ES2906396T3 - Oligonucleótidos antisentido de tirosinasa - Google Patents

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Abstract

Un derivado de ácido nucleico peptídico representado por la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** en donde, n es un número entero entre 10 y 21; el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de tirosinasa humana; el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana, o parcialmente complementario al pre-ARNm de TYR humana con uno o dos malapareamientos del compuesto completo de Fórmula I; S1, S2, ···, Sn-1, Sn, T1, T2,...,Tn-1 y Tn representan independientemente radical deuterido, hidrido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido; X e Y representan independientemente radical deuterido, hidrido [H], formilo [HC(=O)-], aminocarbonilo [NH2- C(=O)-], aminotiocarbonilo [NH2-C(=S)-], alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, alquilfosfonilo sustituido o no sustituido, o radical arilfosfonilo sustituido o no sustituido; Z representa radical hidrido, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido; B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y, por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales con un radical amino sustituido o no sustituido enlazado covalentemente a la fracción de nucleobase.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos antisentido de tirosinasa
Campo técnico
La presente invención se refiere a derivados de ácidos nucleicos peptídicos que se dirigen complementariamente al pre-ARNm de la tirosinasa humana para la mejora de la pigmentación de la piel mediada por tirosinasa.
Antecedentes de la técnica
La melanina se refiere colectivamente a pigmentos naturales y poliméricos oscuros producidos en los organismos vivos. Hay tres tipos de melanina, es decir, eumelanina, feomelanina y neuromelanina. La eumelanina y la feomelanina se sintetizan en la piel. Mientras que la neuromelanina es una melanina que se encuentra en el cerebro y sus funciones fisiológicas aún no se han dilucidado.
La melanina en la piel absorbe eficazmente la radiación UV (ultravioleta) y protege a los animales de la radiación UV (ultravioleta) de la luz solar natural. Por tanto, el bronceado es un proceso natural en el que los animales se protegen de la radiación ultravioleta de la luz solar.
Figure imgf000002_0001
Eumelanina Feom elanina
El aminoácido tirosina polimeriza a eumelanina después de una serie de reacciones complejas en presencia de tirosinasa. La eumelanina se refiere a polímeros de 5,6-dihidroxiindol (DHI) y ácido 5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico (DHICA). La feomelanina se forma cuando la tirosina es polimerizada por la tirosinasa en presencia de cisteína o glutatión.
El Esquema 1 resume las reacciones que implican a TYR (tirosinasa), TYRP-1 (proteína 1 relacionada con tirosinasa, es decir, DHICA oxidasa) y TYRP-2 (proteína 2 relacionada con tirosinasa, es decir, DOPAcromo tautomerasa) durante la biosíntesis de eumelanina y feomelanina. [Int. J. Mol. Sci. vol 10, 4066-4087 (2009)] Esquem a 1
Tirosina CistemilDOPA
Figure imgf000003_0002
Eumelanina
Dado que la tirosinasa (TYR) desempeña un papel central en la biosíntesis de la melanina en la piel, se han usado o desarrollado inhibidores de TYR como ingredientes cosméticos para reducir la pigmentación excesiva de la piel, es decir, la hiperpigmentación. Los inhibidores de TYR fueron revisados por sus efectos contra la melanogénesis en varios artículos. [Int. J. Cosmetic Sci. vol 33, 210-221 (2011); Int. J. Mol. Sci. vol 10, 2440-2475 (2009)]
Figure imgf000003_0001
La hidroquinona (1,4-dihidroxibenceno) se ha usado para tratar la hiperpigmentación tópicamente durante décadas. [JAMA vol 194(9), 965-967 (1965)] Se sabe que la hidroquinona inhibe la actividad de TYR uniéndose al sitio activo de la tirosinasa. En 2006, la fDa de los Estados Unidos revocó la aprobación anterior de todos los productos OTC (de venta libre) que contenían hidroquinona debido a problemas de seguridad, incluyendo carcinogenicidad potencial. La hidroquinona induce ROS (especies reactivas de oxígeno) que dañan los lípidos y las proteínas de la membrana, incluyendo la tirosinasa. El daño oxidativo de los lípidos de la membrana priva permanentemente a los melanocitos.
La arbutina (hidroquinona-O-p-D-glucopiranósido) es una hidroquinona glicosilada extraída de la planta de gayuba. La arbutina también se encuentra en las pieles de trigo y pera. Al igual que la hidroquinona, la arbutina inhibe la melanogénesis uniéndose competitivamente al sitio activo de TYR. [J. Pharmacol. Exp. Ther. vol 276(2), 765-769 (1996)] La arbutina es menos citotóxica para los melanocitos que la hidroquinona.
La desoxiarbutina es un derivado sintético de la arbutina y es comparable a la hidroquinona y la arbutina en la actividad inhibidora de TYR. La desoxiarbutina también es menos citotóxica para los melanocitos que la arbutina y la hidroquinona. [J. Dermatol. Sci. vol 55(3), 179-184 (2009)]. La desoxiarbutina mejoró significativamente la luminosidad de la piel en sujetos humanos tratados tópicamente durante 12 semanas. [Exp. Dermatol. vol 14(8), 601-608 (2005)]
El ácido kójico es un agente quelante producido durante la fermentación fúngica para fabricar salsa de soja y sake, es decir, vino de arroz japonés. El ácido kójico se ha usado para conservar o cambiar el color de alimentos y productos cosméticos. El ácido kójico se quela con los iones de cobre en el sitio activo de TYR para inhibir la melanogénesis. También suprime la tautomerización de DOPAcromo a ácido 5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico. [J. Pharm. Pharmacol. vol 46(12), 982-985 (1994)]. El ácido kójico se ha usado popularmente para tratar el melasma, aunque puede inducir dermatitis de contacto, sensibilización y eritema. [J. Drugs Dermatol. vol 6(1), 32-39 (2007)]
Aunque hay una variedad de inhibidores de TYR, sus valores de IC50 contra TYR son en la mayoría de los casos micromolares (|jM). [J. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol 32(1), 403-425 (2017)] Tales valores de IC50 se consideran bajos considerando sus tamaños moleculares y plantean la posibilidad de reactividad cruzada con otros objetivos moleculares. Como la pobre actividad inhibidora se traduce en una gran dosis transdérmica, la potencia inhibidora debe mejorarse notablemente para cumplir con la actividad transdérmica deseada contra la pigmentación de la piel y también la seguridad.
Pre-ARNm: La información genética se transporta en el ADN (ácido nucleico 2-desoxirribosa). El ADN se transcribe para producir pre-ARNm (ácido ribonucleico pre-mensajero) en el núcleo. El pre-ARNm de mamíferos consiste habitualmente de exones e intrones, y el exón y el intrón están interconectados entre sí como se muestra esquemáticamente a continuación. Los exones e intrones se numeran como se ejemplifica en el siguiente dibujo.
Representación esquem ática de la estructura de pre-ARNm
Intrón 1 Intrón 2 Intrón 3 Intrón (N-2) Intrón (N-1)
Figure imgf000004_0001
Exón (N-1)
Corte y empalme de pre-ARNm: el pre-ARNm se procesa en ARNm después del agotamiento de intrones mediante una serie de reacciones complejas denominadas colectivamente "corte y empalme" que se resume esquemáticamente en el diagrama siguiente. [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol.
6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]
Figure imgf000005_0001
El corte empalme se inicia formando el "complejo de empalmosoma E" (es decir, el complejo de empalmosoma temprano) entre el pre-ARNm y los factores adaptadores de corte y empalme. En el "complejo de empalmosoma E", U1 se une a la unión del exón N y el intrón N, y U2AF35 se une a la unión del intrón N y el exón (N+1). Por tanto, las uniones de exón/intrón o intrón/exón son críticas para la formación del complejo de empalmosoma temprano. El "complejo de empalmosoma E" evoluciona al "complejo de empalmosoma A" tras la formación de complejos adicional con U2. El "complejo de empalmosoma A" experimenta una serie de reacciones complejas para eliminar o cortar y empalmar el intrón para unirse a los exones colindantes.
Síntesis de proteínas ribosómicas: las proteínas están codificadas por ADN (ácido nucleico 2-desoxirribosa). En respuesta a la estimulación celular o espontáneamente, el ADN se transcribe para producir pre-ARNm (ácido ribonucleico pre-mensajero) en el núcleo. Los intrones del pre-ARNm se cortan y empalman enzimáticamente para producir ARNm (ácido ribonucleico mensajero), que luego se traslada al citoplasma. En el citoplasma, un complejo de maquinaria de traducción llamado ribosoma se une al ARNm y lleva a cabo la síntesis de proteínas mientras explora la información genética codificada a lo largo del ARNm. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)]
Oligonucleótido antisentido (ASO): un oligonucleótido que se une a un ácido nucleico que incluye ADN, ARNm y pre-ARNm de una manera específica de la secuencia (es decir, complementariamente) se denomina oligonucleótido antisentido (ASO).
Si un ASO se une firmemente con un ARNm en el citoplasma, por ejemplo, el ASO puede inhibir la síntesis de proteína ribosómica a lo largo del ARNm. El ASO necesita estar presente dentro del citoplasma para inhibir la síntesis de proteína ribosómica de su proteína objetivo.
