KR102236495B1

KR102236495B1 - 티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR102236495B1
Application number: KR1020180084034A
Authority: KR
Inventors: 정다람; 박혜미; 한선영; 김소영
Original assignee: 올리패스 주식회사
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2021-04-06
Also published as: WO2019022434A1; KR20190011207A

Abstract

본 발명은 인간 티로시나아제 프리-mRNA의 3' 접합 부위를 타겟으로 하는 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 티로시나아제 mRNA의 접합부 변형체의 생성을 강력하게 유도하며, 국소 투여시 인간 티로시나아제 단백질을 수반하는 피부과적 징후 또는 질환을 안전하게 치료하는데 유용하다.

Description

티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드{TYROSINASE ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES}

본 발명은 티로시나아제에 의해 매개되는 피부 착색의 개선을 위한, 인간 티로시나아제 프리-mRNA를 상보적으로 타겟화하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이다.

멜라닌은 살아있는 유기체에서 생성되는 천연의 중합체성 흑갈색 색소를 지칭한다. 3가지 유형의 멜라닌, 즉 유멜라닌, 페오멜라닌 및 뉴로멜라닌이 존재한다. 유멜라닌 및 페오멜라닌은 피부에서 합성된다. 반면에, 뉴로멜라닌은 뇌에서 발견되는 멜라닌으로, 그의 생리학적 기능은 아직 밝혀지지 않았다.

피부 중의 멜라닌은 UV선(자외선)을 유효하게 흡수하며 자연광 중의 UV선(자외선)으로부터 동물을 보호한다. 따라서 일광 그을림 (sun tanning)은 동물들이 햇빛 중의 UV선으로부터 자신을 보호하는 자연적인 과정이다.

아미노산 티로신은 티로시나아제의 존재하에서 일련의 복잡한 반응에 따라 유멜라닌으로 합성된다. 유멜라닌은 5,6-디하이드록시인돌(DHI) 및 5,6-디하이드록시인돌-2-카복실산(DHICA)의 중합체를 지칭한다. 페오멜라닌은 티로신이 시스테인 또는 글루타치온의 존재하에서 티로시나아제에 의해 중합될 때 형성된다.

반응식 1은 유멜라닌 및 페오멜라닌의 생합성 중 TYR(티로시나아제), TYRP-1(티로시나아제-관련 단백질 1, 즉 DHICA 옥시다제) 및 TYRP-2(티로시나아제-관련 단백질 2, 즉 DOPA크롬 토오토머라제)를 수반하는 반응들을 요약한다 [Int . J. Mol . Sci. vol 10, 4066-4087 (2009)].

[반응식 1]

티로시나아제(TYR)가 피부에서 멜라닌 생합성에 중요한 역할을 함을 고려하여, TYR 억제제가 과도한 피부 착색, 즉 과색소침착을 감소시키기 위한 미용 성분으로서 사용되고 개발되어 왔다. TYR 억제제는 다수의 논문에서 멜라닌형성에 대한 그의 효과에 대해 고찰되었다 [Int . J. Cosmetic Sci . vol 33, 210-221 (2011); Int. J. Mol . Sci . vol 10, 2440-2475 (2009)].

하이드로퀴논(1,4-디하이드록시벤젠)이 수십년간 과색소침착의 국소 치료에 사용되어 왔다 [JAMA vol 194(9), 965-967 (1965)]. 하이드로퀴논은 티로시나아제의 활성 부위에 결합함으로써 TYR 활성을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 2006년에, 미국 FDA는 잠재적인 발암성을 비롯한 안전상의 우려로 인해 하이드로퀴논을 함유하는 모든 OTC(처방전 없이 살 수 있는) 제품의 사전 승인을 철회하였다. 하이드로퀴논은 티로시나아제를 포함하여 막지질 및 단백질을 손상시키는 ROS (reactive oxygen species: 반응성 산소종)를 유도한다. 막지질의 산화적 손상에 의해 멜라닌 세포는 영구적으로 제거된다.

