BR112020000461A2

BR112020000461A2 - derivado de ácido peptonucleico, composição farmacêutica, método para tratamento de doenças ou condições que envolvam a expressão do gene da tirosinase humana, método para tratamento da hiperpigmentação e uso do derivado de ácido peptonucleico

Info

Publication number: BR112020000461A2
Application number: BR112020000461-8A
Authority: BR
Inventors: Daram Jung; Hye Mi Park; Seon-Young Han; Soyoung KIM
Original assignee: Olipass Corporation
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2020-07-21
Also published as: JP7109532B2; TW201907958A; ES2906396T3; RU2019142512A3; MX2019015246A; EP3658570B1; KR20190011181A; RU2019142512A; US20230148418A1; AR112761A1; CN110831958A; EP3658570A1; EP3658570A4; SG11201912447RA; TWI782999B; AU2018308224A1; JP2020528899A; CN110831958B; AU2018308224B2; AU2018308224B9

Abstract

DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS OU CONDIÇÕES QUE ENVOLVAM A EXPRESSÃO DO GENE DA TIROSINASE HUMANA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DA HIPERPIGMENTAÇÃO E USO DO DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO. São fornecidos derivados de ácido peptonucleico que visam um local de splice 3? do pré-mRNA da tirosinase humana. Os derivados do ácido peptonucleico induzem potentemente uma variante de splice do mRNA da tirosinase humana nas células e são úteis para tratar com segurança indicações ou condições dermatológicas que envolvem a proteína tirosinase humana após administração tópica.

Description

“DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS OU CONDIÇÕES QUE ENVOLVAM A EXPRESSÃO DO GENE DA TIROSINASE HUMANA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DA HIPERPIGMENTAÇÃO E USO DO DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”. CAMPO DE APLICAÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a derivados de ácido peptonucleico que visam complementarmente o pré-mRNA da tirosinase humana para melhoria da pigmentação da pele mediada pela tirosinase.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] A melanina se refere coletivamente a pigmentos escuros e poliméricos naturais produzidos em organismos vivos. Existem três tipos de melanina, isto é, eumelanina, feomelanina e neuromelanina. Eumelanina e feomelanina são sintetizadas na pele. Enquanto isso, a neuromelanina é uma melanina encontrada no cérebro e suas funções fisiológicas ainda não foram elucidadas.

[0003] A melanina na pele efetivamente absorve a radiação UV (ultravioleta) e protege os animais da radiação UV (ultravioleta) na luz solar natural. Assim, o bronzeamento é um processo natural em que os animais se protegem da irradiação UV na luz solar.

[0004] O aminoácido tirosina polimeriza-se em eumelanina após uma série de reações complexas na presença de tirosinase. A eumelanina refere-se a polímeros de 5,6-di- hidroxiindol (DHI |dihydroxyindole) e ácido 5,6-di- hidroxiindol-2-carboxílico (DHICA|5,6-dihydroxyindole-2- carboxylic acid). A feomelanina é formada quando a tirosina é polimerizada pela tirosinase na presença de cisteína ou glutationa. (Vide FIG. 13)

[0005] O Esquema 1 (Vide FIG. 14), resume as reações envolvendo TYR (tirosinase), TYRP-l1 (proteína 1 relacionada à tirosinase, ou seja, DHICA oxidase) e TYRP-2 (proteína 2 relacionada à tirosinase, ou seja, DOPAcromo tautomerase) durante a biossíntese de eumelanina e feomelanina. [Int. O. Mol. Sci. Vol. 10, 4066-4087 (2009)].

[0006] Dado que a tirosinase (TYR) desempenha papéis centrais na biossíntese de melanina na pele, os inibidores de TYR foram usados ou desenvolvidos como ingredientes cosméticos para redução da pigmentação excessiva da pele, isto é, hiperpigmentação. Os inibidores da TYR foram revisados quanto a seus efeitos contra a melanogênese em vários artigos. [Int. J. Cosmetic Sci. vol. 33, 2100-221 (2011); Int. J. Mol. Sci. vol. 10, 2440-2475 (2009)].

oH A oH O O or O on (> O e AP o A AP HO OH oo ELO º Hidroquinona Arbutina Deóxiarbutina Ácido Kójico

[0007] À hidroquinona (1, 4-di-hidroxibenzeno) tem sido utilizada para tratamento tópico da hiperpigmentação ao longo de décadas. [JAMA vol. 194(9), 965-967 (1965)]. Sabe- se que a hidroquinona inibe a atividade da TYR por ligação ao local ativo da tirosinase. Em 2006, a FDA (Food and Drug Administration Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA) revogou a aprovação anterior de todos os produtos vendidos sem receita médica que continham hidroquinona devido a questões de segurança, incluindo potencial carcinogenicidade. A hidroquinona induz ROS (reactive oxygen species|espécies reativas de oxigênio), danificando lipídios e proteínas da membrana, incluindo a tirosinase. O dano oxidativo dos lipídios da membrana priva permanentemente os melanócitos.

[0008] À arbutina (hidroquinona-O-B-D- glicopiranosídeo) é uma hidroquinona glicosilada extraída da planta da uva-ursina. A arbutina também é encontrada na casca do trigo e da Pêra. Como a hidroquinona, a arbutina inibe a melanogênese ao se ligar competitivamente ao local ativo da TYR. [J]. Pharmacol. Exp. Ther. Vol. 276(2), 765-769 (1996)]. A arbutina é menos citotóxica para os melanócitos do que a hidroquinona.

[0009] A desoxiarbutina é um derivado sintético da arbutina e é comparável à hidroquinona e arbutina na atividade inibitória da TYR. A desoxiarbutina é menos citotóxica para os melanócitos do que a arbutina e a hidroquinona. ([9. Dermatol. Sci. vol. 55(3), 179-184 (2009)]. A desoxiarbutina melhorou significativamente a luminosidade da pele em seres humanos tratados topicamente por 12 semanas. [Exp. Dermatol. vol. 14(8), 601-608 (2005)].

[0010] O ácido kójico é um agente quelante produzido durante a fermentação fúngica para fabricação de molho e saquê de soja, isto é, vinho de arroz japonês. O ácido kójico tem sido usado para preservação ou alteração de cores em alimentos e produtos cosméticos. O ácido kójico se quela aos íons de cobre no local ativo da TYR para inibição da melanogênese. Ele também suprime a tautomerização do DOPAcromo a ácido 5,6- di-hidroxiindol-2-carboxílico. [J. Pharm. Pharmacol. vol. 46(12), 982-985 (1994)]. O ácido kójico tem sido popularmente utilizado para tratamento do melasma, embora possa induzir dermatite de contato, sensibilização e eritema. [J. Drugs Dermatol. vol. 6(1), 32-39 (2007)].

[0011] Embora exista uma variedade de inibidores de TYR, seus valores de ICso contra TYR são, na maioria dos casos, micromolares (uM). []. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol. 32(1), 403-425 (2017)]. Tais valores de ICso são considerados ruins, considerando seus tamanhos “moleculares, e aumentam a possibilidade de reatividade cruzada com outros alvos moleculares. Uma vez que uma atividade inibitória fraca é traduzida em grande dose transdérmica, a potência inibitória precisa ser acentuadamente melhorada para alcançar a atividade transdérmica desejada contra a pigmentação da pele, e também a segurança.

[0012] Pré-mRNA: A informação genética é transportada no DNA (ácido 2-desoxirribose nucleico). O DNA é transcrito para produzir pré-mRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. O pré-mRNA dos mamíferos geralmente consiste em éxons e íÍntrons, sendo o éxon e o Íntron interconectados, conforme esquematicamente fornecido abaixo. Éxons e íntrons são numerados, conforme exemplificado no desenho da FIG. 15.

[0013] Splice do pré-mRNA: O pré-mRNA é processado no mMRNA após a exclusão dos íntrons por uma série de reações complexas coletivamente denominadas de “splice”, que são esquematicamente resumidas no diagrama da FIG. 16. [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108- 121 (2014)].

[0014] O splice é iniciado através da formação do “complexo spliceossoma E” (ou seja, complexo spliceossoma inicial) entre o pré-mRNA e os fatores de adaptação do splice. No “complexo do spliceossoma E”, Ul se liga à junção do éxon N e íntron N e U2AF*”* se liga à junção do íntron N e éxon (N+1). Assim, as junções de éxon/íntron ou íntron/éxon são críticas para a formação do complexo do spliceossoma inicial. O “complexo do spliceossoma E” evolui para “complexo do spliceossoma A” após complexação adicional com U2. O “complexo do spliceossoma A” passa por uma série de reações complexas para excluir ou efetuar splice do íÍntron para unir os éxons vizinhos.

[0015] Síntese Proteica Ribossômica: As proteínas são codificadas pelo DNA (ácido 2-desoxirribose nucleico). Em resposta à estimulação celular ou espontaneamente, o DNA é transcrito para produção de pré-mRNA (ácido ribonucleico pré- mensageiro) no núcleo. os íÍntrons do pré-mRNA são enzimaticamente separados para produção de mRNA (ácido ribonucleico mensageiro), que é, então, translocado ao citoplasma. No citoplasma, um complexo de maquinaria de translação chamado ribossomo se liga ao mRNA e realiza a síntese proteica à medida que verifica a informação genética codificada ao longo do mRNA. [Biochemistry vol. 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. Vol. 48, 2659-2668 (1988)].

[0016] Ol igonucleotídeo antissentido (ASO) : Um oligonucleotídeo que se liga ao ácido nucleico incluindo DNA, MRNA e pré-mRNA de uma maneira específica de sequência (isto é, complementarmente) é chamado de oligonucleotídeo antissentido (ASO|antisense oligonucleotide).

[0017] Se um ASO se ligar firmemente a um mRNA no citoplasma, por exemplo, o ASO poderá inibir a síntese de proteínas ribossômicas ao longo do mMRNA. O ASO precisa estar presente no citoplasma para inibir a síntese de proteínas ribossômicas de sua proteína alvo.

[0018] Inibição Antissentido do Splice: Se um ASO se ligar firmemente a um pré-mRNA no núcleo, o ASO pode ser capaz de inibir ou modular o splice do pré-mRNA no mRNA. O ASO precisa estar presente dentro do núcleo para inibir ou modular o splice do pré-mRNA no mRNA. Essa inibição antissentido do splice produz um mMRNA ou mMRNAs sem o éxon alvo do ASO. Esses mMRNAs são chamados de “variante(s) de splice” e codificam proteínas menores que a proteína codificada pelo mRNA completo.

[0019] Em princípio, o splice pode ser interrompido pela inibição da formação do “complexo do spliceossoma E”. Se um ASO se ligar firmemente a uma junção de éxon-íntron (5" —> 3") ou seja, “local de splice 5'"”", o ASO bloqueia a formação complexa entre o pré-mRNA e o fator Ul e, portanto, a formação do “complexo do spliceossoma E”. Da mesma forma, o “complexo do spliceossoma E” não pode ser formado se um ASO se ligar firmemente a uma junção de (5" — 3") íntron-éxon, isto é, “local de splice 3'”.

