KR20190043175A

KR20190043175A - Scn9a 안티센스 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20190043175A
Application number: KR1020197010517A
Authority: KR
Inventors: 정신; 정다람; 초봉준; 장강원; 윤흥식
Original assignee: 올리패스 주식회사
Priority date: 2016-09-16
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2019-04-25
Also published as: CN109996807A; JP2019531287A; RU2019110966A3; EP3512870A1; CN109996807B; RU2748834C2; RU2019110966A; EP3512870A4; WO2018051175A1; JP6997177B2; EP3512870B1; US20190218255A1; KR102443631B1

Abstract

본 발명은 인간 SCN9A 프리-mRNA의 일부분을 표적으로 하는 펩티드 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명의 펩티드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 SCN9A mRNA의 스플라이스 변형체의 생성을 강력하게 유도하며, 통증이나 Na_v1.7 활성을 포함한 질환을 안전하게 치료하는 데 유용하다.

Description

SCN9A 안티센스 올리고뉴클레오티드 {SCN9A Antisense Oligonucleotides}

본 발명은 SCN9A의 프리-mRNA를 표적으로 하여 전위차 나트륨 이온 채널 Na_v1.7 아형에 유관한 통증 및 증상을 치료하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이다.

a와 b의 서브유닛으로 구성된 전위차 나트륨 이온 채널은 (Voltage-gated sodium channels, VGSCs) 세포막에 위치하여, 나트륨 이온이 세포막을 투과할 때에 관문 역할을 한다. 나트륨 채널의 활성은 a-서브유닛에 의해 나타나는 데, 따라서 a-서브유닛의 아형에 따라 VGSC의 아형이 결정되며 현재까지 Na_v1.1, Na_v1.2, … Na_v1.9, 그리고 Na_vX와 같이 적어도 10 개의 아형이 존재한다.

각각의 VGSC는 뚜렷이 구별되는 별개의 a-서브유닛을 갖고 있으며 어느 조직에서 발현되느냐에 따라서 생물학적 활성이 다르다. 예를 들면 Na_v1.2는 중추 신경에서 발현되는 데 뇌전증과 (epilepsy) 유관된 것으로 알려져 있다 [Human Mol . Genet. vol 24(5), 1459-1468 (2015)]. Na_v1.5는 심근에서 (cardiomyocyte) 많이 발현되는 데, Na_v1.5를 저해하면 QT 시간이 길어져서 갑자기 사망할 수도 있다 [Handbook Exp . Pharmacol . vol 221, 137-168 (2014)]. Na_v1.7는 척수 신경절에서 (dorsal root ganglia, DRG) 많이 발현되는 데, Na_v1.7이 상향 조절되면 피부홍통증이 (erythromelalgia) 야기된다 [J. Med . Genet. vol 41, 171-174 (2004)]. 반면에 유전적으로 Na_v1.7의 활성이 없는 사람들은 (SCN9A channelopathy, 이온통로병증) 다른 감각들은 정상인 데 비해 심한 통증을 느끼지 못한다 [Nature vol 444, 894-898 (2006)].

테트로도톡신은 (Tetrodotoxin, TTX) 독어에서 발견된 신경독으로 독성이 매우 강해서 쥐에 복강 투여 시 50%를 사망시키는 양은 (LD₅₀) 10 mg/Kg이었다 [Toxins vol 6, 693-755 (2014)]. TTX를 입으로 먹게 되면 입술과 혀가 마비되며 과다한 침 분비, 발한 (sweating), 두통, 떨림 (tremor), 마비 (paralysis), 청색증 (cyanosis), 발작 (seizures), 조화운동불능 (incoordination), 설사, 복통, 저혈압, 호흡곤란, 심장부정맥, 혼수상태 등이 일어나게 된다. TTX의 이러한 부작용들은 TTX가 VGSC 여러 아형들의 활성 부위에 비특이적으로 결합한 결과라고 알려져 있으며, 따라서 VGSC 아형을 비특이적으로 저해할 위험이 있는 치료제의 개발은 매우 위험하다.

리도카인은 국부 마취제로 널리 사용되고 있는 비특이적인 VGSC 저해제이다. 정맥주사로 투여하면 근육 수축, 구토, 불규칙한 심장박동, 졸음 등의 부작용을 일으킨다. 그러나 리도카인으로 Na_v1.5를 저해하면 심실빈맥을 (ventricular tachycardia) 치료하는 데 유용할 수 있다. 그렇지만 만성 통증을 치료하기 위하여 리도카인을 전신성으로 투여하는 것은, VGSC 아형의 비특이적 저해에서 오는 부작용을 고려해볼 때 바람직하지 않다.

SCN9A 이온통로병증: SCN9A (sodium channel subtype 9A, 나트륨 채널 아형 9A) 유전자는 VGSC 아형 Na_v1.7의 a-서브유닛을 암호화한다. 다른 감각들은 정상인 데 비해 심한 통증을 느끼지 못하는 극소수의 사람들이 있는 데, 그 사람들은 SCN9A가 유전적으로 변이되어서 Na_v1.7의 활성이 없으며 [Nature vol 444, 894-898 (2006)], 이러한 것을 SCN9A 이온통로병증이라고 한다. 인간 SCN9A 이온통로병증의 행동 특성은 SCN9A 유전자 결여 쥐와 거의 유사하며 [PLoS One 9(9): e105895 (2014)], 따라서 Na_v1.7 아형을 선택적으로 저해하면 만성 통증을 안전하게 치료하는 데 유용할 것이다.

Na _v 1 .7의 선택적 저분자 억제제: VGSC의 생리적 기능을 반영하듯이, VGSC 아형들의 활성 부위에 있어서의 3차원적 구조는 매우 비슷하다. 저분자 억제제로 활성 부위를 직접 표적하여 Na_v1.7 아형만을 선택적으로 저해하는 것은 매우 어려울 것으로 예상되며, 리도카인과 테트로도톡신의 VGSC 아형들에 대한 비선택적 저해가 좋은 예이다.

Na_v1.8에 선택적인 억제제를 찾기 위하여 20만개의 화합물을 대용량 검색한 (high throughput screen) 결과, Na_v1.5보다 Na_v1.7에 대해 약 8배 선택적인 억제제를 발굴하였다 [J. Gen. Physiol . vol 131(5), 399-405 (2008)]. 아래의 1-벤즈아제핀-2-원 유도체는 전기생리학적 평가 결과 Na_v1.5보다 Na_v1.7을 약 8배 선택적으로 억제하였다.

현재까지 Na_v1.7에 선택적인 많은 저분자 억제제가 발견되었고 그 중 몇몇은 인간 환자에 대해 평가되었다. 예를 들면, 푸나파이드는 (Funapide, XEN-402/TV-45070) 피부홍통증 환자에 대해 진통 효과를 나타내기는 했지만, 상당히 많은 환자 군에서 치료와 관련된 어지럼증이나 졸음과 같은 용량제한 부작용을 일으켰다. 이러한 중추신경계에서의 부작용은 만성 통증을 안전하게 치료하기에 필요한 Na_v1.7에 대한 선택성이 충분하지 않다는 것을 의미한다.

락사트리진은 (Raxatrigine, CNV1014802/GSK-1014802) Na_v1.7뿐만 아니라 다른 VGSC 아형도 억제하지만, 나트륨 채널의 비활성 상태를 선택적으로 안정화 함으로서 나트륨 채널의 기능 활동을 억제한다고 알려져 있다. 락사트리진이 중추신경계에서 나트륨 채널을 억제하지만 치료용량에서는 잘 용인되고 있다 [The Pharmaceutical J. 11 Mar. 2016. Na_v1.7: a new channel for pain treatment]. 삼차 신경통 환자에 대한 임상 단계 IIa 연구에서 150 mg의 락사트리진을 1일 3회 투여하는 것은 잘 용인되었으나, 많은 환자들에 대해 효능이 한정적이어서 주 효능 평가의 기준을 충족하지 못하였다 [J. M. Zakrzewska et al. Lancet Neurol . Published Online Feb 16, 2017, http://dx.doi.org/10.1016/S1472-4422 (17) 30005-4].

PF-05089771는 IC₅₀가 11 nM인 Na_v1.7 선택적 억제제이며, 나트륨 채널의 비활성 상태를 안정화 한다고 알려져 있다 [Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a-1574a (2015)]. 피부홍통증 환자나 사랑니를 뺀 환자에 대해서 치료 효과를 평가하였는 데, PF-05089771의 약물동태학 분석에 의하면 신경성 통증의 목표 조직에서의 낮은 약물 농도가 나쁜 진통 효과의 원인일 것이라는 설명이다 [Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875-87 (2016)].

Na_v1.7에 선택적인 저분자 억제제들을 구조적인 측면에서 분석한 문헌에 따르면 [Bioorg. Med . Chem . Lett . vol 24, 3690-3699 (2014)], Na_v1.7에 선택적인 억제제들의 분자 크기는 리도카인과 같은 VGSC 아형들에 대해 비선택적인 억제제보다 상당히 크다. Na_v1.7에 대한 선택성은 억제제들을 크게 함으로서 향상되었다. 각각의 Na_v1.7에 선택적인 억제제들은 억제제의 화학 구조에 따라 Na_v1.7 단백질 내의 서로 다른 부위에 결합하는 것으로 생각된다. 아이러니 하게도, Na_v1.7에 선택적인 억제제들의 진통 효과는 크지 않으며 SCN9A 이온통로병증을 가진 사람들로부터 발견된 기대에 미치지 못하였다 [Expert Opin . Ther. Targets vol 20(8), 975-983 (2016)].