Inhibición antisentido del corte y empalme: si un ASO se une firmemente a un pre-ARNm en el núcleo, el ASO puede inhibir o modular el corte y empalme del pre-ARNm en el ARNm. El ASO debe estar presente dentro del núcleo para inhibir o modular el corte y empalme de pre-ARNm en el ARNm. Tal inhibición antisentido del corte y empalme produce un ARNm o varios ARNm que carecen del exón objetivo del ASO. Tales ARNm se denominan "variantes de corte y empalme" y codifican proteínas más pequeñas que la proteína codificada por el ARNm de longitud completa.
En principio, el corte y empalme puede interrumpirse inhibiendo la formación del "complejo de empalmosoma E". Si un ASO se une firmemente a una unión de exón-intrón (5'^3'), es decir, "sitio de corte y empalme 5' ", el ASO bloquea la formación del complejo entre el pre-ARNm y el factor U1 y, por lo tanto, la formación del "complejo de empalmosoma E". De igual manera, el "complejo de empalmosoma E" no puede formarse si un ASO se une firmemente a una unión de (5 '^ ') intrón-exón, es decir, "sitio de corte y empalme 3'".
El sitio de corte y empalme 3' y el sitio de corte y empalme 5' se ilustran esquemáticamente en el dibujo proporcionado a continuación.
Figure imgf000006_0001
Sitio de corte y empalme 5’ Sitio de corte y empalme 3’
Oligonucleótidos no naturales: los oligonucleótidos de ADN o ARN son susceptibles de degradación por las nucleasas endógenas, lo que limita su utilidad terapéutica. Hasta la fecha, se han desarrollado y estudiado intensamente muchos tipos de oligonucleótidos no naturales (que no son de origen natural). [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)] Algunos de ellos muestran una estabilidad metabólica ampliada en comparación con el ADN y el ARN. A continuación se proporcionan las estructuras químicas de unos pocos oligonucleótidos no naturales representativos. Tales oligonucleótidos se unen de manera predecible a un ácido nucleico complementario como lo hace el ADN o el ARN.
Figure imgf000006_0002
B: nucleobase
Oligonucleótido de fosforotioato: El oligonucleótido de fosforotioato (PTO) es un análogo de ADN con uno de los átomos de oxígeno de fosfato de la estructura principal reemplazado con un átomo de azufre por monómero.
Un cambio estructural tan pequeño hizo que el PTO fuera comparativamente resistente a la degradación por nucleasas. [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)]
Como reflejo de la similitud estructural en la estructura principal del PTO y el ADN, ambos penetran mal la membrana celular en la mayoría de los tipos de células de mamíferos. Sin embargo, para algunos tipos de células que expresan abundantemente transportadores de ADN, el ADN y el PTO muestran una buena penetración celular. Se sabe que los PTO administrados sistémicamente se distribuyen fácilmente al hígado y al riñón. [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]
Para facilitar la penetración celular de los PTO in vitro, se ha puesto en práctica popularmente la lipofección. Sin embargo, la lipofección altera físicamente la membrana celular, provoca citotoxicidad y, por lo tanto, no sería ideal para uso terapéutico in vivo a largo plazo.
Durante los últimos 30 años, se han evaluado clínicamente los PTO y las variantes de PTO antisentido para tratar cánceres, trastornos inmunológicos, enfermedades metabólicas, etc. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)] Muchos de tales candidatos de fármacos antisentido no se han desarrollado con éxito en parte debido a la pobre penetración celular de los PTO. Para superar la mala penetración celular, el PTO debe administrarse en dosis altas para la actividad terapéutica. Sin embargo, se sabe que los PTO están asociados con una toxicidad limitante de la dosis, que incluye aumento del tiempo de coagulación, activación del complemento, nefropatía tubular, activación de las células de Kupffer y estimulación inmunitaria incluyendo la esplenomegalia, la hiperplasia linfoide y la infiltración de células mononucleares. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]
Se ha descubierto que muchos PTO antisentido muestran la actividad clínica debida para enfermedades con una contribución significativa del hígado o el riñón. El Mipomersen es un análogo de PTO que inhibe la síntesis de apoB-100, una proteína implicada en el transporte del colesterol LDL. El Mipomersen manifestó su actividad clínica debida en pacientes con aterosclerosis muy probablemente debido a su distribución preferencial en el hígado.
[Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)] El ISIS-113715 es un análogo antisentido de PTO que inhibe la síntesis de la proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), y se descubrió que muestra actividad terapéutica en pacientes con diabetes tipo II. [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)]
Ácido nucleico bloqueado: en el ácido nucleico bloqueado (LNA), el anillo de ribosa de la estructura principal del ARN está restringido estructuralmente para aumentar la afinidad de unión por el ARN o el ADN. Por tanto, el LNA puede considerarse como un análogo de ADN o ARN de alta afinidad. [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)]
Oligonucleótido de fosforodiamidato morfolino: en el oligonucleótido de fosforodiamidato morfolino (PMO), el fosfato de la estructura principal y la 2-desoxirribosa del ADN se reemplazan con fosforamidato y morfolina, respectivamente. [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)] Mientras que la estructura principal de ADN está cargada negativamente, la estructura principal de PMO no está cargada. Por tanto, la unión entre el PMO y el ARNm está libre de repulsión electrostática entre las estructuras principales y tiende a ser más fuerte que entre el ADN y el ARNm. Como el PMO es estructuralmente muy diferente del ADN, el PMO no sería reconocido por los transportadores hepáticos que reconocen el ADN o el ARN. Sin embargo, el PMO no penetra fácilmente en la membrana celular.
Ácido nucleico peptídico: El ácido nucleico peptídico (PNA) es un polipéptido con N-(2-aminoetil)glicina como unidad de estructura principal y fue descubierto por el Dr. Nielsen y sus colegas. [Science vol 254, 1497-1500 (1991)] La estructura química y la nomenclatura abreviada de PNA se ilustran en el dibujo proporcionado a continuación. Al igual que el ADN y el ARN, el PNA también se une selectivamente al ácido nucleico complementario. [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)] Al unirse al ácido nucleico complementario, el extremo N-terminal del PNA se considera equivalente al "extremo 5 '" del ADN o el ARN, y el extremo C-terminal del PNA como equivalente al "extremo 3' " del ADN o ARN.
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Al igual que PMO, la estructura principal de PNA no está cargada. Por tanto, la unión entre el PNA y el ARN tiende a ser más fuerte que la unión entre el ADN y el ARN. Como el PNA es marcadamente diferente del ADN en la estructura química, el p Na no sería reconocido por los transportadores hepáticos que reconocen el ADN y mostraría un perfil de distribución tisular diferente al del ADN o el PTO. Sin embargo, el PNA también penetra mal en la membrana celular de los mamíferos. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)
Nucleobases modificadas para mejorar la permeabilidad de la membrana de PNA: El PNA se hizo altamente permeable a la membrana celular de mamíferos introduciendo nucleobases modificadas con un lípido catiónico o su equivalente unido covalentemente al mismo. A continuación se proporcionan las estructuras químicas de tales nucleobases modificadas. Se descubrió que tales nucleobases modificadas de citosina, adenina y guanina hibridaban de manera predecible y complementaria con guanina, timina y citosina, respectivamente. [Solicitud de PCT N° PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253 ]
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La incorporación de tales nucleobases modificadas en PNA se asemeja a situaciones de lipofección. Por lipofección, las moléculas de oligonucleótidos con estructura principal de fosfato se envuelven con moléculas de lípidos catiónicos como lipofectamina, y tales complejos de lipofectamina/oligonucleótido tienden a penetrar la membrana con bastante facilidad en comparación con las moléculas de oligonucleótidos desnudos.
Además de una buena permeabilidad de membrana, se descubrió que esos derivados de PNA poseían una afinidad ultrafuerte por el ácido nucleico complementario. Por ejemplo, la introducción de 4 a 5 nucleobases modificadas en derivados de PNA de 11 a 13 mer produjo fácilmente una ganancia de Tm de 20° C o más lata en la formación de dúplex con ADN complementario. Tales derivados de PNA son muy sensibles a un solo malapareamiento de bases. Un solo malapareamiento de bases dio como resultado una pérdida de Tm de 11 a 22° C dependiendo del tipo de base modificada así como de la secuencia de PNA.
ARN interferente pequeño (ARNip): El ARN interferente pequeño (ARNip) se refiere a un ARN de doble cadena de 20 a 25 pares de bases. [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)] La cadena antisentido del ARNip interactúa de alguna manera con las proteínas para formar un "complejo de silenciamiento inducido por ARN" (RISC). Luego, el RISC se une a una cierta porción de ARNm complementaria a la cadena antisentido del ARNip. El ARNm complejado con el RISC experimenta escisión. Por lo tanto, el ARNip induce catalíticamente la escisión de su ARNm objetivo y, en consecuencia, inhibe la expresión de proteína por parte del ARNm. El RISC no siempre se une a la secuencia complementaria completa dentro de su ARNm objetivo, lo que plantea preocupaciones relacionadas con los efectos fuera del objetivo de una terapia con ARNip. Al igual que otras clases de oligonucleótidos con estructura principal de ADN o ARN, el ARNip posee una permeabilidad celular deficiente y, por lo tanto, tiende a mostrar una pobre actividad terapéutica in vitro o in vivo a menos que se formule adecuadamente o se modifique químicamente para tener una buena permeabilidad de membrana.
