BR112019013203A2 - oligonucleotídeos antissenso snap25 - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a derivados de ácido nucléico peptídeo alvejando um sítio de remoção 3? do pré-mrna snap25 hu-mano. os derivados de ácido nucléico peptídeo induzem potencialmente pelo menos uma variante de remoção do mrna snap25 humano em células, e são úteis para tratar seguramente indicações ou condições dermatológicas envolvendo a expressão da proteína snap25 humana através de administração tópica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO SNAP25.

[0001] A presente invenção refere-se a derivados de ácido nucléico peptídeo alvejando o pré-mRNA SNAP25 para o tratamento de indicações ou condições dermatológicas mediadas pela proteína SNAP25, e reivindica o benefício de prioridade de pedido provisório U.S. N° 62/443 262 depositado em 6 de janeiro de 2017, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Endocitose é um processo para células absorverem moléculas grandes na célula. Enquanto isso, exocitose é um processo para células secretarem materiais ou conteúdos intracelulares para fora da célula. Existem abundantes tipos de células inteligentemente adotando exocitose para secretar conteúdo vesicular ou materiais para fora da célula. Células neuronais evoluíram para secretarem neurotransmissores através de exocitose para seus papéis fisiológicos destinados para comunicação com células neuronais vizinhas ou tecidos vizinhos. Como um outro exemplo parar exocitose, mastócitos liberam histamina através de exocitose e como resultado recrutam células imunes.

[0003] Vesículas secretórias contêm vários tipos de materiais vesiculares que podem variar dependendo de tipo de célula. Por exemplo, vesículas pré-sinápticas em células neuronais estão localizadas em terminais neuronais pré-sinápticos e contêm um coquetel de neurotransmissores. A membrana vesicular se funde com a membrana de plasma para liberar neurotransmissores em região sináptica para controlar ou afetar fisiologicamente células ou tecidos vizinhos. Células β nas ilhotas pancreáticas possuem vesículas carregadas com insulina, e as vesículas sofrem exocitose envolvendo fusão de membrana para liberação de insulina na corrente sanguínea em resposta ao nível de glicose no sangue [Cell Metabolism, vol 5, 237-252 (2007)].

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2/51 [0004] Exocitose é um processo celular envolvendo uma fusão da membrana vesicular com a membrana de plasma. Existem dois tipos de exocitose, isto é, constitutiva e regulada. Exocitose constitutiva ocorre espontaneamente sem um sinal estimulador. Enquanto isso, exocitose regulada é disparada por um específico sinal estimulador, por exemplo, um aumento na concentração de íon cálcio intracelular em células motores neuronais [Am. Ver. Cell Dev. Biol. Vol 16, 19-49 (2000)].

[0005] Exocitose em junção sináptica: Células neuronais se comunicam umas com as outras usando uma maquinaria chamada junção sináptica especializadas em células neuronais. O processo de exocitose ocorrendo na junção sináptica entre células neuronais vizinhas é ilustrado esquematicamente na Figura 1A. Primeiro, vesículas contendo partículas de neurotransmissores se fundem com a membrana de plasma pré-sináptica em resposta a um sinal estimulador tal como uma mudança na concentração de íons cálcio sentida pelo axônio neuronal. Com a fusão de membranas, partículas neurotransmissoras são liberadas na junção pré-sináptica. Então as partículas neurotransmissoras se difundem e ligam-se a receptores de neurotransmissores expressos sobre a membrana dendrítica de uma célula neuronal vizinha. Finalmente, os receptores são ativados com complexação com a molécula neurotransmissora, e transduzem o sinal neuronal transmitido a partir do axônio da célula neuronal vizinha.

[0006] Excitose Em Junção Neuromuscular: Neurônios motores controlam o movimento de músculos usando a exocitose na junção neuromuscular. Em músculos, um axônio de neurônio motor ramifica em um número de terminais axônio para formação de junções com a membrana sarcolema de células de músculo, isto é, junções neuromusculares. [Nat. Ver. Neuroscience, vol 2, 791-805 (2001)]. A folga entre o terminal de axônio neuronal e a membrana de célula de músPetição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 22/124

3/51 culo é chamada fenda sináptica de uma dimensão de aproximadamente 30 nm.

[0007] Quando um pulso de nervo na forma de potencial de ação atinge o terminal de axônio de um neurônio motor, transmissão sináptica se inicia na junção neuromuscular. O axônio de neurônio motor libera moléculas neurotransmissoras (isto é, acetil colina em vertebrados) na fenda sináptica através de exocitose, e receptores de acetil colina expressos sobre a membrana de célula de músculo são ativados com complexação com acetil colina, o que dispara a contração da fibra de músculo. O processo exocitose ocorrendo na junção neuromuscular entre axônio neuronal e célula de músculo é ilustrado esquematicamente na Figura 1B.

[0008] Proteínas SNARE e Exocitose Neuronal: A fusão da membrana vesicular e membrana de célula neuronal é essencial para exocitose regulada. Tal exocitose regulada é conhecida ser mediada por proteínas SNARE (receptores de proteína de ligação de fator sensível a N-etil maleimida solúvel). [Ann. Ver. Cell Dev. Biol. Vol 16, 1949 (2000)]. Na exocitose neuronal estão envolvidas três proteínas SNARE, isto é, proteína de membrana associada - vesícula (VAMP2, também conhecida como sinaptobrevina), uma proteína de transmembrana de passe-simples localizada na membrana vesicular (v-SNARE); proteína associada a sinaptossoma de 25 kDa (SNAP25); e sintaxina 1A, uma proteína de transmembrana simples que reside na membrana de plasma neuronal (t-SNARE). Sintaxina 1A e VAMP2 possuem um domínio transmembrana terminal-C para ancoragem na membrana vesicular e de plasma neuronal, respectivamente. A ancoragem em membrana de SNAP25 é facilitada pelos grupos palmitoíla ligados covalentemente a vários resíduos cisteína na proteína [Am. J. Physiol. Cell Physiol. Vol 285, C237-249 (2003)].

[0009] O potencial de axônio neuronal ativa canais de cálcio de

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4/51 portão de voltagem e aumenta a concentração de íons cálcio dentro de axônio, o que puxa para baixo vesículas sinápticas próximas de membrana pré-sináptica através de complexação de íons cálcio com sinapttotagmina. Então a fusão da membrana vesicular sináptica com a membrana de plasma axonal é auxiliada como ilustrado esquematicamente na Figura 2A. A formação do complexo ternário de sintaxina, SNAP25 e snaptobrevina dirige as duas membranas para orientação em proximidade e então para sofrerem fusão de membranas para liberação de partículas de acetil colina na fenda sináptica. [Toxins vol. 2, 24-53 (2010)]. Assim, a formação de complexo ternário das proteínas SNARE é o elemento essencial da fusão de membranas envolvida na liberação de neurotransmissores.

[0010] Botulinum Toxina A: Botulinum toxina (BTX) é uma neurotóxi na produzida pela bactéria Clostridium botulinum. A forma ativa de toxina são cadeias de polipeptídeo simples (150 kDa) consistindo na cadeia pesada (100 kDa) e leve (50 kDa) encadeadas uma a outra com uma ligação dissulfeto. BTX é conhecida ser facilmente absorvida em célula neuronal, clivar proteínas SNARE, bloquear a liberação de acetil colina, resultantemente privando a célula neuronal do caráter muito essencial como célula neuronal. Células neuronais expostas a BTX falham para disparar a contração de fibras músculos vizinhas.

[0011] Com entrada em célula neuronal, BTX é clivada em duas partes, isto é, a cadeia leve e pesada. A cadeia leve é uma zinco metaloprotease responsável pelo papel como neurotoxina. Subtipos A, C e E de BTX clivam SNAP25. Enquanto isso, subtipos B, D, F e G degradam VAMP, e subtipo C hidrolisa sintaxina. [Nature, vol. 365, 160163(1993)].

[0012] Uso Cosmético de Botulinum Toxina A: Botulinum toxina A foi originalmente desenvolvida por Allergan para uso cosmético principalmente para tratar rugas faciais. Botox® é uma famosa marca regis

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5/51 trada por Allergan, e é frequentemente tomado como sinônimo para BTX em comunidades públicas.

[0013] Dado com sua atividade fisiológica, BTX A pode ser usada em princípio para tratar um número de distúrbios envolvendo contrações de músculos superativas ou espasmos da cabeça e pescoço, pálpebras, membros, maxilar, e cordas vocais. Adicionalmente, BTX pode ser usada para tratar distúrbios de hipersecreção incluindo hiper salivação e hiperidrose. [Indian J. Dermatol. Vol 55, 8-14 (2010)].

[0014] Injeção de Botox® foi aprovada por US FDA em 2002 para o tratamento de rugas faciais, e é vista como segura se praticada adequadamente por dermatologista versado. Entretanto BTX é notória por sua toxidez. BTX tipo A e B, por exemplo, são estimadas serem letais para humanos se injetadas intravenosamente em 1,3 ~2,1 ng/kg. [Indian J. Dermatol. Vol 55, 8-14 (2010)]. Ainda existem conceitos sobre a segurança de BTX para uso cosmético. Paralisia facial, fraqueza de músculo, e problemas para engolir são os eventos adversos mais comuns observados em sujeitos administrados com injeção intramuscular de BTX. Efeitos colaterais mais sérios são causados por exposição sistêmica devido a super dose ou habilidades pobres de injeção intramuscular local, e incluem dor de cabeça, síndromes semelhantes a resfriados, e reações alérgicas. Repetidas injeções de BTX são conhecidas induzirem respostas antigênicas, que limitam o uso cosmético de BTX. Efeitos colaterais de uso terapêutico podem ser mais sérios que uso cosmético, e podem incluir arritmia, ataque cardíaco, crises, impedimento respiratório, e morte. [J. Am. Acad. Dermatol. Vol 53, 407-415 (2005)].

[0015] De modo a minimizar os efeitos colaterais em sujeitos recebendo injeção de BTX para uso cosmético, liberação localizada ou tópica de BTX pode ser muito preferida no lugar de rota convencional da injeção local intramuscular. BTX é uma macromolécula de tamanho de

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150K. Ainda é um desafio extremo liberar topicamente BTX profundo na camada de músculo debaixo de derme sem basear-se em formulações invasivas.

[0016] Argirelina: Argirelina é um hexa peptídeo sintético derivado do terminal-N da proteína SNAP25. Argirelina é comercializada como produtos cosméticos para rugas faciais. O hexa peptídeo foi reivindicado para antagonizar a formação do complexo SNARE com a proteína SNAP25. O hexa peptídeo está imitando a função de BTX, e pode ser útil para reduzir rugas faciais com administração tópica. Argirelina foi reportada reduzir rugas faciais em sujeitos humanos com uso tópico. [Am. J. Clin. Dermatol. Vol 14(2), 147-153 (2013)].

[0017] Pré-mRNA: Informação genética é transportada sobre DNA (ácido 2-desoxirribose nucléico). DNA é transcrito para produzir prémRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. Pré-mRNA de mamífero usualmente consiste em exons e introns, e exon e intron estão interconectados uns aos outros como provido esquematicamente abaixo. Exons e intros são numerados como ilustrado esquematicamente na Figura 2B.