알부틴(하이드로퀴논-O-β-D-글루코피라노시드)은 베어베리 식물로부터 추출한 글리코실화된 하이드로퀴논이다. 알부틴은 또한 밀 및 배 껍질에서 발견된다. 하이드로퀴논처럼 알부틴은 TYR의 활성 부위에 경쟁적으로 결합함으로써 멜라닌형성을 억제한다 [J. Pharmacol . Exp . Ther . vol 276(2), 765-769 (1996)]. 알부틴은 하이드로퀴논보다 멜라닌 세포에 대한 독성이 약하다.

데옥시알부틴은 알부틴의 합성 유도체이며, TYR 억제 활성에 있어서 하이드로퀴논 및 알부틴에 필적한다. 데옥시알부틴은, 하이드로퀴논보다 뿐만 아니라 알부틴보다도 세포독성이 약하다 [J. Dermatol . Sci . vol 55(3), 179-184 (2009)]. 데옥시알부틴은 12주 동안 국소적으로 치료된 인간 피실험자에서 피부 미백을 현저하게 개선시켰다 [Exp . Dermatol . vol 14(8), 601-608 (2005)].

코지산은 간장 및 사케, 즉 일본 청주의 제조를 위해 진균 발효 중 생성되는 킬레이트화제이다. 코지산은 식품 및 화장품에서 색상을 보존하거나 변화시키는데 사용되었다. 코지산은 TYR의 활성 부위 중 구리 이온에 킬레이트화하여 멜라닌 형성을 억제한다. 또한 DOPA크롬의 5,6-디하이드록시인돌-2-카복실산으로의 토오토머화를 억제한다 [J. Pharm . Pharmacol . vol 46(12), 982-985 (1994)]. 코지산은 기미의 치료에 널리 사용되었지만, 접촉 피부염, 민감화 및 홍반을 유발할 수 있다. [J. Drugs Dermatol . vol 6(1), 32-39 (2007)]

다양한 TYR 억제제들이 존재하지만, TYR에 대한 이들의 IC₅₀ 값은 대부분의 경우에 마이크로몰(μM)이다 [J. Enzyme Inhibition Med . Chem . vol 32(1), 403-425 (2017)]. 상기와 같은 IC₅₀ 값은, 그들의 분자 크기를 고려할 때 불충분한 것으로 간주되며, 다른 분자 타켓(들)과의 교차 반응 가능성을 일으킨다. 불충분한 억제 활성은 다량의 경피 용량으로 해석되기 때문에, 피부 착색에 대한 목적하는 경피 활성 및 또한 안전성을 충족시키기 위해서는 억제 효능의 현저한 개선이 필요하다.

프리 - mRNA :

유전 정보는 DNA(2-데옥시리보스 핵산)상에 실려있다. DNA는 전사되어 핵에서 프리-mRNA(프리-메신저 리보핵산)를 생성한다. 포유동물 프리-mRNA는 대개 엑손과 인트론으로 이루어지며, 엑손과 인트론은 하기에 도식적으로 제공되는 바와 같이 서로에 대해 상호-연결된다. 엑손 및 인트론을 하기 그림에 예시된 바와 같이 넘버링한다.

프리 - mRNA 구조의 도식적인 표현

프리 - mRNA 의 스플라이싱 (splicing: 이어맞추기 ): 프리-mRNA는 집합적으로 "스플라이싱 (이어맞추기)"이라 지칭되는 일련의 복잡한 반응에 의한 인트론의 삭제에 따라 mRNA로 변환된다(하기 그림에서 도식적으로 요약된다) [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol . Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol . Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].

스플라이싱 (이어맞추기)은 프리-mRNA와 스플라이싱 어댑터 인자간의 "스플라이스오솜 E 복합체"(즉 초기 스플라이스오솜 복합체)의 형성에 의해 개시된다. "스플라이스오솜 E 복합체"에서, U1은 엑손 N과 인트론 N의 접합부에 결합하고, U2AF³⁵는 인트론 N과 엑손(N+1)의 접합부에 결합한다. 따라서 엑손/인트론 또는 인트론/엑손의 접합부는 상기 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성에 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"는 U2와 추가적인 복합체 형성시 "스플라이스오솜 A 복합체"로 진화한다. 상기 "스플라이스오솜 A 복합체"는 일련의 복잡한 반응을 겪어 상기 인트론을 삭제시키거나 이어맞추기 제거하여(splice out) 이웃하는 엑손들을 연결시킨다.

