CN116940376A - 用于预防sars-cov-2的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防SARS‑CoV‑2的疫苗组合物，其包括编码SARS‑CoV‑2病毒的S突变抗原的mRNA，其中根据本发明的用于预防SARS‑CoV‑2的疫苗表现出优异的稳定性和在体内的高免疫原性，并且该疫苗因此易于储存和使用，并且可以预期其针对COVID‑19的优异的预防效果。

Description

用于预防SARS-COV-2的疫苗组合物
技术领域
本发明涉及用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物，更具体地涉及用于预防SARS-CoV-2的包括编码SARS-CoV-2病毒的变体S抗原的mRNA的疫苗组合物。
背景技术
冠状病毒是一种RNA病毒，其遗传信息由核糖核酸(RNA)组成。冠状病毒会引起人类和动物的呼吸道和胃肠道感染。冠状病毒易于传播，主要通过黏膜传播、飞沫传播等方式，并且一般会引起人类轻微的呼吸道感染，但异常情况下会引起致命感染。
目前造成疫情的SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)，是一种正义单链RNA冠状病毒，对人类具有传染性，是冠状病毒疾病2019(COVID-19)的病因。SARS-CoV-2病毒利用其表面的刺突蛋白与肺部气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞的表面上存在的ACE2(血管紧张素转换酶2)结合，并因此侵入宿主细胞。基于SARS-CoV-2的基因组测序结果，在刺突蛋白中鉴定出具有与SARS-CoV非常相似的三级结构的受体结合结构域(RBD)，并且推测SARS-CoV-2的RBD对ACE2具有比SARS-CoV的RBD更高的结合亲和力，因此SARS-CoV-2的传染性比SARS-CoV的传染性强(Matthew Z T et al.,Nature ReviewsImmunology,20:363-374,2020)。
刺突蛋白由S1和S2两种蛋白组成，其中S1蛋白由氨基末端结构域和RBD组成。当RBD与ACE2结合时，SARS-CoV-2病毒体通过胞吞作用进入细胞的内体，之后融合肽暴露出来并插入宿主细胞的膜。S2蛋白由融合肽区(FP区)和七肽重复区(HR1、HR2)组成，并且HR1和HR2以接触的方式融合到病毒膜上，从而将SARS-CoV-2病毒体释放到宿主细胞外。S1和S2具有不同的切割位点并且被相应的蛋白酶切割，导致SARS-CoV-2感染。正在使用抑制S1和S2切割或破坏蛋白诸如ACE2或TMPRSS2(跨膜丝氨酸蛋白酶2)与病毒之间的结合的策略，开发SARS-CoV-2疗法和疫苗(Matthew Z T et al.,Nature Reviews Immunology,20:363-374,2020)。
如先前对MERS-CoV和SARS-CoV的研究所证实的，由于SARS-CoV-2的刺突蛋白具有不稳定的蛋白结构，通过脯氨酸取代986(K)和987(V)防止了错误折叠或触发，使得融合前稳定的病毒糖蛋白充当更好的免疫原(Jesper Pallesen et al.PNAS,2017，DOI：https://doi.org/10.1073/PNAS.1707304114)。
与此同时，根据全球共享禽流感数据倡议(GISAID)，SARS-CoV-2已从“D型(D614)”突变为“欧洲型”或“G型(G614)”。G型突变的特征在于病毒表面刺突蛋白的第614位氨基酸从天冬氨酸(GAT；Asp，D)突变为甘氨酸(GGT；Gly，G)(图1)(Plante,J.A et al.Nature(2020)。DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2895-3)。
由于全球疫情，已经相继开发了预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗，并且疫苗接种正处于开始阶段，但是仍然需要开发能够表现出高免疫原性同时保持更稳定效果的疫苗。
与此同时，基因疗法和基因疫苗接种是已经在医学领域得到证实并且被普遍应用的技术，并且不仅可以用于治疗遗传性疾病，还可以用于治疗自身免疫性疾病、感染性疾病、癌症或肿瘤相关疾病以及炎性疾病。
基因疫苗的开发始于据报道，当将编码靶基因的DNA和RNA直接注射到动物体内时，该靶基因在活体动物体内表达，并且通过这种表达免疫是可行的(Wolff JA etal.Science,247:1465-8,1990)。
基因疫苗接种引发针对所选的抗原的所需免疫应答，所选的抗原诸如细菌表面的特征成分、病毒颗粒、肿瘤抗原等。总而言之，疫苗接种是现代医学的关键成就之一。然而，有效的疫苗目前只对数量有限的疾病有用。因此，每年仍有数百万人经受无法被疫苗预防的感染的影响。
在基因疗法或基因疫苗接种中，DNA和RNA可以被用作用于基因给药的核酸分子，并且已知与RNA相比，DNA相对稳定且易于处理。然而，在DNA的情况下，如果给药到患者基因组中的DNA片段被插入到不期望的位置并且基因被损伤，则可能引起潜在的风险。此外，可能出现不需要的抗-DNA抗体，并且其他问题是通过DNA给药和随后的转录/翻译所表达的肽或蛋白质的表达水平有限。调控DNA转录的特定转录因子的存在或缺失对给药的DNA的表达水平具有重大影响，并且在缺失特定转录因子的情况下，DNA转录无法产生足够量的RNA，因此，通过翻译产生的肽或蛋白质的水平也受到限制。
另一方面，当RNA被用作基因给药的工具时，RNA不需要转录，因此能够在细胞质中直接合成蛋白质，而不需要像DNA一样进入细胞核，所以不用担心侵入细胞染色体并引起不期望的基因损伤。此外，RNA的半衰期比DNA短，因此不会诱导长期的基因修饰(Sayour EJ,et al.,J.Immunother.Cancer 2015；3:13,2015)。当递送到细胞中时，一般的RNA疫苗在短时间内被激活以表达靶蛋白，并在几天内被酶反应破坏，并且保留对表达的靶抗原(蛋白)的特异性免疫应答。
此外，当使用RNA作为基因给药的工具时，RNA仅在穿过细胞膜时起作用而不需要穿过核膜，因此，甚至使用比DNA更少的量，也能表达与使用DNA时相同水平的靶蛋白。此外，RNA本身具有免疫增强活性，因此即使与DNA相比以少量给药也能表现出相同的免疫效果。
通过使用RNA代替DNA进行基因疫苗接种，可以最小化或避免不期望的整合到基因组中的风险以及抗DNA抗体的产生。然而，RNA是一种高度不稳定的分子种类，可以容易地被普遍存在的RNA酶降解。
尽管在过去的几年中已经取得了许多进展，但是在本领域中仍然需要提供一种其中给药的有效性不会被由于抗原的过早降解或mRNA从细胞中的低效(inefficient)释放而导致的mRNA的低效翻译而损害的方法，作为可以诱导免疫应答的mRNA疫苗接种的有效方法。此外，还需要减少mRNA疫苗的剂量，以减少潜在的安全问题，并使疫苗在整个第三世界都负担得起。
关于核酸递送仍有许多问题需要解决，以在生物系统中获得期望的应答。基于核酸的疗法具有巨大的前景，但实现这一前景需要将核酸有效地递送至细胞或生物体内的适当位点。
然而，将目前核酸用于治疗和预防目的面临两个问题。首先，游离RNA容易被血浆中的核酸酶降解。其次，游离RNA进入翻译该RNA的翻译机制所在的胞内区室的能力有限。已经尝试掺入由阳离子脂质和其他脂质成分诸如中性脂质、胆固醇、PEG、聚乙二醇化脂质形成的脂质纳米颗粒和寡核苷酸，以阻断血液中RNA的降解并促进核酸的细胞摄取。