ARNip de tirosinasa: se descubrió que un ARNip de TYR dirigido a una secuencia de ARN de 19 mer dentro del ARNm de TYR humana inhibía la expresión del ARNm de TYR y la proteína en melanocitos epidérmicos humanos (HEM) después de una lipofección a 20 nM. El ARNip reguló por disminución el ARNm y la proteína TYR, pero no afectó a la expresión de las proteínas 1 y 2 relacionadas con la tirosinasa. El ARNip inhibió la melanogénesis inducida con radiación UV. [BMB Reports, vol 42(3), 178-183 (2009)]
Se examinaron ARNip diseñados para dirigirse al ARNm de TYR de ratón para determinar su capacidad para inhibir la expresión del ARNm y la proteína de TYR, y la melanogénesis en células de melanoma B16 de ratón después de una lipofección a 40 nM. El ARNip más eficaz se inyectó en el globo ocular de un ratón C57BL/6 y se descubrió que inhibía el ARNm de TYR en la retina en aproximadamente un 60%.[Mol. Biol. International, vol 2010, Article ID 240472 (2010)]
Divulgación de la invención
Problema a resolver
Hay más ejemplos de ARNip TYR en el dominio público. Por ejemplo, un estado de la técnica divulgaba ARNip dirigidos al ARNm de TYR humana para tratar la hiperpigmentación. [Us 7504385] Sin embargo, la viabilidad de tales ARNip es cuestionable para su uso contra la hiperpigmentación. Los ARNip son demasiado caros de fabricar y su utilidad cosmética tiende a ser limitada. Además, necesitan administrarse en la piel mediante administración transdérmica para un buen cumplimiento por parte del usuario. Debe tenerse en cuenta que la administración transdérmica ha sido un gran desafío técnico en el campo de los oligonucleótidos.
Solución al problema
La presente invención proporciona un derivado de ácido nucleico peptídico representado por la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000009_0001
n es un número entero entre 10 y 21;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana, o parcialmente complementario al pre-ARNm de TYR humana con uno o dos malapareamientos del compuesto completo de Fórmula I;
S1, S2, ■■■, Sn-1, Sn, T1, T2,...,Tn-1 y Tn representan independientemente radical deuterido, hidrido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;
X e Y representan independientemente radical deuterido, hidrido [H], formilo [HC(=O)-], aminocarbonilo [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonilo [NH2-C(=S)-], alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, alquilfosfonilo sustituido o no sustituido, o radical arilfosfonilo sustituido o no sustituido;
Z representa radical hídrido, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;
Bi, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales con un radical amino sustituido o no sustituido enlazado covalentemente a la fracción de nucleobase.
El compuesto de Fórmula I induce la omisión del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana, produce la variante o variantes de corte y empalme del ARNm de TYR humana que carecen del "exón 2" y, por lo tanto, es útil para inhibir la actividad funcional del gen que transcribe el pre-ARNm de TYR humana.
La condición de que "n es un número entero entre 10 y 21" significa literalmente que n es un número entero seleccionable de un grupo de números enteros de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.
Las estructuras químicas de nucleobases naturales o no naturales en el derivado de PNA de Fórmula I se ejemplifican en las Figuras 1a-1c. Las nucleobases naturales (es decir, de origen natural) o no naturales (de origen natural) de la presente invención comprenden, pero no se limitan a, las nucleobases proporcionadas en las Figuras 1a-1c. La provisión de tales nucleobases no naturales es para ilustrar la diversidad de nucleobases permitidas y, por lo tanto, no debe interpretarse como que limita el alcance de la presente invención.
Los sustituyentes adoptados para describir el derivado de PNA de Fórmula I se ejemplifican en las Figuras 2a-2e. La Figura 2a proporciona ejemplos de radicales alquilo sustituidos o no sustituidos. Los radicales alquilacilo sustituidos o no sustituidos y alquilacilo arilacilo sustituidos o no sustituidos se ejemplifican en la Figura 2b. La Figura 2c ilustra ejemplos de radicales alquilamino sustituidos o no sustituidos, arilamino sustituidos o no sustituidos, arilo sustituidos o no sustituidos, alquilsulfonilo o arilsulfonilo sustituidos o no sustituidos y alquilfosfonilo o arilfosfonilo sustituidos o no sustituidos. La Figura 2d proporciona ejemplos de radicales alquiloxicarbonilo o ariloxicarbonilo sustituidos o no sustituidos, alquilaminocarbonilo o arilaminocarbonilo sustituidos o no sustituidos. En la Figura 2e se proporcionan ejemplos de radicales alquilaminotiocarbonilo sustituidos o no sustituidos, arilaminotiocarbonilo sustituidos o no sustituidos, alquiloxitiocarbonilo sustituidos o no sustituidos y ariloxitiocarbonilo sustituidos o no sustituidos. La provisión de tales sustituyentes ejemplares es para ilustrar la diversidad de sustituyentes permisibles y, por lo tanto, no debe interpretarse como que limita el alcance de la presente invención. Una persona experta en el campo puede darse cuenta fácilmente de que la secuencia de oligonucleótidos es el factor predominante para la unión específica de la secuencia de oligonucleótidos a la secuencia de pre-ARNm objetivo sobre los sustituyentes en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal.
El compuesto de Fórmula I se une firmemente al ADN complementario como se ejemplifica en la técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. El dúplex entre el derivado de PNA de Fórmula I y su ADN o a Rn complementario de longitud completa posee un valor de Tm demasiado alto para ser determinado fiablemente en tampón acuoso. El compuesto de PNA de Fórmula I produce valores altos de Tm con ADN complementarios de longitud más corta.
El compuesto de Fórmula I se une complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" del pre-ARNm de t Yr humana. [Secuencia de referencia de NCBI: NG_0008748] La secuencia de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana, y consiste de 7 mer del "intrón 1" y 7 mer del "exón 2". Por tanto, la secuencia de pre-ARNm de 14 mer puede indicarse convencionalmente como [(5' ^ 3') uguacag | AUUGUCU], en donde la secuencia del intrón y el exón se proporcionan como letras "minúsculas" y "mayúsculas", respectivamente, y la unión intrón-exón se expresa con "|". La denotación convencional para el pre-ARNm se ilustra adicionalmente mediante una secuencia de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA] que abarca la unión de "intrón 1" y el "exón 2” en el pre-ARNm de TYR humana. Además, la secuencia de pre-ARNm de 30 mer define inequívocamente el sitio de corte y empalme 30 al que se dirige el compuesto de Fórmula I dentro del pre-ARNm de TYR humana, aunque la numeración de los exones de TYR puede indicarse de otra manera.
El compuesto de Fórmula I se une firmemente al sitio de corte y empalme 3' objetivo del pre-ARNm de TYR humana transcrito a partir del gen TYR humana e interfiere con la formación del “complejo de empalmosoma temprano” que implica el exón objetivo del compuesto. Como el compuesto de la presente invención inhibe estéricamente la formación del "complejo de empalmosoma temprano", el "exón 2" de TYR se corta y empalma para producir variantes de corte y empalme de ARNm de TYR que carecen del "exón 2". Por consiguiente, el compuesto de la presente invención induce la omisión del "exón 2" de TYR.
La fuerte afinidad por el ARN permite que el compuesto de Fórmula I induzca la omisión del "exón 2" de TYR, incluso cuando el derivado de p Na posee uno o dos malapareamientos con el sitio de corte y empalme 3' objetivo en el pre-ARNm de TYR. De manera similar, el derivado de PNA de Fórmula I todavía puede inducir la omisión del "exón 2" de TYR en un pre-ARNm mutante de TYR que posea uno o dos SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) en el sitio de corte y empalme objetivo.
El compuesto de Fórmula I posee una buena permeabilidad celular y puede administrarse fácilmente en la célula como un oligonucleótido "desnudo" como se ejemplifica en la técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. Por tanto, el compuesto de la presente invención induce la omisión del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR y produce la variante o variantes de corte y empalme del ARNm de TYR que carecen del "exón 2" de TYR en células tratadas con el compuesto de Fórmula I como oligonucleótidos "desnudos". El compuesto de Fórmula I no requiere ningún medio o formulación para la administración en la célula para inducir potentemente la omisión del exón objetivo en las células. El compuesto de Fórmula I induce fácilmente la omisión del "exón 2" de TYR en células tratadas con el compuesto de la presente invención como oligonucleótido "desnudo" a una concentración subfemtomolar.
