KR20110087436A

KR20110087436A - 전위차 나트륨 이온 채널 아형 9(에스씨엔 9에이)의 안티센스 올리고핵산

Info

Publication number: KR20110087436A
Application number: KR1020100006853A
Authority: KR
Inventors: 정신
Original assignee: 주식회사 씨티아이바이오
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-08-03

Abstract

본 발명은 전위차 나트륨 이온 채널의 하나인 Nav1.7의 생성을 선택적으로 억제하는 SCN9A 안티센스 올리고 핵산을 제공한다.

Description

전위차 나트륨 이온 채널 아형 9(에스씨엔 9에이)의 안티센스 올리고핵산 {SCN9A Antisense Oligonucleotide}

본 발명은 나트륨 이온 채널 Na_v1.7 의 합성을 억제하는 안티센스 올리고 핵산에 관한 것이다.

전위차 나트륨 이온 채널 : 전위차 나트륨 이온 채널(Voltage-gated Sodium Channel: 이하 "VGSC"로 약칭함)은 세포막에 위치하여 세포 안과 밖의 전위차를 인지하여 나트륨 이온을 선택적으로 세포 안으로 투과시키는 기능을 나타낸다. (Genome Biol. 2003, 4:207; J. Physiol. 1998, 508.3, 647-657) 복어 독인 테트로도톡신 (Tetrodotoxin)이 VGSC에 선택적으로 결합하여 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 국소 마취제로 알려진 리도케인(Lidocaine) 역시 VGSG에 결합하여 진통 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다.

VGSG는 10여종의 아류(Subtype)가 알려져 있는데, 그 중 Na_v1.7과 Na_v1.8은 통증 전달에 중요하며, Na_v1.5 는 심장박동에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 VGSC의 아류들의 활성 부위가 구조적으로 거의 동일하여, 각 VGSC아류를 리도케인과 같은 저분자 의약 분자로는 선택적으로 저해/구분하기 매우 어렵다. Na_v1.7는 SCN9A라는 mRNA로부터 발현된다.

최근 유전자 조사에 따르면, 불활성화된 Na_v1.7을 보유한 사람들은 화상, 자상, 타박상 등의 부상에 수반하는 심한 통증을 느끼지 못하지만 다른 신체 기능들은 정상인과 별반 차이가 없는 것으로 알려졌다 (Nature 2006 vol 444, 894-898). 따라서 VGSC 중 Na_v1.7을 선택적으로 저해하는 약물은 진통 효능은 매우 강하지만 부작용은 거의 없는 강력한 진통제가 될 것으로 기대된다. 특히 Na_v1.5를 저해하면 심장박동이 느려지는 부작용이 발생하므로 Na_v1.5를 저해하지 않고 Na_v1.7 만을 선택적으로 저해하는 약물의 발굴이 안전한 진통제 개발에 매우 중요하다.

최근에 Merck 사가 수십만개의 저분자 화합물 라이브러리를 약효 스크리닝하여 Na_v1.5 대비 Na_v1.7에 대한 선택성이 8배인 Na_v1.7 저해제를 발표하였다 (J. Gen. Physiol. 2008, vol 131, 399-405). 그러나 전신적으로 사용이 가능한 진통제가 개발되기 위해서는 Na_v1.7에 대한 선택성의 개선이 현저히 요구된다. 각 VGSC 아류의 활성 부위 구조가 구조적으로 매우 유사하여 각 아류를 저분자 화합물을 이용하여 구분하기는 매우 어려운 과제이다.

안티센스 올리고핵산 : 세포 안에서 전령 리보핵산(Messenger Ribonucleic Acid: 이하 "mRNA"라 칭함)의 특정 부위에 올리고 핵산(Oligonucleotide)이 강하게 결합할 경우, Ribosome이 mRNA에 결합하여 단백질을 합성하는 과정이 저해되며 mRNA에 의하여 생성되는 단백질의 합성이 저해된다. 이러한 올리고핵산을 통상적으로 안티센스 올리고핵산(Antisense Oligonucleotide: 이하 "ASO"라 칭함)이라 한다. 특정 단백질에 대응되는 mRNA에 강하게 결합하는 ASO를 이용하면 해당 단백질에 의하여 유래되는 질병이나 증상을 치료할 수 있다. ASO 치료제는 특정 단백질에 유래되는 질병이나 증상을 선택적으로 제어할 수 있기 때문에, 많은 연구가 진행되어 왔다. (Cancer Res. vol 48, 2659-2668, 1988) ASO인 고지혈증 치료제 미포메르센(Mipomersen) 이미 임상적으로 효능이 입증되어 임상3상 개발 중에 있다.

저분자 화합물 의약과 달리 ASO는 분자량이 매우 크기 때문에 세포막 투과가 매우 어렵고, 특별한 경우가 아니면 ASO의 세포 활성을 얻기가 매우 어렵다. ASO가 의약으로 개발되기 위해서는 세포막 투과가 좋아야 한다.