因此，本发明人已经付出了巨大的努力，以开发具有优异的储存稳定性和体内高免疫原性的针对SARS-CoV-2的预防性疫苗，并因此开发了mRNA疫苗，其在具有特定脂质成分的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体中装载编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的变体抗原的核酸，并确定该疫苗表现出优异的稳定性和体内高免疫原性，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物，该疫苗组合物被命名为EG-COVID，并且表现出优异的稳定性和高免疫原性。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物，其包含编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
根据本发明的疫苗组合物还可以包含脂质体或脂质纳米颗粒，并且所述脂质体或脂质纳米颗粒可以包含阳离子脂质、中性脂质和胆固醇。
此外，本发明提供了一种预防SARS-CoV-2感染的方法，该方法包括给药一种用于预防SARS-CoV-2的组合物，所述组合物包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
此外，本发明提供了组合物用于预防SARS-CoV-2感染的用途，所述组合物包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
此外，本发明提供了用于预防SARS-CoV-2的组合物在制备用于预防SARS-CoV-2感染的药物中的用途，所述组合物包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
附图说明
图1示出了SARS-CoV-2的D型(D614)和G型(G614)突变。
图2示出了证实具有不同脂质组成的脂质体对小鼠的递送效率的结果。
图3示出了依赖于mRNA-脂质体复合物中mRNA和脂质体的混合比例的小鼠中mRNA表达效率。
图4示出了证实通过将CV-LP-b1与CV-SF-614Gm混合获得的制剂在HEK293T细胞中是否正常表达的结果，图4的A示出了使用脂质体lipofectamine以不同浓度的CV-SF-614Gm处理HEK293T细胞后SARS-CoV-2刺突蛋白的表达，并且图4的B示出了使用通过对CV-LP-b1和CV-SF-614Gm的混合物冻干而制备的mRNA复合物处理HEK293T细胞后SARS-CoV-2刺突蛋白的表达。
图5的A示出了在给药CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠的血清中，通过ELISA分析的RBD特异性IgG抗体滴度，图5的B示出了在用S1肽刺激从给药了CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠中分离的脾细胞后，通过ELISA分析培养基中分泌的IFN-γ的浓度的结果，并且图5的C示出了使用SARS-CoV-2替代病毒中和试验(sVNT)试剂盒分析的所获得的血清的中和能力。
图6的A示出了在给药了一次或两次CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠的血清中，通过ELISA分析的RBD特异性IgG抗体滴度，图6的B示出了在用S1肽刺激从给药了一次或两次CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠中分离的脾细胞后，通过ELISA分析培养基中分泌的IFN-γ的浓度的结果，并且图6的C示出了使用SARS-CoV-2替代病毒中和试验(sVNT)试剂盒分析的所获得的血清的中和能力。
图7的A示出了在给药了冷藏0、4和8周的作为液体制剂的L-EG-COVID和作为冻干制剂的F-EG-COVID的小鼠血清中，通过ELISA分析的RBD特异性IgG抗体滴度，图7的B示出了在用S1肽刺激上述经免疫的小鼠的脾细胞后，通过ELISA分析培养基中分泌的IFN-γ浓度的结果，并且图7的C示出了使用SARS-CoV-2替代病毒中和试验(sVNT)试剂盒分析的所获得的血清的中和能力。
图8a和8b示出了证实在对大鼠肌内给药EG-COVID后CV-SF-614Gm随时间的生物分布模式的结果。
图9示出了证实EG-COVID的中和抗体滴度评估的结果，其中A示出了基于SARS-CoV-2(NCCP 43326)病毒感染抑制效率的EG-COVID的IC50的测量结果，所述病毒感染抑制效率依赖于CV-SF-614Gm mRNA浓度，并且B示出了用于α和β变体的EG-COVID的IC50的测量结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文所用的术语是本领域公知的，并且是典型的。
本发明的一方面涉及一种用于预防SARS-CoV-2的的疫苗组合物，其包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
在本发明中，SARS-CoV-2病毒的S抗原被用作包括野生型S抗原和包括至少一个氨基酸突变的变体S抗原的概念。
特别地，在本发明中，SARS-CoV-2病毒的S抗原优选地为序列(CV-SF-614Gm)，其中，为了稳定刺突蛋白结构，刺突蛋白的614G变体被用作骨架，此外986(K)和987(V)被脯氨酸取代和/或RRAR(其为第682至685位氨基酸序列)突变为QQAQ，但是本发明不限于此。
此外，进行了序列优化以通过增加编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的数量达到稳定mRNA并增加人体中翻译效率的目的，在能够详细预测RNA稳定性的指示物中，证实了RNA折叠、RNA折叠热力学系综、RNA结构和共折叠的热力学能量，并基于其结果，选定了具有最低的△G值的CV-SF-WT-614D(编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的mRNA，SEQ ID NO:1)和CV-SF-614Gm(编码SARS-CoV-2 614G变体的刺突蛋白的mRNA，SEQ ID NO:2)(表1)。
[表1]
本发明的疫苗组合物还可以包含脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)，编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA可以被吸附到脂质体或脂质纳米颗粒或与脂质体或脂质纳米颗粒的外部结合，或被包封在脂质体或脂质纳米颗粒的内部。
包含在本发明的疫苗组合物中的脂质体或脂质纳米颗粒包含阳离子脂质，并且优选地另外包含中性脂质。
所述阳离子脂质优选地为选自由以下组成的组的至少一种：二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、C12-200、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二油酰氧基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1乙基PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1乙基PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:0乙基PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:0乙基PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油酰氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(16:0DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷(18:0DAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙-1-胺(DOBAQ)、1,2-硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:0TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(16:0TAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(14:0TAP)以及N4-胆固醇基-精胺(GL67),但不限于此，并且最优选C12-200或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，但不限于此。
