KR102042993B1 - 면역반응 조절물질 및 이를 포함하는 면역보조제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질 및 이를 포함하는 면역보조제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체인 면역반응 조절물질 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 면역반응 조절물질은 내재면역 및 특정 병원체에 대한 적응면역반응 유도능이 우수해 면역증강효능을 발휘할 뿐만 아니라 독성이 거의 없어 안전성이 매우 우수하다.

Description

면역반응 조절물질 및 이를 포함하는 면역보조제 조성물{Immune response modulator and an adjuvant composition comprising the same}

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질 및 이를 포함하는 면역보조제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체인 면역반응 조절물질 및 이의 용도에 관한 것이다.

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 성분으로, 다양한 면역세포를 촉진시키며 특히 선천성 면역 반응을 촉발시킨다. LPS는 사이토카인 분비, 보조자극인자(costimulatory molecule)의 발현 및 항원 제시의 유도를 통하여 항원제시세포를 활성화시키며, 이는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결한다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O, Cell 124: 783-801(2006); Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, et al. Nat Immunol 2: 947-950(2001)).

LPS는 양친매성 도메인(지질 A), 코어 올리고사카라이드(core oligosaccharide, OS) 및 O-항원(O-antigen 혹은 O-antigenic polysaccharide)의 세 개의 도메인으로 구성되어 있다. 지질 A는 LPS의 내독소 활성을 담당하고, 다양한 유형의 면역세포의 TLR4(toll-like receptor 4) 신호전달을 통하여 면역촉진 효과를 나타낸다고 알려져 있다(Raetz CR, Whitfield C, Annu Rev Biochem 71: 635-700(2002)). 감소된 독성을 나타내는 지질 A 유도체가 인간 백신 면역보조제(adjuvant) 개발에 타겟이 되어왔다. MPL(Monophosphoryl lipid A)은 살모넬라 미네소타 R형 균주(Salmonella minnesota rough strain)부터 분리된 LPS의 비독성 유도체이다. 또한, 알루미늄 염과 MPL의 조합은 HBV(hepatitis B virus)와 HPV(human papillomavirus) 백신용 면역보조제로서 승인을 받은바 있다.

LPS의 경우 1950년대부터 항암효과가 알려졌으나, 나노그람(ng) 수준의 오염으로도 패혈증에 의한 사망을 초래할 수 있는 독성으로 인해 사용이 어려운 문제가 있었다. 따라서, LPS에 대한 약독화 시도는 꾸준히 연구되었으며, 특히 폴리사카라이드 체인의 제거 또는 지질 A의 탈아실화를 통하여 독성을 감소시키는데 성공할 수 있었다(Katz SS et al., J Biol Chem. Dec 17;274(51):36579-84 1999). 특히, LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 지질 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL의 경우 LPS의 독성을 제거한 면역항암제로 개발되었으나 그 효과가 미미한 것으로 알려져 있다.

본 출원인은 상기의 면역보조제들의 단점을 보완한 신규한 LPS 유사체를 이미 개발 한 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1509456호). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였고, 이는 우수한 면역촉진 활성을 나타내어 면역보조제로 이용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1509456호

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질의 제공을 목적으로 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

또한, 본 발명은 상기 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 상기 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

또한, 본 발명은 상기 면역반응 조절물질은 LOS에 알카리 처리하여 지질 A가 탈아실화되어 비독성화된 것을 특징으로 하는 면역반응 조절물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포스페이트는 2~6개인 것을 특징으로 하는 면역반응 조절물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포스페이트는 화학식 1의 AB, AC, AD, AE, AF, BC, BD, BE, BF, CD, CE, CF, DE, DF, EF, ABC, ABD, ABE, ABF, ACD, ACE, ACF, ADE, ADF, AEF, BCD, BCE, BCF, BDE, BDF, BEF, CDE, CDF, CEF, DEF, ABCD, ABCE, ABCF, ABDE, ABDF, ABEF, ACDE, ACDF, ADEF, ABCDE, ABCEF 및 ABCDEF로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포함되는 것을 특징으로 하는 면역반응 조절물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 면역반응 조절물질은 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 면역반응 조절물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 면역반응 조절물질은 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역반응 조절물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물은 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염과 그의 수화물; 및 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 면역보조성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물은 알루미늄 하이드록사이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물은 암치료용 또는 면역질환 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 면역질환은 아토피 피부염, 천식, 건선, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기성 육아종, 알레르기성 피부염, 위장관 알레르기, 과민성 폐렴, 음식과민증, 두드러기, 습진, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 낭섬유증, 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선, 다발성근염, 경피증, 아디슨병, 백반증, 악성빈혈, 사구체신염 및 폐섬유증, 염증성장질환 및 그레이브병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물은 칼슘포스페이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, (a) 항원; 및 (b) 상기 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 메르스바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 암 백신, 독감 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 녹농균 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 메르스 백신, 지카백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 일본뇌염 백신, 사스 백신, 에볼라 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 재조합 백신, 단백접합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역반응 조절물질은 내재면역 및 특정 병원체에 대한 적응면역반응 유도능이 우수해 면역증강효능을 발휘할 뿐만 아니라 독성이 거의 없어 안전성이 매우 우수하다.

