3,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸酯(306Oi10)；癸基(2-(二辛基氨基)乙基)磷酸酯(9A1P9)；乙基5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸酯(A2-Iso5-2DC18)；双(2-(十二烷基二硫烷基)乙基)3,3'-((3-甲基-9-氧代-10-氧杂-13,14-二硫杂-3,6-二氮杂二十二烷基)氮杂二基)二丙酸酯(BAME-O16B)；1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)；3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(cKK-E12)；六(辛-3-基)9,9',9”,9”',9””,9””'-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮杂二基))三(丙-3,1-二基))三(氮杂三基))六壬酸酯(FTT5)；((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁-4,1-二基))双(氮杂三基))四(乙-2,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)；TT3；N1,N3,N5-三(3-(十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；十七烷-9-基8-[(2-羟基乙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基]辛酸酯(脂质5)；以及其组合。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质可生物降解。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质不可生物降解。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质可裂解。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质不可裂解。
阳离子脂质在Dong等人(PNAS.111(11):3955-60.2014)；Fenton等人(AdvMater.28:2939.2016)；美国专利号9,512,073；和美国专利号10,201,618中进一步详细描述，其中每项专利均并入本文作为参考。
B.PEG化的脂质
PEG化的脂质组分提供了对纳米颗粒的粒度和稳定性的控制。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且提供用于增加脂质-核酸药物组合物的循环寿命并增加其至靶组织的递送的手段(Klibanov等人,FEBS Letters 268(1):235-7.1990)。可以选择这些组分以在体内快速交换出药物组合物(参见例如，美国专利号5,885,613)。
所考虑的PEG化的脂质包括但不限于长度长达5kDa的聚乙二醇(PEG)链，其共价连接至具有C6-C20(例如，C8、C10、C12、C14、C16或C18)长度的一条或多条烷基链的脂质，如衍生化的神经酰胺(例如，N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)](C8 PEG神经酰胺))。在一些实施方案中，PEG化的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEG)；或1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-聚乙二醇(DSG-PEG)、PEG-DAG；PEG-PE；PEG-S-DAG；PEG-S-DMG；PEG-cer；PEG-二烷氧基丙基氨基甲酸酯；2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)；及其组合。
在某些实施方案中，PEG具有高分子量，例如2000-2400g/mol。在某些实施方案中，PEG是PEG2000(或PEG-2K)。在某些实施方案中，本文的PEG化的脂质是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DLPE-PEG2000、DSG-PEG2000、C8 PEG2000或ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。在某些实施方案中，本文所述PEG化的脂质是DMG-PEG2000。
C.基于胆固醇的脂质
胆固醇组分为纳米颗粒内的脂质双层结构提供了稳定性。在一些实施方案中，LNP包含一种或多种基于胆固醇的脂质。合适的基于胆固醇的脂质包括例如：DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、l,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人,BiochemBiophys Res Comm.(1991)179:280；Wolf等人,BioTechniques(1997)23:139；美国专利5,744,335)、咪唑胆固醇酯(“ICE”；WO 2011/068810)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、β-谷甾醇、谷甾烷醇、岩藻甾醇、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、麦角甾醇；链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)；羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)；7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)；二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)；酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)；Lathosterol(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)；薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)；菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)；菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)；24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)；胆甾烯基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)；胆甾烯基油酸酯；胆甾烯基硬脂酸酯和胆固醇的其他修饰形式。在一些实施方案中，在LNP中使用的基于胆固醇的脂质是胆固醇。
D.辅助脂质
辅助脂质增强了LNP的结构稳定性，并且帮助LNP在内体中逃逸。它改善了mRNA药物有效载荷的摄取和释放。在一些实施方案中，辅助脂质是两性离子脂质，其具有用于增强药物有效载荷的摄取和释放的促融合特性。辅助脂质的例子是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DEPE)；以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPOC)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；DMPC、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DLPC)；1,2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)；和1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DLPE)。
其他示例性辅助脂质是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、鞘磷脂、神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其组合。在某些实施方案中，所述辅助脂质是DOPE。在某些实施方案中，所述辅助脂质是DSPC。
在各种实施方案中，本发明的LNP包含(i)选自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10或GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的阳离子脂质；(ii)DMG-PEG2000；(iii)胆固醇；和(iv)DOPE。
E.脂质组分的摩尔比
上述组分的摩尔比对于LNP在递送mRNA中的有效性是重要的。阳离子脂质、PEG化的脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质的摩尔比是A:B:C:D，其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，在LNP中阳离子脂质相对于总脂质的摩尔比(即，A)是35％-55％，如35％-50％(例如，38％-42％，如40％，或45-50％)。在一些实施方案中，PEG化的脂质组分相对于总脂质的摩尔比(即，B)是0.25％-2.75％(例如，1％-2％，如1.5％)。在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质相对于总脂质的摩尔比(即，C)是20％-50％(例如，27％-30％，如28.5％，或38％-43％)。在一些实施方案中，辅助脂质相对于总脂质的摩尔比(即，D)是5％-35％(例如，28％-32％，如30％，或8％-12％，如10％)。在一些实施方案中，(PEG化的脂质+胆固醇)组分具有与辅助脂质相同的摩尔量。在一些实施方案中，LNP所含有的阳离子脂质与辅助脂质的摩尔比大于1。
在某些实施方案中，本公开文本的LNP包含：
摩尔比为35％至55％或40％至50％的阳离子脂质(例如，摩尔比为35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％或55％的阳离子脂质)；
摩尔比为0.25％至2.75％或1.00％至2.00％的聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质(例如，摩尔比为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％或2.75％的PEG化的脂质)；
摩尔比为20％至50％、25％至45％或28.5％至43％的基于胆固醇的脂质(例如，摩尔比为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的基于胆固醇的脂质)；和
摩尔比为5％至35％、8％至30％或10％至30％辅助脂质(例如，摩尔比为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的辅助脂质)，
其中所有摩尔比均相对于所述LNP的总脂质含量。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的阳离子脂质；摩尔比为1.5％的PEG化的脂质；摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质；和摩尔比为30％的辅助脂质。
在某些实施方案中，所述PEG化的脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)。
在各种实施方案中，所述基于胆固醇的脂质是胆固醇。
在某些实施方案中，所述辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
在各种实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的OF-02；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。
在各种实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的cKK-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。
在各种实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。
在各种实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。
在各种实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的SM-102；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为35％至55％的ALC-0315；摩尔比为0.25％至2.75％的ALC-0159；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的OF-02；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中称为“脂质A”。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的cKK-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中称为“脂质B”。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的D OPE。这种LNP配制品在本文中称为“脂质C”。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DO PE。这种LNP配制品在本文中称为“脂质D”。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DO PE。这种LNP配制品在本文中称为“脂质E”。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为50％的9-十七烷基8-{(2-羟基乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}辛酸酯(SM-102)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为38.5％的胆固醇；和摩尔比为1.5％的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为46.3％的(4-羟基丁基)氮杂二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为9.4％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为42.7％的胆固醇；和摩尔比为1.6％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
在某些实施方案中，所述LNP包含：摩尔比为47.4％的(4-羟基丁基)氮杂二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为40.9％的胆固醇；和摩尔比为1.7％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
为了计算待放入LNP配制品中的每种脂质的实际量，首先基于所需的N/P比确定阳离子脂质的摩尔量，其中N是阳离子脂质中氮原子的数量，并且P是待由LNP转运的mRNA中的磷酸基团的数量。接下来，基于阳离子脂质的摩尔量和所选择的摩尔比计算每种其他脂质的摩尔量。然后使用每种脂质的分子量将这些摩尔量转化为重量。
F.LNP的活性成分
本发明的LNP疫苗组合物的活性成分是编码流感抗原的mRNA。
在所需的情况下，LNP可以是多价的。在一些实施方案中，LNP可以携带编码超过一种流感抗原(如两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种抗原)的mRNA。例如，LNP可以携带多个mRNA，每种编码不同的流感抗原；或者携带可以翻译成超过一种流感抗原的多顺反子mRNA(例如，每个抗原编码序列由编码自切割肽(如2A肽)的核苷酸接头隔开)。携带不同mRNA的LNP通常包含(包封)每种mRNA的多个拷贝。例如，携带或包封两种不同mRNA的LNP通常携带这两种不同mRNA中的每一种的多个拷贝。
在一些实施方案中，单一LNP配制品可以包含多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)LNP，每种携带不同的mRNA。
在一些实施方案中，多价LNP疫苗含有编码源自八种选自血凝素(例如，血凝素1(HA1)和血凝素2(HA2))的流感病毒蛋白、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)的多肽的mRNA分子。在进一步的实施方案中，多价LNP疫苗含有八种编码源自HA蛋白、源自NA蛋白以及源自HA和NA蛋白两者的抗原多肽的mRNA。在一些实施方案中，编码抗原多肽的mRNA分子源自不同的流感毒株。
在某些实施方案中，组合物可以包含一种或多种编码甲型流感、乙型流感和丙型流感病毒的抗原的mRNA。在一个实施方案中，组合物可以包含一种或多种编码甲型流感和乙型流感病毒的HA和/或NA抗原的mRNA。在一个实施方案中，甲型流感病毒的HA抗原选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18亚型。在一个实施方案中，甲型流感病毒的NA抗原选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11亚型。在一个实施方案中，乙型流感病毒的HA和NA抗原来自乙型流感/山形谱系。在一个实施方案中，乙型流感病毒的HA和NA抗原来自乙型流感/维多利亚谱系。在一些实施方案中，所述一种或多种HA和NA抗原来自世界卫生组织(WHO)在其流感疫苗配制品的年度推荐中推荐的流感病毒毒株。
在某些实施方案中，所述一种或多种流感病毒蛋白中的至少一种包含具有从机器学习模型鉴定或设计的分子序列的流感病毒HA蛋白和/或流感病毒NA蛋白，并且在某些实施方案中，所述一种或多种核糖核酸分子中的至少一种编码一种或多种具有从机器学习模型鉴定或设计的分子序列的流感病毒蛋白。
在一个实施方案中，组合物包含一种编码H3 HA抗原的mRNA、一种编码H1 HA抗原的mRNA、一种编码来自乙型流感/山形谱系的HA抗原的mRNA和一种编码来自乙型流感/维多利亚谱系的HA抗原的mRNA。
在一个实施方案中，组合物包含一种编码H3 HA抗原的mRNA、一种编码N2 NA抗原的mRNA、一种编码H1 HA抗原的mRNA、一种编码N1 NA抗原的mRNA、一种编码来自乙型流感/山形谱系的HA抗原的mRNA、一种编码来自乙型流感/山形谱系的NA抗原的mRNA、一种编码来自乙型流感/维多利亚谱系的HA抗原的mRNA和一种编码来自乙型流感/维多利亚谱系的NA抗原的mRNA。
在一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种编码具有从机器学习模型鉴定或设计的分子序列的机器学习流感病毒HA的mRNA，其中所述一种或多种机器学习流感病毒HA可以选自H1 HA、H3 HA、来自B/维多利亚谱系的HA、来自B/山形谱系的HA或其组合。
当选择一种或多种机器学习流感病毒HA时，可以使用任何机器学习算法。例如，本文设想的是以下PCT申请号中披露的任何机器学习算法和方法：标题为用于设计疫苗的系统和方法(Systems and Methods for Designing Vaccines)的WO 2021/080990 A1以及标题为用于预测生物反应的系统和方法(Systems and Methods for PredictingBiological Responses)的WO 2021/080999 A1，将其两者均通过引用以其整体并入本文。