[0018] Remoção de pré-mRNA: Pré-mRNA é processado em mRNA seguindo supressão de introns através de uma série de reações complexas chamadas coletivamente de remoção como esquematicamente resumido na Figura 3A [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]. Remoção é iniciada por formação de complexo splicessoma E (isto é, complexo splicessoma inicial) entre pré-mRNA e fatores adaptadores de remoção. Em complexo splicessoma E, U1 se liga à junção de exon N e intron N, e U2AF³⁵ se liga à junção de intron N e exon (N+1). Assim as junções de exon/intron ou intron/exon são críticas à formação do complexo spliceossoma inicial. Complexo spliceossoma E evolui em complexo

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7/51 spliceossoma A com adicional complexação com U2. O complexo spliceossoma A sofre uma série de reações complexas para deletar ou remover ο intron para ficar em contato a exons vizinhos.

[0019] Síntese de Proteína Ribossomal: Proteínas são codificadas por DNA (ácido 2-desoxirribose nucléico). Em resposta a estimulação celular ou espontaneamente, DNA é transcrito para produzir prémRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. Os introns de pré-mRNA são enzimaticamente removidos para renderem mRNA (ácido ribonucleico mensageiro), que é então translocado no citoplasma. No citoplasma, um complexo de maquinaria de translação chamado ribose se liga a mRNA e realiza a síntese de proteína quando explora a informação genética codificada ao longo de mRNA. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. Vol 48, 2659-2668 (1988)].

[0020] Oligonucleotídeo antissenso (ASO): Um oligonucleotideo ligando a ácido nucléico incluindo DNA, mRNA e pré-mRNA em uma maneira específica de sequência (isto é, complementarmente) é chamado oligonucleotídeo antissenso (ASO).

[0021] Se um ASO se liga hermeticamente a um mRNA no citoplasma, por exemplo, o ASO pode ser capaz de inibir a síntese de proteína ribossomal ao longo de mRNA. ASO precisa estar presente dentro de citoplasma de modo a inibir a síntese de proteína ribossomal de sua proteína alvo.

[0022] Se um ASO se liga fortemente a um pré-mRNA no núcleo, o ASO pode ser capaz de inibir ou modular a separação de pré-mRNA em mRNA. O ASO precisa estar dentro de núcleo de modo a inibir ou modular a separação de pré-mRNA em mRNA. Tal inibição antissenso de separação produz um mRNA ou mRNAs carecendo de exon alvejado pelo ASO. Tais mRNAs são chamados variantes de separação, e codificam proteínas menores que a proteína codificada pelo mRNA

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8/51 de comprimento inteiro.

[0023] Em princípio, remoção pode ser interrompida através de inibição de formação de complexo spliceossoma E. Se um ASO ligase fortemente a uma junção de exon-intron (5’^3’), isto é sítio de remoção 5’, o ASO bloqueia a formação de complexo entre pré-mRNA e fator U1, e por isso a formação de complexo spliceossoma E. Da mesma maneira, complexo spliceossoma E não pode ser formado se um ASO se liga fortemente a uma junção de intron-exon (5’^3’), isto é, sítio de remoção 3’. Sítio de remoção 3’ e sítio de remoção 5’ são ilustrados esquematicamente na Figura 3B.

[0024] Oligonucleotídeos Não Naturais: Oligonucleotídeos DNA ou RNA são suscetíveis a degradação por nucleases endógenas, limitando sua utilidade terapêutica. Atualmente, muitos tipos de oligonucleotídeos não naturais (isto é, não ocorrendo naturalmente) foram desenvolvidos e estudados intensivamente. [Clin. Exp. Paharmacol. Physiol. Vol 33, 533-540 (2006)]. Alguns deles mostram estendida estabilidade metabólica comparados a DNA e RNA. São providas na Figura 4A estruturas químicas para alguns oligonucleotídeos não naturais representativos. Tais oligonucleotídeos previsivelmente se ligam a ácido nucléico complementar como DNA ou RNA faz.

[0025] Oligonucleotídeo fosforotioato: Oligonucleotídeo fosforotioato (PTO) é um análogo de DNA com um dos átomos de oxigênio de fosfato de cadeia principal substituído com um átomo de enxofre por monômero. Uma tal pequena mudança estrutural torna PTO comparativamente resistente a degradação por nucleases endógenas. [Ann. Rev. Biochem. Vol 54, 367-402 (1985)].

[0026] Refletindo a similaridade estrutural na cadeia principal de PTO e DNA, ambos penetram pobremente a membrana de célula em maio ria de tipos de células de mamíferos. Para alguns tipos de células expressando abundantemente transportador(s) de DNA, entretanto,

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DNA e PTO mostram boa penetração em célula. Administrados sistemicamente PTOs são conhecidos distribuírem facilmente para fígado e rim. [Nucleic Acids Res. Vol 25, 3290-3296 (1997)].

[0027] De modo a facilitar penetração em células de PTO in vitro, lipofecção tem sido popularmente empregada. Entretanto, lipofecção altera fisicamente a membrana de célula, elícita citotoxidez, e por isso pode não ser ideal para uso terapêutico de longo termo in vivo.

[0028] Sobre os últimos 30 anos, PTOs antissenso e variantes de PTOs têm sido clinicamente avaliados para tratar cânceres, distúrbios imunológicos, doenças metabólicas, e assim por diante. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol 33, 533540 (2006)]. Muitos de tais candidatos a droga antissenso não foram desenvolvidos com sucesso parcialmente devido a pobre permeabilidade de célula de PTO. De modo a superar a pobre permeabilidade de célula, PTO precisa ser administrado em alta dose para atividade terapêutica. Entretanto, PROs são conhecidos mostrarem toxidez limitante de dose incluindo aumentado tempo de coagulação, ativação de complemento, nefropatia tubular, ativação de célula Kupffer, e estimulação imune incluindo esplenomegalia, hiperplasia linfoide, infiltração de célula mononuclear. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol 33, 533-540 (2006)].

[0029] Muitos PTOs antissenso foram verificados mostrarem atividade clínica para doenças com uma significante contribuição a partir de fígado ou rim. Mipomersen é um análogo de PTO que inibe a síntese de apoB-100, uma proteína envolvida em transporte de colesterol LDL. Mipomersen manifestou atividade terapêutica em uma população de pacientes de aterosclerose mais provável mente devido sua preferencial distribuição para o fígado. [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)].ISIS-113715 é um análogo antissenso de PTO inibindo a síntese de proteína tirosina fosfatase 1B (PTB1B), e foi verificado mostrar

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10/51 atividade terapêutica em pacientes de diabetes tipo II [Curr. Opin. Mol. Ther. Vol 6, 331-336 (2004)].

[0030] Ácido Nucléico Fechado: Em ácido nucléico fechado (LNA), o anel ribose de cadeia principal de RNA está estruturalmente restrito para aumentar a afinidade de ligação para RNA ou DNA. Assim, LNA pode ser visto como um análogo de RNA ou DNA de alta afinidade. [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].

[0031] Oligonucleotídeo morfolino fosforodiamidato: Em oligonucleotídeo morfolino fosforodiamidato (PMO), a cadeia principal fosfato e 2-desoxirribose de DNA são substituídas com fosforoamidato e morfolina, respectivamente. [Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol 71, 575-586 (2006)]. Embora a cadeia principal de DNA seja carregada negativamente, a cadeia principal de PMO não é carregada. Assim a ligação entre PMO e RNA esta livre de repulsão eletrostática entre as cadeias principais, e tende a ser mais forte que a ligação entre DNA e RNAS. Uma vez que PMO é estruturalmente muito diferente de DNA, PMO não pode ser reconhecido pelo transportador(s) hepático reconhecendo DNA ou RNA. Não obstante, PMO não penetra facilmente a membrana de célula.

[0032] Ácido Nucléico Peptídeo: Ácido nucléico peptídeo (PNA) é um polipeptídeo com N -(2-amino etil) glicina como a cadeia principal de unidade, e foi descoberto por Dr. Nielsen e colegas [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. A estrutura química e nomenclatura abreviada de PNA são ilustradas na Figura 4B. Como DNA e RNA, PNA também se liga seletivamente a ácido nucléico complementar. [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. Em ligação a ácido nucléico complementar, o terminus-N de PNA é visto como equivalente à extremidade-5’ de DNA ou RNA, e o terminus-C de PNA como equivalente à extremidade-3’ de DNA ou RNA.

[0033] Como PMO, a cadeia principal de PNA não é carregada.

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Assim a ligação entre PNA e RNA tende a ser mais forte que a ligação entre DNA e RNA. Uma vez que PNA é marcadamente diferente de DNA na estrutura química, PNA não pode ser reconhecido pelo transportador(s) hepático reconhecendo DNA, e pode mostrar um perfil de distribuição em tecido diferente daquele de DNA ou PTO. Entretanto, PNA também penetra pobremente a membrana de célula de mamífero. (Adv. Drug Delivery Ver. Vol 55, 267-280, 2003).

[0034] Nucleobases modificadas para aperfeiçoamento de permeabilidade de membrana de PNA: PNA foi tornado altamente permeável para a membrana de célula de mamífero através de introdução de nucleobases modificadas (isto é, bases) com um lipídeo catiônico ou seu equivalente ligado covalentemente ao mesmo como exemplificado em Figura 4C. Tais nucleobases modificadas de citosina, adenina, e guanina foram verificadas previsivelmente e complementarmente hibridizarem com guanina, timina, e citosina, respectivamente. [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253], [0035] Incorporação de tais nucleobases modificadas sobre PNA simula situações de lipofecção. Através de lipofecção, moléculas de oligonucleotídeos com cadeia principal fosfato são envolvidas com moléculas de lipídeo catiônicas como lipofectamina, e tal complexo de lipofectamina/oligonucleotídeo tende a penetrar a membrana de célula antes facilmente comparado a molécula de oligonucleotídeo nua.

[0036] Em adição a boa permeabilidade de membrana, aqueles derivados de PNA foram verificados possuírem afinidade ultra forte para ácido nucléico complementar. Por exemplo, introdução de 4 a 5 nucleobases modificadas sobre derivados de PNA de 11- a 13-mer rendeu facilmente um ganho T_m de 20°C ou maio r em formação de duplex com DNA complementar. Tais derivados de PNA são altamente sensíveis a um desemparelhamento de base simples. Um desempareIhamento de base simples resultou em uma perda de Tm de 11 a 22°C

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12/51 dependendo do tipo de base modificada assim como sequência de PNA.

[0037] RNA interferente pequeno (siRNA): RNA interferente pequeno (siRNA) refere-se a um RNA de fita dupla de 20-25 pares de bases. [Microbiol. Mol. Biol. Ver. Vol 67(4), 657-685 (2003)]. A fita antissenso de siRNA interage um pouco com proteínas para formar um Complexo de silenciamento induzido-RNA (RISC). Então o RISC se liga a uma certa porção de mRNA complementar para a fita antissenso de siRNA. O mRNA complexado com o RISC sofre divagem para render uma outra cópia de siRNA de fita dupla. Assim, siRNA induz cataliticamente a divagem de seu mRNA alvo, e consequentemente inibe a expressão de proteína pelo mRNA. O RISC não se liga sempre à sequência complementar inteira dentro de seu mRNA alvo, o que faz surgir conceitos de efeitos fora de alvo na terapia de siRNA. Como outras classes de oligonucleotídeos com cadeia principal DNA ou RNA, siRNA possui pobre permeabilidade de célula e por isso tende a mostrar pobre atividade terapêutica in vitro ou in vivo a menos que propriamente formulado ou quimicamente modificado para mostrar boa permeabilidade de membrana.