[0020] O local de splice 3' e o local de splice 5' são esquematicamente ilustrados no desenho fornecido na FIG. 17.

[0021] Oligonucleotídeos Não Naturais: os oligonucleotídeos de DNA ou RNA são suscetíveis à degradação por nucleases endógenas, limitando sua utilidade terapêutica. Até o momento, muitos tipos de oligonucleotídeos não naturais (naturalmente não ocorrentes) foram desenvolvidos e intensivamente estudados. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol. 33, 533-540 (2006)]. Alguns deles mostram estabilidade metabólica estendida em comparação ao DNA e RNA. São fornecidas abaixo as estruturas químicas para alguns dos oligonucleotídeos representativos não naturais. Tais oligonucleotídeos previsivelmente se ligam a um ácido nucleico complementar, como o DNA ou o RNA. x Jo ”. B Y 5 ( B PP ow 4

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DNA PTO LNA PMO PNA B : Nucleobase

[0022] Oligonucleotídeo de Fosforotioato: o oligonucleotídeo de fosforotioato (PTO | phosphorothioate oligonucleotide) é um análogo de DNA com um dos átomos de oxigênio de fosfato da estrutura substituído por um átomo de enxofre por monômero. Uma mudança estrutural tão pequena tornou o PTO comparativamente resistente à degradação por nucleases. [Ann. Rev. Biochem. Vol. 54, 367-402 (1985)].

[0023] Ao refletir a semelhança estrutural na estrutura do PTO e do DNA, ambos penetram insuficientemente na membrana celular da maioria dos tipos de células de mamíferos. Para alguns tipos de células que expressam abundantemente transportador (es) de DNA, no entanto, o DNA e o PTO mostram boa penetração celular. Sabe-se que os PTOs administrados sistemicamente são distribuídos prontamente ao fígado e aos rins. [Nucleic Acids Res. Vol. 25, 3290-3296 (1997) ].

[0024] À fim de facilitar a penetração celular do PTO in vitro, a lipofecção tem sido popularmente praticada. No entanto, a lipofecção altera fisicamente a membrana celular, causa citotoxicidade e, portanto, não seria ideal para uso terapêutico in vivo a longo prazo.

[0025] Nos últimos 30 anos, os PTOs antissentido e variantes de PTOS foram avaliados clinicamente para tratamento de cânceres, distúrbios imunológicos, doenças metabólicas, etc. [Biochemistry vol. 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol. 33, 533-540 (2006)]. Muitos desses candidatos a fármacos antissentido não foram desenvolvidos com sucesso, em parte devido à baixa penetração celular do PTO. A fim de superar a fraca penetração celular, o PTO precisa ser administrado em doses altas para atividade terapêutica. Entretanto, sabe-se que os PTOs estão associados à toxicidade limitante da dose, incluindo aumento do tempo de coagulação, ativação do complemento, nefropatia tubular, ativação das células de Kupffer e estimulação imunológica, incluindo esplenomegalia, hiperplasia linfoide, infiltração de células mononucleares. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol. 33, 533-540 (2006)].

[0026] Verificou-se que muitos PTOs antissentido demonstram atividade clínica devida para doenças com uma contribuição significativa ao fígado ou rim. O Mipomersen é um análogo do PTO que inibe a síntese da apoB-100, uma proteína envolvida no transporte de colesterol LDL. O Mipomersen manifestou atividade clínica devida em pacientes com aterosclerose, provavelmente devido à sua distribuição preferencial no fígado. [Circulation vol. 118(7), 743-753 (2008) ]. O ISIS-113715 é um análogo antissentido do PTO que inibe a síntese da proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) e mostrou atividade terapêutica em pacientes com diabetes tipo II. [Curr. Opin. Mol. Ther. Vol. 6, 331-336 (2004)].

[0027] Ácido Nucleico Bloqueado: No ácido nucleico bloqueado (LNA|locked nucleic acid), o anel ribose da estrutura do RNA é estruturalmente restringido para aumento da afinidade de ligação ao RNA ou ao DNA. Assim, o LNA pode ser considerado um análogo de DNA ou RNA de alta afinidade. [Biochemistry vol. 45, 7347-7355 (2006)].

[0028] Oligonucleotídeo Morfolino Fosforodiamidato: No oligonucleotídeo morfolino fosforodiamidato (PMO | phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), o fosfato da estrutura e a 2-desoxirribose do DNA são substituídos por fosforamidato e morfolina, respectivamente. [Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 71, 575-586 (2006)]. Enquanto a estrutura do DNA é carregada negativamente, a estrutura do PMO não é carregada. Assim, a ligação entre PMO e mRNA fica livre de repulsão eletrostática entre as estruturas e tende a ser mais forte do que aquela entre DNA e mRNA. Como o PMO é estruturalmente muito diferente do DNA, o PMO não seria reconhecido pelos transportadores hepáticos que reconhecem o DNA ou o RNA. No entanto, o PMO não penetra facilmente na membrana celular.

[0029] Ácido Peptonucleico: O ácido peptonucleico (PNA |peptide nucleic acid) é um polipeptídeo com N-(2- aminoetil)glicina como a estrutura da unidade, e foi descoberto pelo Dr. Nielsen e colegas. [Science, vol. 254, 1497-1500 (1991)]. A estrutura química e a nomenclatura abreviada do PNA são ilustradas nos desenhos fornecidos abaixo. Como o DNA e o RNA, o PNA também se liga seletivamente ao ácido nucleico complementar. [Nature (London), vol. 365, 566- 568 (1992)]. Na ligação ao ácido nucleico complementar, o N- terminal do PNA é considerado equivalente à “extremidade 5'” do DNA ou RNA, e o C-terminal do PNA é equivalente à “extremidade 3'” do DNA ou RNA. (N — C) X-B1B2B3----Baey)Br-Z Coterminal N-terminal y 8: Bi 8, / o o o O; N V o V o VW o Y o NAAA ANA is AAA ANA, | H H H H

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[0030] Como o PMO, a estrutura do PNA não é carregada. Assim, a ligação entre PNA e RNA tende a ser mais forte que a ligação entre DNA e RNA. Como o PNA é marcadamente diferente do DNA em sua estrutura química, o PNA não seria reconhecido pelos transportadores hepáticos que reconhecem o DNA e mostraria um perfil de distribuição de tecidos diferente do DNA ou do PTO. No entanto, o PNA também penetra insuficientemente na membrana celular dos mamíferos. (Adv. Drug Delivery Rev. vol. 55, 267-280, 2003).

[0031] Nucleobases Modificadas para Melhoria da Permeabilidade da Membrana do PNA: O PNA se tornou altamente permeável à membrana celular de mamíferos através da introdução de nucleobases modificadas com um lipídio catiônico ou seu equivalente covalentemente ligado a ele. As estruturas químicas dessas nucleobases modificadas são fornecidas “abaixo. Verificou-se que essas nucleobases modificadas de citosina, adenina e guanina hibridam de forma previsível e complementar com guanina, timina e citosina,

respectivamente. [Pedido de PCT Nº PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].

H NH A CH), NHz A tera NA (CHodm (CH2o)m 2 X=CH,O,S.orNH /X Nº NH 1º m = inteiro Ox Tr P CT N 1 EH), n = inteiro es o n o k AN CHado 1 TV "pá H NH NH o x o NH No NS nha x Era) SS. NA, Qd ÇA Hom LA do éh, GALA Had

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[0032] A incorporação dessas nucleobases modificadas no PNA se assemelha a situações de lipofecção. Por lipofecção, moléculas de oligonucleotídeo com estrutura de fosfato são envolvidas com moléculas lipídicas catiônicas, como a lipofectamina, e esses complexos de lipofectamina/oligonucleotídeo tendem a penetrar na membrana com bastante facilidade, em comparação com moléculas de oligonucleotídeo puras.

[0033] Além da boa permeabilidade à membrana, verificou-se que esses derivados de PNA possuem uma afinidade ultraforte com o ácido nucleico complementar. Por exemplo, a introdução de 4 a 5 nucleobases modificadas em derivados de PNA de 11 a 13-mer produziu facilmente um ganho de Tr de 20ºC ou mais na formação de duplex com DNA complementar. Tais derivados de PNA são altamente sensíveis a uma incompatibilidade de base única. Uma incompatibilidade de base única resultou em uma perda de Tr de 11 a 22ºC, dependendo do tipo de base modificada e da sequência de PNA.

[0034] RNAs interferentes pequenos (SiRNA): RNAs interferentes pequenos (siRNA|small interfering RNA) referem- se a um RNA de fita dupla de 20 a 25 pares de bases. [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol. 67(4), 657-685 (2003)]. A cadeia antissentido do siRNA, de alguma forma, interage com proteínas para formar um “Complexo de Silenciamento Induzido por RNA” (RISC | RNA-induced silencing complex). Então, o RISC liga uma parte do mRNA complementar à cadeia antissentido do siRNA. O mRNA complexo com o RISC sofre clivagem. Assim, o siRNA induz cataliticamente a clivagem do seu mRNA alvo e, consequentemente, inibe a expressão da proteína pelo mRNA. O RISC nem sempre se liga à sequência complementar completa dentro de seu mRNA alvo, o que levanta preocupações relacionadas aos efeitos inespecíficos de uma terapia com SiRNA. Como outras classes de oligonucleotídeo com estrutura de DNA ou RNA, o siRNA possui baixa permeabilidade celular e, portanto, tende a mostrar baixa atividade terapêutica in vitro ou in vivo, a menos que formulado adequadamente ou modificado quimicamente para ter boa permeabilidade à membrana.

[0035] siRNAs da tirosinase: Verificou-se que um sSiRNA da TYR que tem como alvo uma sequência de RNA de 19-mer no mMRNA da TYR humana inibe a expressão do mRNA e da proteína da TYR em melanócitos epidérmicos humanos (HEMs|human epidermal melanocytes) após uma lipofecção a 20 nM. O siRNA regulou negativamente o mRNA e a proteína TYR, mas não afetou a expressão das proteínas 1 e 2 relacionadas à tirosinase. O SiRNA inibiu a melanogênese induzida com irradiação UV. [BMB Reports, vol. 42(3), 178-183 (2009)].

[0036] Os sSiRNAs projetados para atingir o mRNA da TYR de um camundongo foram pesquisados quanto à sua capacidade de inibição da expressão do mRNA e da proteína da TYR, assim como à melanogênese em células de melanoma Bl6 de camundongo após uma lipofecção a 40 nM. O siRNA mais eficaz foi injetado no globo ocular do camundongo C57BL/6 e descobriu-se um inibição do mRNA da TYR na retina em cerca de 60%. [Mol. Biol. International, vol. 2010, ID de Artigo 240472 (2010)].

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA A SER RESOLVIDO

[0037] Existem mais exemplos de siRNAs da TYR em domínio público. Por exemplo, uma técnica prévia divulgou SiRNAs que têm como alvo o mRNA da TYR em humanos para tratamento da hiperpigmentação. [US 7504385] no entanto, a praticabilidade de tais siRNAs é questionável para uso contra hiperpigmentação. Os siRNAs são muito caros em sua fabricação e sua utilidade cosmética tende a ser limitada. Além disso, eles precisam ser liberados na pele por administração transdérmica para garantir a conformidade do usuário. Deve- se considerar que a entrega transdérmica tem sido um enorme desafio técnico no campo dos oligonucleotídeos.

