KR102086987B1

KR102086987B1 - 면역반응 조절물질 및 양이온성 리포좀을 포함하는 면역증강용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102086987B1
Application number: KR1020170107420A
Authority: KR
Inventors: 조양제; 김광성; 이나경; 박신애
Original assignee: 아이진 주식회사
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2020-03-10
Also published as: KR20190021938A

Abstract

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체 및 양이온성 리포좀을 포함하는 면역증강용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복하여, 생산, 운송 및 보관에 있어 유리할 뿐만 아니라, 안정성을 개선하여 면역전달시스템으로서 이점을 가진다. 또한, 본 발명은 항원 및 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 모두 포함함으로써, 면역반응 조절물질을 단독으로 사용하는 경우에 비해 향상된 면역증강효능을 발휘한다.

Description

면역반응 조절물질 및 양이온성 리포좀을 포함하는 면역증강용 조성물 및 이의 용도{Composition for immune enhancement comprising immune response modulator and cationic liposome and use thereof}

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체 및 양이온성 리포좀을 포함하는 면역증강용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

리포좀은 생체적합성이 우수, 제법이 간편하여 수용성 및 지용성 약물을 운반할 수 있는 장점이 있어 체내에서의 부작용이 적은 약물전달체로서 연구가 활발히 진행되고 있다. 기존의 리포좀은 계 자체가 물리화학적으로 불안정하기 때문에 수용액 내에 분산시켜 보관할 때 응집, 융합, 인지질의 가수분해, 산화 및 봉입 약물의 누출 등을 야기 할 수 있는 단점을 지니고 있다. 따라서 리포솜을 장기간 보관 시 리포솜 자체의 안정성을 확보해야 하는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 리포솜의 물리-화학적 불안정성을 극복하기 위한 방법으로서 리포솜을 미세분말화하여 저장함으로서 안정성을 향상시키는 연구가 활발히 진행중이다. 하지만 리포좀을 미세분말화하기 위해서는 동결건조 과정이 사용되는데 이의 과정에 리포좀을 단독으로는 적용 시에는 안정성과 균질성이 저해되어 물리화학적 특성이 변형됨에 따라 약물전달체로서의 기능뿐만 아니라, 면역활성의 효과 역시 부진해지고 독성이 발생하는 단점이 있다. 따라서 동결건조과정에서 리포좀의 변형을 방지하기 위하여 동결방지제 등을 첨가하여 리포좀이 가지는 장점을 극대화하면서, 생산 및 보관, 운송에 유리한 조성물에 관한 연구가 진행중이다.

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 성분으로, 다양한 면역세포를 촉진시키며 특히 선천성 면역 반응을 촉발시킨다. LPS는 사이토카인 분비, 보조자극인자(costimulatory molecule)의 발현 및 항원 제시의 유도를 통하여 항원제시세포를 활성화시키며, 이는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결한다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O, Cell 124: 783-801(2006); Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, et al. Nat Immunol 2: 947-950(2001)).

LPS는 양친매성 도메인(지질 A), 코어 올리고사카라이드(core oligosaccharide, OS) 및 O-항원(O-antigen 혹은 O-antigenic polysaccharide)의 세 개의 도메인으로 구성되어 있다. 지질 A는 LPS의 내독소 활성을 담당하고, 다양한 유형의 면역세포의 TLR4(toll-like receptor 4) 신호전달을 통하여 면역촉진 효과를 나타낸다고 알려져 있다(Raetz CR, Whitfield C, Annu Rev Biochem 71: 635-700(2002)). 감소된 독성을 나타내는 지질 A 유도체가 인간 백신 면역보조제(adjuvant) 개발에 타겟이 되어왔다. MPL(Monophosphoryl lipid A)은 살모넬라 미네소타 R형 균주(Salmonella minnesota roμgh strain)부터 분리된 LPS의 비독성 유도체이다. 또한, 알루미늄 염과 MPL의 조합은 HBV(hepatitis B virus)와 HPV(human papillomavirus) 백신용 면역보조제로서 승인을 받은바 있다.

LPS의 경우 1950년대부터 항암효과가 알려졌으나, 나노그람(ng) 수준의 오염으로도 패혈증에 의한 사망을 초래할 수 있는 독성으로 인해 사용이 어려운 문제가 있었다. 따라서, LPS에 대한 약독화 시도는 꾸준히 연구되었으며, 특히 폴리사카라이드 체인의 제거 또는 지질 A의 탈아실화를 통하여 독성을 감소시키는데 성공할 수 있었다(Katz SS et al., J Biol Chem. Dec 17;274(51):36579-84 1999). 특히, LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 지질 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL의 경우 LPS의 독성을 제거한 면역항암제로 개발되었으나 그 효과가 미미한 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고, 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였으며, 상기 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 포함하는 백신 조성물은 우수한 면역촉진 상승효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및 (b) 양이온성 리포좀(cationic liposome)을 포함하는 면역증강용 조성물의 제공을 목적으로 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

또한, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 상기 면역증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계; (b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 면역증강용 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역증강용 조성물의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및 (b) 양이온성 리포좀(cationic liposome)을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 포스페이트는 화학식 1의 AB, AC, AD, AE, AF, BC, BD, BE, BF, CD, CE, CF, DE, DF, EF, ABC, ABD, ABE, ABF, ACD, ACE, ACF, ADE, ADF, AEF, BCD, BCE, BCF, BDE, BDF, BEF, CDE, CDF, CEF, DEF, ABCD, ABCE, ABCF, ABDE, ABDF, ABEF, ACDE, ACDF, ADEF, ABCDE, ABCEF 및 ABCDEF로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포함되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 양이온성 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine , 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양성 지질인 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 양이온성 리포좀은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중성 지질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 상기 면역증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 지카바이러스의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 결핵균 항원, 백일해 항원, 바리셀라 조스터 바이러스(varicella-zoster virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 지카 백신, 일본뇌염 백신, 결핵 백신, 백일해 백신, 대상포진 백신, 수두 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 녹농균 백신, 암 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 콜레스테롤(Cholesterol), 스쿠알렌(Squalene) 또는 트리카프린(Tricaprin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 사포닌 유래 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 상기 사포닌 유래 물질은 사포닌(Saponin), QuilA 또는 QS21인 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계; (b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 면역증강용 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 면역증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계; (b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 리포좀을 형성하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 리포좀에 (a) 단계 용액 및 항원을 첨가한 후 다시 동결건조하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복하여, 생산, 운송 및 보관에 있어 유리할 뿐만 아니라, 안정성을 개선하여 면역전달시스템으로서 이점을 가진다. 또한, 본 발명은 항원 및 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 모두 포함함으로써, 면역반응 조절물질을 단독으로 사용하는 경우에 비해 향상된 면역증강효능을 발휘한다.

