JP5685081B2 - マトリックスメタロプロテネース9遺伝子選択的発現抑制剤 - Google Patents
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Description
(1)N−メチルピロール単位、N−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子プロモーターの塩基配列−84〜−24(配列番号2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域(以下標的領域と言う)の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
(2)更にβアラニン単位を含む上記(1)に記載の薬剤。
(3)更にフルオレセインイソチオシアネート(以下FITCとも言う)単位を含む上記(1)に記載の薬剤。
(4)ヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子発現抑制のための上記(1)〜(3)のいずれか一項に記載の薬剤。
(5)ヒトマトリックスメタロプロテネース9関連疾患の治療のための上記(1)〜(3)のいずれか一項に記載の薬剤。
(6)制癌剤として用いるための上記(5)に記載の薬剤。
(7)前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース9プロモーターの塩基配列−77〜−70(配列番号3)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載の薬剤。
(8)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記(1)〜(7)のいずれか一項に記載の薬剤。
(9)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(10)N−メチルピロール単位、N−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子プロモーターの塩基配列−615〜−553(配列番号4)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてU字型のコンフォメーションをとることができ、C−G塩基対に対してはPy/Im対が、G−C塩基対に対してはIm/Py対が、A−T塩基対及びT−A塩基対に対してはいずれもPy/Py対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
(11)更にβアラニン単位を含む上記(10)に記載の薬剤。
(12)更にフルオレセインイソチオシアネート(以下FITCとも言う)単位を含む上記(10)に記載の薬剤。
(13)ヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子発現抑制のための上記(10)〜(12)のいずれか一項に記載の薬剤。
(14)ヒトマトリックスメタロプロテネース9関連疾患の治療のための上記(10)〜(12)のいずれか一項に記載の薬剤。
(15)制癌剤として用いるための上記(14)に記載の薬剤。
(16)前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース9プロモーターの塩基配列−605〜−599(配列番号5)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記(10)〜(15)のいずれか一項に記載の薬剤。
(17)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記(10)〜(16)のいずれか一項に記載の薬剤。
(18)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(19)上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載の薬剤及び上記(10)〜(17)のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
(20)上記(9)及び上記(18)に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
(21)前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記(1)〜(8)のいずれか一項に記載の薬剤。
(22)前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はN、N−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記(21)に記載の薬剤。
