KR101159296B1 - 표적 ｍｉＲＮＡ의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 ｍｉＲＮＡ 생성 조절 방법 - Google Patents

표적 ｍｉＲＮＡ의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 ｍｉＲＮＡ 생성 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 miRNA의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 miRNA 생성 조절 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 생체내 표적 miRNA 생성량 조절 및 이를 이용한 miRNA의 기능 연구에 이용될 수 있고, 표적 miRNA 관련 질환을 위한 신약 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
마이크로RNA(microRNA, miRNA), pre-miRNA, 다이서(Dicer), let7a-1, miR16-1, miR24-1, 양면성 펩타이드, 라이브러리, 탐색 방법

Description

표적 ｍｉＲＮＡ의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 ｍｉＲＮＡ 생성 조절 방법{Ambivalence peptides promoting production of target miRNA and a method of regulating the production of target miRNA}
본 발명은 표적 miRNA의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 miRNA 생성 조절 방법에 관한 것이다.
유전자(DNA)의 암호를 받아 단백질로 번역(translation)되는 RNA는 전달자 RNA(messenger RNA, mRNA)로서, 총 RNA의 2%에 불과하며 나머지(98%)는 단백질로 번역되지 않는 비 암호화(non-coding) RNA이다. 이러한 비 암호화(non-coding) RNA의 기능이 밝혀지지 않아서 단백질로 번역되지 않는 RNA에 대한 인식이 거의 없었으나, 점차 비 암호화(non-coding) RNA가 유전자 또는 단백질과의 복합체로서, 또는 효소 역할을 하는 라이보자임(ribozyme)으로서의 중요한 기능을 수행하고 있음이 알려지고 있다. 최근에는 유전자 또는 유전자가 만들어내는 산물과 특이적인 인식하에 유전자를 조절하는 기능까지 가지고 있는 것이 알려져, 그 기능의 다양성과 성질에 주목을 받고 있다. 특히 저분자 비 암호화(non-coding) RNA는 생체 내 에 내생적으로(endogenous) 존재하는 마이크로RNA(microRNA, miRNA) 또는 리보스윗치 (riboswitch) 등으로, 이들이 유전자 전체의 조절 기능 중 적어도 2% 정도를 차지하고 있다.
이중 가장 잘 알려진 것이 마이크로RNA(microRNA, miRNA)로서, 인간에서만 약 700 여종이 발견되었다. 19 ~ 25 nt 길이의 단일 가닥 RNA(single strand RNA) 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀 구조 전사체(hairpin-shaped transcript)(Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim, V.N., Mol . Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA의 불안정화를 유도한다. 이러한 miRNA와 암 사이에 강한 연관성이 최근 증명되어 이들 중 다수가 암의 발생 또는 전이에 관계된다는 새로운 사실이 밝혀지고 있으므로 암 생물학 분야에서 새로운 연구 분야로 떠오르고 있다(Esquela-kerscher, A et al., Nat . Rev . Cancer 6(4):259-269, 2006). 또한, miRNA의 발현은 발달과 세포 분화 과정 중에 극적으로 변화하고, miRNA의 프로파일(profiling)이 miRNA와 발달 계통 및 질병 단계 사이에 유의적인 연관성이 있음을 보여주고 있다(Lu, J. et al., Nature 435:834-838, 2005). miRNA 중 하나인 let7a-1는 폐암 또는 직장암, miR16-1은 백혈병 또는 고환암, miR24-1은 백혈병과 관련성이 있음이 보고되었고, let7a-1은 라스(Ras) 유전자를 저해하여 전반적인 발암 유전인자를 억제하는 것으로 밝혀졌으며, miR16-1의 경우에는 발암인자인 Bcl2의 저해작용을 통 해 암을 억제하는 것으로 알려졌다. 따라서, miRNA의 양을 조절할 수 있는 방법 및 물질이 밝혀지면 효과적인 표적 질환 치료제의 후보가 될 수 있다. 즉, 표적 질환을 일으키는 기능을 가진 miRNA는 억제하고, 질환 억제 기능을 가진 miRNA는 활성화하여 질환 억제 효과를 높일 수 있다.
생체 내 miRNA의 생성에는 크게 두 가지 효소가 관여하고 있다. 하나는 핵에 존재하는 드로셔(Drosha)라는 엔도-뉴클레오티드 절단효소(endonuclease)이고, 나머지 하나는 세포질에 존재하는 다이서(Dicer)라는 엔도-뉴클레오티드 절단효소(endonuclease)이다. 상기 두 효소 모두 RNA를 가수분해하는 효소이며, 이들은 염기서열에 대한 특이성 없이, 두 가닥 RNA의 길이를 인지하여 절단하는 제한적인 특이성만을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 최초의 마이크로RNA 전사체(primary miRNA, pri-miRNA)가 핵 내에서 RNaseⅢ 타입의 드로셔 효소에 의해 70 ~ 90 뉴클레오티드 정도의 스템-루프(stem-loop) 구조의 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 pre-miRNA는 세포질로 이동하여 다이서에 의해 절단되어 21 ~ 25 뉴클레오티드의 성숙한 miRNA(mature microRNA)로 만들어진다.
상기 두 효소에 의해 생체 내에서 표적 miRNA의 생성량이 조절되므로, 두 효소의 특이성을 알아내면 miRNA의 생성에 매우 중요한 표적으로 이용할 수 있고, 표적 miRNA가 암과 같은 질병의 원인이 되는 경우에는, 병인이 되는 표적 miRNA를 증폭 또는 감소시킬 수 있는 좋은 표적 단백질이 될 수 있다. 특히, 세포질 속에 존재하는, miRNA를 프로세싱하고 있는 다이서(Dicer)는 세포질에 존재하는 표적 mRNA 와 직접 경쟁적 관계를 형성할 수 있기 때문에 표적으로서의 중요성이 더욱 강조된다.
그러나 현재 알려진 바에 의하면, 다이서(Dicer)가 프로세싱하는 pre-miRNA 염기서열의 특이성 또는 선택성이 없다는 것이 문제이다. miRNA 프로세싱 효소 중 하나인 드로셔(Drosha)는 기질에 잘 결합하는 샤퍼론(chaperon) 단백질이 있어서 특이성이 없는 기질을 특이성이 있도록 만들고 있다. 그러나 다이서(Dicer)는 기질인 pre-miRNA 헤어핀 모양에서 오직 스템(stem)부분의 길이를 인식하는 특이성이 있는 것으로 알려져 있으므로, 내생적으로 존재하는 헤어핀 구조를 가진 700 여개의 다른 기질들을 염기서열 특이적으로 구분할 수 있는 능력은 없다. 물론 생체 내에서 이와 같은 특이성을 조절하는 인자가 있어서 필요한 miRNA만을 성숙하게 만드는 것으로 여겨지지만, 이와 같은 인자에 대해 아직 구체적으로 밝혀진 바는 없다.
