KR20190055256A - 히프 1-알파 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 HIF-1α 프리-mRNA의 일부분을 표적으로 하는 펩티드 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명의 펩티드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 HIF-1α mRNA의 스플라이스 변형체의 생성을 강력하게 유도하며, HIF-1α의 과발현에 연관된 징후 또는 질환을 안전하게 치료하는 데 유용하다.

Description

히프 1-알파 안티센스 올리고뉴클레오티드
본 발명은 히프 1-알파의 프리-mRNA를 표적으로 하여 히프 1-알파에 연관된 징후 또는 질환을 치료하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이다.
저산소증 유도인자 1-알파는 (HIF-1α, Hypoxia-inducible factor 1-α) 포유류의 세포에 산소가 부족한 상태에서 발현되는 데 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 92(12), 5510-5514 (1995)], 세포에서 뿐만 아니라 온 몸에 걸쳐서 산소의 항상성을 조절하는 중요한 역할을 한다 [Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. vol 15, 551-578 (1999)]. HIF-1α는 적혈구생성소 (EPO, erythropoietin), 혈관내피성장인자 (VEGF), 고리형 산소화효소 2 (COX-2), 그리고 당분 전달자 (GLUTs) 등을 포함하는 60여 개 유전자 산물의 전사를 유도하며 [Trends Mol. Med. vol 8, S62-67 (2002); Nature Rev. Cancer vol 3, 721-732 (2003); J. Biol. Chem. vol 276, 9519-9525 (2001)], 저산소 환경에 대응하는 주 스위치 역할을 한다.
HIF-1α는 다양한 생리학적 혹은 병리학적 상황에 관련되어 있다. 예를 들면, 혈관신생 인자로 잘 알려진 VEGF를 유도하고 EPO 발현을 통해 적혈구 생성을 촉진하며, 세포의 증식과 생존에 관련된 유전자의 전사를 유도한다 [Exp. Mol. Med. vol 36(1), 1-12 (2004)].
HIF-1α는 HIF-1α (또는 HIF1A) 유전자에 암호화되어 있으며, 전사인자인 이질이합체 HIF-1의 서브유닛이다. 정상 산소 조건에서 HIF-1α 단백질의 양은 프롤릴히드록실라제 2에 (PHD2) 의한 프롤린 기의 수산화를 통해서 조절된다 [EMBO J. vol 22(16), 4082-4090 (2003)]. 폰 힙펠-린도우 (VHL) 암억제 단백질은 수산화된 HIF-1α를 인식하고 결합하여 HIF-1α는 유비퀴틴화되고 프로테아좀에 의해 분해된다. 저산소 조건에서는 PHD2가 비활성화되어 프로테아좀에 의한 HIF-1α 분해는 억제되어 HIF-1α의 양은 증가한다 [Endocrine-Related Cancer vol 13, S61-S75 (2006)].
종양에서의 HIF-1α 발현: 저산소증은 종양 미세환경의 특징이다. 종양이 빠르게 성장하면서 종양 덩어리의 어떤 부분들은 혈관이 모자라게 되어 암 내에 저산소 미세환경이 생성된다. 종양 세포 내부의 저산소증은 종양 세포를 변화시켜 화학 요법에 대한 저항력이 커지고 전이를 일으키게도 한다. 저산소증에 대한 이러한 종양 세포 변화중의 하나는 종양 세포에서 HIF-1α 단백질 양의 증가이다.
문헌에 의하면, HIF-1α는 원발성 종양과 전이 종양에서 과발현된다. 인간 암에서 HIF-1α의 발현 양은 종양 세포 내의 혈관신생과 치사율에 연관되어 있다 [Cancer Res. vol 61, 2911-2916 (2001); Clin. Cancer Res. vol 7, 1661-1668 (2001); Cancer Res. vol 60, 4693-4696 (2000); Am. J. Pathol. vol 157, 411-421 (2000); Cancer Res. vol 59, 5830-5835 (1999)].
HIF-1α 발현 양이 많은 (T1/T2) 단계의 유방암 환자는 무병생존과 (DFS, disease-free survival) 무전이생존의 (DMFS, distant metastasis-free survival) 기간이 짧은 데, 고 위험 유방암 환자 군에서 암 세포 내의 HIF-1α 양이 예후 판단에 좋은 근거가 될 것이다 [Breast Cancer Res. vol 6(3), R191-R198 (2004)]. HCT116 인간 대장암 세포에서 저산소증 혹은 HIF-1α의 과 발현은 대장암 세포가 마트리겔 (Matrigel)로 침투하는 것을 조장한다. 이러한 전이는 HIF-1α 작은 간섭 리보핵산을 (siRNA) 이용하여 저해되었으며 [Cancer Res. vol 63, 1138-1143 (2003)], HIF-1α 억제제는 암 전이의 억제에 유용할 것이다.
HIF-1α의 저분자 억제제: 전사 인자인 HIF-1α의 발현이나 그 기능의 활성을 저해하는 저분자 억제제들은 HIF-1α의 발현이나 그 기능의 활성에 간접적으로 영향을 미치는 데, 그 많은 예들은 다음과 같다 [Endocrine-Related Cancer vol 13, S61-S75 (2006); Oncotarget vol 7(7), 8172-8183 (2016)].
미세소관 (microtubule) 억제제인 택솔 (taxol), DNA 회전효소 (topoisomerase) I 억제제인 토포테칸 (topotecan), 그리고 히스톤 탈아세틸화 효소 (histone deacetylase) 억제제인 FK228은 미지의 기전을 통해서 HIF-1α 단백질의 발현을 억제한다. DNA 회전효소 II 억제제인 안트라사이클린은 (anthracycline) HIF-1α mRNA의 양을 감소시켜서 HIF-1α을 억제한다. 열 충격 단백질 90 (HSP90, heat shock protein) 억제제인 겔다나마이신은 (geldanamycin) HIF-1α 단백질을 불안정하게 하거나 HIF-1α이 DNA에 결합하는 것을 억제한다. 전사활성화인자 P300 CH1 억제제인 케토민은 (chetomin) HIF-1이 전사를 활성화하는 것을 억제한다. 프로테아좀 (Proteasome) 억제제인 보르테조밉은 (bortezomib) 미지의 기전을 통해서 HIF-1α의 활성을 억제한다. PI3K (Phosphoinositide 3-kinases) 억제제인 wortmanin, 포유류 라파마이신 표적 (mTOR, mammalian target of rapamycin) 억제제인 라파마이신, 콕스-2 억제제인 셀레콕시브, 티로신키나제 억제제인 제니스테인, 그리고 erbB2 단일클론항체인 트라스투주맙은 (trastuzumab, herceptin) HIF-1α mRNA의 복사를 막는다. 그러나 이러한 억제제들은 HIF-1α 경로에 선택적으로 작용하지 않기 때문에, HIF-1α의 억제를 이용한 치료제로서 평가하기 어렵다.
리보솜 단백질 합성: 단백질은 DNA에 있는 암호에 의해 합성된다. 핵에서 DNA로부터 전사된 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 결과적으로 생성된 m-RNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO, Antisense Oligonucleotide): RNA에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드라고 부르는 데, ASO는 mRNA 혹은 프리-mRNA와 강하게 결합할 수 있다.
mRNA에 강하게 결합하는 ASO는, 세포질에서 mRNA의 정보에 따른 리보솜의 단백질 합성을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 세포질 내에 있어야만 한다.
프리-mRNA에 강하게 결합하는 ASO가 프리-mRNA의 스플라이싱 과정을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 핵 내에 있어야만 한다.
비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오티드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈 (nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 올리고뉴클레오티드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)], 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오티드 중 몇몇의 화학 구조가 하기에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 예측한대로 결합한다.
Figure pct00001
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 (PTO, Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터가 (transporter) 많이 발현된 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]. PTO의 세포 투과성을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 세포 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
지난 30여년간 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역 질환, 대사성 질환 등을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 대부분의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포 투과성 부족으로 인하여 성공하지 못하였다. PTO의 세포 투과성 부족을 극복하기 위해서는, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 보체 활성화 (complement activation), 신장 독성 (tubular nephropathy), 쿠퍼 (Kupffer) 세포 활성화, 그리고 비장 비대, 비장 림프구 증식증, 단핵세포 침윤과 같은 면역 자극 등의 다양한 독성을 유발한다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장과 관련된 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센 (Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation vol 118, 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 DNA 혹은 RNA에 대한 핵산 결합력을 증가시키기 위하여 RNA의 리보스 (ribose) 고리 골격을 구조적으로 제한한 핵산이다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO, Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스 (2-deoxyribose)와 포스페이트 (phosphate)가 각각 포스포로다이아미데이트 (phosphodiamidate)와 모폴린 (morpholine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 중성이다. 따라서 PMO와 RNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 RNA의 결합은 DNA와 mRNA 사이의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터 (hepatic transporter)에 의해 인식되지 않지만, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸)글리신 을 단위 골격으로 갖는 폴리펩티드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 아래 그림에 도시되었다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
Figure pct00002
PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 띠지 않은 중성이기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않으며, PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 갖고 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, (2003)].