通常已知阳离子脂质体是有毒的，但是根据本发明的疫苗组合物通过mRNA吸附来解毒(Filion M.C.&Phillips N.C.,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes,1329(2),345–356.1997)。
根据本发明的包含阳离子脂质的脂质体或脂质纳米颗粒可以另外包含中性脂质。
所述中性脂质可以选自由以下组成的组：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰基胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、磷脂酰基丝氨酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂酰基甘油(PG)、磷酸(PA)、磷脂酰基胆碱(PC)、DOPI(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇))和DSPI(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇)，但不限于此，并且最优选1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，但不限于此。
根据本发明的脂质体或脂质纳米颗粒还可以包括至少一种选自由以下组成的组的递送因子：鱼精蛋白、白蛋白、转铁蛋白、PTD(蛋白质转导结构域)、CPP(细胞穿透肽)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇化脂质、金属离子连接的脂质以及巨噬细胞靶向部分。
在本发明中，“DOTAP(二油酰基-3-三甲基铵丙烷)”为优选的阳离子脂质的实例，是具有以下化学式1的结构的阳离子乳化剂，用作织物柔软剂，并且最近被用作蛋白质、化合物、肽等的递送载体，包括形成脂质体或脂质纳米颗粒的核酸载体。
[化学式1]
此外，在本发明中，“DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)”，其为优选的中性脂质的实例，具有以下化学式2的结构，并用作形成阳离子脂质体或脂质纳米颗粒的辅助脂质。
[化学式2]
在根据本发明的脂质体或脂质纳米颗粒中，阳离子脂质与中性脂质的重量比为1∶9至9.5∶0.5，优选2∶8至9∶1，更优选3∶7至8∶2，最优选4∶6至7∶3。
在本发明中，根据本发明的脂质体或脂质纳米颗粒还可以包含胆固醇。在本发明的脂质体或脂质纳米颗粒中，阳离子脂质与胆固醇的重量比为6∶1至1∶3，优选4∶1至1∶2.5，更优选3∶1至1∶2，最优选2.5∶1至1∶1.5，但不限于此。
此外，在本发明中，当阳离子脂质、中性脂质和胆固醇全部包含在根据本发明的脂质体或脂质纳米颗粒中时，阳离子脂质与中性脂质与胆固醇的重量比为1-9.5∶0.5-9∶0.05-3，优选3-8∶7-1∶0.45-7.0，更优选1-3.5∶1-3.5∶0.5-3，但不限于此。
在本发明的实施方式中，将阳离子脂质与中性脂质与胆固醇的重量比设定为2∶2∶1(40∶40∶20，w/w/w)，但不限于此。
在额外包含胆固醇时，例如，当DOTAP和DOPE以1∶1的重量比使用时，胆固醇可以相对于DOTAP以0.2-0.85，优选0.4-0.6的重量比混合以形成脂质体或脂质纳米颗粒。
此外，在根据本发明的用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物中，脂质体或脂质纳米颗粒与mRNA的混合比例可以表示为N∶P比，并且N∶P比影响组合物的mRNA表达和稳定性。
在本发明中，脂质体或脂质纳米颗粒与mRNA的N∶P比可以是0.2∶1至1.4∶1，优选0.23∶1至1∶1.0，更优选0.46∶1至1.0∶1。在本发明的示例性实施例中，所使用的N∶P比为0.6∶1。
本发明的疫苗组合物还可以包含免疫增强剂，但这不是必需的，并且即使在没有免疫增强剂的情况下，也表现出足够的疫苗效力。本发明中可用的免疫增强剂是选自由以下组成的组：响应于与病原体相关分子模式(PAMP)相对应的模式识别受体(PRR)的材料、CpG DNA、脂蛋白、鞭毛、聚I:C、皂苷、角鲨烯、三癸酸酯、3D-MPL和脱毒脂寡糖(dLOS)，但不限于此。
在免疫增强剂中，脱毒脂寡糖(dLOS)可以是韩国专利第1509456号或韩国专利第2042993号中公开的材料，但不限于此。
如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”，也称为LNP，是指至少一种尺寸在纳米级(例如1至1000nm)的包含一种或多种脂质的颗粒。在一些实施方式中，这种脂质纳米颗粒包含阳离子脂质和至少一种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物共轭脂质的赋形剂。在一些实施方式中，mRNA或其部分被包封在脂质纳米颗粒的脂质部分中，或被包封在脂质纳米颗粒的脂质部分的一些或全部包围的水性空间中，因此被保护免受酶促降解或由宿主生物体或细胞的机制诱导的其他不良效应诸如负性免疫应答(negative immune response)的影响。在一些实施方式中，mRNA或其部分与脂质纳米颗粒相连接。
在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒不限于任何特定的形式，而应被解释为包括当阳离子脂质或离子脂质和任选的至少一种额外的脂质在水性环境中和/或在核酸化合物存在下结合所产生的任何形式。例如，脂质体、脂质复合物(lipid complexes)、脂复合物(lipoplexes)等都属于脂质纳米颗粒的范围。
在各种实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约400nm、约50nm至约400nm、约70nm至约400nm、约90nm至约400nm、约110nm至约400nm、约130nm至约400nm、约150nm至约400nm、约200nm至约400nm、约250nm至约400nm、约300nm至约400nm、约350nm至约400nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm，或者约30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm或400nm，并且基本上是无毒的。在一些实施方式中，当mRNA存在于脂质纳米颗粒中时，mRNA抵抗水溶液中核酸酶的降解。如本文所用，平均直径可以由通过动态光散射测定的z平均值表示。
LNP可以包括任何能够形成附着有一个或多个核酸分子或其中包封有一个或多个核酸分子的颗粒的脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，它们是脂肪酸的衍生物(例如酯)，并且通常具有不溶于水但溶于许多有机溶剂的特征。脂质通常至少分为三类：(1)“单纯脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”诸如类固醇。
如本文定义的，包含mRNA的LNP包含至少一种阳离子脂质和至少一种稳定化脂质。稳定化脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