도 1은 본 발명의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)의 구조를 나타낸다. Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다.
도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, 면역반응 조절물질(EG-IM)의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 면역반응 조절물질(EG-IM)을 나타낸다.
도 3 내지 도 5는 혈청 사이토카인 분석결과를 나타낸다. 면역반응 조절물질(EG-IM) 또는 MPL을 각 3μg씩 투여 후 1 및 4시간 후 마우스 심장채혈하여 혈액을 채취한 후 분석하였다(n=3). 도 3은 IL-6, IL-12p40, TNF-α의 분석결과를, 도 4는 IL-5, IL-10의 분석결과를, 도 5는 MCP-1, RANTES의 분석결과를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였고, 이는 우수한 면역촉진 활성을 나타내어 면역보조제로 이용할 수 있음을 확인하고자 하였다.

본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)에 관한 것이다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

본 명세서에서 사용된 용어, “LOS(Lipooligosaccharide)”는 LPS(lipopolysaccharide)의 변형체로서 천연 LPS보다 짧은 당쇄를 가지고 있어 분자량이 작은 것을 의미한다. 탈아실화 전 LOS는 바람직하게는 분자량이 5,000-10,000 Da이며, 더욱 바람직하게는 3000~4000 Da이다. 용어 "탈아실화 LOS"는 이러한 LOS에서 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되어 LOS와 비교하여 독성이 크게 감소된 것을 의미한다. 지질 A의 글루코사민에 지방산은 -C(O)O- 결합 및 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명의 탈아실화 LOS는 지질 A의 탈아실화에 의해 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거된 것을 나타낸다.

상기 EG-IM은 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있으나, 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 특허등록 제0456681호; WO 2004/039413; 대한민국 특허등록 제0740237호; 및 WO 2006/121232에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, LPS에 강염기(예컨대, 0.2 N NaOH)을 처리하여 탈아실화 하여 지질 A로부터 일부 지방산을 제거하여 탈독소화 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 2~6개의 포스페이트를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~4개의 포스페이트기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1에서 포스페이트기의 개수 및 위치는 하기 표 1의 예시와 같을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1에서 당은 헥소오스, N-아세틸 헥소사민, 헵토오스 및 Kdo(2-케토-3-디옥시-옥토네이트)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어, "헥소오스(hexose)"는 한 분자 중 6개의 탄소 원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 예컨대 케토헥소오스(프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스), 알도헥소오스(알로스, 알트로스, 글루코오스, 만노오스, 굴로스, 이도스, 갈락토오스, 탈로스) 및 데옥시당(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 헥소오스는 알도헥소오스이고, 일특정예에서 상기 알도헥소오스는 글루코오스 또는 갈락토오스이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "헵토오스(heptose)"는 한 분자 중 7개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 기능기(알데하이드기 및 케톤기)의 위치에 따라 알도헵토오스(포지션 1) 및 케토헵토오스(포지션 2)로 구분할 수 있다. 상기 알도헵토오스는 예컨대, L-글리세로-D-만노-헵토오스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토헵토오스는 예컨대, 세도헵툴로스 및 만노헵툴로스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 또는 N-아세틸 만노사민이고, 일 특정예에서, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민이다.

본 발명의 EG-IM은 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 갖는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 5~7개의 당을 포함할 수 있으며, 일 특정예에서 EG-IM의 당 개수는 6~7개이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 EG-IM은 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는다.

본 발명의 EG-IM은 지질 A에서 지방산(예컨대, C14 지방산)이 제거되어(탈아실화) 독성이 현저히 감소된 특징을 갖는다. 지방산은 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합 또는 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명에서 탈아실화는 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되는 것을 의미한다.