변형된 핵산 염기로 세포투과성을 높인 PNA: 양이온성 지질 (cationic lipid)이 핵산 염기에 공유 결합으로 연결된 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산 염기의 화학 구조는 다음과 같이 제공된다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 상보적이며 예측한대로 결합한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 리포펙션 (lipofection)과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 올리고뉴클레오티드 자체에 비해 세포막 투과가 용이하다.
Figure pct00003
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 상보적인 DNA와 듀플렉스 (duplex)를 형성할 때 4~5개의 변형된 핵산 염기가 도입된 11~13머 (11~13-mer)의 PNA는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC 이상 높은 Tm 값을 보인다. 또한, 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합 (mismatch)에도 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 순서에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
HIF-1α ASO: HIF-1α의 저분자 억제제와 달리, HIF-1α mRNA를 상보적으로 표적하는 ASO는 리보솜에 의한 HIF-1α 단백질의 합성을 서열 특이적으로 억제할 수 있다.
두 개의 PMO형 25머 HIF-1α ASO들의 손톱개구리에 (Xenopus) 인공적으로 구축된 HIF-1α mRNA의 번역에 대한 억제력을 평가하였다. 손톱개구리의 배아에 주입된 40 ng의 각각의 PMO형 ASO들은 HIF-1α의 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다 [J. Biol. Chem. vol 283(17), 11841-11849 (2008)].
RX-0047은 강력한 PMO형 HIF-1α ASO인 데, 다양한 세포주들에서 HIF-1α에 대한 억제력이 평가되었다. 인체 유방암 세포 (MDA-MB-231), 전립선암 세포 (PC3), 그리고 폐암 세포에 (A549) 리포펙션 (lipofection) 처리한 RX-0047은 생체외에서 (in vitro) IC50가 1.9~4 nM 정도의 활성으로 HIF-1α의 발현을 억제하였다. 또한 미시간 대학교 신장암 세포에서는 (UMRC2) 서열특이적으로 HIF-1α의 발현을 억제하였고, 30 mg/Kg을 복강내 주사한 RX-0047은 쥐의 폐암 세포에서 전이를 억제하였으며, 30 mg/Kg의 RX-0047은 누드마우스의 이종이식 모델에서 종양의 성장을 억제하였다 [J. Cell. Biochem. vol 104, 985-994 (2008)].
EZN-2968은 HIF-1α mRNA의 암호영역을 (coding region) 표적하는 LNA 유도체로 생체 외에서뿐 아니라 생체 내에서도 (in vivo) 리보핵산가수분해효소 H에 의한 HIF-1α mRNA의 절단을 유도하여 HIF-1α 단백질의 발현을 억제한다. 50 mg/Kg을 일주일에 두 번 복강 내 주사한 누드마우스의 이종이식 전립선 암 세포에서 (DU145) 종양의 성장을 현저하게 억제하였다 [Mol. Cancer Ther. vol 7(11), 3598-3608 (2008)].
EZN-2968은 난치성의 악화된 고형 종양을 갖고 있는 작은 수의 암 환자에 대해 평가되었다. 18 mg/Kg의 EZN-2968을 정맥내 주입 방식으로 일주일에 한 번 투약된 환자를 종양 생체 검사했을 때, 6명 중 4명에서 HIF-1αmRNA의 양이 감소하였지만, 임상시험은 의뢰자에 의해 중단되었다 [Cancer Chemother. Pharmacol. vol 73(2), 343-348 (2014)].
EZN-2968은 인간 암 환자에 대해 평가된 HIF-1αASO의 아주 드문 예이다. 제한된 세포투과성으로 인하여, 다른 올리고뉴클레오티드 치료제와 마찬가지로 EZN-2968의 치료용량은 (therapeutic dose) 높은 편이다. DNA나 RNA 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 치료제의 용량 제한적인 독성을 (dose limiting toxicity) 극복하기 위해서는 HIF-1α를 표적하는 올리고뉴클레오티드 치료제의 세포투과성을 향상시켜야 한다.
작은 간섭 RNA (siRNA, Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질의 상호 작용으로 형성된 “RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체”(RISC)는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합하여 mRNA를 절단함으로써 mRNA에 의한 단백질의 발현을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 또는 생체내 효과가 잘 나타나지 않는다.
HIF-1α의 siRNA: 세포에서 HIF-1α의 발현을 하향 조절하는 HIF-1α siRNA의 예는 아주 많다. 그러나 일반적으로는 siRNA 분자들이 효과적으로 세포에 전달된 경우에만 생체외 억제 효과가 관찰되었다. 예를 들면, 결장암 세포에 (HCT116) 리포펙션 처리한 100 nM의 HIF-1α siRNA는 저산소증 조건에서 HIF-1α 단백질뿐만 아니라 HIF-1α mRNA의 양도 현저하게 감소시키는 것으로 발견되었다. 이러한 siRNA는 VEGF와 TGF-α 등과 같은 HIF-1 표적 단백질이나 mRNA의 발현량의 변화도 유도하였다 [Cancer Res. vol 63, 1138-1143 (2003)].
신경교종 세포에 (U251MG와 U343MG) 리포펙션 처리한 75 nM의 HIF-1α siRNA는 저산소증이나 정상산소증 조건 모두에서 HIF-1α의 발현을 현저하게 감소시켰다 [BMC Cancer 10:605 (2010)].
인간 HIF-1α mRNA를 표적하는 siRNA의 양이온성 마이셀 나노입자들은 쥐에 이종이식한 전립선암 세포에서 (PC3) 종양의 성장을 현저히 억제하였다. 또한 HIF-1α siRNA의 나노입자들은 독소루비신을 (doxorubicin) 같이 처리했을 때 이종이식한 전립선암 세포에서 (PC3) 더 큰 항 종양 효과를 나타냈다 [Mol. Pharmaceutics vol 9(10), 2863-2874 (2012)].
HIF-1α siRNA와 RGD 표적 다기능 지질 ECO ((1-aminoethyl)iminobis [N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide])의 나노입자들의 항 종양 및 항 혈관신생 효과를 쥐에 이종이식한 대장암 세포에서 (HT-29) 평가하였다. 성분 배합된 HIF-1α siRNA 2 mg/Kg을 3주 동안 3일에 한 번 정맥 주사한 결과 종양의 성장이 50% 억제되었다. MRI 평가에 의하면 종양의 혈관분포가 현저히 감소하였고 종양 내의 혈류가 70% 감소하였다. 또한 HIF-1α와 유관 단백질인 VEGF, GLUT-1, 그리고 탄산무수화효소 (CA9) 등이 현저히 감소하였다 [Mol. Pharmaceutics vol 13(7), 2497-2506 (2016)].
프리-mRNA의 스플라이싱: DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사된다 (transcription). 도 13에 요약된 바와 같이, "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거함으로써 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. vol 72, 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. vol 6, 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. vol 15, 108-121 (2014)].
스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 접속 인자의 초기 복합체인 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성으로 시작된다. 작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35은 인트론 N과 엑손 (N+1) 연결 부위에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 작업이 진행된다.
안티센스의 스플라이싱 저해: ASO가 핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합하면, ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 저해 혹은 조절하여 표적한 엑손이 결여된 mRNA를 만들게 된다. 이러한 mRNA는 접합부 변형체 또는 스플라이스 변형체 (splice variant)라고 불리며 원래의 단백질보다 짧은 길이의 단백질을 생성한다.
스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 저해하면 스플라이싱을 막을 수 있을 것이라 예상되는 데, 실제로 ASO가 (5'
Figure pct00004
3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 ASO는 프리-mRNA와 U1의 결합을 막고 결과적으로 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다. 이와 유사하게 ASO가 (5'
Figure pct00005
3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다.
HIF-1α 프리-mRNA의 안티센스 엑손 스키핑: 현재까지, HIF-1α 프리-mRNA의 스플라이싱을 저해하여 엑손 스키핑을 일으키는 ASO는 보고된 바 없다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00006
화학식 I 중에서,
n은 10와 26 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00007
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과, 더 좋게는 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00008
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 (deuterido), 수소 (hydrido), 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실 (acyl), 치환체가 있거나 없는 설포닐 (sulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl), 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는 (더 좋게는 최소한 네 개는), 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 전형에서는, S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떤 전형에서는, X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떤 전형에서는, Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, 화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 한다. 어떤 전형에서는, 화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 부분적으로 상보적인 결합을 한다, 예를 들면, 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 갖는다.
화학식 I의 화합물은 인간의 HIF-1α 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 유도하여 "엑손 2"가 결여된 인간 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체를 형성하며, HIF-1α의 활성과 관련된 고형 종양이나 질환을 치료하는 데 유용하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00009
화학식 I 중에서,
n은 10와 26 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00010
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과, 더 좋게는 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00011
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는 (더 좋게는 최소한 네 개는), 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 전형에서는, S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떤 전형에서는, X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 어떤 전형에서는, Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
어떤 전형에서는, 화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 한다. 어떤 전형에서는, 화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 부분적으로 상보적인 결합을 한다, 예를 들면, 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 갖는다.