mRNA可以是未经修饰的(即，仅含有由磷酸二酯键连接的天然核糖核苷酸A、U、C和/或G)，或者可以是经化学修饰的(例如，包括核苷酸类似物，如假尿苷(例如，N-1-甲基假尿苷)、2'-氟核糖核苷酸和2'-甲氧基核糖核苷酸；和/或硫代磷酸酯键)。mRNA分子可以包含5'帽和聚A尾。
G.缓冲液和其他组分
为了稳定核酸和/或LNP(例如，为了延长疫苗产品的保质期)，为了促进LNP药物组合物的施用，和/或为了增强核酸的体内表达，核酸和/或LNP可以与一种或多种载体、靶向配体、稳定试剂(例如，防腐剂和抗氧化剂)和/或其他药学上可接受的赋形剂组合配制。此类赋形剂的例子是对羟基苯甲酸酯、硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞钠(thiomersal)、氯丁醇、苯扎氯铵和螯合剂(例如，EDTA)。
本公开文本的LNP组合物可以作为冷冻液体形式或冻干形式提供。可以使用各种冷冻保护剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘露糖、右旋糖等。冷冻保护剂可以构成LNP组合物的5％-30％(w/v)。在一些实施方案中，LNP组合物包含海藻糖，例如为5％-30％(例如，10％)(w/v)。一旦用冷冻保护剂配制，LNP组合物便可以在-20℃至-80℃下冷冻(或冻干和冷冻保存)。
可以将LNP组合物在水性缓冲溶液中提供给患者：如果先前冷冻，则解冻，或者如果先前冻干，则在床边在水性缓冲溶液中重构。缓冲溶液优选是等渗的，并且适用于例如肌内或皮内注射。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
II.RNA
本公开文本的本发明的LNP疫苗组合物可以包含编码目的抗原的RNA分子(例如，mRNA)。本公开文本的RNA分子可以包含至少一种核糖核酸(RNA)，其包含编码目的抗原的ORF。在某些实施方案中，RNA是包含编码目的抗原的ORF的信使RNA(mRNA)。在某些实施方案中，RNA(例如，mRNA)进一步包含至少一个5'UTR、3'UTR、聚(A)尾和/或5'帽。
II.A.5'帽
mRNA 5'帽可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性，并且促进翻译效率。已知几种类型的5'帽。7-甲基鸟苷帽(也称为“m7G”或“帽-0”)包含鸟苷，其通过5'-5'三磷酸键与第一转录核苷酸连接。
通常如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中除去一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后，经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸中添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5‘5‘5三磷酸键联；然后，通过甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp、(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。另外的帽结构描述于美国公开号US2016/0032356和美国公开号US2018/0125989中，将其通过引用并入本文。
多核苷酸的5'加帽可以根据制造商的方案使用以下化学RNA帽类似物在体外转录反应期间伴随完成，以产生5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')(2'OMe A)pG；m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU；m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(New England BioLabs，马萨诸塞州伊普斯威奇；TriLink Biotechnologies)。经修饰的RNA的5'加帽可以使用痘苗病毒加帽酶在转录后完成，以产生帽0结构：m7G(5')ppp(5')G。可以使用痘苗病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶两者产生帽1结构，以产生：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。可以从帽1结构产生帽2结构，然后使用2'-O甲基转移酶对5'倒数第三个核苷酸进行2'-O-甲基化。可以从帽2结构产生帽3结构，然后使用2'-O甲基转移酶对5'倒数第四个核苷酸进行2'-O-甲基化。
在某些实施方案中，本公开文本的mRNA包含选自以下的5'帽：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)、G(5')ppp(5')A、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')A、m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p G。
在某些实施方案中，本公开文本的mRNA包含以下的5'帽：
II.B.非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，本公开文本的mRNA包括5'和/或3'非翻译区(UTR)。在mRNA中，5'UTR在转录起始位点处开始并继续到起始密码子，但是不包括起始密码子。3'UTR紧接终止密码子之后开始并继续直到转录终止信号。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA可以包含5'UTR，其包括影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件。在一些实施方案中，5'UTR可以具有约10至5,000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，5'UTR可以具有约50至500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，5'UTR具有至少约10个核苷酸的长度、约20个核苷酸的长度、约30个核苷酸的长度、约40个核苷酸的长度、约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA可以包含3'UTR，其包含以下中的一种或多种：多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置的稳定性的蛋白质的结合位点或miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，3'UTR可以具有50至5,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施方案中，3'UTR可以具有50至1,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施方案中，3'UTR具有至少约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA可以包含5'或3'UTR，其源自与由mRNA转录物编码的基因不同的基因(即，UTR是异源UTR)。
在某些实施方案中，5'和/或3'UTR序列可以源自稳定的mRNA(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加mRNA的稳定性。例如，5'UTR序列可以包括部分序列的CMV立即早期1(IE1)基因或其片段，以改善mRNA的核酸酶抗性和/或改善mRNA的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包含到mRNA的3'端或非翻译区。通常，相对于其未经修饰的对应物，这些修饰可以改善mRNA的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如为改善mRNA对体内核酸酶消化的这种抗性而进行的修饰。
示例性5'UTR包括源自CMV立即早期1(IE1)基因的序列(美国公开号2014/0206753和2015/0157565，将其中的每一个通过引用并入本文)或序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:22)(美国公开号2016/0151409，通过引用并入本文)。
在各种实施方案中，5'UTR可以源自TOP基因的5'UTR。TOP基因的特征通常在于5'-末端寡嘧啶(TOP)束的存在。此外，大多数TOP基因的特征在于生长相关的翻译调节。然而，具有组织特异性翻译调节的TOP基因也是已知的。在某些实施方案中，源自TOP基因的5'UTR的5'UTR缺乏5'TOP基序(寡嘧啶束)(例如，美国公开号2017/0029847、2016/0304883、2016/0235864和2016/0166710，将其中的每一个通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，5'UTR源自核糖体蛋白大32(L32)基因(美国公开号2017/0029847,同上)。
在某些实施方案中，5'UTR源自羟基类固醇(17-b)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR(美国公开号2016/0166710,同上)。
在某些实施方案中，5'UTR源自ATP5A1基因的5'UTR(美国公开号2016/0166710,同上)。
在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。
在一些实施方案中，5'UTR包含SEQ ID NO:19所示的核酸序列并复制如下：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQID NO:19)。
在一些实施方案中，3'UTR包含SEQ ID NO:20所示的核酸序列并复制如下：
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQ ID NO:20)。
5'UTR和3'UTR进一步详细描述于WO 2012/075040(通过引用并入本文)中。
II.C.多腺苷酸化尾
如本文所用，术语“聚(A)序列”、“聚(A)尾”和“聚(A)区”是指mRNA分子的3'端处的腺苷核苷酸序列。聚(A)尾可以为mRNA赋予稳定性，并且保护其免于外切核酸酶降解。聚(A)尾可以增强翻译。在一些实施方案中，聚(A)尾实质上是同聚物的。例如，100个腺苷核苷酸的聚(A)尾实质上可以具有100个核苷酸的长度。在某些实施方案中，聚(A)尾可以被与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸(例如，不是腺苷核苷酸的核苷酸)中断。例如，100个腺苷核苷酸的聚(A)尾可以具有超过100个核苷酸的长度(包含100个腺苷核苷酸和与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸或一段核苷酸)。在某些实施方案中，聚(A)尾包含序列AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:23)。
如本文所用，“聚(A)尾”通常涉及RNA。然而，在本公开文本的上下文中，所述术语同样涉及DNA分子中的相应序列(例如，“聚(T)序列”)。
聚(A)尾可以包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸或约40至约150个腺苷核苷酸。聚(A)尾的长度可以是至少约10、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个腺苷核苷酸。
在核酸是RNA的一些实施方案中，在RNA体外转录期间从DNA模板获得核酸的聚(A)尾。在某些实施方案中，通过常用的化学合成方法在体外获得聚(A)尾，而无需从DNA模板转录。在各种实施方案中，使用可商购获得的多腺苷酸化试剂盒和相应的方案通过对RNA进行酶促多腺苷酸化(在RNA体外转录后)，或者可替代地，通过使用固定化的聚(A)聚合酶，例如使用如WO2016/174271中所述的方法和手段，产生聚(A)尾。
核酸可以包含通过酶促多腺苷酸化获得的聚(A)尾，其中大部分核酸分子包含约100(+/-20)至约500(+/-50)或约250(+/-20)个腺苷核苷酸。
在一些实施方案中，核酸可以包含源自模板DNA的聚(A)尾，并且可以另外包含通过酶促多腺苷酸化产生的至少一个另外的聚(A)尾，例如如WO2016/091391中所述。
在某些实施方案中，核酸包含至少一个多腺苷酸化信号。
在各种实施方案中，核酸可以包含至少一个聚(C)序列。
如本文所用，术语“聚(C)序列”旨在是多达约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在一些实施方案中，聚(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，聚(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
II.D.化学修饰
本文公开的mRNA可以是经修饰的或未经修饰的。在一些实施方案中，mRNA可以包含至少一种化学修饰。在一些实施方案中，本文公开的mRNA可以含有一种或多种通常增强RNA稳定性的修饰。示例性修饰可以包括骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，所公开的mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)(包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)))合成。在某些实施方案中，所公开的mRNA可以由嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物合成，所述类似物或衍生物例如像1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。
在一些实施方案中，所公开的mRNA可以包含至少一种化学修饰，包括但不限于假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。
在一些实施方案中，化学修饰包含N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
在一些实施方案中，ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
此类类似物的制备描述于例如美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和美国专利号5,700,642中。
II.E.mRNA合成
本文公开的mRNA可以根据多种方法中的任一种合成。例如，根据本公开文本的mRNA可以经由体外转录(IVT)合成。一些用于体外转录的方法描述于例如Geall等人(2013)Semin.Immunol.25(2):152-159；Brunelle等人(2013)Methods Enzymol.530:101-14中。简而言之，通常用以下进行IVT：含有启动子的线性或环状DNA模板、一池核糖核苷三磷酸、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统、适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切的条件可以根据具体应用而变化。这些试剂的存在通常在最终mRNA产物中是不希望的，并且这些试剂可以被认为是可以纯化或除去的杂质或污染物，以提供适用于治疗用途的无污染的和/或同质的mRNA。虽然在一些实施方案中可能需要从体外转录反应提供的mRNA，但根据本公开文本可以使用其他来源的mRNA，包括由细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。III.用于制备本发明的LNP疫苗的方法
本发明的LNP可以通过本领域目前已知的各种技术制备。例如，可以根据常规技术制备多层囊泡(MLV)，如通过使所选择的脂质沉积在合适的容器或器皿的内壁上(通过将脂质溶解在适当的溶剂中，然后蒸发溶剂以在器皿内部留下薄膜)或通过喷雾干燥来制备。然后可以伴随涡旋运动向器皿中添加水相，这导致MLV的形成。然后可以通过均质化、超声处理或挤出多层囊泡来形成单层囊泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术形成单层囊泡。
各种方法描述于US2011/0244026、US2016/0038432、US2018/0153822、US 2018/0125989和PCT/US2020/043223(2020年7月23日提交)中，并且可以用于实践本发明。一种示例性方法需要通过将其与脂质的混合物混合来包封mRNA，而无需首先将脂质预形成脂质纳米颗粒，如US2016/0038432中所述。另一种示例性方法需要通过将预形成的LNP与mRNA混合来包封mRNA，如US2018/0153822中所述。
在一些实施方案中，制备装载mRNA的LNP的方法包括将一种或多种溶液加热到大于环境温度的温度的步骤，所述一种或多种溶液是包含预形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的混合溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前加热mRNA溶液和预形成的LNP溶液中的一种或两种的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间加热包含预形成的LNP的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的溶液中的一种或多种。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后加热LNP包封的mRNA的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液所加热到的温度是或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所加热到的温度的范围是从约25℃-70℃、约30℃-70℃、约35℃-70℃、约40℃-70℃、约45℃-70℃、约50℃-70℃或约60℃-70℃。在一些实施方案中，温度是约65℃。
可以使用各种方法来制备适用于本发明的mRNA溶液。在一些实施方案中，可以将mRNA直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可以通过在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施方案中，可以通过紧接在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液可以含有在水或缓冲液中的浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。
在一些实施方案中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。通常，将缓冲溶液以大于mRNA储备溶液的速率的速率混合。例如，缓冲溶液可以按mRNA储备溶液的速率的至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率混合。在一些实施方案中，将缓冲溶液以范围在约100-6000ml/分钟之间(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟或60-420ml/分钟)的流速混合。在一些实施方案中，将缓冲溶液以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟或6000ml/分钟的流速混合。
在一些实施方案中，将mRNA储备溶液以范围在约10-600ml/分钟之间(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟或约480-600ml/分钟)的流速混合。在一些实施方案中，将mRNA储备溶液以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟或600ml/分钟的流速混合。
将所需mRNA掺入脂质纳米颗粒中的过程称为“加样”。示例性方法描述于Lasic等人,FEBS Lett.(1992)312:255-8中。LNP掺入的核酸可以完全或部分位于脂质纳米颗粒的内部空间中，脂质纳米颗粒膜的双层膜内，或与脂质纳米颗粒膜的外表面相关。将mRNA掺入脂质纳米颗粒中在本文中也称为“包封”，其中核酸完全或基本上包含在脂质纳米颗粒的内部空间内。