[0038] SNAP25 ASOs e siRNAs: SNAP25 ASOs e siRNAs foram avaliados primariamente como uma ferramenta biológica para melhor entender regras fisiológicas da proteína SNAP25 em células neuronais. [Nature vol 364, 445-448 (1993); Eur. J. Neurosci. vol 20(6), 1593-1603 (2004); EMBO Reports vol 14(7) 645-651 (2013); J. Biol. Chem. vol 281(38), 28174-28184 (2006)]. Oligonucleotídeos regulando descendentemente a atividade da proteína SNAP25 ainda têm de ser investigados para um uso tópico para imitar seguramente as atividades terapêuticas benéficas de BTX. Deve ser notado que liberação transdérmica tem sido um enorme desafio técnico no campo de oligonucleotídeo.

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Breve Descrição de Figuras [0039] A Figura 1A: Ilustração esquemática do processo de exocitose ocorrendo na junção sináptica entre duas células neuronais vizinhas.

[0040] A Figura 1B: Ilustração esquemática do processo de exocitose ocorrendo na junção neuromuscular entre axon neuronal e célula de músculo.

[0041] A Figura 2A. Ilustração esquemática da fusão da membrana vesicular sináptica com a membrana de plasma axonal.

[0042] A Figura 2B: Ilustração esquemática da numeração de exons e introns dentro de um pré-mRNA.

[0043] A Figura 3A. Ilustração esquemática do processo de remoção conduzindo à supressão de intron N.

[0044] Figura 3B. Ilustração esquemática do sítio de remoção 3’ e o sítio de remoção 5’ em relação a complexo espliceossoma E.

[0045] Figura 4A. Estruturas químicas representativas para DNA e ácidos nucléicos não naturais.

[0046] Figura 4B. Ilustração para a estrutura química e nomenclatura abreviada de PNA.

[0047] Figura 4C. Exemplos de nucleobases modificadas empregadas para aperfeiçoamento de permeabilidade de célula de ácido nucléico peptídeo.

[0048] Figura 5. Exemplos de nucleobases naturais ou não naturais (modificadas) selecionáveis para o derivado de ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0049] Figura 6A. Exemplos para radicais alquila substituídos ou não substituídos, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0050] Figura 6B. Exemplos para radicais alquil acila substituídos ou não substituídos, e radicais aril acila substituídos ou não substituí

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14/51 dos, que são selecionáveis para o derivado ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0051] Figura 6C. Exemplos para radicais alquil amino substituídos, aril amino substituídos, arila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, e aril fosfonila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0052] Figura 6D. Exemplos para radicais alquilóxi carbonila substituídos ou não substituídos, arilóxi carbonila substituídos ou não substituídos, alquil amino carbonila substituídos ou não substituídos, e aril amino carbonila substituídos ou não substituídos, que são selecionáveis para o derivado ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0053] Figura 6E. Exemplos para radicais alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, e alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado ácido nucléico peptídeo de Fórmula I.

[0054] Figura 7. Estruturas químicas para os monômeros PNA abreviados como A (adenina), G (guanina), T (timina), C (citosina), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq).

[0055] Figura 8. Estruturas químicas das abreviaturas usadas para descrever substituintes para o terminal-N ou terminal-C de PNA.

[0056] Figura 9. Estrutura química para o derivado PNA de 14-mer abreviado como (N C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)C(1O2)T-NH₂.

[0057] Figura 10. Estrutura química para o derivado PNA 15-mer abreviado como (N C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)C(103)TT-AA(2O2)C-NH₂.

[0058] Figura 11. Estruturas químicas para monômeros Fmoc-PNA

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15/51 exemplares usados para sintetizar os derivados PNA desta invenção. [0059] Figura 12. Ilustração esquemática de um ciclo de elongação de monômero típico adotado em SPPS desta invenção.

[0060] Figura 13A. Cromatograma HPLC de fase reversa-Cis para ASO 1 antes de purificação com HPLC.

[0061] Figura 13B. Cromatograma HPLC de fase reversa-Cis para ASO 1 após purificação com HPLC.

[0062] Figura 14. Dados espectrais de massa ES-TOF obtidos com ASO 1 após purificação com HPLC.

[0063] Figura 15A. Dados de análise eletroforética para produtos de PCR aninhados em células PC12 tratadas com 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000 zM ASO 3 (em cima); junto com um diagrama ilustrando os tamanhos de amplicon dos produtos de PCR para o mRNA de inteiro comprimento e os mRNAs variantes de remoção com exon skipping (fundo).

[0064] Figura 15B. Dados de sequenciamento Sanger para o produto de PCR designado para o pulo de exons 5-7.

[0065] Figura 16A. Mudanças no nível de mRNA SNAP25 de inteiro comprimento em células PC12 tratadas com ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000 zM (barra de erros através de erro padrão). [0066] Figura 16B. Mudanças no nível de mRNA SNAP25 de inteiro comprimento em células PC12 tratadas com ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000 zM. (barra de erros por erro padrão).

[0067] Figura 17A. Dados de western blot de SNAP25 (diagrama superior) e níveis de expressão relativa de SNAP25 normalizados contra β-actina (diagrama inferior) em células PC12 tratadas com ASO 3 por 48 horas em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, ou 10 aM.

[0068] Figura 17B. Dados de Western blot de SNAP25 em células PC12 tratadas com ASO 1 em 0 (controle negativo), 100 ou 1000 zM

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16/51 tanto por 48 horas como por 72 horas.

[0069] Figura 18. Imagens IHC de SNAP25 para as amostras de pele de camundongos administrados topicamente com ASO 1 em 0 (controle negativo), 1, 10 e 100 fM, BID por quatro dias.

[0070] Figura 19A. Dados de western blot de SNAP25 (diagrama superior) e níveis de expressão relativa de SNAP25 normalizados contra β-actina (diagrama inferior) em células SiMa tratadas com ASO 3 por 48 horas em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, ou 100 aM.

[0071] Figura 19B. Mudanças no nível de mRNA SNAP25 de inteiro comprimento em células SiMa tratadas com ASO 3 em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, ou 100 aM (barra de erros através de erro padrão).

Sumário da Invenção [0072] A presente invenção provê um derivado de ácido nucléico peptídeo representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Formula I onde, [0073] n é um inteiro entre 10 e 25;

[0074] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobrepo sição complementar de 10-mer com uma sequência pré-mRNA de 14mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 hu mana;

[0075] o composto de Fórmula I é inteiramente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humana, ou parcialmente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos;

[0076] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n independentemente

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17/51 representam deuterido [D], hidrido [H}, radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[0077] X e Y representam independentemente radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], amino tiocarbonila [NH2C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, arila acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, arilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, ou aril fosfonila substituída ou não substituída;

[0078] Z representa radical hidrido, hidróxi, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[0079] Bi, B2, ..., Bn-ι, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina, e uracila, e nucleobases não naturais; e, [0080] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à metade nucleobase.

[0081] O composto de Fórmula I induz 0 pulo de exon 7 no prémRNA SNAP25 humano, rende variante(s) de remoção de mRNA SNAP25 humano faltando exon 7, e por isso é útil para inibir a atividade funcional do gene transcrevendo 0 pré-mRNA SNAP25 humano. Descrição da Invenção

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18/51 [0082] A presente invenção provê um derivado de ácido nucléico peptídeo representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Formula I onde, [0083] n é um inteiro entre 10 e 25;

[0084] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobrepo sição complementar de 10-mer com uma sequência pré-mRNA de 14mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 hu mana;

[0085] o composto de Fórmula I é inteiramente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humano, ou parcialmente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos;

[0086] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n independentemente representam deuterido [D], hidrido [H}, radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[0087] X e Y representam independentemente radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], amino tiocarbonila [NH2C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, arila acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, arilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída

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19/51 ou não substituída, ou aril fosfonila substituída ou não substituída; [0088] Z representa radical hidrido, hidróxi, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[0089] Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina, e uracila, e nucleobases não naturais; e, [0090] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à metade nucleobase.

[0091] O composto de Fórmula I induz 0 pulo de exon 7 no prémRNA SNAP25 humano, rende variante(s) de remoção de mRNA SNAP25 humano faltando exon 7, e por isso é útil para inibir a atividade funcional do gene transcrevendo 0 pré-mRNA SNAP25 humano.

[0092] A condição adotada para descrever 0 composto de Fórmula I que n é um inteiro entre 10 e 25 literalmente estabelece que n é um inteiro selecionável de um grupo de inteiros de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24.

[0093] O composto de Fórmula I liga-se complementarmente ao sítio de remoção 3’ de exon 7 do pré-RNA SNAP25 humano lido do gene SNAP25 humano [acessado de NCBI Reference Sequence: NG_029626.1]. A sequência de 14-mer de [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA] estendendo a junção de intron 6 e exon 7 no prémRNA SNAP25 humano é um sítio de remoção 3’ consistindo em 7mer a partir de intron 6 e 7-mer a partir de exon 7. Assim a sequência de pré-mRNA 14-mer pode ser convencionalmente representada como [(5’ —> 3’) aucccag I GGUAACA], onde as sequências de intron e exon são representadas com letras pequenas e capitais, respectivamente, e a junção intron-exon é marcada com I. A representação

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20/51 convencional para pré-mRNA ainda é ilustrada por uma sequência de 30-mer de [(5' —> 3') cucuuuggaucccag | GGUAACAAAUGAUGC] estendendo a junção de intron 6 e exon 7 no pré-mRNA SNP25 humano. A numeração de exon pode variar dependendo de transcritos de mRNA SNAP25 reportados. Provisão para a sequência SNAP25 de 30-mer é para identificar inequivocamente o sítio de remoção alvo do composto de Fórmula I independente da numeração de exon do mRNA SNAP25.

[0094] Estruturas químicas de nucleobases naturais (isto é, ocorrendo naturalmente) ou não naturais (isto é, não ocorrendo naturalmente) no derivado ΡΝΑ de Fórmula I são exemplificadas na Figura 5. Nucleobases naturais ou não naturais desta invenção compreendem, mas não são limitadas às nucleobases providas na Figura 5. Provisão de tais nucleobases naturais e não naturais é para ilustrar a diversidade de nucleobases permissíveis, e por isso não deve ser interpretada para limitar o escopo da presente invenção.

[0095] Os substituintes adotados para descrever o derivado ΡΝΑ de Fórmula I são exemplificados em Figuras 6 Α-Ε. Figura 6Α provê exemplos para radicais alquila substituídos ou não substituídos. Radicais alquil acila substituídos ou não substituídos e aril acila substituídos ou não substituídos são exemplificados em Figura 6B. Figura 6C ilustra exemplos para alquil amino substituído, aril amino substituído, arila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, e aril fosfonila substituída ou não substituída. A Figura 6D provê exemplos para radicais alquilóxi carbonila substituídos ou não substituídos, arilóxi carbonila substituídos ou não substituídos, alquil amino carbonila substituídos ou não substituídos, e aril amino carbonila substituídos ou não substituídos. Na Figura 6E, são providos exemplos para radicais alquilóxi tiocarbonila substituídos

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21/51 ou não substituídos, alquil amino tiocarbonila substituídos ou não substituídos, aril amino tiocarbonila substituídos ou não substituídos, e alquilóxi tiocarbonila substituídos ou não substituídos. Provisão de tais substituintes como exemplos é para ilustrar a diversidade de substituintes permissíveis, e por isso não deve ser interpretada para limitar o escopo da presente invenção. Aqueles versados no campo podem facilmente compreender que a sequência de oligonucleotídeos é o fator primordial para ligação específica de sequência de oligonucleotídeo para a sequência de pré-mRNA alvo sobre substituintes no terminus-N ou terminus-C.