다른 종류의 Na _v 1 .7에 선택적인 억제제들: 타란툴라 (tarantula) 거미의 독 펩티드인 ProTx-II는 다른 VGSC 아형들보다 Na_v1.7을 선택적으로 억제하지만, 급성 염증성 통증의 동물 모델에서 진통 효과가 약했다 [Mol . Pharmacol. vol 74, 1476-1484 (2008)]. 독성 펩테드의 전기생리학 평가를, VGSC 아형들에서 아주 많이 발현되는 인간배아신장 세포주에서 (HEK-293) 했다는 것을 고려해 보면, ProTx-II는 Na_v1.7를 주로 발현하는 신경 세포에서 Na_v1.7의 활성 부위에 결합하지 않았을 수도 있다.

지네 독으로부터 분리된 46-머 펩티드인 Ssm6a는 다른 VGSC 아형들보다 Na_v1.7을 선택적으로 억제하는 데, Na_v1.7가 잘 발현되도록 만들어진 HEK-293 세포에서 IC₅₀가 0.3 nM로 측정되었으며 급성 염증성 통증 모델인 쥐의 포르말린 시험에서 모르핀과 유사한 진통 효과를 나타내었다. 또한 척수 신경절 세포에서 나트륨 전류를 억제하였다. 이 펩티드는 혈청에서 안정하였지만, 진통 효과는 몇 시간 밖에 유지되지 못하였다 [Proc . Nat. Acad. Sci . USA vol 110(43), 17534-17539 (2013)].

SVmab1은 VGSC 아형들을 과발현하는 HEK-293 세포에서 다른 VGSC 아형들보다 Na_v1.7을 선택적으로 표적하는 단일클론항체다. SVmab1은 Na_v1.7에 의한 나트륨 전류를 선택적으로 억제하였는 데, HEK-293 세포에서 IC₅₀가 30 nM로 측정되었다. 이 단일클론항체는 쥐의 포르말린 시험에서 50 mg/Kg을 정맥으로 혹은 10 mg 즉 0.5 mg/Kg을 척추강 내로 투여하였을 때 현저한 진통 효과를 나타내었다. 두 가지 투여 경로에 따른 진통 효과의 차이를 고려해보면, 포르말린 시험에서 진통 효과를 나타내기 위해서는 척수나 중추신경계에서 Na_v1.7을 억제하는 것이 중요하다 [Cell vol 157(6), 1393-1404 (2014)].

리보솜 단백질 합성: 단백질은 DNA에 있는 암호에 의해 합성된다. 핵에서 DNA로부터 전사된 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 결과적으로 생성된 m-RNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].

안티센스 올리고뉴클레오티드 ( ASO , Antisense Oligonucleotide): RNA나 DNA에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)를 안티센스 올리고뉴클레오티드라고 부르는 데, ASO는 mRNA 혹은 프리-mRNA와 강하게 결합할 수 있다.

mRNA에 강하게 결합하는 ASO는, 세포질에서 mRNA의 정보에 따른 리보솜의 단백질 합성을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 세포질 내에 있어야만 한다.

프리-mRNA에 강하게 결합하는 ASO가 프리-mRNA의 스플라이싱 과정을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 핵 내에 있어야만 한다.

비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오티드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈 (nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 올리고뉴클레오티드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)], 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오티드 중 몇몇의 화학 구조가 하기에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 예측한대로 결합한다.

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ( PTO , Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].

PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터가 (transporter) 많이 발현된 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].

PTO의 세포 투과성을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 세포 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.

지난 30여년간 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역 질환, 대사성 질환 등을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)]. 대부분의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포 투과성 부족으로 인하여 성공하지 못하였다. PTO의 세포 투과성 부족을 극복하기 위해서는, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 보체 활성화 (complement activation), 신장 독성 (tubular nephropathy), 쿠퍼 (Kupffer) 세포 활성화, 그리고 비장 비대, 비장 림프구 증식증, 단핵세포 침윤과 같은 면역 자극 등의 다양한 독성을 유발한다 [Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)].

여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장과 관련된 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센 (Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation vol 118, 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr . Opin . Mol . Ther . vol 6, 331-336 (2004)].

잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 DNA 혹은 RNA에 대한 핵산 결합력을 증가시키기 위하여 RNA의 리보스 (ribose) 고리 골격을 구조적으로 제한한 핵산이다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].

포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오티드 ( PMO , Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스 (2-deoxyribose)와 포스페이트 (phosphate)가 각각 포스포로다이아미데이트 (phosphorodiamidate)와 모폴린 (morpholine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드이다 [Appl . Microbiol. Biotechnol . vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 중성이다. 따라서 PMO와 RNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 RNA의 결합은 DNA와 RNA 사이의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터 (hepatic transporter)에 의해 인식되지 않지만, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.

펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸)글리신 을 단위 골격으로 갖는 폴리펩티드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 아래 그림에 도시되었다.

DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.

PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 띠지 않은 중성이기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않으며, PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 갖고 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv . Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, (2003)].

변형된 핵산 염기로 세포투과성을 높인 PNA: 양이온성 지질 (cationic lipid)이 핵산 염기에 공유 결합으로 연결된 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산 염기의 화학 구조는 다음과 같이 제공된다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 상보적이며 예측한대로 결합한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].

이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 리포펙션 (lipofection)과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 올리고뉴클레오티드 자체에 비해 세포막 투과가 용이하다.

이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 상보적인 DNA와 듀플렉스 (duplex)를 형성할 때 4~5개의 변형된 핵산 염기가 도입된 11~13머 (11~13-mer)의 PNA는 변형되지 않은 PNA에 비해 20^oC 이상 높은 T_m 값을 보인다. 또한, 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합 (mismatch)에도 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 순서에 따라 다르지만 약 11~22^oC의 낮은 T_m 값을 보인다.

작은 간섭 RNA ( siRNA , Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol . Mol . Biol . Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질의 상호 작용으로 형성된 “RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체” (RISC)는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합하여 mRNA를 절단함으로써 mRNA에 의한 단백질의 발현을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프 타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다 [Nature Rev. Drug Discov . vol 9, 57-67 (2010)]. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 또는 생체내 효과가 잘 나타나지 않는다.

SCN9A 의 siRNA: 인간 SCN9A mRNA 엑손 8에 있는 19-머 서열을 표적하는 [(5' → 3') GAUUAUGGCUACACGAGCU] siRNA를 발표한 선행 기술에서 [US8183221], 척추강 내로 투여한 siRNA가 신경성 통증과 염증성 통증의 동물 모델에서 치료 활성을 나타냈다고 주장하였다. 이 siRNA들은 쥐의 척수 신경절 세포에서 Na_v1.7의 발현을 하향 조절하는 것으로 보고되었다.

스플라이싱 (Splicing): DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사 (transcription)된다. 도 17에 요약된 바와 같이, "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거함으로써 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. vol 72, 291-336 (2003); Nature Rev. Mol . Cell Biol. vol 6, 386-398 (2005); Nature Rev. Mol . Cell Biol. vol 15, 108-121 (2014)].

스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 접속 인자의 초기 복합체인 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성으로 시작된다. 작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF³⁵은 인트론 N과 엑손 (N+1)에 결합하여 "스플라이스오솜 E 복합체"를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 작업이 진행된다.

안티센스의 스플라이싱 저해: ASO가 핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합하면, ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 저해하여 표적한 엑손이 결여된 mRNA를 만들게 된다. 이러한 mRNA는 접합부 변형체 또는 "스플라이스 변형체 (splice variant)라고 불리며 원래의 단백질보다 짧은 길이의 단백질을 생성한다.

"스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 저해하면 스플라이싱을 막을 수 있을 것이라 예상되는 데, 실제로 ASO가 (5' → 3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 "5' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면 ASO는 프리-mRNA와 U1의 결합을 막고 결과적으로 "스플라이스오솜 E 복합체"의형성을 막는다. 이와 유사하게 ASO가 (5' → 3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 "3' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 막는다.

안티센스의 SCN9A 프리 - mRNA 스플라이싱 저해: 현재까지 SCN9A 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 유도한 SCN9A ASO가 보고된 바는 없다.

본 발명의 목적은, 통증 전달에 중요하게 작용하는 인간 SCN9A 프리-mRNA의 일부분을 표적으로 하는 펩티드 핵산 유도체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 펩티드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 SCN9A mRNA의 스플라이스 변형체의 생성을 강력하게 유도하여 Na_v1.7의 합성을 선택적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 우수한 세포투과성과 핵산결합력을 바탕으로 인비보에서도 뛰어난 진통효과를 나타낸다.

발명의 요약

본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체와 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

화학식 I 중에서,

n은 10와 21 사이의 정수이며;

화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;

화학식 I의 화합물 전체가, 표적하는 SCN9A 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;

S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 중수소 (deuterido), 수소 (hydrido), 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH₂-C(=O)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.

화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 유도하여 “엑손 4”가 결여된 인간 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체를 형성하며, Na_v1.7의 활성과 관련된 통증이나 질환을 치료하는 데 유용하다.