리보솜의 단백질 합성: 단백질은 DNA(2-데옥시리보스 핵산)에 의해 암호화된다. DNA는 세포 자극에 응답하거나 또는 자발적으로 전사되어 핵에서 프리-mRNA(프리-메신저 리보핵산)를 생성시킨다. 프리-mRNA의 인트론들은 효소에 의해 이어맞추기 제거되어 mRNA(메신저 리보핵산)를 생성시키고, 이어서 상기 mRNA는 세포질로 이동된다. 세포질에서, 리보솜이라 지칭되는 번역 기구의 복합체가 mRNA에 결합하고 상기 복합체는 상기 mRNA를 따라 암호화된 유전 정보를 스캔함에 따라 단백질 합성을 수행한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)],

안티센스 올리고뉴클레오티드( ASO ): DNA, mRNA 및 프리-mRNA를 포함한 핵산에 서열 특이적인 방식으로(즉 상보적으로) 결합하는 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)라 칭한다.

ASO가 예를 들어 세포질 중의 mRNA에 결합하는 경우, 상기 ASO는 리보솜에 의한 상기 mRNA로부터의 단백질 합성을 억제할 수 있다. ASO는 그의 타겟 단백질의 리보솜 단백질 합성을 억제하기 위해서 상기 세포질내에 존재해야 한다.

안티센스의 스플라이싱 저해: ASO가 핵 중의 프리-mRNA에 강하게 결합하는 경우, 상기 ASO는 프리-mRNA의 mRNA로의 스플라이싱을 억제하거나 조절할 수 있다. ASO는 프리-mRNA의 mRNA로의 스플라이싱을 억제하거나 조절하기 위해서 핵내에 존재해야 한다. 상기와 같은 안티센스의 스플라이싱 저해는, 상기 ASO에 의해 타겟화된 엑손이 없는 mRNA 또는 mRNA들을 생성시킨다. 상기와 같은 mRNA(들)를 "스플라이스 변형체(들)"라 칭하며, 상기는 완전길이 mRNA에 의해 암호화되는 단백질보다 더 작은 단백질(들)을 암호화한다.

이론상으로, "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성의 억제에 의해 스플라이싱을 막을 수 있다. ASO가 (5' → 3') 엑손-인트론의 접합부, 즉 "5' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하는 경우, 상기 ASO는 프리-mRNA와 인자 U1간의 복합체 형성을 막고, 따라서 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 차단한다. 마찬가지로, ASO가 (5' → 3') 인트론-엑손의 접합부, 즉 "3' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하는 경우 "스플라이스오솜 E 복합체"는 형성될 수 없다.

3' 스플라이스 위치 및 5' 스플라이스 위치를 하기에 제공된 그림에 도식적으로 예시한다.

비천연 올리고뉴클레오티드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 내인성 뉴클레아제 (nuclease)에 의한 분해에 민감하여, 그의 치료학적 유용성이 제한된다. 지금까지, 많은 유형의 비천연(자연적으로 발생하지 않은) 올리고뉴클레오티드가 개발되었고 집중적으로 연구되어왔다[Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)]. 이들 중 일부는 DNA 및 RNA에 비해 연장된 대사안정성을 나타낸다. 몇몇 전형적인 비천연 올리고뉴클레오티드들의 화학 구조를 하기에 제공한다. 이 올리고뉴클레오티드들은 예상대로 DNA 또는 RNA처럼 상보성 핵산에 결합한다.

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(PTO)는 주쇄 포스페이트 산소 원자들 중 단량체당 하나가 하나의 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 상기와 같은 작은 구조 변화가 PTO를 뉴클레아제에 의한 분해에 비교적 내성으로 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].