Debido a la buena permeabilidad celular o de la membrana, el derivado de PNA de Fórmula I puede administrarse tópicamente como oligonucleótido "desnudo" para inducir la omisión del "exón 2" de TYR en la piel. El compuesto de Fórmula I no requiere una formulación para aumentar la administración transdérmica en el tejido objetivo para la actividad terapéutica o biológica prevista. Habitualmente, el compuesto de Fórmula I se disuelve en agua y cosolvente, y se administra por vía tópica o transdérmica a una concentración subpicomolar para provocar la actividad terapéutica o biológica deseada en la piel objetivo. El compuesto de la presente invención no necesita formularse intensa o invasivamente para provocar la actividad terapéutica tópica. Sin embargo, el derivado de PNA de Fórmula I puede formularse con ingredientes cosméticos o coadyuvantes como crema o loción tópica. Tal crema o loción cosmética tópica puede ser útil para tratar la hiperpigmentación facial.
El compuesto de Fórmula I puede usarse combinado con un ácido o base farmacéuticamente aceptable que incluye, pero no se limita a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, ácido clorhídrico, ácido metanosulfónico, ácido cítrico, ácido trifluoroacético, y demás.
El derivado de PNA de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse a un sujeto en combinación con un adyuvante farmacéuticamente aceptable que incluye, pero no se limita a, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido tartárico, ácido esteárico, polietilenglicol, polipropilenglicol, etanol, isopropanol, bicarbonato de sodio, agua destilada, conservantes, y demás.
El compuesto de la presente invención puede administrarse tópicamente a un sujeto a una concentración terapéutica o biológicamente eficaz que varía de 1 aM a más de 1 nM, que variaría dependiendo del programa de dosificación, las condiciones o situaciones del sujeto, y demás.
Se prefiere un derivado de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 10 y 21;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana, o parcialmente complementario al pre-ARNm de tYr humana con uno o dos malapareamientos del compuesto completo de Fórmula I;
S1, S2, ■■■, Sn-1, Sn, T1, T2,...,Tn-1 y Tn representan independientemente radical deuterido o hidrido;
X e Y representan independientemente radical deuterido, hidrido, formilo, aminocarbonilo, aminotiocarbonilo, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, alquilfosfonilo sustituido o no sustituido, o radical arilfosfonilo sustituido o no sustituido;
Z representa hidrido, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, o radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV:
Figure imgf000012_0001
en donde,
Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente entre hídrido y radical alquilo sustituido o no sustituido;
- L1, L2 y L3 son un conector covalente representado por la Fórmula V que enlaza covalentemente el grupo amino básico a la fracción de nucleobase:
Figure imgf000012_0002
en donde,
Q1 y Qm son radical de metileno (-CH2-) sustituido o no sustituido, y Qm está enlazado directamente al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de metileno sustituido o no sustituido, oxígeno (-O-), azufre (-S-) y radical amino sustituido o no sustituido [-N(H)-, o -N(sustituyente)-]; y,
m es un número entero entre 1 y 15.
Es de interés un oligómero de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 18;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2, ■■■, Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X e Y representan independientemente radical hidrido, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, o ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,...,Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,...,Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de hidrido y radical alquilo sustituido o no sustituido; Q1 y Qm son radical metileno sustituido o no sustituido, y Qm está enlazado directamente al grupo amino básico; Q2, Q3, ■ ■ y Qm-1 se seleccionan independientemente de radicales metileno, oxígeno y amino sustituidos o no sustituidos; y,
m es un número entero entre 1 y 11.
De particular interés es un derivado de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana;
Si, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-i y Tn son radicales hídrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radicales hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de radical hidrido y alquilo sustituido o no sustituido; Q1 y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno, oxígeno y amino; y,
m es un número entero entre 1 y 9.
De gran interés es un oligómero de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radicales hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R3 y R5 son un radical hidrido, y R2, R4 y R6 representan independientemente un radical hidrido o alquilo sustituido o no sustituido;
Qi y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno, oxígeno; y m es un número entero entre 1 y 9.
De mayor interés es un derivado de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radicales hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de adenina, timina, guanina, citosina y nucleobases no naturales;
por lo menos cinco de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son radical hidrido;
Qi y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno y oxígeno; y,
m es un número entero entre 1 y 9.
De mayor interés es un derivado de PNA de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUGUCU] en el pre-ARNm de TYR humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X es radical hidrido;
Y representa un radical alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido; Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
Bi, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de adenina, timina, guanina, citosina y nucleobases no naturales;
por lo menos cinco de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R 5 y R 6 son radical hidrido;
L1 representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, o -CH2-O-(CH2)5- con el extremo derecho directamente enlazado al grupo amino básico; y,
L2 y L3 se seleccionan independientemente de -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, y -(CH2)8- con el extremo derecho directamente enlazado al grupo amino básico.
De interés específico es un derivado de PNA de Fórmula I que se selecciona del grupo de compuestos proporcionados a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos:
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2;
(N^C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Benzoilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Metilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) n-Propilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) p-Toluenesulfonilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2;
(N^C) Fetoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Bencilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fenilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) [N-(2-Feniloethyl)amino]carbonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Benzoilo-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2;
(N^C) Fetoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(102)TG(5)-TA(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)-T-A(5)C-NH2;
(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2;
(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2;
(N^C) Fetoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N^C) Fetoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(104)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2; y
(N^C) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2:
en donde,
A, G, T y C son monómeros de PNA con una nucleobase natural de adenina, guanina, timina y citosina, respectivamente;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) y G(pOq) son monómeros de PNA con una nucleobase no natural representada por la Fórmula VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX y Fórmula X. respectivamente;
Figure imgf000015_0001
en donde,
p y q son números enteros; y,
las abreviaturas para los sustituyentes de los extremos N- y C-terminal se describen específicamente a continuación: "Fmoc-" es la abreviatura de "[(9-fluorenil)metiloxi]carbonil-"; "Fetoc-" de "[2-(9-fluorenil)etil-1-oxi]carbonilo"; "Ac-" de "acetil-"; "Benzoil-" de "bencenocabonil-"; "Piv-" de "pivalil-"; "Metil-" de "metil-"; "n-Propil-" de "1-(n-propil)-"; "H-" de grupo "hidrido-"; "p-toluenosulfonilo" de "(4-metilbenceno)-1-sulfonil-"; "-Lys-" del residuo de aminoácido "lisina"; "-Val-" del residuo de aminoácido "valina"; "-Leu-" del residuo de aminoácido "leucina"; "-Arg-" del residuo de aminoácido "arginina", "-Gly-" del residuo de aminoácido "glicina"; "[N-(2-feniletil)amino]carbonil-" de "[N-1-(2-feniletil)amino]carbonil-"; "Bencil-" de "1-(fenil)metil-"; "Fenil-" de "fenil-"; "Me-" de "metil-"; y "-NH2" para el grupo "-amino" no sustituido.
La Figura 3 proporciona colectiva e inequívocamente las estructuras químicas para los monómeros de PNA abreviados como A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) y G(pOq). Como se analizó en el estado de la técnica [PCT/KR2009/001256], C(pOq) se considera un monómero de PNA de "citosina modificada" debido a su hibridación con "guanina". A(p) y A(pOq) se toman como monómeros de PNA de "adenina modificada" por su hibridación con "timina". De igual manera, G(p) y G (pOq) se consideran monómeros de PNA de "guanina modificada" por su emparejamiento de bases con "citosina".
La Figura 4 ilustra inequívocamente las estructuras químicas para una variedad de abreviaturas de sustituyentes usados para diversificar el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del derivado de PNA de Fórmula I en la presente invención.
Para ilustrar las abreviaturas empleadas para tales derivados de PNA, en la Figuras 5a se proporciona la estructura química de un derivado de PNA de 13 mer abreviado como "(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2". Como otra ilustración, en la Figura 5b se proporciona la estructura química de un derivado de PNA de 15 mer abreviado como "(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2) T-G(3O2) TA(5)-CA(2O2)A-NH2'.
La secuencia de PNA de 13 mer de "(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2' especificada en la Figura 5a es equivalente a la secuencia de AdN de "(5'^3') CAG-ACA-ATC-TGT-A" para la unión complementaria al pre-ARNm. El PNA de 13 mer tiene una superposición complementaria de 13 mer con la secuencia de 13 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana.
La secuencia de PNA de 15 mer de "(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2" especificada en la Figura 5b es equivalente a la secuencia de ADN de "(5' ^ 3') Ag A-CaA-TcT-GTA-c Aa " para la unión complementaria al pre-ARNm. El PNA de 15 mer tiene una superposición complementaria de 15 mer con la secuencia de 15 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana.
Una secuencia de PNA de 17 mer de "(N^C) Fetoc-AAC(103)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2" es equivalente a la secuencia de ADN de "(5' ^ 3') ACT-Ga C-TAT-CTG-TAC-AÁ' para la unión complementaria al pre-ARNm. El PNA de 17 mer tiene una superposición complementaria de 15 mer con la secuencia de 15 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AU"U"GUC"U"GUAGCCGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana. Los dos malapareamientos se marcaron con un signo de comillas, es decir,"".
Un aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana, que comprende el
Un aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar la hiperpigmentación, que comprende el derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de hiperpigmentación provocada por la sobreproducción de melanina incluyen melasma, cicatrices de acné, manchas hepáticas, pecas, manchas de la edad y daño actínico.
