JP2006022063A - Ｌｏｘ−１遺伝子発現抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＬＯＸ−１の遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
【解決手段】Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、レクチン様ＬＤＬ受容体−１（以下ＬＯＸ−１とも言う）遺伝子プロモーターの−１３０〜−１１（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
【選択図】なし

Description

本発明はレクチン様酸化低比重リポタンパク（ＬＤＬ）受容体−１（以下ＬＯＸ−１とも言う）遺伝子発現抑制剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤に関する。

心筋梗塞や脳梗塞という重篤な疾患の原因となる動脈硬化症の非常に重要な危険因子として、高脂血症、特に高コレステロール血症が挙げられる。動脈硬化の初期には、単球の血管内皮下への進入に先立って内皮障害が起こることが知られており、この障害はＬＤＬが変性を受けて生じる変性ＬＤＬ，特に酸化ＬＤＬが非常に重要な役割を果たしていることが知られている。酸化ＬＤＬは通常のＬＤＬ受容体とは結合せず、スカベンジャー受容体と結合して細胞内に取り込まれる。血管内皮細胞が酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを取り込むことはよく知られているので、これは既知の受容体とは異なる受容体を介する現象であることを示唆するものであった。この血管内皮細胞に発現する酸化ＬＤＬ受容体は、Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．によって同定された。彼らはウシ大動脈内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーからｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ法を用いて、酸化ＬＤＬと結合してこれを取りこむ受容体のクローニングに成功し、ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＬＯＸ−１）と命名した（非特許文献１）。

ＬＯＸ−１は動脈硬化の早期病変における内皮細胞に強い発現が見られるが、病変が進行すると内皮細胞における発現はむしろ減少し、内皮下に進入したマクロファージや血管平滑筋細胞における発現が増加し、また新生血管の内皮細胞にも発現が見られることが報告されている（非特許文献２）。ＬＯＸ−１は正常の血管内皮細胞には少量しか発現しないが、様々な刺激により発現が誘導される。上述のように動脈硬化性病変による発現のほか、ＰＭＡ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βのような炎症性サイトカイン（非特許文献３）、高血圧（非特許文献４）、血流に起因する物理的・機械的刺激（シェアストレス）（非特許文献５）によっても発現が誘導されることが報告されている。

ＬＯＸ−１を介する酸化ＬＤＬの取り込みが内皮細胞の機能障害に関与し、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘導し（非特許文献６）、またＭＣＰ−１の酸化ＬＤＬによる内皮での発現誘導がＬＯＸ−１のアンチセンスにより抑制されることも報告されている（非特許文献７）。

逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。

一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。

ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献８−１０）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。

このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献９−１０）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている（非特許文献１１）。

一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はインビトロ及びインビボの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合したＰｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した（非特許文献１２）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される（非特許文献１３）。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する（非特許文献１４−１６）。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモータにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する（非特許文献１４）。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる（非特許文献１５）。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する（非特許文献１６）。

特許第３０４５７０６号 特開２００１−１３６９７４ ＷＯ０３／０００６８３Ａ１ Sawamura et al: Nature 386, 73-77(1997) Kataoka et al: Circulation, 99, 3110-3117(1999). Minami et al: Biochem Biophys Res Commun, 272, 357-361(2000) Nagase et al: Biochem Biophys Res Commun, 237, 496-498(1997) Murase et al: Circ Res, 83, 328-333(1998) Cominacini et al: J Biol Chem, 275, 12633-12638(2000) Li et al: Circulation, 101, 2889-2895(2000) Trauger et al: Nature, 382, 559-61(1996) White et al: Chem Biol., 4, 569-78(1997) Dervan: Bioorg Med Chem., 9, 2215-35(2001) White at al: Nature, 391, 468-71(1998) Gottesfeld et al: Nature, 387, 202-5(1997) Dickinson et al: Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 12890-5(1998) Lee et al: Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 2570-5(1996) Dickinson et al: Biochemistry, 38, 10801-7(1999) Mapp et al: Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 3930-5(2000)

先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、ＬＯＸ−１の遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤又はＬＯＸ−１関連疾患の治療薬についての報告はない。

本発明者らは、ヒトＬＯＸ−１遺伝子プロモータの特定の領域に特異的に結合してヒトＬＯＸ−１遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＬＯＸ−１遺伝子プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、プロモータ領域の−２５０〜−１の領域のうち、１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｒｂｏｌ １２−ａｃｅｔａｔｅ反応領域（ＴＲＥ）、ＧＡＴＡ転写因子１（ＧＡＴＡ−１）、カタボライト遺伝子アクチベータータンパク質（ＣＡＰ）、ｐ遺伝子（ｐ ｇｅｎｅ）結合領域を含む領域に結合する化合物が、ＬＯＸ−１プロモータの活性を有意に阻害し、培養細胞においてＬＯＸ−１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。
（１） Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、レクチン様ＬＤＬ受容体−１（以下ＬＯＸ−１とも言う）遺伝子プロモーターの−１３０〜−１１（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（２） 更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（３） 前記標的領域がＬＯＸ−１遺伝子プロモーターの塩基配列−６２〜−５５（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（４） 前記標的領域がＬＯＸ−１遺伝子プロモーターの塩基配列−５２〜−４５（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（５） 前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（４）のいずれか一項記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（６） 前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（１）〜（５）のいずれか一項記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
（７） 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（２）又は（３）記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。