이에, 본 발명자들은 pre-miRNA의 염기서열에 대한 특이성이 없다고 알려진 다이서(Dicer)에 인공적인 요소로 특이성을 부과하여, 표적 pre-miRNA에 선택적으로 결합하여 성숙한 miRNA 생성을 돕는 리간드를 연구하던 중, pre-miRNA의 염기 부분과 결합할 수 있도록 하기 위해, 양면성 펩타이드의 소수성 부위에 인돌기를 가진 트립토판을 포함시켜 제작한 양면성 펩타이드가 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 표적 miRNA의 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 및 이를 이용한 표적 miRNA 생성 조절 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한쪽 측면에 4 내지 12개의 루신(Leucine, L)을 갖는 양면성 알파 나선 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 소수성 아미노산 중 1개 이상의 루신이 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 양면성 알파나선 펩타이드들 중 어느 하나 이상을 포함하는 양면성 펩타이드 라이브러리를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 표적 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, pre-miRNA에 대한 양면성 펩타이드의 결합력을 측정하는 단계; 및
4) 상기 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 결합력이 비표적 pre-miRNA에 대한 결합력에 비해 높은 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 pre- miRNA에 특이적으로 결합하는 양면성 펩타이드 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리에 탐색하고자 하는 헤어핀 모양의 pre-miRNA, 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 pre-miRNA 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, 양면성 펩타이드에 대한 pre-miRNA의 결합력을 측정하는 단계; 및
4) 상기 양면성 펩타이드에 대한 결합력이 비표적 pre-miRNA에 비해 높은 표적 pre-miRNA를 선별하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표적 pre-miRNA 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 세포주에 상기 양면성 펩타이드를 처리한 후 배양하는 단계;
3) 상기 세포주의 표적 miRNA 발현 정도를 측정하는 단계; 및
4) 상기 표적 miRNA 발현 정도가 양면성 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 miRNA 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드 탐색 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA 생성 촉진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA의 생성 억제에 의해 유발되는 질환 치료제 또는 진단시약을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 표적 pre-miRNA가 존재하는 시험관 내(in vitro)에 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 처리하는 단계; 및
2) 상기 양면성 펩타이드와 표적 pre-miRNA를 결합시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 표적 pre-miRNA 프로세싱(processing) 촉진 방법을 제공한다.
본 발명은 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시켜 자연에 존재하는 펩타이드보다 강력하고 특이적으로 헤어핀 표적 pre-miRNA에 결합하는 인공적인 펩타이드를 제조함으로써, 표적 miRNA 생성을 촉진시키고, 이를 이용하여 miRNA의 기능 연구 및 표적 miRNA 관련 질환을 위한 신약 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 한쪽 측면에 4 내지 12개의 루신(Leucine, L)을 갖는 양면성 알파 나선 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 소수성 아미노산 중 1개 이상의 루신이 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 양면성 알파나선 펩타이드들 중 어느 하나 이상을 포함하는 양면성 펩타이드 라이브러리를 제공한다.
상기 양면성 펩타이드 라이브러리는 소수성 아미노산인 루신(Leucine, L)과 친수성 아미노산인 라이신(Lysine, K) 또는 글라이신(Glycine G)이 한 개 또는 두 개씩 교대로 배열된 아미노산 서열을 가지는 양면성 펩타이드에서 두 개의 라이신(Lysine, K)이 두 개의 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 알파 나선형 양면성 펩타이드들 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 양면성 펩타이드 라이브러리는 서열번호 2 내지 9, 또는 서열번호 12 내지 21로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 서열번호 12 내지 21로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 서열변호 13, 16 및 18로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이 더욱 더 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 양면성 펩타이드 라이브러리는 헤어핀 모양의 프리-마이크로RNA(pre-microRNA, pre-miRNA)에 특이적으로 결합함으로써, 다이서(Dicer) 효소에 의한 pre-miRNA 프로세싱을 촉진시켜 성숙한 마이크로RNA(microRNA, miRNA)의 생성을 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서는 표적 헤어핀 모양의 pre-miRNA에 강력하며 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제작하기 위하여, 라이신, 루신 및 글리신으로 구성된 알파 나선형의 양면성 펩타이드를 사용하여, RNA 염기와 결합할 수 있는 인돌기를 가진 트립토판(Tryptophan, W)을 소수성 부위의 두 개의 루신(Leucine, L) 자리에 각각 치환하였다.
본 발명자들은 강력하고 특이적인 결합을 유도하는 트립토판의 위치를 파악하기 위하여 스캐닝 라이브러리를 제작하였고(표 1 참조), 하나의 루신을 하나의 트립토판으로 치환하여 제조한 1세대 펩타이드에 대해 pre-let7a-1 및 pre-miR16-1(표 2 참조)에 대한 결합력을 형광 비등방성 방법을 통하여 확인하였다. 그 결과, 양면성 펩타이드(서열번호 1)의 1번 또는 14번째 위치에서 루신이 트핍토판으로 치환된 경우(1a 및 1h)에 pre-miRNA에 대한 결합력이 현저히 증가된 것으로 나타났다. 한편, 양끝 부분의 루신을 트립토판으로 변화시킨 양면성 펩타이드는 pre-miRNA에 대한 결합력의 증진 효과는 나타났지만, 표적 pre-miRNA에 특이적으로 결합을 증진시키는 효과는 나타나지 않았다(표 3 참조). 이에, 하나의 트립토판으로 치환된 양면성 펩타이드는 치환되지 않은 펩타이드에 비해 결합력이 증가하였고 특이성에는 영향이 없음을 알 수 있다.