SOLUÇÃO DO PROBLEMA

[0038] A presente invenção fornece um derivado de ácido peptonucleico representado pela Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: B, B? Bn1 Bn 0 o 0 o x o x Oo Pa Po E Yes h s, TT Sa Tn Ss, Fórmula | caracterizado, por n ser um número inteiro entre 10 e 21;

pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' —> 3') UGUACAGAUVUGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana, ou parcialmente complementar ao pré-mRNA da TYR humana com uma ou duas incompatibilidade(s) de todo o composto da Fórmula [; por Si, Sa, ***, Snifr Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn representarem independentemente deuterido, hidreto, uma alquila substituída ou não substituída ou um radical arila substituído ou não substituído; por X e Y representarem independentemente deuterido, hidreto [HH], formila [H-C(=0)-], aminocarbonila [NH3-C (=O0) —] aminotiocarbonila [NH;-C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída, arilóxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, um radical alquilfosfonila substituído ou não substituído ou um radical arilfosfonila substituído ou não substituído; por Z representar hidreto, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou um radical arila substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 E Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; e por, pelo menos, quatro dentre Bi, B2, ***, Bn1 e Br serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à fração da nucleobase.

[0039] O composto da Fórmula I induz a omissão do “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana, produz a(s) variante(s) de splice do mRNA da TYR humana sem “éxon 2” e, portanto, é útil para inibição da atividade funcional do gene que transcreve Oo pré-mRNA da TYR humana.

[0040] A condição de “n ser um número inteiro entre e 21” literalmente significa que n é um número inteiro selecionável de um grupo de números inteiros de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.

[0041] As estruturas químicas das nucleobases naturais ou não naturais no derivado de PNA da Fórmula I são exemplificadas nas Figuras de la a lc. As nucleobases naturais (isto é, de ocorrências naturais) ou não naturais (de ocorrências não naturais) da presente invenção compreendem, mas não estão limitadas, às nucleobases fornecidas nas Figuras de la a lc. O fornecimento dessas nucleobases não naturais deve ilustrar a diversidade de nucleobases permitidas e, portanto, não deve ser interpretado como uma limitação ao escopo da presente invenção.

[0042] Os substituintes adotados para descrever o derivado de PNA da Fórmula I são exemplificados nas Figuras de 2a a 2e. A Figura 2a fornece exemplos para radicais alquila substituída ou não substituída. Os radicais alquilacila substituída ou não substituída e os radicais alquilacila e arilacila substituída ou não substituída são exemplificados na Figura 2b. A Figura 2c ilustra exemplos de alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, arila substituída ou não substituída, alquilsulfonila ou arilsulfonila substituída ou não substituída e alquilfosfonila ou arilfosfonila substituída ou não substituída. A Figura 2d fornece exemplos de radicais alquiloxicarbonila ou ariloxicarbonila substituídas ou não substituídas, alquilaminocarbonila ou arilaminocarbonila substituídas ou não substituídas. Na Figura 2e são fornecidos exemplos de radicais alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída e ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída. O fornecimento de tais substituintes exemplares visa ilustrar a diversidade de substituintes permitidos e, portanto, não deve ser interpretada como uma limitação ao escopo da presente invenção. Um especialista na técnica pode descobrir facilmente que a sequência de oligonucleotídeos é o fator dominante para a ligação específica da sequência de oligonucleotídeos à sequência do pré-mRNA alvo sobre substituintes no N-terminal ou no C-terminal.

[0043] O composto da Fórmula I se liga firmemente ao DNA complementar, conforme exemplificado na técnica prévia [PCT/KR2009/001256]. O duplex entre o derivado do PNA da

Fórmula I e seu DNA ou RNA complementar de tamanho completo possui um valor de Tr alto demais para ser determinado com segurança em tampão aquoso. O composto do PNA da Fórmula I produz altos valores de Tr com DNAs complementares de menor comprimento.

[0044] O composto da Fórmula I se liga complementarmente ao local de splice 3" do “éxon 2” do pré- mMRNA da TYR humana. [Sequência de referência NCBI: NG 0008748]. A sequência de l4-mer de [(5" — 3") UGUACAGAUVGUCU] abrange a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana e consiste em 7-mer do “íntron 1” e 7-mer do “éxon 2”. Assim, a sequência do pré-mRNA de l4-mer pode ser convencionalmente designada como [(5' —> 3") uguacag | AuUGUCU], caracterizado pela sequência do íntron e do éxon ser fornecida como letras “minúsculas” e “maiúsculas”, respectivamente, e pela junção íntron-éxon ser expressa com “ |”. a denotação convencional para o pré-mRNA é ilustrada, ainda, por uma sequência de 30- mer de [(5' —> 3') gagguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA] que abrange a junção de “íntron 1” e “éxon 2” no pré-mRNA da TYR humana. Além disso, a sequência do pré-mRNA de 30-mer define inequivocamente o local de splice 3' visado pelo composto da Fórmula I no pré-mRNA da TYR humana, embora a numeração dos éxons da TYR possa ser relatada de outra forma.

[0045] O composto da Fórmula I se liga firmemente ao local de splice alvo 3' do pré-mRNA da TYR humana transcrita a partir do gene da TYR humana e interfere na formação do “complexo do spliceossoma inicial” que envolve o éxon alvo do composto. Uma vez que o composto da presente invenção inibe estericamente a formação de um “complexo do spliceossoma inicial”, o “éxon 2” da TYR sofre splice para produção de uma ou mais variante(s) de splice de mRNA da TYR sem o “éxon 2”. Consequentemente, o composto da presente invenção induz a omissão do “éxon 2” da TYR.

[0046] A forte afinidade do RNA permite que o composto da Fórmula I induza a omissão do “éxon 2” da TYR, mesmo quando o derivado do PNA possuir uma ou duas incompatibilidade(s com o local de splice alvo 3' no pré-mRNA da TYR. Assim, o derivado de PNA da Fórmula I ainda pode induzir a omissão do “éxon 2” da TYR em um pré-mRNA mutante da TYR que possua um ou dois SNPs (polimorfismo de nucleotídeo único) no local de splice alvo.

[0047] O composto da Fórmula I possui boa permeabilidade celular e pode ser prontamente entregue na célula como um oligonucleotídeo “desprotegido”, conforme exemplificado na técnica prévia [PCT/KR2009/001256]. Assim, o composto da presente invenção induz a omissão do “éxon 2” no pré-mRNA da TYR e produz uma ou mais variante(s) de splice de mRNA da TYR sem o “éxon 2” da TYR em células tratadas com o composto da Fórmula I como um oligonucleotídeo “desprotegido”. O composto da Fórmula I não requer meios ou formulações para entrega na célula para induzir potentemente a omissão do éxon alvo nas células. O composto da Fórmula IL induz prontamente a omissão do “éxon 2” da TYR em células tratadas com o composto da presente invenção como um oligonucleotídeo “desprotegido” na concentração subfemtomolar.

[0048] Devido à boa permeabilidade celular ou das membranas, o derivado de PNA da Fórmula I pode ser administrado topicamente como um oligonucleotídeo “desprotegido” para induzir a omissão do “éxon 2" da TYR na pele. O composto da Fórmula I não requer uma formulação para aumentar a entrega transdérmica no tecido alvo para a atividade terapêutica ou biológica pretendida. Normalmente o composto da Fórmula I é dissolvido em água e cossolvente e administrado por via tópica ou transdérmica em concentração subpicomolar para obtenção da atividade terapêutica Ou biológica desejada na pele alvo. O composto da presente invenção não precisa ser formulado de maneira pesada ou invasiva para que cause atividade terapêutica tópica. No entanto, o derivado de PNA da Fórmula I pode ser formulado com ingredientes cosméticos ou adjuvantes, como uma loção ou creme tópico. Essa loção ou creme cosmético tópico pode ser útil no tratamento da hiperpigmentação facial.

[0049] O composto da Fórmula I pode ser utilizado conforme combinado com um ácido ou base farmaceuticamente aceitável, incluindo, entre outros, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ácido clorídrico, ácido metanossulfônico, ácido cítrico, ácido trifluoroacético e assim por diante.

[0050] O derivado de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo pode ser administrado a um indivíduo em combinação com um adjuvante farmaceuticamente aceitável, incluindo, entre outros, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido tartárico, ácido esteárico, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etanol, isopropanol, bicarbonato de sódio, água destilada, conservante(s) e assim por diante.

[0051] O composto, de acordo com a presente invenção, pode ser administrado topicamente a um indivíduo em uma concentração terapêutica ou biologicamente eficaz, variando de 1 aM a mais que l nM, o que variaria dependendo do cronograma de dosagem, condições ou situações do indivíduo, e assim por diante.

[0052] É preferido um derivado de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 10 e 21; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' —> 3') UGUACAGAUVUGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mRNA da TYR humana, ou parcialmente complementar ao pré-mRNA da TYR humana com uma ou duas incompatibilidade(s) de todo o composto da Fórmula TI; por Si, Sa, ***r, Snir Snf Ti, Ta, ***, Tn1i E Tn reprsentarem independentemente um radical hidreto ou deuterido; por X e Y representarem independentemente um deuterido, hidreto, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída, arilóxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, um radical alquilfosfonila substituído ou não substituído ou um radical arilfosfonila substituído ou não substituído; por Z representar um hidreto, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído ou radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 e Bi serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, B2, ***, Bn1 e Br serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV:

R N-Ro NH, o

PÁ N

L NA SN NH Í < 1 CAL

NH NOS NÊ NOSNÊ / NON UNH 8 N NH R Pr 1 o 1 N l Lo, -Ra La -R6 Ws N À NnSO R3 R5 ]

TT | Fórmula ll Fórmula Il Fórmula IV em que, Ri, Ro, Ri, Ri, R5 e Rs; são independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; Li, L2 e L; são ligantes covalentes representados pela Fórmula V que liga covalentemente o grupo amino básico à fração da nucleobase: o ATUA, O Fx. AT [e An É Fórmula V em que, Q1 e Qm são radicais metileno (-CH;-) substituídos ou não substituídos e Qr é diretamente ligado ao grupo amino básico; Q2, Q3, *** e Qr1i são independentemente selecionados de metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-) enxofre (-S-) e um radical amino substituído ou não substituído [-N(H)- ou -N(substituinte)-]; e, m é um número inteiro entre 1 e 15.