（８） 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（２）又は（４）記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。

（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。

本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤を得ることができる。

発明を実施するための形態

本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。

例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。

上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。

アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。

固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。

本発明のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＬＯＸ−１遺伝子プロモーターの−２５０〜−１の領域、好ましくは−１３０〜−１１の領域、より好ましくは−６２〜−５５又は−５２〜−４５の領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。

通常ＤＮＡのらせんの骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。

ヒトＬＯＸ−１遺伝子調節領域の塩基配列は図１及び配列番号１に示す通りである（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９，１７７−１８４（１９９９））。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ３１０２及びＧＢＰ３１０３は下記に示す通りである。

ＧＢＰ３１０２は、分子式Ｃ_８９Ｈ_１０７Ｎ_３３Ｏ_１７、分子量１９１１．０１を有し、その標的配列はＬＯＸ−１遺伝子調節領域の−２５０〜−１の領域のうち、ＣＡＰ結合領域、ｐ ｇｅｎｅ結合領域、及びＴＲＥを含む−１３０〜−１１（配列番号２）の領域であり、直接的にはｇａｔｔｇａｇｔ（−６２〜−５５）（配列番号３）の８塩基に結合することにより、ヒトＬＯＸ−１遺伝子の発現を抑制する。
ＧＢＰ３１０３は、分子式Ｃ_９０Ｈ_１０８Ｎ_３２Ｏ_１７、分子量１９１０．０３を有し、その標的配列はＬＯＸ−１遺伝子調節領域の−２５０〜−１の領域のうち、ＴＲＥ、ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ転写因子１）結合領域、及びＣＡＰ（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、カタボライト遺伝子アクチベータータンパク質、ｃＡＭＰ受容体蛋白質）結合領域を含む−１３０〜−１１（配列番号２）の領域であり、直接的にはｔｔｃｔｔｃｔａ（−５２〜−４５）（配列番号４）の８塩基に結合することにより、ヒトＬＯＸ１遺伝子の発現を抑制する。

Ｐｙ−Ｉｍポリアミドはインビトロ研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である（非特許文献１２〜１６）。特異的なポリアミドでショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりするが、これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である。（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：１０１３−２４；Ｊａｎｓｓｅｎ ａｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００；６：９９９−１０１１．）。本発明者らはＬＯＸ−１プロモータの特定の断片を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性をヒト臍帯静脈由来培養血管内皮細胞において示す。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。

最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｄｅｃ ２０；６７（６）：１２４１−５０；Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０；
Ｃｏｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８．）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている（非特許文献１３、１４）。

プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１；５：２）３−８；ＭｃＫｅｏｗｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５；Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０；Ｋｏｚａｋ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ ）ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５．）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９．）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはＬＯＸ−１遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。

本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがＬＯＸ−１遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。

Ｉ．材料及び方法
（１）ＬＯＸ−１プロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ＬＯＸ−１プロモータの−６２〜−５６又は−５２〜−４６の塩基対に結合するように、上記のようなＧＢＰ３１０２又はＧＢＰ３１０３を設計した。

（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
ＦＩＴＣカップリング： ４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。

一般的手順： Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。

カルボン酸としての分解： 合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解： 合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製： 最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。

ＧＢＰ３１０２は元素分析の結果、Ｃ：５５．９４、Ｈ：５．６４、Ｎ：２４．１９、Ｏ：１４．２３という測定値を得た。質量分析スペクトルを図２に示す。
ＧＢＰ３１０３は元素分析の結果、Ｃ：５６．５９、Ｈ：５．７０、Ｎ：２３．４７、Ｏ：１４．２４という測定値を得た。質量分析スペクトルを図３に示す。

（３）ＨＵＶＥＣ（ヒトさい帯静脈由来血管内皮細胞）培養
ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞をＣａ^２＋，Ｍｇ^２＋フリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのトリプシン処理により継代し、７５ｍｍ^２組織培養フラスコで培養した。培地は４〜５日毎に交換し、５〜１０継代の間の細胞について実験を行った。

（４）ＬＯＸ１ｍＲＮＡ発現量の同定のためのＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応）
培養細胞をＰＢＳで洗浄し、１０００μＬ Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解、１００μＬのクロロホルムと混合、遠心分離し、上部水相を等体積のイソプロパノールと混合してＲＮＡを沈澱させた。ＲＮＡの沈殿を５００μＬの７５％エタノールで二回洗浄し、乾燥後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
６５℃で１５分間変性させた後、ＲＮＡ試料を室温で４５分間、０．５ｍｌのＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中、０．５Ｕ ＤＮアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）で処理した。ＤＮアーゼは０．５ｍＬ ０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによって不活化した。