[0096] O composto de Fórmula I liga-se fortemente ao DNA complementar como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256], O duplex entre o derivado PNA de Fórmula 1 e seu DNA ou RNA complementar de inteiro comprimento possui um valor T_m muito alto para ser determinado confiavelmente em tampão aquoso. O composto PNA de Fórmula I rende altos valores de T_m com DNAs complementares de menor comprimento.

[0097] O composto de Fórmula I se liga fortemente ao sítio de remoção 3’ alvo do pré-mRNA SNAP25 humano transcrito do gene SNAP25 humano, e interfere com a formação de complexo inicial espliceossoma envolvendo o dito exon alvo de composto. Uma vez que o composto desta invenção inibe estereamente a formação de complexo inicial espliceossoma, o exo 7 SNAP25 é removido para render variante(s) de remoção de mRNA SNAP25 carecendo de exon 7. Consequentemente o composto desta invenção induz o pulo do exon 7 de SNAP25.

[0098] Devido à forte afinidade do dito composto para a sequência de pré-mRNA complementar, o composto desta invenção também pode se ligar fortemente a uma sequência de pré-mRNA parcialmente complementar com um ou dois desemparelhamentos, e induzir o pulo

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22/51 do exon alvo dentro de pré-mRNA SNAP25.

[0099] O composto de Fórmula I possui boa permeabilidade de célula e pode ser facilmente liberado na célula como oligonucleotídeo nu como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256], Assim o composto desta invenção induz o pulo de exon 7 no prémRNA SNAP25 para render variante(s) de remoção mRNA SNAP25 carecendo de exon 7 de SNAP25 em células tratadas com o composto de Fórmula I como oligonucleotídeo nú. O composto de Fórmula I não requer quaisquer meios ou formulações para liberação em célula para induzir potencialmente o pulo do exon alvo em células. O composto de Fórmula I facilmente induz o pulo do exo n 7 de SNAP25 em células tratadas com o composto desta invenção como oligonucleotídeo nú em concentração subfentomolar.

[00100] Devido à boa permeabilidade de célula ou membrana, o derivado PNA de Fórmula I pode ser administrado topicamente como oligonucleotídeo nu para induzir o pulo do exon 7 de SNAP25 em pele alvo. O dito composto não requer uma formulação para aumentar liberação transdérmica no tecido alvo para a pretendida atividade terapêutica ou biológica. Usualmente o composto de Fórmula I é dissolvido em água e cossolventes, e administrado topicamente ou transdermicamente em concentração subpicomolar para elicitar a desejada atividade terapêutica ou biológica ao redor de sítio de administração na derme. O composto desta invenção não precisa ser pesadamente ou invasivamente formulado para elicitar a atividade terapêutica tópica. [00101] O composto de Fórmula I podem ser usados como combinados com ácido ou base farmaceuticamente aceitável incluindo mas não limitado a hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ácido clorídrico, ácido metano sul fônico, ácido cítrico, ácido triflúor acético , e assim por diante.

[00102] O derivado PNA de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente

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23/51 aceitável do mesmo pode ser administrado a um sujeito em combinação com um adjuvante farmaceuticamente aceitável incluindo mas não limitado a ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido tartárico, ácido esteárico, polietileno glicol, polipropileno glicol, etanol, isopropanol, bicarbonate de sódio, água destilada, preservativo(s), e assim por diante.

[00103] O composto da presente invenção pode ser administrado topicamente a um sujeito em uma concentração terapeuticamente ou biologicamente efetiva variando de 1 aM (isto é, 10^_18M) a maior que 1 nM, que pode variar dependendo do programa de dosagem, condições ou situações do sujeito, e assim por diante.

[00104] É preferido um derivado PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00105] n é um inteiro entre 10 e 25;

[00106] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

[00107] o composto de Fórmula I é inteiramente complementar para o pré-mRNA SNAP25, ou parcialmente complementar para o prémRNA SNAP25 com um ou dois desemparelhamentos;

[00108] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n independentemente representam deuterido [D], hidrido [H}, radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[00109] X e Y representam independentemente radical hidrido, formila, aminocarbonila, amino tiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, arila acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituí

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24/51 da, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, arilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, ou aril fosfonila substituída ou não substituída;

[00110] Z representa radical hidrido, hidróxi, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

[00111] Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina, e uracila, e nucleobases não naturais; e, [00112] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-1, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à metade nucleobases representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Formula IV:

i

Formula II Formula III Formula IV onde, [00113] R1, R2, R3, RR4, Rs e Re são selecionados independentemente de radical hidrido, e alquila substituída ou não substituída;

[00114] L1, l_2 e L3 são um ligante covalente representado por Fórmula V ligando covalentemente 0 grupo amino básico à metade nucleobase:

Formula V

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25/51 onde, [00115] Qi e Q_m são radicais metileno (-CH2-) substituídos ou não substituídos, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

[00116] Q2, Q3, ..., e Qm-i são independentemente selecionados de metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-), e radical amino substituído ou não substituído[-N(H)-, ou -N(substituinte)-]; e, [00117] m é um inteiro entre 1 e 15.

[00118] A condição adotada para descrever Fórmula V que m é um inteiro entre 1 e 15 estabelece literalmente que m é um inteiro selecionável do grupo de inteiros de 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, e 14. [00119] De interesse é um oligômero PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00120] n é um inteiro entre 11 e 21;

[00121] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ -^3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

[00122] 0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar para pré-mRNA SNAP25 humano, ou parcialmente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos;

[00123] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n são radicais hidrido;

[00124] X e Y independentemente representam radicais hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, ou aril sulfo

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26/51 nila substituída ou não substituída;

[00125] Z representa radicalaamino substituído ou não substituído;

[00126] Bi, B2, B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

[00127] Pelo menos quatro de Bi, B2, B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

[00128] R1, R2, R3, R4, Rs e Re são selecionados independentemente de hidrido, e radical alquila substituída ou não substituída;

[00129] Q1 e Q_m são radical metileno substituído ou não substituído, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

[00130] Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio e amino substituído ou não substituído; e, [00131] m é um inteiro entre 1 e 11.

[00132] De particular interesse é um derivado PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00133] n é um inteiro em ter 11 e 19;

[00134] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

[00135] 0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar ao pré-mRNA SNAP25 humano;

[00136] Si, S2, ..., Sn-i, Τι, T2, ..., T_n-i, e T_n são radical hidrido;

[00137] X e Y representam independentemente radical hídrico, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituído ou não substituído, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, al

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27/51 quil amino carbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída ou aril sulfonila substituída ou não substituída;

[00138] Z representa radical amino substituído ou não substituído;

[00139] Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

[00140] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-1, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

[00141] R1, R2, R3, R4, Rs e Re são selecionados independentemente de radical hidrido, e alquila substituída ou não substituída;

[00142] Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está ligado diretamente ao grupo amino básico;

[00143] Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio, e amino; e, [00144] m é um inteiro entre 1 e 9.

[00145] De alto interesse é um oligômero de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00146] n é um inteiro entre 11 e 19;

[00147] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência pré-mRNA de 14mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

[00148] 0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar para pré-mRNA SNAP25 humano;

[00149] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n são radical hidrido;

[00150] X e Y independentemente representam radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituí

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28/51 da, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, ou alcóxi carbonila substituída ou não substituída; [00151] Z representa radical amino substituído ou não substituído;

[00152] Bi, B2, ..., Bn-1, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

[00153] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

[00154] R1, R3, e Rs são radical hidrido, e R2, R4, e Re independentemente representam radical hidrido, ou alquila substituída ou não substituída;

[00155] Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

[00156] Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio; e, [00157] m é um inteiro entre 1 e 8.

[00158] De maior interesse é um derivado PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00159] n é um inteiro entre 11 e 19;

[00160] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

[00161] 0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar para pré-mRNA SNAP25 humano;

[00162] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n são radical hidrido; [00163] X é radical hidrido;

[00164] Y representa radical alquil acila substituída ou não substitu

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29/51 ida, aril acila substituída ou não substituída, ou alquilóxi carbonila substituída ou não substituída;;

[00165] Z representa radical amino substituído ou não substituído; [00166] Bi, B2, ..., Bn-ι, e B_n são selecionados independentemente de adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;

[00167] pelo menos cinco de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

[00168] R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são radicais hidrido;

[00169] Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

[00170] Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio; e, [00171] m é um inteiro entre 1 e 8.

[00172] De maior interesse é um derivado PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

onde, [00173] 0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar para pré-mRNA SNAP25 humano;

[00174] Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n são radical hidrido;

[00175] X e Y independentemente representam radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, ou alcóxi carbonila substituída ou não substituída;

[00176] Z representa radical amino substituído ou não substituído; [00177] Bi, B2, ..., Bn-ι, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e, e nucleobases não naturais;

[00178] pelo menos cinco de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por

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Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

[00179] Ri, R₂, R3, R4, Rs, e Re são radicais hidrido;

[00180] L1 representa -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, ou -CH₂-O-(CH₂)₅- com a extremidade direita estando diretamente ligada ao grupo amino básico; e [00181] l_₂ e l_3 são selecionados independentemente de -(CH₂)₂-, (CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, -(CH₂)₈-, -(CH₂)₂-O(CH₂)₂-, -(CH₂)3-O-(CH₂)₂-, e -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃- com a extremidade direita estando diretamente ligada ao grupo amino básico.

[00182] De específico interesse é um derivado PNA de Fórmula I que é selecionado do grupo de compostos provido abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

(N C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

(N C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

(N C) Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

(N C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)NH₂;

(N C) Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)NH₂;

(N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

(N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH₂;

(N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

(N C) Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)TLys-NH₂;

(N C) H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH₂;

(N C) Benzoil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH₂;

(N C) Benzoil-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N C) n-Hexanoil-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N C) n-Propil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

(N C) Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

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31/51 (N -+ C) [N-(2-fenil etil) amino] carbonil-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)TGG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N -+ C) n-Propil-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N -+ C) FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)TNH₂;

(N -+ C) n-Propil-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-ArgNH₂;

(N -+ C) n-Benzoil-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)TNH₂;

(N -+ C) N-Me-N-fenill-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N -+ C) p-Tolueno sulfonil-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)GA(5)T-Lys-NH₂ (N -+ C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH₂;

(N -+ C) Bezeno sulfonil-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)TNH₂;

(N -+ C) fenil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH₂;

(N -+ C) Benzil-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)ANH₂;

(N -+ C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH₂;

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32/51 (N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

(N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH₂: onde, [00183] A, G, T, e C são monômeros PNA com uma nucleobase natural de adenina, guanina, timina, e citosina, respectivamente;

[00184] C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq) são monômeros PNA com uma nucleobase não natural representada por Fórmula VI, Fór mula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX, e Fórmula X, respectivamente;

O--(CH₂)_q-NH₂

I

I

Formula VI

Formula VII

Formula VII

Formula IX

Formula X onde, [00185] p e q são inteiros; e, [00186] as abreviações para os substituintes de terminus-N e Cisão especificamente definidas como se segue: Fmoc- é a abreviação para [(9-fluorenil) metilóxi] carbonila-; Fethoc- para [2-(9-fluorenil) etil-1-óxi] carbonila; Ac- para acetila-; Benzoíla- para benzeno carbonila-; Piv- para pivalila-; n-propila- para l-(n-propila)-, Ή- para grupo hidrido; p-tolueno sulfonila para (4-metil benzeno)-1sulfonilaa-; -Lys- para resíduo de aminoácido lisina; -Vai- para resíduo de aminoácido valina; -Leu- para resíduo de aminoácido leucina; -Arg- para resíduo de aminoácido arginine; -Gly- para

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33/51 resíduo de aminoácido glicina; [N-(2-fenil etil) amino] carbonila- para [N-1-(2-fenil etil) amino] carbonila-; benzila- para 1 -(fenil) metila; Fenila- para fenila-; Me- para metila-; -HEX- para 6-amino1-hexanoíla-; FAM- para 5, ou 6-fluoresceína carbonila- (mistura isomérica), e -NH2 para grupo -amino não substituído.