También se divulga en la presente un método para tratar enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana, que comprende la administración del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la presente invención. La vía de administración puede ser, por ejemplo, una administración tópica.
También se divulga en la presente un método para tratar la hiperpigmentación, que comprende la administración del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la presente invención. La vía de administración puede ser, por ejemplo, una administración tópica.
Un aspecto de la presente invención proporciona un uso del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana.
Un aspecto de la presente invención proporciona un uso del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hiperpigmentación.
Breve explicación de los dibujos
Figuras 1a-1c. Ejemplos de nucleobases naturales o no naturales (modificadas) seleccionables para el derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
Figuras 2a-2e. Ejemplos de sustituyentes seleccionables para el derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
Figura 3. Estructuras químicas de monómeros de PNA con nucleobase natural o modificada.
Figura 4. Estructuras químicas para abreviaturas de sustituyentes de extremo N- o C-terminal.
Figuras 5a. Estructura química del derivado de PNA de 13-mer "(N^-C) Fetoc- CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)TA(5)-NH2".
Figuras 5b. Estructura química del derivado de PNA de 15 mer "(N^-C) Fetoc-A AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)TG(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2".
Figura 6. Estructuras químicas de los monómeros Fmoc-PNA usados para sintetizar los derivados de PNA de la presente invención.
Figuras 7a-7b. Cromatogramas de HPLC de fase inversa C18 de "ASO 1" antes y después de la purificación por HPLC, respectivamente.
Figura 8. Espectro de masas ESI-TOF de "ASO 1" purificado por HPLC prep C18-RP.
Figura 9a. Análisis electroforético de los productos de PCR anidados en células de melanoma de ratón B16F10 tratadas con 0 (control negativo), 1,10 o 1000 aM "ASO 1M".
Figura 9b. Datos de secuenciación de Sanger para el producto de PCR asignable a la omisión de exones (2-3).
Figura 10a. Cambios en el nivel de ARNm de TYR de longitud completa mediante qPCR en células de melanoma de ratón B16F10 tratadas con "ASO 1M" a 0 (control negativo), 1, 10, 100 o 1000 aM. (barra de error por error estándar)
Figura 10b. Datos de transferencia western de TYR en células de melanoma de ratón B16F10 tratadas durante 24 horas con "ASO 1M" a 0 zM (control negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM o 10 aM (es decir, 10.000 zM).
Figura 11. Cambios en el contenido de melanina en células de melanoma de ratón B16F10 tratadas con "ASO 1M" a 1, 10, 100 o 1000 aM, o con 10 pg/ml o 100 pg/ml de arbutina. (barra de error por error estándar) Figura 12. Cambios en el nivel de ARNm de TYR completo mediante qPCR en melanocitos epiteliales primarios humanos tratados con "ASO 1" a 0 zM (control negativo), 1 zM, 100 zM o 10 aM. (barra de error por error estándar)
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Procedimientos generales para la preparación de oligómeros de PNA
Los oligómeros de PNA se sintetizaron mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) basada en la química Fmoc de acuerdo con el método divulgado en el estado de la técnica [US6.133.444; WO96/40685] con modificaciones menores pero debidas. El soporte sólido empleado en este estudio fue H-Rink Amide-ChemMatrix adquirido de PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canadá). Los monómeros Fmoc-PNAcon una nucleobase modificada se sintetizaron como se describe en el estado de la técnica [PCT/KR 2009/001256] o con modificaciones menores. Tales monómeros de Fmoc-PNA con una nucleobase modificada y monómeros de Fmoc-PNA con una nucleobase de origen natural se usaron para sintetizar los derivados de PNA de la presente invención. Los oligómeros de PNA se purificaron mediante HPLC de fase inversa C18 (agua/acetonitrilo o agua/metanol con TFA al 0,1%) y se caracterizaron mediante espectrometría de masas que incluía ESI/TOF/MS.
El Esquema 2 ilustra un ciclo de elongación de monómeros típico adoptado en el SPPS de este estudio, y a continuación se proporcionan los detalles sintéticos. Sin embargo, para un experto en el campo, hay muchas variaciones menores obviamente posibles en la ejecución eficaz de tales reacciones de SPPS en un sintetizador de péptidos automático o un sintetizador de péptidos manual. Cada paso de reacción en el Esquema 2 se proporciona brevemente como sigue.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
[Activación de la resina H-Rink-ChemMatrix] se agitó 0,01 mmol (aproximadamente 20 mg de resina) de la resina ChemMatrix en 1,5 ml de piperidina al 20%/DMF con vórtex en un tubo libra durante 20 min y se filtró la solución de DeFmoc. La resina se lavó durante 30 segundos cada una en serie con 1,5 ml de cloruro de metileno (MC), 1,5 ml de dimetilformamida (DMF), 1,5 ml de MC, 1,5 ml de DMF y 1,5 ml de MC. Las aminas libres resultantes sobre el soporte sólido se sometieron a acoplamiento o con un monómero Fmoc-PNA o con un derivado de aminoácido protegido con Fmoc.
[DeFmoc] La resina se agitó con vórtex en 1,5 ml de piperidina al 20%/DMF durante 7 min y se filtró la solución de DeFmoc. La resina se lavó durante 30 segundos cada una en serie con 1,5 ml de MC, 1,5 ml de DMF, 1,5 ml de MC, 1,5 ml de DMF y 1,5 ml de MC. Las aminas libres resultantes sobre el soporte sólido se sometieron inmediatamente a acoplamiento con un monómero Fmoc-PNA.
[Acoplamiento con monómero Fmoc-PNA] Las aminas libres sobre el soporte sólido se acoplaron con un monómero Fmoc-PNA de la siguiente manera. Se incubaron 0,04 mmol de monómero de PNA, 0,05 mmol de HBTU y 10 mmol de DIEA durante 2 min en 1 ml de DMF anhidra y se añadieron a la resina con aminas libres. La solución de resina se agitó con vórtex durante 1 hora y se filtró el medio de reacción. Luego, la resina se lavó durante 30 segundos cada uno en serie con 1,5 ml de MC, 1,5 ml de DMF y 1,5 ml de MC. Las estructuras químicas de los monómeros Fmoc-PNA con una nucleobase modificada usadas en la presente invención se proporcionan en la Figura 6. Los monómeros Fmoc-PNA con una nucleobase modificada que se proporcionan en la Figura 6 deben tomarse como ejemplos y, por lo tanto, no debe considerarse que limitan el alcance de la presente invención. Un experto en el campo puede descubrir fácilmente una serie de variaciones en los monómeros Fmoc-PNA para sintetizar el derivado de PNA de Fórmula I.
[Recubrimiento] Después de la reacción de acoplamiento, las aminas libres sin reaccionar se taparon agitando durante 5 min en 1,5 ml de solución de caperuza (anhídrido acético al 5% y 2 ,6-leutidina al 6% en DMF). Luego, la solución de recubrimiento se filtró y se lavó durante 30 segundos cada una en serie con 1,5 ml de MC, 1,5 ml de DMF y 1,5 ml de MC.
[Introducción del radical "Fetoc-" en el extremo N-terminal] Se introdujo el radical "Fetoc-" en el extremo N-terminal haciendo reaccionar la amina libre de la resina con "Fetoc-OSu" en condiciones básicas de acoplamiento. La estructura química de "Fetoc-OSu" [N° CAS 179337-69-0, C20H17NO5, PM 351,36] se proporciona como sigue.
Figure imgf000018_0001
[Escisión de la resina] Los oligómeros de PNA unidos a la resina se escindieron de la resina agitando durante 3 horas en 1,5 ml de solución de escisión (triisopropilsilano al 2,5% y agua al 2,5% en ácido trifluoroacético). La resina se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo resultante se trituró con éter dietílico y el precipitado resultante se recogió por filtración para su purificación por HPLC de fase inversa.
[Análisis y purificación por HPLC] Después de una escisión de la resina, el producto bruto de un derivado de PNA se purificó por HPLC de fase inversa C18 eluyendo con agua/acetonitrilo o agua/metanol (método de gradiente) que contenía TFA al 0,1%.Las Figuras 7a y 7b son cromatogramas de HPLC ejemplares para "ASO 1" antes y después de la purificación por HPLC, respectivamente. La secuencia del oligómero de "ASO 1" es como se proporciona en la Tabla 1.
Ejemplos sintéticos para derivados de PNA de Fórmula I
Para dirigirse complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana, se prepararon derivados de PNA de la presente invención de acuerdo con los procedimientos sintéticos proporcionados con anterioridad o con modificaciones menores. La provisión de tales derivados de PNA dirigidos al pre-ARNm de TYR humana es para ejemplificar los derivados de PNA de Fórmula I, y no debe interpretarse que limita el alcance de la presente invención.
Tabla 1. Derivados de PNA dirigidos complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-
Figure imgf000018_0002
La Tabla 1 proporciona derivados de PNA dirigidos complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana leído del gen TYR humana [Secuencia de referencia NCBl: NG_0008748] junto con datos de caracterización estructural por espectrometría de masas. La provisión de los ASO de TYR en la Tabla 1 es para ejemplificar los derivados de PNA de Fórmula I, y no debe interpretarse que limita el alcance de la presente invención.