본 발명자들은 상기 1세대 펩타이드인 트립토판 스캐닝 라이브러리를 바탕으로, 양면성 펩타이드에 결합력과 특이성을 부여하기 위해 1번 또는 14번 중 하나의 루신을 트립토판으로 치환하였고, 가운데 여섯 개의 루신 중 한 개를 트립토판으로 치환한, 즉 트립토판이 2개 포함된 2세대 펩타이드 라이브러리를 제작하였다(표 4 참조). 형광 비등방성 방법을 통하여 pre-let7a-1 및 pre-miR16-1에 대한 2세대 펩타이드의 결합력을 확인한 결과, 펩타이드 2b가 특히 pre-let7a-1에 대해 강력하게 결합하였고, pre-miR16-1에 대해서는 펩타이드 2b 및 2c가 각각 첫 번째와 두번째로 강력하게 결합하는 것으로 나타났다(표 5 참조). 또한, 결합상수를 바탕으로 분별계수를 산출한 결과, 펩타이드 2b는 pre-let7a-1에 가장 강력하게 결합하지만 다른 헤어핀 형태의 pre-miRNA에는 상대적으로 결합력이 약하여 11 정도의 높은 분별계수를 나타냈다. pre-miR16-1에 가장 강력하고 특이적으로 결합하는 펩타이드는 2e이었고, 분별계수는 2.3으로 나타났으며, pre-miR124-1에 강력하고 특이적으로 결합하는 펩타이드는 2g이었고 분별계수는 2.3으로 특이적 인식을 하는 것으로 나타났다. 이에, 두 개의 루신을 하나의 트립토판으로 각각 치환하여, 두 개의 트립토판이 포함된 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
본 발명자들은 상기 결과에서 현저한 효과가 있는 것으로 나타난 펩타이드 2b 및 2c의 다이서(Dicer) 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 펩타이드 2b 또는 2c 존재하에 동위원소가 표지된 pre-miRNA인 pre-let7a-1 또는 pre-miR16-1을 처리하여 반응 생성물의 양을 통하여 반응 초기속도를 확인하였다. 그 결과, 펩타이드를 처리하지 않은 경우에 비하여 펩타이드 2b 또는 2c를 처리한 모든 pre-miRNA가 다이서(Diser)에 의해 성숙한 miRNA로 변환이 촉진되는 것으로 나타났다. 특히, pre-let7a-1과 2b를 반응시켰을 경우에, 성숙한 miRNA의 생성이 가장 현저히 증가하였고(도 2 참조), 이는 펩타이드와 pre-miRNA 사이에 강력하고 특이적인 결합력에서 기인하는 것임을 알 수 있다. 또한, 펩타이드 2b의 농도에 따른 성숙한 miRNA의 생성을 알아본 결과, 2b의 농도에 의존적으로 반응 초기속도가 변화하였고 100 nM 이상 농도에서 반응이 급격히 증가하였다(도 3 참조).
본 발명자들은 세포 수준에서 펩타이드의 다이서(Dicer) 효소 활성의 촉진을 통한 성숙한 miRNA의 생성 증가를 알아보기 위하여, 펩타이드 2b 또는 2c를 대장암 세포주에 처리하여 성숙한 miRNA 생성량을 노던 블랏팅(northern blotting)을 통하여 정량 분석하였다. 그 결과, 펩타이드를 세포에 처리하면 표적 miRNA의 생성이 증가하는 것으로 나타났고, 특히, pre-let7a-1에 특이적인 결합력이 검증된 2b를 처리했을 때, 성숙한 let7a-1의 생성이 가장 현저히 증가하였다(도 4 참조). 이에, pre-miRNA에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 촉진함을 알 수 있다.
따라서, 두 개의 트립토판을 가진 양면성 펩타이드 라이브러리는 표적 miRNA의 생성 촉진을 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 표적 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, pre-miRNA에 대한 양면성 펩타이드의 결합력을 측정하는 단계; 및
4) 상기 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 결합력이 비표적 pre-miRNA에 대한 결합력에 비해 높은 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 pre-miRNA에 특이적으로 결합하는 양면성 펩타이드 탐색 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 pre-miRNA는 pre-let7a-1, pre-miR16-1 및 pre-miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 탐침 분자는 형광을 띄고 양면성 펩타이드와 경쟁하여 표적 헤어핀 모양의 pre-miRNA에 결합할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합력은 형광 비등방성(fluorescence anisotropy)을 이용한 경쟁적 결합 측정 방법에 의해 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 양면성 펩타이드의 양면을 변화시킴으로써 표적 pre-miRNA에 대한 선택적이고 강력한 결합력을 가진 펩타이드를 탐색하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리에 탐색하고자 하는 헤어핀 모양의 pre-miRNA, 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 pre-miRNA 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, 양면성 펩타이드에 대한 pre-miRNA의 결합력을 측정하는 단계; 및
4) 상기 양면성 펩타이드에 대한 결합력이 비표적 pre-miRNA에 비해 높은 표적 pre-miRNA를 선별하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표적 pre-miRNA 탐색 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 탐침 분자는 형광을 띄고 양면성 펩타이드와 경쟁하여 표적 헤어핀 모양의 pre-miRNA에 결합할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합력은 형광 비등방성(fluorescence anisotropy)을 이용한 경쟁적 결합 측정 방법에 의해 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 양면성 펩타이드의 표적이 되는 miRNA의 탐색을 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 세포주에 상기 양면성 펩타이드를 처리한 후 배양하는 단계;
3) 상기 세포주의 표적 miRNA 발현 정도를 측정하는 단계; 및
4) 상기 표적 miRNA 발현 정도가 양면성 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 miRNA 생성을 촉 진하는 양면성 펩타이드 탐색 방법을 제공한다.
상기 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 프리-마이크로RNA(pre-microRNA, pre-miRNA)에 특이적으로 결합함으로써, 다이서(Dicer) 효소에 의한 pre-miRNA 프로세싱을 촉진시켜 성숙한 마이크로RNA(microRNA, miRNA)의 생성을 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 세포주는 대장암 세포주인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 miRNA 발현 정도는 노던 블랏팅(northern blotting), RT-PCR 및 마이크로어레이(microarray)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 양면성 펩타이드의 양면을 변화시킴으로써 표적 miRNA의 생성을 촉진하는 펩타이드를 탐색하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로 표적 miRNA 생성 촉진을 위한 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA 생성 촉진 방법을 제공한다.