LNP包括阳离子脂质。阳离子脂质优选地是可阳离子化的。特别地，当pH值降低到脂质的可电离基团的pKa以下时，阳离子脂质会质子化，但在更高的pH值时逐渐变中性。当带正电荷时，脂质可以与带负电荷的核酸结合。在一些实施方式中，阳离子脂质包括两性离子脂质，其在pH降低时变得带正电荷。LNP可以包括任何能够形成附着有一个或多个核酸分子或其中包封一个或多个核酸分子的颗粒的脂质。
在一些实施方式中，LNP可以包含任何额外的阳离子或可阳离子化的脂质，尤其是在选择性pH(诸如生理pH)下拥有净正电荷的许多脂质种类中的任何一种。
此外，本发明提供了一种制备根据本发明的用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物的方法。
制备根据本发明的用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物的方法可以包括向编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或包含其的溶液或缓冲液中添加包含脂质体或脂质纳米颗粒的溶液或缓冲液。
这里，编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或脂质体或脂质纳米颗粒可以以冻干粉的形式或以溶解在适当的溶液或缓冲液中的状态提供。当编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或脂质体或脂质纳米颗粒以冻干状态提供时，将它们溶解在合适的溶液或缓冲液中，并且可以将包含脂质体或脂质纳米颗粒的溶液或缓冲液加入到编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或包含其的溶液或缓冲液中，从而制备根据本发明的用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物。
此外，当根据本发明的编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的疫苗组合物中还包含dLOS时，可以将编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或包含其的溶液或缓冲液加到dLOS或包含其的溶液或缓冲液中，并可以向其中添加包含脂质体或脂质纳米颗粒的溶液或缓冲液，从而制备根据本发明的用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物。
dLOS可以以冻干粉的形式或以溶解在合适的溶液或缓冲液中的状态提供。当dLOS以冻干状态提供时，可以在溶解于适当的溶液或缓冲液后再使用。
在本发明的实施方式中，F-EG-COVID，即作为根据本发明用于预防SARS-CoV-2的疫苗的EG-COVID的冻干制剂，其被证实即使在-2至8℃下储存8周后也表现出优异的免疫原性(图7)。
已知用于本发明的阳离子脂质体具有贮库效应(depot effect)(TherapeuticAdvances in Vaccines 2(6):159-82)。在本发明的另一实施方式中，将使用阳离子脂质体作为递送载体的用于预防SARS-CoV-2的疫苗EG-COVID给药至大鼠的左大腿肌肉，并且随时间推移证实大鼠的血清和各组织中CV-SF-614G mRNA的表达，并且也证实即使在经过一段时间后CV-SF-614G mRNA仅在给药部位表达(图8)。
在本发明的又一实施方式中，基于使用给药了用于预防SARS-CoV-2的疫苗EG-COVID的小鼠血清对Vero 76细胞中SARS-CoV-2感染抑制效果的测定结果，证实感染抑制效果随EG-COVID的mRNA量的增加而增加(图9的A)。
在本发明的再一实施方式中，证实了本发明的EG-COVID表现出针对作为SARS-CoV-2变体的α和β变体的优异的交叉免疫效果(图9的B)。
本发明的另一方面涉及一种预防SARS-CoV-2感染的方法，该方法包括给药一种用于预防SARS-CoV-2的的组合物，所述组合物包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
本发明的又一方面涉及包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA的组合物用于预防SARS-CoV-2感染的用途。
本发明的再又一方面涉及用于预防SARS-CoV-2的组合物在制备用于预防SARS-CoV-2感染的药物中的用途，所述组合物的包括编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
实施例
通过以下实施例可以更好地理解本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：mRNA序列的选择
该mRNA序列用于编码序列(CV-SF-614Gm)，其中，为了稳定刺突蛋白结构，986(K)和987(V)被脯氨酸取代，并且RRAR(第682至685位氨基酸序列)被突变为QQAQ。
在SARS-CoV-2的刺突蛋白和SARS-CoV-2 614G变体的刺突蛋白的序列中，使用以下三种程序进行序列优化，目的是通过增加mRNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的数量来稳定mRNA并增加人体中的翻译效率。
程序1：GenSmart密码子优化程序(Genscript)
程序2：集成DNA技术密码子优化程序(IDT,Integrated DNA Technologies)
程序3：GenArt密码子优化程序(Thermo Fisher)
在能够详细预测RNA稳定性的指示物中，证实了RNA折叠、RNA折叠热力学系综、RNA结构和共折叠的热力学能量。众所周知，ΔG越低，热力学稳定性越高，因此选择CV-SF-WT-614D(编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的mRNA，SEQ ID NO:1)和CV-SF-614Gm(编码SARS-CoV-2614G变体的刺突蛋白的mRNA，SEQ ID NO:2)作为通过程序3获得的具有最低ΔG值的序列。
所选择的mRNA序列由TriLink BioTechnologies通过体外转录合成。
CV-SF-WT-614D和CV-SF-614Gm的DNA序列分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4表示，CV-SF-WT-614D和CV-SF-614Gm的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6表示。
[表2]
实施例2：使用薄膜法制备脂质体递送载体
将DOTAP(Merck&Cie/CH2900014)、DOPE(Avanti Polar Lipid)和胆固醇(WAvantiPolar Lipid)中的每种以40∶40∶20的比例与氯仿混合，并在37℃下完全溶解10分钟以形成液体溶液。
通过在圆底烧瓶中以预定的重量比混合液体溶液来制备脂质混合物，并且将含有DOTAP的脂质混合物在旋转蒸发器(Buchi/B491_R200)中于60℃下挥发30分钟以除去氯仿，并且在烧瓶的壁上形成脂质膜。
将含有4％(w/v)蔗糖的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)置于烧瓶中，在60℃下溶解脂质膜以形成脂质体。使用动态光散射分析仪测量由此形成的脂质体的粒径、ζ电位和分散度。将所制备的剩余脂质体在4℃的冰箱中储存直至测试。
实施例3：体外表达依赖于脂质体的脂质组成的证实