발명의 상세한 설명

[화학식 I]

화학식 I 중에서,

n은 10와 21 사이의 정수이며;

“n은 10과 21 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 그리고 20 중에서 선택된다"는 것이다.

화학식 I의 화합물은 인간 SCN9A 유전자에서 [NCBI Reference Sequence: NG_000002.12] 유래된 인간 SCN9A 프리-mRNA의 "엑손 4"의 5' 스플라이스 위치와 강하게 결합한다. [(5' → 3') UUUGUCGUCAUUGUUUUUGC- GUAAGUACUUUCAGCUUUUU]는 인간 SCN9A 프리-mRNA 40머 서열인 데, 20머는 “엑손 4”에 그리고 20머는 “인트론 4에 속해 있으며, 엑손과 인트론 번호들은 보고된 SCN9A mRNA 전사 결과에 따라 다를 수 있다. 20머 프리-mRNA 서열을 제공하는 것은 인간 SCN9A 프리-mRNA 내에서 표적하는 5' 스플라이스 위치를 명백히 하기 위함이다.

40머의 프리-mRNA 서열은 [(5' → 3') UUUGUCGUCAUUGUUUUUGC┃guaaguacuuucagcuuuuu]로 표시하기도 하는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 인트론과 엑손의 연결 부분을 나타낸다. 따라서 본 발명의 화학식 I의 화합물을 서술하기 위한 14머 프리-mRNA [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA]는 [(5' → 3') UUUUUGC┃guaagua]로 표시될 수도 있다.

화학식 I의 PNA 유도체는 인간의 SCN9A 프리-mRNA에서 표적인 “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여 표적 스플라이스 위치를 포함하는 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 방해한다. 화학식 I의 PNA 유도체는 표적 스플라이스 위치를 포함하는 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 입체적으로 방해하기 때문에, SCN9A 엑손 4는 잘라져 나가게 되어 “엑손 4”가 결여된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체 혹은 변형체들이 생성된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 SCN9A “엑손 4”의 스키핑을 유도한다. 결과적으로 생성된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체 혹은 변형체들은 나트륨 이온 채널 활성과 같은 완전한 Na_v1.7 단백질의 기능성을 결여한 Na_v1.7 단백질 변형체 혹은 변형체들을 생성하게 된다.

선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 화학식 I의 PNA 유도체들과 상보적인 DNA나 RNA와의 이중나선의 (duplex) T_m 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 T_m 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다. 화학식 I의 PNA 유도체들과 10머 정도의 짧은 길이의 상보적인 DNA와의 이중나선의 T_m 값도 상당히 높다.

강한 결합력으로 인하여, “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치와 11-머 정도의 짧은 상보적인 결합을 하는 본 발명의 PNA 유도체는 세포 내에서 SCN9A “엑손 4”의 스키핑을 강하게 유도한다.

화학식 I의 PNA 유도체들은 상보적인 표적 SCN9A 프리-mRNA에 대해 강한 결합력을 가지고 있으며, 한두 개의 염기 부정합을 가지고 있는 화학식 I의 PNA 유도체들도 충분히 강한 결합력을 가지고 있어서 스플라이싱을 방해한다. 예를 들면, 어떤 14-머 화학식 I의 PNA 유도체는 본 발명의 14-머 SCN9A 프리-mRNA와 [(5' → 3') UUUUUGC┃guaagua] 12-머만 상보적인 결합을 하고 두 개의 염기 부정합을 가지고 있지만 SCN9A “엑손 4”의 스키핑을 유도한다. 그렇지만, 다른 유전자의 프리-mRNA에 결합하는 것을 피하기 위해서는 표적 프리-mRNA 서열에 대해 너무 많은 염기 부정합이 존재하는 것은 바람직하지 않다.

화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기의 구조는 도 1(A), 1(B), 그리고 1(C)에 예시되어 있다. 본 발명에서 천연에 존재하는 천연 또는 천연에 존재하지 않는 비천연 핵산염기는 도 1(A), 1(B), 그리고 1(C)에서 제공된 핵산염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 비천연 핵산염기들은 단지 핵산염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 본 발명의 표적 프리-mRNA 서열에 상보적이면서도 화학식 I의 PNA 화합물의 특정 부분을 이용한 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기의 변형을 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이다.

화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들은 도 2(A)-2(E)에 예시되어 있다. 도 2(A)는 치환체가 있거나 없는 알킬의 예들을 제공하고, 도 2(B)는 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예들을 예시하며, 도 2(C)는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환된 아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 또는 아릴설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 또는 아릴포스포닐의 예들을 나타낸다. 도 2(D)는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 또는 아릴옥시카보닐과 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 또는 아릴아미노카보닐의 예들을 예시하며, 도 2(E)는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐을 제공한다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA에 염기서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.

선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수해서 올리고뉴클레오티드 “그 자체”를 처치해도 세포 내에 쉽게 전달된다. 따라서 본 발명의 화합물 “그 자체”를 처리한 세포에서, 인간 SCN9A 프리-mRNA에 있는 “엑손 4”의 스키핑을 유도하여 “엑손 4”가 결여된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 화학식 I의 화합물 “그 자체”를 처리한 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해서 적은 양의 전체 길이 SCN9A mRNA가 발현되고 낮은 Na_v1.7 기능 활성을 보인다.

화학식 I의 화합물은 의도한 치료적 혹은 생물학적 활성을 위하여 전신성 전달을 용이하게 하기 위한 침습성의 제제가 (formulation) 따로 필요 없다. 화학식 I의 화합물은 보통, 포스페이트 완충용액이나 (PBS) 소금물에 녹인 후 전신성으로 투여하면 표적 조직에서 (주로 신경 세포) 원하는 치료적 (진통) 혹은 생물학적 활성을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 전신성 치료 활성을 위하여 강한 침습성의 제제가 따로 필요 없다.

화학식 I의 화합물은 그 자체를 전신성으로 투여해도 신경 세포나 조직에서 Na_v1.7의 발현을 억제한다. 따라서 본 발명의 화합물은 Na_v1.7의 과발현에 관련된 통증이나 증상을 안전하게 치료하는 데 유용하다.

화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 수산화 칼륨 (potassium hydroxide), 염산 (hydrochloric acid), 메탄설폰산 (methanesulfonic acid), 구연산 (citric acid), 그리고 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.

화학식 I의 화합물이나 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (tartaric acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜 (polypropyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (isopropanol), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 증류수, 그리고 방부제 (preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.

화학식 I의 화합물은 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 위해 1 nM/Kg 이하의 농도로 전신성 투여를 할 수 있는데, 그 농도는 투여 일정이나 대상자의 증상 등에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 10와 21 사이의 정수이며;

S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;

X와 Y는 수소[H], 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.

화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,

L₁, L₂ 그리고 L₃는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:

[화학식 Ⅴ]

화학식 V 중에서,

Q₁과 Q_m은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH₂-)이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;

Q₂, Q₃, … 그리고 Q_m _-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,

m 은 1과 16 사이의 정수이다.

본 발명의 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 12와 20 사이의 정수이며;

X와 Y는 수소, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;

Q₁과 Q_m은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;

Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,

m 은 1과 11 사이의 정수이다.

본 발명의 특히 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 12와 19 사이의 정수이며;

화학식 I의 화합물 전체가 표적하는 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;

X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;

Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;

Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,

m 은 1과 10 사이의 정수이다.

본 발명의 매우 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 12와 18 사이의 정수이며;

X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;

R₁, R₃, 그리고 R₅는 수소이고, R₂, R₄, 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;

Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;

m 은 1과 10 사이의 정수이다.

본 발명의 매우 더 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 12와 16 사이의 정수이며;

Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;

B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기, 그리고 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소이며;

Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;

m 은 1과 10 사이의 정수이다.

본 발명의 가장 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

화학식 I 중에서,

n은 12와 16 사이의 정수이며;

X는 수소이며;

Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소이며;

L₁은 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, 또는 -CH₂-O-(CH₂)₅- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,

L₂와 L₃는 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, 그리고 -(CH₂)₈- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.

본 발명의 PNA 유도체 중 특별히 중요한 것으로서 그 구체적인 예는, 다음 식의 PNA 유도체들과 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Piv-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) FAM-HEX-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Acetyl-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) H-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Me-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Benzyl-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-Lys-NH₂;

(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)AC-A(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-TA(6)C-GC(1O2)A-A(6)AA(6)-ACA(6)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A- A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Val-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Gly-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂;

(N→C) Piv-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Piv-Leu-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-A(5)GT-A(5)CT-TA(5)C-G(6)CA(5)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-A(5)TC(1O3)-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-Gly-A(5)TC(1O3)-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-Arg-NH₂;

(N→C) H-CTT-A(5)CG(3)- C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O3)AA(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)TA(5)-AA(5)T-C(1O2)AA(5)-NH₂;

(N→C) Benzoyl-CTT-A(5)CG(2O2)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O5)AA(5)-NH₂;

(N→C) n-Propyl-CTT-A(5)CG(2O3)-C(1O2)AA(3)-AA(5)A-C(2O2)AA(5)-NH₂;

(N→C) p-Toluenesulfonyl-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(8)-AA(5)A- C(1O2)AA(5)-NH₂;

(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CTT-A(5)CG(6)- C(1O2)AA(2O2)-AA(5)A-C(1O2)A A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(4)- AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂;

(N→C) N-Phenyl-N-Me-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)- AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)C-TTA(5)-CG(6)C-A(5)A-NH₂; 그리고,

(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)C-TTA(5)-CG(6)C-A(5)A-Lys-NH₂:

상기에서,

A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.