[00187] A Figura 7 provê coletivamente as estruturas químicas para monômeros PNA abreviados como A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq). Como discutido na técnica anterior [PCT/KR2009/001256], C(pOq) é visto como um monômero PNA modificado correspondendo a citosina devido sua preferida hibridização para guanina. A(p) e A(pOq) são tomados como monômeros PNA modificados atuando como adenina por sua alta afinidade para timina. Da mesma maneira G(p) e G(pOq) são considerados serem monômeros PNA modificados equivalentes a guanina devido seu emparelhamento de base produtivo com citosina.

[00188] A Figura 8 provê inequivocamente as estruturas químicas para uma variedade de abreviações para substituintes usados para introduzir diversidades no terminus-N ou terminus-C do derivado PNA de Fórmula I nesta invenção.

[00189] De modo a ilustrar as abreviações empregadas para tais derivados PNA, a estrutura química para um derivado PNA de 14-mer abreviada como (N C) Fethoc-GA(5)A-C(1°2)TT-A(5)TC-CTA(5)C(1°2)T-NH2 é provida na Figura 9. Como uma outra ilustração, a estrutura química para um derivado PNA de 15-mer abreviado como (N

C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH₂ é provida em Figurar 10.

[00190] Uma sequência PNA de 16-mer de (N C) FethocA(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂ é equivalente à sequência de DNA de (5' 3') ATT-TGT-TAC-CCT-GGG-A para ligação complementar a pré-mRNA. O PNA de 16-mer tem uma sobrePetição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 53/124

34/51 posição complementar de 16-mer com o pré-mRNA SNAP25 humano como marcado em negrito e sublinhada na sequência de pré-MRNA de 30-mer de [(5' 3') cucuuuqqaucccag | GGUAACAAAUGAUGC1 estendendo a junção de intron 6 e exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano.

[00191] Uma sequência PNA de 14-mer de (N C) Fmoc-LeuTA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH₂ é equivalente à sequência de DNA de (5’ —> 3’) TAC-CCT-GGG-ATC-CA para ligação complementar a pré-mRNA. O PNA de 14-mer tem uma sobreposição complementar de 14-mer com o pré-mRNA SNAP25 humano como marcado com negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 30-mer de [(5' -> 3') cucuuuggaucccag | GGUAACAAAUGAUGC1.

[00192] Uma sequência PNA de 16-mer de (N C) FethocA(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂ é equivalente à sequência de ADN de (5' 3') ATC-TGT-TAC-CCT-GGG-A para ligação complementar a pré-mRNA. O PNA de 16-mer tem uma sobreposição complementar de 15-mer com a sequência de 16-mer como marcada em negrito e sublinhada na sequência de pré-mRNA de 30-mer de [(5' -► 3') cucuuuqqaucccag | GGUAACAAAUGAUGC1, onde o desemparelhamento simples está marcado com um sinal entre aspas (). O PNA de 16-mer é parcialmente complementar para o sítio de remoção 3’ do exon 7 de SNAP25 com um desemparelhamento simples com exon 7.

Descrição Detalhada da Invenção

Procedimentos Genéricos Para Preparação de Oliqõmeros PNA [00193] Oligômeros PNA foram sintetizados por síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) baseado em química-Fmoc de acordo com o processo mostrado na técnica anterior [US 6 133 444; WO 96/40685] com menores modificações se necessário. O suporte sólido empregado neste estudo foi Η-Rink Amide-ChemMatrix adquirido de PCAS BiPetição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 54/124

35/51 oMatrix Inc. (Quebec, canada). Monômeros Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada foram sintetizados como descrito na técnica anterior [PCT/KR 2009/001256] ou com menores modificações. Tais monômeros Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada e monômeros Fmoc-PNA com uma nucleobase natural foram usados para sintetizar os derivados PNA da presente invenção. Os monômeros Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada são providos na Figura 11. Para uma pessoa versada na técnica, entretanto, existem lotes de variações menores obviamente possíveis para os grupos de proteção sobre tais monômeros PNA. Assim os monômeros Fmoc-PNA na Figura 11 devem ser tomados como exemplos, e por isso não devem ser tomados para limitarem o escopo da presente invenção. Oligômeros PNA foram purificados por HPLC de fase reversa-Cis (água/acetonitrila ou água/metanol com TFA 0,1%) e caracterizados por espectrometria de massa incluindo ESI/TOF/MS.

[00194] A Figura 12 ilustra esquematicamente um típico ciclo de elongação de monômero adotado em SPPS neste estudo, e os detalhes sintéticos são providos como abaixo. Para aqueles versados na técnica, entretanto, existem lotes de menores variações obviamente possíveis na corrida efetiva de tais reações SPPS sobre um sintetizador automático de peptídeos ou sintetizador manual de peptídeo. Cada etapa de reação é resumidamente provida como se segue.

[00195] [Ativação de Resina H-Rink-ChemMatrix], 0,01 mmol (aproximadamente 20 mg de resina) da resina ChemMatrix em 1,5 mL de piperidina/DMF 20% foi feito vórtice em um tubo libra por 20 minutos, e a solução DeFmoc foi filtrada. A resina foi lavada por 30 segundos cada em séries com 1,5 mL de cloreto de metileno (MC), 1,5 mL de dimetil formamida (DMF), 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, e 1,5 mL de MC. As resultantes aminas livres sobre o suporte sólido foram submetidas a acoplamento tanto com um monômero Fmoc-PNA ou com um

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36/51 derivado de aminoácido protegido-Fmoc.

[00196] [DeFmoc]. A resina foi feita vórtice em 1,5 mL de piperidina/DMF 20% por 7 minutos, e a solução DeFmoc foi filtrada. A resina foi lavada por 30 segundos cada em séries com 1,5mL de MC, 1,5 mL de DMF, 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, e 1,5 mL de MC. As resultantes aminas livres sobre o suporte sólido foram imediatamente submetidas a acoplamento com um monômero Fmoc-PNA.

[00197] [Acoplamento com Monômero Fmoc-PNA], As aminas livres sobre o suporte sólido foram acopladas com um monômero Fmoc-PNA como se segue. 0,04 mmol de um monômero Fmoc-PNA, 0,05 mmol de HBTU [hexa flúor fosfato de 2-(1H-benzo triazol-1-il)-1,1,3,3-tetra metil uronium], e 10 mmoles de DIEA (N,N-di-isopropil etil amina) foram incubados por 2 minutos em 1 mL de DMF anidra, e adicionados à resina com aminas livres. Então a resina foi lavada por 30 segundos cada em séries com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, e 1,5 mL de MC.

[00198] [Capeamento], Seguindo a reação de acoplamento, as aminas livres não reagidas foram capeadas através de agitação por 5 minutos em 1,5 mL de solução de capeamento (5% anidrido acético e 6% 2,6-leutidina em DMF). Então a solução de capeamento foi filtrada e lavada por 30 segundos cada em séries com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, e 1,5 mL de MC.

[00199] [Introdução de radical Fethoc- em terminus-N], Radical Fethoc- foi introduzido para o terminus-N através de reação de aminas livres sobre a resina com Fethoc-OSu sob condições de acoplamento básicas usuais. A estrutura química de Fethoc-OSu [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, PM 351,36] é provida como se segue.

Fethoc-OSu

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37/51 [00200] [Clivagem a partir de resina], Oligômeros PNA ligados à resina foram clivados da resina através de agitação por 3 horas em 1,5 mL de solução de clivagem (2,5% tri-isopropil silano e 2,5% água em ácido triflúor acético). A resina foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi triturado com éter dietílico e o resultante precipitado foi coletado por filtração para purificação através de HPLC de fase reversa.

[00201] [Análise e Purificação com HPLC]. Seguindo uma clivagem a partir de resina, o produto bruto de um derivado PNA foi purificado por HPLC de fase reversa - Cis eluindo com água/acetonitrila ou água/metanol (processo gradiente) contendo 0,1% TFA. Figuras 13A e 13B são cromatogramas de HPLC exemplares para ASO 1 antes e após purificação com HPLC, respectivamente. A sequência de oligômero de ASO 1 é como provida na Tabela 1.

Exemplos sintéticos para derivado PNA de Fórmula I [00202] De modo a alvejar complementarmente o sítio de remoção 3’ de exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano, derivados PNA desta invenção foram preparados de acordo com os procedimentos sintéticos providos acima ou com menores modificações. Provisão de tais derivados PNA alvejando o pré-mRNA SNAP25 humano é para exemplificar os derivados PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretada para limitar o escopo da presente invenção.

[00203] A Tabela 1 provê derivados PNA alvejando complementarmente o sítio de remoção 3’ de exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano junto com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. Provisão dos ASOs SNAP25 na Tabela 1 é para exemplificar os derivados PNA de Fórmula 1, e não deve ser interpretada para limitar o escopo da presente invenção.

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Tabela 1. Derivados PNA alvejando complementarmente o sítio de remoção 3’ estendo a junção de intron 6 e exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano junto com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.

Exemplo de PNA	Sequência de PNA (N C)	Massa exata, m/z
teor.a	obs.b
ASO 1	Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(102)T-GG(6)G-A(6)-NH2	5190,39	5188,38
ASO 2	Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(102)CT-GG(5)G-A(5)-NH2	4266,93	4266,95
ASO 3	Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(102)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2	4533,03	4533,04
ASO 4	Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(102)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2	4519,01	4518,95
ASO 5	Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(105)T-GG(6)G-A(3)T-NH2	4533,03	4533,04
ASO 6	Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(102)-CTG-G(5)GA(5)-TC(102)-NH2	4601,07	4601,08
ASO 7	Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(102)-TG(6)-NH2	4478,98	4478,99
ASO 8	Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(102)-TG(5)-NH2	4468,02	4468,04
ASO 9	Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(102)CT-G(5)-NH2	4216,91	4216,93
ASO 10	Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(102)-TG(5)-NH2	5374,45	5374,44
ASO 11	Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(102)CT-GG(5)G-A(5)-NH2	5188,36	5188,35
ASO 12	Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(102)CT-G(5)G-NH2	4522,04	4522,05
ASO 13	Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(102)T-GG(5)G-A(5)-NH2	5160,33	5160,31
ASO 14	p-Tolueno sulfonil-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(102)T-GG(5)G-A(5) T-Lys-NH2	4581,03	4581,05
ASO 15	n-Hexanoil-TG(5)T-TA(8)C-CC(102)T-GG(5)G-A(5)T-NH2	4423,05	4423,03
ASO 16	Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(102)T-GG(5)G-A(202)T- Lys-NH2	4890,27	4890,27
ASO 17	[N-(2-fenil etil)amino]carbonil-TG(5)T-TA(4)C-CC(102)T-GG (5)G-A(5)T-NH2	4415,98	4416,14
ASO 18	H-TG(5)T-TA(5)C-CC(102)T-GG(3)G-A(5)T-NH2	4254,90	4254,64
ASO 19	n-Propil-TG(202)T-TA(5)C-CC(202)T-GG(5)G-A(5)T-NH2	4340,97	4341,03
ASO 20	Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(102)T-GG(5)T-A(5)T-NH2	4503,02	4503,04
ASO 21	N-Me-N-Fenil-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH2	4415,03	4415,00
ASO 22	Benzoil-TG(5)T-TA(5)C-CC(103)T-GG(5)G-A(5)T-NH2	4400,97	4401,44

^a) massa exata teórica,^b) massa exata observada [00204] A Figura 13A é um cromatograma de HPLC obtido com um produto bruto de ASO 1. O produto bruto foi purificado por HPLC preparatória RP-Cis. A Figura 13B é um cromatograma de HPLC para um produto purificado de ASO 1. A pureza de ASO 1 aperfeiçoou acentuadamente seguindo a purificação com HPLC preparatória. A Figura 14 provê um espectro de massa ESI-TOF obtido com o produto purificado de ASO 1. Provisão dos dados de análise para ASO 1 é para ilustrar como os derivados de PNA de Fórmula I foram purificados e identificados na presente invenção, e não deve ser interpretada para limitar o escopo desta invenção.