对于脂质体，据报道，当磷脂酰基胆碱(下文称为“PC”)型脂质变为磷酸乙醇胺(下文称为“PE”)型脂质时，红细胞生成素(下文称为“EPO”)蛋白的表达水平增加了约7倍(Dowhan W et al.,New Comprehensive Biochemistry,36(4):1-35,2002；Leung A-KK etal.,The Journal of Physical Chemistry B,119(28):8698-8706,2015；Kauffman KJ etal.,Nano letters,15(11):7300-7306,2015)。
因此，为了寻找用于增加mRNA递送效率的最佳脂质体组合物，尝试使用以下四种组成的脂质体来研究能够提高体内mRNA递送效率的最佳条件，所述四种组成是通过将胆固醇(Chol)加入到DOTAP和DMPC(它们是常规用于带状疱疹疫苗(EG-HZ)的阳离子脂质体的组成脂质)中，或者用1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(以下称为“DOPE”)代替DMPC来形成。
第一组：DOTAP/DMPC(50:50，w/w)
第二组：DOTAP/DMPC/Chol(40:40:20，w/w/w)
第三组：DOTAP/DOPE(50:50，w/w)
第四组：DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20，w/w/w)
如上制备由不同脂质组成的脂质体，将20μg的海肾萤光素酶(TriLinkBioTechnologies)和80μg的脂质体混合，然后将其总共100μL肌内给药于6周龄雌性C57BL/6N小鼠[日本SLC](Central Lab.Animal Inc.)(n＝4-5/组)。给药后6小时，通过腹腔给药250mg/kg的Avertin工作溶液麻醉小鼠，使用2.4mL的1x PBS和0.37mg/瓶海肾萤光素酶底物储备液(substrate stock solution)制备0.15mg/mL的海肾萤光素酶底物溶液，然后将1mg/kg的海肾萤光素酶底物溶液经静脉内给药至小鼠尾部。给药后，立即将小鼠置于体内成像系统(IVIS)(Ami HTX)中，然后通过将曝光时间设置为60秒来拍照，并比较给药部位的感兴趣的区域(以下称为“ROI”)的值。
因此，如图2所示，证实了包含以40∶40∶20(w/w/w)的比例混合的DOTAP/DOPE/Chol的阳离子脂质体具有最高的体内递送效率，其被命名为CV-LP-b1并用作EG-COVID的mRNA递送系统。
实施例4：脂质体的特性的分析
为了开发EG-COVID，即用于预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗，对3批CV-LP-b1(其为实施例3中经证实的mRNA递送系统)的物理特性进行了分析。
将CV-LP-b1脂质体混合在含4％蔗糖的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中，使用马尔文/ZSP进行动态光散射(DLS)分析，并测定其粒径、分散性和ζ电位的平均值和标准偏差。
因此，测得CV-LP-b1的平均粒径为80.3±3.0d.nm，分散度为0.194±0.010，ζ电位为50.7±3.0mV。
考虑到典型脂质体的大小为50-250μm(公开号2014-0097215的韩国专利申请)，该脂质体的大小处于合适的水平，并且已知在带正电荷的情况下，当脂质体的ζ电位为30mV或更高时，不会发生聚集并且稳定地保持结构(Antisense drug technology；Principles,Strategy,and Application,CRC press,second edition,253,2007)，并且假设脂质体是静电稳定的，分析脂质体的ζ电位超过该值。此外，脂质体的PDI值都为0.25或更小，证实脂质体在稳定状态下具有接近单分散性的颗粒分布(Appl.Chem.Eng.,28(2):177-185,2017)。
实施例5：NP比的证实
通过将实施例1和2中制备的脂质体(LP)和作为主要成分的mRNA混合并吸附在含有4％蔗糖的20mM HEPES(pH 7.4)中来制备mRNA-脂质体复合物。
使用以下方程计算N/P比，即脂质体和mRNA的混合比例。所制备的复合物是SEQ IDNO:8EGFP mRNA-脂质体复合物、SEQ ID NO:7RLuc mRNA-脂质体复合物和SEQ ID NO:2cv-SF-614GM mRNA-脂质体复合物，它们分别被用于DLS、体内表达和免疫原性实验。
通过改变形成复合物的脂质体和mRNA的NP比例来制备每种mRNA-脂质体复合物，并且使用小鼠来证实mRNA-脂质体复合物的体内表达。
将100μL表达RLuc的mRNA复合物经肌内注射到6周龄雌性小鼠(C57BL/6N,OrientBio,Central Lab.Animal Inc.)的大腿三角肌中。
试验材料给药6小时后，通过腹腔给药250mg/kg的Avertin工作溶液来麻醉小鼠，使用2.4mL的1x PBS和0.37mg/瓶海肾萤光素酶底物储液(Promega)制备0.15mg/mL的海肾萤光素酶底物溶液，然后将1mg/kg的海肾萤光素酶底物溶液静脉内给药至小鼠尾部。给药后，立即使用Ami-HTX(Xenogen IVIS-200，光谱仪器成像，USA)将暴露时间设定为60秒，对小鼠进行拍照，并使用Aura成像软件(光谱仪器成像，USA)对给药部位的表达水平进行定量。
因此，如图3所示，当NP比为0.23或更高时，mRNA表达效率在小鼠中增加，并且在0.46∶1至1.0∶1时表达是最高的。在下面的实验中，mRNA和脂质体的混合比设定为NP比＝0.6。
实施例6：通过所选择的脂质体进行体外表达
体外表达是为了证实CV-LP-b1与CV-SF-614Gm混合在其中的制剂(下文称为‘EG-COVID’)是否正常表达。
将HEK293T细胞(人胚胎肾293T细胞，CRL-3216/ATCC)以2×106个细胞/皿接种于100mm培养皿中，在CO2孵育箱中于37℃培养过夜，并在60-70％的汇合时进行转染。
为了转染CV-SF-614Gm，将细胞用lipofectamine 3000(Thermo Fisher)和CV-LP-b1的混合物在37℃下于CO2孵育箱中处理24小时。
24小时后，除去所有细胞培养基，随后用D-PBS洗涤，之后在冰上将400μL的1x细胞裂解液分配到100mm培养皿中，然后使用刮刀将细胞收集在1.7mL管中，涡旋，然后在15000rpm和4℃下离心15分钟，以收集上清液中的蛋白质。对如此收集的蛋白质进行定量，将20μg/孔的蛋白质进行SDS-PAGE并进行蛋白质印迹分析。
用于蛋白质印迹分析的抗体如下。
SARS-CoV-2抗体[NB100-56578/Novus biologicals/ab092903c-15，(免疫原；SARS-CoV-2，来自S2蛋白的氨基酸1124-1140)]
SARS-CoV-2抗体[MBS434243/Mybiosource/T1218EL，(免疫原；SARS-CoV-2S-全蛋白)]
SARS-CoV-2抗体[40591-MM42/Sino biological/HA14AP3001，(免疫原；SARS-CoV-2S1-mFC蛋白)
β-肌动蛋白兔单克隆抗体HRP缀合物[5125/Cell signaling/6]
山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附二抗，HRP[G21234/Thermo/2087715]
山羊抗小鼠IgG二抗，HRP[SSA007/Sino biological/HO21OC1101]
因此，如图4的A所示，证实了表达依赖于使用lipofectamine 3000(ThermoFisher)的CV-SF-614Gm浓度，并以浓度依赖性方式呈现。此外，如图4的B所示，基于对由不同量的CV-SF-614Gm组成的EG-COVID的表达观察的结果，证实了S蛋白正常表达。
实施例8：免疫原性依赖于mRNA(CV-SF-614Gm)的剂量的证实