펩타이드 핵산 : 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid: 이하 "PNA"라 칭함)은 펩타이드 골격을 갖는 인공 핵산으로서 1991년 Nielsen 등에 의하여 발명되었다. (Science vol 254, 1497-1500, 1991) PNA 역시 DNA나 RNA에 상보적으로 결합하는 등 ASO로서 필요한 성질들을 보유한다. (Nature (London) vol 365, 566-568, 1992) 그러나 PNA는 동물세포에 대한 투과성이 좋지 않아, PNA 자체를 의약으로 개발하는데 한계가 있다. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)

당 업자는 최근에 PNA 모노머의 염기(Nucleobase)에 적절한 아미노기(Amino Radical)를 도입할 경우, PNA의 세포투과성과 핵산결합력이 현저히 개선된다고 보고한 바 있다. (WO 2009/113828) 본 발명에서는 이러한 변형된 PNA를 올리패스 올리고 핵산(OliPass Oligonucleotide: 이하 "OliPass Oligo"라 칭함)으로 정의하기로 한다. OliPass Oligo는 세포투과성이 좋을 뿐 아니라, 핵산결합력이 매우 강하기 때문에 ASO에 적절하다.

각 VGSC 아류의 활성 부위 구조가 구조적으로 매우 유사하여 각 아류를 저분자 화합물을 이용하여 구분하기는 매우 어려우나, 각 VGSC 아류의 mRNA 염기 서열은 많은 차이가 나기 때문에, ASO를 이용하여 Nav1.7 합성을 선택적으로 억제하는 것이 가능하다.

본 발명은 VSGC 아류(Subtype) Na_v1.7의 합성을 억제하는 올리고 핵산과 약제학적으로 허용된 염을 제공한다. 아울러 본 발명은 이러한 올리고 핵산이 작용하는 SCN9A mRNA의 작용 부위를 제공한다.

본 발명이 제공하는 올리고 핵산은 다음과 같이 <구조식 I>로 표시된다.

<구조식 I>

<구조식 I> 중,

X와 Y는 각각 알킬기, 알킬옥시 카르보닐기, 알킬 카르보닐기, 아릴기, 아릴 카르보닐기, 혹은 수소기이며,

Z는 알킬 아미노기, 아릴 아미노기, 혹은 아미노기이며,

B₁, B₃, 그리고 B₉은 아데닌(Adenine) 혹은 <구조식 II>로 표시되는 핵산 염기로서 A(5)로 정의하기로 하며,

<구조식 II>

B₄, B₅, B₁₀, 그리고 B₁₂는 티민(Thymine)이며,

B₂, B₇, B₈, 그리고 B₁₁은 싸이토신(Cytosine) 혹은 <구조식 III>으로 표시되는 핵산 염기로서 C(1/2)로 정의하기로 하며,

<구조식 III>

그리고, B₆는 구아닌(Guanine)이다.

아울러 본 발명이 제공하는 올리고 핵산이 작용하는 SCN9A mRNA (Accession Number NM_002977)은 염기 서열은 스타트 코돈(Start Codon)을 포함하는 47 ~ 58번이다.

<구조식 I>의 올리고 핵산은 다양한 방법으로 생체에 투여될 수 있는데, 정맥 주사, 피하 주사, 흡입형 분사 투여, 경구 투여 등이 있을 수 있는데 이러한 방법들에 한정되는 것은 아니다. <구조식 I>의 올리고 핵산은 약제학적으로 허용되는 보조제와 함께 투여될 수 있는데, 이들 보조제는 구연산, 염산, 염화나트륨, 타르타르산, 스테아린산, 녹말, 젤라틴, 탈크, 아스코르빈산, 올리브유, 야자유, 메틸셀룰로우스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리프로필렌글리콜, 감미료, 방부제, 에탄올, 티타늄옥사이드, 중탄산나트륨, 증류수, 등을 포함하나 꼭 이들에 한정하는 것은 아니다. <구조식 I>의 올리고 핵산은 다양한 제형으로 제조될 수 있는데, 주사액, 흡입형 분무액, 정제, 분말, 과립, 경질캡슐, 연질캡슐, 경구용 현탁액, 등을 포함하나 꼭 이에 한정되는 것은 아니다.

<구조식 I>의 올리고 핵산은 당량의 수산화칼륨, 수산화나트륨, 염산, 메틸설폰산, 구연산 등과 같이 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기로 중화시켜, 염으로 변환될 수 있다.

[올리고 핵산의 합성]

<구조식 I>의 올리고 핵산은 WO 2009/113828에 공개된 방법과 유사하게 Fmoc-PNA 모노머를 이용하여 고체상 펩타이드 합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)에 의하여 합성하였다. 합성된 올리고 핵산은 C₁₈ Reverse Phase HPLC (전개 용매: 아세토니트릴/증류수/0.1% TFA)를 이용하여 정제되었으며 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 동정하였다.

Fmoc-AC(1/2)A-TTG-C(1/2)CA(5)-TC(1/2)T-NH₂ (화합물 1)의 합성.