도 1은 본 발명의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)의 구조를 나타낸다. Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다.
도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, 면역반응 조절물질(EG-IM)의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 면역반응 조절물질(EG-IM)을 나타낸다.
도 3은 지질용해 단계에서의 리포좀 사이즈 분포도를 나타낸 것이며, 도 4는 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 단계에서의 리포좀 사이즈 분포도를 나타낸 것이다.
도 5는 liposomal EG-IM 의 면역세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 liposomal EG-IM 의 TNF-a 자극 활성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 liposomal EG-IM 의 세포독성 완화 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 liposomal EG-IM 을 포함하는 백신의 형성이 정전기적 인력에 의한 흡착임을 증명하는 결과이다. LP는 리포좀, S는 상층액(supernatant), P는 침전물(pellet)을 나타낸 것이다.
도 9는 liposomal EG-IM 의 면역세포 리크루팅(recruiting) 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 liposomal EG-IM을 포함하는 백신의 uptake 효과를 flow cytometry로 분석한 결과를 나타내며, 도 11은 monocyte에 의한 uptake 효과를 나타낸 그래프이다. 도 11(A)는 dLN에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 세포 분석한 것이고, 도 11(B)는 근육 조직에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 세포 분석한 것이며, 도 11(C)는 dLN에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 monocytes 측정한 것이고, 도 11(D)는 근육 조직에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 monocytes 측정한 것이다.
도 12는 liposomal EG-IM을 포함하는 백신의 depot 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 Liposomal EG-IM을 포함하는 지카바이러스 백신의 지카 바이러스 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다.
도 14(A)는 Liposomal EG-IM을 포함하는 일본뇌염 백신의 JEV 특이-항체 역가를 측정한 거이고, 도 14(B)는 일본뇌염 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 15(A)는 liposomal EG-IM을 포함하는 결핵 백신의 TB 특이-항체 역가를 측정한 것이고, 도 15(B)는 결핵 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량을 측정한 것이며, 도 15(C)는 liposomal EG-IM을 포함하는 결핵 백신의 박테리아 살균 효과를 분석한 것이다.
도 16(A)는 liposomal EG-IM을 포함하는 백일해 백신의 TB 특이-항체 역가를 측정한 것이고, 도 16(B)는 백일해 백신의 CD4 T 세포 증식을 분석한 것이다.
도 17(A)는 백일해 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량을 측정한 것이며, 흰색 그래프는 비장세포, 검정색 그래프는 폐 세포에서의 결과를 나타낸다. 도 17(B), (C)는 각각 백일해 백신 투여시 IFN-γ, IL-17의 유도능 나타낸 것이다.
도 18은 liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 19 내지 21은 liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신에 지질성분을 추가한 경우 상승효과를 분석한 것이다. 도 19는 콜레스테롤을, 도 20은 스쿠알렌을, 도 21은 트리카프린을 추가하였다.
도 22는 liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신에 사포닌 계열 면역보조제 성분을 추가한 경우 상승효과를 분석한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고, 리포좀의 물리화학적 불안정성을 극복하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였으며, 상기 면역반응 조절물질과 양이온성 리포좀을 포함하는 백신 조성물은 우수한 면역촉진 상승효과를 나타냄을 확인하고자 하였다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM); 및 (b) 양이온성 리포좀(cationic liposome)을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)은 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다.

[화학식 1]

본 명세서에서 사용된 용어, “LOS(Lipooligosaccharide)”는 LPS(lipopolysaccharide)의 변형체로서 천연 LPS보다 짧은 당쇄를 가지고 있어 분자량이 작은 것을 의미한다. 탈아실화 전 LOS는 바람직하게는 분자량이 5,000-10,000 Da이며, 더욱 바람직하게는 3000~4000 Da이다. 용어 “탈아실화 LOS”는 이러한 LOS에서 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되어 LOS와 비교하여 독성이 크게 감소된 것을 의미한다. 지질 A의 글루코사민에 지방산은 -C(O)O- 결합 및 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명의 탈아실화 LOS는 지질 A의 탈아실화에 의해 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거된 것을 나타낸다.

상기 EG-IM은 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있으나, 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 특허등록 제0456681호; WO 2004/039413; 대한민국 특허등록 제0740237호; 및 WO 2006/121232에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, LPS에 강염기(예컨대, 0.2 N NaOH)을 처리하여 탈아실화 하여 지질 A로부터 일부 지방산을 제거하여 탈독소화 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 2~6개의 포스페이트를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~4개의 포스페이트기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1에서 포스페이트기의 개수 및 위치는 하기 표 1의 예시와 같을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1에서 당은 헥소오스, N-아세틸 헥소사민, 헵토오스 및 Kdo(2-케토-3-디옥시-옥토네이트)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어, “헥소오스(hexose)”는 한 분자 중 6개의 탄소 원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 예컨대 케토헥소오스(프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스), 알도헥소오스(알로스, 알트로스, 글루코오스, 만노오스, 굴로스, 이도스, 갈락토오스, 탈로스) 및 데옥시당(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 헥소오스는 알도헥소오스이고, 일특정예에서 상기 알도헥소오스는 글루코오스 또는 갈락토오스이다.

본 명세서에서 사용된 용어, “헵토오스(heptose)”는 한 분자 중 7개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 기능기(알데하이드기 및 케톤기)의 위치에 따라 알도헵토오스(포지션 1) 및 케토헵토오스(포지션 2)로 구분할 수 있다. 상기 알도헵토오스는 예컨대, L-글리세로-D-만노-헵토오스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토헵토오스는 예컨대, 세도헵툴로스 및 만노헵툴로스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 또는 N-아세틸 만노사민이고, 일 특정예에서, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민이다.