将CV-LP-b1与不同剂量的mRNA混合，以0.1HD(人剂量)以3周间隔给药到6周龄雌性B6C3F1/slc小鼠(Central Lab.Animal Inc.)两次，最终免疫后2周处死小鼠，从中分离血清，通过间接ELISA分析SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)蛋白特异性总IgG抗体滴度(log10)来测定终点滴度。
为了证实mRNA-脂质体复合物的免疫原性，选择6周龄雌性B6C3F1/slc小鼠(日本slc)作为靶动物，将CV-LP-b1与不同剂量的mRNA混合，以0.1HD(人剂量)以3周的间隔给药小鼠两次，在最终免疫后2周处死小鼠，从中分离血清，通过间接ELISA分析SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)蛋白特异性总IgG抗体滴度(log10)来测定终点滴度。
8-1:血液采集
在最后一次给药后两周，通过腹腔给药250mg/kg的Avertin工作溶液来麻醉小鼠，并通过心脏采血收集全血。将如此收集的全血转移到微管中，使其在室温下静置3小时，并在4℃和15000rpm下离心10分钟，之后将上清液转移到新的微管中，获得血清并储存在-20℃的温度下直至分析。
8-2:脾细胞再刺激
通过颈椎脱臼处死小鼠并从中取出脾脏后，将每组的脾脏集中并转移到24孔板中，在该板中分配了补充有1％青霉素-链霉素溶液的PBS(下文中，PBS w/抗生素)。所用的培养基如下表3和表4所示。
[表3]
[表4]
在洁净的工作台上用含抗生素的PBS洗涤脾组织，转移到含3mL的基础培养基的60mm培养皿中，用40μm细胞过滤器压碎以分离脾细胞。将分离的脾细胞转移到15mL试管中，并在4℃下和3000rpm下离心5分钟以除去上清液，用3mL的RBC裂解缓冲液(Thermo Fisher)处理脾细胞，使其在室温下静置3分钟，然后在4℃下和3000rpm下离心5分钟。
除去上清液后，将细胞悬浮在3mL的含抗生素的PBS中，并在4℃下和3000rpm下离心5分钟以除去上清液，将细胞悬浮在10mL的完全培养基(Gibco)中。
使用完全培养基将细胞悬浮液稀释至2×107个细胞/mL，然后以100μL/孔分配到96孔细胞培养板中。
将PepMix SARS-CoV-2-S1-S1肽库(JPT Peptide Technologies)和S2肽库(JPTPeptide Technologies)在各自小瓶中溶解于50μL的DMSO中，然后与完全培养基混合至2.5μg/mL的最终浓度，从而制备SARS-CoV-2刺突肽刺激物。
将40μg/孔的刺激物和60μL/孔的完全培养基添加到含有细胞悬浮液的96孔中，然后在37℃和5％ CO2下反应72小时。
8-3:抗体滴度的分析
使用1x PBS将RBD抗原(Mybiosource，USA)稀释至1μg/mL，然后将其100μL分配到免疫板中，用密封膜覆盖，并允许在4℃的冰箱中静置过夜。通过用纯水稀释20x PBS以获得1L的1x PBS并向其中加入500μL的吐温20来制备洗涤缓冲液。用ELISA洗涤器(Tecan/Hydroflexelisa)除去每个孔中的溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。
通过将1g的BSA溶解在100mL的PBS中来制备试剂稀释剂(1％BSA)，将该试剂稀释剂以200μL/孔分配到免疫板中，用密封膜覆盖，并允许在37℃的反应器中静置1小时。用ELISA洗涤器除去每个孔中的溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。将试剂稀释剂以100μL/孔分配到免疫板中。使用试剂稀释剂将通过上述方法6-1获得的血清样品以1∶50稀释，将其100μL分配在免疫板的B到G的第1行中，并通过在孔中吸移几次来混合样品。此后，对样品以从第1行取100μL并将其加入第2行的方式进行1/2系列稀释直到ELISA板上的第12行。
为了评估试验的充分性，使用试剂稀释剂将超血清按1:200稀释，之后将其100μL分配到免疫板的H的第1行，接着以与上述相同的方式进行1/2系列稀释。
用密封膜覆盖免疫板，然后在孵育器中于37℃反应2小时。用ELISA洗涤器除去每个孔中的溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。
使用试剂稀释剂将山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Laboratory)1:5000稀释，以100μL的量分配到免疫板中，用密封膜覆盖，并在37℃下于孵育器中反应1小时。
用ELISA洗涤器除去每个孔中的溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。将平衡至室温的100μL的TMB底物溶液分配到免疫板中，并在室温下于黑暗中反应5分钟。通过将100μL的1N H2SO4溶液分配到免疫板中来终止反应，并使用ELISA读数器(Biotek/Epoch)在450nm处测量吸光度。
8-4:细胞因子测定(ELISA)
使用IFN-γELISA试剂盒(小鼠IFN-γ双抗体ELISA，R&D systems)进行以下测试。
使用试剂稀释剂将通过上述6-2的脾细胞再刺激方法刺激的脾细胞培养液稀释1/5，以100μL/孔分配到包被有抗小鼠IFN-γ捕获抗体(Jackson)的微孔板中，用密封膜覆盖，并在室温下静置2小时，之后用ELISA洗涤器(Tecan/Hydroflexelisa)去除每个孔中的溶液，随后用洗涤缓冲液洗涤三次。
使用试剂稀释剂将试剂盒中的链霉亲和素-HRP稀释1/40，以100μL/孔分配到免疫板中，用密封膜覆盖，并在室温下静置20分钟，之后用ELISA洗涤器除去每个孔中的溶液，随后使用洗涤缓冲液洗涤三次。
使用试剂稀释剂将试剂盒中的抗小鼠IFN-γ检测抗体稀释至200ng/mL，以100μL/孔分配到免疫板中，用密封膜覆盖，并在室温下静置1小时，之后用ELISA洗涤器(Tecan/Hydroflexelisa)去除每个孔中的溶液，随后使用洗涤缓冲液洗涤三次。
将100μL的TMB底物(KPL SureBlue TMB微孔过氧化物酶底物，Seracare)溶液分配到免疫板中，并在室温下于黑暗中反应15分钟，之后通过将100μL的1N H2SO4溶液分配到免疫板中来终止反应，并使用ELISA读数器在450nm处测量吸光度。
8-5:中和能力的证实
对于通过给药本发明的EG-COVID疫苗获得的血清样品，使用SARS-CoV-2替代性病毒中和试验(sVNT)试剂盒(Genscript)评估疫苗是否有效抑制了病毒感染。
将阴性对照、阳性对照和血清样品各60μL和60μL的经1:1000稀释的HRP缀合的RBD在1.5mL微管中混合，然后在37℃下于培养箱中反应30分钟，之后将100μL的所得反应混合物分配到微量滴定测试条板中，用密封膜覆盖，并在37℃下于培养箱中反应15分钟。
用ELISA洗涤器(Tecan/Hydroflexelisa)除去每个孔中的溶液，然后用1x洗涤缓冲液洗涤四次。
将100μL/孔的TMB溶液(Thermo Fisher)进行分配，用密封膜覆盖，并在室温下在黑暗中反应15分钟，之后通过分配50μL/孔的终止溶液来终止反应，使用ELISA读数器(Thermo Scientific)在405nm处测量光密度，然后如下确定中和能力(中和％)。
图5的A示出了在给药CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠血清中，通过ELISA分析的RBD特异性IgG抗体滴度，通过吸附高达30μg的mRNA证实了优异的递送效率。图5的B示出了在给药CV-LP-b1和CV-SF-614Gm在其中混合的mRNA复合物的小鼠血清中，通过ELISA分析的IFN-γ的浓度，表明在5μg和10μg的mRNA的情况下IFN-γ浓度高。图5的C示出了使用SARS-CoV-2替代性病毒中和试验(sVNT)试剂盒分析的所得血清的中和能力，表明在5μg或更多mRNA的情况下诱导免疫的能力高。