(23)前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記(10)〜(17)のいずれか一項に記載の薬剤。
(24)前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はN、N−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記(23)に記載の薬剤。
(25)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(26)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
(27)基礎実験の試薬として用いる上記(9)、(18)、(25)及び(26)に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドHMMP9AP1及びHMMP9NFκβは下記に示す通りである。
本発明に係るPy−Imポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。従って、本発明のMMP9AP1及びMMP9NFκβはヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子発現抑制のための薬剤、当該遺伝子関連疾患の治療、及び制癌剤として使用することができる。
また、本発明のHMMP9AP1及びHMMP9NFκβはヒト乳腺癌MDA−MB−231細胞及びヒト子宮頸がん由来のHeLa細胞の濃度依存的に生細胞数を減少させた。このことより、本発明のポリアミドが当該細胞の増殖を抑制したことが分かった。
なお、本発明のポリアミドが標的とする塩基配列以外の配列(図1において四角で囲まれた配列)に対して合成されたポリアミドは、HeLa細胞を用いた増殖抑制アッセイにおいて増殖の抑制を示さなかった(データは示さない)。このことより、本発明のポリアミドの特異性が示された。
本発明のHMMP9NFκβによって、マウスヒト大腸がん肝転移モデルにおける肝転移巣の数及び面積が減少した。
従って、本発明のポリアミドは、MMP−9遺伝子発現抑制のための薬剤、MMP−9関連疾患、具体的には、血管新生、繊維化、細胞浸潤を含む病態、浸潤性腫瘍、転移性腫瘍、腫瘍血管新生の治療のための薬剤、及び制癌剤として使用できる点で有利である。
I.材料及び方法
Py−Imポリアミドとして、ヒトマトリックスメタロプロテネース9プロモーター領域の−77〜−70又はヒトマトリックスメタロプロテネース9プロモーターの−605〜−599の塩基対に結合するように、上記のようなHMMP9AP1、及びHMMP9NFκβを設計した。
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Pioneer(商標)(アプライドバイオシステムズ)を用いて0.1mmolスケール(200mgのFmoc−β−アラニン−CLEAR酸レジン、0.50meq/g、Peptide Institute、Inc.)で実施した。自動固相合成はDMF洗浄、Fmoc基の20%ピペリジン/DMFによる除去、メタノール洗浄、HATU及びDIEA(それぞれ4当量)の存在下でのモノマーとの60分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸/ピリジンによる保護、及び最終的なDMF洗浄からなっている。Py−Imポリアミドは一般に中程度の収率(10−30%)で得られた。
一般的手順: Fmoc−β−アラニン−Wang樹脂のFmoc基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をFmocアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行い、これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。最終カップリング工程を終えた後、N末端アミノ基をピペリジンにより除去したのち、4等量のフルオレセインとDIEAを反応容器に加え60分間反応させた。反応終了後、DMFおよびメタノールにより反応樹脂の洗浄と回収を行った。
アミンとしての分解: 合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程(N、N−ジメチルアミノプロピルアミン5mL/樹脂0.1mmol、50℃、一晩)の後に単離した。
精製: 最終精製は、10mL/minの流速の分析用RP−HPLCで、緩衝液A(0.1%TFA/水又は0.1%AcOH/水)中B(アセトニトリル)の直線勾配を用いて、350nmのUV検出により行った。HMMP9AP1、HMMP9AP1−FITC、HMMP9NFκβ及びHMMP9NFκβ−FITCを図4、図5、図6及び図7に示す。またそれぞれのRP−HPLCのチャートを図21、図22、図23及び図24に示す。