"ASO 1" tiene una superposición complementaria de 13 mer con la secuencia de 13 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AUUGU-CUGUAGCCGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana. Por lo tanto, "ASO 1" posee una superposición de 5 mer con el "intrón 1" y una superposición de 8 mer con el "exón 2" dentro del pre-ARNm de TYR humana.
La Tabla 2 proporciona "ASO 1M" dirigido complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR de ratón leído del ADN genómico de ratón [accedido desde la Secuencia de referencia de NCBI: NC_000073] junto con datos de caracterización estructural por espectrometría de masas. La provisión de "ASO 1M" es para evaluar la actividad antisentido en células de origen de ratón.
Tabla 2. Derivados de PNA dirigidos complementariamente al sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-
Figure imgf000019_0001
Se leyó una secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') aauuguuuuucacag | AUCAUUUGUAGCAGA] que abarca la unión del intrón 1 y el exón 2 en el pre-ARNm de TYR de ratón del gen de TYR de ratón [Número de registro de gen NCBI: NC_0o0o73].
"ASO 1M" es equivalente a la secuencia de ADN de "(5' ^ 3') CAA-ATG-ATC-TGT-G" para la unión complementaria al pre-ARNm. "ASO 1M" tiene una superposición complementaria de 13 mer con la secuencia de 13 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') aauuguuuuucacag | AUCAUUUGUAGCAGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR de ratón.
Al igual que "ASO 1" contra el pre-ARNm de TYR humana, "ASO 1M" posee una superposición de 5 mer con el "intrón 1" y una superposición de 8 mer con el "exón 2" dentro del pre-ARNm de TYR de ratón. "ASO 1M" puede servir como un buen compuesto sustituto de la actividad antisentido de "ASO 1" en células de origen humano.
La Figura 7a es un cromatograma de HPLC obtenido con un producto bruto de "ASO 1". El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa C-is-RP. La Figura 7b es un cromatograma de HPLC para un producto purificado de "ASO 1". La pureza de "ASO 1" mejoró notablemente después de la purificación por HPLC preparatoria. La Figura 8 proporciona un espectro de masas ESI-TOF obtenido con el producto purificado de "ASO 1". La provisión de datos de análisis para "ASO 1" es para ilustrar cómo se purificaron e identificaron los derivados de PNA de Fórmula I en la presente invención, y no debe interpretarse que limita el alcance de la presente invención.
Afinidad de unión de derivados de PNA modelo para ADN complementario
Los derivados de PNA en las Tablas 1 y 2 se evaluaron en cuanto a su afinidad de unión por ADN de 10 mer que se dirigían complementariamente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal. La afinidad de unión se evaluó mediante el valor de Tm para el dúplex entre PNA y ADN complementario de 10 mer. El dúplex entre los derivados de PNA y los ADN totalmente complementarios muestra valores de Tm demasiado altos para determinarlos de manera fiable en solución tampón acuosa, ya que la solución tampón tiende a hervir durante la medición de Tm.
Los valores de Tm se determinaron en un espectrómetro UV/Vis de la siguiente manera. Una solución mixta de oligómero de PNA 4 pM y ADN de 10 mer complementario 4 pM en 4 ml de tampón acuoso (pH 7,16, fosfato de sodio 10 mM, NaCl 100 mM) en un tubo falcon de polipropileno de 15 ml se incubó a 90° C durante un minuto y se enfrió lentamente a temperatura ambiente. Luego, la solución se transfirió a una cubeta UV de cuarzo de 3 ml equipada con una tapa hermética y se sometió a una medición de Tm a 260 nm en un espectrofotómetro UV/Visible como se describe en el estado de la técnica [PCT/KR2009/001256] o con modificaciones menores. Los ADN complementarios de 10 mer para la medición de Tm se adquirieron de Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, República de Corea) y se usaron sin purificación adicional.
Los valores de Tm observados de los derivados de PNA de Fórmula I son muy altos para una unión complementaria a ADN de 10 mer, y se proporcionan en la Tabla 3. Por ejemplo, "ASO 1" mostró un valor de Tm de 78,0° C para el dúplex con el ADN complementario de 10 mer que se dirige al extremo N-terminal de 10 mer en el PNA marcado en "negrita" y "subrayado" en [(N ^ C) Fetoc- -cA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH2. Mientras tanto, "ASO 1" mostró un Tm de 73,0° C para el dúplex con el ADN complementario de 10 mer que se dirige al extremo C-terminal de 10 mer en el PNA como se marca en "negrita" y "subrayado" en [(N ^ C) Fetoc CA(5)G-ACA(5)-ATC(102)-TG(6)T-A(5)-NH2].
Tabla 3. Valores de Tm entre los PNA y el ADN complementario de 10 mer dirigido al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del PNA.
Figure imgf000020_0001
Ejemplos de actividades biológicas de derivados de PNA de fórmula I
Se evaluaron los derivados de PNA en la presente invención para sus actividades antisentido de TYR in vitro en células de melanoma de ratón B16F10 y melanocitos humanos. Los ejemplos biológicos se proporcionaron como ejemplos para ilustrar los perfiles biológicos de los derivados de PNA de Fórmula I y, por lo tanto, no debe interpretarse que limitan el alcance de la presente invención. Ejemplo 1. Omisión de exón inducido por "ASO 1M".
El "ASO 1M" especificado en la Tabla 2 tiene una superposición complementaria de 13 mer con la secuencia de 13 mer marcada en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') aauuguuuuucacag | AUCAUUUGUAGCAGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR de ratón. Mientras tanto, "ASO 1M" posee un complemento de 9 mer junto con 4 malapareamientos marcados en "negrita" y "subrayado" dentro de la secuencia de ARN de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuug"u"acag | AU"UG"U"C"Ug UAGCCGA] que abarca la unión del "intrón 1" y el "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana.
Se evaluó "ASO 1M" por su capacidad para inducir la omisión del "exón 2" de TYR en células de melanoma B16F10 de ratón, aunque "ASO 1M" posee 4 malapareamientos con el sitio de corte y empalme 3' del "exón 2" en el pre-ARNm de TYR humana. "ASO 1M", que es completamente complementario al pre-ARNm de TYR de ratón, puede servir como un buen compuesto sustituto para "ASO 1", que es completamente complementario al pre-ARNm de TYR humana.
[Cultivo celular y Tratamiento ASO] Se mantuvieron células de melanoma de ratón B16F10 (Número de catálogo CRL-6475, ATCC) en DMEM (medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con FBS al 10%, estreptomicina/penicilina al 1% y 0,01 mg/ml insulina bovina. Se incubaron células B16F10 cultivadas en placas de cultivo de 60 mm que contenían 5 ml de DMEM durante 5 horas con "ASO 1M" a 0 (control negativo), 1, 10, 100 o 1000 aM.
[Extracción de ARN y Síntesis de ADNc mediante PCR en un solo paso] Después de una incubación durante 5 horas, se extrajo el ARN total usando el "Kit de extracción de ARN universal" (Número de catálogo 9767, Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron 200 ng de plantilla de ARN para una reacción de transcripción inversa de 25 y l usando el kit de PCR de un solo paso Super Script® con polimerasa Platinum® Taq (N° de Cat. 10928-042, Invitrogen) contra un conjunto de cebadores específicos de exón de [exón 1_directo: (5' ^ 3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; y exón 4_inverso: (5' ^ 3') AGAGC-GGTATGAAAGGAA] de acuerdo con las siguientes condiciones de ciclo: 50° C durante 30 min y 94° C durante 2 min, seguido de 15 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 52° C, y 40 segundos a 72° C.
[Amplificación por PCR anidada] Se amplificó adicionalmente 1 y l de ADNc en una reacción de PCR anidada de 20 yl (N° de Cat. K2612, Bioneer) contra un conjunto de cebadores de [exón ln_directo: (5' ^ 3') GAGAACTAAcTg Gg GATGA; y exón 4n_inverso: (5' ^ 3') CGATAGGTGCATTGGCTT] de acuerdo con las condiciones del ciclo especificadas a continuación: 95° C durante 5 min seguido de 30 ciclos de 30 s a 95° C, 30 s a 52° C y 40 s a 72° C.
[Identificación de productos de omisión de exones] Los productos de PCR se sometieron a separación electroforética en un gel de agarosa al 2%. Las bandas de tamaño objetivo se recogieron y analizaron mediante secuenciación Sanger.
La Figura 9a proporciona los datos de electroforesis de los productos de PCR. Las células sin el tratamiento con "ASO 1M" produjeron dos bandas de PCR fuertes, una para el ARNm de TYR de longitud completa y la otra para la variante de corte y empalme de ARNm de TYR que carece de los exones 2 y 3. Por tanto, se considera que la omisión de los exones 2-3 se produce espontáneamente. Las células tratadas con "ASO 1M" de 1 a 1000 aM, sin embargo, produjeron solo la variante de corte y empalme de ARNm de TYR que carecía de los exones 2 y 3. Por lo tanto, "ASO 1M" aumenta la propensión a omitir los exones 2-3 en las células de melanoma B16F10. El producto de PCR con omisión de exón se secuenció para ser la omisión de los exones 2-3 como se muestra en la Figura 9b. Ejemplo 2. qPCR para ARNm de TYR en células de melanoma de ratón B16F10 tratadas con "ASO 1M".