화학식 I의 화합물은 인간의 HIF-1α 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 유도하여 "엑손 2"가 결여된 인간 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체를 형성하며, HIF-1α의 활성과 관련된 고형 종양이나 질환을 치료하는 데 유용하다.
“n은 10과 26 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 그리고 25 중에서 선택된다"는 것이다.
화학식 I의 화합물은 인간 HIF-1α 유전자에서 [NCBI Reference Sequence: NG_029606.1] 유래된 인간 HIF-1α 프리-mRNA의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치와 강하게 결합한다. [(5'
Figure pct00012
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU]는 인간 HIF-1α 프리-mRNA 20머 서열인 데, 10머는 "인트론 1"에 그리고 10머는 "엑손 2"에 속해 있으며, 엑손과 인트론 번호들은 보고된 HIF-1α mRNA 전사 결과에 따라 다를 수 있다. 20머 프리-mRNA 서열을 제공하는 것은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 내에서 표적하는 3' 스플라이스 위치를 명백히 하기 위함이다.
20머의 프리-mRNA 서열은 [(5'
Figure pct00013
3') uguuaaguag┃GAUAAGUUCU]로 표시하기도 하는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 인트론과 엑손의 연결 부분을 나타낸다. 따라서 본 발명의 화학식 I의 화합물을 서술하기 위한 14머 프리-mRNA [(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]는 [(5' → 3') uaaguag┃GAUAAGU]로 표시될 수도 있다.
화학식 I의 PNA 유도체는 인간의 HIF-1α 프리-mRNA에서 표적인 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여 표적 스플라이스 위치를 포함하는 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 방해한다. 화학식 I의 PNA 유도체는 표적 스플라이스 위치를 포함하는 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 입체적으로 방해하기 때문에, HIF-1α 엑손 2는 잘라져 나가게 되어 엑손 2가 결여된 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체 혹은 변형체들이 생성된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 HIF-1α 엑손 2의 스키핑을 유도한다. 결과적으로 생성된 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체 혹은 변형체들은 완전한 HIF-1α 단백질의 기능성을 결여한 HIF-1α 단백질 변형체 혹은 변형체들을 생성하게 된다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 화학식 I의 PNA 유도체들과 상보적인 DNA나 RNA와의 이중나선의 (duplex) Tm 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 Tm 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다. 화학식 I의 PNA 유도체들과 10머 정도의 짧은 길이의 상보적인 DNA와의 이중나선의 Tm 값도 상당히 높다. 강한 결합력으로 인하여, "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치와 10머 정도의 짧은 상보적인 결합을 하는 본 발명의 PNA 유도체는 세포 내에서 HIF-1α "엑손 2"의 스키핑을 강하게 유도한다.
화학식 I의 PNA 유도체들은 상보적인 표적 HIF-1α 프리-mRNA 서열에 대해 강한 결합력을 가지고 있으며, 표적 HIF-1α 프리-mRNA 서열에 대해 한두 개의 염기 부정합을 가지고 있는 화학식 I의 PNA 유도체들도 충분히 강한 결합력을 가지고 있어서 스플라이싱을 방해한다. 예를 들면, [(5' → 3') aaguag┃GAUAAGUU]라는 14머인 화학식 I의 PNA 유도체는 14머 HIF-1α 프리-mRNA와 12머만 상보적인 결합을 하고 두 개의 염기 부정합을 가지고 있지만 HIF-1α "엑손 2"의 스키핑을 유도한다. 그렇지만, 다른 프리-mRNA에 결합하는 것을 피하기 위해서는 표적 프리-mRNA 서열에 대해 너무 많은 염기 부정합이 존재하는 것은 바람직하지 않다.
화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기의 구조는 아래에 예시되어 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
본 발명의 천연 (천연에 존재하는) 또는 비천연 (천연에 존재하지 않는) 핵산염기는 위에서 제공된 핵산염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 천연 혹은 비천연 핵산염기들은 단지 화학식 I의 화합물에 허용되는 핵산염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 본 발명의 표적 프리-mRNA 서열에 상보적이면서도 화학식 I의 PNA 화합물의 특정 부분을 이용한 천연 혹은 비천연 핵산염기의 변형을 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들이 다음과 같이 예시되며, 치환체가 있거나 없는 알킬의 예들이 아래에 제공된다.
Figure pct00017
치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예들이 아래에 예시된다.
Figure pct00018
치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환된 아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 또는 아릴설포닐의 예가 아래에 보여진다.
Figure pct00019
치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 또는 아릴옥시카보닐과 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 또는 아릴아미노카보닐의 예들이 아래에 제공된다.
Figure pct00020
치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐을이 아래에 제공된다.
Figure pct00021
제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 화학식 I의 화합물에 허용되는 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 PNA 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA 서열에 서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 PNA 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수해서 올리고뉴클레오티드 "그 자체"를 처치해도 세포 내에 쉽게 전달된다. 따라서 본 발명의 화합물 "그 자체"를 처리한 세포에서, 인간 HIF-1α 프리-mRNA에 있는 "엑손 2"의 스키핑을 유도하여 "엑손 2"가 결여된 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 화학식 I의 화합물 "그 자체"를 처리한 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해서 적은 양의 전체 길이 HIF-1α mRNA나 HIF-1α 단백질이 발현된다. 마찬가지로, 전신성으로 투여한 화학식 I의 화합물 "그 자체"는 고형 종양 조직에서 HIF-1α의 발현을 억제한다. 따라서 화학식 I의 화합물은 고형 종양이나 HIF-1α의 과도한 발현과 연관된 질환의 치료에 유용하다.
화학식 I의 화합물은 의도한 치료적 혹은 생물학적 활성을 위하여 표적 조직으로의 전신성 전달을 증가시키기 위한 침습성의 제제가 (formulation) 따로 필요 없다. 화학식 I의 화합물은 보통, 인산완충식염수나 (PBS) 소금물에 녹인 후 전신성으로 투여하면 표적 조직에서 원하는 치료적 (예를 들면 항 종양) 혹은 생물학적 활성을 나타낸다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 수산화 칼륨 (potassium hydroxide), 염산 (hydrochloric acid), 메탄설폰산 (methanesulfonic acid), 구연산 (citric acid), 그리고 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 화합물이나 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (tartaric acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜 (polypropyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (isopropanol), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 증류수, 그리고 방부제 (preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 화합물은 치료상의 효과를 위해 1 펨토몰 (1 fole/Kg)에서 1 나노몰 (1 nmole/Kg) 이상의 양으로 전신성 투여를 할 수 있는데, 그 양은 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다.
화학식 I의 화합물은 치료상의 효과를 위해 1 아토몰 (1 aM)에서 1 나노몰 (1 nM) 이상의 농도로 국소 투여를 할 수 있는데, 그 농도는 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
n은 10와 26 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00022
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함하는 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10와 26 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00023
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함하는 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노 [-NH2], 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬, 수소, 하이드록시, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
Figure pct00024
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
Figure pct00025
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 16 사이의 정수이다.
본 발명의 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 23 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00026
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
본 발명의 특히 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00027
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 12와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00028
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 더 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 12와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00029
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 11개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
본 발명의 가장 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 12와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00030
3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 12개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물이 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, CH2-O-(CH2)5-, -CH2-O-(CH2)6-, 또는 -CH2-O-(CH2)7- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
본 발명의 PNA 유도체 중 특별히 중요한 것으로서 다음 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH2;
(N → C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) n-Propyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Benzyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G(3)-AA(5)C- TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)- TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) N-Ph-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(2O2)A-C(1O5)TT-A(3)TC-CTA(5)-C(1O3)T-NH2;
(N → C) Benzoyl-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH2;
(N → C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)GA-AC(1O2)T-TG(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-CA-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-AT-NH2;
(N → C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;
(N → C) Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
(N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T- A(6)CT-TA(6)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-G-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(1O2)T- AC(1O5)T-TA(6)A-C-NH2; 그리고
(N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CCT-AC(1O5)T- TAA-CA(2O2)A-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.
Figure pct00031
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; " Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-";"-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00032
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 10와 26 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00033
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 10와 26 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬, 수소, 하이드록시, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 16 사이의 정수이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00034
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 11와 21 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 하이드록시 및 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00035
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 11와 19 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소 및 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아민이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00036
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 11와 19 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소 및 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00037
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 11와 19 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소 및 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음과 같은 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
화학식 I 중에서,
화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
Figure pct00038
3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
n은 11와 17 사이의 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 아실이며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, 또는 -CH2-O-(CH2)3-이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-CA(5)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-CG(6)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
(N → C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Benzoyl-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T- TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
(N → C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
(N → C) Ac-AG(5)A-A(2O3)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Lys-NH2;
(N → C) Benzoyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Ac-HEX-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fmoc-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Me-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Benzyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2; 그리고
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"에 대한 약어이다.