I.材料及び方法
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、HMMP9AP1及びHMMP9NFκβプロモーターの塩基対に対応する2種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをFITCで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二本鎖DNAを作成した。具体的なヌクレオチドの塩基配列は、AP−1結合部位を含む−77〜−70領域に相当するHMMP9AP1(マッチ)センスプライマー(5’GACCCCTGAGTCAGCACTTGCC)(配列番号8)及びこれに2塩基変異を有するHMMP9AP1オリゴDNA(ミスマッチ1)センスプライマー(5’GACCCCTGAGTAGGCACTTGCC)(配列番号9)、並びにNFκβ結合部位を含む−605〜−599を含むHMMP9NFκβ(マッチ)センスプライマー(5’TGCCCCAGTGGAATTCCCCAGC)(配列番号10)及びこれに2塩基変異を有するHMMP9NFκβ(ミスマッチ1)センスプライマー(5’TGCCCCAGTGGGGTTCCCCAGC)(配列番号11)および前記4つのプライマーにそれぞれ相補的なアンチセンスプライマーを作成した。0.6μMの蛍光標識されたマッチ二本鎖DNA又はミスマッチ二本鎖DNA(蛍光センスプライマーとアンチセンスプライマーにより作成された2本鎖DNA)を、37℃で1時間、結合緩衝液(40mM Tris、pH7。9、250mM NaCl、25mM EDTA、25mM DTT、100mM KCl)中で10μMポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を20%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機(フジフィルム、LAS−4000、東京、日本)で解析した。
合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりHMMP9AP1及びHMMP9NFκβの標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む22塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖DNAを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールポリアミドと標的配列との結合性を検討した。HMMP9AP1及びHMMP9NFκβとともに二本鎖DNA(DS)にピロールイミダゾールポリアミド(Py−Im)を加えると、DSのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、DSとPy−Imとの結合が証明された。結果を図8及び図9に示す。
ヒト乳腺癌MDA−MB−231細胞株を使用した。100μg/mlのストレプトマイシン、100ユニット/mlのペニシリン及び10%牛胎仔血清(FBS)(Sigma)を補充したRPMI1640培地(Sigma、St.Louis、MO、USA)中で、5%CO2を含む加湿環境、37℃で培養した。ヒト子宮頸がん細胞HeLa細胞は10%FBS及び2mM L-グルタミンを含有するダルベッコ基礎培地(DMEM、In vitrogen Life Technologies, Corp., Carlsbad、CA)中で培養した。
I.材料及び方法
創傷治癒過程における細胞の移動を測定するために、8ウェルチャンバースライドの各々のウェルに細胞(3×105)を播種し、細胞が集密状態に達したときに、細胞層をプラスチックマイクロピペットによって傷つけた。培地及びデブリは吸引除去し、種々のポリアミドを含む100μlの新鮮な培地に入れ替えた。傷をつけてから48時間後に細胞はDiff−Quik溶液(国際試薬株式会社、神戸、日本)によって固定してから染色し、位相差顕微鏡によって撮影した。
本発明のポリアミドの細胞移動能を評価する為に様々な濃度のポリアミドを用いて細胞を処理した。MDA−MB−231細胞は創傷治癒分析の結果、本発明のポリアミドによって移動を阻害されることが分かった。DMSO処理したMDA−MB−231は48時間で傷を受けた領域が閉じることが分かった。対照的に、本発明のポリアミドである、HMMP9AP1及びHMMP9NFκβはMDA−MB−231細胞の移動を濃度依存的に阻害することが分かった。また、HMMP9NFκβはHeLa細胞の移動を濃度依存的に阻害することが分かった。これらの結果より、本発明のHMMP9AP1及びHMMP9NFκβはヒト乳腺癌細胞において細胞の移動を阻害することが分かった。また、HMMP9NFκβはヒト子宮頸がん細胞においても細胞の移動を阻害することが分かった。結果を図10及び図11に示す。