Afinidade de ligação de modelos de derivados de PNA para ADN complementar

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39/51 [00205] Os derivados de PNA de Tabela 1 foram avaliados para sua afinidade de ligação para DNAs de 10-mer alvejando complementarmente tanto o terminal-N como o terminal-C. A afinidade de ligação foi avaliada através de valor T_m para o duplex entre PNA e DNA complementar de 10-mer. O duplex entre derivados PNA na Tabela 1 e DNAs inteiramente complementares mostrou valores T_m muito altos para serem confiavelmente determinados em solução tampão aquosa, uma vez que a solução tampão tendeu a ebulir durante medição de T_m.

[00206] Valores T_m foram determinados sobre espectrômetro UV/Vis como se segue. Uma solução mista de oligômero PNA 4 μΜ e DNA de 10-mer complementar 4 μM em 4 mL de tampão aquoso (pH 7,16, fosfato de sódio 10 mM, NaCI 100 mM) em tubo falcon de polipropileno de 15 mL foi incubada a 90°C por um minuto e lentamente resfriada para temperatura ambiente. Então a solução foi transferida em uma cubeta de UV de quartzo de 3mL equipada com uma tampa à prova de ar, e submetida a uma medição T_m em 260 nm sobre um espectrofotômetro UV/Visível como descrito na técnica anterior [PCT/KR2009/001256] ou com menores modificações. DNAs complementares de 10-mer para medição de T_m foram adquiridos de Bioneer (www.bioneer.com· Dajeon, República da Coréia) e usado sem ainda purificação.

[00207] Valores de T_m observados dos derivados PNA de Fórmula I foram muito altos para um complementar ligando-se a DNA de 10-mer, e são providos na Tabela 2 como não corrigidos. Por exemplo, ASO 3 mostrou u m valor T_m de 77,3°C para o duplex com o DNA complementar de 10-mer alvejando o terminal-N de 10-mer no PNA como marcado em negrito e sublinhado em [(N —> C) Fethoc-TG(5)TTA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH?1· Enquanto isso, ASO 3 mostrou u ma T_m de 88,7°C para o duplex com o DNA complementar de 10-mer alvejando o terminal-C de 10-mer no PNA como marcado em

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40/51 negrito e sublinhado em [(N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)CC(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH?1.

Tabela 2. Valores T_m entre PNAs na Tabela e DNA complementar de

10-mer alvejando tanto o terminal-N como o terminal-C de PNA.

PNA	Valor Tm , °C
DNA de 10-mer contra terminal-N	DNA 10-mer contra terminal-C
ASO 2	76,0	87,6
ASO 3	77,3	88,7
ASO 4	83,0	77,0
ASO 5	73,0	85,8
ASO 6	84,0	91,8
ASO 8	58,0	68,0
ASO 9	62,0	76,0
ASO 10	61,0	68,0
ASO 12	62,0	74,0

Exemplos para atividades biológicas de derivados PNA de Fórmula I [00208] Derivados PNA de Fórmula I especificados em Tabela 1 foram avaliados para a atividade antissenso SNAP25 em células PC12 de origem de rato e células SiMa de origem humana, e para sua habilidade para inibir a expressão de SNAP25 na pele de camundongos C57BL/6 com administração tópica. Os exemplos biológicos foram providos como exemplos para ilustração de atividade antissenso dos derivados de PNA de Fórmula I, e por isso não devem ser interpretados para limitação de escopo da presente invenção para os compostos listados na Tabela 1.

Exemplo 1. Pulo de exon induzido por ASO 3.

[00209] ASO 3 especificado é um ASO de 14-mer inteiramente complementar para uma sequência de 14-mer no sítio de remoção 3’ estendendo a junção de intron 6 e exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano. ASO 3 se sobrepõe complementarmente com a sequência de pré-mRNA de 14-mer como marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 30-mer de [(5' —> 3') cucuuuqgaucccag | GGUAACAAAUGAUGC1. ASO 3 possui uma sobreposição de 7-mer com intron 6, e uma outra sobreposição de 7-mer com

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41/51 exon 7.

[00210] Enquanto isso, o ASO de 14-mer possui uma sobreposição complementar de 13-mer com o pré-mRNA SNAP25 de rato lido a partir de DNA genômico de rato [acessado de NCBI Reference Sequence: NC_005012] como marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 25-mer de [(5' 3') uqqcucccag | GGUAACAAACGAUGC], na qual o único desempareIhamento é marcado com um sinal entre aspas ().

[00211] ASO 3 foi avaliado para sua habilidade para induzir pulo de exon em células PC 12 (Cat. Number CRL-1721, ATCC) como provido abaixo.

[00212] [Cultura de Células & Tratamento ASO]. Células PC12 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS 5%, soro de cavalo 10%, streptomicina/penicilina 1%, L-glutamina 1%, e piruvato de sódio 1% sob atmosfera de 5% de CO2 a 37°C. Células crescidas em placas de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000 zM.

[00213] [Extração de RNA & Síntese de cDNA Através de PCR de Uma-etapa], Seguindo uma incubação com ASO 3 por 42 horas, as células foram tratadas com 100 pg/mL de ciclo-heximida por outras 6 horas de modo a congelar a tradução ribossomal. Então RNA total foi extraído usando Universal RNA Extraction Kit (Cat. Number 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de molde RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando kit Super Script One-Step RT-PCR com Platinum Taq polimerase (Cat. Number 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos - exon de [exon 1_dianteiro: (5' —> 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; e exon 14_reverso: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG] de acordo com as seguintes condições de ciclo: 50^0+c

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42/51 por 30 minutos e 94o₊q p_{Or 2} minutos, que foram seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C, e 1 minuto a 72°C.

[00214] [Amplificação PCR aninhada], 1 pL de cDNA foi submetido a uma reação PCR aninhada de 20 μΙ_ (Cat. Number K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de exon de [exon 1_ dianteiro: (5' —> 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; exon 14n_reverso: (5' —> 3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT] de acordo com as seguintes condições de ciclo: 95°C por 2 minutos seguido por 34 cicl os de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C, e 1 minuto a 72°C.

[00215] [Identificação de Produtos de Pulo de Exon], Os produtos de PCR foram submetidos a separação eletroforética sobre um gel de agarose 2%. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento Sanger.

[00216] A Figura 15A provê os dados de eletroforese para os produtos de PCR, nos quais a amostra de tratamento ASO de 10 zM rendeu uma banda de PCR fraca designável para o pulo de exons 5-7. Mesmo se as células foram tratadas com ciclo-heximida para desestabilizar o mRNA de inteiro comprimento através de congelamento a tradução ribossomal, a banda de pulo de exon foi detectada somente fracamente. Assim a variante de remoção de mRNA SNAP25 que pode ser designada para o pulo de exons 5-7 é provável de mostrar pobre estabilidade metabólica em células comparado ao mRNA de inteiro comprimento. O produto de PCR de pulo de exon foi sequenciado para ser o pulo de exons 5-7 como mostrado em Figura 15B. Uma vez que o produto de PCR designado para o pulo de exon 6 foi observado independente da concentração de ASO, o pulo de exon 6 é considerado ocorrer espontaneamente.

[00217] A intensidade do mRNA SNAP25 de inteiro comprimento diminuiu mais nas células tratadas com ASO 3 10 zM. A intensidade de mRNA de inteiro comprimento aumentou gradualmente para aquela

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43/51 do co ntrole negativo (isto é, sem tratamento ASO), quando a concentração de ASO foi aumentada de 10 para 1000 zM. O padrão de resposta de dose inevertida nos dados de PCR aninhada pode ser devido a uma regulação ascendente de transcrição pelo RNA circular de intron exon (ElciRNA) acumulada durante o pulo de exon com ASO 3. [Nature Strtuc. Mol. Biol. Vol 22(3), 256-264 (2015)].

Exemplo 2. qPCR para mRNA SNAP25 em células PC12 tratadas com ASO 3 [00218] ASO 3 foi avaliado por qPCR aninhada SNAP25 para sua habilidade para induzir mudanças no nível de mRNA SNAP25 de rato em células PC12 como se segue.

[00219] [Cultura de Células & Tratamento ASO]. Células PC12 crescidas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000zM. (2 placas de cultura por concentração de ASO).

[00220] [Extração de RNA & Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa], Seguindo uma incubação com SNAP-ASO 3 por 42 horas, as células foram tratadas com 100 pg/mL de ciclo-heximida por outras 6 horas para congelar a tradução ribossomal. Então RNA total foi extraído de células usando Universal RNA Extraction Kit (Cat. Number 9767, Takara), e 200 ng de molde RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando kit One Step RT-PCR (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos-exon de [exon 1_dianteiro: (5' —> 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; e exon 14_reverso: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG] de acordo com as seguintes condições de ciclo: 50°C por 30 minutos e 94°C por 2 minutos, que foi seguido por 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C, e 1 minuto a 72°C.

[00221] [Amplificação qPCR Aninhada], 1 pL de cada solução de cDNA diluída por 100X foi submetido a uma reação de PCR tempoPetição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 63/124

44/51 real de 20 μΙ_ contra um conjunto de iniciadores especificos-exon de [exon 7q_dianteiro: (5' —> 3') ATGGATGAAAACCTAGAGC; e exon 8q_reverso: (5' —> 3') CTTCCCAGCA-TCTTTGTT] de acordo com as seguintes condições de ciclo: 95°C por 3 minutos seguido por 40 cicl os de 10 segundos a 95°C, e 30 segundos a 60°C. A reação qPCR foi seguida com uma sonda Taqman de [(5' 3') 5,6-FAM-CAGCCTTCTZEN-CCATGATCCT-3IABKFQ] alvejando a junção de exon 7 e exon 8 para quantificar especificamente o mRNA SNAP25 de inteiro comprimento.

[00222] A Figura 16A provê os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de inteiro comprimento diminuiu significantemente (teste-t de Student) nas células tratadas com ASO 3 em 10 zM e 100 zM por aproximadamente 50% e 20%, respectivamente. Entretanto, o nível de mRNAS de inteiro comprimento nas células tratadas com 1000 zM ASO 3 foi levemente maior que o nível das células sem tratamento com ASO (isto é, controle negativo). O padrão de resposta de dose invertido dos dados de qPCR é pobremente consistente com o padrão de resposta de dose do nível de mRNA de inteiro comprimento observado durante o pulo de exon descrito em Exemplo 1, sugerindo uma regulação ascendente de transcrição quando a dose de ASO foi aumentada de 10 para 1000 zM.