Se evaluó "ASO 1M" mediante qPCR anidada de TYR para determinar su capacidad para inducir cambios en el nivel de ARNm de TYR de ratón en células B16F10 como se describe a continuación.
[Cultivo celular y Tratamiento con ASO] Se trataron células B16F10 cultivadas en placas de cultivo de 60 mm que contenían 5 ml de DMEM con "ASO 1M" a 0 (control negativo), 1, 10, 100 o 1000 aM. (2 placas de cultivo por dosis)
[Extracción de ARN y síntesis de ADNc mediante PCR en un solo paso] Después de una incubación con "ASO 1M" durante 5 horas, se extrajo el ARN total de las células usando el "kit de extracción de ARN universal" (N° de Cat. 9767, Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron 200 ng de plantilla de ARN para una reacción de transcripción inversa de 25 pl usando el kit de RT-PCR de un paso (Invitrogen, USA) contra un conjunto de cebadores específicos de exón de [exón 1_directo: (5' ^ 3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; y exón 4_inverso: (5' ^ 3') AGAGCGGTATGAAAGGAA] de acuerdo con las siguientes condiciones de ciclo: 50° C durante 30 min y 94° C durante 2 min, seguido de 15 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 52° C y 40 segundos a 72°C.
[Amplificación de qPCR anidada] Las soluciones de ADNc se diluyeron 100 veces, y se sometió 1 pl de cada producto de PCR diluido a una reacción de PCR en tiempo real de 20 pl con un conjunto de sondas Taqman que abarcaba la unión del exón 2 y el exón 3 (N° de Cat. Mm00495818_ml, Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las siguientes condiciones de ciclo: 95° C durante 3 min seguido de 30 ciclos de 10 s a 95° C y 30 s a 60° C.
[Análisis estadístico] El experimento de qPCR anidada se repitió independientemente cuatro veces, y los niveles de ARNm individuales de cada experimento se normalizaron frente al nivel de ARNm sin el tratamiento con "ASO 1M". Los niveles de ARNm obtenidos de los 4 experimentos separados se agruparon para el análisis estadístico mediante la prueba t de Student. Por tanto, el número de muestras de ARN es de 8 por concentración.
La Figura 10a proporciona los datos de qPCR agrupados, en los que el nivel de ARNm de longitud completa disminuyó significativamente en aproximadamente un 40% en las células tratadas con "ASO 1M" de 1 a 1000 aM.
Ejemplo 3. Inhibición de la expresión de proteína TYR en células de melanoma B16F10 por"ASO 1M".
Se evaluó "ASO 1M" para determinar su capacidad para regular por disminución la expresión de la proteína TYR en células de melanoma de ratón B16F10 como se describe a continuación.
Se trataron células B16F10 cultivadas en placas de cultivo de 60 mm que contenían 5 ml de DMEM con "ASO 1M" a 0 zM (control negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM o 10 aM. 24 horas más tarde, las células se lavaron 2 veces con PBS frío (solución salina tamponada con fosfato) y luego se sometieron a lisis con 200 pl de tampón de lisis celular 1X (N° de Cat. 9803, Cell Signaling Tech) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa 1X (N° de Cat. P8340, Sigma). Se mezclaron 200 pl de cada lisado en un tubo electrónico de 1,5 ml con 100 pl de tampón de muestra 5X y se hirvieron a 100° C durante 5 min. Se sometieron 20 pl del lisado a separación electroforética en un gel TGX con un gradiente del 4 al 15% (N° de Cat 456-1086, Bio-Rad), y transferencia de proteína en una membrana de PVDF de 0,45 pm. La membrana se sondeó con un anticuerpo anti-TYR (N° de Cat. 9319, Cell Signaling Tech) y un anticuerpo anti-p-actina (N° de Cat. a3845, Sigma).
La Figura 10b proporciona los datos de transferencia Western para la expresión de la proteína TYR en células B16F10. La intensidad de la banda de expresión de TYR fue considerablemente más débil en los lisados con tratamiento "ASO 1M" que en los lisados sin tratamiento "ASO 1M", es decir, control negativo. El nivel de proteína TYR y ARNm disminuyó de manera comparable con el tratamiento con ASO. (ver el "Ejemplo 2")
Ejemplo4. Inhibición de la melanogénesis en células de melanoma B16F10 por"ASO 1M".
Se evaluó "ASO 1M" para determinar su capacidad para inhibir la melanogénesis en células de melanoma de ratón B16F10 como se describe a continuación.
Las células B16F10 subcultivadas en placas de cultivo de 60 mm que contenían 5 ml de DMEM se trataron con nada (control negativo), con "ASO 1M" de 1 a 1000 aM, o con 10 o 100 pg/ml de arbutina como control positivo. (2 placas de cultivo por dosis) 24 horas más tarde, las células se lavaron 2 veces con PBS frío y se sometieron a lisis con 200 pl de NaOH IN. Cada lisado se recogió en un tubo e de 1,5 ml y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. El contenido de melanina en cada lisado se determinó por absorbancia a 475 nm en un lector ELISA. El mismo experimento se repitió cuatro veces usando células en diferentes pases. Los cuatro conjuntos de datos de contenido de melanina se agruparon para el análisis estadístico mediante la prueba t de Student frente al contenido de melanina sin tratamiento (control negativo).
La Figura 11 resume los cambios del contenido de melanina en las células B16F10 después de una incubación de 24 horas o con "ASO 1M" o con arbutina. El contenido de melanina disminuyó significativamente en un 15% y un 25% en las células tratadas con 10 |jg/ml y 100 |jg/ml de arbutina, respectivamente. En el caso de las células tratadas con "ASO 1M", el contenido de melanina disminuyó significativamente en aproximadamente un 15% sin mucha dependencia de la dosis. La actividad inhibidora de "ASO 1M" fue comparable a la de 10 jg/ml de arbutina.
Ejemplo 5. Preparación de crema tópica que contiene el compuesto de Fórmula I.
Se formuló un compuesto de Fórmula I, por ejemplo "ASO 2", como una crema para aplicación tópica a sujetos. La crema tópica se preparó como se describe a continuación. Como hay muchas variaciones posibles de crema tópica, esta preparación debe tomarse como un ejemplo y no debe interpretarse que limita el alcance de la presente invención.
[Preparación de la Solución A] En un vaso de precipitados, se mezclaron agua desionizada (196 g), EDTA disódico (0,06 g), glicerina (15 g), dipropilenglicol (30 g), fenoxietanol (0,9 g), etilhexilglicerina (0,9 g), copolímero de acrilato de hidroxietilo/acriloildimetiltaurato de sodio (2,4 g), y solución acuosa 1 nM de "ASO 2" (0,3 ml). La mezcla se sometió a homogeneización a 70~75°C utilizando un mezclador homogéneo.
[Preparación de la Solución B] En otro vaso de precipitados, se mezclaron a 70~75°C etilhexanoato de cetearilo (12 g), dimeticona (6 g), ácido esteárico/aceite vegetal hidrogenado/alcohol behenílico/alcohol cetearílico (15 g), manteca de butyrospermum parkii (karité) (9 g) y diestearato de poligliceril-3-metilglucosa/estearato de glicerilo SE/sesquistearato de metilglucosa (6 g).
[Preparación de crema tópica] Se mezclaron "Solución A" y "Solución B" y se sometieron a homogeneización a 7.200 rpm y 70~75°C. durante 3 min usando un mezclador homogéneo. La mezcla se enfrió lentamente a temperatura ambiente para producir una crema tópica que contenía 1 pM de "ASO 2".
Ejemplo 6. qPCR para ARNm de TYR en melanocitos humanos tratados con "ASO 1".
El "ASO 1" especificado en la Tabla 1 es un ASO de TYR de 13 mer totalmente complementario al sitio de corte y empalme 3' que abarca la unión del intrón 1 y el exón 2 en el TYR humana como está marcado en "negrita" y "subrayado" en la secuencia de pre-ARNm de TYR humana de 30 mer de [(5' ^ 3') ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA].
"ASO 1" se evaluó mediante qPCR anidada de TYR para determinar su capacidad para inducir cambios en el nivel de ARNm de TYR en melanocitos epidérmicos primarios humanos de la siguiente manera.
[Cultivo celular y tratamiento con ASO] Las células de melanocitos epidérmicos primarios (N° de Cat. PCS-200-013, ATCC) se mantuvieron en medio basal de células dérmicas (N° de Cat. PCS-200-030, ATCC) suplementado con el componente del kit de crecimiento de melanocitos adultos (N° de Cat. PCS-200-042, ATCC). Los melanocitos cultivados en placas de cultivo de 60 mm que contenían 5 ml de medio de cultivo se trataron con "ASO 1" a 0zM (control negativo), 1 zM, 100 zM o 10 aM. (3 placas de cultivo por concentración)
[Extracción de ARN y síntesis de ADNc mediante PCR en un solo paso] Después de una incubación con "ASO 1" durante 5 horas, se extrajo el ARN total usando "RNeasy Mini Kit" (N° de Cat. 74106, Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sometieron 200 ng de plantilla de ARN a una reacción de transcripción inversa de 25 j l usando el kit de RT-PCR de un solo paso Super Script® con polimerasa Platinum® Taq (N° de cat.