Fmoc-PNA 모노머를 이용하여 합성된 올리고머를 Prep HPLC (C₁₈ Reverse Phase, 0.1% TFA 아세토니트릴/증류수 그래디언트)로 정제 및 분리한 후, MALDI-TOF 질량분석기(Ultraflex MALDI-TOF, Burker Daltonics)를 이용하여 동정하였다. m/z = 3817.508 (이론치 3815.6217). 화합물 1의 구조식은 <도 1>에 표시된 바와 같으며, <도 2>는 정제된 화합물 1에 대한 MALDI-TOF 스펙트럼이다.

Fmoc-AC(1/2)A-AA(5)G-C(1/2)TC(1/2)-TGA(5)-NH₂ (화합물 2)의 합성.

화합물 2를 실시예 1과 유사한 방법으로 합성하여 정제 및 분리하였다. m/z = 3975.542 (이론치 3974.7462).

SCN9A 안티센스 활성 측정

ATCC에서 구매한 PC-3 세포주를 10% FBS가 보강된 F12K 배지를 이용하여 60mm 컬쳐 디쉬(Culture Dish)에서 배양하여 50~60% 포화도에 도달한 후 증류수에 녹인 <구조식 I>의 올리고 핵산, 증류수, 혹은 EPA(Eicosapentaenoic Acid)를 정해진 농도가 되도록 가하였다. 이렇게 처리된 세포를 이산화탄소 배양기에서 48 시간 추가로 배양하고, 차가운 PBS로 세포를 세척한 후, 프로테아제 저해제 칵테일(Complete Mini, Roche)을 녹인 RIPA 버퍼를 각 디쉬에 0.3 ml 가하여 라이시스(Lysis)시켰다. 라이세이트(Lysate)를 에펜도르프 튜브에 옮긴 후 30분간 얼음에 인큐베이션 시킨 후, 20,000g 에서 30분간 저온 원심 분리하여 얻어진 상층액 0.2 ml를 에펜도르프 튜브에 취하여 5X 샘플 버퍼 0.2 ml와 섞었다. 혼합된 라이세이트를 10분간 끓인 후 웨스턴 블롯(Western Blot) 방법으로 Na_v1.7 단백질에 대한 영향을 평가하였다. Na_v1.7 검출하기 위하여 PN1 항체(Sigma)가 사용되었으며, 각 라이세이트의 Na_v1.7 농도는 베타 액틴 시그널을 이용하여 상대 비교 및 분석하였다.

PC-3 세포에서 Na_v1.7의 분자량 220K에 근접하는 웨스턴 밴드는 매우 희미하거나 검출이 되지 않아 Na_v1.7의 정량에 사용하기는 어려웠으며, 대신 100K 부근의 강한 웨스턴 밴드를 이용하여 Na_v1.7 발현량을 측정하였다. PC-3 세포를 30 mM EPA로 48시간 처리한 경우, 100K 부근의 웨스턴 밴드의 강도가 현저히 주는 것으로 보아(<도 3> 참고), 100K 부근의 밴드를 Na_v1.7의 대사체로 간주하여 Na_v1.7 정량에 이용할 수 있다. 참고로 PC-3 세포에 EPA를 48시간 처리하면 SCN9A mRNA와 Na_v1.7 단백질 양이 줄어든다고 보고된 바 있다. (Brit. J. Pharmacol. (2009) vol 156, 420-431).

<도 3>은 PC-3 세포에 증류수, 3 mM 화합물 1, 3 mM 화합물 2, 30 mM EPA를 각각 48시간 처리한 후 100K 부근의 Na_v1.7 대사체 조각에 대한 영향을 웨스턴 블롯으로 평가한 결과이다. 화합물 1이 3 mM 농도에서 Na_v1.7 합성을 저해하며, 아울러 EPA 30 mM도 문헌에 보고된 바와 같이 Na_v1.7 합성을 저해하였다. 반면에 SCN9A mRNA의 안티센스 염기서열(75-86)을 갖고 있음에도 불구하고 화합물 2는 3 mM 농도에서 Na_v1.7 합성에 별다른 영향을 주지 못하였다.

Claims

<구조식 I>로 표시되는 올리고 핵산이나 이러한 올리고 핵산의 약제학적으로 허용되는 염.

<구조식 I>

<구조식 I> 중,
X와 Y는 각각 알킬기, 알킬옥시 카르보닐기, 알킬 카르보닐기, 아릴기, 아릴 카르보닐기, 혹은 수소기이며,
Z는 알킬 아미노기, 아릴 아미노기, 혹은 아미노기이며,
B₁, B₃, 그리고 B₉은 아데닌(Adenine) 혹은 <구조식 II>로 표시되는 핵산 염기로서 A(5)로 표시하기로 하며,
<구조식 II>

B₄, B₅, B₁₀, 그리고 B₁₂는 티민(Thymine)이며,
B₂, B₇, B₈, 그리고 B₁₁은 싸이토신(Cytosine) 혹은 <구조식 III>으로 표시되는 핵산 염기로서 C(1/2)로 표시하기로 하며,
<구조식 III>

그리고, B₆는 구아닌(Guanine)이다.
SCN9A mRNA 염기서열 47-58번 혹은 이를 전부 혹은 일부 포함하는 SCN9A mRNA 염기서열에 대한 안티센스 올리고 핵산.