[0053] É de interesse um oligômero de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 11 e 18; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência do pré- mMRNA de l4á-mer de [(5'" — 3') UGUACAGAUUGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana; por S1, Sa, ***, Snir Sn, Ti, Ta, ***, Tn1, E Tn serem radicais hidreto; por X e Y representarem independentemente hidreto, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída ou um radical arilóxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn-1 e Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, Ba, ***, Bn1 e Br serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ra, Ri, Ra, Rs e Ró serem independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; por Q: e Om serem radicais metileno substituídos ou não substituídos e por Qm ser diretamente ligado ao grupo do amino básico; por Q:, Q3, *** E Qr1 serem independentemente selecionados de radicais metileno, oxigênio e amino substituídos ou não substituídos; e por m ser um número inteiro entre 1 e 11.

[0054] É de particular interesse um derivado de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência do pré- mMRNA de l4á-mer de [(5'" — 3') UGUACAGAUUGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana; por Si, Sa, ***, Sn1ir Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn serem radicais hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de hidreto alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 E Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro Bi, Ba, ***, Bn-1 Ee B, serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ra, Ra, Ra, R5 e Rk; são independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; por Q: e Qr serem radicais metileno e Qm ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q:, Q3, *** E Qr1 serem independentemente selecionados de metileno, oxigênio e um radical amino; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

[0055] É de alto interesse um oligômero de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência do pré- mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana; por Si, Sa, ***, Snif Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn serem radicais hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de um hidreto, uma alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído;

por Bi, Ba, ***, Bn1 E Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, B2, **, Bn1 e Br serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, R; e R5s serem radicais hidreto e por Ra, Ra, e Rs representarem independentemente hidreto ou um radical alquila substituído ou não substituído; por Q1: e Qm serem radicais metileno e Qm ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q:x, Q3, *** E Qr1 serem independentemente selecionados de metileno, um radical oxigênio; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

[0056] É de maior interesse um derivado de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência do pré- mMRNA de l4á-mer de [(5'" — 3') UGUACAGAUUGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana; por Si, Sa, ***, Sn1i, Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn serem radicais hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de um hidreto, uma alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn-1 e Bh serem independentemente selecionados de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais; por, pelo menos, cinco dentre Bi, Ba, ***, Bn1i e Bn serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Re , Ra, R41, Rs € Rs serem radicais hidreto; por Q: e Qr serem radicais metileno e Qm ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q:, Q3, *** E Qr1 serem independentemente selecionados de metileno e um radical oxigênio; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

[0057] É de mais alto interesse um derivado de PNA da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado, por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência do pré- mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da TYR humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da TYR humana; por Si, Sa, ***, Snif Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn serem radicais hidreto; por X ser um radical hidreto; por Y representar alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn-1 e Bh serem independentemente selecionados de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais; Por, pelo menos, cinco dentre Bi, Ba, ***, Bn1i e Bn serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ra, Ri, Ra, Rs € Ré serem radicais hidreto; por Li representar —-(CH2)2-O-(CH2).-, -CH2-O-(CH2).-, -CH3;-O- (CH2)3-, —“—CH27-O-(CH2)a- Ou —-CH;-O-(CHr))s- com a extremidade direita sendo diretamente ligada ao grupo amino básico; e por L; e L; serem independentemente selecionados de -(CH7;);-O- (CH2) 27, —-(CH2)3-O- (CH2)2-, —-(CH2)2-O- (CH2)3-, —-(CH2)2-, —-(CH2)3-, —(CH2)a-, ——-(CHo)s-, —-(CHa)s-, -—(CH));y e -(CH));s- com a extremidade direita sendo diretamente ligada ao grupo amino básico.

[0058] É de interesse específico um derivado de PNA da Fórmula I, o qual é selecionado do grupo de compostos fornecido abaixo ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: (NC) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(S5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH>;; (NC) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NH>2; (NC) Benzoíl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH>;; (NC) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-NH>; (NC) Metil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) n-Propil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(S5)-NHo; (NC) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH>; (N —> C) p-Toluenossulfonil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T- A(5) -NHo;

(N—>C) H-Lis-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-Lis-Gli-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-NH>; (NC) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-Lys-NH>; (NC) Fetoc-Val-Gli-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-NH>; (NC) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (N—>C) Benzil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-NH>; (NC) Fenil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (N — Cc) [N- (2-Feniletil) amino] carbonil-CA(5)G-ACA(5S)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH>; (NC) Benzoíl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH>; (N>C) Piv-Lis-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-Val-NH>; (NC) Fetoc-CA(7)G-AC(202) A-A(4) TC (102) -TG (6) T-A-NH>;; (NC) Fetoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(102)-TG(5)T-A(5)-NH3; (NC) Fetoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-TCA(3)-GAC(105)-A(5)AT-C(102) TG(5) -TA(5) -NHa; (NC) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5) C-NH>2; (NC) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(102) T-G(6) TA(5) -C-NH;; (NC) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(102) T-G(6) TA(5) -CA (202) A-NH2; (N 2 OC) Fetoc-AC(102) A-GA (6) C-AA (6) T-CTG (6) -TA(6) C(102)- AA (6) -NH>2; (NC) Fetoc-AC(103)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(105)-A(4)A- NH2; (NC) Fetoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(102)-AA(6)-NH; (N—>C) Fetoc-AC(102)A-GA(6)C-AA(6) T-CTG(6) -TA(6) C-A(5) AA (202) -A-NH>;; (NC) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(202) -A-NH>; (NC) Fetoc-AC (102) A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(203) -A-NH>; (NC) Fetoc-GC(104)T-AC(102) A-GA (4) C-AAT-CTG (6) -TA(6) C-NH>;

(NC) Fetoc-GC(102)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(102) TG-NH; (NC) Fetoc-GC(102)T-A(3)CA-G(202) AC-A(5) AT-C (102) TG-NH3; e (NC) Fetoc-GC(102)T-A(3)CA-GA(4)C-A(202) AT-C (102) TG-NH2: caracterizado, por A, G, T e C serem monômeros do PNA com uma nucleobase natural de adenina, quanina, timina e citosina, respectivamente; por C(pOgq), A(p), A(pOq), G(p) e G(pOq) serem monômeros de PNA com uma nucleobase não natural representada pela Fórmula VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX e Fórmula X, respectivamente; P (CHI) NH?

CH NA NH> NH? NÃo não N ANAC N ne CH sto ho H e H Fórmula VI Fórmula VII Fórmula VIII o o NÃ PA . EA O (CH N nº nº (CH2) N nº nº (Ha) a H % H Fórmula IX Fórmula X em que, peqsão números inteiros; e as abreviações para os substituintes N-terminais e C- terminais são conforme especificamente descritos a seguir: “Fmoc-"” é a abreviação para “[(9- fluorenil)metilóxi]carbonil-"; “Fetoc-” para “[2-(9-

fluorenil)etil-l-óxilcarbonil”; “AC” para “acetil-”; “Benzoil-” para “benzenocabonil-”; “Piv-” para “pivalil-”; “Metil-” para “metil-”; “n-Propil-” para “l- (n-propil)-”"; “H-” para o grupo “hidreto-”; “p-Toluenossulfonil” para “(4- metilbenzeno)-l-sulfonil-"; “Lis” para o resíduo de aminoácido “lisina”; “-Val-” para o resíduo de aminoácido “valina”; “-Leu-” para o resíduo de aminoácido “leucina”; “- Arg-" para o resíduo de aminoácido “arginina”; “-Gli-” para o resíduo de aminoácido “glicina”; “[N-(2- feniletil)amino]carbonil-” para “[N-1- (2- feniletil)amino]carbonil-"; “Benzil-” para “l-(fenil)metil-”"; “Fenil” para “fenil”"; “Me” para “metil”; e “-NH2” para o grupo “-amino” não substituído.

[0059] A Figura 3 fornece, coletivamente e sem ambiguidade, as estruturas químicas para os monômeros de PNA abreviados como A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) e G(pOqg). Conforme discutido na técnica prévia [PCT/KR2009/001256], C(pOgq) é considerado um monômero de PNA de “citosina modificada” devido à sua hibridação com “guanina”. A(p) e A(pOoq) são tomados como monômeros de PNA de “adenina modificada” por sua hibridação com “timina”. Da mesma forma, G(p) e G(pOq) são considerados monômeros de PNA de “guanina modificada” por seu pareamento de base com “citosina”.

[0060] A Figura 4 inequivocamente ilustra as estruturas químicas para uma variedade de abreviações de substituintes utilizados para diversificar o N-terminal ou o C-terminal do derivado de PNA da Fórmula I na presente invenção.

[0061] A fim de ilustrar as abreviações empregadas para esses derivados de PNA, a estrutura química de um derivado de PNA com l3-mer abreviada como “(N—>C) Fetoc- CA (5) G-ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH/” é fornecida na Figura 5a. Como outra ilustração, a estrutura química de um derivado de PNA com 15-mer abreviado como “(N—>C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A- TC (102) T-G (302) TA (5) -CA (202) A-NH7" é fornecido na Figura 5b.

[0062] A sequência de PNA com 13-mer de “(N—C) Fetoc- CA (5) G-ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH7” especificada na Figura 5a é equivalente à sequência de DNA de “(5 — 3") CAG-ACA- ATC-TGT-A” para ligação complementar ao pré-mRNA. O PNA de l13-mer tem uma sobreposição complementar de 1l3-mer com a sequência de 13-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5" — 3") ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2” no pré-mRNA da TYR humana.

[0063] A sequência de PNA de l15-mer de “(N—C) Fetoc- AG (6) A-CA (5) A-TC (102) T-G (302) TA (5) -CA (202) A-NH2”" especificada na Figura 5b é equivalente à sequência de DNA de “(5'" —> 3") AGA-CAA-TCT-GTA-CAA” para ligação complementar ao pré-mRNA. O PNA de l5-mer possui uma sobreposição complementar de 15- mer com a sequência de 1l5-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5' —> 3") ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana.

[0064] Una sequência de PNA de l7-mer de “(N—>C) Fetoc-AC(103) T-GA(6)C-TA(6) T-CTG (6) -TAC (105) -A (4) A-NH2J” é equivalente à sequência de DNA de “(5 — 3') ACT-GAC-TAT- CTG-TAC-AA"” para ligação complementar ao pré-mRNA. O PNA de l17-mer possui uma sobreposição complementar de l5-mer com a sequência de 15-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5" — 3")

ggguguuuuguacag | AU”"U"GUC”"U”"GUAGCCGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana. As duas incompatibilidades foram marcadas com um sinal de aspas, ou seja, “ “.

[0065] Um aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratamento de doenças ou condições que envolvam a expressão do gene da tirosinase humana, compreendendo o derivado de ácido peptonucleico, de acordo com a presente invenção.

[0066] Um aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratamento de hiperpigmentação, compreendendo o derivado de ácido peptonucleico, de acordo com a presente invenção. Exemplos de hiperpigmentação causada pela superprodução de melanina incluem melasma, cicatrizes de acne, manchas no fígado, sardas, manchas na idade e danos actínicos.

[0067] Um aspecto da presente invenção fornece um método para tratamento de doenças ou condições envolvendo a expressão do gene da tirosinase humana, compreendendo a administração do derivado de ácido peptonucleico, de acordo com a presente invenção. A via da administração pode ser, por exemplo, uma administração tópica.