A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 약기된 PNA 모노머들에 대한 화학 구조를 총괄하여 아래와 같이 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 모노머로 인식된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"과 상보결합하기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과 염기 짝을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 모노머로 인식된다.
Figure pct00039
Figure pct00040
본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 다음과 같이 제공한다.
Figure pct00041
Figure pct00042
PNA 유도체들의 약자들을 분명히 보여주기 위해, 약자로 씌여진 14-머 PNA 유도체 "(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T -NH2"의 화학 구조가 다음과 같이 제공된다.
Figure pct00043
또 다른 예시로서 약자로 씌여진 15-머 PNA 유도체 "(N → C) Fmoc-Val- CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2" 의 화학 구조가 다음과 같이 제공된다.
Figure pct00044
"(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2"의 14-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') CAG-AAC- TTA-TCC-TA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 14-머 PNA는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') guuguuguuaaguag┃GAUAAGUUCUGAACG]의 30-머 RNA 서열에 14-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이다 [(5' → 3') guuguuguuaag uag ┃ GAUAAGUUCUG AACG].
"(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2"의 15-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') CAA-TTC- ATC-CTA-CTC"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 15-머 PNA는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 [(5' → 3') guuguuguuaaguag┃GAUAAGUUCUGAACG]의 30-머 서열에 15-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이다 [(5' → 3') guuguu guuaaguag ┃ GAUAAG UUCUGAACG].
"(N → C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val- NH2"의 15-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') ATT-CAT-CCT-ATT-CAA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 15-머 PNA는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 [(5' → 3')guuguuguuaaguag┃GAUAAGUUCUGAACG]의 30-머 서열에 15-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이다 [(5' → 3') guuguugu uaaguag ┃ GAUAAGUU CUGAACG].
"(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6) -NH2"의 17-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') AGA-ACT-CAT-CCT-ACT-TA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 17-머 PNA는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 [(5' → 3') guuguuguuaaguag┃GAUAAGUUCUGAACG]의 30-머 서열에 16-머의 상보적 결합을 하고 한 개의 염기 부정합을 갖는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이고 인용 부호 (" ")로 표시한 부분이 부정합 위치이다 [(5' → 3') guuguugu uaaguag ┃ GAU "A" AGUUCU GAACG]. 한 개의 염기 부정합에도 불구하고, 이 17-머 PNA는 화학식 I의 화합물의 구조 요건 내에 있으며, 따라서 이 17-머 PNA는 화학식 I의 화합물에 속한다.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음에 나열된 특별한 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2;
(N → C) Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2; 그리고
(N → C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2.
어떤 전형에서는, 본 발명은 다음에 나열된 특별한 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
(N → C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T- TA(5)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
(N → C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Benzoyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
(N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2; 그리고
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2.
본 발명은 인간 HIF-1α 프리-mRNA를 표적으로 하는 PNA 유도체를 제공한다. 이러한 PNA 유도체는 세포 내에서 엑손 스키핑을 강하게 유도하여 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체가 생성되게 하며, 인간 HIF-1α 유전자의 과발현에 관련된 징후 및 질환을 치료하는 데 유용하다.
도 1A. "ASO 1"의 HPLC 정제 전의 C18 역상 HPLC 크로마토그램.
도 B. "ASO 1"의 HPLC 정제 후의 C18 역상 HPLC 크로마토그램.
도 2. "ASO 1"의 C18-역상 대용량 HPLC 정제후의 ESI-TOF 매스 스팩트럼.
도 3A. "ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 PCR 산물의 전기 영동 데이터. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM]
도 3B. PCR 밴드들의 예상 크기.
도 3C. "엑손 2"가 스키핑된 PCR 밴드의 생거 서열 데이터.
도 4A. "ASO 2"를 24시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터. [농도: 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 또는 10 aM]
도 4B. "ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 β-액틴에 대해 정규화된 HIF-1α 의 발현양. [농도: 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 또는 10 aM]
도 5A. "ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 중첩 qPCR 결과. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM] (표준 오차에 의한 에러바)
도 5B. "ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 중첩 qPCR 결과. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM] (표준 오차에 의한 에러바)
도 6A. "ASO 6"을 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 RT-PCR 산물의 전기 영동 데이터. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM]
도 6B. "ASO 6"을 24시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터. [농도: 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1 aM]
도 6C. "ASO 6"을 24시간 처리한 HeLa 세포에서 β-액틴에 대해 정규화된 HIF-1α 의 발현양. [농도: 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1 aM] (표준 오차에 의한 에러바)
도 7A. "ASO 6"을 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 중첩 qPCR 결과. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM] (표준 오차에 의한 에러바)
도 7B. "ASO 6"를 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 중첩 qPCR 결과. [농도: 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM] (표준 오차에 의한 에러바)
도 8A. "ASO 1"을 72시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터. [농도: 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 100 aM, 또는 300 aM]
도 8B. "ASO 1"을 72시간 처리한 헬라 세포에서 β-액틴에 대해 정규화된 HIF-1α 의 발현양. [농도: 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 100 aM, 또는 300 aM] (음성 대조군 N=4; 표준 오차에 의한 에러바)
도 9A. "ASO 1"을 피하 투여한 누드 마우스에서 U251 종양 성장. [투여량: 0 (음성 대조용), 100, 1,000, 또는 3,000 pmole/Kg] (표준 오차에 의한 에러바)
도 9B. 각 ASO 투여 군에서의 대표적인 종양 내의 HIF-1α IHC 화상.
도 9C. 음성 대조군에 대해 정규화된 각 투여 군의 평균 HIF-1α 발현양. (군당 N=5; 표준 오차에 의한 에러바)
도 10A. "ASO 6"을 피하 투여한 누드 마우스에서 A431 종양 성장. [투여량: 0 (음성 대조용), 30, 100, 또는 300 pmole/Kg, 주당 3회 투여]
도 10B. 날자 25에서의 평균 종양의 무게. (표준 오차에 의한 에러바)
도 10C. "ASO 6"을 피하 투여한 누드 마우스에서 PC3 종양 성장. [투여량: 0 (음성 대조용), 1, 10, 또는 100 pmole/Kg, 주당 2회 투여]
도 10D. 날자 28에서의 평균 종양의 무게. (표준 오차에 의한 에러바)
도 11A. 같은 양의 "ASO 6"과 "ASO 11"을 피하 투여한 누드 마우스에서 U251 MG 종양 성장. [투여량: 0 (음성 대조용), 0.1, 1.0, 또는 10 pmole/Kg, 주당 2회 투여] (표준 오차에 의한 에러바)
도 11B. 날자 92에서의 평균 U251 MG 종양의 무게.
도 12A. 음성 대조군과 1.0 pmole/Kg 투여 군에서의 대표적인 종양 내의 HIF-1α IHC 화상.
도 12B. 음성 대조군에 대해 정규화된 1.0 pmole/Kg 투여 군에서의 평균 HIF-1α 발현양. (군당 N=4; 표준 오차에 의한 에러바)
도 12C. 음성 대조군과 1.0 pmole/Kg 투여 군에서의 대표적인 종양 내의 VEGF-A IHC 화상.
도 12D. 음성 대조군에 대해 정규화된 1.0 pmole/Kg 투여 군에서의 평균 VEGF-A 발현양. (군당 N=4; 표준 오차에 의한 에러바)
도 13. "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거함으로써 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다.
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
PNA 올리고머는 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법으로, 혹은 이를 약간 변형하여 Fmoc-화학에 기반한 고체상 펩타이드 합성 (SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드로부터 (PCAS BioMatrix Inc., 캐나다 퀘백 소재) 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스 (H-Rink Amide-ChemMatrix)였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머 및 천연 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머를 사용하여 본 발명의 PNA 유도체들을 합성하였다. PNA 올리고머를 C18-역상 HPLC (0.1% TFA를 갖는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올)에 의해 정제하고 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.
반응식 1은 상기 연구의 SPPS의 전형적인 모노머 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. 반응식 1의 각 반응 단계를 하기와 같이 간략하게 제공한다.
[반응식 1]
Figure pct00045
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 0.01 mmol (약 20 mg) 켐매트릭스 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드 (MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머나 Fmoc으로 보호된 아미노산과 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc 제거 (DeFmoc)] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링 (Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol PNA monomer, 0.05 mmol HBTU, 그리고 10 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 2분 후에 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다. 본 발명에서 사용된 변형된 핵산염기를 갖는, Fmoc으로 보호된 PNA 모노머의 화학적 구조는 아래에 제공된다. 아래에 제공된 변형된 핵산염기를 갖는, Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 예시로 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다. 당해 분야의 숙련가들은 화학식 I의 PNA 유도체를 합성하기 위한 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들을 쉽게 변형할 수 있다.
Figure pct00046
[캡핑(Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액 (capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 염기성의 커플링 조건에서 "Fethoc-OSu"와 반응하여 레진의 N-말단 아민에 "Fethoc"기가 도입되는 데, "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같다.