상기 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 표적 miRNA 생성을 촉진하기 위하여 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA의 생성 억제에 의해 유발되는 질환 치료제 또는 진단시약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적인 표적 miRNA의 생성 억제에 의해 유발되는 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 질환은 대장암, 전립선암, 고환암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 표적 miRNA 생성 억제에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 진단시약에 이용할 수 있고, 표적 miRNA 생성 억제에 의해 유발되는 질환의 치료를 위해 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 치료제는 상기 양면성 펩타이드 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 치료제는 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트 로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 치료제에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
즉, 본 발명의 치료제는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 치료제의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 치료제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 치료제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 표적 pre-miRNA가 존재하는 시험관 내(in vitro)에 상기 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 처리하는 단계; 및
2) 상기 양면성 펩타이드와 표적 pre-miRNA를 결합시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 표적 pre-miRNA 프로세싱(processing) 촉진 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 pre-miRNA는 pre-let7a-1, pre-miR16-1 및 pre-miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 양면성 펩타이드는 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 강력하고 특이적인 결합력을 확보하기 위하여 인돌기를 가진 트립토판을 두 자리에 포함 시켜 헤어핀 pre-miRNA의 이중나선을 이루는 그루브(groove)와의 인식력을 높였고, 이렇게 제작한 양면성 펩타이드는 표적 pre-miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하고, 이러한 특이적인 결합력에 기인하여 다이서(Dicer) 효소의 활성을 촉진시켜 성숙한 표적 miRNA의 생성을 특이적으로 증가시키므로, 시험관 내(in vitro)에서 표적 pre-miRNA 프로세싱(processing)을 촉진하기 위하여 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 1세대 펩타이드의 합성
펩타이드는 링크 아미드 MBHA 레진(0.4 ~ 0.6 mmol/g)을 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 약 25 μmol 스케일로 합성하였다. 합성에 필요한 아미노산 단위체는 모두 NovaBiochem에서 구입하였다. 모든 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하였고, 상기 펩타이드들은 337 ㎚의 질소 레이저 및 1.2 m 플라이트 튜브(flight tube)를 장착하고 있는 Auto Flex Ⅱ MALDI-TOF/TOF mass spectrometer(Bruker Daltonics, Germany)를 이용하여 확인하였다. 또한, Agilent 1100 HPLC(high performance liquid chromatography)를 통하여 펩타이드를 분리하고 순도를 확인하였다.
구체적으로, 하기 표 1의 펩타이드 1을 링크 아미드 MBHA 레진(0.64 mmol/g) 50 ㎎(32 μmol)으로 합성하였다. 레진은 디클로로메탄(1 ㎖, 5분), 디메틸포름아미드(dimethyl formamide, DMF)(1 ㎖, 5분)로 스웰링(swelling)한 후, DMF에 혼합한 20% 피페리딘(piperidine) 1.5 ㎖로 5분간 2회 회전 교반기에서 혼합하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 피페리딘 용액은 디클로로메탄(1 ㎖, 5회), DMF(1 ㎖, 2회)로 교반한 후 여과하여 완전히 세척하였다. 그 후, 펩타이드 1의 경우, 첫 번째 아미노산인 글리신(glycine)을 부착하기 위해, 아미노기에 Fmoc 보호된 단위체, FmocGly-OH(48 ㎎, 5 eq) 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피리디노-포스포니움(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrridino-phosphonium hexafluoro-phosphate, PyBOP, 84 ㎎, 5 eq)을 DMF 1 ㎖에 녹인 후, N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA, 56 ㎕, 12 eq)을 마지막에 추가하고 이 용액을 위의 Fmoc 보호기가 제거된 레진에 넣고 상온에서 1시간 회전 교반기에서 혼합하면서 반응시켰다. 그 후, 반응의 완결은 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS) 테스트를 통해 확인하였고, 반응이 완결되면 디클로로메탄(1 ㎖, 5회), DMF(1 ㎖, 2회)로 교반한 후, 여과하면서 반응용액을 제거하였다. 상기와 같이, Fmoc 제거 및 아미노산 결합 반응을 마지막 아미노산이 결합할 때까지 반복하였다. N-말단의 아세틸화는 상기와 동일한 방법으로 Fmoc 보호기를 제거하고, N-하이드록시벤조트리아졸(N-Hydroxybenzotriazole, HOBt, 41.2 ㎎, 10 eq), 무수아세트산(29 ㎕, 10 eq)을 DMF 900 ㎕, 디클로로메탄 100 ㎕에 녹여 이 용액을 레진에 넣고 상온에서 1시간 교반하여 수행하였다. 그 후 얻어진 펩 타이드의 고체상에의 분리를 위해, 메탄올로 수축시킨 레진에 클리비지 칵테일(cleavage cocktail){1.5 ㎖, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)/트리이소프로필 실레인(triisopropyl silane, TIS)/물(water) = 95:2.5:2.5}을 넣고 2시간 교반하였다. 교반한 후, 레진은 여과하여 제거하고 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)(0.5 ㎖, 2회)으로 레진을 세척하여 남아있는 펩타이드를 회수하였다. 수득한 용액을 질소하에서 농축시킨 후, 10 ㎖의 차가운 디에틸에테르와 n-헥산(v/v = 50/50)을 넣어 펩타이드를 침전시켰다. 수득한 침전물을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 펩타이드를 펠릿(pellet)으로 얻고, 위의 상층액은 경사분리(decantation)하여 조심스럽게 제거하였다. 상기 펠릿을 10 ㎖의 차가운 디에틸에테르와 n-헥산(v/v = 50/50)으로 2회 원심분리하고 경사분리하여 세척하였다. 얻어진 펩타이드 펠릿을 공기 중에서 건조하고 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)(0.2 ㎖)에 녹인 후 0.45 ㎛의 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 정제(purification)를 수행하였다. HPLC는 waters 600을 이용하여, 고정상으로 XBridgeTM Prep C18 5 ㎛ OBDTM(19 ㎜ × 150 ㎜, Waters)를 사용하였고, 이동상으로는 Buffer A, 0.1% TFA가 첨가된 물, 및 Buffer B, 0.1% TFA가 첨가된 CH3CN을 사용하여, 그레디언트(gradient)를 주어 분리하였다. 펩타이드 1의 경우, 30 ~ 35%의 buffer B 조건에서 분리하였고, 펩타이드는 동결건조하여 백색 고체 파우더로 수득하였다(4.8 ㎎, 수율 8%). 모든 펩타이드는 상기와 동일한 방법으로 수득하였다.
그런 다음, 펩타이드 1 및 루신 자리에 트립토판이 스캐닝된 펩타이드(1a-1h)의 아미노산 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 통한 실제 분석된 펩타이드의 질량을 확인한 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.
펩타이드 서열 계산된 질량a 실제 질량
1 Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG (서열번호 1) 1861.5 1861.5
1a Ac-WKKLLKLLKKLLKLAG (서열번호 2) 1934.3 1934.3
1b Ac-LKKWLKLLKKLLKLAG (서열번호 3) 1934.3 1934.4
1c Ac-LKKLWKLLKKLLKLAG (서열번호 4) 1934.3 1934.4
1d Ac-LKKLLKWLKKLLKLAG (서열번호 5) 1934.3 1934.3
1e Ac-LKKLLKLWKKLLKLAG (서열번호 6) 1934.3 1934.5
1f Ac-LKKLLKLLKKWLKLAG (서열번호 7) 1934.3 1934.6
1g Ac-LKKLLKLLKKLWKLAG (서열번호 8) 1934.3 1934.1
1h Ac-LKKLLKLLKKLLKWAG (서열번호 9) 1934.3 1934.1
a모든 펩타이드에 대해 측정된 질량은 (M+H+)이다.