[0068] Un aspecto da presente invenção fornece um método para tratamento da hiperpigmentação, compreendendo a administração do derivado de ácido peptonucleico de acordo com a presente invenção. A via da administração pode ser, por exemplo, uma administração tópica.

[0069] Um aspecto da presente invenção fornece um uso do derivado de ácido peptonucleico, de acordo com a presente invenção, na preparação de um medicamento para tratamento de doenças ou condições que envolvam a expressão do gene da tirosinase humana.

[0070] Um aspecto da presente invenção fornece um uso do derivado de ácido peptonucleico, de acordo com a presente invenção, na preparação de um medicamento para tratamento de hiperpigmentação.

BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS

[0071] Figuras la-lc. Exemplos de nucleobases naturais ou não naturais (modificadas) selecionáveis para o derivado de ácido peptonucleico da Fórmula IL.

[0072] Figuras 2a-2e. Exemplos de substituintes selecionáveis para o derivado de ácido peptonucleico da Fórmula [I.

[0073] Figura 3. Estruturas químicas de monômeros de PNA com nucleobase natural ou modificada.

[0074] Figura 4. Estruturas químicas para abreviações de substituintes do N-terminal ou C-terminal.

[0075] Figura 5a. Estrutura química do derivado de PNA de l13-mer “(N—>C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)- NH”.

[0076] Figura 5b. Estrutura química do derivado de PNA de l5-mer “(N—C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(102)T-G(302)TA(5)- CA (202) A-NH2”.

[0077] Figura 6. Estruturas químicas de monômeros de Fmoc-PNA usada para sintetizar os derivados de PNA da presente invenção.

[0078] Figuras 7a-7b. Cromatogramas de HPLC em fase reversa Cig de “ASO 1” antes e após a purificação por HPLC, respectivamente.

[0079] Figura 8. Espectro de massa ESI-TOF de “ASO 1”

purificado por HPLC preparativa em C1is;-RP.

[0080] Figura 9a. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhados em células de melanoma de camundongo B16F10, tratadas com O (controle negativo), 1, 10 ou 1.000 aM “ASO 1M”.

[0081] Figura 9b. Dados de sequenciamento de Sanger para o produto de PCR atribuíveis à omissão de éxons (2 a 3).

[0082] Figura l10a. Alterações no nível de mRNA da TYR de comprimento total por qPCR nas células de melanoma de camundongo B16Fl0 tratadas com “ASO 1M” em O (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 aM (barra de erro por erro padrão).

[0083] Figura 10b. Dados de western blot da TYR em células de melanoma de camundongo B16F10 tratadas por 24 horas com “ASO IM” a O zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou 10 aM (ou seja, 10.000 zM).

[0084] Figura 11. Alterações no teor de melanina nas células de melanoma de camundongo B16F10 tratadas com “ASO 1M” a 1, 10, 100 ou 1.000 aM ou com 10 ug/mL ou 100 pg/ml de arbutina (barra de erro por erro padrão).

[0085] Figura 12. Alterações no nível de mRNA da TYR de comprimento total por qPCR em melanócitos epiteliais primários humanos tratados com “ASO 1” a O zM (controle negativo), l1 zM, 100 zZM ou 10 aM (barra de erro por erro padrão).

[0086] Figura 13. Polimerização do aminoácido tirosina em eumelanina e formação da feomelanina.

[0087] Figura 14. Resumo esquemático das reações envolvendo TYR (tirosinase), TYRP-l1 (proteína 1 relacionada à tirosinase, ou seja, DHICA oxidase) e TYRP-2 (proteína 2 relacionada à tirosinase, ou seja, DOPAcromo tautomerase) durante a biossíntese de eumelanina e feomelanina. [Int. O. Mol. Sci. Vol. 10, 4066-4087 (2009)].

[0088] Figura 15. Representação esquemática da estrutura de Pré-mRNA.

[0089] Figura 16. Resumo esquemático do Pré-mRNA processado em mRNA após exclusão dos íÍntrons por uma série de reações complexas coletivamente denominadas de “splice”.

[0090] Figura 17. Ilustração dos locais de splice 3' e 5".

[0091] Figura 18. Ilustração esquemática de um ciclo típico de alongamento do monômero adotado na SPPS deste estudo, com os detalhes sintéticos.

MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO PROCEDIMENTOS GERAIS PARA PREPARAÇÃO DE OLIGÔMEROS DO PNA

[0092] Os oligômeros do PNA foram sintetizados por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS | solid phase peptide synthesis) com base na química de Fmoc, de acordo com o método divulgado na técnica prévia [US 6.133.444; WO96/40685] com modificações menores, mas devidas. O suporte sólido empregado —“neste estudo foi o H-Rink Amide-ChemMatrix adquirido da PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canadá). Os monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada foram sintetizados conforme descrito na técnica prévia [PCT/KR 2009/001256] ou com pequenas modificações. Tais monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada e monômeros de Fmoc- PNA com uma nucleobase de ocorrência natural foram usados para sintetizar os derivados de PNA da presente invenção. Os oligômeros de PNA foram purificados por HPLC em fase reversa Cig (água/acetonitrila ou água/metanol com TFA a 0,1%) e caracterizados por espectrometria de massa incluindo ESI/TOF/MS.

[0093] O Esquema 2 ilustra um ciclo típico de alongamento de monômero adotado na SPPS deste estudo, e os detalhes sintéticos são fornecidos, conforme FIG. 18. Para um especialista na técnica, no entanto, existem muitas variações menores, obviamente possíveis, na execução eficaz dessas reações da SPPS em um sintetizador de peptídeo automático ou um sintetizador de peptídeo manual. Cada etapa da reação no Esquema 2 é fornecida brevemente da seguinte maneira.

[0094] [Ativação da resina H-Rink-ChemMatrix]. 0,01 mmol (cerca de 20 mg de resina) da resina ChemMatrix em 1,5 mL de piperidina a 20%/DMF foi agitado em vórtice em um tubo de libra por 20 minutos e a solução DeFmoc foi filtrada. A resina foi lavada por 30 segundos, cada uma em série com 1,5 mL de cloreto de metileno (MC | methylene chloride), 1,5 mL de dimetilformamida (DMF | dimethylformamide), 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC. As aminas livres resultantes no suporte sólido foram sujeitas à associação com um monômero de Fmoc-PNA ou com um derivado de aminoácido protegido por Fmoc.

[0095] [DeFmoc]. A resina foi agitada em vórtice em 1,5 mL de piperidina/DMF a 20% por 7 min e a solução DeFmoc foi filtrada. A resina foi lavada por 30 segundos cada uma em série com 1,5 mL MC, 1,5 mL DMF, 1,5 mL MC, 1,5 mL DMF e 1,5 mL MC. As aminas livres resultantes no suporte sólido foram imediatamente submetidas à associação com um monômero de Fmoc- PNA.

[0096] [Associação com Monômero de Fmoc-PNA]J. As aminas livres no suporte sólido foram associadas a um monômero de Fmoc-PNA, conforme segue. 0,04 mmols do monômero de PNA,

0,05 mmols de HBTU e 10 mmols de DIEA foram incubados por 2 min em 1 mL de DMF anidro e adicionados à resina com aminas livres. A solução de resina foi agitada em vórtice durante 1 hora e o meio de reação foi removido por filtração. Em seguida, a resina foi lavada por 30 segundos, cada uma em série com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC. As estruturas químicas dos monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada utilizada na presente invenção são fornecidas na Figura 6. Os monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada que são fornecidos na Figura 6 devem ser tomados como exemplos e, portanto, não devem ser tomados como limitações ao escopo da presente invenção. Um especialista na técnica pode facilmente descobrir uma série de variações nos monômeros de EFmoc-PNA para sintetizar o derivado de PNA da Fórmula [I.

[0097] [Capeamento]. Após a reação de associação, as aminas livres que não reagiram sofreram capeamento por agitação por 5 min em 1,5 mL de solução de capeamento (5% de anidrido acético e 6% de 2,6-leutidina em DMF). Em seguida a solução de capeamento foi filtrada e lavada por 30 segundos, cada uma em série com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC.

[0098] [Introdução do Radical “Fetoc-” no N-terminal]. O radical “Fetoc-"” foi introduzido no N-terminal ao reagir a amina livre na resina com “Fetoc-OSu” sob condições básicas de associação. A estrutura química de “Fetoc-OSu” [Nº CAS 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] é fornecida, conforme abaixo:

o O Fethoc-OSu K O e ON

O O O

[0099] [Clivagem a partir da Resina]. Os oligômeros de PNA ligados à resina foram clivados a partir da resina por agitação por 3 horas em 1,5 mL de solução de clivagem (2,5% de tri-isopropilsilano e 2,5% de água em ácido trifluoroacético). A resina foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi triturado com éter dietílico e o precipitado resultante foi coletado por filtração para purificação por HPLC de fase reversa.

[0100] [Análise e Purificação por HPLC]. Após uma clivagem a partir da resina, o produto bruto de um derivado de PNA foi purificado por HPLC em fase reversa Cig, eluindo água/acetonitrila ou água/metanol (método gradiente) contendo 0,1% de TFA. As Figuras 7a e 7b são exemplos de cromatogramas por HPLC para “ASO 1” antes e após a purificação por HPLC, respectivamente. A sequência de oligômeros de “ASO 1" é conforme fornecida na Tabela 1.

EXEMPLOS SINTÉTICOS PARA DERIVADO DE PNA DA FÓRMULA I

[0101] Para direcionar complementarmente o local de splice 3" do “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana, os derivados de PNA da presente invenção foram preparados, de acordo com os procedimentos sintéticos fornecidos acima, ou com pequenas modificações. O fornecimento de tais derivados de PNA visando o pré-mRNA da TYR humana deve exemplificar os derivados de PNA da Fórmula I, não devendo ser interpretado como uma limitação ao escopo da presente invenção. TABELA 1. Derivados de PNA que visam complementarmente o local de splice 3' do “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana, juntamente com os dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. EEE Sn *?) massa exata teórica; ” massa exata observada.

[0102] A Tabela 1 fornece derivados de PNA que visam complementarmente o local de splice 3" do “éxon 2" no pré- mMRNA da TYR humana lido a partir do gene da TYR humana [Sequência de Referência NCBI: NG 0008748], juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs da TYR na Tabela 1 deve exemplificar os derivados de PNA da Fórmula I, e não deve ser interpretado como uma limitação ao escopo da presente invenção.

[0103] O “ASO 1” possui uma sobreposição complementar de l3-mer com a sequência de l3-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5' —> 3") ggguguuuuguacag | AUUGU-CUGUAGCCGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2” no pré-mRNA da TYR humana. Assim, “ASO 1” possui uma sobreposição de 5-mer com o “íntron 1” e uma sobreposição de 8-mer com o “éxon 2” dentro do pré-mRNA da TYR humana.

[0104] A Tabela 2 fornece o “ASO 1M” que visa complementarmente o local de splice 3" do “éxon 2" no pré- mRNA da TYR do camundongo, lido no DNA genômico do camundongo [acessado a partir da Sequência de Referência NCBI: NC 000073], juntamente com os dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. A provisão de “ASO IM” visa avaliar a atividade antissentido em células de origem do camundongo. TABELA 2. Derivados de PNA que visam complementarmente o local de splice 3" do “éxon 2” no pré-mRNA da TYR do camundongo, juntamente com os dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.

