KR102086986B1 - 면역반응 조절물질을 포함하는 백신 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체 및 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 면역반응 조절물질과 알룸을 모두 포함함으로써, 면역반응 조절물질을 단독으로 사용하는 경우에 비해 향상된 면역증강효능을 발휘한다.

Description

면역반응 조절물질을 포함하는 백신 조성물 및 이의 용도{Vaccine composition comprising immune response modulator and use thereof}

본 발명은 신규한 구조의 면역반응 조절물질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 독성을 감소시킨 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 유사체 및 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 성분으로, 다양한 면역세포를 촉진시키며 특히 선천성 면역 반응을 촉발시킨다. LPS는 사이토카인 분비, 보조자극인자(costimulatory molecule)의 발현 및 항원 제시의 유도를 통하여 항원제시세포를 활성화시키며, 이는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결한다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O, Cell 124: 783-801(2006); Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, et al. Nat Immunol 2: 947-950(2001)).

LPS는 양친매성 도메인(지질 A), 코어 올리고사카라이드(core oligosaccharide, OS) 및 O-항원(O-antigen 혹은 O-antigenic polysaccharide)의 세 개의 도메인으로 구성되어 있다. 지질 A는 LPS의 내독소 활성을 담당하고, 다양한 유형의 면역세포의 TLR4(toll-like receptor 4) 신호전달을 통하여 면역촉진 효과를 나타낸다고 알려져 있다(Raetz CR, Whitfield C, Annu Rev Biochem 71: 635-700(2002)). 감소된 독성을 나타내는 지질 A 유도체가 인간 백신 면역보조제(adjuvant) 개발에 타겟이 되어왔다. MPL(Monophosphoryl lipid A)은 살모넬라 미네소타 R형 균주(Salmonella minnesota rough strain)부터 분리된 LPS의 비독성 유도체이다. 또한, 알루미늄 염과 MPL의 조합은 HBV(hepatitis B virus)와 HPV(human papillomavirus) 백신용 면역보조제로서 승인을 받은바 있다.

LPS의 경우 1950년대부터 항암효과가 알려졌으나, 나노그람(ng) 수준의 오염으로도 패혈증에 의한 사망을 초래할 수 있는 독성으로 인해 사용이 어려운 문제가 있었다. 따라서, LPS에 대한 약독화 시도는 꾸준히 연구되었으며, 특히 폴리사카라이드 체인의 제거 또는 지질 A의 탈아실화를 통하여 독성을 감소시키는데 성공할 수 있었다(Katz SS et al., J Biol Chem. Dec 17;274(51):36579-84 1999). 특히, LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 지질 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL의 경우 LPS의 독성을 제거한 면역항암제로 개발되었으나 그 효과가 미미한 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였으며, 상기 면역반응 조절물질과 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물은 각각 단독사용하는 경우보다 우수한 면역촉진 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1509456호

(a) 항원; (b) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및 (c) 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, (a) 항원; (b) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및 (c) 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

또한, 본 발명은 상기 포스페이트는 화학식 1의 AB, AC, AD, AE, AF, BC, BD, BE, BF, CD, CE, CF, DE, DF, EF, ABC, ABD, ABE, ABF, ACD, ACE, ACF, ADE, ADF, AEF, BCD, BCE, BCF, BDE, BDF, BEF, CDE, CDF, CEF, DEF, ABCD, ABCE, ABCF, ABDE, ABDF, ABEF, ACDE, ACDF, ADEF, ABCDE, ABCEF 및 ABCDEF로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포함되는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원은 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 백일해 항원, 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신은 일본뇌염 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 지카 백신, 녹농균 백신, 암 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신은 면역반응 조절물질과 알룸(Alum)을 모두 포함함으로써, 면역반응 조절물질을 단독으로 사용하는 경우에 비해 향상된 면역증강효능을 발휘한다.