合适的LNP可以按各种尺寸制备。在一些实施方案中，减小的脂质纳米颗粒尺寸与mRNA的更有效递送相关。选择适当的LNP尺寸可以考虑靶细胞或组织的位点以及在某种程度上脂质纳米颗粒将用于的应用。
本领域已知的各种方法可用于改变脂质纳米颗粒群的尺寸。在本文中优选的方法利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)来测量LNP粒度。在一种方案中，将10μl的LNP样品与990μl的10％海藻糖混合。将此溶液装入比色皿中，然后放入Zetasizer机器中。z-平均直径(nm)或累积量平均值被认为是样品中LNP的平均尺寸。Zetasizer机器还可以用于通过使用动态光散射(DLS)和自相关函数的累积量分析来测量多分散性指数(PDI)。可以通过对所形成的LNP进行超声处理来减小平均LNP直径。间歇超声处理循环可以与准弹性光散射(QELS)评估交替，以指导有效的脂质纳米颗粒合成。
在一些实施方案中，大部分经纯化的LNP(即，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的LNP)的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。在一些实施方案中，基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的LNP的平均尺寸小于150nm、小于120nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于30nm或小于20nm。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的LNP的尺寸的范围为从约40-90nm(例如，约45-85nm、约50-80nm、约55-75nm、约60-70nm)或约50-70nm(例如，55-65nm)，这特别适合于经由雾化进行肺部递送。
在一些实施方案中，通过本发明提供的药物组合物中的LNP的分散性或分子尺寸异质性量度(PDI)小于约0.5。在一些实施方案中，LNP的PDI小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.28、小于约0.25、小于约0.23、小于约0.20、小于约0.18、小于约0.16、小于约0.14、小于约0.12、小于约0.10或小于约0.08。PDI可以通过如上所述的Zetasizer机器测量。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物中大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的经纯化的LNP将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施方案中，药物组合物中基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的包封效率在50％与99％之间；或者大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％。通常，用于在本文中使用的脂质纳米颗粒的包封效率为至少90(例如，至少91％、92％、93％、94％或95％)。
在一些实施方案中，LNP的N/P比在1与10之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的N/P比高于1、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在进一步的实施方案中，本文的典型LNP的N/P比为4。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物含有至少约0.5μg、1μg、5μg、10μg、100μg、500μg或1000μg的所包封的mRNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1μg至1000μg、至少约0.5μg、至少约0.8μg、至少约1μg、至少约5μg、至少约8μg、至少约10μg、至少约50μg、至少约100μg、至少约500μg或至少约1000μg的所包封的mRNA。
在一些实施方案中，mRNA可以通过化学合成或通过DNA模板的体外转录(IVT)来制备。用于制备和纯化mRNA的示例性方法描述于实施例1中。在此方法中，在IVT过程中，使用cDNA模板来产生mRNA转录物，并且将DNA模板通过DNA酶降解。通过深度过滤和切向流过滤(TFF)纯化转录物。通过添加帽和尾进一步修饰经纯化的转录物，并且通过深度过滤和TFF再次纯化经修饰的RNA。
然后在水性缓冲液中制备mRNA，并且将其与含有LNP的脂质组分的两亲溶液混合。用于溶解LNP的四种脂质组分的两亲溶液可以是醇溶液。在一些实施方案中，醇是乙醇。水性缓冲液可以是例如柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐或琥珀酸盐缓冲液，并且可以具有约3.0-7.0(例如，约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.5)的pH。缓冲液可以含有其他组分，如盐(例如，钠，钾和/或钙盐)。在特定实施方案中，水性缓冲液具有1mM柠檬酸盐、150mMNaCl，pH 4.5。
用于制备mRNA-LNP组合物的示例性的非限制性方法描述于实施例1中。所述方法涉及将经缓冲的mRNA溶液与脂质的乙醇溶液以受控的均匀方式混合，其中在整个混合过程中维持脂质:mRNA的比率。在此说明性例子中，mRNA在含有柠檬酸一水合物、柠檬酸三钠二水合物和氯化钠的水性缓冲液中呈现。将mRNA溶液添加到溶液(1mM柠檬酸盐缓冲液、150mMNaCl，pH 4.5)中。将四种脂质(例如，阳离子脂质、PEG化的脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质)的脂质混合物溶解在乙醇中。将水性mRNA溶液和乙醇脂质溶液在具有近“无脉”泵系统的“T”形混合器中以4:1的体积比混合。然后对所得混合物进行下游纯化和缓冲液交换。可以使用透析盒或TFF系统实现缓冲液交换。可以使用TFF来紧接在经由T混合过程形成之后对所得的新生LNP进行浓缩和缓冲液交换。渗滤过程是连续操作，通过以与渗透物流相同的速率添加适当的缓冲液使体积保持不变。IV.mRNA-LNP疫苗的包装和使用
mRNA-LNP疫苗可以包装用于肠胃外(例如，肌内、皮内或皮下)施用或鼻咽(例如，鼻内)施用。疫苗组合物可以呈即用配制品的形式，其中LNP组合物被冻干并刚好在使用前用生理缓冲液(例如，PBS)重构。疫苗组合物还可以按水性溶液或冷冻水性溶液的形式运送和提供，并且可以直接施用给受试者而无需重构(如果先前冷冻，则在解冻后)。
因此，本公开文本提供了制品(如试剂盒)，其在单个容器中提供mRNA-LNP疫苗，或者在一个容器中提供mRNA-LNP疫苗并且在另一个容器中提供用于重构的生理缓冲液。所述一个或多个容器可以含有单次使用剂量或多次使用剂量。容器可以是预处理的玻璃小瓶或安瓿。制品也可以包括使用说明书。
在某些实施方案中，提供mRNA-LNP疫苗用于在肌内(IM)注射中使用。疫苗可以注射到受试者的例如他/她的上臂中的三角肌处。在一些实施方案中，疫苗在预填充的针筒或注射器(例如，单室的或多室的)中提供。在一些实施方案中，疫苗被提供以用于在吸入中使用，并且在预填充的泵、雾化器或吸入器中提供。
将mRNA-LNP疫苗可以预防有效量施用给有需要的受试者，所述预防有效量即提供针对靶病原体的足够免疫保护持续足够量的时间(例如，一年、两年、五年、十年或一生)的量。足够的免疫保护可以是例如预防或减轻与病原体感染相关的症状。在一些实施方案中，将多剂(例如，两剂)的疫苗注射给有需要的受试者，以实现所需的预防效果。剂量(例如，初免剂量和加强剂量)可以隔开例如1周、2周、3周、4周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、五年或十年的间隔。
在一些实施方案中，单次剂量的mRNA-LNP疫苗含有1-50μg的mRNA(例如，单价的或多价的)。例如，单次剂量可以含有约2.5μg、约5μg、约7.5μg、约10μg、约12.5μg或约15μg的mRNA用于肌内(IM)注射。在进一步的实施方案中，多价单次剂量的LNP疫苗含有多种(例如，2、3或4种)的LNP，每种针对不同的抗原，并且每种LNP具有例如2.5μg、约5μg、约7.5μg、约10μg、约12.5μg或约15μg的mRNA量。
在另一个方面，本发明提供了在受试者中针对一种或多种流感病毒免疫受试者的方法。本发明进一步提供了在受试者中引发针对一种或多种流感病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。
在各种实施方案中，本文提供的免疫方法引发针对一种或多种流感病毒内的多个表位的广泛的保护性免疫应答。在各种实施方案中，本文提供的免疫方法引发针对一种或多种流感病毒的广泛的中和免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答包含抗体应答。因此，在各种实施方案中，本文所述的组合物可以提供针对不同类型的流感病毒的广泛的交叉保护。在一些实施方案中，组合物提供针对禽流感、猪流感、季节性流感和/或大流行流感病毒的交叉保护。在一些实施方案中，组合物提供针对一种或多种甲型、乙型或丙型流感亚型的交叉保护。在一些实施方案中，组合物提供针对以下病毒的多种毒株的交叉保护：甲型流感H1亚型病毒(例如，H1N1)、甲型流感H3亚型病毒(例如，H3N2)、甲型流感H5亚型病毒(例如，H5N1)和/或乙型流感病毒(例如，山形谱系、维多利亚谱系)。
在一些实施方案中，本发明的方法能够引发针对一种或多种季节性流感毒株的改善的免疫应答。示例性的季节性毒株包括但不限于A/波多黎各/8/1934、A/蒙茅斯堡/1/1947、A/智利/1/1983、A/德克萨斯/36/1991、A/新加坡/6/1986、A/北京/32/1992、A/新喀里多尼亚/20/1999、A/所罗门群岛/03/2006、A/布里斯班/59/2007、A(H3N2)病毒抗原性类似于细胞增殖的原型病毒A/维多利亚/361/2011、A/北京/262/95(H1N1)样病毒、A/布里斯班/02/2018(H1N1)pdm09样病毒、A/布里斯班/10/2007(H3N2)样病毒、A/加利福尼亚/7/2004(H3N2)样病毒、A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)样病毒、A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09样病毒、A/柬埔寨/e0826360/2020(H3N2)样病毒、A/福建/411/2002(H3N2)样病毒、A/福建/411/2002(H3N2)样病毒、A/广东-茂南区/SWL1536/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/夏威夷/70/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/香港/2671/2019(H3N2)样病毒、A/香港/45/2019(H3N2)样病毒、A/香港/4801/2014(H3N2)样病毒、A/堪萨斯/14/2017(H3N2)样病毒、A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09样病毒、A/莫斯科/10/99(H3N2)样病毒、A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)样病毒、A/佩斯/16/2009(H3N2)样病毒、A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)样病毒、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)样病毒、A/南澳大利亚/34/2019(H3N2)样病毒、A/瑞士/8060/2017(H3N2)样病毒、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)样病毒、A/悉尼/5/97(H3N2)样病毒、A/德克萨斯/50/2012(H3N2)样病毒、A/维多利亚/2570/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/维多利亚/2570/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/维多利亚/361/2011(H3N2)样病毒、A/惠灵顿/1/2004(H3N2)样病毒、A/威斯康星/588/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/威斯康星/588/2019(H1N1)pdm09样病毒、A/威斯康星/67/2005(H3N2)样病毒、B/北京/184/93样病毒、B/布里斯班/60/2008样病毒、B/科罗拉多/06/2017样病毒(B/维多利亚/2/87谱系)、B/佛罗里达/4/2006样病毒、B/香港/330/2001样病毒、B/马来西亚/2506/2004样病毒、B/马萨诸塞/2/2012样病毒、B/普吉岛/3073/2013(B/山形谱系)样病毒、B/普吉岛/3073/2013样病毒、B/普吉岛/3073/2013样病毒(B/山形/16/88谱系)、B/山东/7/97样病毒、B/上海/361/2002样病毒、B/四川/379/99样病毒、B/华盛顿/02/2019(B/维多利亚谱系)样病毒、B/华盛顿/02/2019样(B/维多利亚谱系)病毒和B/威斯康星/1/2010样病毒。在一些实施方案中，本发明的方法能够引发针对一种或多种大流行流感毒株的改善的免疫应答。示例性大流行毒株包括但不限于A/加利福尼亚/07/2009、A/加利福尼亚/04/2009、A/比利时/145/2009、A/南卡罗来纳/01/1918和A/新泽西/1976。大流行亚型尤其包括H1N1、H5N1、H2N2、H3N2、H9N2、H7N7、H7N3、H7N9和H10N7亚型。在一些实施方案中，本发明的方法能够引发针对一种或多种猪流感毒株的改善的免疫应答。示例性猪毒株包括但不限于A/新泽西/1976分离株和A/加利福尼亚/07/2009。在一些实施方案中，本发明的方法能够引发针对一种或多种禽流感毒株的改善的免疫应答。示例性禽毒株包括但不限于H5N1、H7N3、H7N7、H7N9和H9N2。另外的流感大流行毒株、季节性毒株、禽毒株和/或猪毒株是本领域已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用本发明的组合物来预防或治疗流感感染的方法。在一些实施方案中，受试者患有或易患流感感染。在一些实施方案中，如果受试者显示通常与流感感染相关的一种或多种症状，则认为受试者患有流感感染。在一些实施方案中，已知或认为受试者已经暴露于流感病毒。在一些实施方案中，如果已知或相信受试者已经暴露于流感病毒，则认为受试者易患流感感染。在一些实施方案中，如果受试者已经与已知或怀疑已经被流感病毒感染的其他个体接触和/或如果受试者出现或已经出现在已知或相信流感感染流行的地方，则已知或相信受试者已经暴露于流感病毒。
在各种实施方案中，如本文所述的组合物可以在出现一种或多种流感感染症状之前或之后施用。在一些实施方案中，将组合物作为预防剂施用。在此类实施方案中，本发明的方法有效地预防或保护受试者免于流感病毒感染。在一些实施方案中，将本发明的组合物用作季节性和/或大流行流感疫苗的组分或用作旨在赋予持久(多季节)保护的流感疫苗接种方案的一部分。在一些实施方案中，使用本发明的组合物来治疗流感感染的症状。
在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是农场动物或宠物(例如，狗、猫、绵羊、牛和/或猪)。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是禽(例如，鸡)。
在一些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者是成年人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，人类受试者不到6月龄。在一些实施方案中，人类受试者为6月龄或以上，为6月龄至35月龄，为36月龄至8岁，或者为9岁或以上。在一些实施方案中，人类受试者是55岁或以上(如60岁或以上或者65岁或以上)的老年人。本发明还考虑了在子宫中施用组合物和/或在子宫中进行治疗方法。
除非本文另有规定，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，但在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些类似或等效的方法和材料。在发生冲突的情况下，应以包括定义在内的本说明书为准。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法以及其技术是本领域熟知且常用的那些。根据制造商的说明书如本领域通常所实现的或如本文所述的那样进行酶促反应和纯化技术。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。在整个本说明书和实施方案中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或变型如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组。将本文提及的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其整体并入。尽管本文引用了许多文件，但此引用并不意味着承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外从上下文显而易见，所述术语是指落入所陈述的参考值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。
V.载体
在一个方面，本文公开了包含在本文中公开的mRNA组合物的载体。编码感兴趣蛋白的RNA序列(例如，编码流感蛋白的mRNA)可被克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可被克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌体、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体可包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和优化体外转录的载体。
在某些实施方案中，载体可用于在宿主细胞中表达mRNA。在各种实施方案中，载体可用作IVT的模板。适合治疗用途的最佳翻译IVT mRNA的构建过程在Sahin等人(2014).Nat.Rev.Drug Discov.13,759-780；Weissman(2015).Expert Rev.Vaccines 14,265-281中详细公开。
在一些实施方案中，本文公开的载体可以包含至少以下(从5'到3')：RNA聚合酶启动子；编码5'UTR的多核苷酸序列；编码ORF的多核苷酸序列；编码3'UTR的多核苷酸序列；和编码至少一种RNA适配体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本文公开的载体可包含编码多聚(A)序列和/或多腺苷酸化信号的多核苷酸序列。
已知有多种RNA聚合酶启动子。在一些实施方案中，启动子可以是T7 RNA聚合酶启动子。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是已知的。
本文还公开了包含在本文中公开的载体或RNA组合物的宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)。