Figure pct00047
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액 (cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진에서 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압에서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진에서 분리된 PNA 유도체의 조생성물 (crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 구배 방법의(gradient method) C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 1A와 1B는 "ASO 1"의 정제 전과 후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다. "ASO 1"의 서열은 표 1에 제공된다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
본 발명의 PNA 유도체는 위의 방법에 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 표 1은 본 발명의 HIF-1α ASO들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 1에서 HIF-1α ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
화학식 I의 PNA 유도체들과 매스 구조 분석 데이터
PNA PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
ASO 1 Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4486.05 4486.04
ASO 2 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4473.99 4474.02
ASO 3 Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4462.03 4462.07
ASO 4 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2 4376.94 4376.99
ASO 5 Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2 4504.07 4504.09
ASO 6 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2 5393.47 5393.44
ASO 7 Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 4784.18 4784.14
ASO 8 Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 4727.13 4727.79
ASO 9 Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2 3695.73 3695.74
ASO 10 Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2 4844.33 4844.33
ASO 11 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2 5448.54 5448.50
ASO 12 H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH2 4263.98 4263.99
ASO 13 Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4441.06 4441.06
ASO 14 n-Propyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2 4306.03 4306.05
ASO 15 p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4405.95 4405.90
ASO 16 [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4426.06 4426.08
ASO 17 Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2 4984.44 4984.46
ASO 18 N-Ph-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2 4468.11 4468.14
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
도 1A는 "ASO 1" 조생성물의 HPLC 크로마토그램이다. 조생성물은 C18-역상 대용량 HPLC로 정제하는 데, 도 1B는 정제한 "ASO 1"의 HPLC 크로마토그램이다. "ASO 1"의 순도는 대용량 HPLC 정제에 의해 현저히 향상되는 데, 도 2는 정제한 "ASO 1"의 ESI-TOF 질량 분석 스펙트럼이다. "ASO 1"의 분석 데이터를 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체의 본 발명에서의 정제 및 동정 방법을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
상보적인 10-머 DNA에 대한 PNA의 결합력 (Binding Affinity)
표 1에 있는 PNA 유도체들의 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA들과의 결합력을 측정하였다. 결합력은 PNA와 상보적인 10-머 DNA 이중나선의 (duplex) Tm 값으로 평가하였다. 표 1에 있는 PNA와 전체 길이의 상보적인 DNA 이중나선의 Tm 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 Tm 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다. Tm은 UV/Vis 분광 광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 다음과 같이 또는 부분적인 수정을 통하여 측정하였다.
15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브 (falcon tube)에서 4 μM PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 10-머 DNA를 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90oC에서 일분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하고, 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 260 nm에서 Tm을 측정하였다. Tm 측정에 사용된 10-머 DNA는 대전의 (주)바이오니아 (www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
화학식 I PNA 유도체들의 관찰된 Tm 값들은 G/C 함량이 낮은 10-머 결합으로서는 상당히 높게 나타났는 데, 그 결과들은 표 2에 요약되었다. 예를 들면, "ASO 8"은 [(N → C) Fethoc- CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2) TT-AA(6)C- NH2]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 PNA 중의 N-말단 10-머를 표적하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 73.0℃의 Tm 값을 나타내었다. 반면에, "ASO 8"은 [(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)T C-CTA(6)- C(1O2)TT-AA(6)C -NH2]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 PNA 중의 C-말단 10-머를 표적하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 61.0℃의 Tm 값을 나타내었다.
PNA 유도체들과 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머DNA들과의 Tm 값.
PNA Tm 값, ℃
N-말단에 대한 10-머 DNA C-말단에 대한 10-머 DNA
ASO 1 66.0 60.0
ASO 4 66.0 53.4
ASO 5 62.0 58.0
ASO 7 69.0 61.0
ASO 8 73.0 61.0
ASO 9 60.9 59.0
ASO 10 61.0 60.0
ASO 11 73.4 61.0
화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예
화학식 I PNA 유도체의 생체 외 (in vitro) 안티센스 활성은 헬라 (HeLa) 세포에서, 그리고 항암 활성은 누드 쥐의 (nude mice) 이종이식 암 모델에서 평가하였다. 이러한 안티센스 효능 평가 예들은 화학식 I PNA 유도체의 전체적인 생물학적 윤곽을 예시하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
실시예 1. "ASO 2"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1의 14-머 "ASO 2"는 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5'
Figure pct00048
3') guuguuguua aguag ┃ GAUAAGUUC UGAACG]의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 2"는 " 인트론 1"과 5-머 결합을 하고 "엑손 2"와 9-머 결합을 한다.
헬라 세포에서 “ASO 2”가 인간 HIF-1α 프리-mRNA "엑손 2"의 스키핑을 유도하는 정도를 중첩 (nested) RT-PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 헬라 세포는 (Cat. Number CCL-2, ATCC) 60 mm 배양 접시에서 5 mL EMEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포들에 대하여 “ASO 2”를 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출] 5 시간 후에, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'
Figure pct00049
3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; 및 엑손 8_역방향: (5'
Figure pct00050
3') AACCCAGACATATCCACC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.
[중첩 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 1n_순방향: (5'
Figure pct00051
3') TGAAGACA-TCGCGGGGAC; 및 엑손 5n_역방향: (5'
Figure pct00052
3') TTTTTCACAAGGCCATTTCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20μL 중첩 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 증폭시켰다: 95℃ 5분에 이어서, 39 주기의 95 ℃ 30초, 50 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 크기 표시 혼합물을 (size marker cocktail) 이용하여 2% 아가로스 젤 상에서 상기 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 생거 (Sanger) 서열분석에 의해 분석하였다. 관찰된 PCR 밴드들은 도 3A에 표시된 바와 같이 전체 길이의 mRNA (즉, 엑손 스키핑이 없음) 및 "엑손 2"가 스키핑된 스플라이스 변형체와 일치했다. ASO를 처리하지 않은 음성 대조군에서도 "엑손 2"가 스키핑된 밴드가 나왔는 데, 즉 "엑손 2"는 어느 정도는 저절로 잘라져 나가는 것으로 보인다. 그러나, ASO를 처리한 세포에서 나타난 엑손 스키핑 밴드가 훨씬 강하게 나타난 것을 보면 "ASO 2"가 헬라 세포에서 "엑손 2"의 스키핑을 촉진하였다. 액손 스키핑 밴드의 서열은 도 3B에 제공되었으며, "엑손 1"과 "엑손 3"의 연결 부위에서의 mRNA 서열이 잘 나타나 있다.
실시예 2. 헬라 세포에서 "ASO 2"에 의한 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
헬라 세포에서 "ASO 2"가 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL ENEM 배양액에서 배양된 헬라 세포들에 대하여 “ASO 2”를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM, 또는 10 aM의 농도로 처리하였다.
[CoCl2 처리 및 세포 용해] ASO를 처리하고 24시간 후에, 프로필히드록실라제의 (propylhydroxylases, PHDs) 활성을 억제하기 위하여 음성 대조군 이외의 배양 접시를 200 μM CoCl2로 3시간 동안 처리하였다. 세포를 차가운 1 mL PBS로 2번 씻어준 후 얼음 위에서, 1% SDS와 1X 프로티나제 억제제 혼합제가 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μM RIPA 완충용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 용해하였다. 용해액을 1.5 mL 이튜브에 (e-tube) 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액을 섞은 후 100oC에서 5분간 끓인다. 용해액을 8% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동 분리를 하고 0.45 μm PVDF 막으로 (membrane) 옮겼으며 그 막은 항-HIF-1α 항체와 (Cat. Number 610958, BD Biosciences) 항-β-액틴 항체를 (Cat. Number sc4778, Santa Cruz) 이용하여 탐색하였다.
[HIF-1α 단백질 발현의 억제] "ASO 2"를 처리한 헬라 세포로부터 얻은 웨스턴 블럿 데이터를 도 4A에 제공한다. CoCl2를 처리하지 않은 세포의 용해액에서 HIF-1α 밴드가 나타나지 않은 반면, CoCl2를 처리한 세포의 용해액에서는 HIF-1α 밴드가 강하게 나타났는 데, 이는 CoCl2가 PHDs의 활성을 강하게 억제했다는 의미이다.
덴시토미트리로 (densitometry) 측정한 각각의 β-액틴 밴드에 대한 HIF-1α 밴드의 강도를 도 4B에 제공한다. "ASO 2"의 농도가 증가할수록 HIF-1α의 발현은 점차 감소하는 데, "ASO 2"의 농도를 10 aM까지 올렸을 때 약 75%가 감소하였다.
실시예 3. "ASO 2"로 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
헬라 세포에서 "ASO 2"가 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL ENEM 배양액에서 배양된 헬라 세포들에 대하여 “ASO 2”를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출] ASO를 처리한 3 시간 후에, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'
Figure pct00053
3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; 및 엑손 8_역방향: (5'
Figure pct00054
3') AACCCAGACATATCCACC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.