도 1은 본 발명의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)의 구조를 나타낸다. Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다.
도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, 면역반응 조절물질(EG-IM)의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 면역반응 조절물질(EG-IM)을 나타낸다.
도 3은 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV) 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다.
도 4는 일본뇌염백신 투여시 IFN-γ, IL-5 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 5는 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 HIB(Haemophilus influenzae type b) 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다.
도 6은 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 메르스 바이러스 spike S1 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다. 도 6A는 메르스 바이러스 항원 특이적인 혈중 IgG1 항체 역가를 나타낸다. 도 6B는 메르스 바이러스 항원 특이적인 혈중 IgG2a 항체 역가를 나타낸다.
도 7은 재조합 MERS-CoV spike S1 단백질을 사용한 메르스 백신 투여시 메르스 바이러스 spike S1 단백질 자극에 의한 IFN-γ, IL-4, IL-5 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 8은 재조합 MERS-CoV spike RBD 단백질을 사용한 메르스 백신 투여시 IFN-γ 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 9는 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 지카 바이러스 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다.
도 10은 지카 백신 투여시 IFN-γ, IL-5 사이토카인 분비량을 측정한 것이다.
도 11 및 도 12는 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 녹농균 항원의 특이-항체 역가를 측정한 것이다. 도 11은 P. aeruginosa FT2 항원을 사용하여 면역화한 경우이며, 도 12는 P. aeruginosa FT1 항원을 사용하여 면역화한 경우를 나타낸다.
도 13은 녹농균 항원과 EG-IM/Alum을 조합하여 사용한 경우 형성된 항체의 옵소노파고사이토시스 활성을 평가 해 면역화 혈청의 기능성을 평가한 것이다. 도 13A는 식세포자극 유도활성을 나타내며, 도 13B는 혈청 농도에 따른 식세포 자극활성을 나타낸다. 도 13C는 보체가 결핍된 경우와 보체가 포함된 경우의 식세포 자극 활성을 비교한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 기존의 LPS의 사용시 문제되었던 독성을 감소시키면서도 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하고자 노력한 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LOS를 분리 정제하고, 탈아실화시켜 독성이 감소된 신규한 구조의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)을 발견하였으며, 상기 면역반응 조절물질과 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물은 각각 단독사용하는 경우보다 우수한 면역촉진 활성을 나타냄을 확인하고자 하였다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 항원; (b) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM); 및 (c) 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

본 명세서에서 사용된 용어, “항원(antigen)”은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질이다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 면역반응 유도효능을 나타내는 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각일 수 있다.

본 발명에서 상기 항원은 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 백일해 항원, 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, 에볼라바이러스의 항원, 폐렴구균의 항원일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 일본뇌염바이러스의 항원, HIB의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 녹농균의 항원을 통해 본 발명의 면역원성 증강 효과를 확인하였다.

본 발명의 면역반응 조절물질(EG-Immune Modulator; EG-IM)은 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, Glc는 글루코오스, GlcN는 글루코사민, HEP은 헵토오스, KDO는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, A~F는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타낸다)

본 명세서에서 사용된 용어, “LOS(Lipooligosaccharide)”는 LPS(lipopolysaccharide)의 변형체로서 천연 LPS보다 짧은 당쇄를 가지고 있어 분자량이 작은 것을 의미한다. 탈아실화 전 LOS는 바람직하게는 분자량이 5,000-10,000 Da이며, 더욱 바람직하게는 3000~4000 Da이다. 용어 “탈아실화 LOS”는 이러한 LOS에서 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되어 LOS와 비교하여 독성이 크게 감소된 것을 의미한다. 지질 A의 글루코사민에 지방산은 -C(O)O- 결합 및 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명의 탈아실화 LOS는 지질 A의 탈아실화에 의해 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거된 것을 나타낸다.

상기 EG-IM은 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있으나, 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 특허등록 제0456681호; WO 2004/039413; 대한민국 특허등록 제0740237호; 및 WO 2006/121232에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, LPS에 강염기(예컨대, 0.2 N NaOH)을 처리하여 탈아실화 하여 지질 A로부터 일부 지방산을 제거하여 탈독소화 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 2~6개의 포스페이트를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~4개의 포스페이트기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1에서 포스페이트기의 개수 및 위치는 하기 표 1의 예시와 같을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1에서 당은 헥소오스, N-아세틸 헥소사민, 헵토오스 및 Kdo(2-케토-3-디옥시-옥토네이트)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어, “헥소오스(hexose)”는 한 분자 중 6개의 탄소 원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 예컨대 케토헥소오스(프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스), 알도헥소오스(알로스, 알트로스, 글루코오스, 만노오스, 굴로스, 이도스, 갈락토오스, 탈로스) 및 데옥시당(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 헥소오스는 알도헥소오스이고, 일특정예에서 상기 알도헥소오스는 글루코오스 또는 갈락토오스이다.