Exemplo 3. qPCR para mRNA SNAP25 em células PC12 tratadas com ASO 1 [00223] ASO 1 especificado em Tabela 1 é um ASO de 16-mer inteiramente complementar para uma sequência de 16-mer do sítio de remoção 3’ estendendo a junção de intron 6 e exon 7 no pré-mRNA SNAP25 humano. ASO 1 se sobrepõe complementarmente com a sequência alvo de 16-mer como marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA humana de 30-mer de [(5' —> 3') cucuuugqaucccag | GGUAACAAAUGAUGC1. ASO 1 possui uma sobreposi

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45/51 ção de 6-mer com intron 6 e uma sobreposição de 10-mer com exon 7. Entretanto, o ASO possui um único desemparelhamento com o prémRNA SNAP25 de rato como marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 25-mer de [(5' —> 3') uqqcucccag | GGUAACAAACGAUGC1, onde p único desemparelhamento é marcado com um sinal entre aspas ().

[00224] ASO 1 foi avaliado por qPCR aninhada SNAP25 para sua habilidade para induzir mudanças no nível de mRNA SNAP25 de rato em células PC12 como descrito no Exemplo 2, a menos que notado de outro modo.

[00225] A Figura 16B provê os dados de qPCR, onde o nível de mRNA de inteiro comprimento diminuiu significantemente (teste-t de Student) nas células tratadas com SNAP-ASO 1 em 10 zM, 100 zM e 1000 zM por aproximadamente 50%, 40% e 70%, respectivamente. Como no caso de ASO 3, o padrão de resposta de dose invertido foi parcialmente reproduzido com ASO 1 quando a dose foi aumentada de 10 para 100 zM. Dado que o nível de mRNA de inteiro comprimento ainda diminuiu quando a concentração de ASO foi aumentada para 1000 zM, entretanto, a eficácia de pulo de exon de ASO 1 parece ser mais forte que a eficácia de Aso 3.

Exemplo 4. Inibição de expressão de proteína SNAP25 em células PC12 por ASO 3 [00226] ASO 3 foi avaliado para sua habilidade para inibir a expressão da proteína SNAP25 em células PC12 como se segue.

[00227] Células PC12 foram crescidas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura, e tratadas com ASO 3 em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM ou 10 aM por 48 horas. Existiram 4 placas de cultura do controle negativo para compensar por potenciais artefatos técnicos durante a análise western blot.

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46/51 [00228] [Lise de Célula], Então as células foram submetidas a lise sobre gelo com 200 pL de tampão 1X RIPA (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) suplementado com 1% SDS e coquetel de inibidores de proteinase 1X (complete Mini, Roche). Os lisados foram coletados em tubo-e de 1,5 mL, misturados com 100 pL de tampão de amostra 5X, e levado à ebulição por 5 minutos.

[00229] [Western Blot], Os lisados foram submetidos a separação eletroforética sobre um gel de gradiente TGX-PAGE 4-15% (Cat. Number 456-1086, Bio-Rad) e então transferidos sobre uma membrana de PVDF de 0,45 pm. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-SNAP25 (Cat. Number S9684, Sigma) e um anticorpo anti-βactina (Cat. Number A3845, Sigma).

[00230] A Figura 17A provê os dados de western blot de SNAP25 obtidos com os lisados de célula PC12 (diagrama superior) junto com os níveis de expressão relativa de SNAP25normalizados contra βactina através de densitometria (diagrama inferior). O nível de proteína SNAP25 diminuiu por 10 a 60% nas células tratadas com ASO 3. O nível de expressão do controle negativo (isto é, 0 zM ASO 3) é o nível de expressão médio das 4 amostras.

Exemplo 5. Inibição de expressão de proteína SNAPO25 em células PC12 por ASO 1 [00231] ASO 1 foi avaliado para sua habilidade para inibir a expressão de proteína SNAP25 em células PC12 como descrito no Exemplo 4, a menos que notado de outro modo. Células PC12 foram tratadas com ASO 1 em 0 (controle negativo), 100 ou 1000 zM tanto por 48 horas como por 72 horas (uma placa de cultura para cada concentração de ASO).

[00232] A Figura 17B provê os dados de western blot para o tratamento com ASO de 48 horas (esquerda) e 72 horas (direita). ASO 1 inibiu consideravelmente a expressão da proteína SNAP25 em células

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PC12 em ambos pontos de tempo.

Exemplo 6. Inibição de expressão de proteína SNAP25 em pele administrada topicamente com ASO 1 em camundongo [00233] ASO 1 é inteiramente complementar para o sítio de remoção 3’ de exon 7 no pré-mRNA SNAP25 de camundongo. ASO 1 foi avaliado para sua habilidade para inibir a expressão da proteína SNAP25 na pele com administração tópica como descrito abaixo.

[00234] [Corte de pelo e Agrupamento], No Dia 0, 8 camundongos C57BL/6 fêmeas (5 semanas de idade) foram anestesiados com zoletil/rompun, e o pelo nas costas (aproximadamente 3 cm x 4 cm) foi cortado com um cortador. Camundongos forram designados randomicamente em quatro grupos, isto é, nenhum grupo com tratamento com ASO (controle negativo) e 3 grupos de tratamento de 1 fM, 10 fM e 100 fM de ASO 1. (2 animais por grupo).

[00235] [Administração Tópica], Soluções tópicas de ASO 1 foram preparadas através de diluição de uma solução estoque aquosa mãe em etanol aquoso 30% (v/v) suplementado com glicerina 3% (v/v) para 0 (controle negativo), 1, 10 e 100 fM de ASO 1. Cada animal foi administrado topicamente com aproximadamente 100 μΙ_ de uma solução tópica 2 vezes por dia (manhã & depois à tarde) durante Dias 0 a 4 na pele das costas de pelo cortado usando uma bola de algodão.

[00236] [Amostragem de Pele], Na tarde de Dia 4, os animais foram sacrificados após anestesia com zoletil/rompun de modo a amostrar a porção da pele tratada topicamente com o ASO. As amostras de pele foram então submetidas a análises imuno histoquímica (IHC) contra a proteína SNAP25 como descrito abaixo.

[00237] [IHC de SNAP25], As amostras de pele foram crioseccionadas e imuno manchadas em séries com um anticorpo antiSNAP25 primário (Cat. Number ab41455, Abeam) em diluição 1:200, com uma anti-lgG secundária (Cat. Number BA-1100, Vector) em dilui

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48/51 ção 1:200, e então com Dylight 594-steptavidina (Cat Number AS5594, Vector, CA, USA) em diluição 1:200 para marcação com fluorescência vermelha. O anticorpo anti-SNAP25 sonda o termina-C da proteína SNAP25. Imagens IHC foram capturadas sobre um scanner de lâmina Zeiss para avaliar mudanças na expressão do nível de SNAP25 de inteiro comprimento. Manchamento DAPI foi adicionalmente realizado para localizar a microestrutura de derme.

[00238] A Figura 18 provê um conjunto representativo das imagens IHC de SNAP25 por grupo. No grupo de controle negativo, a expressão de proteína SNAP25 de inteiro comprimento foi alta na camada de músculo debaixo de derme. A expressão de proteína SNAP25 na camada de músculos é considerada originar-se da expressão de proteína SNAP25 nos axons neuronais-motores embutidos na camada de músculos. A expressão de proteína SNAP25 de inteiro comprimento na camada de músculo diminuiu acentuadamente nos grupos de tratamento com ASO. A diminuição mais notável foi observada no grupo de tratamento com ASO 1 100 fM. A extensão inibidora da expressão de proteína SNAP25 de inteiro comprimento na pele foi muito mais forte do que a extensão observada em células PC12 (cf. Exemplo 5).

[00239] Dado que BTX tem sido amplamente usado para tratar rugas faciais (para antienvelhecimento) através de injeção, a inibição da expressão de proteína SNAP25na camada de músculo debaixo de derme é de importância farmacológica e terapêutica. Uma injeção de BTX está associada com um risco de que uma certa fração da injeção potencialmente distribui para tecidos de músculo conceito de segurança. Se BTX se distribui para tecidos de músculo liso pulmonar, por exemplo, o sujeito está em alto risco de insuficiência pulmonar.

[00240] A atividade inibidora de SNAP25 depende da concentração de ASO em tecido alvo. Com administração tópica, a concentração de ASO diminui rapidamente em tecidos distais para a camada de derme

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49/51 de administração de ASO. É improvável que tecidos alvos de conceito de segurança sejam expostos ao ASO em uma concentração suficientemente alta para elevar conceito de segurança. Assim o derivado PNA de Fórmula I para uso tópico é distintamente vantajoso sobre injeção de BTX para segurança assim como aquiescência de sujeito.

Exemplo 7. Inibição de expressão de proteína SNAP25 em células SiMa por ASO 3 [00241] ASO 3 foi avaliado para sua habilidade para inibir a expressão da proteína SNAP25 em células de neuroblastoma humano SiMa como se segue.

[00242] [Cultura de células e tratamento com ASO]. Células SiMa (Cat. Number ACC164, DSMZ) foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS 10%, streptomicina/penicilina 1%, L-glutamina 1%, e piruvato de sódio 1% sob atmosfera de CO2 5% a 37°C. Células SiMa foram crescidas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura, e foram tratadas por 48 horas com ASO 3 em 0 zM (controle negativo), 1 zM a 100 aM. Existiram 3 placas de cultura para 0 controle negativo para compensar por potenciais artefatos técnicos durante a análise western blot.

[00243] [Lise], As células foram submetidas a lise sobre gelo com 200 pL de tampão 1X RIPA (Cat. Number 9806, Cell Signalling Tech) suplementado com SDS 0,1% e coquetel de inibidores de proteinase 1X (complete Mini, Roche). Então os lisados foram coletados em tuboe de 1,5 mL, misturados com 100 pL de tampão de amostra 5X, e levados a ebulição por 5 minutos.

[00244] [Western Blot], Os lisados foram submetidos a separação eletroforética sobre um gel SDS-PAGE 12%, e transferidos sobre uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,2 pm. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-SNAP25 (Cat. Number ab41455, Sigma) e um anticorpo anti-p-actina (Cat. Number A3845,

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Sigma).

[00245] A Figura 19A provê os dados de western blot de SNAP25 obtidos com os lisados de células (diagrama superior) junto com os níveis de expressão de SNAP25 relativos normalizados contra β-actina por densitometria (diagrama inferior). O nível de expressão do controle negativo (isto é, 0 zM ASO 3) é o nível de expressão médio das 3 amostras. O nível de proteína SNAP25diminuiu por 40 a 50% nas células tratadas com ASO 3.

Exemplo 8. qPCR para mRNA SNAP25 em células SiMa tratadas com ASO 3 [00246] ASO 3 foi avaliado por qPCR aninhada SNAP25 para sua habilidade para induzir mudanças no nível de mRNA SNAP25 humano em células SiMa como se segue.

[00247] [Cultura de células & Tratamento com ASO]. Células SiMa foram crescidas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura, e foram tratadas com ASO 3 em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM, ou 1 aM, 10 aM, ou 100 aM. (2 placas de cultura por concentração ASO).