I.材料及び方法
細胞浸潤アッセイは、24ウェル細胞培養BioCoatマトリゲル浸潤チャンバー(ベクトンディックソンラボウエア、ベッドフォード、MA、USA)を用いて行った。MDA−MB−231細胞(1×103細胞/ウェル)又はHeLa細胞(1×103細胞/ウェル)を0.1%FBSを含有するRPMI1640培地またはDMEM培地に懸濁させ、上部チャンバーに添加した。5%FBSを含有するRPMI1640培地又はDMEM培地は下部チャンバーに添加した。その後、37℃、5%CO2で22時間培養した。メンブレンの上部に残った非浸潤細胞はコットンスワブによってふき取った。浸潤細胞は固定し、Diff−Quikキットで染色した。メンブレンに浸潤した細胞の数を、光学顕微鏡(拡大率200×)を用いて一つのメンブレンで10視野のカウントを、計3つの膜で行い平均と標準偏差を求めた。
細胞外マトリックス構成タンパク質の分解は、腫瘍細胞浸潤において重要である。本発明のMMP9Py−Imポリアミド、HMMP9AP1及びHMMP9NFκβの腫瘍細胞浸潤に対する影響を評価するために、種々の濃度のポリアミドと5×103のMDA−MB−231細胞を22時間インキュベートした。DMSO及び本発明のポリアミドで処理した細胞の浸潤性をMDA−MB−231細胞において比較した。DMSOで処理したMDA−MB−231細胞はマトリゲルでコートした透過膜を顕著に浸潤した。これは、細胞が顕著に染色されたことから示唆される。対照的に、本発明のHMMP9AP1及びHMMP9NFκβで処理した細胞では、メンブレンへの浸潤が顕著に減少した。これは、対照と比較した染色強度によって示唆される。0.3μM、1μM、3μM及び10μMのHMMP9AP1で処理したMDA−MB−231細胞はDMSO処理対照と比べて、それぞれ、90%、52%、44%及び25.4%の浸潤の減少を示した。0.3μM、1μM、3μM及び10μMのHMMP9NFκβで処理したMDA−MB−231細胞はDMSO処理対照と比べて、それぞれ、88%、61%、30%及び22%の浸潤の減少を示した。これらの結果より、濃度依存的にマトリゲルを通過する浸潤細胞が減少することが分かった。結果を図12及び図13に示す。
I.材料及び方法
MDA−MB−231細胞を種々の濃度の本発明のポリアミドで処理した。処理の48時間後、細胞分画は製造者の手順に従ったトライゾール試薬(In vitrogen Life Technologies, Corp.)を用いたRNA分離に供した。RNAはcDNA合成の前にDNaseによって処理された。逆転写による相補的DNA鎖はSuperScriptTMFirst−Strandkit(In vitrogen Life Technologies, Corp.)によって合成された。リアルタイムRT−PCR(Thermal cycler Dice Real Time system TP800, Takara Bio Inc., Japan)は、SYBR Premix Ex Taq Kit(タカラバイオ)を使用した。HMMP9AP1のためのプライマーは、(フォワード、 5’−GAGACCGGTGAGCTGGATAG−3’,配列番号12; リバース 5’−TACACGCGAGTGAAGGTGAG−3’,配列番号13;236bp), 及び内部標準ヒト内在性グリセルアルデヒド−3−ホスフェート ジヒドロゲナーゼ(GADPH;フォワード、5’−GCACCGTCAAGGCTGAGAAC−3’,配列番号14;リバース、5’−TGGTGAAGACGCCAGTGGA−3’,配列番号15;138bp)を使用した。また、HMMP9NFκβのためのプライマーは、(フォワード、5’−GAGACCGGTGAGCTGGATAG−3’,配列番号16;リバース、5’−TACACGCGAGTGAAGGTGAG−3’,配列番号17;236bp)及び内部標準ヒト内在性グリセルアルデヒド−3−ホスフェート ジヒドロゲナーゼ(GADPH;フォワード、5’−GCACCGTCAAGGCTGAGAAC−3’,配列番号18;リバース、5’−TGGTGAAGACGCCAGTGGA−3’,配列番号19;138bp)を使用した。ツーステップRT−PCR混合物25μlは、SYBR Premix EXTAq12.5μl、夫々のフォワード及びリバースプライマー0.5μl、RNaseフリー水10.5μl、鋳型cDNA1μlからなる。リアルタイムサイクル条件は、95℃、10秒、95℃、5秒 60℃、30秒の反応系によって行った。MMP−9遺伝子の定量はGAPDH発現と比較することによって標準化した。