본 명세서에서 사용된 용어, “헵토오스(heptose)”는 한 분자 중 7개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 기능기(알데하이드기 및 케톤기)의 위치에 따라 알도헵토오스(포지션 1) 및 케토헵토오스(포지션 2)로 구분할 수 있다. 상기 알도헵토오스는 예컨대, L-글리세로-D-만노-헵토오스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토헵토오스는 예컨대, 세도헵툴로스 및 만노헵툴로스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 또는 N-아세틸 만노사민이고, 일 특정예에서, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민이다.

본 발명의 EG-IM은 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 갖는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EG-IM은 5~7개의 당을 포함할 수 있으며, 일 특정예에서 EG-IM의 당 개수는 6~7개이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 EG-IM은 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는다.

본 발명의 EG-IM은 지질 A에서 지방산(예컨대, C14 지방산)이 제거되어(탈아실화) 독성이 현저히 감소된 특징을 갖는다. 지방산은 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합 또는 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명에서 탈아실화는 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되는 것을 의미한다.

상기 탈아실화는 LOS에 알카리를 처리하여 실시할 수 있으며, 상기 알카리는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, Ca(OH)2, LiOH, RbOH 를 Mg(OH)2를 포함하며, 보다 바람직하게는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, Ca(OH)2, LiOH 및 Mg(OH)2이고, 보다 더 바람직하게는 NaOH, KOH 및 Mg(OH)2이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 EG-IM은 대장균(E. coli)으로부터 유래된 것이며, 상기 대장균은 대장균 EG0024(기탁번호: KCTC 12948BP)이다. 상기 균주는 2015년 11월 19일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12948BP로 기탁되었다.

본 발명의 EG-IM은 면역촉진 효능이 종래의 면역보조제와 비교하여 우수할 뿐만 아니라 독성도 감소되어 있어, 본 발명의 백신 조성물에 매우 적합하다. 본 발명의 EG-IM은, LPS의 독성을 제거하기 위하여 LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 리피드 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL(Monophosphoryl lipid A) 보다 독성이 적다.

본 명세서에서 사용된 용어, “면역보조제”는 그 자신은 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역을 유발할 수 없지만 항원과 함께 작용할 때 면역계를 자극하여 면역반응을 상승시키는 작용을 하는 기질 또는 첨가물을 의미한다. 즉, 항원과 면역보조제를 함께 이용한 백신은 항원 단독에 의해 유도되는 것보다 더 강력한 면역반응을 유도한다. 본 발명에서는 황산알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등과 같은 알루미늄 화합물(알룸), 포타슘 설페이트마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘포스페이트, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드를 면역보조제로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 면역보조제로 알룸(Alum)을 사용하였다.

본 발명의 백신은 질병의 예방용 또는 치료용으로 사용될 수 있으며, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 백신은 세포성 면역뿐만 아니라 체액성 면역을 증진시키는 효능을 가진다. 본 발명의 일 실시예에서 EG-IM 및 Alum을 포함하는 일본뇌염바이러스 백신은 항체성 면역반응뿐 아니라 TH1 타입 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였으며(도 4), EG-IM 및 Alum을 포함하는 메르스 백신(도 7 및 도 8)과 지카 백신(도 10) 역시 항체성 면역반응뿐 아니라 TH1 타입 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 백신은 일본뇌염 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 지카 백신, 녹농균 백신, 암 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신 및 페렴구균 백신일 수 있으며, 바람직하게는 일본뇌염 백신, 헤모필루스 인플루엔자 백신, 메르스 백신, 지카 백신, 녹농균 백신일 수 있다.

상기 암 백신은, 이에 의하여 제한되는 것은 아니나, 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암에 대한 백신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 조성물 총 중량에 대하여 상기 면역반응 조절물질을 1~10중량%로 포함할 수 있다. 상기 면역반응 조절물질을 1중량% 미만으로 포함하는 경우는 효과적인 면역효과를 기대할 수 없으며, 30중량% 초과로 포함하는 경우는 면역관용현상이 나타날 수 있다.