본 발명의 EG-IM은 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 갖는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 5~7개의 당을 포함할 수 있으며, 일 특정예에서 EG-IM의 당 개수는 6~7개이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 EG-IM은 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는다.

본 발명의 EG-IM은 지질 A에서 지방산(예컨대, C14 지방산)이 제거되어(탈아실화) 독성이 현저히 감소된 특징을 갖는다. 지방산은 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합 또는 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명에서 탈아실화는 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되는 것을 의미한다.

상기 탈아실화는 LOS에 알카리를 처리하여 실시할 수 있으며, 상기 알카리는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, Ca(OH)2, LiOH, RbOH 를 Mg(OH)2를 포함하며, 보다 바람직하게는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, Ca(OH)2, LiOH 및 Mg(OH)2이고, 보다 더 바람직하게는 NaOH, KOH 및 Mg(OH)2이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 EG-IM은 대장균(E. coli)으로부터 유래된 것이며, 상기 대장균은 대장균 EG0024(기탁번호: KCTC 12948BP)이다. 상기 균주는 2015년 11월 19일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12948BP로 기탁되었다.

본 발명의 EG-IM은 면역촉진 효능이 종래의 면역보조제와 비교하여 우수할 뿐만 아니라 독성도 감소되어 있어, 본 발명의 백신 조성물에 매우 적합하다. 본 발명의 EG-IM은, LPS의 독성을 제거하기 위하여 LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 리피드 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL(Monophosphoryl lipid A) 보다 독성이 적다.

본 발명에서 양이온성 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine , 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양성 지질이며, 상기 양이온성 리포좀은 단독으로 사용되거나, 또는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중성 지질과 혼합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 주로 DOTAP 및 DMPC를 혼합(DOTAP:DMPC), DDA 및 DOPC를 혼합(DDA:DOPC), DDA 및 DMPC를 혼합(DDA:DMPC)하여 사용하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "면역증강"은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 말한다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 면역증강용 조성물의 제조방법에 관한 것이며, 하기의 단계로 면역증강용 조성물이 제조될 수 있다.

(a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계;

[화학식 1]

(b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 면역증강용 조성물을 형성하는 단계.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 면역증강용 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, “항원(antigen)”은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질이다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 면역반응 유도효능을 나타내는 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각일 수 있다.

본 발명에서 상기 항원은 상기 항원은 지카바이러스의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 결핵균 항원, 백일해 항원, 바리셀라 조스터 바이러스(varicella-zoster virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원 에볼라바이러스의 항원, 폐렴구균의 항원일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지카바이러스의 항원, 일본뇌염바이러스의 항원, 결핵균 항원, 백일해 항원, 바리셀라 조스터 바이러스의 항원을 통해 본 발명의 면역원성 증강 효과를 확인하였다.

본 발명의 백신은 질병의 예방용 또는 치료용으로 사용될 수 있으며, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 백신은 지카 백신, 일본뇌염 백신, 결핵 백신, 백일해 백신, 대상포진 백신, 수두 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 녹농균 백신, 암 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신, 페렴구균 백신일 수 있다.

상기 암 백신은, 이에 의하여 제한되는 것은 아니나, 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암에 대한 백신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 당업계에서 용인되는 지질의 성분을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 콜레스테롤(Cholesterol), 스쿠알렌(Squalene) 또는 트리카프린(Tricaprin)을 추가로 포함하는 백신을 제조하여 면역원성 상승효과를 확인하였다(도 19 내지 21).

또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 당업계에서 용인되는 면역보조제로 사포닌(Saponin), QuilA, QS21 등을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 사포닌 유래 물질인 QuilA를 포함하는 백신을 제조하여 면역원성 상승효과를 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이며, 하기의 단계로 백신 조성물이 제조될 수 있다.

[화학식 1]

(b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 리포좀을 형성하는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계의 리포좀에 (a) 단계 용액 및 항원을 첨가한 후 다시 동결건조하는 단계.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 제조예 1] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 제조

1. 건조 균체 제조

대장균(E.coli)을 37℃ TSB(Triptic soy broth, Difco) 30 g/ℓ 배지에서 20시간 80 rpm 이하에서 진탕배양하고, 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 에탄올을 섞은 후 원심분리 하여 침전물을 수득하였다. 이후, 수득한 침전물에 아세톤을 첨가해 충분히 섞은 후 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물에 에틸에테르를 첨가하고 잘 섞은 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물은 60℃ 건조오븐에서 건조하여 건조균체를 제조하였다.

2. LOS 추출

건조 균체의 중량을 측정한 후 중량 1 g 당 7.5 mL의 PCP(페놀, 클로로포롬, 페트롤리움이써) 추출혼합액을 첨가하여 균체균부터 LOS를 분리하였다. 상기 방법으로 분리하여 얻은 LOS 추출물은 회전증발기를 이용하여 고온에서 유기용매를 제거하였다. 남은 추출액은 고온에서 원심분리 하여 침전물을 수득하고, 침전물에 에틸에테르를 첨가하여 침전물을 세척하였다. 이어 정제수를 넣고 침전물을 생성하였다. 생성된 침전물은 원심분리 하여 상층액과 분리하고 침전물은 에탄올로 세척하여 회수한다. 고온 건조오븐에서 침전물을 충분히 건조시키고, 정제수로 침전물을 용해시켜 LOS를 추출하였다.

3. LOS의 독성 제거

LOS 추출물의 함량을 확인한 후 3 mg/mL 농도로 맞추고, 0.2 N NaOH와 1:1 볼륨으로 섞는다. 60℃ 항온수조에서 120분간 반응시키며, 10분마다 5초간 vortex를 이용하여 섞어주었다. 이후, 초기 0.2N NaOH 양의 약 1/5정도의 1 N 아세트산을 첨가하였다. 이후 에탄올 침전법을 이용하여 면역반응 조절물질인 EG-IM을 수득하였다.

4. LOS 및 EG- IM 정량 및 확인

LOS 및 EG-IM의 함량은 2-Thiobarbituric acid를 이용한 KDO(2-케토-3-디옥시옥토네이트) 정량법으로 함량을 측정하였고, 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 크기에 따라 분리하여 실버염색으로 확인하여 도 2에 나타내었다. 도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, EG-IM의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커(SeeBlue® Plus2 Prestained standard, Invitrogen, LC5952)를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 탈아실화된 LOS인 EG-IM을 나타낸다.