< 실시예 2> Pre - miRNA 의 합성
상기 <실시예 1>에서 합성한 펩타이드와의 결합력 측정을 위한 각각의 RNA는 T7 효소를 이용한 시험관내 전사(in vitro transcription) 방법으로 대량 합성하였다. T7 효소의 활성을 위해 5' 위치에 링커(linker)(5'-GGGAGA-3')를 추가하였다. 전체 염기서열은 하기 표 2와 같았다.
pre-miRNA 염기서열 (5'-3')
pre-let7a-1 GGGAGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUC (서열번호 10)
pre-miR16-1 GGGAGACAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUCCAGUAUUAACUGUGCUGCUGAA (서열번호 11)
< 실시예 3> 1세대 펩타이드와 pre - miRNA 의 결합력 확인
상기 <실시예 1>에서 합성한 펩타이드와 상기 <실시예 2>에서 합성한 pre-miRNA와의 결합력은 형광 비등방성(fluorescence anisotropy)을 이용한 경쟁적 결합 측정 방법에 의해 측정하였다. 형광 탐침으로 N-말단(terminal)에 로다민(rhodamine)을 부착한 rev 펩타이드를 사용하였고, 측정은 Perkin-Elmer사의 LS-55 luminescence spectrometer를 사용하였다. 이때, 항온조를 부착하여 20℃로 온도 조건을 조절할 수 있도록 하였다. 200 nM의 로다민-rev(rhodamine-rev) 펩타이드를 550 ㎚(슬릿 너비 10 ㎚)에서 자극(excitation)하고 580 ㎚(슬릿 너비 10 ㎚)에서 형광강도를 측정하였다. 통합(integration) 시간은 5초로 하였고, 각각의 측정치는 5회 측정에서 얻어진 값의 평균값으로 나타냈다. 결합력 측정에 사용된 버퍼는 20 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산{4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES}, 140 mM 염화나트륨(NaCl), 5 mM 염화칼륨(KCl) 및 1 mM 염화마그네슘(MgCl2)(pH 7.5)이었다. 결합력은 하기 수학식 1을 사용하여, Kaleida 그래프에서 결합 상수를 결정하였다.
Figure 112009064672233-pat00001
이때, A 및 A0는 각각 RNA가 있을 때와 없을 때의 형광 비등방성(fluorescence anistropy) 값을 의미하며, ΔA는 그 값의 차이를 나타낸다. [RNA]0와 [Rh-rev]0는 각각 RNA와 로다민이 결합된 rev 펩타이드의 초기 농도를 의미한다.
상기 <실시예 1>에서 합성한 펩타이드와 <실시예 2>에서 합성한 두 개의 pre-miRNA(pre-let7a-1, pre-miR16-1)와의 결합력을 측정한 결과, 하기 표 3과 같이, 펩타이드에서 하나의 트립토판으로 치환됨으로써 치환되지 않은 펩타이드(펩타이드 1)에 비해 150배 정도의 결합력 증가(펩타이드 1h)를 가져왔다. 결합력의 증가가 펩타이드의 양끝 부분의 변화(1a 및 1h)에 의해 비롯되었으므로 트립토판 치환 위치로서 양끝 부분이 중요한 것으로 나타났다(표 3).
1세대 펩타이드의 pre-let7a-1 또는 pre-miR16-1에 대한 결합력 K d.a
펩타이드 아미노산 서열 pre-let7a-1에 대한 결합력 K d (nM) pre-miR16-1에 대한 결합력 K d (nM)
1 Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG 17 12
1a Ac-WKKLLKLLKKLLKLAG 0.17 0.42
1b Ac-LKKWLKLLKKLLKLAG 0.68 1.2
1c Ac-LKKLWKLLKKLLKLAG 0.41 0.56
1d Ac-LKKLLKWLKKLLKLAG 0.64 1.8
1e Ac-LKKLLKLWKKLLKLAG 20 27
1f Ac-LKKLLKLLKKWLKLAG 0.32 0.48
1g Ac-LKKLLKLLKKLWKLAG 0.25 0.56
1h Ac-LKKLLKLLKKLLKWAG 0.11 0.4
a결합력은 로다민-rev(Rhodamine-rev) 펩타이드를 형광표지로 하여 경쟁적 형광 비등방성(competitive fluorescence anisotropy) 방법으로 측정하였다.
< 실시예 4> 결합 특이성이 향상된 2세대 펩타이드의 합성
상기 <실시예 1>의 트립토판 스캐닝 펩타이드 보다 결합 특이성이 향상되도록 개량된 펩타이드의 제조를 위해, 양끝 루신 자리 중 하나를 트립토판으로 치환함과 동시에 안쪽 6개의 루신 자리 중 한 개를 트립토판으로 치환한 2세대 펩타이드를 합성하였다. 양끝 부분에 치환된 트립토판은 결합력을 증진시키고 가운데 부분에 치환된 트립토판은 특이성을 증진시키는데 역할을 할 수 있도록 펩타이드를 고안했다. 가운데 부분의 트립토판을 치환할 때에는 상기 <실시예 1>에서 치환된 결과를 바탕으로 결합력이 증진된 트립토판 자리만을 선별하여 2세대 펩타이드를 고안하여 합성하였다(표 4).
그런 다음, 2세대 펩타이드의 아미노산 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 통한 실제 분석된 펩타이드의 질량을 확인한 결과, 하기 표 4와 같이 나타났다.
펩타이드 아미노산 서열 계산된 질량a 확인된 질량
2a Ac-WKKLWKLLKKLLKLAG (서열번호 12) 2007.3 2007.8
2b Ac-WKKLLKWLKKLLKLAG (서열번호 13) 2007.3 2007.8
2c Ac-WKKLLKLLKKWLKLAG (서열번호 14) 2007.3 2007.7
2d Ac-WKKLLKLLKKLWKLAG (서열번호 15) 2007.3 2007.6
2e Ac-WKKLLKLLKKLLKWAG (서열번호 16) 2007.3 2007.8
2f Ac-LKKLWKLLKKLLKWAG (서열번호 17) 2007.3 2007.6
2g Ac-LKKLLKWLKKLLKWAG (서열번호 18) 2007.3 2007.7
2h Ac-LKKLLKLLKKWWKLAG (서열번호 19) 2007.3 2007.9
2i Ac-LKKLLKLLKKWLKWAG (서열번호 20) 2007.3 2007.8
2j Ac-LKKLLKLLKKLWKWAG (서열번호 21) 2007.3 2007.6
a모든 펩타이드에 대해 측정된 질량은 (M+H+)이다.