C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.

상기에서,

p와 q는 정수이며; 그리고,

N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "Me-"은 "메틸-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; "-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH₂"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.

도 3은 A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 약기된 PNA 모노머들에 대한 화학 구조를 집합적이고 명료하게 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 모노머로 인식된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"과 상보결합하기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과 염기 짝을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 모노머로 인식된다.

도 4는 본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 명료하게 예시한다.

약자들의 명확한 제시를 위해 본 발명의 14-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂"의 구조가 도 5(A)에 제공된다. 14-머 PNA "(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A- A(5)A-NH₂"의 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') TAA-ATA-CGC-AAA-AA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 14-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치에 걸쳐 있는 [(5' → 3') UUGUUUUUGC┃guaaguacuu]의 20-머 RNA 서열에 12-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 결합을 하는 부분이고 “인트론 4”에 인용 부호 (“ ”)로 표시한 부분이 두 개의 부정합 위치이다 [(5' → 3') UUG UUUUUGC ┃ gua "ag" ua cuu]. “인트론 4”에서 두 개의 염기 부정합에도 불구하고, 이 14-머 PNA는 화학식 I의 화합물의 상보성 결합 요건 즉, 다음의 요건 내에 있다.

“화학식 I의 화합물은 인간 SCN9A 프리-mRNA 내의 14-머 RNA 서열인 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA]와 적어도 10-머의 상보성 결합을 하며, 화학식 I의 화합물은 표적 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이거나 한 개 혹은 두 개 염기 부정합의 부분적 상보성을 갖는다."

또 다른 예로서, 본 발명의 16-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-AG(5)C- A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂"의 구조가 도 5(B)에 제공된다. 16-머 PNA의 서열은 SCN9A 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') AGC-ACT-TAC-GCA-AAA-A"의 DNA 서열에 상응한다. 이 16-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UUGUUUUUGC┃guaaguacuu]의 20-머 RNA 서열에 15-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 결합을 하는 부분이고 “인트론 4”에 인용 부호 (“ ”)로 표시한 부분이 한 개의 부정합 위치이다 [(5' → 3') UUG UUUUUGC ┃ guaagu "a" cu u]. “인트론 4”에서 한 개의 염기 부정합에도 불구하고, 이 16-머 PNA는 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

16-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA- A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH₂"의 서열은 SCN9A 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') ACT-TAC-GCA-AAA-ACA-A "의 DNA 서열에 상응한다. 이 16-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UUGUUUUUGC┃ guaaguacuu]의 20-머 RNA 서열에 16-머의 완전한 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 결합을 하는 부분이다 [(5' → 3') UUGUUUUUGC ┃ guaagu acuu]. 이 16-머 PNA는 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

17-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-TG(6)T-TA(5)A-A(5)TA(5)- CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂"의 서열은 SCN9A 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') TGT-TAA-ATA-CGC-AAA-AA "의 DNA 서열에 상응한다. 이 17-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UUGUUUUUGC┃ guaaguacuu]의 20-머 RNA 서열에 12-머의 상보적 결합을 하는 데, "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 결합을 하는 부분이고 “인트론 4”에 인용 부호 (“ ”)로 표시한 부분이 다섯 개의 부정합 위치이다 [(5' → 3') UUG UUUUUGC ┃ gua "ag" ua "cuu"]. 이 17-머 PNA는 상기의 14-머 PNA와 같이 12-머 상보성 결합을 하지만, “인트론 4”에 있는 다섯 개의 염기 부정합으로 인하여 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합하지 않는다. 17-머 정도 길이에 많은 염기 부정합이 있으면 SCN9A 프리-mRNA가 아닌 다른 프리-mRNA와 결합할 가능성이 있으므로 안전을 위해서 화학식 I 화합물의 범주에서 탈락시켜야 한다.

본 발명은 인간 SCN9A 프리-mRNA를 표적으로 하는 PNA 유도체를 제공한다. 이러한 PNA 유도체는 세포 내에서 엑손 스키핑을 강하게 유도하여 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체가 생성되게 하며, 통증이나 Na_v1.7 활성에 관련된 징후 및 질환을 치료하는 데 유용하다.

도 1(A)-1(C). 화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 핵산 염기나 비천연 핵산 염기의 예.
도 2(A)-2(E). 화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 치환체의 예.
도 3. 천연 혹은 비천연 핵산 염기를 갖는 PNA 모노머의 화학 구조.
도 4. N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 5(A). Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂의 화학 구조.
도 5(B). Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂의 화학 구조.
도 6. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하기 위해 사용되는 Fmoc-PNA 모노머의 화학 구조.
도 7(A)-(B). "ASO 4"의 HPLC 정제 전후의 C₁₈ 역상 HPLC 크로마토그램.
도 8. “ASO 4”의 HPLC 정제후의 C₁₈ ESI-TOF 매스 스팩트럼.
도 9(A). "ASO 9"를 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 PCR 산물의 전기 영동 결과.
도 9(B). “엑손 4” 및 “엑손 4-5”가 스키핑된 PCR 밴드의 생거 서열 데이터.
도 10(A). "ASO 9"를 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 10(B). "ASO 9"를 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석 결과.
도 11(A). "ASO 4"를 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 11(B). "ASO 5"를 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 11(C). "ASO 1"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 11(D). "ASO 6"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 11(E). "ASO 10"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 qPCR 결과.
도 12(A). "ASO 10"을 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석 결과.
도 12(B). "ASO 6"을 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석 결과.
도 12(C). "ASO 4"를 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석 결과.
도 12(D). "ASO 5"를 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석 결과.
도 13. SNL로 (L5 결찰 및 L6 절단) 유도된 SD쥐의 이질통에 대한 피하 투여한 “ASO 1”의 효과.
도 14. DPNP로 유도된 쥐의 이질통에 대한 피하 투여한 “ASO 5” 또는 경구 투여한 양성 대조군 프레가발린의 효과.
도 15. DPNP로 유도된 쥐의 이질통에 대한 피하 투여한 “ASO 9” 또는 “ASO 10”의 효과.
도 16. SNL로 (L5/L6 결찰) 유도된 SD쥐의 이질통에 대한 피하 투여한 “ASO 9”의 효과.
도 17. "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거함으로써 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다.

PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법

PNA 올리고머는 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법으로, 혹은 이를 약간 변형하여 Fmoc-화학에 기반한 고체상 펩타이드 합성 (SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드로부터 (PCAS BioMatrix Inc., 캐나다 퀘백 소재) 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스 (H-Rink Amide-ChemMatrix)였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머 및 천연 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머를 사용하여 본 발명의 PNA 유도체들을 합성하였다. PNA 올리고머를 C₁₈-역상 HPLC (0.1% TFA를 갖는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올)에 의해 정제하고 ESI/TOF/MS와 같은 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.

반응식 1은 상기 연구의 SPPS의 전형적인 모노머 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. 반응식 1의 각 반응 단계를 하기와 같이 간략하게 제공한다.

[반응식 1]

[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드 (MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머나 Fmoc으로 보호된 아미노산과 반응할 준비가 완료된다.

[Fmoc 제거 (DeFmoc)] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.

[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링 (Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol PNA monomer, 0.05 mmol HBTU, 그리고 10 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 2분 후에 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머의 화학적 구조는 도 6에 제공된다. 도 6에 제공된 변형 염기를 갖는 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다. 당해 분야의 숙련가들은 화학식 I의 PNA 유도체를 합성하기 위한 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들을 쉽게 변형할 수 있다.

[캡핑(Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액 (capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.

[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 염기성의 커플링 조건에서 "Fethoc-OSu"와 반응하여 레진의 N-말단 아민에 "Fethoc"기가 도입되는 데, "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C₂₀H₁₇NO₅, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같다.

[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액 (cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진에서 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압에서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.

[HPLC 분석 및 정제] 레진에서 분리된 PNA 유도체의 조생성물 (crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 구배 방법으로(gradient method) C₁₈-역상 HPLC로 정제한다. 도 7(A)와 7(B)는 "ASO 4"의 정제 전과 후의 C₁₈-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다. "ASO 4"의 서열은 표 1에 제공된다.

화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예

본 발명의 PNA 유도체는 위의 방법에 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 표 1은 인간 SCN9A 프리-mRNA “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치를 표적하는 SCN9A ASO들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 1에서 SCN9A ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.