本発明のポリアミドによる細胞移動及び浸潤活性がMMP−9発現の減少と相関しているかどうかを更に調べるために、リアルタイムRT−PCRによって、本発明のポリアミドで処理したMDA−MB−231細胞とDMSO処理したコントロールのMMP−9発現レベルを比較した。転写調節はMMP−9発現に重要な役割を果たす。リアルタイムRT−PCRによる分析は、HMMP9AP1では、MMP−9mRNAの発現量は0.3μMで84%、1μMで54%、3μMで38%、10μMで26%減少した(図14)。HMMP9NFκβでは、MMP−9mRNAの発現量は0.3μMで86%、1μMで68%、3μMで40%、10μMで28%減少した(図15)。本発明のポリアミドによって、濃度依存的にMMP−9mRNAの量が減少していることが分かった。
I.材料及び方法
MDA−MB−231細胞培養上清から採取したタンパク質をNovex(登録商標)ザイモグラムゼラチンゲル及びXCell SureLockTM Mini−cell(In vitrogen Life Technologies, Corp.)を用いて行った。2.5×105細胞に種々の濃度の本発明のポリアミドを加えた。48時間インキュベート後に上清を採取した。各サンプルからのタンパク質をNovex(登録商標)Tris−グリシンSDSサンプルバッファー(2×)に混合し、10%ザイモグラムゼラチンゲルで分離した。製造者のマニュアルに従って、ゲルは再生バッファー及び現像バッファーで洗浄した。その後ゲルはデジタル化された。
48時間処理した細胞から採取された細胞培養上清の蛋白活性を測定した。コントロールと比べて、1μMのHMMP9AP1の処理でゼラチン分解活性が50%抑制され、10μMでほとんど完全にMMP−9の酵素活性は阻害された(図16)。1μMのHMMP9NFκβの処理でゼラチン分解活性が62%抑制され、10μMでは82%抑制された(図17)。
I.材料及び方法
MDA−MB−231細胞は、種々の濃度の本発明のポリアミドで処理した。処理の48時間後、細胞を採取し、全細胞ライセートを、50mM Tris−HCl、150mM NaCl、10mM EDTA、1%Triton−Xを含むプロテアーゼ阻害カクテル(ベーリンガーインゲルハイム、GmbH、ドイツ)を含む抽出バッファー中に準備した。ホモジネートは、15,000×g、4℃で10分間遠心分離した。上清を採取し、タンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプル(10μg)をNuPAGE+TM10%Bis−Trisゲル(In vitrogen Life Technologies, Corp.)上で電気泳動し、PVDF(Polyvinylidene fluoride)ポリビニリデンジフルオライド膜(ミリポア、Bedford、MA)にトランスファーした。PVDF膜は、Calbiochem(登録商標)から入手したラビット抗MMP−9ポリクローナル抗体(Calbiochem(登録商標)Biosciences, Inc.La Jolla, CA)(1:500)とともに終夜インキュベートした。PVDF膜を0.2%Tween20を含有するTris緩衝液で三回洗浄した。免疫複合体化タンパク質は、ウサギIgGに対するペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体(MP biomedicals, Inc.)との反応によって同定され、次に化学発光検出(Amersham,Piscataway,NJ)によって増幅された。
本発明のポリアミドがMMP−9タンパク質発現を抑制するかを調べるために、ウエスタンブロッティング分析を行った。本発明のポリアミド処理したMDA−MB−231細胞とDMSO処理したコントロールのMMP−9発現レベルを比較した。転写調節はMMP−9タンパク質発現に重要な役割を果たす。ウエスタンブロッティング分析は、HMMP9NFκβで処理したMDA−MB−231細胞で、MMP−9タンパク質の発現がHMMP9NFκβの濃度依存的に低下したことを示した。結果を図18に示す。
MDA−MB−231細胞は、6ウェルプレートの各ウェルに3.0×104となるよう播種した。2mlの10%FBS(In vitrogen)を含むRPMI1640培地にて37℃、5%、CO2で培養した。培養24時間後、MDA−MB−231細胞に蛍光標識ポリアミドHMMP9AP1(以下HMMP9AP1−FITCとも言う)及び蛍光標識ポリアミドHMMP9NFκβ(以下HMMP9NFκβ−FITCとも言う)を最終濃度10μMで成長培地に添加し2時間培養した。細胞は洗浄しFBSフリー培地を添加した。あらかじめ決められた時間(30分と96時間)において、生存細胞を×200の倍率で観察し4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。核はHoechst33342(In vitrogen Life Technologies, Corp., Carlsbad,CA)によって染色し、再度観察した。