多核苷酸可使用多种不同方法中的任何一种导入靶细胞，例如，市售方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，科隆，德国))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，波士顿，马萨诸塞州)或Gene Pulser II(BioRad，丹佛，科罗拉多州)、Multiporator(Eppendorf，汉堡，德国)、使用脂质转染法的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、生物弹道颗粒递送系统如“基因枪”(参见例如Nishikawa等人(2001).Hum Gene Ther.12(8):861-70,或TransIT-RNA转染试剂盒(Mirus，麦迪逊，威斯康星州)。
将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油型乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。一种用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊)。
无论使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式使细胞暴露于本公开文本的抑制剂，为了确认宿主细胞中存在mRNA序列，可以进行各种测定。
VI.自复制RNA和反式复制RNA
自复制RNA：
在一个方面，本文公开了编码流感蛋白的自复制RNA。
可通过使用源自例如甲病毒的复制元件，并用编码感兴趣蛋白(例如流感蛋白)的核苷酸序列替代病毒结构蛋白，产生自复制RNA。自复制RNA通常是正链分子，其在递送至细胞后可被直接翻译，这种翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，然后RNA依赖性RNA聚合酶从递送的RNA产生反义和有义转录本。因此，递送的RNA会产生多个子代RNA。这些子代RNA以及共线性亚基因组转录本本身可被翻译，以提供经编码的抗原(即流感蛋白抗原)的原位表达，或者也可被转录，以提供与递送的RNA具有相同意义的其他转录本，这些转录本被翻译，以提供抗原的原位表达。这种转录序列的总体结果是引入的复制子RNA数量大幅增加，因此经编码的抗原成为细胞的主要多肽产物。
以这种方式实现自复制的一种合适系统是使用基于甲病毒的复制子。这些复制子是正链(正义链)RNA，在递送至细胞后会导致复制酶(或复制酶-转录酶)的翻译。复制酶被翻译成多聚蛋白，其自动裂解，形成复制复合物，复制复合物生成正链递送的RNA的基因组拷贝。这些负(-)-链转录本本身也可被转录，产生更多的正链母体RNA的拷贝，并产生编码抗原的亚基因组转录本。因此，亚基因组转录本的翻译会导致受感染细胞原位表达抗原。合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可以使用突变型或野生型病毒序列，例如，VEEV的减毒TC83突变体已被用于复制子中，参见以下参考文献：WO2005/113782，并入本文作为参考。
在一个实施方案中，本文所述的每种自复制RNA编码(i)RNA依赖性RNA聚合酶，其可从自复制RNA分子转录RNA；和(ii)流感蛋白抗原。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如，包含一种或多种甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。天然甲病毒基因组除了编码非结构性复制酶多聚蛋白外，还编码结构性病毒蛋白，而在某些实施方案中，自复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，自复制RNA可在细胞中产生自身的基因组RNA拷贝，但不能产生含RNA的病毒粒子。不能产生这些病毒粒子意味着，与野生型甲病毒不同，自复制RNA分子不能以感染形式延续自身。在本公开文本的自复制RNA中不存在野生型病毒延续所必需的甲病毒结构蛋白，取而代之的是编码感兴趣的免疫原的基因，因此亚基因组转录本编码的是免疫原，而不是甲病毒病毒粒子结构蛋白。自复制RNA在WO2011005799中有更详细的描述，并入本文作为参考。
反式复制RNA：
在一个方面，本文公开了编码流感蛋白的反式复制RNA。
反式复制RNA具有与上述自复制RNA相似的元件。然而，反式复制RNA使用两个独立的RNA分子。第一RNA分子编码上述RNA复制酶(例如甲病毒复制酶)，第二RNA分子编码感兴趣的蛋白(例如流感蛋白抗原)。RNA复制酶可复制第一和第二RNA分子中的一个或两个，从而大大增加编码感兴趣的蛋白的RNA分子的拷贝数。反式复制RNA在WO2017162265中有更详细的描述，并入本文作为参考。
VII.药物组合物
根据本公开文本纯化的RNA可用作药物组合物中的组分，例如用作疫苗。这些组合物通常包含RNA和药学上可接受的载剂。本公开文本的药物组合物还可以包含一种或多种额外组分，如小分子免疫促进剂(例如TLR激动剂)。本公开文本的药物组合物还可以包含用于RNA的递送系统，如脂质体、水包油型乳剂或微粒。在某些实施方案中，药物组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。在某些实施方案中，组合物包含包封在LNP中的编码抗原的核酸分子。
VIII.疫苗接种的方法
可以向受试者施用本文公开的流感疫苗，以诱导针对一种或多种流感蛋白的免疫应答，其中，相对于未接种本文公开的流感疫苗的受试者的抗-抗原抗体滴度，或者相对于针对流感的替代疫苗，接种疫苗后受试者的抗-抗原抗体滴度增加。“抗-抗原抗体”是与抗原特异性结合的血清抗体。
在一个方面，本公开文本提供了一种引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的流感疫苗。本公开文本还提供了一种本文所述的流感疫苗，其用于引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染。本公开文本还提供了一种本文所述的流感mRNA，其用于制造引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的疫苗。
为了可以更好地理解本发明，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：LNP配制品的优化
本实施例描述了这样的研究，其中从各种组分的组合文库制备了mRNA疫苗的一系列LNP配制品。合成了合理设计的新型阳离子脂质。总共测试了超过150种脂质和超过430种配制品。将人红细胞生成素(hEPO)mRNA用作测试mRNA。在下文所述的先导配制品中，使用阳离子脂质和以下三种其他脂质的组合以各种组合排列将mRNA配制到LNP中：辅助脂质；基于胆固醇的脂质；和PEG化的脂质。
LNP配制品由以下四种脂质组分组成：可电离的脂质、辅助脂质DOPE、胆固醇和PEG化的脂质DMG-PEG-2K。将PEG化的脂质摩尔分数保持在1.5％下不变，同时评价可电离的脂质和不同的辅助脂质及其摩尔比，以基于hEPO筛选研究鉴定优化比率。
在LNP配制品的制备中使用柠檬酸盐缓冲液(1mM柠檬酸盐、150mM NaCl，pH 4.5)。在配制过程期间，将添加到柠檬酸盐缓冲液中的mRNA溶液与脂质的乙醇溶液混合。选择缓冲液的pH和浓度，以在LNP配制品中实现高mRNA包封率。
LNP配制过程包括使用泵系统将脂质乙醇溶液和mRNA柠檬酸盐溶液在“T”形混合器中混合。然后使用TFF/透析管对所得溶液进行缓冲液交换。基于给药需求调整10％(w/v)海藻糖中的最终配制品的浓度。
将hEPO蛋白的小鼠体内表达用作测量LNP在体内递送mRNA的效力的替代物。在本研究中，将单次剂量的在源自组分的各种组合的LNP中配制的hEPO mRNA(0.1μg)肌内地(IM)注射给小鼠。使用ELISA测试在施用后6小时和24小时采集的血清的hEPO水平。将MC3配制品(行业基准)用作计算hEPO表达的倍数增加的参考(Angew,Chem Int Ed.(2012)51:8529-33)。
针对每种LNP配制品所见的hEPO表达水平指示配制品将mRNA递送到细胞中的能力。初始配制品包括2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE；辅助脂质)、DMG-PEG2000和胆固醇，阳离子脂质:DMG-PEG2000:胆固醇:DOPE的摩尔比为40:1.5:28.5:30。当与MC3配制品相比时，发现这些配制品具有稳健的效力。
测试了进一步的配制品。经优化的配制品脂质A LNP和脂质B LNP示于表1中。这些配制品中的mRNA可以是经修饰的或未经修饰的，并且可以编码源自流感的抗原。
表1.示例性LNP配制品的组成
在表1中，人疫苗的最终给药将是基于预期的单次人剂量的上述最终散装产品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稀释液。基于最终药物产品的标称计算WFI的量。配制品中的海藻糖含量对应于10％(100mg/mL)海藻糖二水合物，使用无水海藻糖和海藻糖二水合物的分子量值的比率转化为无水基础。
以下两种经优化的配制品中脂质组分的摩尔比示于表2中：脂质A和脂质B LNP配制品(CL：阳离子脂质)。
表2.示例性LNP中脂质组分的摩尔比
CL LNP代码 CL:DMG-PEG2000:胆固醇:DOPE的摩尔比
OF-02 脂质A 40:1.5:28.5:30
cKK-E10 脂质B 40:1.5:28.5:30
如表3和图1A所示，脂质A和脂质B与MC3相比hEPO表达的倍数增加表明了这些LNP相对于MC3用于递送mRNA的优越性。在下表中，“P2”意指PEG2000；“倍数于MC3”意指相对于MC3的增加倍数；并且“Std Dev”意指标准差。
表3.hEPO mRNA在小鼠中的体内递送
图1B示出了在使用LNP脂质A和脂质B的小鼠和非人灵长类动物(NHP)中的hEPO表达。肌内地注射单次剂量的用脂质A或脂质B配制的hEPO mRNA(对于小鼠为0.1μg，并且对于NHP为10μg)。使用ELISA在施用后6、24、48和72小时定量血清hEPO水平。数据显示出在小鼠和NHP中甚至超过4天的延长的体内hEPO蛋白表达。
在优化期间鉴定的关键过程参数之一是初始混合步骤期间的流速。通过在混合期间改变这些流速来制备具有不同的最终LNP尺寸(范围为从108-177 nm)的配制品，允许对过程和产品属性进行另外的控制。流速越高，粒度越小。当流量达到375 ml/min从而产生108 nM的平均LNP尺寸时，效力显著增加。注意到尺寸对LNP效力的影响是相对于MC3的hEPO表达的倍数增加的量度，如表4所示。
表4.LNP尺寸优化
*PDI：多分散性指数。
上述筛选数据表明，辅助脂质DOPE有效地促进蛋白质表达。数据还确定了四种脂质的有前途的摩尔组成(OF-02或cKK-E10:DMG-PEG-2K:胆固醇:DOPE＝40:1.5:28.5:30)。表征了10％海藻糖中的LNP配制品的所有参数，包括粒度、PDI、mRNA包封和mRNA完整性。所测试的所有批次在冻/融循环中均显示出所需的特征和稳定性。评估了配制品在10％(w/v)海藻糖中在-80℃下的长期稳定性。表明脂质A和脂质B配制品高度稳定。
实施例2：流感H1N1 LNP疫苗配制品
当新型流感病毒在人群中出现时，可能发生流感大流行。此类大流行仍然是对公共卫生的重大威胁，需要高度警惕和准备好在病毒在人与人之间持续传播的情况下使用的对策。在本实施例中所述的实验中，将来自高致病性H1N1毒株A/加利福尼亚/7/2009(CA09)(2009年流感大流行的原因)的血凝素(HA)用作原型抗原来评价用脂质A和脂质B的LNP配制品制备的mRNA疫苗的效力。
如上所述制备HA mRNA。在LNP组合物的制备中使用柠檬酸盐缓冲液(1mM柠檬酸盐、150mM NaCl，pH 4.5)。在配制过程期间，将含有mRNA的柠檬酸盐缓冲液与脂质的乙醇溶液混合。选择缓冲液的pH和浓度，以在LNP配制品中实现高mRNA包封率。使用泵系统将两种溶液(mRNA的柠檬酸盐缓冲液溶液和脂质的乙醇溶液)在“T”形混合器中混合，导致同质的无脉流，其中在整个过程中将脂质和mRNA以恒定的比率混合。这对于获得具有所需尺寸和低PDI(更均匀的尺寸分布的指示)的同质配制品至关重要。此过程导致高mRNA包封，这对于实现高效力至关重要。然后使用TFF/透析管对所得溶液进行缓冲液交换。
在小鼠研究中，在与MC3 LNP配制品以及重组HA(rHA)的头对头比较中评估了脂质A和脂质B CA09 HA配制品的功效。在第0天(D0)和第28天(D28)，将用不同阳离子脂质配制的CA09(H1)HA mRNA(0.4μg)肌内地注射给Balb/C小鼠(n＝8)。疫苗的免疫原性(如通过HA抑制(HAI)效价所指示的)示于图2A中。数据表明，在第0天(D0)和第28天(D28)脂质A或脂质B的两次免疫引发了高HAI效价，并且允许完全保护动物免于同源病毒攻击(Belgium09H1N1病毒)(图2B)。在14天的激发后观察期间，在脂质A和脂质B处理组内未观察到明显的发病迹象(体重减轻)，而重组蛋白对照组内的少量动物表现出发病(图2B)。
类似地，用脂质A配制编码来自Mich15流感毒株(Mich15 N1)的神经氨酸酶(NA)的mRNA，并且评价其效力。将两剂(0.4或0.016μg)的用脂质A配制的NA mRNA肌内地注射给Balb/c小鼠(n＝8)。给对照组(n＝8)注射0.6μg的hEPO mRNA或稀释剂。一半小鼠仅在研究第0天接受一次注射(1剂)，而另外一半接受在研究第0天和第28天给予的两次注射(2剂)。数据表明，此N1脂质A配制品引发了稳健的免疫应答，如通过NA抑制(NAI)效价所指示的(图3A)。数据进一步表明，用一剂或两剂疫苗处理的小鼠被保护免于Belgium09 H1N1的致死病毒攻击(图3B)。保护水平与疫苗处理组相比于阴性对照组(hEPO和稀释剂)的NAI效价相关。
还在NHP模型中测试了用本发明的LNP配制的CA09 H1 mRNA。用脂质A和脂质B配制mRNA(10μg)，并且在研究第0天和第28天将其肌内地注射给食蟹猴(n＝6)。对于所有LNP，到第14天观察到可检测的HAI引发，并且到第28天观察到HAI效价的显著提高(图4，右小图)。ELISA数据还证明了对于所测试的所有剂量，到第14天相对于基线的显著引发，其中在加强后两周检测到稳健的提高(图4，左小图)。结果表明，本发明的H1 mRNA配制品导致稳健的免疫应答，如通过HAI和终点ELISA效价所指示的。
实施例3：流感H3N2 LNP疫苗配制品
本实施例描述了这样的实验，其中评价了流感毒株Sing16(H3N2)的mRNA-LNP疫苗配制品的效力。在这些实验中使用的mRNA之一是MRT1400。MRT1400是通过体外转录制造的生物合成的经密码子优化的HA-H3(流感病毒血凝素，H3亚型)信使RNA(CO-HA-H3 mRNA)。
下文示出了流感病毒血凝素H3亚型的蛋白质序列：
此蛋白质的编码序列是经密码子优化的。编码蛋白质的经密码子优化的序列示于图5A中(SEQ ID NO:2)，其中野生型序列显示为SEQ ID NO:3。mRNA结构和序列分别示于图5B和图5C中。如图所示，HA-H3 mRNA编码序列侧接分别为140和100个核苷酸的5'和3'非翻译区(UTR)。生物合成的HA-H3 mRNA还含有5'帽结构，其由经由倒5'-5'三磷酸桥与5'UTR的第一个核苷连接的7-甲基鸟苷(m7G)残基组成，所述第一个核苷本身通过2'-O-核糖甲基化进行修饰。5'帽对于核糖体起始翻译必不可少。整个线性结构在3'端以一束大约100至500个腺苷核苷(聚A)终止。聚A区为mRNA赋予稳定性，并且还被认为增强翻译。所有这些结构元件均是天然存在的用于促进HA-H3 mRNA的有效翻译的组分。
构建了DNA质粒，以用于通过体外转录产生经密码子优化的mRNA序列。使用RNA聚合酶进行体外转录(IVT)反应。沉淀反应混合物。将沉淀出的RNA样品装到单独的深度过滤盒上，用80％乙醇洗涤并用再循环H2O再溶解。以与第一步类似的方式泵送通过第二等分试样的H2O。将此步骤再重复一次。使用50kD中空纤维TFF盒对合并的洗脱物进行超滤/渗滤。然后稀释每种IVT TFF合并物以为帽和尾反应做准备。沉淀帽-尾反应物，并且如上所述纯化和收集来自反应的RNA。将过滤出的mRNA储存在-20℃下直到使用。
在这些实验中，用脂质A或脂质B LNP配制编码Sing16 NA(N2)或Sing16 HA(H3；MRT1400 mRNA)抗原的mRNA，并且在D0和D28将其以每剂0.4μg的mRNA肌内地注射给Balb/c小鼠(n＝8)。为了比较，通过肌内途径将1μg的具有水包油乳液佐剂(AF03)的重组Sing16H3或Sing16 N2蛋白注射给Balb/c小鼠(n＝8)。通过NAI和HAI测定测量免疫应答。
数据表明，用NA(N2)mRNA免疫的动物到第14天表现出可检测的NAI引发，并且到第28天表现出NAI效价的显著提高(图6，右小图)。数据还表明，HA Sing16脂质A和脂质B配制品在第28天加强后引发了稳健的HAI反应(图6，左小图)。
类似地，在非人灵长类动物(NHP)食蟹猴(n＝6)中评价了Sing16 HA mRNA脂质A和脂质B疫苗。通过肌内途径将用脂质A或脂质B配制的HA Sing 16mRNA(50μg)注射给食蟹猴。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。数据表明，疫苗在第28天加强时引发了稳健的免疫功能应答(图7A)。
另外，在NHP中评价了以下四种剂量水平的在脂质A中配制的HA Sing16mRNA(即，MRT5400疫苗)：15、45、135和250μg。在研究第0天给予第一次免疫，在研究第28天给予第二次免疫。对于所测试的所有剂量，所有NHP均表现出IgG结合和HAI效价，其中在第二次注射后两周(在D42)测试的各种剂量之间在免疫应答方面没有差异(图7B和图7C)。
在第二次疫苗接种后，还在NHP中评价了Sing16 HA mRNA脂质A疫苗的T细胞应答。在第42天收集外周血单个核细胞(PBMC)，并且将其与Sing16 H3重组蛋白或代表整个HA开放阅读框的肽合并物一起孵育过夜。在ELISPOT测定中评估了通过再刺激诱导的细胞因子。分泌IFN-γ(Th1细胞因子)(图8A)或IL-13(Th2细胞因子)(图8B)的PBMC的频率计算为每百万PBMC的斑点形成细胞(SFC)。在所测试的三种剂量水平组(250μg、135μg和45μg)中的大部分动物表现出IFN-γ分泌细胞的高频存在，其中每百万PBMC有超过100个SFC(图8A)。未观察到剂量反应，因为较低剂量水平组和较高剂量水平组的动物显示出相当频率的IFN-γ分泌细胞。相比之下，在所测试的任何组中且在任何剂量水平下均未检测到IL-13细胞因子分泌细胞的存在(图8B)。这些数据呈现了在NHP中在疫苗接种后对HA抗原的Th1偏向性细胞应答和缺乏Th2应答的明显证据。
实施例4：具有经修饰的mRNA的流感LNP疫苗配制品
本实施例描述了比较含有未经修饰的(未经修饰的非复制性或“UNR”)和经修饰的(经修饰的非复制性或“MNR”)mRNA的疫苗的效力的实验。通过体外转录制备了UNR CA09 HAmRNA和MNR CA09 HA mRNA。在MNR中，所有尿苷均被假尿苷代替。
通过肌内途径将五种不同剂量(0.016、0.08、0.4、2和10μg)的用脂质A配制的CA09HA mRNA(经修饰的或未经修饰的)注射给Balb/c小鼠(n＝15)。数据表明，LNP配制品增加了裸mRNA(UNR)的稳定性和递送效率，因为UNR与MNR mRNA之间的效力相当，如通过HAI效价所指示的(图9A)。Balb/c小鼠的ELISA数据还证明了对于所测试的所有剂量，到第14天相对于基线的显著引发(UNR和MNR mRNA两者)，其中在加强后两周检测到稳健的提高。数据还表明，UNR和MNR mRNA在引发ELISA效价方面是相当的(图9B)。
总之，本发明的剂量调整研究证明，用脂质A配制的未经修饰的和经修饰的CA09HA mRNA在Balb/c小鼠中引发了统计上不可区分的免疫应答，如通过HAI或通过终点ELISA测定所指示的。用四种较高剂量的UNR和MNR mRNA免疫的Balb/c小鼠到第14天表现出可检测的HAI引发，并且对于所有剂量，到第42天表现出HAI效价的显著提高。这些第14天引发效价代表剂量效应和剂量节省可能性两者，以用于在125倍的范围内产生可检测的效价。相同剂量范围的第二次注射效价确认了对此mRNA-LNP配制品的免疫应答的稳健性。在非人灵长类动物中也观察到类似的结果。
实施例5：多价流感疫苗LNP配制品
本实施例描述了使用含有编码CA09 HA的mRNA(如实施例2中所述)和编码Sing16HA的mRNA(如实施例3中所述)的基于脂质A的LNP疫苗的研究。
更具体地，在Balb/c小鼠(n＝8)中评价了在脂质A中共包封的CA09 HA mRNA和Sing16 HA mRNA。将mRNA-LNP作为共包封的两种mRNA施用或者作为单独包封的mRNA分开给药。对于两种方法，通过肌内注射将总共0.4μg的LNP配制品注射给小鼠。在研究第0天给予第一次注射，并且在研究第28天给予第二次注射。数据表明，疫苗引发了稳健的免疫功能应答。两种施用方法之间似乎没有任何差异。这些数据表明，共包封没有导致两种mRNA之间的妨碍或干扰。