< 실시예 5> 2세대 펩타이드와 pre - miRNA 의 결합력 및 특이성 확인
상기 <실시예 3>에 기재된 방법에 따라, 형광 편광 및 형광 탐침 분자를 이용하여 2세대 펩타이드와 상기 <실시예 2>에서 합성한 2개의 pre-miRNA에 대한 결합력을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5와 같이, 2세대 펩타이드는 헤어핀 모양의 pre-miRNA에 더욱 강력하면서도 특이적인 결합력을 나타냈다. 특히, 펩타이드 2b는 pre-let7a-1 RNA에 대해서만 강력한 결합을 보여주고 있다. 이와 같이, 트립토판이 2개 치환된 2세대 펩타이드에서 결합력이 현저하게 향상되었으며(트립토판으로 치환되지 않은 펩타이드에 비하여 260배 향상), 다른 RNA와의 분별(분별계수가 1에서 11로 증가함)이 잘 되어 특이성이 향상된 것으로 나타났다.
또한, 하기 표 6과 같이, 2세대 펩타이드 중 펩타이드 2b가 표적한 pre-let7a-1 헤어핀 RNA에 결합하는 정도(결합상수)와 다른 일반적인 헤어핀 RNA에 결합하는 정도(평균 결합상수)를 비교한 분별계수(모든 헤어핀 pre-miRNA에 결합하는 Kd값의 평균/표적 pre-miRNA에 결합하는 Kd값)는 펩타이드 2b/pre-let7a-1의 경우 11로 나타났다. 분별계수가 클수록 특이적인 인식을 하는 펩타이드-RNA 결합이므로, 펩타이드 2b/헤어핀 RNA pre-let7a-1의 인식은 매우 특이적인 것으로 나타났다. pre-miR16-1에 가장 강하게 결합하는 펩타이드도 2b이고 그 결합력이 250 pM 정도로 강력하며, 펩타이드 2e와 pre-miR16-1는 다른 RNA에 대한 분별계수가 2.3으로 강력하고 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. pre-miR24-1에 대해서는 2g/pre-miR24-1의 분별계수가 2.3으로, 특이적 인식을 하는 것으로 나타났다.
2세대 펩타이드의 pre-let7a-1 및 pre-miR16-1에 대한 결합력 K d.a
펩타이드 아미노산 서열 pre-let7a-1에 대한 결합력 K d (nM) pre-miR16-1에 대한 결합력 K d (nM)
1 Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG 17 12
2a Ac-WKKLWKLLKKLLKLAG 0.23 0.32
2b Ac-WKKLLKWLKKLLKLAG 0.067 0.22
2c Ac-WKKLLKLLKKWLKLAG 0.15 0.27
2d Ac-WKKLLKLLKKLWKLAG 0.25 0.64
2e Ac-WKKLLKLLKKLLKWAG 0.22 0.28
2f Ac-LKKLWKLLKKLLKWAG 0.90 2.1
2g Ac-LKKLLKWLKKLLKWAG 0.96 1.1
2h Ac-LKKLLKLLKKWWKLAG 1.5 2.6
2i Ac-LKKLLKLLKKWLKWAG 0.31 0.47
2j Ac-LKKLLKLLKKLWKWAG 0.37 0.44
a결합력은 로다민-rev(Rhodamine-rev) 펩타이드를 형광표지로 하여 경쟁적 형광 이등방성(competitive fluorescence anisotropy) 방법으로 측정하였다.
2세대 펩타이드의 pre-miRNA 또는 다른 헤어핀(hairpin) RNA에 대한 결합력 K d a 비교
펩타이드 결합력 K d (nM)b
pre-let7a-1 pre-miR16-1 pre-miR24-1 HBV IRES
2a 0.23 (2.8) 0.32 (2.6) 0.82 (0.66) 0.77 0.90
2b 0.067 (11) 0.22 (1.1) 0.43 (1.5) 0.90 1.0
2c 0.15 (2.8) 0.27 (1.4) 0.88 (0.41) 0.46 0.46
2d 0.22 (1.2) 0.64 (1.2) 0.67 (1.0) 0.79 0.77
2e 0.90 (1.7) 0.28 (2.3) 0.84 (0.50) 0.34 0.76
2f 0.96 (9.3) 2.1 (1.2) 2.2 (0.66) 0.38 3.8
2g 0.96 (0.85) 1.1 (0.99) 0.47 (2.3) 1.0 1.3
2h 1.5 (1.8) 2.6 (1.0) 1.5 (1.9) 5.7 1.7
2i 0.31 (4.4) 0.47 (1.6) 0.53 (1.2) 0.82 1.2
2j 0.37 (1.0) 0.44 (1.4) 0.27 (1.9) 0.35 0.85
a결합력은 로다민-rev(Rhodamine-rev) 펩타이드를 형광표지로 하여 경쟁적 형광 이등방성(competitive fluorescence anisotropy) 방법으로 측정하였다.
b각 miRNA에 대한 분별계수는 괄호에 표시하였다. 분별 계수는 다른 RNA(HBV, IRES, 다른 miRNA들)들에 대한 K d / 표적 miRNA에 대한 K d로 정의되었다.