HMMP9AP1−FITCは、MDA−MB−231細胞を培養している成長培地に添加された45分後すべての細胞で核での局在が観察された(データは示さない)。添加から96時間後であってもHMMP9AP1−FITCは、安定に核に存在することが確認された。また、HMMP9NFκβ−FITCは、添加された30分後すべての細胞の核での局在が観察された。添加から96時間後であってもHMMP9NFκβ−FITCは、安定に核に存在することが確認された。結果を図19及び図20に示す。
I.材料及び方法
MDA−MB−231及びHeLa細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。HeLa細胞を、2500細胞となるよう96穴マイクロタイタープレートに播種し、100μlの培地、10%子牛血清(Invitrogen)を含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)、にて24時間培養後、培地を交換し、0μMから30μM(0μM,0.3μM,1μM,3μM,10μM,30μM)のポリアミドHMMP9NFκβを含む10%子牛血清添加培地で72時間培養し、生細胞数測定試薬SF(Nacalai Tesque, Inc.)を10μlずつ添加し、2時間呈色反応を行い、ARVOマイクロタイタープレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。なお,当該実験は水溶性ホルマザンを用いたmodified MTT assay(WST−8TM: Nacalai Tesque, Inc.)で施行した。
ポリアミドHMMP9NFκβをMDA−MB−231細胞とHeLa細胞に添加することによって、濃度依存性に生細胞数の減少が見られた。このような結果は、本発明のポリアミドが制癌剤として有効であることを示唆する。結果を図25に示す。
I.材料及び方法
MDA−MB−231及びHeLa細胞を用いて抗NFκβ抗体による免疫沈降PCRアッセイを行った。MDA−MB−231及びHeLa細胞を100mm培養皿に播種し100μlの培地、10%子牛血清(Invitrogen)を含むDulbecco変性Eagle培地(DMEM)にて24時間培養後、1μMのマッチポリアミドHMMP9NFκβ及び1μMのミスマッチポリアミド(図26に示す。)とともに4時間培養した。蛋白−DNA複合物は1%formaldehydeで固定し、特異的NF−κBp65抗体と非特異的rabbit immunoglobulin G 抗体との反応を行い、抗体−蛋白−DNA複合物として、Protein A beadsで沈降させ回収した。蛋白−DNAの複合物は5M NaClで反応することによってDNAを分離し、MMP9NFκβ結合配列を挟むPCRプライマーで増幅反応を行った。MMP9遺伝子プロモータ領域のNFκβと結合したDNAが、PCR産物として同定される。
PCRプライマーは、フォワード: 5’−TGTCCCTTTACTGCCCTGA−3’(配列番号20), リバース: 5’−ACTCCAGGCTCTGTCCTCCTCTT−3’(配列番号21))を用い、MMP−9プロモータ領域(−657から−484)を増幅した。(Schwingshackl A, Duszyk M, Brown N, Moqbel R. HμMan eosinophils release matrix metalloproteinase-9 on stimulation with TNF-α. J Allergy Clin Immunol 104: 983-989, 1999).
MMP−9プロモーターのNF−κβ領域は、本発明のポリアミドで未処理及びミスマッチポリアミドで処理した場合には、抗NF−κβp65抗体によって免疫沈降された。しかしながら、NF−κβp65−NF−κβ結合領域複合体は、本発明のポリアミドMMP9NFκβで処理した場合には、上記免疫沈降アッセイで検出されなかった。結果は図27に示す。この結果は、in vivoにおいて、本発明のポリアミドMMP9NFκβがMMP−9プロモーター領域とNF−κβタンパク質の特異的な結合を阻害したことを示す。
I.材料及び方法
0.15mg蛍光標識ポリアミドHMMP9NFκβ(以下、HMMP9NFκβ−FITCとも言う)を最終濃度7.5mg/kgでマウスに尾静脈注射した。静脈注射後1日(24時間)、6日および21日目にマウスを解剖し、肝臓、脾臓、腎臓の各組織を採集し、冷凍切片を作製し4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した。核はHoechst33342(In vitrogen Life Technologies,Corp.,Carlsbad,CA)によって染色し、観察した。