实施例6：对多价流感疫苗LNP配制品的进一步研究
制备了一组编码以下的未经修饰的mRNA：CA09 HA、Sing16 HA、Sing16 NA、Mich15NA、A/佩斯/16/2009流感病毒(Perth09 NA)以及萤火虫萤光素酶(FF)和hEPO的报告抗原。然后在体外测试了HA和NA mRNA-LNP制剂的LNP配制品的表达，在动物中测试了所述LNP配制品的免疫应答，并且在临床前模型中测试了所述LNP配制品的效力。对于本实施例中的研究，所有的LNP配制品均是脂质A配制品。
材料与方法
mRNA-LNP制备
通过使用未经修饰的核苷酸利用RNA聚合酶与编码所需基因的质粒DNA模板的体外转录合成了编码hEPO、FF、CA09 HA、Sing16 HA、Mich15 NA和Sing16 NA的mRNA转录物。如通过凝胶电泳确定的，经由酶促添加长度为大约200个核苷酸的5'帽结构(帽1)和3'聚(A)尾使所得的经纯化的前体mRNA进一步反应，并且对其进行纯化。在-20℃下储存之前，分析所有mRNA制剂的纯度、完整性和帽1的百分比。上文描述了mRNA/脂质纳米颗粒(LNP)配制品的制备。简而言之，在固定的脂质和mRNA比率下，将脂质(可电离的脂质、磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇-脂质)的混合物的乙醇溶液与靶mRNA的水性缓冲溶液在受控的条件下在酸性pH下合并，以得到均匀LNP的悬浮液。在超滤和渗滤到合适的稀释剂体系中后，将所得的纳米颗粒悬浮液稀释至最终浓度，过滤，并且在-80℃下冷冻储存直到使用。表征了mRNA-LNP配制品的尺寸(通过动态光散射)、包封百分比，并且在-80℃下以1mg/mL储存，直到通过用合适的缓冲液稀释而进一步使用。利用hEPO-LNP和FF-LNP来检查靶蛋白的体内表达水平。
在HeLa细胞中表达的S蛋白的可视化
使用先前所述的方法(Kalnin等人,npj Vaccines(2021)6:61)，在用二价H3N2(Sing16 HA和Perth09 NA)mRNA LNP转染的HeLa细胞中进行流感NA和HA蛋白的免疫细胞化学-免疫荧光分析。将细胞固定在4％多聚甲醛中，并且进行针对HA(GeneTex GTX40258)、NA和ER标记钙联蛋白(Abcam ab22595)的受试抗体染色。在共聚焦显微镜上捕获图像，然后进行图像分析，以用于定量HA和NA到ER的共定位、平均信号强度和细胞面积百分比。
流式细胞术
在37℃与5％CO2下在补充有GlutaMAX(Life Technologies)、链霉素、青霉素(Gibco)和20％热灭活的FBS(VWR)的M199(Life Technologies)中培养人骨骼肌细胞(HskMC，Lonza)。通过胰蛋白酶化收获细胞，将其用PBS洗涤，并且按照制造商的电穿孔程序D-033在Nucleofector 2b(Lonza)上使用人原代肌细胞转染试剂盒以12mg的mRNA/106个细胞进行电穿孔。24小时后，将收获的细胞固定，用CYTOFIXTM/Perm(BD)透化，并且用CA09 HA(Immune Tech)、Sing16 HA(30-2F11-F7-A5，GeneTex)、Mich15NA(6G6，Immune Tech)和Sing16 NA(40017-RP01，Sino Biologicals)特异性Ab染色，然后用PE缀合的山羊抗小鼠IgG第二Ab(Southern Biotech)或AF647缀合的山羊抗兔IgG(Life Technologies)染色。然后通过Fortessa(BD)获得经抗体标记的细胞，并且通过FLOWJOTM(TreeStar)分析每种蛋白质的表达。
低温透射电子显微镜检查
使用PELCO EASIGLOWTM装置来在施加LNP样品之前对网格进行等离子体清洁，并且使用将室保持在100％湿度和18℃下的Vitrobot Mark IV系统(ThermoFisher)进行急速冷冻。将3.0μl的LNP样品微滴分配到具有碳膜和金条的300目R2/1网格上。对网格印迹4秒，将其在原地保持10秒，然后立即在液体乙烷中急速冷冻以储存并转移到Krios显微镜上。使用在计数模式下操作的配备有BioQuantum能量过滤器和K3直接电子检测器(Gatan)的Titan Krios透射电子显微镜(ThermoFisher)收集曝光。检测器处的校准物理像素尺寸为对应于64,000x放大率。在散焦在-0.5至-1.7μm之间的情况下，在每帧为的剂量下收集了总共3,141个69帧的影片曝光。对于每个影片曝光，使用RELION-3.1.34进行基于贴片的移动校正、超分辨率像素的分箱和帧剂量加权。从校正图像中提取了超过700个候选颗粒坐标。用具有图像处理工具箱的MATLAB R2019a进行随后的数据分析。
对小鼠和NHP进行免疫以用于表达研究
向各组四只食蟹猴(NHP)(雄性和雌性)四至八只雄性BALB/c小鼠肌内地施用剂量为10μg(NHP)或者1、0.5、0.1和0.05μg(小鼠)的以与旨在用于HA/NA mRNA-LNP配制品的比率相同的比率制备的hEPO-LNP。在施用前以及在施用后6h、24h、48h、72h和96h取血样，以便按照制造商的方案使用R and D Systems的ELISA人红细胞生成素免疫测定试剂盒经由ELISA监测血清hEPO表达，并且报告为mIU/ml和ng/ml的最终值。简而言之，将用对EPO具特异性的小鼠单克隆抗体预包被的微孔板孔与标本或标准品一起孵育。在除去过量的标本或标准品之后，将孔与缀合至辣根过氧化物酶的兔抗EPO多克隆抗体一起孵育。在第二次孵育期间，抗体-酶缀合物与固定的EPO结合。通过洗涤除去过量的缀合物。将色原添加到孔中，并且通过酶反应氧化以形成蓝色的复合物。通过添加酸终止反应，这使蓝色变为黄色。所产生的颜色的量与结合至EPO抗体复合物的缀合物的量成正比，后者反过来又与标本或标准品中EPO的量成正比。测量此复合物的吸光度，并且通过绘制吸光度相对于EPO标准品的浓度产生标准曲线。通过将标本的光密度与标准曲线进行比较来确定未知标本的EPO浓度。在此测定中使用的标准品是针对第二国际参考制剂(67/343)(尿液源形式的人红细胞生成素)校准的重组hEPO。
对小鼠和NHP进行免疫以用于免疫原性研究
按照处理组将各组的Balb/c小鼠(小家鼠(Mus musculus))在异氟醚麻醉下经由IM途径在四头肌中用一定剂量的0.05mL的指定的疫苗制剂或稀释剂免疫，在第0天在一条后腿中进行免疫，并且在第28天在对侧腿中进行免疫。在研究终止之前，在兽医对动物的健康进行评估之后，对减轻超过20％的初始体重和显示严重临床体征的小鼠实施安乐死。
选择未经处理的雄性和雌性毛里求斯源食蟹猴(Cynomolgus macaques/Macaca fascicularis)用于研究。在研究开始时，动物称重>2kg，并且年龄>2岁。在分配到研究之前，为研究所选择的动物进行了综合体检。根据NIRC SOP的适用情况，健康状况的分配前评估包括实际操作的兽医检查和血样采集用于CBC分析。通常成对地饲养动物并在研究开始之前适应至少3天。各组由最多6只动物/处理组组成。在研究第0天，将所有动物在氯胺酮HCl(10mg/kg，IM)或泰拉唑(telazol)(4-8mg/kg，IM)镇静下经由IM途径在每只动物的一条前肢中瞄准三角肌用一定剂量的0.5ml的各自的疫苗制剂或稀释剂免疫。在第一次免疫发生后二十八天，在对侧肢中向动物给予第二次免疫。
对小鼠和NHP进行免疫以用于激发研究
在最后一次免疫后大约9-12周为小鼠接种激发毒株。将储备病毒的小瓶解冻并在冰冷的无菌PBS中稀释至适当浓度。将所有小鼠用含有在PBS中的105.54TCID50(其等于4LD50)的Belgium09病毒的50μl的总体积激发。在增强的ABSL2实验室中，在生物安全柜内进行病毒激发。将小鼠首先通过IP注射氯胺酮/塞拉嗪溶液(50mg/kg氯胺酮和5mg/kg塞拉嗪)麻醉，然后使用微量移液管用总体积为50μl的流感病毒IN激发(逐滴滴到两个鼻孔中；每个鼻孔25μl)。在激发程序后，将小鼠置于背卧位，并且观察直到从麻醉中恢复。在H1N1激发后称每日体重。对单次观察体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。将体重测量值在激发后每日记录在在线数据库(版本7.5.0Build 8)中直到安乐死，或者写在研究专用工作表中。
采血
对于小鼠，在镇静下经由下颌下或眶窦放血(活体放血，研究前和研究第14天、第28天和第42天，大约200μl)和心脏穿刺(终末放血，第56天)从所有动物采集血液。在研究前给小鼠放血，以获得基线免疫前血清样品并用于预筛选目的。血清的处理，将血样采集到SST管中，并且允许其在室温下凝结30分钟至1小时。然后在关闭制动的情况下，将样品以1000-1300g离心5-10分钟。使用P200移液器采集血清，将其分到两个0.5ml的冷冻小瓶中，并且储存在-20℃下。所有放血均记录在标本采集和处理日志中，指示样品采集时间和负责执行程序的技术人员。在HAI或ELLA和ELISA测定中评价了一部分血清样品的抗体效价。
在使用10mg/kg氯胺酮/1mg/kg乙酰丙嗪肌内施用的麻醉下的同时给NHP放血以分离血清(第-4天、第2天、第7天、第14天、第28天、第30天、第35天、第42天、第56天、第90天和第180天)。所抽出的血液的体积未超过关于体重百分比和动物身体状况的既定指导。使用与BDSSTTM凝胶管连接的Vacutainer 21ga x1”采血针或Abbott Butterfly23ga x3/4”管，使用股静脉穿刺从经麻醉的NHP抽血。通过使管在室温下以1200x g的速度旋转10分钟来分离血清。然后将血清等分到经标记的冷冻小瓶(1ml/小瓶)中，并且储存在≤-20℃下。在HAI或ELLA和ELISA测定中评价了一部分血清样品的抗体效价。对于PBMC，在疫苗接种前给NHP预放血，并且在第一次注射后大约42-63天再次放血。为此目的，将血液采集到含有肝素抗凝血剂的BD管中。简而言之，将抗凝血的血样在PBS中稀释，并且使用分离溶液(Sigma)对其在400x g下进行30分钟梯度密度离心。然后收集含有单核细胞的不透明界面，将其在PBS中洗涤三次，使用低速(250x g)离心用于最后一次离心以减少血小板的数量。使用Nexcelom Cellometer K2枚举活和死PBMC。使用MR.冷冻盒在具有10％DMSO的FBS中冷冻保存PBMC。将盒子立即置于-80℃冷冻箱中24小时，然后转移以储存在液氮罐中。
ELISA
使用重组产生的Sing16 NA蛋白、Sing16 HA蛋白或CA09 HA蛋白进行抗体ELISA。在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中以2μg/ml的浓度在96孔高结合聚苯乙烯板上捕获蛋白质。将板覆盖并在2℃-8℃下孵育过夜(16±4小时)。在孵育过夜后，将经抗原包被的板用洗涤缓冲液(PBS，0.5％Tween20)洗涤5次，并且在室温下用封闭溶液(PBS中10％BSA)封闭60±30分钟。将测试样品、未经处理的对照和参考样品稀释在样品稀释剂(PBS 10％BSA 0.5％Tween 20)中，并且一式两份地添加到孔中，然后在室温下孵育90分钟。将板用洗涤缓冲液洗涤5次，并且以1:10,000的稀释度添加山羊抗小鼠HRP(对于小鼠血清)或山羊抗猴HRP(对于NHP血清)。然后将板在室温下孵育30分钟，并且用洗涤缓冲液洗涤过量的HRP-IgG。将Sure-Blue TMB底物添加到每个板中，并且在约10分钟后用TMB终止溶液终止反应。然后在450nm下用Thermo Labsystems MULTISKANTM分光光度计读取板。抗抗原(HA或NA)特异性抗体效价表示为吸光度值>0.3的最高血清稀释度的倒数。
HAI测定
使用Sing16 H3N2和CA09 H1N1病毒储备物(BIOQUAL,Inc.)进行HAI测定。通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理血清，并且将其在37℃水浴中孵育过夜。通过在56℃下孵育30分钟的时间，然后添加六份PBS至1/10的最终稀释度来使酶失活。使用四个血凝单位(HAU)的病毒和0.5％火鸡RBC在V形底96孔板中进行HAI测定。在每个测定板上包括每种毒株的参考血清作为阳性对照。每个板还包括返滴定以确认抗原剂量(4HAU/25μl)以及阴性对照样品(PBS或未经处理的对照血清)。HAI效价确定为导致血凝完全抑制的最高血清稀释度。仅仅具有适当的返滴定结果(验证添加了4HAU/25μl)且参考血清效价在预期效价的2倍内的板的结果有效。
NAI测定
使用酶联凝集素测定法(ELLA)测定的方法来确定神经氨酸酶抑制(NAI)抗体效价。调整抗原(病毒NA)的来源，并且选择标准量以与血清的连续稀释液一起孵育。用血清(在56℃下热灭活1小时)的连续稀释液进行血清的滴定，并且将标准量的病毒添加到经胎球蛋白包被的板的重复孔中。然后将此混合物孵育过夜(16-18小时)；第二天，将HRP缀合的花生凝集素PNA(稀释至2.5μg/ml)添加到经洗涤的板中，并且在室温下孵育2小时。添加底物(在柠檬酸钠中的ODP)并孵育10分钟以使颜色显色。然后添加终止缓冲液(1N硫酸)以终止反应。扫描板以得到在OD 490nm下的吸光度。由于存在NA特异性抗体，相对于病毒对照的颜色减少或不存在表明了NA活性的抑制。从OD读数计算NAI效价(IC50值)，并且在GraphPadPrism中绘制结果。如果ELLA滴定曲线不允许良好的拟合来确定可靠的IC50值，则使用不同的稀释方案来重新测试样品以达到50％终点。
T细胞ELISPOT测定
将完全培养基(DMEM1640+10％热灭活的FCS)在37℃水浴中预热。将PBMC在37℃水浴中迅速解冻，并且逐滴转移到具有预热的培养基的锥形管中。将管以1,500rpm离心5min，并且将细胞重悬并使用Guava细胞计数器计数。使用猴IFN-γELISPOT试剂盒(Mabtech3421M-4APW)和IL-13ELISPOT试剂盒(Mabtech 3470M-4APW)。将由试剂盒提供的预包被的板用无菌PBS洗涤四次，并且在37℃培养箱中用200μl的完全培养基封闭至少30分钟。将Sing16 H3肽合并物(Genscript Custom Order)(每种肽为1μg/ml)在测定中用作回忆抗原。将2μg/ml的ConA(Sigma，目录号C5275)用作阳性对照。将50μl的回忆抗原和50μl的300,000个PBMC添加到每个孔中以进行刺激。将板置于37℃、5％CO2加湿培养箱中48小时。
在孵育后，除去细胞，将板用PBS洗涤5次，并且将100μl的1μg/ml生物素化的抗IFN-γ或抗IL-13检测抗体添加到板的每个孔中。在孵育2小时后，将板用PBS洗涤5次，并且在室温下与每个孔中100μl的链霉亲和素的1:1000稀释液一起孵育一小时。用100μl的BCIP/NBT底物溶液使板显色，直到出现斑点。将板用自来水冲洗，风干并扫描，并且使用CTL读取器(Cellular Technology Ltd.)计数。数据报告为每百万PBMC的斑点形成细胞(SFC)。
记忆B细胞(MBC)ELISPOT测定
按照制造商的说明书，使用人IgG单色记忆B细胞ELISPOT试剂盒(目录号NC1911372，CTL)来测量Sing16 H3特异性和总IgG+抗体分泌细胞(ASC)。通过使用由试剂盒提供的刺激混合物在PBMC中进行MBC到ASC的分化。简而言之，将冷冻的PBMC在37℃水浴中迅速解冻，与DNA酶I(目录号90083，Fisher Scientific)混合并转移到含有预热的完全培养基(CM)(RPMI 1640(目录号22400-089，Gibco)，含有10％FCS(目录号SH30073.03，HYCLONETM)和1％青霉素/链霉素(目录号P4333，Sigma))的管中，并且以1,500rpm离心5分钟。将细胞沉淀以2x106个细胞/ml重悬在5ml的完全培养基中，并且转移到37℃下的5％CO2培养箱中的T25烧瓶中1小时。然后将细胞悬浮液的体积调整到6ml，并且以1:1000稀释度添加B-Poly-S。将细胞留在CO2培养箱中以刺激4天。将由试剂盒提供的PVDF微孔板用70％乙醇预湿，冲洗，并且用80μl/孔的由试剂盒提供的抗人IgG捕获Ab或4μg/ml的Sing16/H3重组蛋白包被过夜。
在刺激4天后收获细胞，将其洗涤并计数，并且在CM中调整到指定的浓度。将经包被的微孔板用PBS洗涤，用CM封闭1小时并清空。将细胞悬浮液以100μl/孔添加到板中，并且在37℃下在CO2培养箱中孵育18h。在洗涤后，将80μl/孔的1:400稀释的抗人IgG生物素检测抗体添加到板中，并且在室温下孵育2小时。在洗涤后，将1:1000稀释度的链霉亲和素-AP以80μl/孔添加到板中持续1小时。添加新鲜制备的底物溶液并在室温下孵育18min。将板用自来水冲洗，风干并扫描，并且使用CTL读取器(Cellular Technology Ltd)计数。对于每只个体动物，计算每百万PBMC的IgG+ASC的数量和Sing16/H3特异性ASC的数量。抗原特异性ASC的频率计算为抗原特异性ASC比总IgG+ASC的％。为了评估测定背景，将每个板上的阴性对照孔用PBS包被(未检测到背景)。
统计分析
为了估计辐射的Tmax，使用非参数方法基于观察到的数据来估计个体受试者的Tmax。为了估计辐射半衰期，假设在达到最大值之后的辐射呈指数衰减模型，将线性模型拟合到每个受试者的从最大辐射衰减到基线的时间进程期间对数变换的数据(我们使用盐水中的辐射平均值估计基线)。半衰期估计为当辐射对数值已经达到最大值与基线值之间的中间点时的时间点。为了分析结果总结为几何平均值的不同读出，从重复测量的混合效应模型估计基于SE模型的几何平均值和SE，其中响应是对数变换的读出，疫苗接种是固定效应并且时间是重复量度；然后，将来自模型的基于对数的平均值和SE估计值反向变换以得到几何平均值和SE。对于体重变化，使用过描述性(over descriptive)统计分析。报告了每组的随时间的相对于基线(第0天)的体重减轻最大值％的中值和范围以评价更糕的情况；报告了在最后一次观察时每组的相对于基线的体重变化％的中值和范围以评价体重恢复。
抗原序列
本文使用的Perth09 N2抗原的序列是：
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERN
ITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCDITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYV
SCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNNTVRDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSC
HDGKAWLHVCITGDDKNATASFIYNGRLVDSVVSWSKEILRTQESECVCINGTCTVVMTDG
SASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDI
NIKDHSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTI
SEKSRLGYETFKVIEGWSNPKSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKEETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI*(SEQ ID NO:4)
本文使用的Mich15 N1抗原的序列是：
MNPNQKIITIGSICMTIGMANLILQIGNIISIWVSHSIQIGNQSQIETCNQSVITYENNTW
VNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFI
SCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASA
CHDGINWLTIGISGPDSGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTIMTD
GPSDGQASYKIFRIEKGKIIKSVEMKAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVS
FNQNLEYQMGYICSGVFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSIS
SRKGFEMIWDPNGWTGTDNKFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPEENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK*(SEQ ID NO:5)
本文使用的Sing16 H3抗原的序列是：
MKTIIALSYILCLVFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQN
SSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYA
SLRSLVASSGTLEFKNESFNWTGVTQNGTSSACIRGSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVT
MPNKEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPS
RISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIP
NDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGW
YGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEK
YVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHK
CDNACIESIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI*(SEQ ID NO:6)
本文使用的Sing16 N2抗原的序列是：
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERN
ITEIVYLTNTTIEKEICPKPAEYRNWSKPQCGITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYV
SCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNNTVRDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSC
HDGKAWLHVCITGDDKNATASFIYNGRLIDSVVSWSKDILRTQESECVCINGTCTVVMTDG
NATGKADTKILFIEEGKIVHTSKLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDI
NIKDHSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTI
NETSRLGYETFKVVEGWSNPKSKLQINRQVIVDRGDRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELI RGRKEETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADLNLMHI*(SEQ ID NO:7)
本文使用的CA09 H1抗原的序列是：
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKL
RGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQL
SSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYI
NDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDREGRM
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本文使用的HA毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)(CA09)抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：
AUGAAAGCUAUCCUGGUCGUCUUGCUGUAUACUUUCGCCACUGCCAACGCCGAC
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本文使用的A/密歇根/45/2015(Mich15)神经氨酸酶(NA)抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAACCCAAACCAGAAAAUCAUCACGAUUGGCUCGAUUUGCAUGACCAUUGGAAUGGCGAACCUUAUCCUCCAAAUUGGCAACAUUAUCUCGAUCUGGGUCAGCCACUCGAUCCAGAUCGGCAACCAAUCCCAGAUUGAAACUUGCAACCAGAGCGUGAUUACUUACGAAAACAACACGUGGGUGAACCAGACUUACGUCAAUAUUAGCAACACUAACUUCGCCGCUGGGCAGAGCGUCGUCAGCGUGAAGCUCGCCGGAAAUUCCUCGCUCUGCCCCGUGUCCGGCUGGGCGAUCUACAGCAAGGAUAACAGCGUCCGGAUUGGUAGCAAGGGCGACGUUUUCGUGAUCCGCGAACCCUUCAUAUCAUGCUCCCCGCUCGAAUGUCGCACGUUCUUCCUGACCCAAGGCGCCCUGCUGAACGACAAGCACUCCAAUGGCACUAUCAAGGAUCGGAGCCCUUACCGGACCUUGAUGUCCUGCCCUAUUGGAGAAGUGCCUUCACCAUAUAACUCGCGCUUUGAAAGCGUGGCUUGGUCAGCCUCCGCCUGCCAUGACGGGAUUAACUGGCUGACCAUUGGCAUAAGCGGCCCCGAUUCCGGCGCCGUGGCCGUCCUGAAGUACAACGGGAUCAUCACCGACACCAUUAAGUCCUGGCGCAACAACAUCCUGAGGACCCAGGAGUCCGAGUGCGCGUGCGUGAACGGGUCCUGCUUUACCAUCAUGACCGACGGACCGUCCGACGGUCAAGCCUCGUACAAGAUCUUCCGGAUCGAGAAAGGAAAGAUCAUCAAGAGCGUGGAGAUGAAGGCCCCGAACUACCACUACGAGGAAUGUUCAUGCUAUCCCGACUCGUCCGAGAUUACUUGCGUGUGCCGCGACAAUUGGCACGGAUCCAACAGGCCGUGGGUCAGCUUCAACCAGAACCUUGAAUACCAGAUGGGAUACAUUUGCAGCGGAGUGUUCGGGGACAACCCUCGCCCGAACGACAAGACCGGAUCGUGUGGGCCCGUGUCCUCCAACGGCGCAAACGGCGUCAAGGGAUUUUCCUUCAAAUACGGGAACGGGGUCUGGAUCGGACGGACCAAGAGCAUUUCAAGCAGAAAGGGAUUCGAGAUGAUUUGGGACCCGAACGGCUGGACUGGUACCGAUAACAAAUUCAGCAUCAAGCAGGACAUCGUGGGAAUUAACGAGUGGUCCGGUUACUCCGGGAGCUUCGUGCAGCAUCCCGAACUCACUGGACUGGACUGCAUUCGGCCGUGCUUUUGGGUGGAAUUGAUCCGGGGCAGACCUGAGGAGAACACGAUUUGGACCUCCGGCUCCUCGAUCUCGUUCUGCGGAGUGAACUCCGACACCGUGGGAUGGUCCUGGCCCGACGGUGCAGAGCUGCCCUUCACCAUUGAUAAGUAA(SEQ ID NO:9)
本文使用的A/新加坡.INFIMH160019/2016（Sing16；H3N2）HA血凝素抗原mRNA开放阅读框（ORF）的序列是：
AUGAAAACCAUAAUCGCGCUCUCAUACAUACUUUGCCUGGUCUUUGCCCAAAAGAUCCCUGGCAACGACAACUCAACCGCGACCCUUUGCCUCGGCCAUCACGCCGUGCCGAACGGCACUAUCGUCAAGACCAUCACAAACGACCGCAUCGAAGUGACCAACGCGACUGAGCUAGUGCAGAACUCCAGCAUUGGAGAGAUUUGCGAUUCUCCACACCAAAUCCUGGACGGAGAGAAUUGUACCUUGAUCGACGCGCUGCUGGGGGAUCCGCAGUGCGACGGAUUCCAGAACAAGAAAUGGGACCUUUUCGUGGAACGGAGCAAGGCAUACUCGAAUUGCUACCCCUACGAUGUGCCCGACUACGCCUCGCUGCGGUCCUUGGUCGCUUCCUCCGGGACCCUGGAAUUCAAAAACGAGAGCUUUAAUUGGACCGGAGUGACCCAGAAUGGCACCUCGAGCGCCUGCAUUCGGGGCUCCUCCUCGAGCUUCUUCAGCCGCCUGAACUGGCUCACUCACCUCAACUACACCUACCCGGCACUGAACGUGACCAUGCCGAACAAGGAACAAUUCGACAAGCUCUACAUUUGGGGGGUGCAUCACCCGGGUACCGAUAAGGACCAGAUCUUCCUCUACGCCCAAUCCUCGGGCCGGAUCACCGUGUCCACUAAGCGCUCGCAGCAGGCCGUGAUCCCGAACAUUGGAAGCAGACCCCGCAUUCGCGACAUUCCAUCGAGGAUCUCGAUCUACUGGACGAUUGUCAAGCCUGGCGACAUCCUCCUCAUUAACUCCACCGGGAACCUCAUCGCCCCUCGGGGUUAUUUCAAGAUCCGCAGCGGGAAGUCCUCCAUCAUGAGAAGCGAUGCCCCCAUUGGAAAGUGCAAGUCCGAGUGUAUCACACCUAACGGAAGCAUUCCCAAUGACAAGCCAUUCCAGAACGUGAACAGAAUUACCUACGGAGCUUGCCCUCGCUACGUCAAACAUUCGACCCUCAAGUUGGCGACUGGAAUGCGCAACGUGCCGGAGAAGCAAACCCGGGGGAUCUUCGGGGCUAUCGCGGGAUUCAUCGAAAAUGGAUGGGAAGGAAUGGUCGAUGGUUGGUACGGUUUCAGACACCAGAACUCCGAGGGGCGGGGCCAGGCCGCAGACCUGAAGUCCACUCAGGCCGCGAUUGACCAGAUCAACG
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本文使用的佩斯/16/2009(H3N2)NA抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAACCCUAACCAGAAGAUCAUCACAAUUGGAAGCGUGUCCCUGACCAUUUCGACGAUUUGCUUCUUCAUGCAAAUCGCGAUCUUGAUUACCACCGUCACCCUGCAUUUCAAGCAAUACGAAUUCAACUCCCCGCCAAACAACCAAGUCAUGCUCUGCGAGCCCACCAUCAUCGAACGCAACAUCACCGAGAUCGUGUACCUUACCAACACUACCAUCGAAAAGGAGAUUUGCCCCAAGUUGGCCGAAUACCGGAACUGGAGCAAGCCCCAGUGUGACAUCACGGGAUUUGCGCCAUUCAGCAAGGAUAACUCGAUCAGACUUUCCGCCGGGGGCGACAUUUGGGUCACUCGGGAGCCUUACGUGAGCUGCGACCCGGACAAGUGCUACCAAUUCGCACUCGGACAGGGUACCACCCUGAACAACGUCCAUAGCAACAACACCGUGCGCGAUAGAACCCCGUACCGCACCCUCCUCAUGAACGAACUGGGAGUGCCGUUCCACUUGGGAACCAAACAAGUCUGCAUUGCAUGGUCCUCCUCCUCCUGCCACGACGGCAAAGCCUGGCUUCACGUUUGCAUCACCGGCGACGACAAGAAUGCGACGGCCUCCUUCAUAUACAAUGGUAGACUCGUGGAUAGCGUGGUGUCAUGGUCCAAGGAAAUUCUCAGGACUCAGGAGUCAGAGUGCGUGUGCAUCAACGGGACUUGCACUGUCGUGAUGACCGACGGAUCGGCCUCCGGAAAGGCCGACACUAAGAUCCUCUUCAUCGAGGAGGGAAAGAUCGUGCACACUUCUACCCUGAGCGGCUCGGCUCAGCAUGUCGAAGAGUGCUCGUGCUACCCCCGGUAUCCCGGGGUCCGCUGCGUGUGCCGGGACAAUUGGAAAGGCUCAAACCGCCCCAUCGUGGACAUUAACAUCAAGGACCACUCCAUCGUGAGCUCCUACGUAUGCAGCGGGCUGGUCGGGGAUACCCCGCGGAAGAACGAUUCCUCGUCCUCCUCCCACUGCCUGGACCCUAACAACGAAGAGGGAGGCCACGGAGUGAAGGGAUGGGCUUUUGACGAUGGCAACGACGUGUGGAUGGGCAGGACUAUUUCCGAAAAGUCCCGGCUGGGAUACGAAACCUUCAAGGUCAUCGAGGGCUGGUCCAACCCGAAGUCAAAGCUCCAGAUCAACCGCCAGGUCAUCGUGGAUAGGGGCAAUAGAUCCGGCUACUCCGGGAUCUUCAGCGUGGAAGGGAAGUCCUGCAUUAACCGAUGCUUCUACGUGGAACUCAUUCGGGGUCGGAAGGAGGAAACCGAAGUGCUGUGGACUUCGAACUCAAUCGUGGUGUUUUGUGGGACCUCCGGAACUUACGGAACUGGGUCCUGGCCUGACGGUGCCGACAUCAACCUUAUGCCGAUCUAA(SEQ ID NO:11)
本文使用的A/威斯康星/588/2019抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAAAGCCAUCCUUGUUGUCAUGCUGUACACAUUCACCACCGCAAAUGCGGAUACCCUGUGUAUCGGCUACCACGCAAAUAAUUCCACCGACACCGUUGAUACCGUCCUGGAAAAGAACGUGACAGUGACUCACAGCGUCAAUCUCCUUGAGGAUAAACAUAAUGGCAAGCUGUGCAAGCUGAGAGGCGUGGCUCCCCUGCAUCUGGGAAAGUGCAACAUCGCUGGUUGGAUCCUCGGGAACCCAGAGUGUGAGUCCCUCUCAACCGCACGGUCUUGGUCAUACAUCGUGGAGACUAGCAAUUCAGACAACGGCACAUGCUACCCCGGUGACUUCAUUAACUACGAGGAGCUGAGAGAACAGCUGAGUUCCGUGUCAUCCUUCGAGAGAUUCGAAAUCUUCCCCAAAACCUCCUCCUGGCCCAAUCAUGACUCCGACAAUGGAGUGACAGCCGCUUGUCCCCACGCCGGUGCCAAGAGUUUCUAUAAGAACCUCAUCUGGCUGGUGAAAAAGGGCAAGUCCUAUCCCAAAAUUAACCAGACCUACAUUAACGAUAAGGGGAAAGAAGUCCUGGUCCUGUGGGGGAUAC ACCACCCCCCUACCAUCGCCGACCAGCAGUCUCUGUAUCAGAACGCCGACGCCUACGUGUUCGUGGGUACCAGCCGUUAUAGUAAAAAGUUCAAGCCAGAAAUUGCCACCAGACCUAAGGUGCGCGACCAGGAGGGCCGCAUGAACUACUACUGGACCCUGGUGGAACCUGGCGACAAGAUUACAUUCGAGGCCACUGGGAACCUGGUGGCACCCAGAUACGCCUUUACAAUGGAACGGGAUGCUGGGAGCGGAAUCAUUAUCUCCGAUACCCCUGUCCACGACUGCAAUACUACCUGUCAGACCCCAGAAGGCGCUAUCAAUACCUCUCUGCCUUUCCAAAACGUGCACCCUAUCACUAUCGGGAAAUGUCCCAAGUAUGUGAAAAGCACCAAACUGCGCCUGGCAACCGGUCUGAGAAAUGUGCCCUCCAUCCAGUCCCGCGGCUUGUUCGGUGCAAUCGCUGGCUUUAUCGAGGGUGGCUGGACUGGAAUGGUCGAUGGCUGGUACGGCUACCAUCACCAGAACGAGCAGGGGUCCGGGUAUGCUGCCGACCUGAAAAGCACUCAGAACGCCAUCGAUAAAAUCACUAACAAGGUGAACUCCGUGAUCGAAAAGAUGAAUACACAGUUCACAGCAGUUGGCAAGGAGUUCAACCACCUGGAAAAACGGAUAGAGAACCUGAAUAAGAAAGUCGAUGAUGGCUUUCUGGACAUCUGGACUUACAAUGCCGAGCUGCUGGUGCUCCUGGAAAACGAGCGGACACUGGAUUAUCACGACUCAAACGUGAAGAACCUGUAUGAAAAGGUGCGUAACCAGCUGAAAAACAACGCCAAGGAAAUCGGCAAUGGCUGUUUCGAAUUUUACCACAAGUGUGAUAAUACCUGUAUGGAGAGCGUUAAGAACGGGACUUACGACUACCCAAAAUACAGCGAGGAGGCCAAGCUGAACCGGGAGAAGAUCGACGGCGUCAAACUCGACUCCACUAGAAUAUACCAGAUUCUCGCCAUCUAUAGCACAGUGGCAUCAAGUCUCGUCCUGGUGGUGUCACUGGGAGCCAUCAGCUUUUGGAUGUGCAGCAAUGGAUCCCUCCAGUGUAGGAUCUGCAUCUAA(SEQ ID NO:12)
本文使用的A/塔斯马尼亚/503/2020抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAAGACCAUCAUCGCUCUGUCCUACAUCCUGUGCCUGGUGUUUGCUCAGAAAAUCCCCGGGAAUGACAAUUCCACUGCCACUCUCUGCCUGGGCCAUCAUGCCGUGCCAAAUGGAACCAUUGUCAAGACUAUAACAAAUGACCGCAUCGAAGUGACCAACGCUACCGAGCUGGUUCAGAACAGCAGUAUUGGAGAAAUCUGCGAUUCCCCACACCAGAUACUGGAUGGCGGCAACUGCACCCUGAUCGACGCACUGCUGGGUGACCCUCAGUGCGACGGAUUUCAGAAUAAGGAGUGGGACCUUUUCGUUGAGCGCAGCAGAGCCAAUAGCAACUGCUACCCGUACGACGUGCCGGAUUACGCCAGUCUUCGAAGCCUGGUCGCAUCCAGCGGGACACUGGAGUUUAAGAAUGAGUCCUUUAAUUGGACAGGCGUGAAGCAGAACGGGACUAGCAGCGCAUGCAUUCGGGGCAGUAGCUCAUCCUUCUUUAGCCGACUGAACUGGCUGACCCACCUCAACUACACAUACCCCGCACUGAAUGUGACUAUGCCAAACAAAGAACAGUUUGACAAACUGUACAUCUGGGGAGUGCACCAUCCUAGCACAGACAAGGACCAGAUCAGCCUGUUUGCCCAGCCCAGCGGCAGGAUUACCGUGUCCACAAAACGGUCACAGCAAGCCGUGAUCCCUAAUAUUGGAUCCCGCCCCCGGAUAAGGGACAUCCCUAGUCGCAUCAGUAUCUACUGGACCAUCGUGAAGCCCGGAGAUAUCUUGCUCAUCAAUAGCACUGGCAACCUCAUUGCCCCCAGGGGCUAUUUUAAGAUCAGAAGCGGCAAGUCCAGCAUUAUGCGCAGCGACGCACCCAUUGGCAAGUGCAAGUCCGAGUGCAUCACUCCUAAUGGGUCCAUCCCAAACGACAAGCCAUUCCAAAAUGUCAACAGAAUCACCUACGGGGCUUGCCCCCGCUACGUGAAGCAGAGUACACUGAAACUGGCCACCGGGAUGCGCAACGUGCCCGAGAAGCAAACUAGAGGCAUCUUUGGAGCUAUCGCUGGCUUCAUUGAGAAUGGCUGGGAGGGUAUGGUGGACGGCUGGUACGGAUUCCGCCACCAGAAUAGCGAAGGCAGAGGCCAGGCAGCAGACUUGAAGUCCACCCAGGCCGCCAUUGAUCAGAUCAACGGCAAACUGAAUCGGCUUAUUGGAAAAACAAACGAGAAGUUCCAUCAGAUUGAGAAGGAGUUUAGCGAGGUGGAGGGCCGCGUGCAGGAUCUGGAAAAGUACGUUGAAGACACCAAGAUCGACCUGUGGUCAUACAAUGCAGAGCUGCUCGUUGCCCUGGAAAAUCAGCACACAAUUGACCUUACAGACUCCGAAAUGAAUAAGCUCUUUGAAAAGACCAAGAAGCAGCUGCGCGAGAACGCCGAGGAUAUGGGGAACGGUUGUUUUAAGAUCUACCACAAGUGUGACAACGCCUGCAUUGGGUCCAUCCGAAAUGAAACAUACGACCACAACGUGUAUAGAGAUGAGGCCCUGAACAACCGAUUCCAGAUUA AGGGAGUCGAGCUGAAGAGUGGCUAUAAGGACUGGAUCCUGUGGAUCUCAUUCGCCAUGUCAUGCUUCCUUCUGUGUAUUGCUCUGCUCGGCUUCAUCAUGUGGGCUUGCCAGAAAGGCAAUAUCCGGUGCAACAUCUGCAUCUAA(SEQ ID NO:13)