PTO 및 DNA의 주쇄에서 구조 유사성에 비추어, 이들은 둘 다 대부분의 포유동물 세포 유형에서 세포막을 불충분하게 투과한다. 그러나, DNA의 수송체(들)를 풍부하게 발현하는 일부 유형의 세포의 경우, DNA 및 PTO는 양호한 세포 투과를 나타낸다. 전신 투여된 PTO는 간 및 신장에 쉽게 분배되는 것으로 공지되어 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].

시험관내에서 PTO의 세포 투과를 촉진하기 위해서, 리포펙션(lipofection)이 널리 실행되었다. 그러나, 리포펙션은 상기 세포막을 물리적으로 변경시키고, 세포독성을 유발하며, 따라서 장기적인 생체내 치료용으로는 이상적이지 않을 수 있다.

과거 30년에 걸쳐, 안티센스 PTO 및 PTO의 변형체들이 암, 면역학적 질환, 대사 질병 등의 치료에 임상적으로 평가되었다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)]. 상기와 같은 안티센스 약물 후보 중 다수는 부분적으로 PTO의 불충분한 세포 투과로 인해 성공적으로 개발되지 못했다. 상기 불충분한 세포 투과를 극복하기 위해서, PTO는 치료학적 활성을 위해 고용량으로 투여될 필요가 있다. 그러나, PTO는 혈액응고 시간증가, 보체 활성화, 요세관 신장병증(tubular nephropathy), 쿠퍼세포(Kupffer cell) 활성화, 및 비장종대(splenomegaly), 림프증식증(lymphoid hyperplasia), 단핵세포 침윤을 포함한 면역 자극을 포함한 용량-제한 독성과 관련되는 것으로 공지되어 있다 [Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . vol 33, 533-540 (2006)].

다수의 안티센스 PTO가, 간 또는 신장으로부터 현저하게 기인하는 질병에 합당한 임상적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포머센(Mipomersen)은, LDL 콜레스테롤 수송에 관련된 단백질인 apoB-100의 합성을 억제하는 PTO 유사체이다. 미포머센은 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 환자에서 임상 활성을 나타내었는데 이는, 간으로의 그의 우선적인 분배에 기인한 것으로 보인다 [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B)의 합성을 억제하는 PTO 안티센스 유사체이며, II형 당뇨병 환자에서 치료학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 [Curr . Opin . Mol . Ther . vol 6, 331-336 (2004)].

잠금 핵산: 잠금 핵산(LNA)에서, RNA의 주쇄 리보스 고리가 구조적으로 속박되어 있어 이로 인해 RNA 또는 DNA에 대한 결합 친화성이 증가된다. 따라서, LNA는 고 친화성 DNA 또는 RNA 유사체로서 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드: 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO)에서, DNA의 주쇄 포스페이트 및 2-데옥시리보스가 각각 포스포아미데이트 및 모르폴린으로 치환된다 [Appl . Microbiol . Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. 상기 DNA 주쇄는 음으로 하전되는 반면, 상기 PMO 주쇄는 하전되지 않는다. 따라서 PMO와 mRNA간의 결합은 상기 주쇄들간의 정전기적 반발이 없으며, DNA와 mRNA간의 결합보다 더 강한 경향이 있다. PMO는 DNA와 구조적으로 매우 상이하기 때문에, PMO는 DNA 또는 RNA를 인식하는 간 수송체(들)에 의해 인식되지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, PMO는 세포막을 쉽게 투과하지 못한다.

펩타이드 핵산: 펩타이드 핵산(PNA)은 단위 주쇄로서 N-(2-아미노에틸)글리신을 갖는 폴리펩타이드이며, 니엘센 박사(Dr. Nielsen)와 동료들에 의해 발견되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조 및 약어 명명법을 하기에 제공된 그림에 예시한다. DNA 및 RNA처럼, PNA도 또한 상보성 핵산에 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보성 핵산에의 결합에서, PNA의 N-말단은 DNA 또는 RNA의 "5'-단부"와 동등한 것으로 간주되고, PNA의 C-말단은 DNA 또는 RNA의 "3'-단부"와 동등한 것으로 간주된다.