상기 탈아실화는 LOS에 알카리를 처리하여 실시할 수 있으며, 상기 알카리는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, Ca(OH)2, LiOH, RbOH 를 Mg(OH)2를 포함하며, 보다 바람직하게는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, Ca(OH)2, LiOH 및 Mg(OH)2이고, 보다 더 바람직하게는 NaOH, KOH 및 Mg(OH)2이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 EG-IM은 대장균(E. coli)으로부터 유래된 것이며, 상기 대장균은 대장균 EG0024(기탁번호: KCTC 12948BP)이다. 상기 균주는 2015년 11월 19일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12948BP로 기탁되었다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어, "면역촉진"은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 말한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 TNF-α, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, MCP-1, RANTES로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 분비를 촉진시킨다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 EG-IM을 유효성분으로 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 EG-IM은 면역촉진 효능이 종래의 면역보조제와 비교하여 우수할 뿐만 아니라 독성도 감소되어 있어, 본 발명의 백신 조성물에 매우 적합하다. 본 발명의 EG-IM은, LPS의 독성을 제거하기 위하여 LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 리피드 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL(Monophosphoryl lipid A) 보다 독성이 적다.

본 발명의 면역보조제 조성물은 상기 EG-IM만으로도 충분한 면역반응 유도하여 다양한 질환에 대한 예방 효능을 발휘할 수 있으며, 구체적으로 상기 면역보조제 조성물은 암치료용 또는 면역질환 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 암은 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암, 자궁경부암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역질환은 아토피 피부염, 천식, 건선, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기성 육아종, 알레르기성 피부염, 위장관 알레르기, 과민성 폐렴, 음식과민증, 두드러기, 습진, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 낭섬유증, 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선, 다발성근염, 경피증, 아디슨병, 백반증, 악성빈혈, 사구체신염 및 폐섬유증, 염증성장질환, 그레이브병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 선택적으로, 본 발명의 면역보조제 조성물은 다른 면역보조성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염 또는 그의 수화물; 또는 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드를 포함할 수 있다. 상기 염은, 예를 들면, 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 면역보조제 조성물에서 추가적으로 포함될 수 있는 면역보조성분은 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘포스페이트, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역보조제 조성물은 알루미늄 하이드록사이드를 더 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 면역보조제 조성물은 칼슘포스페이트를 더 포함한다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 상기 면역반응 조절물질(EG-IM)을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항원(antigen)"은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질이다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 면역반응 유도효능을 나타내는 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 메르스바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 에볼라바이러스의 항원, 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 그의 기본적인 조성, 즉 항원과 면역반응 조절물질(EG-IM)만으로도 충분한 면역반응을 유도하여 특정 질환에 대한 예방 효능을 발휘할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 백신 조성물은 위에서 언급한 추가의 면역보조성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 백신은 암 백신, 독감 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 녹농균 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 메르스 백신, 지카백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 일본뇌염 백신, 사스 백신, 에볼라 백신 또는 페렴구균 백신 일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 재조합 백신, 단백접합 백신, 단가백신, 다가백신, 혼합백신의 형태일 수 있다.

상기 암 백신은, 이에 의하여 제한되는 것은 아니나, 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암에 대한 백신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 제조예 ] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 제조

1. 건조 균체 제조

대장균(E.coli)을 37℃ TSB(Triptic soy broth, Difco) 30 g/ℓ 배지에서 20시간 80 rpm 이하에서 진탕배양하고, 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 에탄올을 섞은 후 원심분리 하여 침전물을 수득하였다. 이후, 수득한 침전물에 아세톤을 첨가해 충분히 섞은 후 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물에 에틸에테르를 첨가하고 잘 섞은 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물은 60℃ 건조오븐에서 건조하여 건조균체를 제조하였다.

2. LOS 추출

건조 균체의 중량을 측정한 후 중량 1 g 당 7.5 mL의 PCP(페놀, 클로로포롬, 페트롤리움이써) 추출혼합액을 첨가하여 균체균부터 LOS를 분리하였다. 상기 방법으로 분리하여 얻은 LOS 추출물은 회전증발기를 이용하여 고온에서 유기용매를 제거하였다. 남은 추출액은 고온에서 원심분리 하여 침전물을 수득하고, 침전물에 에틸에테르를 첨가하여 침전물을 세척하였다. 이어 정제수를 넣고 침전물을 생성하였다. 생성된 침전물은 원심분리 하여 상층액과 분리하고 침전물은 에탄올로 세척하여 회수한다. 고온 건조오븐에서 침전물을 충분히 건조시키고, 정제수로 침전물을 용해시켜 LOS를 추출하였다.

3. LOS의 독성 제거

LOS 추출물의 함량을 확인한 후 3 mg/mL 농도로 맞추고, 0.2 N NaOH와 1:1 볼륨으로 섞는다. 60℃ 항온수조에서 120분간 반응시키며, 10분마다 5초간 vortex를 이용하여 섞어주었다. 이후, 초기 0.2N NaOH 양의 약 1/5정도의 1 N 아세트산을 첨가하였다. 이후 에탄올 침전법을 이용하여 면역반응 조절물질인 EG-IM을 수득하였다.