[ 실시예 1] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 구조분석

정제한 시료는 정제수를 이용하여 적절히 희석하였다. C18 역상컬럼 (ACQUITY BEH300 C18 1.7 um 2.1 X 150 mm)을 기기(Water 사의 UPLC)에 장착한 후, 이동상 A(50 mM Ammonium formate pH 4.5)와 이동상 B(100 % Aceronitrile)를 이용하여 35~95% 농도 구배를 주어 시료를 분리하였다. MS 분석 및 MS/MS 분석은 질량분석기(VELOS PRO, Thermo 사)를 이용하였다. 100 ~ 3000 m/z 범위의 분자들을 분석하였으며, MS 분석 후 확인된 50~2000 m/z 범위의 분자들을 한번 더 분석하였다. 2372 m/z 분자량을 갖는 분자가 major 하게 확인되었으며, 각각의 피크(peak)들을 분석한 구조 모식도 도 1에 나타내었다.

[ 제조예 2] EG- IM을 포함한 리포좀 ( liposomal EG- IM ) 제조

1. EG- IM 용액 및 MPL 용액 제조

(1) EG- IM을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine 용액 제조

1 mg/mL의 EG-IM을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine 용액을 제조하여 -20℃에 보관하였다.

(2) EG- IM을 포함한 10%(w/v) sucrose 용액 제조

1 mg/mL의 EG-IM을 포함한 10%(w/v) sucrose 용액을 제조하였다.

(3) MPL을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine 용액 제조

MPL 5 mg이 들어있는 바이알에 0.3%(v/v) triethylamine 5 mL을 넣고 강하게 vortexing 한 후 10 분간 sonication 하여 균질화된 MPL 용액을 제조하였다. 제조한 용액은 1 mg/mL씩 실리콘 튜브에 소분하여 -20℃에 보관하였다.

2. liposomal EG- IM 제조

(1) 리피드 (lipid) 용해 및 당지질을 혼합한 시료 제조

Tert-butylalcohol을 용매로 하여 1 mg/mL의 DMPC 또는 DOTAP 용액을 만들고 vortex mix 하였다. 제조된 DMPC 용액 1 mL과 DOTAP 용액 1 mL을 바이알에 분주하여 DMPC와 DOTAP가 1:1 (v/v)로 혼합된 지질혼합용액을 제조하였다.

지질혼합용액에 EG-IM을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine을 혼합해 6 mol%, 3 mol%, 1 mol%의 EG-IM이 포함된 지질혼합용액을 제조하였고, MPL을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine을 혼합해 6 mol%, 3 mol%, 1 mol%의 MPL이 포함된 지질혼합용액을 제조하였다. 이 후, 지질혼합용액이 담긴 바이알을 -70℃ deep freezer에서 1시간 동안 예비동결한 후, 12 시간 이상 동결건조 하여 지질혼합물 케이크를 제조하였다.

(2) 재수화 ( rehydration ) 과정을 통한 리포좀 제조

지질혼합물 케이크 중 단순 지질혼합 바이알과 EG-IM 또는 MPL이 포함된 지질혼합 바이알에 10%(w/v) sucrose 용액 1 mL씩을 가하고 vortex mix 하여 리포좀을 제조하였다.

(3) 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 시료 제조

EG-IM을 포함한 10%(w/v) sucrose 용액과 리포좀 용액을 용량별로 혼합하여 리포좀과 EG-IM 6 mol%, 3 mol%, 1 mol%를 단순혼합한 시료를 제조하였다.

MPL을 포함한 0.3%(v/v) triethylamine 용액과 리포좀 용액을 용량별로 혼합하여 리포좀과 MPL 6 mol%, 3 mol%, 1 mol%를 단순혼합한 시료를 제조하였다.

[ 실시예 2] liposomal EG- IM 의 물성 분석

1. 리포좀 사이즈 분석

(1) 리포좀 사이즈 변화율 분석

지질용해 단계의 시료 및 제조예 2-(3)의 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 시료를 각각 1 mL씩 큐벳에 넣은 후 Dynamic light scattering 장비(Malvern instrument, ZSP nano)를 이용하여 Hydrodynamic size를 측정하였다(표 2).

그 결과, MPL은 리포좀과 단순혼합하는 경우 사이즈가 매우 커지는 경향이 관찰되었다. 반면, EG-IM은 고함량/단순혼합 제조 시 약간 사이즈가 증가하지만 1 μm 이하였고, 함량 및 제조 방법이 사이즈 변화에 영향을 미치지 않았다. 따라서, EG-IM을 포함한 리포좀(liposomal EG-IM)은 제조 후 사이즈 변화율이 적기 때문에 봉입형, 흡착형 등 다양한 형태로 제조 가능하며, 300 ~ 600 nm (<1 um)의 나노사이즈로도 제조 가능할 것으로 판단된다.

(2) 리포좀 사이즈 균질도 분석

지질용해 단계의 시료 및 제조예 2-(3)의 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 시료를 각각 1 mL 씩 큐벳에 넣은 후 Dynamic light scattering 장비(Malvern instrument, ZSP nano)를 이용하여 Hydrodynamic size 및 분포도를 도출하였다. 를 분석하였다(표 3, 도 3 및 도 4). 도 3은 지질용해 단계에서의 리포좀 사이즈 분포도를 나타낸 것이며, 도 4는 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 단계에서의 리포좀 사이즈 분포도를 나타낸 것이다.

그 결과, MPL의 경우는 농도에 의존적으로 분산도가 커지는 경향이 관찰되었다. 반면, EG-IM의 경우는 함량에 관계없이 분산도가 균일하게 유지되었다.

지질용해 단계에 당지질을 함입하면 당지질이 봉입된 형태의 리포좀이 형성된다(도 3). MPL의 경우는 제조된 리포좀의 사이즈 분포가 균일하지 않고, MPL 자체의 micelle이 형성되는 것을 확인 할 수 있다(도 3(A), (C), (E)). 반면, EG-IM의 경우는 제조된 리포좀이 균질하게 제조되어 단일의 피크를 형성하는 것을 확인할 수 있다(도 3(B), (D), (F)). 따라서, EG-IM은 봉입된 형태의 리포좀을 균일하게 제조할 수 있음을 확인하였다.