[중첩 qPCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 2n_순방향: (5'
Figure pct00055
3') CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC; 엑손 2n_역방향: (5'
Figure pct00056
3') AAGTTTCCTCACACGCAAATAG; 엑손 3n_순방향: (5'
Figure pct00057
3') GAAAGCACAGATGAATTGC; 엑손 3n_역방향: (5'
Figure pct00058
3') TCATGTCACC- ATCATCTGT; 엑손 4n_순방향: (5'
Figure pct00059
3') CTAACTGGACACAGTGTGTTTG; 및 엑손 4n_역방향: (5'
Figure pct00060
3') TCTGTGTGTAAGCATTTCTCTC; 엑손 5n_순방향: (5'
Figure pct00061
3') GCC-TTGTGAAAAAGGGTAAAG; 및 엑손 5n_역방향: (5'
Figure pct00062
3') CCATGTTGCAGACTTTATGT]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 사이버 그린으로 (SYBR Green, 타카라, 일본) 탐색하였고 주기 조건은 다음과 같다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.
[HIF-1α mRNA 엑손의 양 변화] ASO를 처리한 세포들의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 엑손의 양, 즉 음성 대조군에 대해 정규화 하였다. 각 엑손에 대한 상대적인 양이 도 5A에 제공된다. "ASO 2"를 10 zM과 100 zM을 처리한 세포들에서 모든 엑손의 양이 각각 60~80%와 50~70%만큼 현저하게 감소하였다. 그러나 "ASO 2"를 1,000 zM을 처리한 세포들에서의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포들과 비슷했다. ASO의 농도를 1,000 zM로 올렸을 때 엑손의 양이 음성 대조군의 양으로 돌아가는 이유는 앞으로 밝혀져야 한다. 그렇지만, qPCR 데이터의 용량 반응 패턴은 "실시예 1" 도 3A의 용량 반응 패턴과 비슷하다.
실시예 4. "ASO 2"로 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "실시예 3"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "ASO 2"가 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 평가하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'
Figure pct00063
3') CGCGAACGACAAGAAAAA; 및 엑손 8_역방향: (5'
Figure pct00064
3') CTGTGGTGAC-TTGTCCTTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠)를 갖는 슈퍼스크립트 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 20 주기의 94 ℃ 30초, 51 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
[중첩 qPCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA로 인간 HIF-1α "엑손 1"과 "엑손 2"의 연결 부위를 감지하도록 고안된 택만 탐색을 (TaqMan probe, Hs00936371_m1, Thermo Fisher) 이용한 20 μL 실시간 PCR 반응을 하였고 주기 조건은 다음과 같다: 95℃ 3분에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 10초, 60 ℃ 30초.
[전체 길이 HIF-1α mRNA의 양 변화] ASO를 처리한 세포들의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 mRNA의 양에 대해 정규화 하였다. 관찰된 상대적인 mRNA의 양이 도 5B에 제공된다. "ASO 2" 100 zM과 1,000 zM을 처리한 세포들에서 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양이 각각 65%와 55%만큼 현저하게 감소하였다. 그러나 "ASO 2" 10 zM을 처리한 세포들에서의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 변화가 없었다.
실시예 5. "ASO 6"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1의 17-머 "ASO 6"은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5'
Figure pct00065
3') guuguugu uaaguag ┃ GAUAAGUUCU GAACG]의 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 6"은 "인트론 1"과 7-머 결합을 하고 "엑손 2"와 10-머 결합을 한다.
별도의 언급이 없으면 "실시예 1"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 “ASO 6”이 인간 HIF-1α mRNA "엑손 2"의 스키핑을 유도하는 정도를 중첩 RT-PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
2% 아가로스 젤 상에서 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였고 그 결과는 도 6A에 제공된다. "엑손 2"의 스키핑은 "ASO 6"의 모든 투여농도에서 확실하며, "ASO 6"가 "ASO 2"보다 더 효과적으로 유도한다. 전체 길이 HIF-1α mRNA의 PCR 밴드는 "ASO 6"의 모든 투여농도에서 거의 완전히 사라진 반면에 [도 6A], "ASO 2"를 10에서 1,000 zM 투여한 세포의 RNA 추출물에서는 상당한 양의 전체 길이 HIF-1α mRNA가 남아 있었다 [도 3A].
실시예 6. "ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
별다른 언급이 없으면 "실시예 2"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "ASO 6"이 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가하였다.
0 zM (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM 농도의 "ASO 6"을 처리한 헬라 세포로부터 얻은 웨스턴 블럿 데이터를 도 6B에 제공한다. HIF-1α 단백질의 발현은 투여 농도에 따라 약 45~55%가 감소하였다 (도 6C).
실시예 7. "ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "실시예 4"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "ASO 6"이 HIF-1α mRNA의 발현을 변화시키는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'
Figure pct00066
3') CGCGAACGACAAGAAAAA; 및 엑손 8_역방향: (5'
Figure pct00067
3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠)를 갖는 슈퍼스크립트 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 51 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
[HIF-1α mRNA 엑손의 양 변화] ASO를 처리하지 않은 세포의 엑손의 양에 대해 정규화한 ASO를 처리한 각 세포들의 엑손의 양은 도 7A에 제공된다. "ASO 6"을 10, 100, 그리고 1,000 zM을 처리한 세포들에서 엑손의 양이 각각 35%, 약 30%, 그리고 약 45%만큼 현저하게 감소하였다.
실시예 8. "ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "실시예 7"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "ASO 6"이 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 평가하였다.
[전체 길이 HIF-1α mRNA의 양 변화] ASO를 처리한 세포들의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 mRNA의 양에 대해 정규화 하였다. 관찰된 상대적인 mRNA의 양이 도 7B에 제공된다. "ASO 6" 100 zM과 1,000 zM (1 aM)을 처리한 세포들에서 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양이 각각 약 60%와 80%만큼 현저하게 감소하였다. 그러나 "ASO 6" 10 zM을 처리한 세포들에서의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 변화가 없었다.
실시예 9. "ASO 1"로 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
표 1의 14-머 "ASO 1"은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5'
Figure pct00068
3') guuguuguuaag uag ┃ GAUAAGUUCUG AACG]의 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 6"은 "인트론 1"과 3-머 결합을 하고 "엑손 2"와 11-머 결합을 한다.
별도의 언급이 없으면 "실시예 2"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 “ASO 1”이 인간 HIF-1α의 발현을 하향 조절하는 정도를 중첩 RT-PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다. 이 실시예에서는 헬라 세포들에 대하여 "ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM, 또는 300 aM의 농도로 72시간 동안 처리 한 다음 PHDs의 활성을 억제하기 위하여 200 μM CoCl2로 3시간 동안 처리하였다. 음성 대조용으로는 4개의 배양 접시를 사용하였다.
"ASO 1"을 처리한 헬라 세포 용해물로부터 얻은 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터를 도 8A에 제공한다. 음성 대조군 용해물의 HIF-1α 단백질 양이 "ASO 1"을 처리한 모든 세포 용해물의 HIF-1α 단백질 양보다 상당히 많다.
덴시토미트리로 측정한 각각의 β-액틴 밴드에 대한 HIF-1α 밴드의 강도를 도 8B에 제공한다. 헬라 세포에서 "ASO 1"의 농도가 0.1에서 300 aM로 증가할수록 72시간 후에 HIF-1α의 발현은 40에서 80%가 감소하였다.
실시예 10. 누드 마우스 U-251 이종이식 모델에서 "ASO 1"에 의한 종양 성장 억제.
누드 마우스 U-251 이종이식 모델에서 "ASO 1"이 종양 성장을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[U-251 이종이식의 유도] U-251 인간 교모세포종 (glioblastoma) 세포는 DMEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 14일 후에 동물당 5x105개의 U-251 세포를 6주령 수컷 누드 마우스의 (Charles River, Japan) 우측 견갑상 부위에 피하로 접종하였고, 일반 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였다.
[군 분리 및 ASO 처리] 날자 0에 동물들은 음성 대조용과 (ASO 투여하지 않음), "ASO 1"을 각각 100 pmole/Kg, 1,000 pmole/Kg, 그리고 3,000 pmole/Kg 처리한 네 군으로 무작위 분리하였고, 군당 7마리이며 종양의 부피는 평균 50 mm3 이었다. ASO 투여 군에 5 mL/Kg의 "ASO 1" PBS 용액을 날자 0부터 날자 21 사이에 1주일에 3번 피하 투여하였다.
[종양 성장 억제] 종양의 부피는 일주일에 3번 측정하였고 날자 21에 종양의 성장은 ASO 투여 군에서 약 35에서 45% 현저하게 억제되었다. [도 9A 참고]
[종양 종괴의 HIF-1α 면역조직화학염색] 날자 22에 희생시킨 동물로부터 종양 종괴를 (tumor mass) 추출하고, HIF-1α 면역조직화학염색을 (IHC) 이용하여 종양 종괴에서 HIF-1α 단백질 발현 정도를 평가하였다. 파라핀 블록을 이용하여 IHC용 조직 샘플을 만들었고, 관찰할 조직은 100배 묽힌 토끼 항-인간 HIF-1α 항체 (Cat. Number SC-10790, Santa Cruz), 200배 묽힌 항-토끼 IgG (Cat No. BA-1100, Vector), 그리고 200배 묽힌 Dylight 594-steptavidin (Cat No. SA-5594, Vector, CA, USA)의 순서로 면역표지 하였다. HIF-1α IHC 화상은 올림푸스 형광 현미경으로 관찰하였고 핵은 DAPI로 염색하였다.