본 발명은 조성물 총 중량에 대하여 상기 알룸(Alum)을 70~99중량%로 포함할 수 있다. 상기 면역반응 조절물질을 70중량% 미만으로 포함하는 경우는 효과적인 면역효과를 기대할 수 없다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 제조예 ] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 제조

1. 건조 균체 제조

대장균(E.coli)을 37℃ TSB(Triptic soy broth, Difco) 30 g/ℓ 배지에서 20시간 80 rpm 이하에서 진탕배양하고, 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 에탄올을 섞은 후 원심분리 하여 침전물을 수득하였다. 이후, 수득한 침전물에 아세톤을 첨가해 충분히 섞은 후 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물에 에틸에테르를 첨가하고 잘 섞은 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물은 60℃ 건조오븐에서 건조하여 건조균체를 제조하였다.

2. LOS 추출

건조 균체의 중량을 측정한 후 중량 1 g 당 7.5 mL의 PCP(페놀, 클로로포롬, 페트롤리움이써) 추출혼합액을 첨가하여 균체균부터 LOS를 분리하였다. 상기 방법으로 분리하여 얻은 LOS 추출물은 회전증발기를 이용하여 고온에서 유기용매를 제거하였다. 남은 추출액은 고온에서 원심분리 하여 침전물을 수득하고, 침전물에 에틸에테르를 첨가하여 침전물을 세척하였다. 이어 정제수를 넣고 침전물을 생성하였다. 생성된 침전물은 원심분리 하여 상층액과 분리하고 침전물은 에탄올로 세척하여 회수한다. 고온 건조오븐에서 침전물을 충분히 건조시키고, 정제수로 침전물을 용해시켜 LOS를 추출하였다.

3. LOS의 독성 제거

LOS 추출물의 함량을 확인한 후 3 mg/mL 농도로 맞추고, 0.2 N NaOH와 1:1 볼륨으로 섞는다. 60℃ 항온수조에서 120분간 반응시키며, 10분마다 5초간 vortex를 이용하여 섞어주었다. 이후, 초기 0.2N NaOH 양의 약 1/5정도의 1 N 아세트산을 첨가하였다. 이후 에탄올 침전법을 이용하여 면역반응 조절물질인 EG-IM을 수득하였다.

4. LOS 및 EG- IM 정량 및 확인

LOS 및 EG-IM의 함량은 2-Thiobarbituric acid를 이용한 KDO(2-케토-3-디옥시옥토네이트) 정량법으로 함량을 측정하였고, 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 크기에 따라 분리하여 실버염색으로 확인하여 도 2에 나타내었다. 도 2A는 추출된 LOS를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이고, 도 2B는 LOS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 추출된 LOS 기준으로, EG-IM의 크기가 작아짐을 확인한 결과이다. M은 마커(SeeBlue® Plus2 Prestained standard, Invitrogen, LC5952)를 나타내며, 레인 1은 탈아실화 전의 추출된 LOS(탈아실화 전의 LOS), 레인 2는 탈아실화된 LOS인 EG-IM을 나타낸다.

[ 실시예 1] 면역반응 조절물질(EG- IM )의 구조분석

정제한 시료는 정제수를 이용하여 적절히 희석하였다. C18 역상컬럼 (ACQUITY BEH300 C18 1.7um 2.1 X 150mm)을 기기(Water 사의 UPLC)에 장착한 후, 이동상 A(50 mM Ammonium formate pH 4.5)와 이동상 B(100 % Aceronitrile)를 이용하여 35~95% 농도 구배를 주어 시료를 분리하였다. MS 분석 및 MS/MS 분석은 질량분석기(VELOS PRO, Thermo 사)를 이용하였다. 100~3000 m/z 범위의 분자들을 분석하였으며, MS 분석 후 확인된 50~2000 m/z 범위의 분자들을 한번 더 분석하였다. 2372 m/z 분자량을 갖는 분자가 major 하게 확인되었으며, 각각의 피크(peak)들을 분석한 구조 모식도 도 1에 나타내었다.