인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치를 표적하는 SCN9A ASO와 매스 구조 분석 데이터

PNA 예	PNA 서열 (N→C)	정확한 질량, m/z
PNA 예	PNA 서열 (N→C)	theor.^a	obs.^b
ASO 1	Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	4640.19	4640.88
ASO 2	FAM-HEX-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	4887.24	4887.40
ASO 3	Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CTC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	4613.17	4612.51
ASO 4	Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	4652.20	4652.24
ASO 5	Fethoc-TG(6)T-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)- AA(5)A-A(5)A-NH₂	5574.61	5574.57
ASO 6	Fethoc-TA(5)A-C(1O2)TA(5)-CGA(5)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	4652.20	4652.24
ASO 7	Fethoc-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH₂	4261.98	4262.00
ASO 8	Fethoc-TA(6)C-GC(1O2)A-A(6)AA(6)-ACA(6)-A-NH₂	4318.05	4318.17
ASO 9	Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)- AC(1O2)A-A(5)-NH₂	5250.53	5250.46
ASO 10	Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A- A(5)AC-A(5)A-NH₂	5539.61	5539.57
AOS 11	Piv-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2	4500.17	4499.79
ASO 12	FAM-HEX-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂	3970.82	3974.17
ASO 13	Fmoc-TA(6)A-A(5)TA(6)-CGC(1O2)-AA(6)A- AA(6)C-A(6)-NH₂	5334.57	5335.59
ASO 14	Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH₂	4975.34	4975.34
ASO 15	H-CTT-A(5)CG(3)- C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O3)AA(5)-NH₂	4711.22	4711.25
ASO 16	Benzoyl-CTT-A(5)CG(2O2)-C(1O2)AA(5)- AA(5)A-C(1O5)AA(5)-NH₂	4873.30	4873.32
ASO 17	n-Propyl-CTT-A(5)CG(2O3)-C(1O2)AA(3)- AA(5)A-C(2O2)AA(5)-NH₂	4769.27	4769.30
ASO 18	p-Toluenesulfonyl-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(8)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH₂	4935.32	4935.29
ASO 19	[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(2O2)-AA(5)A-C(1O2)A A(5)-NH₂	4888.31	4888.32
ASO 20	Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)TA(5)-AA(5)T- C(1O2)AA(5)-NH₂	4957.32	4957.32
ASO 21	Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(4)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂	5330.60	5330.60
ASO 22	N-Phenyl-N-Me-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)- AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂	4957.40	4957.42

^a) 이론상 정확한 질량, ^b) 관측된 정확한 질량

도 7(A)는 “ASO 4” 조생성물의 HPLC 크로마토그램이다. 조생성물은 C₁₈-역상 HPLC로 정제하는 데, 도 7(B)는 정제한 “ASO 4”의 HPLC 크로마토그램이다. “ASO 4”의 순도는 HPLC 정제에 의해 현저히 향상되는 데, 도 8은 정제한 “ASO 4”의 ESI-TOF 질량 분석 스펙트럼이다. “ASO 4”의 분석 데이터를 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체의 본 발명에서의 정제 및 동정 방법을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.

" ASO 1"과 상보적인 10-머 DNA와의 결합력 (Binding Affinity)

표 1에 있는 화학식 I PNA 유도체들의 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA들과의 결합력을 측정하였다. 결합력은 PNA와 상보적인 10-머 DNA 이중나선의 T_m 값으로 평가하였다. 표 1에 있는 PNA와 전체 길이의 상보적인 DNA 이중나선의 T_m 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 T_m 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다.

T_m은 UV/Vis 분광 광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브 (falcon tube)에서 4 μM PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 10-머 DNA를 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90^oC에서 일분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하고, 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 260 nm에서 T_m을 측정하였다. T_m 측정에 사용된 10-머 DNA는 대전의 (주)바이오니아 (www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.

화학식 I PNA 유도체들의 T_m 값들은 10-머 결합으로서는 상당히 높게 나타났는 데, 그 결과들은 표 2에 요약되었다. 예를 들면, “ASO 10”은 [(N

C) Fethoc- Fmoc- TA (5)A-A(5) TA (5)- CGC (1 O2 )-A A(5)A-A(5)AC-A(5)A-NH₂]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 PNA 중의 N-말단 10-머를 타겟화하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 74.0℃의 T_m 값을 나타내었다. 반면에, "ASO 10"은 [(N

C) Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-C GC(1O2)-AA(5)A-A(5)AC- A(5)A -NH₂]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같은 PNA 중의 C-말단 10-머를 타겟화하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 68.6℃의 T_m 값을 나타내었다.

PNA 유도체들과 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA들과의 T_m 값.

PNA	T_m 값, ℃
PNA	N-말단에 대한 10-머 DNA	C-말단에 대한 10-머 DNA
ASO 5	63.5	71.6
ASO 9	65.0	64.6
ASO 10	74.0	68.6
ASO 14	76.0	77.0

화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예

화학식 I PNA 유도체의 생체 외 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 활성을 평가하였다. 이러한 안티센스 효능 평가 예들은 화학식 I PNA 유도체의 전체적인 생물학적 윤곽을 예시하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.

실시예 1. "ASO 9"에 의해 유도된 엑손 스키핑.

16-머 "ASO 9"는 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "엑손 4" 및 "인트론 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') CGUCA UUGUUUUUGC ┃ guaagu acuuucagc]의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 16-머 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 9"은 "엑손 4"와 10-머 결합을 하고 "인트론 4"와 6-머 결합을 하므로 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

PC3 세포에서 인간 SCN9A mRNA가 풍부하게 발현된다는 보고를 고려하여 [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)], PC3 세포에서 “ASO 9”가 SCN9A “엑손 4”의 스키핑을 유도하는 정도를 중첩 (nested) PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.

[세포배양 & ASO 처리] PC3 세포는 (Cat. No. CRL-1435, ATCC) 60 mm 배양 접시에서 5 mL Ham? F-12K 배양액에 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37^oC, 5% CO₂ 조건에서 세포 배양하였다. 세포들은 “ASO 9”를 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 18 시간 동안 처리한 후, 리보솜에 의한 번역을 막기 위해 100 mg/mL의 시클로헥사미드로 6 시간 동안 처리하였다.

[RNA 추출] 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.

[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 2_순방향: (5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 엑손 9_역방향: (5' → 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]의 유전자-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum^® Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script^® 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 mL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 40 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.

[중첩 PCR 증폭] 100배 희석한 1 mL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 3n_순방향: (5' → 3') GGACCAAAAATGTCGAGTATTT; 및 엑손 8_역방향: (5' → 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 “엑손 4”의 스키핑을 탐색하도록 고안된 프라이머 세트에 대해 20 mL 중첩 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 증폭시켰다: 95℃ 5분에 이어서, 35 주기의 95 ℃ 30초, 50 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분. “엑손 3n_순방향” 서열은 “엑손 4”의 스키핑을 탐색하기 위하여 “엑손 3”과 “엑손 5”의 연결 부위를 표적한다.

[엑손 스키핑 생성물의 확인] 2% 아가로스 젤 상에서 상기 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 생거 (Sanger) 서열분석에 의해 분석하였다. 10 zM 및 100 zM의 “ASO 9”로 처리한 PC3 세포에서도 “엑손 4”의 스키핑이 보이기는 했지만, 1 aM로 처리한 것에서 “엑손 4”의 스키핑이 눈에 띄게 강했다 [도 9(A)]. 도 9(B)에서 보는 바와 같이 “엑손 4”의 스키핑 밴드들은 생거 서열분석으로 명백하게 확인하였다.

실시예 2. "ASO 9”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR.

PC3 세포에서 "ASO 9”가 인간 SCN9A mRNA를 하향 조절하는 정도를, “엑손 4~6”에 작용하는 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.

[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL F-12K 배양액에 “ASO 9”를 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리한 PC3 세포를 24 시간 동안 배양하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시).

[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 2_순방향: (5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 엑손 9_역방향: (5' → 3') TTGCCTGGTTCTGTTCTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum^® Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script^® 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 20 mL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.

[중첩 qPCR 증폭] 50배 희석한 1 mL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 4_순방향: (5' → 3') GTACACTTTTACTGGAATATATAC; 엑손 4_역방향: (5' → 3') AATGACGACAAAATCCAGC; 엑손 5_순방향: (5' → 3') GTATTTAACAGAATTTGTAAACCT; 엑손 5_역방향: (5' → 3') CTGGGATT- ACAGAAATAGTTTTCA; 엑손 6_순방향: (5' → 3') GAAGACAATTGTAGGGGC; 및 엑손 6_역방향: (5' → 3') GTCTTCTTCACTCTCTAGGG]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 mL 실시간 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 사이버 그린으로 (SYBR Green, 타카라, 일본) 탐색하였고 주기 조건은 다으과 같다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.

[qPCR 결과] ASO를 처리한 세포들의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 엑손의 양, 즉 음성 대조군에 대해 정규화 하였다. 도 10(A)는 qPCR 결과를 요약한 것인 데, 10, 100, 그리고 1,000 zM 농도에서 “엑손 4~6”의 양이 70%, 40%, 그리고 20~30% 각각 감소하였다. 이러한 용량 반응 패턴은 “ASO 9”에 의한 엑손 스키핑 도중에 축적된 “엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)”에 의한 인위적 결과 때문일 것이다 [Nature Struc . Mol . Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].

실시예 3. "ASO 9”로 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제.

세포의 나트륨 전류는 보통 패치클램프 (patch clamp)로 측정한다. 나트륨 이온이 세포 안으로 들어가면 세포내의 나트륨 이온의 양이 증가하는 데, 나트륨 이온의 양은 나트륨 이온에 반응하는 염료에 의해 탐색할 수 있다. “코로나 그린”은 (CoroNa Green) 크라운 에테르 형의 나트륨 이온 킬레이트제를 (chelator) 이용한 염료인 데, 나트륨 이온이 킬레이트화하면 “코로나 그린”은 녹색 형광을 발한다. “코로나 그린”은 세포내의 나트륨 이온의 양을 간접적으로 측정하는 데 사용되어 왔는 데, “코로나 그린”으로 측정한 나트륨의 양은 나트륨 이온 패치 클램프로 측정한 나트륨 이온 전류와 연관성이 있다 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)].