각 군의 대표적인 HIF-1α IHC 화상을 도 9B에 제공한다. ASO를 처리한 군에서 HIF-1α의 발현이 아주 적은 반면, 음성 대조군에서는 발현이 현저하게 나타났다. HIF-1α의 발현은 각 IHC 화상을 ImageJ 프로그램을 사용한 덴시토메트리로 평가하였다. 음성 대조군으로 정규화한 각 투여 군의 평균 HIF-1α의 발현양은 도 9C에 제공된다 (군당 5개). 종양 내의 HIF-1α 발현양은모든 투여 군에서 약 40~50%만큼 현저하게 감소하였다 (독립표본　T　검정).
실시예 11. 누드 마우스 A431 이종이식 모델에서 "ASO 6"에 의한 종양 성장 억제.
누드 마우스 A431 이종이식 모델에서 "ASO 6"이 종양 성장을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[A431 이종이식의 유도] A431 인간 상피세포암종 세포는 (Cat. Number CRL1555, ATCC) DMEM 배양액에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 10일 후에 동물당 5x105개의 A431 세포를 6주령 수컷 누드 마우스의 (Charles River, Japan) 좌측 다리에 피하로 접종하였고, 일반 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였다.
[군 분리 및 ASO 처리] 날자 0에 동물들은 음성 대조용과 (ASO 투여하지 않음), "ASO 6"을 각각 30 pmole/Kg, 100 pmole/Kg, 그리고 300 pmole/Kg 처리한 네 군으로 무작위 분리하였고, 군당 8마리이며 종양의 부피는 평균 108 mm3 이었다. ASO 투여 군에 2 mL/Kg의 "ASO 6" PBS 용액을 날자 0부터 날자 25 사이에 1주일에 3번 피하 투여하였다.
[종양 성장 억제] 종양의 부피는 일주일에 3번 측정하였고 "ASO 6"을 반복 투여함에 따라, 통계적 유의성은 없지만 종양의 성장은 투여한 양에 비례하여 억제되었다 [도 10A 참고]. 종양의 성장은 300 pmole/Kg 군에서 약 20% 억제되었다. 날자 25에 희생된 동물로부터 종양 종괴를 추출하였으며 ASO의 투여량을 늘릴수록 날자 25의 종양 종괴는 감소하였다 [도 10B 참고]. 통계적 유의성은 없지만 종양 종괴는 300 pmole/Kg 군에서 약 20% 감소하였다.
실시예 12. 누드 마우스 PC3 이종이식 모델에서 "ASO 6"에 의한 종양 성장 억제.
누드 마우스 PC3 이종이식 모델에서 "ASO 6"이 종양 성장을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[PC3 이종이식의 유도] PC3 인간 전립선암종 세포는 (Cat. Number CRL1435, ATCC) F-12K 배양액에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 7일 후에 동물당 3x106개의 PC3 세포를 6주령 수컷 누드 마우스의 (Harlan Laboratories, Italy) 좌측 다리에 피하로 접종하였고, 일반 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였다.
[군 분리 및 ASO 처리] 날자 0에 동물들은 음성 대조용과 (ASO 투여하지 않음), "ASO 6"을 각각 1 pmole/Kg, 10 pmole/Kg, 그리고 100 pmole/Kg 처리한 네 군으로 무작위 분리하였고, 군당 9마리이며 종양의 부피는 평균 88 mm3 이었다. ASO 투여 군에 2 mL/Kg의 "ASO 6" PBS 용액을 날자 0부터 날자 28 사이에 1주일에 2번 피하 투여하였다.
[종양 성장 억제] 종양의 부피는 일주일에 3번 측정하였고 10 pmole/Kg 군에서 날자 19~26에 종양의 성장이 약 25~30% 현저히 억제되었다 [도 10C 참고]. 날자 28에 희생된 동물로부터 종양을 추출하였으며, 통계적 유의성은 없지만 10 pmole/Kg 군에서 종양 종괴의 평균 크기는 음성 대조군에 비해 21% 작았다 [도 10D 참고].
투여량이 10에서 100 pmole/Kg으로 증가함에 따라 항 종양 활성이 사라졌다. HIF-1α의 발현양이 증가하면 유전자 이식 쥐에서 림프구의 생존이 연장된다는 것을 고려하면 [PLOS One vol 8(4), e57833 (April 2013)], 100 pmole/Kg 군에서의 항 종양 활성 감소는 고용량의 투여에 의해 HIF-1α 활성이 너무 낮아져서 선천성 면역이 감소되었기 때문인 것으로 보인다.
실시예 13. 누드 마우스 U-251 MG 이종이식 모델에서 "ASO 6"와 "ASO 11"에 의한 종양 성장 억제.
"ASO 6"이 인간의 HIF-1α 프리-mRNA와 완전히 상보적이기는 하지만 쥐의 HIF-1α 프리-mRNA 엑손 2와는 한 개의 염기 부정합이 있다. "ASO 11"는 쥐의 HIF-1α 프리-mRNA에서, "ASO 6"이 인간의 HIF-1α 프리-mRNA에서 표적하는 위치와 같은 위치에 완전히 상보적으로 표적하도록 고안된 17-머의 ASO이다. "ASO 11"는 쥐의 HIF-1α 프리-mRNA "인트론 1" 및 "엑손 2"와 7-머 및 10-머씩 각각 상보적 결합을 한다.
누드 마우스 U-251 MG 이종이식 모델에서 같은 양으로 섞은 "ASO 6"과 "ASO 11"의, 쥐에서뿐만 아니라 인간 유래 이종이식에서 HIF-1α의 발현을 억제하는 것에 의한 항 종양 활성을 평가하였다.
[U-251 MG 이종이식의 유도] U-251 인간 교모세포종 (glioblastoma) 성상세포종 (astrocytoma) 세포는 (Cat. Number 09063001, Sigma) MEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 30일 후에 동물당 3x106개의, 마트리겔 (Matrigel)로 제제한 U-251 MG 세포를 5주령 수컷 누드 마우스의 (Harlan Laboratories, Italy) 우측 견갑상 부위에 피하로 접종하였고, 일반 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였다.
[군 분리 및 ASO 처리] 날자 0에 동물들은 음성 대조용과 (ASO 투여하지 않음), "ASO 6"과 "ASO 11"을 각각 0.1 pmole/Kg, 1 pmole/Kg, 그리고 10 pmole/Kg을 처리한 네 군으로 무작위 분리하였고, 군당 9마리이며 종양의 부피는 평균 75 mm3 이었다. ASO 투여 군에는 2 mL/Kg의 "ASO 6"과 "ASO 11" PBS 용액을 날자 0부터 날자 91 사이에 1주일에 2번 피하 투여하였다.
[장기/조직 분석을 위한 희생] 날자 92에 희생시킨 동물로부터 종양, 전혈, 간, 폐, 심장, 그리고 신장을 추출하였고, 조직 샘플들에 대해 IHC와 생물학적 분석을 실시하였다.
[종양 성장 억제] 종양의 부피는 투여 후 처음 2주간은 일주일에 2번 측정하였고 그 다음부터는 일주일에 1번 측정하였다. ASO 투여 군들에서 명백하고 현저하게 종양 성장이 억제되었으나, 1 pmole/Kg 투여 군에서 가장 강한 억제가 관찰되었다. 날자 92에 종양의 성장은 0.1 pmole/Kg, 1 pmole/Kg, 그리고 10 pmole/Kg 투여 군에서 각각 66%, 83%, 그리고 56%만큼 현저하게 (분산분석, ANOVA) 억제되었다. [도 11A 참고]
날자 92에 군별 종양 무게의 평균을 도 11B에 제공한다. ASO 투여 군들에서 47~71%만큼 종양 무게가 감소되었으나, 1 pmole/Kg 투여 군에서 가장 많이 71% 감소되었다. 음성 대조군과 1 pmole/Kg 투여 군의 차이가 가장 현저하다 (독립표본　T　검정).
HIF-1α의 발현양이 증가하면 유전자 이식 쥐에서 림프구의 생존이 연장된다는 것을 고려하면 [PLOS One vol 8(4), e57833 (April 2013)], 1 pmole/Kg 군보다 10 pmole/Kg 군에서의 항 종양 활성이 약한 것은 10 pmole/Kg 군에서 고용량의 투여에 의해 HIF-1α 활성이 너무 낮아져서 선천성 면역이 감소하였기 때문인 것으로 보인다.
[평균 몸무게와 기관의 무게] 몸무게에 큰 변화는 없지만, 13주차에 10 pmole/Kg 군에서의 평균 몸무게가 가장 작았다. 즉 음성 대조군에서는 39.6g이었고 10 pmole/Kg 군에서는 38.0g이었다.