리포좀과 당지질을 단순혼합하면 당지질이 리포좀 표면에 흡착된 형태의 리포좀이 형성된다(도 4). MPL의 경우는 제조된 리포좀의 사이즈 분포가 균일하지 않고(표 3), MPL 자체의 micelle이 형성되는 것을 확인 할 수 있다(도 4(A), (C), (E). 반면, EG-IM의 경우는 제조된 리포좀이 균질하게 제조되어 단일의 피크를 형성하는 것을 확인할 수 있다(도 4(B), (D), (F)). 따라서, EG-IM의 경우는 흡착된 형태의 리포좀 역시 균일하게 제조할 수 있음을 확인하였다.

2. 리포좀 표면전하 분석

지질용해 단계의 시료 및 제조예 2-(3)의 당지질을 리포좀과 단순 혼합한 시료를 각각 1 mL씩 각각 표면전하 측정용 큐벳에 로딩한 후 Dynamic light scattering 장비(Malvern instrument, ZSP nano)를 이용하여 표면전하를 측정하였다(표 4).

그 결과, EG-IM의 경우는 함량에 상관없이 표면 전하가 55 mV 수준으로 균일하게 유지되었다. 반면, MPL의 경우는 6 mol%로 고함량을 혼합하는 경우 표면전하가 급격하게 감소하였다.

[ 실시예 3] liposomal EG- IM 메커니즘 분석

1. liposomal EG- IM 의 면역세포 증식 및 세포독성 완화

(1) liposomal EG- IM 의 면역세포 증식 효과

마우스 대식세포주 J774A.1 세포에 EG-IM(0.025, 0.05, 0.1, 0.5, 또는 1.0 μg/ml)과 다양한 조성의 리포좀(양이온성 지질로써, 1.25, 2.5, 5, 또는 2550 μg/ml)을 단독 또는 혼합하여 처리하였다. 세포에 시험물질을 처리하고 24시간 뒤, CCK-8 용액을 세포에 처리하고 1시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후 세포 배양액을 수집하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 배양액처리군(음성대조군)의 흡광도를 100%로 기준하여 각 시험군의 cell viability를 도출하였다.

NP는 리포좀 단독 처리군, NP+EG-IM은 EG-IM과 액상 리포좀의 단순 혼합물, NP/EG-IM는 리포좀과 EG-IM을 혼합 한 후 동결건조한 제형이다.

NP-A는 DDA:DOPC 리포좀, NP-B는 DOTAP:DMPC리포좀, NP-C는 DOTAP:DMPC:Squalene 리포좀, NP-D는 DOTAP:DMPC:Tricaprin 리포좀을 나타낸다.

그 결과, 다양한 조성의 양이온성 리포좀에 EG-IM을 혼합한 경우, 면역세포의 증식이 증가하였음을 확인할 수 있다(도 5).

(2) liposomal EG- IM 의 TNF -a 자극 활성 효과

마우스 대식세포주 J774A.1 세포에 EG-IM(0.025, 0.05, 0.1, 0.5, 또는 1.0 μg/ml)과 다양한 조성의 리포좀(양이온성 지질로써, 1.25, 2.5, 5, 25, 또는 50 μg/ml)을 단독 또는 혼합하여 처리하였다. 시험물질을 세포에 처리하고 24시간 배양 한 뒤, 세포배양액 내의 TNF-α 사이토카인 분비수준을 sandwich ELISA로 측정하였다.

NP-A는 DDA:DOPC 리포좀, NP-B는 DOTAP:DMPC 리포좀, NP-C는 DOTAP:DMPC:Squalene 리포좀, NP-D는 DOTAP:DMPC:Tricaprin 리포좀을 나타낸다.

그 결과, 다양한 조성의 양이온성 리포좀에 EG-IM을 혼합한 경우, TNF-a 분비 활성이 유도되었음을 확인할 수 있다(도 6).

(3) liposomal EG- IM 의 세포독성 완화 효과

일반적으로 양이온성 리포좀은 세포독성을 일으킨다고 알려져 있다. 이에 제조된 liposomal EG-IM의 경우 EG-IM에 의한 양이온성 리포좀의 세포독성이 완화되는 효과를 나타내는지 확인하였다. 사람 섬유아세포 MRC-5 세포를 이용해 EG-IM을 포함한 리포좀의 세포독성을 측정하였다. DDA:DMPC로 구성된 양이온성리포좀에 콜레스테롤 유무와 사이즈 균질화 방법 차이, 면역자극물질 EG-IM 유무에 따른 제조 리포좀의 세포독성을 평가하였으며, MRC-5 세포에 각 물질을 농도별로 처리해 자극한 후 MTT assay를 통해 세포 독성을 평가하였다.

A는 Cholesterol을 포함하지 않은 리포좀, B는 콜레스테롤을 포함한 리포좀, 1은 extruder를 사용하여 리포좀 균질화한 군이며, 2는 초음파파쇄기(sonicator)를 사용하여 리포좀 균질화한 군이다.

그 결과, DDA:DMPC에 의해 농도 의존적으로 나타나는 세포독성이 EG-IM 혼합에 의해 완화되었음을 확인할 수 있다(도 7).

2. liposomal EG- IM 을 포함하는 백신의 형성 메커니즘: 정전기적 인력에 의한 흡착

Liposomal EG-IM 백신의 형성 메커니즘이 정전기적 인력에 의한 흡착인지 확인하기 위하여, 리포좀(liposome, LP), 재조합 VZV gE 단백질, EG-IM을 혼합한 후 초원심분리 (4℃, 100,000 x g, 1 hr)하였다. 그 후, 상층액(supernatant, S)과 침전물(pellet, P)을 분리한 후 침전물은 상층액과 동일볼륨의 PBS를 넣고 초음파로 파쇄하여 완전히 현탁시켰다. 동일 볼륨의 시료를 전기영동한 후, silver staining 실시하였다.