4. LOS 및 EG- IM 정량 및 확인

LOS 및 EG-IM의 함량은 2-Thiobarbituric acid를 이용한 KDO(2-케토-3-디옥시옥토네이트) 정량법으로 함량을 측정하였고, 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 크기에 따라 분리하여 실버염색으로 확인하여 도 2에 나타내었다. 도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, EG-IM의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커(SeeBlue® Plus2 Prestained standard, Invitrogen, LC5952)를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 탈아실화된 LOS인 EG-IM을 나타낸다.

[ 실시예 1] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 구조분석

정제한 시료는 정제수를 이용하여 적절히 희석하였다. C18 역상컬럼 (ACQUITY BEH300 C18 1.7um 2.1 X 150mm)을 기기(Water 사의 UPLC)에 장착한 후, 이동상 A(50 mM Ammonium formate pH 4.5)와 이동상 B(100 % Aceronitrile)를 이용하여 35~95% 농도 구배를 주어 시료를 분리하였다. MS 분석 및 MS/MS 분석은 질량분석기(VELOS PRO, Thermo 사)를 이용하였다. 100 ~ 3000 m/z 범위의 분자들을 분석하였으며, MS 분석 후 확인된 50~2000 m/z 범위의 분자들을 한번 더 분석하였다. 2372 m/z 분자량을 갖는 분자가 major 하게 확인되었으며, 각각의 피크(peak)들을 분석한 구조 모식도 도 1에 나타내었다.

[ 실시예 2] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 면역반응 분석

1. 면역화 및 혈액 샘플링

5주령에 입고되어 1주간 순화시킨 6주령 마우스 (BALB/c, female, 중앙실험동물/SLC Japan)의 뒷다리 대퇴부 삼각근에 본 발명에 따른 EG-IM 또는 MPL을 각 3 μg씩 투여하였다(n=3). 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다. 투여 후 1 및 4시간 후 럼품/케타민 마취액을 복강투여하여 마우스를 마취시키고 심장채혈하여 혈액을 채취하였다. 냉장조건에 혈액을 약 4시간 정치한 후 4℃, 3000 rpm, 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 새 튜브에 옮겨 -70℃에 보관하였다.

2. 마우스 혈청 사이토카인 수준의 분석

멀티플렉스 사이토카인 분석(Milliplex MAP assay kit, Millipore, Billerica, MA, USA)을 실시하여 사이토카인 및 케모카인의 수준을 측정하였다. 표적 사이토카인은 TNF-α, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, MCP-1, RANTES로 하였으며, 분석장비[Luminex 200 (Millipore)] 및 분석프로그램 [MILLIPLEX Analyst (Millipore)]을 사용하여 실험 결과를 분석하여 도 3 내지 도 5에 나타내었다. 도 3은 IL-6, IL-12p40, TNF-α의 분석결과를, 도 4는 IL-5, IL-10의 분석결과를, 도 5는 MCP-1, RANTES의 분석결과이다.

도 3 내지 도 5를 살펴보면, EG-IM을 투여한 경우 염증유발 사이토카인인 TNF-α와 IL-6, Th1-유형 사이토카인인 IL-12p40, 및 케모카인인 IP-10, MIG-1, MCP-1 및 RANTES의 분비를 유도한다는 것을 알 수 있다. 또한, 면역반응 조절물질-유도 사이토카인 수준은 MPL에 의하여 유도된 수준보다 높았다. 이는, In-vivo에서 면역반응 조절물질인 EG-IM의 면역자극 활성이 MPL 보다 더 우수함을 보여준다.

Claims (16)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질.
   [화학식 1]
   

   

   
   (상기 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 함)
   
2. 제1항에 있어서, 상기 면역반응 조절물질은 LOS에 알카리 처리하여 지질 A가 탈아실화되어 비독성화된 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절물질.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 포스페이트는 2~5개인 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절물질.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 C, D, E, CD, CE, DE 및 CDE로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포스페이트가 포함되는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절물질.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 면역반응 조절물질은 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절물질.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 면역반응 조절물질은 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절물질.
   
7. 제1항의 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염과 그의 수화물; 및 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 면역보조성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 알루미늄 하이드록사이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 암치료용 또는 면역질환 치료용인 것을 특징으로 하는, 조성물.
    
11. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 칼슘포스페이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
    
12. (a) 항원; 및
    (b) 제1항의 면역반응 조절물질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 메르스바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 백신은 암 백신, 독감 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 녹농균 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 메르스 백신, 지카백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 일본뇌염 백신, 사스 백신, 에볼라 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
    
16. 제12항에 있어서, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 재조합 백신, 단백접합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
    

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