[ 실시예 2] 사백신에 대한 EG- IM /Alum의 효능 분석

일본뇌염백신의 면역

사백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV) 항원을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(코아텍, 대한민국)에 inactivated 일본뇌염백신 또는 일본뇌염백신과 Alum(알루미늄 하이드록사이드; Brenntag, Germany)의 조합을 inactivated 일본뇌염백신 각 0.5 ㎍/마우스 또는 1 ㎍/마우스를 사용하고, Alum 25 ㎍/마우스, EG-IM 0.5 ㎍/마우스를 조합하여 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 만들어 2주 간격으로 2회 투여하였다. 음성 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline, pH 7.3)를 투여하였다.

JEV 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였다. 면역 후 혈청 내 JEV 항원의 특이-항체 역가를 측정하기 위해, 엔드-포인트 희석 ELSIA(end-point dilution Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. JEV를 1㎍/ml의 농도로 희석하고 100 ㎕/well씩 96-웰 플레이트에 코팅(4℃, 하룻밤) 한 후, 1％ BSA(Bovine Serum Albumin) 300 ㎕로 블록킹을 하였다(실온, 1시간). 블록킹 후 0.05％ Tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척하고, 면역 후 얻은 혈청을 10베 계열희석하고 각 희석 혈청 100㎕를 반응 시켰다 (37℃, 2시간). JEV 항원-특이 항체를 확인하기 위해 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 항-마우스 IgG 항체(Jackson, 115-035-003), IgG1 항체(Serotec, STAR132P), IgG2a 항체(Serotec, STAR133P)를 반응 시킨 후, TMB(tetramethylbenzidine, BD Bio science, 55555214)을 첨가하였고, 1 N H2SO4로 반응을 중지시켰다. 실험 결과는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 면역 후 회수한 혈중 IgG, IgG1, IgG2a 항체 역가를 측정하였다. 그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 EG-IM 단독 또는 Alum 단독으로 이용한 시험군에 비해 각각 JEV 바이러스 항원-특이 IgG 항체 생성이 각각 13배, 3배 정도 증가되었다. 또한, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 EG-IM 단독 또는 Alum 단독으로 이용한 시험군에 비해 각각 JEV 바이러스 항원-특이 IgG1 항체 생성이 12배, 3배 정도 증가되었으며, JEV 바이러스 항원-특이 IgG2a 항체생성 역시 EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서 증가되었다(도 3).

따라서, 면역반응 조절물질로 EG-IM을, 면역보조제로 Alum을 동시에 포함하는 본 발명의 일본뇌염백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 inactivated JEV 항원 또는 재조합 JEV gE 단백질 5 ㎍/ml로 자극하고 72시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ, IL-5 사이토카인 분비량을 sandwich ELISA(R&D systems, DY485; DY405)로 분석하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군은 체액성 면역을 증가시키는 기능을 하는 Alum을 단독으로 이용한 시험군에 비해, IFN-γ 분비를 증진시켰으나, IL-5 분비는 증진시키지 않았다(도 4).

따라서, EG-IM 및 Alum을 포함하는 일본뇌염바이러스 백신은 항체성 면역반응뿐 아니라 TH1-타입 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

[ 실시예 3] 컨쥬게이트 백신에 대한 EG- IM /Alum의 효능 분석

B형 헤모필루스 인플루엔자 백신의 면역

컨쥬게이트 백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, HIB(Haemophilus b)항원을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 ActHIB(Haemophilus b conjugate Vaccine, Tetanus Toxoid Conjugate, Sanofi Pasteur SA)과 EG-IM/Alum을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 3회 투여하였다. 투여용량은 ActHIB 2 μg/마우스, Alum 25 μg/마우스 또는 EG-IM 0.5 μg/마우스를 혼합하였다.

HIB 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였으며, HIB 항원의 특이-항체 역가를 측정하기 위해, mouse anti-Haemophilus influenza type b IgG ELISA kit(XpressBio, US)를 이용해 혈중 IgG 항체 역가를 측정하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 상용백신에 비해 2배 증가된 HIB 항원-특이 IgG항체 생성이 증가되었다(도 5).