그 결과, 재조합 VZV gE 단백질만 초원심분리한 경우는 상층액에서 재조합 gE 단백질이 검출되지만 liposomal EG-IM 백신(LP:gE:EG-IM 혼합물)은 침전물에서 재조합 gE 단백질이 검출되었다(도 8). 이는 리포좀과 재조합 gE 단백질이 흡착되었기 때문에 침전물에서 관찰된 것으로 판단된다.

3. liposomal EG- IM을 포함하는 백신의 면역효과

(1) liposomal EG- IM 의 면역세포 리크루팅 (recruiting) 효과

Liposomal EG-IM을 6 주령의 암컷 BALB/c 마우스의 근육투여 경로로 투여하고 투여 후 3시간, 24 시간 후 주사 부위 근육조직으로부터 세포를 분리하였다. 분리된 세포의 면역세포를 characterization 하기 위해 anti-CD11b Ab (FITC), anti-CD11c Ab (FITC), anti- Ly6C Ab (PE), anti-Ly6G Ab (PE), anti-F4/80 Ab (PE), anti-MHCII Ab (PE), anti-CD3 Ab (PE)를 이용해 세포를 면역염색하고 Flow cytometry로 분석하였다.

그 결과, liposomal EG-IM에 의해 CD11b+ 면역세포 (Monocytes, granulocytes), DCs, Monocytes, Macrophage, Granulocytes 의 주사부위 이동이 증가하였음을 확인할 수 있다(도 9). 이를 통해, liposomal EG-IM에 의해 면역세포 리크루팅이 개시되고, 이는 liposomal EG-IM에 의한 선천면역반응 유도 및 면역세포에 의한 liposomal EG-IM uptake가 증가할 가능성이 있다는 것을 알 수 있다.

(2) liposomal EG- IM을 포함하는 백신의 uptake 효과

gE 단백질을 형광물질(Alexa647)로 표지한 후 수지상세포(dendritic cell, DC)에 처리하고, 형광이 검출되는 DC를 flow cytometry로 분석하였다.

그 결과, gE 단백질 단독 또는 EG-IM 단독으로 사용한 경우에는 Fluorescence DC가 관찰되지 않았으나, liposomal EG-IM을 adjuvant system으로 사용한 경우에는 Fluorescence DC가 검출되었다(도 10). 이를 통해, liposomal EG-IM을 포함하는 백신은 DC uptake 효율을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 재조합 VZV gE 단백질을 형광물질(Alexa647)로 표지한 후 liposomal EG-IM과 혼합하여 백신을 제조하였다. 제조된 백신을 마우스 대퇴부 삼각근에 투여하고 투여 후 4시간, 24시간 후 draining lymph node (dLN)와 근육 조직을 이용해 면역세포의 표면마커 형광염색법을 실시하고 Flow cytometry로 분석하여 도 11에 나타내었다. 도 11(A)는 dLN에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 세포 분석한 것이고, 도 11(B)는 근육 조직에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 세포 분석한 것이며, 도 11(C)는 dLN에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 monocytes 측정한 것이고, 도 11(D)는 근육 조직에서 형광표지된 gE 단백질 특이적인 monocytes 측정한 것이다.

그 결과, 재조합 VZV gE 단백질 단독 또는 EG-IM 단독으로 사용한 경우와 비교할 때, liposomal EG-IM을 adjuvant system으로 사용한 경우에는 dLN와 근육조직에 세포가 리크루팅(recruiting) 되었으며, monocyte에 의한 백신의 uptake가 활발히 유도되었다(도 11).

(3) liposomal EG- IM을 포함하는 백신의 depot 효과

gE 단백질을 형광물질(Alexa647)로 표지한 후 liposomal EG-IM과 혼합하여 백신을 제조하였다. 제조된 백신을 마우스 대퇴부 삼각근에 투여하고 투여 후 30분, 24시간 후 in vivo 형광 이미지 촬영(A)을 하였으며, 마우스의 림프노드를 분리해 형광을 측정하였다(B).

그 결과, gE 단백질(항원)만 투여한 경우와 liposomal EG-IM을 포함하는 백신(VAC)을 투여한 경우 모두 24시간까지 주사 부위에서 형광이 검출되었다. 각 림프노드에서 형광을 분석 한 결과, 슬와근과 요추에서 비교적 높은 강도로 형광이 검출되었다. 항원만 투여한 경우는 24시간 후 형광 강도가 반감되었지만, liposomal EG-IM을 포함하는 백신을 투여한 경우는 형광 감도가 반감되지 않았다(도 12). 이를 통해, liposomal EG-IM을 포함하는 백신이 depot effect 를 증진시켰음을 알 수 있다.

[ 실시예 4] 지카 백신에 대한 liposomal EG- IM의 면역원성 분석

지카 백신에서 liposomal EG-IM의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 지카바이러스 표면(envelope) 단백질을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 재조합 지카바이러스 표면 당단백질, 다양한 면역보조제로 Alum(알루미늄 하이드록사이드; Brenntag, Germany), EG-IM, liposomal EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 2회 투여하였다. 투여용량은 재조합 지카바이러스 표면 당단백질 2 μg/마우스, Alum 25 μg/마우스, EG-IM 0.5 μg/마우스, liposomal EG-IM 25 μg/마우스이다. 최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리하였다. 분리된 비장세포를 항원 5 μg/mL로 자극하고 72시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ 사이토카인 분비량을 ELISA 키트(R&D systemsㅡMillipore)로 분석하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 Alum 단독 또는 리포좀 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ 분비를 증진시켰다(도 13). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 지카 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였다.

[ 실시예 5] 일본뇌염 백신에 대한 liposomal EG- IM의 면역원성 분석

일본뇌염 백신에서 liposomal EG-IM의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV) 항원을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 inactivated JEV 항원, 면역보조제로 EG-IM, liposomal EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 2회 투여하였다. 투여용량은 inactivated JEV 항원 0.5 ㎍/마우스, EG-IM 0.5 μg/마우스, liposomal EG-IM 25 μg/마우스이다.