< 실시예 6> 선택된 양면성 펩타이드 존재하의 다이서(Dicer)의 활성 측정
다이서(Dicer) 효소의 활성을 측정하기 위한 기질인 2종류의 pre-miRNA(pre-let7a-1, pre-miR16-1)는 삼천리제약에서 주문 합성하였다(도 1). 다이서(Dicer) 활성 측정을 위해, 우선 합성된 pre-miRNA의 5' 부분을 32P 동위원소로 표지화하였다. 각 pre-miRNA 2 pmole을 T4폴리뉴클레오티드 키나아제(T4 polynucleotide kinase)(New England Biolabs) 10 units을 이용하여 20 mCi의 [g-32 P] ATP(New England Biolabs) 동위원소로 표지화하였다. 표지화 반응은 10 ㎕ 정도로 37℃에서 1시간 수행하였다. 반응 후 수득한 동위원소 표지된 RNA는 G-25 Sephadex 컬럼(Sigma)을 이용하여 정제하였다. 정제한 기질을 이용해 다이서(Dicer)의 효소활성을 측정하는 실험을 수행하였다. 동위원소로 표지된 pre-miRNA 1 nM을 24 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산{4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES}, 200 mM 염화나트륨(NaCl), 0.04 mM EDTA, 1 mM ATP, 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2)(pH 8.0)의 버퍼 조건으로 37℃에서 0.001 u/㎕의 재조합 인간 다이서(recombinant human Dicer)(Genlantis, CA, USA)를 첨가하여 총 부피를 30 ㎕로 하여 배양하였다. 400 nM 농도의 2b 또는 2c 펩타이드 존재하에서 반응 후 0, 10, 30, 60 또는 120분 뒤에 3 ㎕씩 취하여 각각의 반응 혼합물을 RNA 젤 로딩 버퍼(gel loading buffer){95% 포마마이드(formamide), 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 0.05% SDS, 0.05% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 0.05% 자일렌 시아놀 FF(xylene cyanol FF)} 5 ㎕와 혼합하여 65℃에서 5분간 가열한 후, 7M 유레아(urea)를 포함한 15% 폴리아크릴아마이드젤(Polyacrylamide gel)에서 분리(gel running)하여 반응 생성물의 양을 결정하였고, 각각의 반응에서 얻어진 반응 초기 속도(V0 )를 비교하였다. 효소의 반응 초기속도(V0)는 120분 동안 측정된 효소의 반응에서 초기 선형을 이루는 시간(30분까지)에서의 반응속도를 의미한다. 각 초기속도는 기질에 따라 펩타이드 없는 조건의 초기속도로 표준화(normalization)하였다. pre-let7a-1 및 pre-miR16-1에 대해 펩타이드를 처리하지 않았을 때의 다이서(Dicer) 반응 초기속도는 각각 0.0071 및 0.018 fmole/min이었다. 측정된 반응 초기속도값은 적어도 각 3번 이상의 측정을 통하여 데이터를 얻었으며, 편차를 편차 막대(error bar)로 표시하였다. 각 펩타이드 400 nM 존재하에서 pre-miRNA가 성숙된 miRNA로 변환되는 속도를 표준화하여 막대그래프로 나타낸 결과, 도 2와 같이, 2b 펩타이드와 pre-let7a-1 사이에서 다이서(Dicer) 효소의 반응 초기속도의 가속화가 가장 극대화되는 것으로 나타났다. 이는 펩타이드 2b와 pre-let7a-1 간의 결합력과 관계가 있으며, 결합력이 강할수록 다이서(Dicer)의 프로세싱 반응속도가 빠르게 나타났다. 펩타이드 2b에 의해 pre-miR16-1의 프로세싱 속도도 현저히 증가되었으며 이는 펩타이드 2b가 pre-miR16-1에도 강력하게 결합하는 것을 나타냈다. 펩타이드 2c의 경우, pre-let7a-1 및 pre-miR16-1에 대한 결합력을 반영한 초기속도의 증가가 나타났다. 이에 반하여, 음성대조군으로 쓴 펩타이드 1e는 pre-miRNA에 대한 다이서(Dicer)의 프로세싱 반응 초기속도를 증가시키지 않았다. 또한, 도 3과 같이, 펩타이드 2b 농도에 따른 다이서(Dicer)에 의한 pre-miRNA의 프로세싱 초기속도는 농도 의존적으로 변화하였고, 하기 수학식 2에 따라 얻어진 EC50 값은 940 nM이었고, 기울기는(hill slope)는 3.5로 나타났다. 펩타이드 2b의 농도가 100 nM 이상일 때 초기속도는 현저하게 상승하였고, 1,000 nM 이상의 농도에서는 오히려 초기속도가 낮아지는 경향을 보였다.
Figure 112009064672233-pat00002
(b; bottom, t; top)
< 실시예 7> 선택된 양면성 펩타이드 존재하의 표적 miRNA 의 생성량의 측정
<7-1> HCT116 세포 배양 및 총 RNA 의 추출
HCT116 세포는 미국유전자은행(American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하여 사용하였고, RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2 존재하에 배양하였다. 총 RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 사용하여 제작자가 지시한 프로토콜(recommended protocol)에 따라 추출하였다.
2 μM의 농도의 2b 또는 2c 펩타이드 조건에서 리포펙타민(lipofectamine) 존재하에 배양하여 RNA의 양의 변화를 측정하였다.
<7-2> 노던 블랏팅( Northern blotting )
2 μM의 2b, 2c, 1e 또는 0.2 ㎍/㎖의 독소루비신(doxorubicin)을 HCT116 세포에 처리한 뒤 3시간 후에 수득한 총 RNA에 대하여 성숙한 miRNA의 생성량을 확인하기 위하여 노던 블랏팅을 실시하였다. 이때, 18S rRNA의 밴드 세기(band intensity)로 로딩 대조군(loading control)을 잡았고, P53 인듀서(inducer)인 독소루비신(doxorubicin)은 최근에 드로셔(Drosha) 효소에 작용하여 성숙한 miRNA의 증가를 보인다고 밝혀져, 양성대조군으로 사용하였으며, 펩타이드 1e는 음성대조군으로 사용하였다. 10 ~ 20 ㎍의 총 RNA를 Decade marker(Ambion)와 함께 20 mM 3-(N-몰폴리노)프로판설폰산-수산화나트륨{3-(N-morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)-NaOH}(pH 7.0)에서 7 M 유레아(urea)를 포함한 12.5% 폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel)을 이용하여 350 V에서 2시간 동안 분리하였다. RNA 블랏팅(blotting)은 화학적 교차결합(chemical cross-linking) 방법에 따라 수행하였다. 분리된 각각의 RNA는 neutral nylon membrane(Hybond NX, Amersham/Pharmacia)으로 트랜스퍼(transfer)하였고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드{1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC}를 이용하여 막(membrane)에 교차결합(crosslink)하였다. 이를 50 ㎕의 10 ㎎/㎖ 연어 정자(salmon sperm) DNA를 포함한 혼성화 버퍼(hybridization buffer)(clontech, CA, USA)에서 30분간 먼저 혼성화(prehybridization) 하였다. 그 후, 각 miRNA의 상보적인 서열의 동위원소 표지된 탐침(probe) DNA를 같은 조건의 버퍼에서 2시간 동안 혼성화 하였다. 이때 사용한 탐침(probe)은 25 μCi의 [γ-32P] ATP(New England Biolabs) 및 5 units의 폴리뉴클레오티드 키나아제(polynucleotide kinase)(New England Biolabs)를 이용하여 동위원소 표지하였고, 이렇게 얻어진 탐침은 에탄올 침전(EtOH precipitation)을 하고, 50 ㎕의 DEPC 처리된 물에 녹여 사용하였다. 그 후, 0.3 M 염화나트륨(NaCl), 0.03 M 구연산나트륨(sodium citrate), 0.05% 소듐두데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)(pH 7.0)를 포함한 버퍼 200 ㎖로 30분 동안 2회, 0.015 M 염화나트륨(NaCl), 0.0015 M 구연산나트륨(sodium citrate), 0.1% SDS(pH 7.0)를 포함한 버퍼 200 ㎖로 15분 동안 2회 세척하여 얻어진 막을 phosphorimager screen에 노출시키고, 각각의 밴드를 FLA-3000에서 측정하여 MultiGauge Ver. 3.0 소프트웨어(Fuji Photo)로 분석하였다.