따라서, 면역반응 조절물질로 EG-IM을, 면역보조제로 Alum을 동시에 포함하는 B형 헤모필루스 인플루엔자 백신은 항체성 면역반응을 유도하며, 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

[ 실시예 4] 재조합 백신에 대한 EG- IM /Alum의 효능 분석

1. 메르스 백신

(1) 재조합 MERS - CoV spike S1 단백질을 사용한 경우

메르스 백신의 면역

재조합 백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 MERS-CoV spike S1 단백질(eEnzyme, MERS-S1-005P)을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 재조합 MERS-CoV spike S1 단백질과 Alum및/또는 EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 3회 투여하였다. 투여용량은 S1 단백질 0.5 μg/마우스 또는 1 μg/ 마우스, Alum 25 μg/ 마우스 또는 EG-IM 0.5 μg/마우스를 혼합하였다.

메르스 바이러스 항원 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 4주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였으며, 메르스 바이러스 항원 특이-항체 역가를 측정하기 위해, ELISA kit를 이용해 혈중 IgG1, IgG2a 항체 역가를 측정하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 Alum 단독으로 이용한 시험군에 비해 농도의존적으로 메르스 바이러스 항원-특이 IgG1, IgG2a 항체 생성이 증가되었으며, 단독으로 이용한 시험군과 비교하여 증가도는 IgG2a 경우가 IgG1보다 높은 것으로 확인되었다(도 6). 따라서, 면역반응 조절물질로 EG-IM을, 면역보조제로 Alum을 동시에 포함하는 본 발명의 메르스 백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 4주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 s1 단백질로 자극하고 72시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ, IL-4, IL-5 사이토카인 분비량을 sandwich ELISA(R&D systems, DY485; DY404; DY405)로 분석하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군은 체액성 면역을 증가시키는 기능을 하는 Alum을 단독으로 이용한 시험군에 비해, 농도의존적으로 IFN-γ 분비를 증진시켰으나, IL-4, IL-5 분비는 오히려 감소되었다(도 7).

(2) 재조합 MERS - CoV spike RBD 단백질을 사용한 경우

메르스 백신의 면역

재조합 백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 MERS-CoV spike RBD 단백질을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 재조합 MERS-CoV spike S1 단백질과 Alum및/또는 EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 3회 투여하였다. 투여용량은 RBD 단백질 1 μg/마우스와 alum 25 μg/마우스, Addavax 12.5 μg/마우스 또는 EG-IM 0.5 μg/마우스를 혼합하였다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 RBG 단백질로 자극하고 72시간 세포 배양했다. IFN-γ 사이토카인 분비에 기여하는 T cell subtype을 분석하기 위해 각 시험군을 항원으로 자극할 때에 CD4 blocking 항체 또는 CD8 blocking 항체를 처리하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수 하여 세포 배양액 내의 IFN-γ 사이토카인 분비량을 sandwich ELISA(R&D systems, DY485)로 분석하였다. AddaVax(Invivogen)은 대조 면역보조제로 사용되었다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군은 체액성 면역을 증가시키는 기능을 하는 Alum을 단독으로 이용한 시험군 또는 addavax를 이용한 시험군에 비해, IFN-γ 분비를 증진시킴을 확인할 수 있다(도 8).

따라서, EG-IM 및 Alum을 포함하는 메르스 백신은 항체성 면역반응뿐 아니라 TH1-타입 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

2. 지카 백신

지카 백신의 면역

재조합 백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, 재조합 지카바이러스 envelope 단백질을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스(SLC, Japan)에 재조합 지카바이러스 envelope 단백질과 Alum및/또는 EG-IM을 혼합하여 근육투여 경로로 2주 간격으로 2회 투여하였다. 투여용량은 재조합 지카바이러스 envelope 단백질 2μg/마우스와 Alum 25 μg/마우스 또는 EG-IM 0.5 μg/마우스를 혼합하였다.