비장을 (spleen) 제외하고는 10 pmole/Kg 군에서의 기관들의 무게가 검정 대조군보다 작았다. 심장과 신장의 무게는 각각 (0.23 ± 0.01)g 대 (0.20 ± 0.01)g 및 (0.60 ± 0.02)g 대 (0.56 ± 0.02)g 정도로 10 pmole/Kg 군에서의 무게가 검정 대조군보다 현저히 작았다.
비장의 무게는 (0.33 ± 0.13)g 대 (0.27 ± 0.03)g 정도로 10 pmole/Kg 군에서의 무게가 검정 대조군보다 컸다.
무게에 관한 위의 관찰 결과를 보면, 10 pmole/Kg 투여는 저용량 투여군이나 음성 대조군에 비해 동물의 성장이나 발달에 영향이 있다고 여겨진다. HIF-1α가 VEGF와 EPO의 발현을 유도하는 것을 고려할 때, HIF-1α의 만성적 전신성 억제가 비장 무게를 현저히 증가시키는 것은 놀라운 일이 아니다. 즉, 1 pmole/Kg 군에서보다 10 pmole/Kg 군에서 HIF-1α 발현이 더 억제된다.
[혈청에서의 VEGF-A의 양] 혈청에서의 VEGF-A의 양은 쥐의 VEGF-A ELISA 키트로 (Cat. Number NMV00, R&D Systems, USA) 측정한다. 통계적 유의성은 없지만, 흥미롭게도 혈청에서의 VEGF-A의 양은 ASO 처리 군에서 더 많았다. 음성 대조군과 0.1 pmole/Kg, 1 pmole/Kg, 그리고 10 pmole/Kg을 처리한 세 군에서의 관찰된 혈청에서의 VEGF-A의 양은 각각 (47.0 ± 2.5) pg/mL, (48.7 ± 3.1) pg/mL, (51.0 ± 5.6) pg/mL, 그리고 (50.0 ± 2.7) pg/mL 이었다. 관찰된 혈청에서의 VEGF-A의 양은 생체 외 HIF-1α 생물학에 기초한 예측과는 대조된다. 그러나 세심히 관리된 임상 시험에서, 일시적인 저산소증이 혈청에서의 VEGF-A의 양의 현저한 감소를 유도한다는 사실은 VEGF 생리학의 복잡성을 제시한다 [Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. vol 290, E434-439 (2006)].
[종양 종괴의 HIF-1α 면역조직화학염색] 파라핀 블록을 이용하여 음성 대조군과 1.0 pmole/Kg군의 HIF-1α IHC용 종양 샘플을 만들었다 (군당 4개). 관찰할 조직은 100배 묽힌 토끼 항-HIF-1α 항체와 (Cat. Number ab51608, Abcam) 250배 묽힌 항-토끼 IgG (Cat. Number A21207, Invitrogen)의 순서로 면역표지 하였다. HIF-1α IHC 화상은 자이스 (Zeiss) 슬라이드 스캐너로 관찰하였고 핵은 DAPI로 염색하였다.
각 군의 대표적인 HIF-1α IHC 화상을 도 12A에 제공한다. HIF-1α의 발현은 각 IHC 화상을 ImageJ 프로그램을 사용한 덴시토메트리로 평가하였다. 음성 대조군으로 정규화한 1 pmole/Kg군의 평균 HIF-1α의 발현양은 도 12B에 제공된다 (군당 4개). 종양 내의 HIF-1α 발현양은 1 pmole/Kg군에서 42%만큼 현저하게 감소하였다 (독립표본　T　검정).
[종양 종괴의 VEGF-A 면역조직화학염색] 파라핀 블록을 이용하여 음성 대조군과 1.0 pmole/Kg군의 VEGF-A IHC용 종양 샘플을 만들었다 (군당 4개). 관찰할 조직은 100배 묽힌 토끼 항-VEGF-A 항체와 (Cat. Number ab46154, Abcam) 250배 묽힌 항-토끼 IgG (Cat. Number A21207, Invitrogen)의 순서로 면역표지 하였다. VEGF-A IHC 화상은 자이스 (Zeiss) 슬라이드 스캐너로 관찰하였고 핵은 DAPI로 염색하였다.
각 군의 대표적인 VEGF-A IHC 화상을 도 12C에 제공한다. VEGF-A의 발현은 각 IHC 화상을 ImageJ 프로그램을 사용한 덴시토메트리로 평가하였다. 음성 대조군으로 정규화한 1 pmole/Kg군의 평균 VEGF-A의 발현양은 도 12D에 제공된다. 종양 내의 VEGF-A 발현양은 1 pmole/Kg군에서 13%만큼 약간 감소하였다.

Claims (22)

  1. 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00069

    화학식 I 중에서,
    n은 10와 26 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00070
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    X와 Y는 수소 [H], 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노 [-NH2], 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 10와 26 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00071
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 아미노 [-NH2], 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다..
    Figure pct00072

    화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬, 수소, 하이드록시, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:
    [화학식 Ⅴ]
    Figure pct00073

    화학식 V 중에서,
    Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 16 사이의 정수이다
  3. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 23 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00074
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소 (-O-), 그리고 아미노 [-N(H)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 11 사이의 정수이다.
  4. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 21 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00075
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 9 사이의 정수이다.
  5. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 12와 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00076
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 9 사이의 정수이다.
  6. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 12와 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00077
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 11개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 8 사이의 정수이다.
  7. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 12와 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00078
    3') UAAGUAGGAUAAGU] 과 최소한 12개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X는 수소이며;
    Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, CH2-O-(CH2)5-, -CH2-O-(CH2)6-, 또는 -CH2-O-(CH2)7- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
    L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
  8. 제 1 내지 7의 모든 항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    화학식 I의 화합물은 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함하는 부분적으로 상보적인 결합을 한다.
  9. 제 8 항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    화학식 I의 화합물은 표적하는 HIF-1α 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 한다.
  10. 제 1항에 있어서, 아래에 제공된 펩타이드 핵산 유도체들 중에서 선택된 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) n-Propyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Benzyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G(3)-AA(5)C- TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)- TA(5)-Lys-NH2;
    (N → C) N-Ph-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
    (N → C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
    (N → C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(2O2)A-C(1O5)TT-A(3)TC-CTA(5)-C(1O3)T-NH2;
    (N → C) Benzoyl-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH2;
    (N → C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(5)GA-AC(1O2)T-TG(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-CA-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-AT-NH2;
    (N → C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;
    (N → C) Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
    (N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T- A(6)CT-TA(6)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-G-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(1O2)T- AC(1O5)T-TA(6)A-C-NH2; 그리고
    (N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CCT-AC(1O5)T- TAA-CA(2O2)A-NH2:

    상기에서,
    A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이며;
    C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.
    Figure pct00079

    상기에서,
    p와 q는 정수이며; 그리고,
    N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino] carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; "-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
  11. 제 1항에 있어서, 아래에 제공된 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2;
    (N → C) Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2; 그리고
    (N → C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2.
  12. 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    화학식 I의 화합물은, 인간의 HIF-1α 프리-mRNA 중 20개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5'
    Figure pct00080
    3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    n은 10와 26 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
  13. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 10와 26 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다..
    화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬, 수소, 하이드록시, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:
    화학식 V 중에서,
    Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 16 사이의 정수이다
  14. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 21 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 하이드록시 및 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 11 사이의 정수이다.
  15. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 19 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소 및 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 수소 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 9 사이의 정수이다.
  16. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 19 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소 및 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, 그리고 R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 9 사이의 정수이다.
  17. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 19 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소 및 치환체가 있거나 없는 아실 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 8 사이의 정수이다.
  18. 제 12항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11와 17 사이의 정수이며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X는 수소이며;
    Y는 치환체가 있거나 없는 아실이며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, 또는 -CH2-O-(CH2)3- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
    L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
  19. 제 12항에 있어서, 아래에 제공된 펩타이드 핵산 유도체들 중에서 선택된 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
    (N → C) Fethoc-CA(5)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
    (N → C) Fethoc-CG(6)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
    (N → C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
    (N → C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Benzoyl-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T- TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
    (N → C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
    (N → C) Ac-AG(5)A-A(2O3)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Lys-NH2;
    (N → C) Benzoyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Ac-HEX-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fmoc-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Me-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Benzyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2; 그리고
    (N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
    상기에서,
    A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.
    C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.
    상기에서,
    p와 q는 정수이며; 그리고,
    N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"에 대한 약어이다.
  20. 제 12항에 있어서, 아래에 제공된 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH2;
    (N → C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2;
    (N → C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T- TA(5)A-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2;
    (N → C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH2;
    (N → C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Benzoyl-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2;
    (N → C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2; 그리고
    (N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
  21. 제 1 내지 20항 중의 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 HIF-1α의 발현에 연관된 징후 또는 질환을 치료하는 방법.
  22. 제 1 내지 20항 중의 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 고형 종양을 치료하는 방법.
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