SCN의 다름 아형들이 동시에 발현되기는 하지만, PC3 세포에서는 인간 SCN9A mRNA와 나트륨 전류가 풍부하게 발현된다 [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)]. Nav1.7 나트륨 채널 아형이 PC3 세포의 전체 나트륨 이온 전류 중에서 많은 부분을 차지한다면 활성이 있는 SCN9A mRNA를 하향 조절하면 PC3 세포의 나트륨 이온 전류가 상당히 줄어들 것이다.

PC3 세포에서 "ASO 9"가 나트륨 이온 전류를 얼마나 하향 조절하는가를 “코로나 그린”을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.

[세포배양 & ASO 처리] 35 mm 배양 접시에서 2 mL F-12K 배양액에 “ASO 9”를 0 (음성 대조용), 100 zM, 또는 1 aM의 농도로 처리한 PC3 세포를 배양하였다.

[코로나 분석] 30 시간 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 (Hank의 안정된 소금물, Cat. Number 14025-092, Life Technologies) 씻은 다음 2 mL의 HBSS를 가하였다. 37^oC에서 5 μM “코로나 그린”을 (Cat. Number C36676, Life Technologies) 가하고 30 분 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 씻은 다음 2 mL의 HBSS를 가하였다. 세포의 녹색 형광 영상을 계속 촬영하기 위한 디지털 비디오 카메라가 구비된 올림푸스 형광 현미경 위에 배양접시를 올려 놓았다. 세포를 100 mM 소금물로 급속히 처리하고, 한 프레임에 4 개의 세포가 들어간 세포의 형광 영상의 변화를 3 분간 촬영하였다. 각각 세포의 형광강도는 초 단위로 기록하였고, 각 시점에서 겹쳐 평균을 내었다. ImageJ 프로그램을 (버전 1.50i, NIH) 사용한 도 10(B)는 ASO의 농도에 따른 각 세포의 평균값들을 나타낸다. 형광강도 기록의 평균값은 0 (음성 대조용), 100, 그리고 1,000 zM의 “ASO 9”를 처리한 각 세포 내부의 나트륨 이온 농도로 간주하였다.

[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 10(B)에 요약하였다. 1,000 zM의 “ASO 9”를 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. ASO 처리에 의해 유도된 나트륨 전류 변화를 평가하기 위하여 100초 후의 평균 형광강도를 비교하였는 데, ASO를 처리하지 않았을 때는 81.86, 그리고 1,000 zM의 “ASO 9”를 처리하였을 때는 51.47 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 “ASO 9”를 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 37% 감소하였다 (p-값 = 0.035, 독립표본 t-검정). PC3 세포가 다양한 VGSC 아형들을 발현한다는 것을 고려할 때, 37%의 감소는“ASO 9”에 의한 Na_v1.7의 발현 억제가 현저하다고 할 수 있다. 100 zM의 “ASO 9”를 처리한 PC3 세포에서의 나트륨 전류는 별로 감소하지 않았다.

실시예 4. "ASO 4”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.

원래 14-머 "ASO 4"는 인간 SCN9A mRNA “엑손 4”와 “엑손 5”의 연결부위 14-머 서열을 상보적으로 표적하게 고안된 것이었다. 그러나, "ASO 4"는 우연하게도 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "엑손 4" 및 "인트론 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') CGUCAUUG UUUUUGC┃gua "ag" ua cuuucagc]의 5' 스플라이스 위치의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 12-머 서열과 상보성 결합을 하며, “인트론 4”에는 인용 부호로 표시한 (“ “) 두 개의 염기 부정합이 있다. "ASO 4"는 "엑손 4"와 7-머 결합을 하고 "인트론 4"와 5-머 결합을 하므로 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 2”와 같은 방법으로, “ASO 4”가 인간 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를, “엑손 4~6”에 작용하는 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 qPCR로 평가하였다.

[ASO 처리] 배양접시의 “ASO 4”는 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시).

[qPCR 결과] 도 11(A)는 qPCR 결과인 데, 10~1,000 zM의 농도의 “ASO 4”를 24시간 처리한 PC3 세포에서 “엑손 4~6”의 발현이 70% 이상 감소하였다.

실시예 5. "ASO 5”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.

원래 17-머 "ASO 5"는 인간 SCN9A mRNA “엑손 4”와 “엑손 5”의 연결부위 17-머 서열을 상보적으로 표적하게 고안된 것이었다. 그러나, "ASO 4"는 우연하게도 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "엑손 4" 및 "인트론 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') CGUCAUUG UUUUUGC ┃ gua "ag" ua "cuu"ucagc]의 5' 스플라이스 위치의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 12-머 서열과 상보성 결합을 하며, “인트론 4”에는 인용 부호로 표시한 (“ “) 다섯 개의 염기 부정합이 있다. "ASO 5"는 "엑손 4"와 7-머 결합을 하고 "인트론 4"와 5-머 결합을 한다. "ASO 5"와 "ASO 4"는 SCN9A 프리-mRNA에 대해 같은 정도의 상보성 결합을 하지만, "ASO 5"는 다섯 개의 염기 부정합 때문에 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합하지 않는다.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 2”와 같은 방법으로, “ASO 5”가 인간 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를, “엑손 4~6”에 작용하는 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 qPCR로 평가하였다.

[qPCR 결과] 도 11(B)는 “ASO 5”를 처리한 PC3 세포에서 얻은 qPCR 결과인 데, 10 zM, 100 zM, 그리고 1 aM 농도에서 “엑손 4~6”의 발현이 80%, 50%, 그리고 70% 각각 감소하였다.

qPCR 결과에 의하면 “ASO 5”가 SCN9A mRNA의 발현을 억제하기는 하지만, SCN9A 프리-mRNA에 대해서 다섯 개의 염기 부정합이 있어서 다른 프리-mRNA와 반응할 경향이 증가한다.

실시예 6. "ASO 1”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.

14-머 "ASO 1"은 "ASO 4"와 서열은 같고 N-말단만 "Fethoc”이 "Fmoc-"으로 바뀐 SCN9A ASO이다. 따라서 "ASO 1"은 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

[qPCR 결과] 도 11(C)는 “ASO 1”을 처리한 PC3 세포에서 얻은 qPCR 결과인 데, 10 zM, 100 zM, 그리고 1 aM 농도에서 “엑손 4~6”의 발현이 85%, 50%, 그리고 60% 각각 현저하게 감소하였다 (독립표본 t-검정).

실시예 7. "ASO 6”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.

"ASO 6"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "엑손 4" 및 "인트론 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') CGUCAUUG UUUUU "G" C ┃ gua "ag" ua cuuucagc]의 5' 스플라이스 위치의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 11-머 서열과 상보성 결합을 하며, "ASO 6"은 "엑손 4"와 6-머 결합을 하고 "인트론 4"와 5-머 결합을 한다. "ASO 6"은 인간 SCN9A 프리-mRNA에 대한 세 개의 염기 부정합 때문에 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합하지 않는다.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 2”와 같은 방법으로, “ASO 6”이 인간 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를, “엑손 4~6”에 작용하는 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 qPCR로 평가하였다. PC3 세포에 처리한 “ASO 6”은 0 (음성 대조용), 10, 또는 100 zM의 농도였다.

[qPCR 결과] 도 11(D)는 “ASO 6”을 처리한 PC3 세포에서 얻은 qPCR 결과인 데, 10 zM과 100 zM 농도에서 “엑손 4~6”의 발현이 약 80% 감소하였다 (독립표본 t-검정).

"ASO 6"이 세 개의 염기 부정합 때문에 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합하지 않지만, qPCR 결과에 의하면 SCN9A 프리-mRNA에 대한 11-머 상보적 결합은 PC3 세포에서 엑손 스키핑을 유도하기에 충분히 강하다.

실시예 8. "ASO 10”로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.

원래 17-머 "ASO 10"은 인간 SCN9A mRNA “엑손 4”와 “엑손 5”의 연결부위 17-머 서열을 상보적으로 표적하게 고안된 것이었다. 그러나, "ASO 10"은 우연하게도 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "엑손 4" 및 "인트론 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5' → 3') CGUCA UUGUUUUUGC┃gua "ag" ua cuuucagc]의 5' 스플라이스 위치의 30-머 RNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 15-머 서열과 상보성 결합을 하며, “인트론 4”에는 인용 부호로 표시한 (“ “) 두 개의 염기 부정합이 있다. "ASO 10"은 "엑손 4"와 10-머 결합을 하고 "인트론 4"와 5-머 결합을 하며, 본 발명의 화학식 I 화합물의 상보성 결합 요건에 부합한다.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 2”와 같은 방법으로, “ASO 10”이 인간 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를, “엑손 4~6”에 작용하는 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 qPCR로 평가하였다. PC3 세포에 처리한 “ASO 10”은 0 (음성 대조용), 10, 또는 100 zM의 농도였다.

[qPCR 결과] 도 11(E)는 “ASO 10”을 처리한 PC3 세포에서 얻은 qPCR 결과인 데, 10 zM과 100 zM 농도에서 “엑손 4~6”의 발현이 60%와 80% 각각 감소하였다 (독립표본 t-검정).

실시예 9. "ASO 10"을 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 3”과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "ASO 10"이 나트륨 이온 전류를 얼마나 억제하는가를 “코로나 그린”을 이용하여 평가하였다.