그 결과, 도 4와 같이, 펩타이드의 종류에 따라 miRNA의 생성량이 특이적으로 변화하는 것으로 나타났다. 펩타이드 2b 처리시 let7a-1의 양이 가장 현저하게 증가한 것으로 나타났고, 펩타이드 2b 처리시 miR16-1의 생성량과 펩타이드 2c 처리시 let7a-1의 생성량이 증가함을 알 수 있었다. 이와 같은 경향성은 펩타이드 존재하에서의 다이서(Dicer)의 프로세싱 초기속도의 경향성과 유사하였다.
상기와 같이, 본 발명에 의해 선별된, 헤어핀 모양의 표적 miRNA에 강력하고 특이적으로 결합하여 선택적으로 성숙한 miRNA 생성을 촉진하는 양면성 펩타이드는 표적 miRNA와 관련된 질환에 대한 신약 개발 및 진단키트의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pre-miRNA의 두 종류인 pre-let7a-1(a) 및 pre-miR16-1(b)의 M-fold를 이용하여 예측된 2차 구조를 나타낸 그림이다.
도 2는 펩타이드 2b, 2c 또는 1e 존재하에서의 pre-miRNA가 성숙된 miRNA로 변환되는 다이서(Dicer) 반응 초기속도(VO)를 표준화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 펩타이드 2b의 농도에 따른 pre-miRNA가 성숙된 miRNA로 변환되는 다이서(Dicer) 반응 초기속도(VO)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 펩타이드 2b, 2c 또는 1e 존재하에서 생성된 성숙된 miRNA의 양을 노던 블랏팅(northern blotting)을 통하여 나타낸 그래프이다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Ambivalence peptides promoting production of target miRNA and a method of regulating the production of target miRNA <130> 9p-09-27 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1a <400> 2 Trp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1b <400> 3 Leu Lys Lys Trp Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1c <400> 4 Leu Lys Lys Leu Trp Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1d <400> 5 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1e <400> 6 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Trp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1f <400> 7 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Trp Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1g <400> 8 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Trp Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1h <400> 9 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pre-let7a-1 <400> 10 gggagaugag guaguagguu guauaguuuu agggucacac ccaccacugg gagauaacua 60 uacaaucuac ugucuuuc 78 <210> 11 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pre-miR16-1 <400> 11 gggagacagc acguaaauau uggcguuaag auucuaaaau uaucuccagu auuaacugug 60 cugcugaa 68 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2a <400> 12 Trp Lys Lys Leu Trp Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2b <400> 13 Trp Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2c <400> 14 Trp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Trp Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2d <400> 15 Trp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Trp Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2e <400> 16 Trp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2f <400> 17 Leu Lys Lys Leu Trp Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2g <400> 18 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2h <400> 19 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Trp Trp Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2i <400> 20 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Trp Leu Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2j <400> 21 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Trp Lys Trp Ala Gly 1 5 10 15

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 기재되는 양면성 알파나선 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 소수성 아미노산 중 1개 이상의 루신이 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 양면성 알파나선 펩타이드들 중 서열번호 6으로 기재되는 펩타이드를 제외한 어느 하나 이상을 포함하는 양면성 펩타이드 라이브러리.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 양면성 펩타이드 라이브러리는 서열번호 1로 기재되는 양면성 알파나선 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 두 개의 라이신(Lysine, K)이 두 개의 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 양면성 알파나선 펩타이드들 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 양면성 펩타이드 라이브러리.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 양면성 펩타이드 라이브러리는 서열번호 2 내지 5, 서열번호 7 내지 9, 또는 서열번호 12 내지 21로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 양면성 알파나선 펩타이드들 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 양면성 펩타이드 라이브러리.
  4. 1) 제 1항의 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
    3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 표적 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, pre-miRNA에 대한 양면성 펩타이드의 결합력을 측정하는 단계; 및
    4) 상기 헤어핀 모양의 표적 pre-miRNA에 대한 결합력이 비표적 pre-miRNA에 대한 결합력에 비해 높은 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 pre-miRNA에 특이적으로 결합하는 양면성 펩타이드 탐색 방법.
  5. 1) 제 1항의 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 상기 양면성 펩타이드 라이브러리에 탐색하고자 하는 헤어핀 모양의 pre-miRNA, 및 대조군으로서 하나 이상의 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA를 합성하는 단계;
    3) 상기 양면성 펩타이드, 헤어핀 모양의 pre-miRNA 또는 비표적 pre-miRNA, 및 탐침 분자를 혼합한 후, 양면성 펩타이드에 대한 pre-miRNA의 결합력을 측정하는 단계; 및
    4) 상기 양면성 펩타이드에 대한 결합력이 헤어핀 모양의 비표적 pre-miRNA에 비해 높은 표적 miRNA를 선별하는 단계를 포함하는, 상기 양면성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 표적 pre-miRNA 탐색 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 2)의 pre-miRNA는 pre-let7a-1, pre-miR16-1 및 pre-miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  7. 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 3)의 탐침 분자는 양면성 펩타이드와 경쟁하여 표적 헤어핀 모양의 pre-miRNA에 결합할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  8. 1) 제 1항의 양면성 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 세포주에 상기 양면성 펩타이드를 처리한 후 배양하는 단계;
    3) 상기 세포주의 표적 miRNA 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    4) 상기 표적 miRNA 발현 정도가 양면성 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 양면성 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 miRNA 생성을 촉 진하는 양면성 펩타이드 탐색 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 단계 2)의 세포주는 대장암 세포주인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 단계 3)의 miRNA는 let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 단계 3)의 miRNA 발현 정도는 노던 블랏팅(northern blotting), RT-PCR 및 마이크로어레이(microarray)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  12. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 miRNA의 생성 촉진용 조성물.
  13. 삭제
  14. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, let7a-1, miR16-1 및 miR24-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 miRNA의 생성 억제에 의해 유발되는 암 진단시약.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 암은 고환암, 직장암, 폐암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 진단시약.
  16. 1) 표적 pre-miRNA가 존재하는 시험관 내(in vitro)에 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 선별된 양면성 펩타이드를 처리하는 단계; 및
    2) 상기 양면성 펩타이드와 표적 pre-miRNA를 결합시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 표적 pre-miRNA로부터 성숙한 표적 miRNA의 생성을 촉진하는 방법.
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