지카 바이러스 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였으며, 재조합 지카바이러스 envelope 단백질 특이-항체 역가를 측정하기 위해, ELISA kit를 이용해 혈중 IgG1, IgG2a 항체 역가를 측정하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 Alum 단독으로 이용한 시험군에 비해 지카 바이러스 항원-특이 IgG1, IgG2a 항체 생성을 증진시켰으며, 단독으로 이용한 시험군과 비교하여 증가도는 IgG2a 경우가 IgG1보다 높은 것으로 확인되었다(도 9). 따라서, 면역반응 조절물질로 EG-IM을, 면역보조제로 Alum을 동시에 포함하는 본 발명의 지카 백신은 면역 효능 즉 백신 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

사이토카인 분석

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 비장 조직을 적출한 뒤 단일세포로 분리해 s1 단백질로 자극하고 72시간 세포 배양한 후, 세포 배양액 내의 IFN-γ, IL-5 사이토카인 분비량을 sandwich ELISA (R&D systems, DY485; DY405)로 분석하였다.

그 결과, EG-IM/Alum을 이용한 시험군은 체액성 면역을 증가시키는 기능을 하는 Alum을 단독으로 사용한 시험군에 비해, 농도의존적으로 IFN-γ 분비를 증진시켰으나, IL-5 분비는 오히려 감소되었다(도 10).

따라서, EG-IM 및 Alum을 포함하는 지카 백신은 항체성 면역반응뿐 아니라 TH1-타입 세포성 면역 유도능이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

[ 실시예 5] 추출단백질 백신에 대한 EG- IM /Alum의 효능 분석

녹농균 백신의 면역

추출단백질 백신에서 EG-IM/Alum의 면역원성 증강 효과를 확인하기 위해, P. aeruginosa FT2 항원 또는 FT1 항원을 사용하였다. 6주령 Balb/c 마우스에 FT2 항원 또는 FT1 항원, Alum 및/또는 EG-IM을 혼합하여 항원은 1주 간격으로 5μg 또는 6.5 μg 씩 2회 투여하였다. PBS를 투여한 군을 음성대조군으로 사용하였다.

녹농균 항원의 특이-항체 역가 측정

최종 투여일로부터 2주 후 마우스를 마취하고 심장채혈하여 혈액 샘플을 수집하였으며, 녹농균 특이-항체 역가를 측정하기 위해, ELISA kit를 이용해 혈중 (total)IgG, IgG1, IgG2a 항체 역가를 측정하였다.

그 결과, P. aeruginosa FT2 항원을 사용하여 면역화한 경우, EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 Alum 단독으로 사용한 시험군에 비해 녹농균-특이 IgG 항체 생성이 증가되었다(도 11). 또한, P. aeruginosa FT1 항원을 사용하여 면역화한 경우 역시 EG-IM/Alum을 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 Alum 단독으로 사용한 시험군에 비해 항원-특이 IgG, IgG1, IgG2a 항체 생성뿐만 아니라 P.aeruginosa GN3 (FT 1 strain) 특이 IgG, IgG1, IgG2a 항체 생성이 모두 증가되었다(도 12). 이는 EG-IM/Alum을 면역보조제로 사용하면 면역화 혈청이 녹농균 백신에 사용된 항원 뿐 아니라 실제 감염 균체에 대한 반응성을 높임을 나타낸다.

녹농균 백신 면역화에 의해 형성된 마우스 혈청의 옵소노파고사이틱 활성 측정

녹농균 백신 면역화에 의해 형성된 마우스 혈청의 옵소노파고사이틱 활성 을 측정하기 위해, P. aeruginosa FT2 항원 6.5 μg 을 항원 단독, 또는 Alum 및/또는 EG-IM을 혼합하여 2주 간격으로 2회 투여하였다. 최종 면역화 2주 후 심장채혈하여 혈청을 수집하고 P. aeruginosa PA103 (FT2 strain)에 대해 옵소노파고사이틱 활성을 측정하였다. 구체적으로는 P. aeruginosa FT2를 대수기까지 키운 후 회수하여 56℃에서 30분간 heat-inactivation 시키고 100 μg/ml FITC-Isomer I과 4℃에서 1시간 동안 반응시켜 균주에 형광을 표지하였다. 표지가 완료된 균주는 PBS로 수회 세척하고 옵소노파고사이틱 활성 시험용 버퍼 용액(5% defined FBS and 0.1% gelatin in HBSS) 을 이용해 OD600 0.9가 되도록 희석했다. 형광 표지된 균주를 카운트하여 5 × 106 CFU 를 면역화 혈청과 혼합하고 불활성화 토끼 보체와 혼합하여 30분 간 암소에서 진탕 배양하였다. 이후, HL-60 세포에 균주 혼합물을 20:1 (균주:HL-60 세포) 비율로 혼합하고 30분간 배양하였다. 배양이 종료된 후 0.1% BSA가 포함된 PBS로 세포를 세척하고 세포를 회수해 flow cytometry(FACSCanto II™ system, BD Biosciences)와 FlowJo software(Treestar, USA)를 이용해 분석하였다. 옵소노파고사이틱 활성은 HL-60 세포에 표지 된 평균형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)로 나타내었다.