JEV 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 4주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였다. 면역 후 혈청 내 JEV 항원의 특이-항체 역가를 측정하기 위해, 엔드-포인트 희석 ELSIA(end-point dilution Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. JEV 항원을 1㎍/ml의 농도로 희석하고 100 ㎕/well씩 96-웰 플레이트에 코팅(4℃, 하룻밤) 한 후, 1％ BSA(Bovine Serum Albumin) 300 ㎕로 블록킹을 하였다(실온, 1시간). 블록킹 후 0.05％ Tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척하고, 면역 후 얻은 혈청을 10배 계열희석하고 각 희석 혈청 100㎕를 반응 시켰다 (37℃, 2시간). JEV 항원-특이 항체를 확인하기 위해 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 항-마우스 IgG 항체 (Jackson, 115-035-003), IgG1 항체 (Serotec, STAR132P), IgG2a 항체 (Serotec, STAR133P)를 반응 시킨 후, TMB(tetramethylbenzidine, BD Bio science, 55555214)을 첨가하였고, 1 N H2SO4로 반응을 중지시켰다. 실험 결과는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 면역 후 회수한 혈중 IgG, IgG1, IgG2a 항체역가를 측정하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군에서는 EG-IM 단독 또는 리포좀 단독으로 이용한 시험군에 비해 각각 JEV 바이러스 항원-특이 IgG 항체, IgG1 항체, IgG2a 항체생성이 증가되었다(도 14(A)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 본 발명의 일본뇌염 백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 14주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 재조합 JEV 당단백질 1 ㎍/ml로 자극하고 24시간 후 IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트(Millipore) 로 분석하였다.

그 결과, Liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 리포좀 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ를분비하는 세포수를 증진시켰다(도 14(B)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 일본뇌염 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였다.

[ 실시예 6] 결핵 백신에 대한 liposomal EG- IM의 면역원성 분석

결핵(tuberculosis, TB)백신에서 Liposomal EG-IM의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 결핵 항원으로 Ag85A, ESAT-6, HspX 각각 또는 이들 3종 결핵 항원의 mixture를 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 재조합 결핵 항원, 면역보조제로 EG-IM, liposomal EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 3회 투여하였다. 투여용량은 재조합 결핵 항원 5 ㎍/마우스, EG-IM 0.5 μg/마우스, liposomal EG-IM 250 μg/마우스이다.

TB 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 3주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였다. 면역 후 혈청 내 TB 항원의 특이-항체 역가를 측정하기 위해, 엔드-포인트 희석 ELSIA(end-point dilution Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 실험 결과는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 면역 후 회수한 혈중 IgG 항체역가를 측정하였다.

그 결과, Ag85A, ESAT-6, HspX 각각 또는 이들 3종 결핵 항원의 mixture를 사용한 경우 모두 liposomal EG-IM을 이용한 시험군에서는 EG-IM 단독으로 이용한 시험군에 비해 각각 재조합 TB 항원-특이 IgG 항체 생성이 증가되었다(도 15(A)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 본 발명의 결핵 백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 3주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 재조합 TB gE 단백질 10 ㎍/ml로 자극하고 24시간 세포 배양한 후, IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트(Millipore) 로 분석하였다.

그 결과, Ag85A, ESAT-6, HspX 항원을 사용한 경우 모두 liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 EG-IM 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ를 분비하는 세포수를 증진시켰다(도 15(B)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 결핵 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

박테리아 살균 효과 분석

면역화된 마우스의 비장세포를 BCG-infected macrophage와 공동배양(co-culture)하였다. 배양 7일 후, 세포를 회수하고 용해시킨 뒤, Middlebrook OADC inrichment (Difco)를 포함한 Middlebrook 7H11 Bacto agar plate (Difco) 에 도말하였다. 37℃에서 4주간 배양한 후 생성된 bacterial colony 수를 계수하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 EG-IM 단독으로 이용한 시험군에 비해 BCG 살균효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있다(도 15(C)).

[ 실시예 7] 백일해 백신에 대한 liposomal EG- IM의 면역원성 분석

백일해 백신에서 Liposomal EG-IM의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 정제백일해 백신(aP) 항원을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 정제백일해 백신(aP) 항원, 면역보조제로 EG-IM, 리포좀, liposomal EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 2회 투여하였다. 투여용량은 aP 항원 5 ㎍/마우스, 리포좀 25 μg/마우스, EG-IM 0.5 μg/마우스, liposomal EG-IM 25 μg/마우스이다.

aP 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였다. 면역 후 혈청 내 aP 항원의 특이-항체 역가를 측정하기 위해, 엔드-포인트 희석 ELSIA(end-point dilution Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 실험 결과는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 면역 후 회수한 혈중 IgG 항체역가를 측정하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 리포좀을 단독으로 이용한 시험군에 비해 각각 aP 항원-특이 IgG 항체 생성이 증가되었다(도 16(A)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 본 발명의 백일해 백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

CD4 T 세포 증식 분석

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 5 μg의 aP 항원으로 자극하여 0, 4, 8일 세포배양을 하였다. 이 후, flow cytometry를 사용하여 CD4+ T 세포의 증식을 확인하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 리포좀을 단독으로 이용한 시험군에 비해 CD4+ T 세포의 증식 효능이 가장 우수함을 알 수 있다(도 16(B)).

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장과 폐 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 aP 항원 5 ㎍/ml로 자극하고 24시간 세포 배양한 후, IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트 (Millipore) 로 분석하였다. 흰색 그래프는 비장세포, 검정색 그래프는 폐 세포에서의 결과를 나타낸다. 또한 비장세포를 aP 항원 5 ㎍/ml로 자극하고 72시간 세포 배양한 후, IFN-γ 사이토카인 분비량을 sandwich ELISA (R&D systems)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 EG-IM 또는 리포좀 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ를 분비하는 세포수를 증진시켰다(도 17(A)). 또한, liposomal EG-IM을 이용한 시험군에서 IFN-γ 및 IL-17 사이토카인 분비능 역시 우수하였다(도 17(B), (C)). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 결핵 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