[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 12(A)에 요약하였다. 1,000 zM의 “ASO 10”을 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. 100초 후의 평균 형광강도는 ASO를 처리하지 않았을 때는 130.3, 그리고 1,000 zM의 “ASO 10”을 처리하였을 때는 89.7 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 “ASO 10”을 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 31% 감소하였다 (p < 0.001). 100 zM의 “ASO 10”을 처리한 PC3 세포에서의 감소한 나트륨 전류는 30% 이다 (p < 0.001).

실시예 10. "ASO 6"을 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 3”과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "ASO 6"이 나트륨 이온 전류를 얼마나 하향 조절하는가를 “코로나 그린”을 이용하여 평가하였다.

[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 12(B)에 요약하였다. 100 zM과 1,000 zM의 “ASO 6”을 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도와 차이가 나지 않았으며, PC3 세포에 “ASO 4”를 처리하고 30시간 배양하는 것이 나트륨 채널 활성의 감소를 유도하지 못하였다.

“실시예 7”에서 보았듯이 “ASO 6”이 완전한 SCN9A mRNA의 발현을 억제하지만, PC3 세포에서 나트륨 전류를 억제하지는 못하였다. “ASO 6”가 표적 프리-mRNA 서열에 대해 세 개의 염기 부정합이 있어서, 엑손 스키핑을 유도하기에 충분할 만큼 강하게 “엑손 4”의 5' 스플라이스 위치와 결합하지는 못하는 것 같다.

실시예 11. "ASO 4"를 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 3”과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "ASO 4"가 나트륨 이온 전류를 얼마나 하향 조절하는가를 “코로나 그린”을 이용하여 평가하였다.

[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 12(C)에 요약하였다. 100 zM의 “ASO 4”를 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. 100초 후의 평균 형광강도는 ASO를 처리하지 않았을 때는 89.3, 그리고 1,000 zM의 “ASO 4”를 처리하였을 때는 61.4 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 “ASO 4”를 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 31% 감소하였다 (p < 0.01). 그러나, 100 zM의 “ASO 4”를 처리한 PC3 세포에서의 감소한 나트륨 전류는 18%로 통계적 유의성이 없다.

실시예 12. "ASO 5"를 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제.

특별한 언급이 없는 한 “실시예 3”과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "ASO 5"가 나트륨 이온 전류를 얼마나 하향 조절하는가를 “코로나 그린”을 이용하여 평가하였다.

[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 12(D)에 요약하였다. 100 zM의 “ASO 5”를 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. 100초 후의 평균 형광강도는 ASO를 처리하지 않았을 때는 90.6, 그리고 100 zM의 “ASO 5”를 처리하였을 때는 60.8 이었다. 즉, PC3 세포에서 100 zM의 “ASO 5”를 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 33% 감소하였다 (p < 0.01).

그러나, 1,000 zM의 “ASO 5”를 처리하였을 때 100초 후의 평균 형광강도는 110.2로 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 “ASO 5”를 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 22% 증가하였다 (p < 0.05). 이러한 용량 반응 패턴은 “ASO 5”에 의한 엑손 스키핑 도중에 축적된 “엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)”에 의한 전사 상향조절의 결과 때문일 것이다 [Nature Struc . Mol . Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].

실시예 13. 척수신경결찰 모델에서 L5 및 L5/L6 결찰.

척수신경결찰은 (Spinal Nerve Ligation, SNL) 척수 신경절에서 신경병증을 유도하는 데, 신경성 통증의 모델로 널리 사용되고 있다 [Pain vol 50(3), 355-363 (1992)]. 척수 신경의 결찰 방법에 따라 다양한 SNL이 가능하며 척수 신경절에서 신경병증의 정도나 지속 기간도 신경의 결찰 방법에 따라 다양하다 [Pain vol 43(2), 205-218 (1990)]. 본 발명에서 수행한 두 가지 SNL 모델은, 더 심하고 오래 지속되는 신경병증을 유도하는 “L5/L6 결찰”(방법 B)과 “L5 결찰과 L6 절단” (방법 A) 이다.

[방법 A: L5 결찰과 L6 절단] 졸레틸/럼푼으로 (zoletil/rompun) 마취한 수컷 SD쥐의 (Sprague rat) L5와 L6 척수 신경을 단단히 묶고 L6는 절단한 다음, 무균 조건에서 근육과 피부를 봉합한다.

[방법 B: L5/L6 결찰] 졸레틸/럼푼으로 마취한 수컷 SD쥐의 L5와 L6 척수 신경을 단단히 묶고 무균 조건에서 근육과 피부를 봉합한다.

실시예 14. 폰프레이 검사에 의한 이질통 측정.

[방법 A: 폰프레이 검사 전자장비] 다음 서술과 같이 전자 폰프레이 지각검사계를 (von Frey anesthesiometer) [37450 Dynamic Plantar Aesthesiometer, Ugo Basile; 또는 Model Number 2390, IITC Inc. Life Sciences] 이용하여 이질통의 (allodynia) 정도를 측정하였다: 플라스틱 우리 안에서 30분 정도 안정화한 후 폰프레이 측정을 위해 준비한 동물의 결찰한 뒷 발에 (보통 왼쪽) 대해서 몇 분 간격으로 6번 측정한다. 동물이 측정에 대해 아직 익숙하지 않기 때문에 첫 번째 측정치는 제외하고, 나머지 다섯 번의 측정치 중에서 최고치와 최저치는 이상치로 (outlier) 제외한다. 나머지 세 개의 측정치의 평균을 폰프레이 측정의 결과로 한다.

[방법 B: 미세섬유 (Touch Test^® 폰프레이 검사] "위와 아래 (Up & Down)" 방법에 따라 미세섬유를 이용하여 (Touch Test^® 이질통의 정도를 측정하였다 [J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63 (1994)].

실시예 15. SNL로 유도된 이질통에 대한 “ASO 1”의 효과.

SNL로 유도된 쥐의 이질통을 경감시키는 “ASO 1”의 효과가 다음과 같이 평가되었다.

[SNL 시술 및 분류] “실시예 13”의 방법 A와 같이 L5는 결찰하고 L6는 절단하는 SNL 수술을 한 30마리의 수컷 SD쥐를 준비한 다음, 15일 후에 가장 낮은 폰프레이 측정치를 보인 18마리의 쥐를 고르고 무작위로 3개의 군으로, 즉 “ASO 1” 0 pmole/Kg (음성 대조용), 3 pmole/Kg, 그리고 10 pmole/Kg, 분류하였다.

[ASO 투여와 폰프레이 측정] “ASO 1”의 저장 수용액을 PBS로 희석하여 만든 3 nM과 10 nM 농도의 “ASO 1” 1 mL/Kg를 16, 18, 20, 22, 그리고 24일 후에 각각의 쥐에 피하 투여하였다. 20, 22, 24, 27, 그리고 29일 후에 “실시예 14”의 방법 A 즉, 폰프레이 검사 전자장비를 이용하여 폰프레이를 측정하였다. 20, 22, 그리고 24일 후의 경우에 폰프레이 측정 후에 ASO를 투여하였다. 폰프레이 측정치는 음성 대조군에 대한 통계적 유의성을 위하여 독립표본 T-검정을 사용하여 평가하였다.

[치료 효과] 도 13은 관찰된 폰프레이 측정치를 제공하는 데, 20, 22, 24, 그리고 27일 후에 ASO를 처치한 군의 폰프레이 측정치는 음성 대조군에 비하여 현저하게 높다. 24일 후 마지막으로 ASO를 투여한 다음 최소한 3일은 치료 효과가 지속되었다. 즉, 3 pmole/Kg 또는 10 pmole/Kg의 “ASO 1”을 피하 투여한 쥐에서 “L5 결찰”로 유도한 이질통이 현저하게 경감되었다.

실시예 16. 당뇨병 유발 말초 신경병성 통증의 유발.

제 I형 당뇨병 쥐에서 다음과 같이 말초 신경병성 통증이 (Diabetes-induced Peripheral Neuropathic Pain, DPNP) 유발되었다. 시트레이트 완충용액에 (pH 6) 녹인 스트렙토조신 (Streptozotocin) 60 mg/Kg을 약 200g의 수컷 SD쥐에게 복강 내로 투여하였다 [J. Ethnopharmacol. vol 72(1-2), 69-76 (2000)]. 말초 신경병증의 정도는 폰프레이 측정치로 평가하였다. SCN9A ASO들의 치료 활성을 평가하기 위하여 며칠 동안 안정적으로 낮은 폰프레이 측정치를 보인 동물들을 선택하였다.

실시예 17. 쥐에서 DPNP에 의한 이질통에 대한 “ASO 5”의 효과.

쥐에서 DPNP에 의한 이질통을 경감시키는 “ASO 5”의 효과가 다음과 같이 평가되었다.

[DPNP의 유발 및 분류] “실시예 16”과 같이 스트렙토조신을 수컷 SD쥐의 복강 내로 투여하여 제 I형 당뇨병을 유발하였다. 10일 후에 “실시예 14”의 방법 B로 10일 후에 측정한 폰프레이 측정치에 기초하여 DPNP를 가진 쥐를 무작위로 다음과 같이 분류하였다 (군당 8마리): 군1 “ASO 5” 0 pmole/Kg (음성 대조용), 군2 프레가발린 (pregabalin) 30 mg/Kg, 군3 "ASO 5" 0.01 pmole/Kg, 군4 "ASO 5" 0.1 pmole/Kg, 군5 "ASO 5" 1 pmole/Kg, 그리고 군 6 "ASO 5" 10 pmole/Kg.