그 결과, EG-IM/Alum 만을 투여한 음성대조군 및 항원과 Alum을 혼합한 시험군에 비해 항원과 EG-IM/Alum 조합을 투여한 마우스 혈청에 의해 식세포작용이 활발 했다(도면 13A). 식세포 작용은 혈청 농도 및 보체 의존적이었다(도면13B 및 13C). 이를 통해, EG-IM/Alum 조성물에 의해 유도된 녹농균백신 항원 특이적인 항체가 녹농균에 대한 옵소노파고사이토시스를 증진시켜 항체의 기능이 향상되었음을 확인하였다.

녹농균 항원의 감염방어능 측정

녹농균 항원에 대한 EG-IM/Alum의 감염방어능(Protective efficacy)을 확인하기 위해, 6주령 Balb/c 마우스에 FT2 항원, Alum 및/또는 EG-IM을 혼합하여 항원은 1주 간격으로 5μg씩 2회 투여하였다. PBS를 투여한 군을 음성대조군으로 사용하였다. 최종 투여일로부터 2주 후 혈액 샘플을 수집하였고, 1주 후에 마우스는 P. aeruginosa FT2 strain PA103을 10 LD₅₀로 lethal challenge하여 8일 동안 생존을 관찰하였다.

면역화	감염방어능 (%)
PBS	0
Ag	20
Ag + EG-IM	0
Ag + Alum	20
Ag + EG-IM/Alum	80

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, EG-IM/Alum을 이용한 시험군은 감염방어능이 80%에 가깝게 유도되었으나, EG-IM 단독으로 이용한 시험군에서는 EG-IM 또는 Alum 단독으로 이용한 시험군은 감염방어능이 거의 유도되지 않았다.

따라서, 녹농균으로부터 추출한 수용성 단백질 혼합물을 항원으로 하고, 면역반응 조절물질로 EG-IM을, 면역보조제로 Alum을 혼합한 녹농균 백신은 항체성 면역반응 유도능이 우수하고, 감염방어능이 우수하게 유도된다는 것을 확인할 수 있다.

Claims (6)

1. (a) 항원;
   (b) 하기 화학식 1로 표시되는 면역반응 조절물질; 및
   [화학식 1]
   

   

   
   (상기 화학식 1에서, C, D 및 E는 포스페이트(phosphate)를 포함할 수 있는 위치를 나타내며, 상기 포스페이트는 당의 히드록시기 중 어느 하나에 결합되는 것을 특징으로 함)
   (c) 알룸(Alum)을 포함하는 백신 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 C, D, E, CD, CE, DE 및 CDE로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 포스페이트가 포함되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 및 세포 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 항원은 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, HIB(Heamophilus influenzae type B)의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카바이러스의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 백일해 항원, 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 사스코로나바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, 에볼라바이러스의 항원 및 폐렴구균의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 백신은 사균백신, 약독화백신, 아단위 백신, 컨쥬게이트 백신, 재조합 백신, 단가백신, 다가백신 또는 혼합백신 형태인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 백신은 일본뇌염 백신, 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae type B) 백신, 메르스 백신, 지카 백신, 녹농균 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신, 수두 백신, 다제내성균 백신, 장알균백신, 포도알균 백신, 폐렴막대균 백신, 아시네토박터 백신, 엔테로박터 백신, 헬리코박터 백신, 말라리아 백신, 뎅기열 백신, 쯔쯔가무시 백신, 중증열성혈소판감소증후군 백신, 사스 백신, 에볼라 백신, 인플루엔자 백신 및 페렴구균 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.

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