*?) massa exata teórica; ” massa exata observada.

[0105] Uma sequência de RNA de 30-mer de [(5'" —> 3") aauuguuuuucacag | AUCAUVUGUAGCAGA], abrangendo a junção do íntron 1 e do éxon 2 no pré-mRNA da TYR de um camundongo, foi lida a partir do gene da TYR de um camundongo [Número de Acesso ao Gene NCBI: NC 000073].

[0106] O “ASO 1M” é equivalente à sequência de DNA de “(5'" —> 3") CAA-ATG-ATC-TGT-G"”" para ligação complementar ao Ppré-mRNA. O “ASO 1M” possui uma sobreposição complementar de l13-mer com a sequência de l3-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5' —> 3") aauuguuuuucacag | AUCAUUVUGUAGCAGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR de um camundongo.

[0107] Assim como o “ASO 1” contra o pré-mRNA da TYR humana, o “ASO IM” possui uma sobreposição de 5-mer com o “íntron 1” e uma sobreposição de 8-mer com o “éxon 2” dentro do pré-mRNA da TYR de um camundongo. O “ASO 1M” pode servir como um bom composto substituto para a atividade antissentido de “ASO 1” em células de origem humana.

[0108] A Figura 7a é um cromatograma de HPLC obtido com um produto bruto de “ASO 1". O produto bruto foi purificado por HPLC preparativa em Cig-RP. A Figura 7b é um cromatograma de HPLC para um produto purificado do “ASO 1”. A pureza do “ASO 1” melhorou acentuadamente após a purificação por HPLC preparativa. A Figura 8 fornece um espectro de massa ESI-TOF obtido com o produto purificado do “ASO 1”. O fornecimento dos dados de análise para o “ASO 1” deve ilustrar como os derivados de PNA da Fórmula I foram purificados e identificados na presente invenção, e não devem ser interpretados como uma limitação ao escopo da presente invenção.

AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE DERIVADOS MODELO DE PNA PARA DNA COMPLEMENTAR.

[0109] Os derivados de PNA nas Tabelas 1 e 2 foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação a DNAs de l10-mer que visam complementarmente o N-terminal ou o C-terminal. A afinidade de ligação foi avaliada pelo valor de Tm para o duplex entre PNA e DNA complementar de l0-mer. O duplex entre derivados de PNA e DNAs totalmente complementares mostra valores de Tr muito altos para serem determinados com segurança em solução tampão aquosa, uma vez que a solução tampão tende a ferver durante a medição de Tn.

[0110] Os valores de Tm foram determinados em um espectrômetro UV/Vis da seguinte maneira. Uma solução mista de oligômero de PNA a 4 uM e DNA de l0-mer complementar a 4 uM em tampão aquoso de 4 mL (pH 7,16, fosfato de sódio 10 mM, NaCl 100 mM) em 15 mL de polipropileno em tubo tipo falcon foi incubada a 90ºC por um minuto e resfriada lentamente até a temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi transferida para uma cubeta de UV de quartzo de 3 mL equipada com uma tampa hermética e submetida a uma medição de Tr a 260 nm em um espectrofotômetro UV/Visível, conforme descrito na técnica prévia [PCT/KR2009/001256]. ou com pequenas modificações. Os DNAs complementares de l0-mer para medição de Tr foram adquiridos da Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, República da Coreia) e usados sem outras purificações.

[0111] Os valores de Tm observados dos derivados de PNA da Fórmula I são muito altos para uma ligação complementar ao DNA de l10-mer, e são fornecidos na Tabela 3. Por exemplo, “ASO 1” mostrou um valor de Tr de 78,0ºC para o duplex com o DNA complementar de l0-mer visando o N-terminal de l0-mer no PNA, conforme marcado em “negrito” e “sublinhado” em [(N —> C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102) -TG(6) T-A(5)-NH2]. Enquanto isso, “ASO 1” mostrou um Tr de 73,0ºC para o duplex com o DNA complementar de 10-mer, visando o C-terminal de 10-mer no PNA, conforme marcado em “negrito” e “sublinhado” em [(N—C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6) T-A(5)-NH2]. TABELA 3. Valores de Tr entre PNAs e o DNA complementar de l10-mer visando o N-terminal ou o C-terminal do PNA.

EXEMPLOS DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE DERIVADOS DE PNA DA FÓRMULA I

[0112] Os derivados de PNA na presente invenção foram avaliados quanto a atividades antissentido da TYR in vitro em células de melanoma de camundongo B1l6F10 e melanócitos humanos. Os exemplos biológicos foram fornecidos como exemplos para ilustrar os perfis biológicos dos derivados de PNA da Fórmula I e, portanto, não devem ser interpretados como uma limitação ao escopo da presente invenção. EXEMPLO 1. Omissão do Éxon Induzido por “ASO 1M”.

[0113] O “ASO 1M” especificado na Tabela 2 possui uma sobreposição complementar de 13-mer com a sequência de 13-mer marcada em “negrito” e “sublinhada” dentro da sequência de RNA de 30-mer de [(5" —> 3") aauuguuuuucacag | AUCAUUVUGUAGCAGA] , abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR de um camundongo. Enquanto isso, o “ASO IM” processa um 9-mer “complementar, juntamente com 4 incompatibilidades marcadas em “negrito” e “sublinhadas” na sequência de 30-mer do RNA de [(5'" —> 3') gaguguuuug”u"acag | AU”UG”U”"C"UGUAGCCGA], abrangendo a junção de “íntron 1” e “éxon 2" no pré-mRNA da TYR humana. As 4 incompatibilidades foram marcadas com sinal de aspas (“ “).

[0114] O “ASO IM” foi avaliado por sua capacidade de induzir a omissão do “éxon 2" da TYR nas células de melanoma de um camundongo B16F10, mesmo que o “ASO 1M” possua 4 incompatibilidades com o local de splice 3'” do “éxon 2” no pré-mRNA da TYR humana. O “ASO 1M”, que é totalmente complementar ao pré-mRNA da TYR do camundongo, pode servir como um bom composto substituto para o “ASO 1”, que é totalmente complementar ao pré-mRNA da TYR humana.

[0115] [Cultura Celular e Tratamento com ASO] . Células de melanoma de um camundongo B16F10 (Número de Cat. CRL-6475, ATCC) foram mantidas em DMEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de SFB, 1% de estreptomicina/penicilina e 0,01 mg/ml de insulina bovina. As células B1l6F10 cultivadas em uma placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de DMEM foram incubadas por 5 horas com “ASO 1M” a O (controle negativo), 1, 10.100 ou 1000 aM.

[0116] [Extração de RNA e Síntese de cDNA por PCR em Etapa Única]. Após uma incubação de 5 horas, o RNA total foi extraído usando o “Conjunto para Extração Universal de RNA”

(Número de Cat. 9767, Takara), de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de modelo de RNA foram utilizados para uma reação de transcrição reversa de 25 pl, utilizando o conjunto de RT-PCR Super-Scripte de Etapa Única com polimerase Platinumbd Tag (Número de Cat. 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon de [éxon 1 forward: (5' —> 3") GTAAGTTTGGATTTGGGG; e éxon 4 reverse: (57 — 3") AGAGC-GGTATGAAAGGAA], de acordo com as seguintes condições de ciclo: 50ºC por 30 minutos e 94ºC por 2 minutos, seguidos por 15 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos em 52ºC e 40 segundos a 72ºC.

[0117] [Amplificação por PCR Aninhada]. 1 pl de cDNA foi amplificado em uma PCR aninhada de 20 pl (Número de Cat. K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores de [éxon ln forward: (5º — 3') GAGAACTAACTGGGGATGA; e éxon 4n reverse: (5' — 3") CGATAGGTGCATTGGCTT], de acordo com as condições do ciclo especificadas da seguinte forma: 95ºC por 5 minutos seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 52ºC e 40 segundos a 72ºC.

[0118] [Identificação de Produtos para Omissão de Éxon]. Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2%. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger.

[0119] A Figura 9a fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR. As células sem tratamento por “ASO 1M” produziram duas bandas de PCR fortes, uma para o mRNA da TYR de comprimento total e a outra para o mRNA da TYR variante de splice sem os éxons 2 e 3. Assim, considera-se que ocorre a omissão espontânea dos éxons 2-3. As células tratadas com o “ASO 1M” de 1 a 1.000 aM, no entanto, produziram apenas o mMRNA da variante de splice da TYR sem os éxons 2 e 3. Assim, o “ASO 1M” aumenta a propensão dos éxons 2-3 se omitirem nas células de melanoma B1l6F10. O produto de PCR para omissão do éxon foi sequenciado para ser a omissão dos éxons 2-3 conforme mostrado na Figura 9b. EXEMPLO 2. qPCR para mRNA da TYR em células de melanoma de camundongo B16F10 tratadas com “ASO 1M”.

[0120] O “ASO IM” foi avaliado por qPCR aninhado por TYR quanto à sua capacidade de induzir alterações no nível de mMRNA da TYR de um camundongo em células Bl6Fl10, conforme descrito abaixo.

[0121] [Cultura Celular e Tratamento ASO]. As células B16F10 cultivadas em uma placa de cultura de 60 mm contendo mL de DMEM foram tratadas com “ASO 1M” a O (controle negativo), 1, 10.100 ou 1000 aM. (2 placas de cultura por dose)

[0122] [Extração de RNA e Síntese de cDNA por PCR em Etapa Única]. Após uma incubação com “ASO 1M” por 5 horas, o RNA total foi extraído das células usando o “Conjunto para Extração Universal do RNA” (Número de Cat. 9767, Takara), de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de RNA foram usados para uma reação de transcrição reversa de 25 pl usando o Conjunto RT-PCR de Etapa Única (Invitrogen, EUA) contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon [éxon 1 forward: (5'" — 3") GTAAGTTTGGATTTGGGG; e éxon 4 reverse: (5'" —> 3") AGAGCGGTATGAAAGGAA], de acordo com as seguintes condições de ciclo: 50ºC para 30 min e 94ºC para 2 min, seguido por 15 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 52ºC e 40 seg. a 72ºC.

[0123] [Amplificação Aninhada de aPCR]. As soluções de CDNA foram diluídas por 100 vezes e 1 pl de cada produto de

PCR diluído foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 ul com uma sonda Tagman ajustada na junção do éxon 2 e do éxon 3 (Número de Cat. MmO0495818 ml, Thermo Fisher Scientific) de acordo com as seguintes condições de ciclo: 95ºC por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 10 segundos a 95ºC e 30 segundos a 60ºC.

[0124] [Análise Estatística]. O experimento de qPCR aninhado foi repetido independentemente quatro vezes, e os níveis individuais de mRNA de cada experimento foram normalizados em relação ao nível de mRNA sem tratamento com “ASO IM”. Os níveis de mRNA obtidos de todas as quatro experiências separadas foram reunidos para análise estatística por teste t de Student. Assim, o número de amostras de RNA é 8 por concentração.