本文使用的B/华盛顿/02/2019抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAAAGCAAUCAUAGUGCUGCUGAUGGUGGUGACUAGCAAUGCCGAUCGGAUCUGCACCGGCAUCACUUCCAGUAACAGCCCUCAUGUGGUCAAAACCGCCACACAGGGCGAGGUGAACGUGACCGGAGUGAUUCCACUGACAACUACACCAACGAAGAGUCACUUCGCCAACCUGAAGGGCACCGAAACACGAGGCAAGCUCUGCCCCAAGUGUCUGAAUUGCACCGACCUGGACGUCGCUUUGGGCCGCCCUAAAUGUACCGGCAAAAUACCUUCCGCCAGAGUGUCCAUCCUGCACGAGGUGCGCCCCGUGACCUCCGGGUGUUUUCCCAUAAUGCACGACCGCACUAAAAUCCGCCAGCUGCCCAAUCUUCUGAGGGGGUACGAACAUGUCAGGCUGUCCACUCACAACGUGAUCAACGCAGAAGACGCCCCCGGAAGGCCUUAUGAGAUUGGAACCAGUGGGUCCUGCCCAAACAUUACCAACGGCAACGGCUUCUUCGCCACUAUGGCCUGGGCCGUGCCAAAGAACAAGACCGCCACCAACCCCCUGACAAUUGAAGUCCCUUACAUCUGCACAGAGGGAGAGGAUCAGAUCACCGUGUGGGGGUUUCACUCUGAUAACGAAACUCAGAUGGCCAAGCUGUACGGGGAUUCUAAACCCCAGAAGUUCACCAGUAGCGCUAACGGGGUGACCACCCAUUAUGUGUCUCAGAUCGGAGGUUUCCCAAAUCAGACCGAGGACGGCGGACUGCCCCAGUCUGGAAGGAUCGUAGUGGACUAUAUGGUGCAGAAGAGUGGAAAAACCGGCACCAUUACCUAUCAGCGCGGCAUACUGCUGCCACAGAAGGUGUGGUGUGCUUCCGGCAGGUCCAAGGUUAUCAAAGGGUCCCUCCCCCUGAUCGGCGAAGCAGAUUGUCUGCACGAGAAGUACGGCGGACUGAAUAAGAGCAAACCCUACUACACCGGAGAACACGCUAAGGCAAUUGGGAAUUGUCCGAUCUGGGUGAAGACGCCCCUGAAACUGGCCAAUGGCACAAAAUACCGGCCCCCCGCUAAGCUGCUGAAGGAACGGGGGUUCUUCGGCGCCAUAGCCGGCUUUCUGGAGGGAGGCUGGGAGGGCAUGAUAGCCGGGUGGCACGGCUACACUUCCCAUGGGGCUCACGGGGUGGCUGUGGCCGCCGACCUGAAGUCUACGCAGGAAGCUAUCAACAAAAUCACUAAGAACCUGAACAGCCUGUCGGAAUUGGAGGUCAAGAAUCUGCAGCGGCUGAGCGGCGCCAUGGAUGAGCUGCACAAUGAGAUCCUGGAGCUUGACGAGAAGGUCGAUGAUCUUCGGGCCGAUACAAUUAGUAGCCAAAUUGAGUUGGCCGUGCUGCUCAGCAACGAAGGCAUAAUCAACAGCGAGGACGAGCACCUCCUGGCUCUGGAGAGAAAGCUGAAGAAGAUGCUCGGCCCUAGCGCAGUUGAGAUCGGAAACGGCUGCUUCGAAACCAAGCACAAGUGCAACCAGACCUGCCUGGACAGGAUCGCGGCAGGAACAUUCGACGCUGGGGAAUUCAGCCUCCCCACCUUCGACAGCCUGAACAUCACAGCCGCCAGUCUGAAUGAUGACGGACUGGAUAACCAUACCAUCCUGCUGUACUACUCUACCGCUGCUUCCUCCCUGGCCGUGACAUUGAUGAUCGCAAUCUUUGUGGUUUAUAUGGUGAGCCGAGACAACGUCAGUUGCAGUAUCUGCCUUUAA(SEQ IDNO:14)
本文使用的B/普吉岛/3073/2013抗原mRNA开放阅读框(ORF)的序列是：AUGAAAGCCAUCAUUGUGCUGCUGAUGGUUGUUACAAGCAACGCCGACCGCAUCUGCACCGGGAUUACAAGCAGCAAUAGCCCUCACGUGGUGAAGACAGCAACACAGGGAGAGGUGAACGUGACCGGCGUGAUUCCACUGACAACCACCCCAACUAAAUCUUACUUUGCAAACCUGAAAGGGACACGGACCAGAGGAAAGCUGUGCCCUGAUUGCCUGAAUUGCACAGACCUGGACGUGGCCCUGGGCAGACCAAUGUGCGUGGGCACUACACCAAGCGCCAAGGCCUCCAUCCUCCAUGAGGUGCGGCCCGUGACUUCUGGAUGUUUCCCCAUUAUGCACGACAGAACCAAGAUUAGACAGCUGCCAAACCUGCUCCGCGGCUACGAGAAAAUUCGCCUGUCUACACAGAAUGUGAUCGACGCCGAGAAGGCUCCAGGAGGACCAUACAGACUGGGGACUUCUGGCAGCUGCCCUAACGCCACCUCUAAGAUCGGGUUCUUCGCAACCAUGGCUUGGGCCGUGCCUAAAGACAAUUACAAGAAUGCCACCAAUCCACUGACUGUCGAGGUGCCAUAUAUUUGCACAGAGGGGGAGGACCAGAUCACUGUGUGGGGCUUUCAUAGCGAUAAUAAGACUCAGAU GAAGUCUCUCUACGGCGACUCUAACCCUCAGAAGUUCACCUCCUCUGCCAACGGGGUGACAACACACUACGUGUCCCAGAUCGGGGACUUUCCUGACCAGACCGAGGAUGGAGGACUGCCUCAGUCUGGACGCAUCGUGGUGGACUAUAUGAUGCAGAAGCCUGGGAAGACCGGCACUAUCGUGUACCAGAGGGGCGUGCUGCUGCCCCAAAAGGUGUGGUGUGCCUCCGGAAGAAGCAAAGUGAUUAAGGGAUCCCUGCCUCUGAUUGGGGAGGCCGAUUGCCUGCAUGAAGAGUAUGGAGGGCUGAACAAGUCCAAGCCAUACUAUACAGGAAAGCACGCAAAAGCCAUCGGCAACUGUCCCAUCUGGGUCAAAACUCCUCUGAAGCUGGCCAACGGCACCAAAUACCGCCCUCCAGCCAAGCUGCUGAAAGAACGCGGAUUCUUCGGCGCCAUUGCAGGGUUUCUGGAAGGAGGCUGGGAGGGCAUGAUUGCUGGAUGGCACGGAUAUACCUCUCACGGCGCUCACGGGGUGGCCGUGGCCGCCGAUCUGAAGUCCACACAGGAGGCAAUUAACAAGAUCACCAAGAAUCUGAAUUCACUGUCCGAGCUCGAAGUGAAAAACCUGCAGCGCCUGUCCGGCGCCAUGGACGAGCUGCACAAUGAAAUCCUGGAGCUGGACGAGAAGGUGGACGACCUGCGGGCUGACACUAUCAGCAGCCAGAUCGAGCUGGCAGUGCUGCUGAGCAAUGAGGGCAUCAUCAACUCAGAAGACGAACACCUCCUGGCACUGGAAAGGAAACUCAAGAAGAUGCUGGGCCCCUCCGCAGUGGACAUUGGGAACGGCUGUUUCGAAACCAAGCAUAAGUGUAACCAGACUUGUCUGGAUAGGAUCGCAGCAGGAACCUUCAACGCCGGCGAAUUUUCUCUGCCAACAUUUGACUCCCUGAACAUCACAGCUGCAUCCCUGAACGACGACGGACUGGACAAUCACACCAUCCUGCUGUACUACUCUACUGCCGCUAGCUCCCUGGCCGUGACCCUGAUGCUGGCCAUCUUCAUCGUGUACAUGGUUUCCAGGGAUAACGUGUCUUGUAGCAUUUGCCUGUAA(SEQ ID NO:15)
结果
mRNA抗原制备，表征和表达
使用未经修饰的核糖核苷酸酶促地合成了编码各种流感毒株的经密码子优化的全长HA和NA的mRNA。所有mRNA制剂均具有>95％的5'帽1，并且在毛细管电泳上显示出单个同质峰。通过将各种脂质组分与mRNA在受控的条件下且以固定的比率混合来制备mRNA-LNP配制品。所有mRNA-LNP均展现出>95％的包封，其中均匀的流体动力半径的范围为从95-105nm，并且多分散性指数(PDI)为0.060-0.136，如表5所示。
表5.在小鼠临床前测试中使用的LNP配制品的属性
LNP 尺寸(nm) PDI 包封％
CA09 HA 97.54 0.117 95.2
Sing16HA 103.2 0.068 97.3
Sing16NA 105.8 0.128 96.5
Mich15NA 103.3 0.136 97.4
CA09 HA mRNA-LNP图像的低温电子显微镜检查(Cryo-TEM)显示出具有多层内核结构的均匀球形颗粒。通过傅里叶变换进一步分析的固体核结构的层状性表明在层之间有3.7nm的周期性。在显微照片中所见的颗粒的均匀形态表明同质LNP制剂具有LNP的正确组装。
通过用CA09 HA、Sing16 HA、Sing16 NA或Mich15 NA的未包封的mRNA构建体瞬时转染人骨骼肌细胞(HskMC)通过流式细胞术确认抗原表达，并且用蛋白质特异性抗体染色以用于分析。观察到来自HskMC的高水平的HA和NA表达，确认在肌肉细胞中表达后天然形式HA三聚体和NA四聚体的正确组装和运输。为了研究所表达的HA和NA蛋白的亚细胞定位，用二价H3N2 LNP转染HeLa细胞，并且通过免疫染色和共聚焦显微镜检查使蛋白质可视化。虽然NA信号指示了在ER中的强共定位(约90％)，但发现当用相应蛋白质和钙联蛋白(内质网(ER)标记)的抗体对经透化的细胞染色时，HA适度地(25％)与ER共定位。这与以下认识是一致的，即新生NA和HA蛋白易位到ER中进行组装(Dou等人,Front Immunol.(2018)9:1581)。
使用报告mRNA表达评价了LNP递送mRNA的效率和最佳配制参数的选择(Thess等人,Molecular Therapy(2015)23(1):S55)。在小鼠中肌内地(IM)施用单次剂量的0.05μg、0.1μg、1μg、5μg的未经修饰的FF-LNP配制品。萤光素酶活性(通过平均生物发光所测量的)表明了来自mRNA构建体的持续表达，其在所有剂量下在注射后6小时达到峰值，并且在超过72小时时可检测(图11，小图(a))。在小鼠中在单次0.1μg剂量下并且在非人灵长类动物(NHP)中在10μg下用hEPO进一步验证了高水平的mRNA介导的蛋白质表达。本研究旨在使用标准品LNP Dlin-MC3-DMA25配制品作为对照来比较LNP。通过ELISA定量的血清hEPO在6h表现出最大表达，其中与hEPO-MC3相比，用hEPO-LNP表达的红细胞生成素要高大约12倍(图11，小图(c))。hEPO-LNP和hEPO-MC3两者在NHP中显示出类似的表达动力学，从6小时至72小时可检测(图11，小图(d))。结果确认了本发明的LNP配制品有效递送mRNA以便在体外和在体内表达的效用。
HA(H1，H3)和NA(N1，N2)mRNA-LNP在小鼠中的免疫原性
自然历史和疫苗研究表明，针对流感HA和NA的抗体具有抗病毒功能，并且认为两种抗原对于有效流感疫苗均是重要的(Krammer等人,Nat Rev Immunol.(2019)19(6):383-97)。在BALB/c小鼠(n＝8)中以两剂方案在以4周间隔时间表施用的2、0.4、0.08或0.016μgmRNA-LNP下评价了未经修饰的CA09 HA-LNP和Sing16 HA-LNP mRNA疫苗。使用相同毒株的重组HA(rHA)抗原来在ELISA中评价总IgG应答。在单次剂量后在所有组中均检测到HA特异性抗体，但是在第二剂之后的第42天效价达到峰值(图12)。为了测量功能性抗体，针对同源毒株CA09和Sing16评价了血凝抑制(HAI)反应。尽管在第28天可以观察到2μg剂量的CA09-LNP和Sing16-LNP处理组的在第一剂后的HAI效价，分别地GMT为160和GMT 70，但在第二剂后观察到HAI效价的更明显的增加。在第42天，在CA09-HA-LNP组中，0.016μg和0.4μg组的GMT效价分别为80和2200；并且在Sing 16HA-LNP组中，0.016μg和0.4μg组的GMT效价分别为14和100(图13)。
类似地，为了测试抗NA反应，将小鼠用2、0.4、0.08或0.016μg的Sing16 NA-LNP或Mich15 NA-LNP免疫。用重组NA抗原进行ELISA，以评估由Mich15 NA-LNP或Sing16 NA-LNP配制品诱导的总IgG应答。动物在单次剂量后出现高抗体结合反应，其中在第二剂后在第42天NA结合抗体显著增加(图14)。将酶联凝集素测定(ELLA)用作针对H6N1或H6N2嵌合病毒的神经氨酸酶抑制(NAI)活性的功能性抗体效价的替代物。尽管与单次剂量相比，两剂的疫苗大幅增加了功能性抗体应答，但在单次剂量后第28天记录了令人鼓舞的NAI效价，其中GMT为800和GMT 60，甚至分别在低剂量的0.016μg的Mich15 NA-LNP和Sing16 NA-LNP下也如此。在第42天，在Sing16 NA-LNP组中，在0.4μg与0.016μg之间的GMT效价分别为900和10200，表明了剂量依赖性反应，其中在Mich15NA-LNP的情况下，效价达到高于ULOQ(图15)。
保护小鼠免于病毒攻击
为了测试mRNA疫苗在小鼠流感病毒激发模型中的功效，我们在第0周和第4周为BALB/c小鼠IM接种0.4μg的CA09 HA-LNP，并且为阴性对照组接种两剂的LNP稀释剂缓冲液。在研究第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第92天和第107天的疫苗组血清样品的HAI效价证明了稳健的免疫应答，其中第56天和第92天的GMT分别为1660和1:830(图16A)。在第93天，将所有小鼠用与CA09同源的Belgium09病毒以四倍于可导致50％致命后果的剂量(4xLD50)鼻内激发。疫苗组中的所有小鼠均从攻击中存活而没有死亡，并且一些轻度的发病的特点是暂时体重减轻小于5％(图16B)。然而，稀释剂对照组中的小鼠遭受显著且快速的体重减轻，这到第9天导致了高死亡率(90％)。这些结果证明了基于HA的MRT配制品在致死小鼠流感激发模型中的高功效。
为了评估基于NA的MRT疫苗的保护功效，我们在BALB/c小鼠中进行了类似的激发实验。由于Mich15 NA-LNP疫苗在未经处理的小鼠中在单次免疫后引发了稳健的NAI效价(图16A)，因此我们评价了在4周的间隔内施用0.4或0.016μg的Mich15 NA-LNP的一次或两次给药方案。以相同的方案接种对照组，接受0.6μg hEPO-LNP或稀释剂缓冲液。在单次施用后观察到稳健的NAI效价，其中在第28天记录的0.4μg的Mich15 NA-LNP的GMT为14,000NAI，并且0.016μg的Mich15 NA-LNP的GMT为1,800NAI(图17A)。在第二次免疫后，在第42天，对于0.4μg组，NAI效价升至108,000NAI；并且对于0.016μg组，NAI效价升至37,000NAI。在疫苗接种方案后超过12周之后，将所有组用4xLD50的Belgium09 H1N1病毒激发。依据处理组的随时间的相对于基线的个体体重变化绘制在图17B中。两个对照组中的所有小鼠均遭受显著的发病，由于体重减轻>20％，到感染后第8天，不得不对所有动物实施安乐死。值得注意的是，除疫苗组中的一只外，单次剂量0.016μg组中的所有动物均从攻击中存活，表明了针对死亡的高保护功效，甚至在低至0.016μg的Mich15 NA-LNP的单次剂量后也如此。较高剂量(0.4μg)表现出总体更高的保护，然而，与HA免疫相比，NA疫苗接种不足以保护免于体重减轻，因为接种疫苗的动物表现出10％初始体重的中值体重减轻，与针对其他NA疫苗报告的观察结果一致。观察到接种疫苗的组的体重恢复，导致与基线相比，在低剂量下平均最终体重变化为2.7％，并且对于较高剂量体重增加4.8％。总的来说，结果证明，单次低剂量MRT NA-LNP疫苗接种可以引发可测量的功能性抗体以阻断流感NA活性，并且足以赋予小鼠针对致命攻击的保护。
HA(H3)mRNA-LNP在NHP中的免疫原性
为了评价mRNA-LNP在NHP中的免疫原性，在NHP中进行了覆盖15、45、135和250μg的Sing16 HA-LNP的剂量范围研究。在第一次免疫后，所有接种疫苗的NHP均出现对重组HA蛋白有反应性的抗体，如在ELISA中所注意到的(图18)。在第二剂后观察到效价的进一步提高。令人惊讶的是，15μg剂量所诱导的ELISA效价仅比135μ剂量水平低1.8倍(95％CI 1.0，3.6)，表明了剂量饱和度接近15μg水平。在第42天，在所有剂量组中均诱导了稳健的HAI抗体，并且所记录的GMT对于15μg为400，对于45μg为700，对于135μg为900，且对于250μg为570。在第42天，GMT效价的倍数增加与95％CI在135μg与15μg处理组之间为2.2倍(1.0；5.0)，并且在135μg与45μg处理组之间为1.3倍(0.6；2.8)，表明尽管随着剂量的增加，观察到较高效价的趋势，但各组之间的差异很小(图19A)。通过微量中和(MN)测定评估的中和效力(图19B)显示出剂量效应的更好趋势，其中在D28的GMT对于15μg为40，对于45μg为180，且对于135μg为300。
由于已经表明T细胞在动物模型中有效地降低病毒载荷和限制疾病的严重程度(Rimmelzwaan等人,Vaccine(2008)26(4):D41–D44；Sridhar等人,Nat Med.(2013)19(10):1305-12；Sridhar等人,Front Immunol.(2016)7:195)，因此我们评价了用45、135、250μg的Sing16 HA-LNP或用45μg的重组HA接种的NHP中的回忆T细胞。通过用跨越Sing16 HA的整个序列的合并的重叠肽进行回忆刺激在IFN-γ(Th1细胞因子)和IL-13(Th2细胞因子)ELISPOT测定中评价了在第42天收集的PBMC。除250μg组中的一只外，所有接种疫苗的动物均出现IFN-γ分泌细胞，范围为从28至1328个斑点形成细胞(SFC)/百万PBMC(图20A)。值得注意的是，未观察到剂量反应，并且较低和较高剂量水平组的动物显示出相当频率的IFN-γ分泌细胞。相比之下，用重组Sing16 HA蛋白免疫的对照组中的所有动物均表现出IFN-γ产生细胞的不存在。在所测试的所有组中均未检测到IL-13细胞因子分泌细胞的存在或非常低(图20B)。数据表明，Sing16 HA-LNP在NHP中诱导了强的Th1偏向性细胞应答，与目前正在开发的SARS-CoV-2疫苗MRT5500(Kalnin等人,同上)所见的情况相当。