等量のＲＮＡ（１μｇ／２０μＬ反応液）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ デオキシＮＴＰ、及び２．５μＭランダムヘキサマー中、２．５Ｕ／２０μＬトリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写させた。２μＬの希釈ｃＤＮＡ生成物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々０．２μＭとともに混合し合計２５μＬとした。センスプライマー（５’−ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣ−３’）（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴ−３’）（配列番号６）をＬＯＸ１ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ヒト１８ＳリボゾームＲＮＡについてセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３’）（配列番号７）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号８）を内部対照として使用した。ＰＣＲはサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ条件は９４℃２分の初期変性、次いで３０サイクルの変性９４℃１分、アニーリング５８℃１分、伸張７２℃１分を行い、最後に７２℃１０分の伸張反応を行うものであった。１８Ｓ ｒＲＮＡについてのプライマーによるＰＣＲを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノムＤＮＡがＰＣＲによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しなかった。ｍＲＮＡの半定量的分析のために、ＰＣＲ産物が検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。標的ｍＲＮＡの各々に対応するＰＣＲ産物の量は２０〜３５サイクルで直線的に増加した。ＰＣＲ産物はＢｉｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量した。

（５）統計解析
結果は平均値±ＳＥＭで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデントｔ検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとした。
（６）合成ポリアミドによるＨＵＶＥＣでのＬＯＸ１ｍＲＮＡの阻害
インビボにおけるＬＯＸ１遺伝子の発現に対するポリアミドの効果を観察するために、培養ＨＵＶＥＣを１０^−７Ｍ ＰＭＡおよび１０^−６Ｍ〜１０^−９Ｍのポリアミドとともに６時間インキュベートし、ＬＯＸ１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析した。ＰＭＡを陽性対照として用いた。１０^−７Ｍ ＰＭＡはＬＯＸ１ｍＲＮＡの発現を有意に刺激した。本発明のポリアミドはＰＭＡにより誘導されたＬＯＸ１ｍＲＮＡの発現を有意に阻害した。
以下に、本発明のポリアミドとしてＧＢＰ３１０２及びＧＢＰ３１０３を用いたＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果の実験例を示す。

ＩＩ． ＧＢＰ３１０２によるＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
ヒト臍帯静脈由来培養血管内皮細胞を培養し、１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡ（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）を添加して刺激し、Ｐｙ−ＩｍとしてＧＢＰ３１０２を加えて，そのＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。細胞を、サブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えて更に１２時間無血清で培養した。細胞からｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、これにａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより定量した。ＬＯＸ−１遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＬＯＸ−１遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。ＬＯＸ−１遺伝子発現量は１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡ刺激により３倍以上に増加し、ＧＢＰ３１０２の添加により１ｘ１０^−６Ｍで約５０％に抑制された（図４）。

ＩＩＩ． ＧＢＰ３１０３によるＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
ヒト臍帯静脈由来培養血管内皮細胞を培養し、１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡ（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）を添加して刺激し、Ｐｙ−ＩｍとしてＧＢＰ３１０３を加えて，そのＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。細胞を、サブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えて更に１２時間無血清で培養した。細胞からｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、これにａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより定量した。ＬＯＸ−１遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＬＯＸ−１遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。ＬＯＸ−１遺伝子発現量は１ｘ１０^−７ＭのＰＭＡ刺激により３倍以上に増加し、ＧＢＰ３１０３の添加により１ｘ１０^−６Ｍで約３０％抑制された（図５）。

本発明のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤はＬＯＸ−１の産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。

ヒトＬＯＸ−１遺伝子の調節領域の塩基配列を示す。 本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ３１０２の質量分析スペクトルを示す。 本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ３１０３の質量分析スペクトルを示す。 ＧＢＰ３１０２によるＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。 ＧＢＰ３１０３によるＬＯＸ−１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。

配列番号５ センスプライマー
配列番号６ アンチセンスプライマー
配列番号７ センスプライマー
配列番号８ アンチセンスプライマー

Claims (9)

1. Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１（以下ＬＯＸ−１とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−１３０〜−１１（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
2. 更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
3. 前記標的領域がＬＯＸ−１遺伝子プロモーターの塩基配列−６２〜−５５（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
4. 前記標的領域がＬＯＸ−１遺伝子プロモーターの塩基配列−５２〜−４５（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
5. 前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している請求項１〜４のいずれか一項記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
6. 前記アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである請求項１〜５のいずれか一項記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
7. 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２又は３記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
   
8. 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２又は４記載のＬＯＸ−１遺伝子発現抑制剤。
   
9. 下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。