[00248] [Extração de RNA & Síntese de cDNA], RNA total foi extraído de células usando Rneasy Mini Kit (Cat. Number 74106, Qiagen) de acordo com instruções do fabricante. 200 ng de molde RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando PrimeScript 1^st strand cDNA synthesis Kit (Cat. No. 6110B, Takara) contra hexâmetros randômicos.

[00249] [Amplificação qPCR]. As reações PCR foram monitoradas com uma sonda Taqman [(5' —> 3') 56-FAM-CGGCTTCAT-ZENCCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ] alvejando a junção de exon 6 e exon 7 contra um conjunto de iniciadores específico-exon [exon 6_dianteiro: (5' 3') GACGAAC-GGGAGCAGATG; e exon 8_reverso(2): (5' 3')

ATCTCATTGCCCATATCCAGG]. Condições de ciclo: 95°C por 3 mi

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51/51 nutos seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95°C, e 30 segundos a 60°C.

[00250] A Figura 19B provê os dados de qPCR, onde o nível de mRNA SNAP25 humano de inteiro comprimento diminuiu significantemente (teste-t de Student) nas células tratadas com ASO 3 em 1 zM, 100 zM, 1 aM e 100 aM por 20 a 40%. As células tratadas com o ASO em 100 aM mostraram a inibição mais forte de 40%.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Derivado ácido nucléico peptídeo, caracterizado pelo fato de ser representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

   Bi

   V o yr/ ^Y S-! ^T1 b₂

   V O

   B_n-1

   V o

   Sn-1 s,

   B_n ¹ 0

   Formula I

   T_n em que, urn inteiro entre 10 e 25; composto de Fórmula I possui pelo sição complementar de 10-mer com uma sequência pré-mRNA de 14mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 hu menos uma sobrepomana;

   o composto de Fórmula I é inteiramente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humana, ou parcialmente complementar para o pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos;

   Si, S₂, ..., Sn-i, S_n, Ti, T₂, ..., Tn-ι, e T_n independentemente representam deuterido [D], hidrido [H}, radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

   X e Y representam independentemente radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH₂-C(=O)-], amino tiocarbonila [NH₂C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, arila acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, arilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída,

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2. 2/12 aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, ou aril fosfonila substituída ou não substituída;

   Z representa radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

   Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina, e uracila, e nucleobases não naturais; e, pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à metade nucleobase.

   2. Derivado ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 10 e 25;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ -^3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula I é inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano, ou parcialmente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos;

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n representam independentemente radical deuterido, hidrido, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;

   X e Y independentemente representam radical hidrido, formila, amino carbonila, amino tiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituído

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 73/124
3. 3/12 ou n ão substituído, aril acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil amino tiocarbonila substituída ou não substituída, aril amino tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, arilóxi tiocarbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, aril sulfonila substituída ou não substituída, alquil fosfonila substituída ou não substituída, ou aril fosfonila substituída ou não substituída;

   Z representa radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída; Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são independentemente selecionados de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina, e uracila, e nucleobases não naturais; e, pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por

   Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV:

   

   Formula II

   

   

   Formula III

   Formula IV em que,

   Ri, R2, R3, RR4, Rs e Re são selecionados independentemente de radical hidrido, e alquila substituída ou não substituída;

   L1, l_2 e l_3 são um ligante covalente representado por Fórmula V ligando covalentemente 0 grupo amino básico à metade nucleobase:

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4. 4/12

   

   Formula V em que,

   Qi e Qm são radicais metileno (-CH2-) substituídos ou não substituídos, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

   Q2, Q3, ..., e Qm-i são independentemente selecionados de metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-), e radical amino substituído ou não substituído[-N(H)-, ou N(substituinte)-]; e, m é um inteiro entre 1 e 15.

   3. Derivado ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 11 e 21;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula I ser inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano, ou parcialmente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano com um ou dois desemparelhamentos

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n serem radical hidrido;

   X e Y independentemente representarem radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, arilóxi carbonila substituída ou não substituída, alquil amino carbonila substituída ou não substituída, aril amino carbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, ou aril sulfonila substituída ou não substituída;

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5. 5/12

   Z representar radical amino substituído ou não substituído;

   Bi, B2, B_n-i, e B_n serem selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

   pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n serem selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

   Ri, R2, R3, R4, Rs e Re serem selecionados independentemente de radical hidrido, e alquila substituída ou não substituída;

   Q1 e Q_m serem radical metileno substituído ou não substituído, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

   Q2, Q3, ..., e Qm-i serem selecionados independentemente de radical metileno substituído ou não substituído, oxigênio, e amino; e, m ser um inteiro entre 1 e 11.

   4. Derivado ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 11 e 19;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula ser inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano;

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n são radical hidrido;

   X e Y independentemente representam radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, alquilóxi carbonila substituída ou não substituída, al

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 76/124
6. 6/12 quil amino carbonila substituída ou não substituída, alquil sulfonila substituída ou não substituída, ou aril sulfonila substituída ou não substituída;

   Z representa radical amino substituído ou não substituído;

   Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

   pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

   Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são selecionados independentemente de radical hidrido, e alquila substituída ou não substituída;

   Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

   Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio, e amino; e, m é um inteiro entre 1 e 9.

   5. Derivado ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 11 e 19;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula I ser inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano;

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n serem radical hidrido;

   X e Y independentemente representarem radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substitu

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 77/124
7. 7/12 ida, alquil acila substituída ou não substituída, ou aril acila substituída ou não substituída, ou alquilóxi carbonila substituída ou não substituída/ representar radical amino substituído ou não substituído;

   Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n serem selecionados independentemente de nucleobases naturais incluindo ade nina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;

   pelo menos quatro de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

   R1, R3, e Rs são radical hidrido, e R2, R4 e Re independentemente representam radical hidrido, ou alquila substituída ou não substituída;

   Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

   Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio; e, m é um inteiro entre 1 e 8.

   6. Derivado de ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 11 e 19;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula ser inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano;

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n serem radical hidrido;

   X e Y independentemente representam radical hidrido, alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 78/124
8. 8/12 substituída, ou alquilóxi carbonila substituída ou não substituída;

   Z representa radical amino substituído ou não substituído;

   Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais;

   pelo menos cinco de Bi, B2, ..., B_n-i, e B_n são selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

   Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são radical hidrido;

   Q1 e Q_m são radical metileno, e Q_m está diretamente ligado ao grupo amino básico;

   Q2, Q3, ..., e Qm-i são selecionados independentemente de radical metileno, oxigênio; e, m é um inteiro entre 1 e 8.

   7. Derivado de ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo, caracterizado pelo fato de:

   n ser um inteiro entre 11 e 19;

   0 composto de Fórmula I possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de pré-mRNA de 14-mer de [(5’ 3’) AUCCCAGGGUAACA] no pré-mRNA SNAP25 humano;

   0 composto de Fórmula I ser inteiramente complementar para 0 pré-mRNA SNAP25 humano;

   Si, S2, ..., Sn-i, S_n, Τι, T2, ..., Tn-ι, e T_n serem radical hidrido;

   X ser radical hidrido;

   Y representar radical alquil acila substituída ou não substituída, aril acila substituída ou não substituída, ou alquilóxi carbonila substituída ou não substituída;

   Z representar radical amino substituído ou não substituído;

   Bi, B2, ..., Bn-ι, e B_n serem selecionados independentemen

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 79/124
9. 9/12 te de adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;

   pelo menos cinco de Bi, B2, B_n-i, e B_n serem selecionados independentemente de nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;

   Ri, R2, R3, R4, Rs e Re serem radical hidrido;

   L1 representar -(CH₂)2-O-(CH₂)2-, -CH₂-O-(CH₂)2-, -CH2-O(CH2)3-, -CH₂-O-(CH₂)4-, ou -CH₂-O-(CH₂)5- com a extremidade direita diretamente ligada ao grupo amino básico; e l_2 e l_3 serem selecionados independentemente de -(CFEA, -(CH₂)₃-, -(CH₂)4-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, -(CH₂)₈-, -(CH₂)2-O(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, e -(CH2)2-O-(CH2)3- com a extremidade direita diretamente ligada ao grupo amino básico.

   8. Derivado de ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo de derivados de ácido nucléico peptídeo provido abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

   (N C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

   (N C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

   (N C) Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH₂;

   (N C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)NH₂;

   (N C) Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)NH₂;

   (N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

   (N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH₂;

   (N C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

   (N C) Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)TLys-NH₂;

   (N C) H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH₂;

   (N C) Benzoil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH₂;

   Petição 870190058822, de 25/06/2019, pág. 80/124
10. 10/12 (N -+ C) Benzoil-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) n-Hexanoil-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) n-Propil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

    (N -+ C) Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

    (N -+ C) [N-(2-fenil etil) amino] carbonil-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)TGG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) n-Propil-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)TNH₂;

    (N -+ C) n-Propil-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-ArgNH₂;

    (N -+ C) n-Benzoil-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)TNH₂;

    (N -+ C) N-Me-N-fenil-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) p-Tolueno sulfonil-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)GA(5)T-Lys-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH₂;

    (N -+ C) Bezeno sulfonil-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)TNH₂;

    (N -+ C) fenil-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH₂;

    (N -+ C) Benzil-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)ANH₂;

    (N -+ C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH₂;

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11. 11/12 (N -+ C) Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)NH₂;\ (N -+ C) Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH₂;

    (N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH₂;

    e, (N -+ C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH₂: em que,

    A, G,T, e C são monômeros PNA com uma nucleobase natural de adenina, guanina, timina, e citosina, respectivamente;

    C(pOq), A(p), A(pOq), G9p), e G9pOq) são monômeros PNA com uma nucleobase não natural representada por Fórmula VI, Fórmula VII,

    Fórmula VIII, Fórmula IX, e Fórmula X, respectivamente;

    O--(CH₂)_q-NH₂

    

    I

    I

    Formula VI

    

    Formula VII

    

    Formula VII

    

    Formula IX

    

    Formula X em que, p e q são inteiros; e, as abreviações para os substituintes de terminus-N e Cisão especificamente definidas como se segue: Fmoc- é a abreviação para [(9-fluorenil) metilóxi] carbonila-; Fethoc- para [2-(9-fluorenil) etil-1-óxi] carbonila; Ac- para acetila-; Benzoíla- para benzeno

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12. 12/12 carbonila-; Piv- para pivalila-; n-propila- para l-(n-propila)-, Ή- para grupo hidrido; p-tolueno sulfonila para (4-metil benzeno)-1sulfonilaa-; -Lys- para resíduo de aminoácido lisina; -Vai- para resíduo de aminoácido valina; -Leu- para resíduo de aminoácido leucina; -Arg- para resíduo de aminoácido arginine; -Gly- para resíduo de aminoácido glicina; [N-(2-fenil etil) amino] carbonila- para [N-1-(2-fenil etil) amino] carbonila-; benzila- para 1 -(fenil) metila; Fenila- para fenila-; Me- para metila-; -HEX- para 6-amino1-hexanoíla-; FAM- para 5, ou 6-fluoresceina carbonila- (mistura isomérica), e -NH2 para grupo -amino não substituído.

    9. Método para tratar uma doença ou condição envolvendo a expressão do gene SNAP25 humano, caracterizado pelo fato de compreender administrar 0 derivado de ácido nucléico peptídeo como definido na reivindicação 1 a um sujeito humano.

    10. Método para tratar uma doença ou condição envolvendo a expressão do gene SNAP25 humano, caracterizado pelo fato de compreender administração tópica do derivado de ácido nucléico peptídeo de acordo com a reivindicação 1 a um sujeito humano.