为了研究在用Sing16 HA-LNP免疫后NHP中的回忆B细胞(MBC)的频率，开发了ELISPOT测定以定量抗原特异性MBC作为体液免疫记忆的读出。在第180天，从用45μg或15μg的Sing16 HA mRNA-LNP配制品或用作为比较物的45μg剂量的重组HA免疫的NHP收集PBMC。进行了4天的PBMC的多克隆刺激，其被优化以将记忆B细胞驱动成抗体分泌细胞(ASC)，并且将受刺激的PBMC在抗原特异性ELISPOT中铺板，其中可以确定抗原特异性ASC的频率。然后抗原特异性记忆B细胞定量为总IgG+记忆B细胞的百分比。在所有动物中均检测到抗原特异性记忆B细胞，并且其频率范围对于45ug剂量组为从1％至5％，且对于15μg剂量组为从0.3％至1.5％。在经rHA免疫的动物中，记忆B细胞应答似乎显著降低，因为在六只动物中的五只中检测不到抗原特异性记忆B细胞(图21)。我们得出结论，像其他mRNA疫苗一样，Sing16 HA-LNP引发了有希望延长免疫的抗HA特异性记忆B细胞群(Lindgren等人,FrontImmunol.(2019)10:614)。
多价流感病毒抗原
mRNA-LNP平台的优势是LNP包封的灵活性以用于多种mRNA抗原构建体。然而，需要测试此潜力以解决对抗原干扰的担忧。为了探索流感抗原的组合，将共包封的HA和NA mRNA在LNP中配制，作为在H3H1、H3N2或N1N2组合中含有0.2μg的每种mRNA的二价配制品，或者在单价的情况下，含有0.2μg的每种相应的抗原。在小鼠中施用这些配制品，以通过比较二价与单价配制品中单独抗原的功能效价来确定对免疫原性的任何抗原干扰(图22，小图(a)-(c)和表6)。
表6.抗原特异性记忆B细胞在用H3 mRNA-LNP疫苗接种的NHP中的频率
在H1H3组合中，在共包封与分开施用的疫苗之间，无论时间点如何，对于HAI效价，均未看到统计上显著的差异(p＝0.2584)；并且对于H3效价，在D42未看到显著差异(p＝0.8389)。在H3N2组合的情况下，疫苗的NA组分与HA组分组合引发了高中和抗体，证明了HA优势的缺乏。在共包封与分开施用的疫苗之间，无论时间点如何，对于H3效价，均未看到统计上显著的差异(p＝0.2960)；并且对于N2效价，在D42未看到显著差异(p＝0.0904)。同样，对于N2，N1N2组合没有统计上显著的差异(p＝0.3899)。共包封和分开施用的疫苗在第42天的N1效价高于定量限。因此，N2N1、H3H1或H3N2的组合产生了与分开配制的单独LNP等同的抗体效价。
我们进一步探索了共包封的H1、N1、H3和/或N2 mRNA的四价配制品。在NHP中以由2.5μg的每种流感抗原mRNA和填充量的非编码mRNA(如果需要)组合构成的总共10μg测试了这些配制品，得到四价(H1N1H3N2)、二价(H1N1或H3N2)或单价(H1、H3、N1或N2)LNP(表7)。
表7.在小鼠研究中流感病毒的二价组合
在单价配制品与二价或四价配制品之间比较了对H1或H3的HAI效价或者对N1或N2的NAI效价(图23)。在第42天，当分析H1单价组(p＝0.9054，非配对双尾t检验)或H1N1二价组(p＝0.8002)的HAI效价时，四价组的H1的HAI效价相当。类似地，当分析H3单价组(p＝0.2504)或H3N2二价组(p＝0.5894)的H3 HAI效价时，四价组的H3HAI效价相当。在用N1单价mRNA或H1N1二价mRNA或四价H1N1H3N2 mRNA配制品接种的各组动物中对N1的NAI效价几乎相同。同样，在N2单价mRNA配制品(p＝0.8485)或H3N2二价mRNA配制品(0.4545)与四价H1N1H3N2 mRNA配制品之间，N2 NAI效价没有差异。
总的来说，这些发现表明，在此剂量水平下HA/NA mRNA-LNP的共包封的或组合多价疫苗可以有效地递送所有四种抗原，而无需对抗原干扰有任何担忧，并且所有抗原在配制品中均像单独递送这些抗原时一样具有免疫原性。
实施例7：另外的LNP配制品
制备了mRNA疫苗的另外的LNP配制品，命名为脂质C(含有阳离子脂质GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1)、脂质D(含有阳离子脂质GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10)和脂质E(含有阳离子脂质GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14)。将人红细胞生成素(hEPO)mRNA用作测试mRNA。通过ELISA测量来自从注射LNP的小鼠取的样品的hEPO的表达。在注射后6小时、24小时、48小时和72小时取样品。如图24所示，与含有阳离子脂质MC3的对照LNP配制品相比，hEPO表达在LNP配制品脂质A、脂质B、脂质C、脂质D和脂质E的情况下在所有时间点始终更高。
下表8总结了相对于包含MC3阳离子脂质的对照LNP的结果。
表8.相对于MC3来自LNP配制品脂质A-E的hEPO的水平。
接下来在非人灵长类动物(NHP)中测试了相同的hEPO mRNA-LNP配制品。在注射后6小时、48小时和96小时取样品。如图25所示，每种LNP配制品均产生了与MC3对照配制品相当水平的hEPO。
还在NHP中测试了流感HA编码mRNA-LNP配制品。经由肌内注射向NHP施用10μg的LNP配制品，并且在注射后第28天和第42天取样品。如上所述测量HAI效价。如图26所示，每种LNP配制品均产生了与MC3对照配制品相当或更高的HAI效价。
进行了与图26所示相同的实验，同时测量了Cal09 H1流感抗原情况下的HAI效价。如图27所示，每种LNP配制品均产生了与MC3对照配制品相当或更高的HAI效价。
如图28所示，对于LNP配制品脂质C和脂质D，在Sing16 H3抗原情况下的HAI效价升高。
实施例8：对四价或八价流感疫苗LNP配制品的进一步研究
从施用各种多价LNP-流感mRNA疫苗的小鼠测量HAI效价和NAI效价。针对流感毒株A/密歇根/45/2015、A/新加坡/INFIMH160019/2016、B/马里兰/15/2016 BX69A和B/普吉岛/3073/2013测量了HAI效价。针对流感毒株A/密歇根/45/2015、A/新加坡/INFIMH160019/2016、B/科罗拉多/06/201和B/普吉岛/3073/2013测量了NAI效价。
针对接受单价或四价HA或NA mRNA疫苗的小鼠比较了HAI效价和NAI效价。
在第0天给小鼠注射初免疫苗，并且在第21天注射相同剂量的加强疫苗。在第1天、第20天、第22天和第35天采集血液。对于含有编码HA或NA抗原的mRNA的单价组合物，使用单独编码以下中的每一种的mRNA：来自B/维多利亚谱系的H1、H3、HA以及来自B/山形谱系的HA(具体地来自毒株A/密歇根/45/2015；A/新加坡/Infimh160019/2016；B/马里兰/15/2016；和B/普吉岛/3037/2013)。还制备了四价疫苗组合物，其含有编码来自B/维多利亚谱系的N1、N2、NA中的每一种和来自B/山形谱系的NA以及来自B/维多利亚谱系的H1、H3、HA中的每一种和来自B/山形谱系的HA(具体地来自毒株A/密歇根/45/2015；A/新加坡/Infimh160019/2016；B/科罗拉多/06/2017；和B/普吉岛/3037/2013)的mRNA。最后，制备了八价疫苗组合物，其含有编码来自B/维多利亚谱系的H1、H3、HA中的每一种，来自B/山形谱系的HA，来自B/维多利亚谱系的N1、N2、NA中的每一种和来自B/山形谱系的NA(具体地来自毒株A/密歇根/45/2015；A/新加坡/Infimh160019/2016；B/科罗拉多/06/2017；和B/普吉岛/3037/2013)的mRNA，并且将其作为八价疫苗施用。对于所有组合物，每种mRNA均以0.4μg/毒株的量添加。对于每个组，n＝6只小鼠。
每个实验组的概述叙述于下表9中。
表9.在小鼠中多价流感疫苗的实验组的概述
如图29所示，对于4种流感毒株中的3种，八价mRNA-LNP配制品所导致的HAI效价在四价配制品的4倍内。
上述各组的NAI效价结果的概述示于图31中。八价mRNA-LNP配制品所导致的NAI效价与四价mRNA-LNP配制品相当。
因此，数据证明，八价疫苗能够诱导稳健的HA和NA免疫应答，并且来自四种不同流感毒株的免疫显性HA的存在似乎并不抑制或干扰抗NA免疫应答。
对于HA和NAI效价，另外从施用各种多价LNP-流感mRNA疫苗的雪貂测量基于高内涵成像的中和测试(HINT)效价。HINT测定进一步详细描述于Jorquera等人(ScientificReports.9:2676.2019)(通过引用并入本文)中。针对流感毒株A/密歇根/45/2015、A/新加坡/INFIMH160019/2016、B/爱荷华/06/2017和B/普吉岛/3073/2013测量了HINT效价。针对流感毒株A/密歇根/45/2015、A/新加坡/INFIMH160019/2016、B/科罗拉多/06/201和B/普吉岛/3073/2013测量了NAI效价。
将用于评估多价疫苗免疫原性的雪貂用以下接种两次，间隔21天：(1)编码NA抗原(N1、N2、BvNA和ByNA)的四种mRNA的混合物，(2)编码HA抗原(H1、H3、BvHA和ByHA)的四种mRNA的混合物，或(3)编码NA抗原(N1、N2、BvNA和ByNA)的四种mRNA和编码HA抗原(H1、H3、BvHA和ByHA)的四种mRNA的混合物，如下表12所示。每种HA包括来自以下四种毒株之一的HA：A/密歇根/45/2015(H1)；A/新加坡/Infimh-16-0019/2016(H3)；B/爱荷华/06/2017(B/维多利亚谱系)；和B/普吉岛/3073/2013(B/山形谱系)。所有抗原均以1:1的比率施用。
每个实验组的概述叙述于下表10中。
在基线时、在加强前一天或刚好在加强前、在加强疫苗接种时以及在激发后两周(根据需要)，在镇静(异氟醚)下给所有雪貂放血。通过ELLA测试血清样品(储存在-20℃下直到需要)以评估NAI活性。另外，进行血凝抑制测定(HAI)以评估在多价疫苗接种后对血凝素抗原的抗体应答。
表10.在雪貂中多价流感疫苗的实验组的概述
上述各组的HINT结果的概述示于图30中。八价mRNA-LNP配制品所导致的HINT效价与四价mRNA-LNP配制品相当。
上述各组的NAI效价结果的概述示于图32(第20天)和图33(第42天)中。八价mRNA-LNP配制品所导致的NAI效价与四价mRNA-LNP配制品相当。这对于第20天和第42天的样品是真实的。

Claims (51)

1.一种流感疫苗组合物，所述组合物包含八个信使RNA(mRNA)，每个mRNA包含编码不同流感抗原的开放阅读框(ORF)。
2.根据权利要求1所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含八个mRNA，所述mRNA编码(i)一种或多种血凝素(HA)抗原，(ii)一种或多种神经氨酸酶(NA)抗原，或(iii)至少一种HA抗原和至少一种NA抗原。
3.根据权利要求1或2所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含一种或多种编码甲型、乙型和/或丙型流感病毒抗原的mRNA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述抗原为甲型流感病毒和乙型流感病毒的HA和/或NA抗原。
5.根据权利要求3或4所述的流感疫苗组合物，其中所述甲型流感病毒的HA抗原选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18亚型。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述甲型流感病毒的NA抗原选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11亚型。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述乙型流感病毒的HA和NA抗原来自乙型流感/山形谱系或乙型流感/维多利亚谱系。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述HA抗原和NA抗原选自由以下组成的组：H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N9、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2和H10N7亚型和/或B/山形谱系和B/维多利亚谱系。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含一个编码H3 HA抗原的mRNA、一个编码H1 HA抗原的mRNA、一个编码乙型流感/山形谱系HA抗原的mRNA和一个编码乙型流感/维多利亚谱系HA抗原的mRNA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含一个编码H3 HA抗原的mRNA、一个编码N2 NA抗原的mRNA、一个编码H1 HA抗原的mRNA、一个编码N1 NA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/山形谱系的HA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/山形谱系的NA抗原的mRNA、一个编码来自乙型流感/维多利亚谱系的HA抗原的mRNA和一个编码来自乙型流感/维多利亚谱系的NA抗原的mRNA。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述ORF是经密码子优化的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述mRNA分子包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个多腺苷酸化(聚(A))序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述mRNA包含至少一种化学修饰。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
19.根据权利要求1-18中任一项的流感疫苗组合物，其中所述mRNA在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。
20.根据权利要求19所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含至少一种阳离子脂质。
21.根据权利要求20所述的流感疫苗组合物，其中所述阳离子脂质可生物降解。
22.根据权利要求20所述的流感疫苗组合物，其中所述阳离子脂质不可生物降解。
23.根据权利要求20所述的流感疫苗组合物，其中所述阳离子脂质可裂解。
24.根据权利要求20所述的流感疫苗组合物，其中所述阳离子脂质不可裂解。
25.根据权利要求20所述的流感疫苗组合物，其中所述阳离子脂质选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP进一步包含聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含：
摩尔比在35％至55％之间的阳离子脂质；
摩尔比在0.25％与2.75％之间的聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质；
摩尔比在20％与45％之间的胆固醇基脂质；和
摩尔比在5％与35％之间的辅助脂质，
其中所有摩尔比均相对于所述LNP的总脂质含量。
28.根据权利要求27所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含：
摩尔比为40％的阳离子脂质；
摩尔比为1.5％的PEG化的脂质；
摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质；和
摩尔比为30％的辅助脂质。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述PEG化的脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述基于胆固醇的脂质是胆固醇。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。
32.根据权利要求19-31中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含：
摩尔比为40％的阳离子脂质，其选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；
摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；
摩尔比为28.5％的胆固醇；和
摩尔比为30％的DOPE。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP的平均直径为30nm至200nm。
34.根据权利要求33所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP的平均直径为80nm至150nm。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的流感疫苗组合物，所述流感疫苗组合物包含1mg/mL至10mg/mL的LNP。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含1至20个mRNA分子。
37.根据权利要求19-35中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含5-10个或6-8个mRNA分子。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述LNP包含两个或更多个mRNA，其中每个mRNA编码不同的流感抗原。
39.根据权利要求19-37中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含八个LNP，其中每个LNP包含编码不同流感抗原的mRNA。
40.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物配制用于肌内注射。
41.根据权利要求40所述的流感疫苗组合物，其中所述组合物包含磷酸盐缓冲盐水。
42.一种在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的流感疫苗组合物。
43.一种预防流感感染或减轻流感感染的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的流感疫苗组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述流感疫苗组合物引发针对一种或多种季节性和/或大流行性流感毒株的免疫应答。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，所述方法包括向受试者施用一剂或多剂的所述流感疫苗组合物，每剂包含约1μg至约250μg mRNA。
46.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用一剂或多剂的所述流感疫苗组合物，每剂包含约2.5μg、5μg、15μg、45μg或135μg mRNA。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者以2-6周、任选地4周的间隔施用两剂的所述流感疫苗组合物。
48.根据权利要求1-41中任一项所述的流感疫苗组合物用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用的药物的用途。
49.根据权利要求1-41中任一项所述的流感疫苗组合物，其用于在治疗有需要的受试者中使用。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有单次使用或多次使用剂量的根据权利要求1-41中任一项所述的组合物的容器，任选地其中所述容器是小瓶或者预填充针筒或注射器。
51.根据权利要求1-41中任一项所述的流感疫苗组合物，其中所述流感抗原包含具有从机器学习模型鉴定或设计的分子序列的流感病毒HA抗原和/或流感病毒NA抗原。
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