[ASO 투여와 폰프레이 측정] “ASO 5”의 저장 수용액을 증류수로 (deionized distilled water, DDW) 희석하여 만든 0.01, 0.1, 1 그리고 10 nM 농도의 “ASO 5”를 11, 13, 15, 그리고 17일 후에 피하 투여하였다. 양성 대조군 프레가발린은 11과 17일 후에 경구 투여하였다.

11, 13, 15, 그리고 17일 후에 약물을 투여하고 2시간이 지난 다음 “실시예 14”의 방법 B으로 폰프레이를 측정하였다. 또한 마지막 약물 투여 후 약물 활성의 지속 시간을 평가하기 위하여 20일 후에 추가로 폰프레이를 측정하였다. 폰프레이 측정치는 음성 대조군에 (군1) 대한 통계적 유의성을 위하여 독립표본 T-검정을 사용하여 평가하였다.

[치료 효과] 도 14는 관찰된 폰프레이 측정치를 제공하는 데, ASO를 처치한 군 중에서 군6에서만 ("ASO 5" 10 pmole/Kg) 이질통이 음성 대조군에 비하여 현저하게 (~80%) 경감되었다. 11일 후에 보는 바와 같이 치료 활성은 몇 시간 만에 아주 빨리 나타났다. 17일 후를 보면 군6과 ("ASO 5" pmole/Kg) 군2에서 (프레가발린 30 mg/Kg) 비슷하게 나타났다. 군6의 치료 활성은 마지막 투여 3일 후인 20일 후에 거의 다 사라졌다.

실시예 18. DPNP에 의한 이질통에 대한 “ASO 9”와 “ASO 10”의 효과.

다른 언급이 없으면 “실시예 17”과 같이, 쥐에서 DPNP에 의한 이질통을 경감시키는 “ASO 9”와 “ASO 10”의 효과가 다음과 같이 평가되었다.

[분류] 10일 후에 DPNP를 가진 쥐를 무작위로 다음과 같이 분류하였다 (군당 8~9마리): DDW만 투약 (음성 대조용), "ASO 9" 100 pmole/Kg, 그리고 "ASO 10" 100 pmole/Kg.

[ASO 투여와 폰프레이 측정] “ASO 9”, “ASO 10”, 또는 DDW를 11, 13, 15, 17 그리고 19일 후에 피하 투여하였다. 양성 대조군 프레가발린은 11과 17일 후에 경구 투여하였다.

11, 13, 15, 17 그리고 19일 후에 약물을 투여하고 2시간이 지난 다음 폰프레이를 측정하였다. 또한 마지막 약물 투여 후 약물 활성의 지속 시간을 평가하기 위하여 21 및 23일 후에 추가로 폰프레이를 측정하였다. 폰프레이 측정치는 음성 대조군에 대한 통계적 유의성을 위하여 독립표본 T-검정을 사용하여 평가하였다.

[치료 효과] 도 15는 관찰된 폰프레이 측정치를 제공하는 데, “ASO 9”와 “ASO 10”에 의해서 이질통이 음성 대조군에 비하여 현저하게 경감되었다. 17 및 19일 후에 “ASO 9”는 이질통을 약 75% 경감하였고 “ASO 10”의 경우 19일 후에 이질통을 약 60% 서서히 경감하였다. “ASO 9”는 “ASO 10”보다 SCN9A 프리-mRNA와 상보적 결합을 더 많이 하는 데, 이 것이 두 ASO의 치료 효과 차이를 설명할 수 있다. ASO들의 치료 활성은 마지막 투여 2일 후인 21일 후에 거의 다 사라졌는 데, 이는 약력학적 (pharmacodynamics) 반감기가 며칠 이내라는 것을 의미한다.

실시예 19. SNL로 유도된 이질통에 대한 “ASO 9”의 효과.

SNL로 유도된 쥐의 이질통을 경감시키는 “ASO 9”의 효과가 다음과 같이 평가되었다.

[SNL 시술 및 분류] “실시예 13”의 방법 B와 같이 L5/L6을 결찰하고 12일 후에 폰프레이 측정치에 (“실시예 14”의 방법 A, 폰프레이 검사 전자장비) 기초하여 쥐를 고르고 무작위로 2개의 군으로, 즉 “ASO 9” 0 pmole/Kg (음성 대조용) 및 “ASO 9” 100 pmole/Kg, 분류하였다 (군당 6마리).

[ASO 투여와 폰프레이 측정] “ASO 9”의 저장 수용액을 PBS로 희석하여 만든 100 nM 농도의 “ASO 9” 1 mL/Kg를 22, 23, 그리고 24일 후 08시, 14시, 그리고 21시에 하루에 세 번 각각의 쥐에 피하 투여하였다. 22, 23, 그리고 24일 후 20시에 “실시예 14”의 방법 A로 폰프레이를 측정하였다. 20, 22, 폰프레이 측정치는 두 군들에 대한 통계적 유의성을 위하여 독립표본 T-검정을 사용하여 평가하였다.

[치료 효과] 도 16은 관찰된 폰프레이 측정치를 제공하는 데, 23 및 24일 후에 ASO를 처치한 군의 폰프레이 측정치는 음성 대조군에 비하여 현저하게 높다. 즉, 100 pmole/Kg의 “ASO 9”을 1일 3회 피하 투여한 쥐에서 “L5/L6 결찰”로 유도한 이질통이 현저하게 경감되었다.

Claims

화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]

화학식 I 중에서,
n은 10와 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 표적하는 SCN9A 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 중수소 (deuterido), 수소 (hydrido), 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH₂-C(=O)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌. 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택된다.
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 10와 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 표적하는 SCN9A 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 세 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.

화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
L₁, L₂ 그리고 L₃는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기쌍을 형성하는 부분인 핵산염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]

화학식 V 중에서,
Q₁과 Q_m은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH₂-)이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q₂, Q₃, … 그리고 Q_m _-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 16 사이의 정수이다
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 12와 20 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 표적하는 SCN9A 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X와 Y는 수소, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q₁과 Q_m은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 12와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가 표적하는 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 10 사이의 정수이다.
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 12와 18 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가 표적하는 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R₁, R₃, 그리고 R₅는 수소이고, R₂, R₄, 그리고 R₆는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 10 사이의 정수이다.
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 12와 16 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가 표적하는 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기, 그리고 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소이며;
Q₁과 Q_m은 메틸렌이고, Q_m은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q₂, Q₃, …, 그리고 Q_m _-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 10 사이의 정수이다.
제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 12와 16 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14개의 염기로 이루어진 RNA 서열 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가 표적하는 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S₁, S₂, ……, S_n _-1, S_n, T₁, T₂, ……, T_n _-1 그리고 T_n은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 포함하는 천연 핵산염기, 그리고 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B₁, B₂, ……, B_n _-1 그리고 B_n 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 그리고 R₆는 수소이며;
L₁은 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, 또는 -CH₂-O-(CH₂)₅- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L₂와 L₃는 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, 그리고 -(CH₂)₈- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
제 1항에 있어서, 다음 식의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Piv-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) FAM-HEX-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Acetyl-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Lys-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) H-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Me-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Benzyl-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-Lys-NH₂;
(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)AC-A(5)A-NH₂;
(N→C) Fethoc-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-TA(6)C-GC(1O2)A-A(6)AA(6)-ACA(6)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH₂;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A- A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Val-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Gly-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH₂;
(N→C) Piv-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Lys-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Piv-Leu-AG(5)T-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-A(5)GT-A(5)CT-TA(5)C-G(6)CA(5)-A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Lys-A(5)TC(1O3)-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-NH₂;
(N→C) Fethoc-Gly-A(5)TC(1O3)-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)A-Arg-NH₂;
(N→C) H-CTT-A(5)CG(3)- C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O3)AA(5)-NH₂;
(N→C) Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH₂;
(N→C) Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)TA(5)-AA(5)T-C(1O2)AA(5)-NH₂;
(N→C) Benzoyl-CTT-A(5)CG(2O2)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O5)AA(5)-NH₂;
(N→C) n-Propyl-CTT-A(5)CG(2O3)-C(1O2)AA(3)-AA(5)A-C(2O2)AA(5)-NH₂;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(8)-AA(5)A- C(1O2)AA(5)-NH₂;
(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CTT-A(5)CG(6)- C(1O2)AA(2O2)-AA(5)A-C(1O2)A A(5)-NH₂;
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(4)- AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂;
(N→C) N-Phenyl-N-Me-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)- AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH₂;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)C-TTA(5)-CG(6)C-A(5)A-NH₂; 그리고,
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)C-TTA(5)-CG(6)C-A(5)A-Lys-NH₂:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.

상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "Me-"은 "메틸-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; "-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체혼합물)"; "-NH₂"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
제 1항의 펩타이드 핵산 유도체을 투여하여 통증이나 Na_v1.7 활성을 포함한 질환을 치료하는 방법.
제 1항의 펩타이드 핵산 유도체을 투여하여 만성 통증을 치료하는 방법.
제 1항의 펩타이드 핵산 유도체을 투여하여 신경병성 통증을 치료하는 방법.