当将上述结果转换成HD(人剂量)时，通过吸附高达300μg的mRNA，证实CV-LP-b1表现出优异的递送效率，并且50μg或更多的mRNA被判断为适于免疫诱导。然而，考虑到IFN-γ浓度，发现细胞免疫在5至10μg的情况下非常优越。
实施例9：免疫原性的差异依赖于给药的频率
将CV-LP-b1与200μg的CV-SF-614GM以NP比＝0.6∶1混合，然后冻干，之后证实了以0.1HD给药一次和两次后的免疫原性差异。
6周龄雌性B6C3F1/slc小鼠(Central Lab.Animal Inc.)以3周的间隔免疫两次，并在2周后处死，或在单次给药后2周处死，之后使用获得的血清和脾细胞(n＝6/组)证实免疫原性。
以与实施例8中相同的方式进行试验，其结果在图6中示出，证实了当给药两次而不是一次时，免疫原性(包括体液免疫和细胞免疫)更优异。
实施例10：冻干制剂的稳定性的证实
目前开发的基于mRNA的疫苗，即来自Pfizer和Moderna的COVID-19预防性疫苗，使用脂质纳米颗粒(以下称为“LNP”)作为mRNA递送载体，因此由于冷藏稳定性较差，需要在低温储存(-20℃至-80℃)下分装。
另一方面，EG-COVID使用阳离子脂质体，并且在本实施例中，对L-EG-COVID(其为冷藏8周的阳离子脂质体CV-LP-b1和CV-SF-614Gm复合物(EG-COVID)的液体制剂)和F-EG-COVID(其为冻干制剂)测量体内功效，并且与冷藏0周和4周的成品的免疫原性进行比较分析，借以按照与实施例8相同的方式比较了依赖于制剂类型和冷藏储存期的体内功效和稳定性。
将本实施例中的EG-COVID配制为包含100μg的CV-SF-614GM，并且在-2℃至8℃下将液体制剂或其冻干制剂储存预定时间后，将冻干制剂再水合并进行免疫原性测试，以证实功效得以保持。
通过以下方法由实施例2的液体制剂制备冻干制剂。
将0.65mL的液体EG-COVID制剂分配到2mL的无菌玻璃瓶中，用橡胶塞半封闭，转移到冷冻干燥机(Ilshin Biobase)，并以-40℃(50mTorr)下10小时，-20℃(50mTorr)下10小时以及20℃(50mTorr)下20小时的顺序进行冻干。
冻干完成后，用橡胶塞完全封闭小瓶，密封，并储存在2-8℃下。
因此，如图7所示，发现液体制剂由于在储存4周后稳定性急剧下降而不能诱导免疫原性，但是冻干制剂稳定地维持免疫原性达8周，证实EG-COVID的冻干制剂的储存稳定性是优异的。
实施例11：生物分布的证实
根据本发明的COVID-19预防性疫苗EG-COVID使用阳离子脂质体作为mRNA递送载体，以便将CV-SF-614Gm有效地递送到体内。在本发明人以前的研究中，基于对小鼠肌内给药编码海肾萤光素酶的mRNA和CV-LP-b1的混合物后萤光素酶蛋白在体内随时间的表达模式的测量结果，证实了该蛋白仅在给药部位表达，而在给药后6小时至24小时在其他器官中不表达。
在本实施例中，将EG-COVID经肌内给药大鼠，之后观察CV-SF-614Gm随时间在给药部位和除给药部位以外的主要器官中的分布。为此，使用RT-qPCR测量CV-SF-614Gm与GAPDH(看家基因)的相对值，以证实给药EG-COVID后CV-SF-615Gm的生物分布模式。
为了证实CV-SF-614Gm随时间的生物分布模式，将EG-COVID给药于大鼠的左大腿肌肉，在0、2、6、24、48、72和120小时后，通过RT-qPCR证实体内CV-SF-614Gm的存在。
作为试验动物，使用了105只6周龄雄性SD大鼠(Orient Bio)，试验组如下表5所示。
[表5]
[表6]术语表
编号 器官 缩写
1 左大腿肌肉，注射部位左侧 ISL
2 右大腿肌肉，非注射部位右侧 ISR
3 肾脏 K
4 睾丸 TS
5 脑 B
6 心脏 H
7 脾脏 S
8 肝脏 L
9 近侧腘窝淋巴结 LNP
10 远端腋窝淋巴结 LND
11 肺脏 Lug
12 眼 E
13 血清 SR
血清和组织样品从试验组的大鼠获得，根据制造商推荐的试验方法，使用RNeasyMicro kit(QIAGEN/74004)提取血清和组织的总RNA，使用Nanodrop(Thermo Fisher)测定总RNA的浓度和产量。
[表7]用于RT-qPCR的引物和探针(Thermo Fisher)
GAPDH引物和探针组(Thermo Fisher)用于大鼠GAPDH作为参考基因，并且VIC染料标记在引物的5'末端。
[表8]
GAPDH测定ID GAPDH基因识别号 产物(bp)
Rn01749022_g1 NIM_017008.4 60
如下表9和10所示，在96孔板(Invitrogen/A28138)或384孔板(Invitrogen/A28140)中，使用多通道移液管分别分配样品1(来源于组织的RNA)、TaqPath 1步法多重预混液(TaqPath 1-step multiplex master mix)(以下称为“预混液”，(Thermo Fisher/A28523))、引物和探针、GAPDH测定混合物(GAPDH assay mix)和无核酸酶水以达到15μL的最终体积，并进行qRT-PCR反应。
[表9]
成分 工作浓度 样品
4x预混液 1x 3.75
60x CV-SF-614Gm引物和探针 0.2x 0.06
60x GAPDH测定混合物 0.2x 0.5
总RNA 25ng 5
无核酸酶水 - 5.69
总体积(μL) 15
[表10]
qRT-PCR条件
每个样本的反应结果计算如下，以确认CV-SF-614Gm相对于GAPDH的量。
CV-SF-614Gm相对于GAPDH Ct(ΔR)＝CV-SF-614Gm的平均Ct-GAPDH的平均Ct
此外，为了准确的比较，ΔR被转换成指数。
此后，通过按组、时间和组织绘制图表来分析CV-SF-614Gm的生物分布模式。
基于包括给药部位的12个主要器官和血清中CV-SF-614Gm对GAPDH的量的测量结果，仅在对应于给药部位的左大腿肌肉(ISL)中检测到CV-SF-614Gm。
在ISL中，观察到CV-SF-614Gm对GAPDH的相对指数值在EG-COVID给药2小时后最大值为57％，在6小时后最大值为70％。在6小时检测到CV-SF-614Gm最高，6小时后逐渐下降，72小时后未检测到。在观察期内，除了给药部位以外，在主要器官中未证实有CV-SF-614Gm(图8a和8b)。
实施例12：中和抗体滴度的评估(蚀斑减少中和试验)
为了评估EG-COVID的中和抗体滴度，进行了以下试验以确认对SARS-CoV-2(NCCP43326)的保护能力。
作为试验动物，使用6周龄雌性B6C3F1/slc小鼠(n＝6/组)(Orient Bio)，以3周的间隔两次对动物给药阴性对照和包括CV-SF-614Gm的EG-COVID作为试验组，并在2周后采集血液。
在拥有BL3设施的Masan国立医院(Masan National Hospital)通过PRNT进行了病毒实验。
将VERO 76细胞系(ATCC CRL-1587TM)以8×105个细胞/孔接种在6孔板中，然后培养24小时以准备亚汇合(sub-confluence)。将来自EG-COVID给药组的血清和来自阴性对照组的血清在无血清DMEM中稀释1/10，然后2倍连续稀释至1/20480，并且将105μL的经稀释的血清与400pfu/105μL的病毒(SARS-CoV-2(NCCP 43326))溶液以1:1混合，然后在37℃下培养1小时。