[0125] A Figura 10a fornece os dados de qPCR combinados, nos quais o nível de mRNA completo diminuiu significativamente em cerca de 40% nas células tratadas com “ASO 1M” de 1 a 1.000 aM.

EXEMPLO 3. Inibição da expressão da proteína TYR em células de melanoma Bl6F10 por “ASO 1M”.

[0126] O “ASO 1M” foi avaliado quanto à sua capacidade de regular negativamente a expressão da proteína TYR em células de melanoma de um camundongo Bl6F10, conforme descrito abaixo.

[0127] As células B16F10 cultivadas em uma placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de DMEM foram tratadas com “ASO IM” a O zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou aM. 24 horas depois, as células foram lavadas 2 vezes com PBS frio (solução salina tamponada com fosfato) e depois submetidas à lise com tampão de lise celular 1X a 200 ul

(Número de Cat. 9803, Cell Signaling Tech) suplementado com coquetel de inibidores de protease 1X (Número de Cat. P8340, Sigma). 200pl de cada lisado em tubo-e de 1,5 mL foram misturados com 100 pl de tampão de amostra 5X e fervidos a 100ºC por 5 min. 20 ul do lisado foi submetido à separação eletroforética em um gel de TGX com gradiente de 4 a 15% (Núnero de Cat. 456-1086, Bio-Rad), e transferência de proteína em uma membrana de PVDF a 0,45 /M. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-TYR (Número de Cat. 9319, Cell Signaling Tech) e anticorpo anti-B-actina (Número de Cat. a3845, Sigma).

[0128] A Figura 10b fornece os dados de western blot para a expressão da proteína TYR nas células B16F10. A intensidade da banda da expressão de TYR foi consideravelmente mais fraca nos lisados com tratamento “ASO 1M” do que nos lisados sem tratamento “ASO IM”, isto é, controle negativo. A proteína TYR e o nível de mRNA diminuíram comparativamente pelo tratamento com ASO. (vide “Exemplo 2”) EXEMPLO 4. Inibição da Melanogênese em Células de Melanoma B16F10 por “ASO IM”.

[0129] O “ASO 1M” foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a melanogênese nas células de melanoma de um camundongo B16F10, conforme descrito abaixo.

[0130] As células B1l6F10 subcultivadas em uma placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de DMEM foram tratadas sem nada (controle negativo), com “ASO 1M” de 1 a 1.000 aM ou com ou 100 pg/ml de arbutina como controle positivo (2 placas de cultura por dose). 24 horas depois, as células foram lavadas 2 vezes com PBS frio e submetidas à lise com 200 pl de 1N NaOH. Cada lisado foi coletado em tubo-e de 1,5 mL e mantido durante a noite à temperatura ambiente. O teor de melanina em cada lisado foi determinado por absorvência a 475 nm num leitor ELISA. A mesma experiência foi repetida quatro vezes usando células em passagens diferentes. Os quatro conjuntos de dados de teor de melanina foram agrupados para análise estatística pelo teste t de Student contra o teor de melanina sem tratamento (controle negativo).

[0131] A Figura 11 resume as alterações no teor de melanina nas células Bl6Fl10 após uma incubação de 24 horas com “ASO IM” ou com arbutina. O teor de melanina diminuiu significativamente em cerca de 15% a 25% nas células tratadas com 10 ug/mL e 100 pug/mL de arbutina, respectivamente. No caso das células tratadas com “ASO 1M”, o teor de melanina diminuiu significativamente em cerca de 15%, sem muita dependência da dose. A atividade inibitória de “ASO 1M” foi comparável à de ug/mL de arbutina.

EXEMPLO 5. Preparação de Creme Tópico Contendo o Composto da Fórmula [I.

[0132] Un composto da Fórmula I, por exemplo, o “ASO 2", foi formulado como um creme para aplicação tópica em indivíduos. O creme tópico foi preparado, conforme descrito abaixo. Dado que existem muitas variações possíveis de um creme tópico, esta preparação deve ser tomada como um exemplo e não deve ser interpretada como uma limitação ao escopo da presente invenção.

[0133] [Preparação da solução A]. Em um béquer, foram misturadas água deionizada (196 9g), EDTA dissódico (0,06 g), glicerina (15 gq), dipropilenoglicol (30 gq), fenoxietanol (0,9 g), etil-hexilglicerina (0,9 g), um copolímero de hidroxietilacrilato/copolímero de taurato de acriloildimetil sódico (2,4 g) e solução aquosa 1 nM de “ASO 2" (0,3 mL). A mistura foi submetida à homogeneização a 70 - 75ºC usando um misturador homo.

[0134] [Preparação da solução B]. Em outro béquer, foram misturados a 70 - 75ºC etilhexanoato de cetearila (12 g), dimeticona (6 g), ácido esteárico/óleo vegetal hidrogenado/álcool behenílico/álcool cetearílico (15 gg), manteiga de butyrospermum parkii (karité) (9 9) e distearato de poligliceril-3-metilglucose/estearato de gliceril SE/sesquistearato de metilglicose (6 g).

[0135] [Preparação do Creme Tópico]. A “Solução A” e a “Solução B” foram misturadas e sujeitas à homogeneização a

7.200 rpm a 70 - 75ºC por 3 min, utilizando um misturador homo. A mistura foi lentamente arrefecida à temperatura ambiente para fornecer um creme tópico contendo 1 pM de “ASO 2".

EXEMPLO 6. qPCR para o mMRNA de TYR em melanócitos humanos tratados com “ASO 1”.

[0136] O “ASO 1” especificado na Tabela 1 é um ASO da TYR de l13-mer totalmente complementar ao local de splice 3" que abrange a junção do íntron 1 e do éxon 2 na TYR humana, conforme marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré- mMRNA da TYR humana de 30-mer de [(5" = 3") ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA] .

[0137] O “ASO 1” foi avaliado por qPCR aninhado da TYR quanto à sua capacidade de induzir alterações no nível do mRNA da TYR em melanócitos epidérmicos primários humanos, conforme mostrado a seguir.

[0138] [Cultura Celular e Tratamento com ASO]. As células de melanócitos epidérmicos primários (Número de Cat.

PCS-200-013, ATCC) foram mantidas em meio basal de células dérmicas (Número de Cat. PCS-200-030, ATCC) suplementado com Componente de Conjunto de Cultivo de Melanócitos Adultos (Número de Cat. PCS-200-042, ATCC). Os melanócitos cultivados em uma placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratados com “ASO 1” a O zM (controle negativo), 1 zM, 100 zZM ou 10 aM (3 placas de cultura por concentração).

[0139] [Extração de RNA e Síntese de cDNA por PCR em Etapa Única]. Após uma incubação com “ASO 1” por 5 horas, o RNA total foi extraído usando o “Mini Conjunto RNeasy” (Número de Cat. 74106, Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 ul usando o Conjunto de RT-PCR Super Scripte de Etapa Única com polimerase PlatinumO Taq (Número de Cat. 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxons de [éxon 1 forward(2): (5' — 3") CTCTTTGTCTGGATGCATT; e éxon 5 reverse: (5º — 3") CTGTGGTAATCCTCTITCT], de acordo com as seguintes condições de ciclo especificadas: 50ºC para 30 min e 94ºC para 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 50ºC elmina 72ºC.

[0140] [Amplificação por PCR Aninhado]. 1 ul de cDNA foi, ainda, amplificado em uma reação de PCR aninhada em 20 ul (Número de Cat. K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon [éxon 2n forward: (5' — 3") GATAAAGCTGCCAATTTC; e éxon 3n reverse: (5" > 3" TTGTGCATGCTGCTTTGA] contra uma sonda Taqgman [(5" — 3') 5,67 FAM-CACTGG-ZEN- AAGGATTTGCTAGICCAC-3IABKFOQ]. Condições de Ciclo: 95ºC por 3 minutos, seguidos de 40 ciclos 10 seg. a 95ºC e 30 seg. a 60ºC.

[0141] A Figura 12 fornece os dados de qPCR, nos quais o nível completo de mRNA da TYR diminuiu cerca de 30% nos melanócitos humanos tratados com o “ASO 1” de 1 zM a 10 aM.

As reduções observadas foram significativas (teste t de Student) nas células tratadas com “ASO 1” a lzMe 10 aM.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”, representado pela Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: B, B, Br B, o o x o 2. o 2 o PS sa Yes Tt Ss, Ta Sa Tm Ss. Th Fórmula | caracterizado por n ser um número inteiro entre 10 e 21; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVUGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré- mMRNA da tirosinase humana, ou parcialmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana com uma ou duas incompatibilidade(s) de todo o composto da Fórmula I; por Si, Sa, *“*, Sn-1,y Snr Ti, Ta, «*, Tn-1 e Tn representarem independentemente deuterido, hidreto, uma alquila substituída ou não substituída ou um radical arila substituído ou não substituído; por X e Y representarem independentemente deuterido, hidreto [H], formila [H-C(=O0)-], aminocarbonila [NH2-C (=0) -], aminotiocarbonila [NH2-C (=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída, arilóxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, um radical alquilfosfonila substituído ou não substituído ou um radical arilfosfonila substituído ou não substituído; por Z representar hidreto, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou um radical arila substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn-1 Ee Br serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; e por, pelo menos, quatro dentre Bi, B2, ***, Bn1 e Bn Serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à fração da nucleobase.

2. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO” de acordo com a reivindicação 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre e 21; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5" — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana, ou parcialmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana com uma ou duas incompatibilidade(s) de todo o composto da Fórmula I; por Si, S2a, ***, Snir Snf Ti, Toy, ***, Tn1 e Tn representarem —independentemente um radical hidreto ou deuterido; por X e Y representarem independentemente um deuterido, hidreto, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída, arilóxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, um radical alquilfosfonila substituído ou não substituído ou um radical arilfosfonila substituído ou não substituído; por Z representar um hidreto, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído ou radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Bo, ...., Bn-1 Ee B, serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, Ba, ***, Bn1 e Bi serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV:

R N-Ro NH? o

O EA Nº NON NH NONÔDNH * Ara ! L, R Í À | BP N 6 não R3 Rs

T Fórmula || Fórmula Ill Fórmula IV em que, Ri, Ri Ri, R, R; e Rs; são independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; Li, L7 e L; são ligantes covalentes representados pela Fórmula V que liga covalentemente o grupo amino básico à fração da nucleobase: “ ea Fórmula V em que, Q: e Or são radicais metileno (-CH;-) substituídos ou não substituídos e Qn é diretamente ligado ao grupo amino básico; Q2, Q3, *-*- e Qn1 são independentemente selecionados de metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-) e um radical amino substituído ou não substituído [-N(H)- ou -N(substituinte)-]; e m é um número inteiro entre 1 e 15.

3. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO", de acordo com a reivindicação 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre 11 e 18; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l10-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana; por Si, S2, ***, Sn-17 Sn, Ti, To, ***, Tn1 E Tn serem radicais hidreto; por X e Y representarem independentemente hidreto, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilóxicarbonila substituída ou não substituída ou um radical arilóxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn-1 e Bn serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, quanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, Ba, '"*, Bn1 e Br, serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Rir, Ra, Ria, Ra, Rs e Rs serem independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; por Q: e Qm serem radicais metileno substituídos ou não substituídos e por Qnm ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q2, Q3, *** e Qr1i serem independentemente selecionados de radicais metileno, oxigênio e amino substituídos ou não substituídos; e por m ser um número inteiro entre 1 e 11.

4, “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”, de acordo com a reivindicação 3 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l10-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana; por Si, S2, ***, Sn-11 Sn, Ti, To, ***, Tn1, E Tn serem um radical hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de um hidreto, uma alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por 2 representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 e Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, B2, ***, Bn1 e Bi serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ra, Ra, Ra, R5 e R; serem independentemente selecionados de um hidreto e um radical alquila substituído ou não substituído; por Q: e Qrm serem radicais metileno e Qr ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q;, Q3, *** e Qr1 serem independentemente selecionados de metileno, oxigênio e um radical amino; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

5. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”", de acordo com a reivindicação 4 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5" — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana; por Si, S2, ***, Sn-117 Sn, Ti, To, ***, Tn1, E Tn serem radicais hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de um hidreto, uma alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por 2 representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 e Bh serem independentemente selecionados de nucleobases naturais, incluindo adenina, timina, guanina, citosina, uracila e nucleobases não naturais; por, pelo menos, quatro dentre Bi, Ba, ***, Bn1 e Bi serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, R3, e Rs serem radicais hidreto e por R2, Ra, e Rs representarem independentemente hidreto ou um radical alquila substituído ou não substituído; por Q: e Om serem radicais metileno e Om ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q2, Q3, *** e Qr1 serem independentemente selecionados de metileno, um radical oxigênio; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

6. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”, de acordo com a reivindicação 5 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l0-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5' — 3") UGUACAGAUVUGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana; por Si, S2, ***, Sn-117 Sn, Ti, To, ***, Tn1, E Tn serem radicais hidreto; por X e Y serem independentemente selecionados de um hidreto, uma alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 e Bh serem independentemente selecionados de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais; por, pelo menos, cinco dentre Bi, Ba, ***, Bn-1 e Bn serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ro , Ra, R1, Rs e Rs serem radicais hidreto; por Q: e Qn serem radicais metileno e Qm ser diretamente ligado ao grupo amino básico; por Q2, Q3, .. .e Qm-1 serem independentemente selecionados de metileno e um radical oxigênio; e por m ser um número inteiro entre 1 e 9.

7. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO", de acordo com a reivindicação 6 ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: caracterizado por n ser um número inteiro entre 11 e 16; pelo composto da Fórmula I possuir, pelo menos, uma sobreposição complementar de l10-mer com a sequência pré-mRNA de l4-mer de [(5" — 3") UGUACAGAUVGUCU] no pré-mRNA da tirosinase humana; pelo composto da Fórmula I ser totalmente complementar ao pré-mRNA da tirosinase humana; por Si, Sa, ***, Sn-11r Snf Ti, Toy ***, Tn1i, E Tn serem radicais hidreto; por X ser um radical hidreto; por Y representar alquilacila substituída ou não substituída ou um radical alquiloxicarbonila substituído ou não substituído; por Z representar um radical amino substituído ou não substituído; por Bi, Ba, ***, Bn1 e Bh serem independentemente selecionados de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais; por, pelo menos, cinco dentre Bi, Ba, ***, Bn1 e Bn serem independentemente selecionados de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV; por Ri, Ra, R3, Ra, Rs Ee Rs serem radicais hidreto; por Li representar -(CH72)2-O- (CH2)2-, -CH2-O- (CH2)2-, -CH2-O-(CH2)37, - CH2-O- (CH2) ar ou -CH7-O- (CH2)s- com a extremidade direita sendo diretamente ligada ao grupo amino básico; e por Lz e L3 serem independentemente selecionados de -(CH2)2-O-(CH2)2-, —-(CH2)3- O- (CH2)2-, —-(CH2)2-O0-(CH2)3-, —-(CH2z)2-, —-(CH2)3;, -(CHo)an, -

(CH2)5-, -(CH2)6s-, -(CH2);- e -(CH27);s- com a extremidade direita sendo diretamente ligada ao grupo amino básico.

8. “DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado do grupo de derivados de ácido peptonucleico fornecido abaixo ou um sal farmaceuticamente aceitável respectivo: (N—>C) Fetoc- CA (5) G-ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A (5) -NH>; (N —> C) Fetoc- AC (1/2) A(5) -GA(5) C-AA (5) T-CTG (6) -C (1/2) C-NH>2; (N —> C) Ac- CA (5) G-ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A (5) -NH>; (N —> C) Benzoíl- CA(5) G-ACA(5) -ATC (102) -TG(6) T-A(5) -NHo; (NC) Piv-CA(5)G- ACA(5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NHo; (NC) Metil-CA(5)G-ACA(5)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH>;; (N —> C) n-Propil-CA(5)G-ACA(5)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH>2; (N —> OC) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)- ATC (102) -TG (6) T-A (5) -NH>; (N*C) p-Toluenossulfonil-CA(5)G- ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NHo; (N—>C) H-Lis-CA(5)G-ACA(S5)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NH>;; (N — C) Fetoc-Lis-Gli-CA(5)G- ACA (5) -ATC (102) - TG (6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -Lys-NH3y; (N — C) Fetoc-Val-Gli-CA(5)G- ACA (5) -ATC (102) - TG (6) T-A(5) -NH>2; (N —> C) Ac-Arg-CA(5)G- ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A (5) -NH3; (N —> C) Benzil-CA(5)G- ACA(5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NHo; (NC) Fenil-CA(5)G-ACA(5)- ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NHo; (N = Cc) [N- (2-7 Feniletil)amino]carbonil-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102) -TG(6) T-A(5)- NHo; (NC) Benzoíl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)- NHo; (NC) Piv-Lis-CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-Val- NH; (NC) Fetoc-CA(7)G-AC(202)A-A(4)TC(102)-TG(6) T-A-NH>; (NC) Fetoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH3; (N—C) Fetoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(102)-TG(5) T-A(5)-NH3; (NC) Fetoc- TA(5) G-ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A(5) -NHo; (NC) Fetoc-TCA(3)- GAC (105) -A(5) AT-C (102) TG(5) -TA(5) -NHo; (NC) Fetoc-CA(5)G-

ACA (5) -ATC (102) -TG (6) T-A (5) C-NH>z; (N —> C) Fetoc-AG(6)A- CA(5) A-TC (102) T-G(6) TA(5) -C-NHo; (NC) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A- TC (102) T-G(6) TA(5) -CA (202) A-NH7; (NC) Fetoc-AC(102) A-GA (6) C- AA (6) T-CTG (6) -TA (6) C (102) -AA (6) -NH>2; (N—>C) Fetoc-AC(103)T- GA (6) C-TA (6) T-CTG (6) - TAC (105) -A (4) A-NH>; (N —> C) Fetoc- GA (6) C-AA (6) T-CTG(6) -TA(6) C(102) -AA (6) -NH2; (N—>C) Fetoc- AC (102) A-GA (6) C-AA (6) T-CTG (6) -TA(6) C-A(5)AA(202) -A-NH>;; (N —C) Fetoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(202)-A-NHo; (N—C) Fetoc-AC (102) A-GA (6) C-AA (6) T-CTG (6) -TA(6) C-A(5) AA (203) -A- NH2; (N — C) Fetoc-GC (104) T-AC (102) A-GA (4) C-AAT-CTG(6)- TA (6) C-NH>2; (N —> OC) Fetoc-GC (102) T-A (3) CA-GA (4) C-AAT- C(102) TG-NHo; (NC) Fetoc-GC(102)T-A(3)CA-G(202)AC-A(5)AT- C(102) TG-NHa; e (NC) Fetoc-GC(102)T-A(3)CA-GA (4) C-A(202) AT- C(102) TG-NH;; em que, A, G, T e C são monômeros do PNA com uma nucleobase natural de adenina, guanina, timina e citosina respectivamente; C(pOq), A(p), A(pOgq), G(p) e G(pOga) são monômeros de PNA com uma nucleobase não natural representada pela Fórmula VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX e Fórmula X, respectivamente; PACHIGANH?

CH ' ha NH, NH? Ye SN NAN NH NAN 9 (CHah LA Ex da Ex ria NO NOS NNW 72 NoOSNôngiT 72 ha a H o H Fórmula VI Fórmula VII Fórmula VIII o o NWÃe ubn Aro N NA EH, NANA 7 CH) H a H Fórmula IX Fórmula X em que, p e q são números inteiros; e as abreviações para os substituintes do N-Terminal e do C-Terminal são conforme especificamente descritas a seguir: “Fmoc-” é a abreviação para “[(9- fluorenil)metilóxil]lcarbonil-”"; “Fetoc-” para “[2- (9-fluorenil)etil-l-óxilcarbonil”; “Ac-"” para “acetil-”; “Benzoíl-” para “benzenocabonil-”; “Piv-” para “pivalil-”; “Metil-” para “metil-”; “n-Propil-” para “l- (n-propil)-"; “H-” para grupo “hidreto-”; “p-Toluenossulfonil” para “(4- metilbenzeno)-l-sulfonil-"; “Lis” para o resíduo de aminoácido “lisina”; “-Val-” para o resíduo de aminoácido “valina”; “-Leu-” para o resíduo de aminoácido “leucina”; “- Arg-" para o resíduo de aminoácido “arginina”; “-Gli-” para o resíduo de aminoácido “glicina”; “[N-(2-Feniletil)amino] carbonil-”" para “[N-1-(2-feniletil)amino]carbonil-"; “Benzil-” para “l-(fenil)metil-”; “Fenil-” para “fenil-”; “Me-” para “metil-”; e “-NHY” para o grupo “-amino” não substituído.

9. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, para tratamento de doenças ou condições que envolvam a expressão do gene da tirosinase humana, caracterizada por ter o derivado de ácido peptonucleico definido na reivindicação 1.

10. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, para tratamento de hiperpigmentação, caracterizada por ter o derivado de ácido peptonucleico definido na reivindicação 1.

11. “MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS OU CONDIÇÕES

QUE ENVOLVAM A EXPRESSÃO DO GENE DA TIROSINASE HUMANA”, caracterizado por consistir da administração do derivado de ácido peptonucleico definido na reivindicação 1.

12. “MÉTODO PARA TRATAMENTO DA HIPERPIGMENTAÇÃO”, caracterizado por consistir da administração do derivado de ácido peptonucleico definido na reivindicação 1.

13. “USO DO DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”", definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparação de um medicamento para tratamento de doenças ou condições que envolvam a expressão do gene da tirosinase humana.

14. “USO DO DERIVADO DE ÁCIDO PEPTONUCLEICO”", definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparação de um medicamento para tratamento da hiperpigmentação.