10928-042, Invitrogen) contra un conjunto de cebadores específicos de exones [exón 1_directo(2): (5' ^ 3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; y exón 5_inverso: (5' ^ 3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT] de acuerdo con las siguientes condiciones de ciclo especificadas: 50° C durante 30 min y 94° C durante 2 min, lo cual fue seguido por 15 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 50° C y 1 min a 72°C.
[Amplificación por PCR anidada] Se amplificó adicionalmente 1 j l de ADNc en una reacción de PCR anidada de 20 j l (N° de cat. K2612, Bioneer) contra un conjunto de cebadores específicos de exones [exón 2n_directo: (5' ^ 3') GATAAAGCTGCCAATTTC; y exón 3n_inverso: (5' ^ 3') TTGTGCATGCTGCTTTGA] contra una sonda Taqman [(5' ^ 3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]. Condiciones del ciclo: 95° C durante 3 min seguido de 40 ciclos de 10 s a 95°C y 30 s a 60°C.
La Figura 12 proporciona los datos de qPCR, en los que el nivel de ARNm de TYR de longitud completa disminuyó aproximadamente un 30% en los melanocitos humanos tratados con "ASO 1" de 1 zM a 10 aM. Las disminuciones observadas fueron significativas (prueba t de Student) en las células tratadas con "ASO 1" a 1 zM y 10 aM.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un derivado de ácido nucleico peptídico representado por la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000051_0001
en donde,
n es un número entero entre 10 y 21;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana, o parcialmente complementario al pre-ARNm de TYR humana con uno o dos malapareamientos del compuesto completo de Fórmula I;
S1, S2, ■■■, Sn-1, Sn, T1, T2,...,Tn-1 y Tn representan independientemente radical deuterido, hidrido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;
X e Y representan independientemente radical deuterido, hidrido [H], formilo [HC(=O)-], aminocarbonilo [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonilo [NH2-C(=S)-], alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, alquilfosfonilo sustituido o no sustituido, o radical arilfosfonilo sustituido o no sustituido;
Z representa radical hidrido, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales con un radical amino sustituido o no sustituido enlazado covalentemente a la fracción de nucleobase.
2. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 10 y 21;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana, o parcialmente complementario al pre-ARNm de TYR humana con uno o dos malapareamientos del compuesto completo de Fórmula I;
S1, S2, ■ ■, Sn-1, Sn, T1, T2,...,Tn-1 y Tn representan independientemente radical deuterido o hidrido;
X e Y representan independientemente radical deuterido, hidrido, formilo, aminocarbonilo, aminotiocarbonilo, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, arilaminotiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, ariloxitiocarbonilo sustituido o no sustituido, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, alquilfosfonilo sustituido o no sustituido, o radical arilfosfonilo sustituido o no sustituido;
Z representa hidrido, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, o radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,
por lo menos cuatro de Bi, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV:
Figure imgf000052_0001
en donde,
Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente entre hídrido y radical alquilo sustituido o no sustituido;
- L1, L2 y L3 son un conector covalente representado por la Fórmula V que enlaza covalentemente el grupo amino básico a la fracción de nucleobase:
Figure imgf000052_0002
en donde,
Q1 y Qm son radical de metileno (-CH2-) sustituido o no sustituido, y Qm está enlazado directamente al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de metileno sustituido o no sustituido, oxígeno (-O-), azufre (-S-) y radical amino sustituido o no sustituido [-N(H)-, o -N(sustituyente)-]; y,
m es un número entero entre 1 y 15.
3. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 18;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2, ■■■, Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X e Y representan independientemente radical hidrido, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alquilacilo sustituido o no sustituido, arilacilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido, o ariloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,...,Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,...,Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de radical hidrido y alquilo sustituido o no sustituido; Q1 y Qm son radical metileno sustituido o no sustituido, y Qm está enlazado directamente al grupo amino básico; Q2, Q3, ■ ■ y Qm-1 se seleccionan independientemente de radicales metileno, oxígeno y amino sustituidos o no sustituidos; y,
m es un número entero entre 1 y 11.
4. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radical hidrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radical hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de radical hidrido y alquilo sustituido o no sustituido; Q1 y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno, oxígeno y amino; y,
m es un número entero entre 1 y 9.
5. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de Tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de Tirosinasa humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radical hidrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radical hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;
por lo menos cuatro de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R3 y R5 son radical hidrido, y R2, R4 y R6 representan independientemente radical hidrido o alquilo sustituido o no sustituido;
Qi y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno, oxígeno; y m es un número entero entre 1 y 9.
6. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radical hidrido;
X e Y se seleccionan independientemente de radical hidrido, alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de adenina, timina, guanina, citosina y nucleobases no naturales;
por lo menos cinco de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son radical hidrido;
Qi y Qm son radical metileno, y Qm está directamente enlazado al grupo amino básico;
Q2, Q3, .. y Qm-1 se seleccionan independientemente de radical metileno y oxígeno; y,
m es un número entero entre 1 y 9.
7. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 6, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde,
n es un número entero entre 11 y 16;
el compuesto de Fórmula I posee por lo menos una superposición complementaria de 10 mer con la secuencia de pre-ARNm de 14 mer de [(5' ^ 3') UGUACAGAUUg Uc U] en el pre-ARNm de tirosinasa humana;
el compuesto de Fórmula I es completamente complementario al pre-ARNm de tirosinasa humana;
S1, S2,..., Sn-1, Sn, T1, T2,..., Tn-1 y Tn son radicales hidrido;
X es radical hidrido;
Y representa un radical alquilacilo sustituido o no sustituido o alquiloxicarbonilo sustituido o no sustituido;
Z representa un radical amino sustituido o no sustituido;
B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de adenina, timina, guanina, citosina y nucleobases no naturales;
por lo menos cinco de B1, B2,..., Bn-1 y Bn se seleccionan independientemente de nucleobases no naturales representadas por la Fórmula II, Fórmula III o Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, R 5 y R 6 son radical hidrido;
L1 representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, o -CH2-O-(CH2)5- con el extremo derecho directamente enlazado al grupo amino básico; y,
L2 y L3 se seleccionan independientemente de -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, y -(CH2)8- con el extremo derecho directamente enlazado al grupo amino básico.
8. El derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo de derivados de ácidos nucleicos peptídico proporcionado a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2;
(N^C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C)Benzoilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Metilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) n-Propilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) p-Toluenesulfonilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2;
(N^C) Fetoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Bencilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fenilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
) [N-(2-Feniletil)amino]carbonilo-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Benzoilo-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2;
) Fetoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N^C)Fetoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH2;
(N^C) Fetoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH2;
(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2;
(N^C) Fetoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2;
(N^C) Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N^C)Fetoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2;
(N^C)Fetoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N^C)Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N^C) Fetoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N^C)Fetoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2;
(N^C) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2; y
(N ^ C ) Fetoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2:
en donde,
A, G, T y C son monómeros de PNA con una nucleobase natural de adenina, guanina, timina y citosina, respectivamente;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) y G(pOq) son monómeros de PNA con una nucleobase no natural representada por la Fórmula VI, Fórmula Vil, Fórmula VIII, Fórmula IX y Fórmula X. respectivamente;
Figure imgf000055_0001
en donde,
p y q son números enteros; y,
las abreviaturas para los sustituyentes de los extremos N- y C-terminal se describen específicamente a continuación: "Fmoc-" es la abreviatura de "[(9-fluorenil)metiloxi]carbonil-"; "Fetoc-" de "[2-(9-fluorenil)etil-1-oxi]carbonilo"; "Ac-" de "acetil-"; "Benzoil-" de "bencenocabonil-"; "Piv-" de "pivalil-"; "Metil-" de "metil-"; "n-Propil-" de "1 -(n-propil)-"; "H-" de grupo "hidrido-"; "p-toluenosulfonilo" de "(4-metilbenceno)-1-sulfonil-"; "-Lys-" del residuo de aminoácido "lisina"; "-Val-" del residuo de aminoácido "valina"; "-Leu-" del residuo de aminoácido "leucina"; "-Arg-" del residuo de aminoácido "arginina", "-Gly-" del residuo de aminoácido "glicina"; "[N-(2-feniletil)amino]carbonil-" de "[N-1-(2-feniletil)amino]carbonil-"; "Bencil-" de "1-(fenil)metil-"; "Fenil-" de "fenil-"; "Me­ " de "metil-"; y "-NH2" para el grupo "-amino" no sustituido.
9. Una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana, que comprende el derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Una composición farmacéutica para tratar la hiperpigmentación, que comprende el derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. Un derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un método para tratar enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana, que comprende la administración de dicho derivado de ácido nucleico peptídico o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Un derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un método para tratar la hiperpigmentación, que comprende la administración de dicho derivado de ácido nucleico peptídico o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Un uso del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones que implican la expresión del gen de la tirosinasa humana.
14. Un uso del derivado de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hiperpigmentación.
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