[ 실시예 8] 대상포진 백신에 대한 liposomal EG- IM의 면역원성 분석

대상포진 백신에서 liposomal EG-IM의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 대상포진(varicella-zoster virus, VZV) gE 항원을 사용하였다. 6주령 C57BL/6 마우스(SLC, Japan)에 약독화 VZV를 피하주사 경로로 투여하여 priming 모델을 만들고 4주 후 재조합 VZV gE 항원, 면역보조제로 Alum, EG-IM, liposomal EG-IM을 혼합하여 제조한 대상포진 백신을 근육투여 경로로 2주 간격으로 2회 투여하였다. 투여용량은 재조합 VZV gE 항원 5 ㎍/마우스, EG-IM 2 또는 3 μg/마우스, liposomal EG-IM 50 μg/마우스이다. 대조군으로 상용백신인 Zostavax (Merck, 미국)를 사람투여용량의 1/10 용량으로 희석하여 마우스에 1회 투여하였다. 또한 liposomal EG-IM의 구성성분인 리포좀의 조성비를 DOTAP:DMPC=1:1 또는 DOTAP:DMPC=1:2로 변화시켜 비교하였다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 4주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 Zostavax(약독화바이러스) 1000 PFU/mL 또는 gE peptide mix 4 ㎍/ml 로 자극하고 72 시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ 사이토카인 분비량을 ELISA 키트(R&D systems) 로 분석하였다. 또한 비장 세포를 Zostavax(약독화바이러스) 1000 PFU/mL 또는 gE peptide mix 4 ㎍/ml 로 자극하고 24 시간 후 IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트 (Millipore)로 분석하였다.

그 결과, liposomal EG-IM을 이용한 시험군은 EG-IM 단독으로 이용한 시험군에 비해 IFN-γ 분비를 증진시켰으며, 상용백신인 Zostavax 보다도 IFN-γ 분비를 증진시켰다 (도 18). 따라서, liposomal EG-IM을 포함하는 대상포진 백신은 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였다.

지질조성물 추가에 따른 상승효과 분석

Liposomal EG-IM의 구성에 추가적인 지질조성물로서 콜레스테롤(Chol), 스쿠알렌(Squalene), 트리카프린(Tricaprin)을 추가로 같이 혼합하여 상승효과가 나타나는지 여부를 확인하였다. 각각의 백신을 2주 간격으로 2회 근육주사하고 최종 투여일로부터 2주 또는 4주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 재조합 VZV gE 10 ㎍/ml로 자극하고 72 시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ 사이토카인 분비량을 ELISA 키트(R&D systems) 로 분석하였다. 또한 비장세포를 gE peptide mix 4 ㎍/ml로 자극하고 24 시간 세포 배양한 후, IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트(Millipore)로 분석하였다.

그 결과, 콜레스테롤(도 19), 스쿠알렌(도 20), 트리카프린(도 21)을 추가로 포함한 liposomal EG-IM에서 IFN-γ 분비를 증진시켰다. 따라서, liposomal EG-IM에 추가적인 지질조성물로서 콜레스테롤, 스쿠알렌, 트리카프린을 포함시킨 경우의 백신은 세포성 면역 유도능에서 liposomal EG-IM 단독으로 사용하는 경우보다 우수하다는 것을 확인하였다.

면역보조제 추가에 따른 상승효과 분석

Liposomal EG-IM의 구성에 추가적인 면역보조제로서 사포닌 계열 물질인QuilA을 추가로 혼합하여 상승효과가 나타나는지 여부를 확인하였다. 각각의 백신을 2주 간격으로 2회 근육주사하고 최종 투여일로부터 4주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 재조합 VZV gE peptide mix 4 ㎍/ml 또는 Zostavax 1000 PFU/mL로 자극하고 24 시간 세포 배양한 후, IFN-γ 사이토카인을 분비하는 세포를 ELISPOT 키트 (Millipore)로 분석하였다.

그 결과, 사포닌 유래물질 QuilA를 추가로 포함한 liposomal EG-IM에서 IFN-γ 분비를 증진시켰다(도 22). 따라서, liposomal EG-IM에 추가적인 면역증강물로서 사포닌 유래 물질을 포함시킨 경우의 백신은 세포성 면역 유도능에서 EG-IM 단독으로 사용하는 경우보다 우수하다는 것을 확인하였다.

Claims

(a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 함)
(b) 양이온성 리포좀(cationic liposome)을 포함하는 면역증강용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 C, D, E, CD, CE, DE 및 CDE로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포스페이트가 포함되는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine , 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양성 지질인 것을 특징으로 하는, 면역증강용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중성 지질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 조성물.
(a) 항원; 및
(b) 제1항의 면역증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항원은 지카바이러스의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 결핵균 항원, 백일해 항원, 바리셀라 조스터 바이러스(varicella-zoster virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 백신은 지카 백신, 일본뇌염 백신, 결핵 백신, 백일해 백신, 대상포진 백신, 수두 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 녹농균 백신, 암 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 백신은 콜레스테롤(Cholesterol), 스쿠알렌(Squalene) 또는 트리카프린(Tricaprin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서, 상기 백신은 사포닌 유래 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제11항에 있어서, 상기 사포닌 유래 물질은 사포닌(Saponin), QuilA 또는 QS21인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
하기 단계를 포함하는 면역증강용 조성물의 제조방법:
(a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계;
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 함)
(b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 리포좀을 형성하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 리포좀에 (a) 단계 용액을 첨가한 후 동결건조하는 단계.
제13항에 있어서, 상기 화학식 1의 C, D, E, CD, CE, DE 및 CDE로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포스페이트가 포함되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 (b) 단계의 지질은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine , 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양성 지질인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중성 지질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
하기 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법으로서,
상기 백신은 사포닌 유래 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물의 제조방법:
(a) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질이 포함된 용액을 제조하는 단계;
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 함)
(b) 지질을 유기용매에 녹인 후 지질혼합용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 지질혼합용액을 동결건조하여 유기용매를 제거하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 수득된 물질을 재수화(rehydration)하여 리포좀을 형성하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 리포좀에 (a) 단계 용액 및 항원을 첨가한 후 다시 동결건조하는 단계.
제17항에 있어서, 상기 (e) 단계의 항원은 지카바이러스의 항원, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 결핵균 항원, 백일해 항원, 바리셀라 조스터 바이러스(varicella-zoster virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물의 제조방법.
제17항에 있어서, 상기 백신은 콜레스테롤(Cholesterol), 스쿠알렌(Squalene) 또는 트리카프린(Tricaprin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물의 제조방법.
삭제
제17항에 있어서, 상기 사포닌 유래 물질은 사포닌(Saponin), QuilA 또는 QS21인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물의 제조방법.