除去VERO 76细胞系的培养基，随后用PBS洗涤，加入200μL的血清和病毒的混合溶液，每隔15分钟摇动，并在37℃下培养90分钟以允许病毒感染。此后，除去培养基，接着用PBS洗涤以除去未感染的病毒，之后用含有2％ FBS和1％琼脂糖的DMEM(Gibco)包被细胞，接着在37℃下于培养箱中培养3天。培养完成后，将4％甲醛溶液施用在琼脂糖上并在室温下固定1小时，小心除去琼脂糖，并用0.5％结晶紫(在20％甲醇中)溶液对经固定的细胞层染色。用PBS洗涤三次后，将平板完全地干燥。对用结晶紫染色的感染细胞(下文称为“蚀斑”)进行计数，并与未中和的对照组进行比较，从中确定病毒感染抑制效率，其方程式如下所示。
(对照是未中和病毒的组)
基于病毒感染抑制效率，使用GraphPad Prism软件的非线性回归，通过计算减少率为50％时的稀释因子，将中和抗体滴度确定为IC50滴度(log10)。
因此，如图9的A所示，对于感染SARS-CoV-2野生型病毒(NCCP43326，韩国病原体国家培养物保藏中心)，在EG-COVID给药组1(2.5μg/小鼠)、EG-COVID给药组2(5μg/小鼠)和EG-COVID给药组3(10μg/小鼠)中，IC50滴度(log10)分别为3.569±0.418、4.039±0.357和4.375±0.443(平均值±标准偏差)，表明中和抗体滴度随着mRNA量的增加而增加。
此外，如图9的B所示，证实了针对作为SARS-CoV-2变体的α和β变体也表现出优异的交叉免疫。
工业实用性
根据本发明，用于预防SARS-CoV-2的疫苗能够在不需要额外的免疫增强剂的情况下表现出优异的疫苗效果，原因在于其优异的稳定性和在体内的高免疫原性，并且即使在制备成冻干制剂时也能够保持疫苗效果，因此该疫苗易于储存和使用，从而预期在预防COVID-19中具有优异的效果。
上面已经详细描述了本发明的特定部分，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些特定描述仅仅是优选实施方式，本发明的范围并不因此受到限制。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
文本的序列表
附上电子文件。

Claims (16)

1.一种用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物，其包含编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述编码S抗原的mRNA具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，还包含脂质体或脂质纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒包含阳离子脂质。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含中性脂质。
6.根据权利要求4或5所述的疫苗组合物，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含胆固醇。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质为选自以下组成的组的至少一种：二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、C12-200、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二油酰氧基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1乙基PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1乙基PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:1乙基PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(18:0乙基PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0乙基PC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:0乙基PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(12:0乙基PC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油酰氧基]-苯甲酰基胺(MVL5)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-
二甲基铵-丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(16:0DAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷(18:0DAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙-1-胺(DOBAQ)、1,2-硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:0TAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(16:0TAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(14:0TAP)以及N4-胆固醇精胺(GL67)。
8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述中性脂质是选自由以下组成的组的至少一种：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰基胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、磷脂酰基丝氨酸(PS)、磷酸乙醇胺(PE)、磷脂酰基甘油(PG)、磷酸(PA)、磷脂酰基胆碱(PC)、DOPI(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇))以及DSPI(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸肌醇)。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的重量比为1∶9至9.5∶0.5。
10.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质与所述胆固醇的重量比为6∶1至1∶3。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质与所述胆固醇的重量比为1-9.5:0.5-9:0.05-3。
12.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒与mRNA的N∶P比为0.2∶1至1.4∶1。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的疫苗组合物，还包含免疫增强剂。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中，所述免疫增强剂包含选自由以下组成的组的至少一种：PAMP、皂苷、CpG DNA、脂蛋白、鞭毛、聚I:C、角鲨烯、三癸酸酯、3D-MPL和脱毒脂寡糖(dLOS)。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物呈冻干制剂的形式。
16.一种制备用于预防SARS-CoV-2的疫苗组合物的方法，包括向编码SARS-CoV-2病毒的S抗原的mRNA或包含其的溶液或缓冲液中添加包含脂质体或脂质纳米颗粒的溶液或缓冲液。
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