FITC標識をしたポリアミドHMMP9NFκβは投与1日後肝臓、腎臓の細胞の核に多く取り込まれた。脾臓の細胞の核にも取り込まれた。また,添加後6日後でも、強いFITCの蛍光が認められた。さらに,6日でFITCの蛍光強度があまり減弱しない事より、ポリアミドHMMP9NFκβが細胞核内で非常に安定であることが示唆された。しかし21日後には、各組織の細胞でのFITCの蛍光強度は顕著に減弱しており、細胞核内でのDNAの結合は徐々に失われていくものと考えられた。これは他のポリアミド化合物と同様に、尿や胆汁よりポリアミドが排泄されることで説明できる現象であった。結果は図28に示す。
I.材料及び方法
5週齢の雄ヌードマウス(BALB/c Nude Mice CBy.Cg−Foxn1nu/J)(ジャクソンラボラトリー)を購入し、無病原体環境で6週齢まで維持し、実験に使用した。ヒト大腸がん細胞株HT29を100cm2細胞培養フラスコで単層培養し、コンフルエント前に0.05%trypsin、0.02%EDTA液で処理し、細胞を採取、800rpmで3分遠心後Ca2+、Mg2+を含まないPBSで洗浄し、1時間ポリアミド10μM濃度に調整した培養液もしくはポリアミドを含まない培養液で一時間培養後に再度100μl中3×106細胞となるようにPBSで細胞サスペンジョンを作製した。このようにしてHMMP9NFκβポリアミド含有、ミスマッチポリアミド含有及びポリアミド非含有PBSによる3群の細胞をそれぞれ6匹のヌードマウスに投与した。ヌードマウスは麻酔下に左側腹部皮膚に縦切開を入れ、腹膜を切開し、脾臓に達し、29ゲージの注射針を用い、脾臓被膜下に、上記大腸がん細胞サスペンジョンを100μl移植した(図29A)。細胞移植部の脾臓被膜を通した色調の変化及び出血、サスペンジョン液の漏出がないことで移植細胞の脾臓被膜下への確実な移入を確認した。移植後のマウスは、6週間飼育され、剖検を行った。肝臓と脾臓を摘出し、10%緩衝ホルマリン溶液で固定し、ヘマトキシリン・エオジン組織染色を行い、顕微鏡観察に供した。図29Bにそれぞれの群における転移巣数を示す。肝臓転移巣部分を標本中に円の中として示す。
全ての症例で大腸腺がん細胞の浸潤が脾臓の移植部に原発巣として、肝に転移巣として認められた。図29(B)に示されるように肝転移巣の数と大きさがHMMP9NFκβ群で明らかに少なく面積も小さいことが示された。これに対しポリアミド未処理群、ミスマッチポリアミド投与群では転移巣の大きさが大きく、転移巣同士の融合傾向が強く、転移巣の数も多い傾向が見られた(図29)。このことは、HMMP9NFκβポリアミドによりヌードマウスにおいて脾臓に移植されたヒト大腸がんの肝臓への転移が抑制されたことを示すものと考えられた。
結果は平均値±SEで表現した。統計的有意性はスチューデントt−検定により評価した。0.05未満のp値を有意であると判定した。
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配列番号10 センスプライマー
配列番号11 センスプライマー
配列番号12 フォワードプライマー
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配列番号18 フォワードプライマー
配列番号19 リバースプライマー
配列番号20 フォワードプライマー
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Claims (9)
- 更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項1に記載の薬剤。
- 血管新生、繊維化、又は細胞浸潤を含む病態、並びに浸潤性腫瘍、転移性腫瘍及び腫瘍血管新生から成る群から選択される、ヒトマトリックスメタロプロテネース9関連疾患の治療のための請求項1又は2に記載の薬剤。
- 制癌剤として用いるための請求項3に記載の薬剤。
- 更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項5に記載の薬剤。
- 血管新生、繊維化、又は細胞浸潤を含む病態、並びに浸潤性腫瘍、転移性腫瘍及び腫瘍血管新生から成る群から選択される、ヒトマトリックスメタロプロテネース9関連疾患の治療のための請求項5又は6に記載の薬剤。
- 制癌剤として用いるための請求項7に記載の薬剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬剤又は請求項5〜8のいずれか一項に記載の薬剤、及び薬剤として許容される担体を含む、ヒトマトリックスメタロプロテネース9遺伝子発現抑制のための医薬組成物。
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