PMO처럼, PNA 주쇄는 하전되지 않는다. 따라서 PNA와 RNA간의 결합은 DNA와 RNA간의 결합보다 더 강한 경향이 있다. PNA는 화학 구조에 있어서 DNA와 현저하게 상이하므로, PNA는 DNA를 인식하는 간 수송체(들)에 의해 인식되지 않을 것이며, DNA 또는 PTO와 상이한 조직 분포 프로파일을 나타낼 것이다. 그러나, PNA도 또한 포유동물 세포막을 불충분하게 투과한다 (Adv . Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).

PNA의 막 투과성을 개선시키도록 변형된 핵염기 : PNA는 양이온성 지질 또는 그의 균등물이 공유적으로 부착된 변형된 핵염기의 도입에 의해 포유동물 세포막에 고도로 투과성으로 되었다. 상기와 같은 변형된 핵염기의 화학 구조를 하기에 제공한다. 시토신, 아데닌 및 구아닌의 상기와 같은 변형된 핵염기는 각각 구아닌, 티민 및 시토신과 예상 가능하고 상보적으로 하이브리드화하는 것으로 밝혀졌다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].

PNA은, 상기와 같은 변형된 핵염기의 통합에 의해 리포펙션의 상황과 비슷하게 된다. 리포펙션에 의해, 포스페이트 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드 분자는 양이온성 지질 분자, 예를 들어 리포펙타민으로 둘러싸이며, 상기와 같은 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 네이키드(naked) 올리고뉴클레오티드 분자에 비해 다소 용이하게 막을 투과하는 경향이 있다.

상기 PNA 유도체는 양호한 막 투과성외에, 상보성 핵산에 대해 매우-강한 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 11- 내지 13-머 PNA 유도체상에 4 내지 5개의 변형된 핵염기의 도입은 상보성 DNA와의 듀플렉스 형성에서 20 ℃ 이상의 T_m 이득을 생성시켰다. 상기와 같은 PNA 유도체는 단일 염기 불일치에도 대단히 민감하다. 단일 염기 불일치는 PNA 서열뿐만 아니라 변형된 염기의 유형에 따라 11 내지 22 ℃의 T_m 손실을 생성시켰다.

작은 간섭 RNA( siRNA ): 작은 간섭 RNA(siRNA)는 20 내지 25 염기쌍의 이중가닥 RNA를 지칭한다 [Microbiol . Mol . Biol . Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥은 단백질 일부와 상호작용하여 "RNA-유도된 침묵 복합체"(RISC)를 형성한다. 이어서 상기 RISC는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보성인 mRNA의 어떤 부분에 결합한다. 상기 RISC와 복합체를 형성한 mRNA는 절단을 겪는다. 따라서 siRNA는 그의 타겟 mRNA의 절단을 촉매적으로 유도하며, 결과적으로 상기 mRNA에 의한 단백질 발현을 억제한다. 상기 RISC는 그의 타겟 mRNA내의 전체 상보성 서열에 항상 결합하는 것은 아니며, 이는 siRNA 치료법의 타겟-외 효과와 관련된 우려를 발생시킨다. DNA 또는 RNA 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드의 다른 부류들처럼, siRNA는 불충분한 세포 투과성을 가지며 따라서 양호한 막 투과성을 갖도록 적합하게 제형화되거나 화학적으로 변형되지 않는 한 불충분한 시험관내 또는 생체내 치료학적 활성을 나타내는 경향이 있다.

티로시나아제 siRNA : 인간 TYR mRNA내의 19-머 RNA 서열을 타겟화하는 TYR siRNA는 20 nM 농도와 리포펙션 조건에서 인간 표피 멜라닌세포(HEM) 중의 TYR mRNA 및 단백질의 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. siRNA는 상기 TYR mRNA 및 단백질을 하향조절하였지만, 티로시나아제 관련된 단백질 1 및 2의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 상기 siRNA는 UV 조사에 의해 유도된 멜라닌 형성을 억제하였다 [BMB Reports, vol 42(3), 178-183 (2009)].

마우스 TYR mRNA를 타겟화하도록 설계된 siRNA를, 40 nM 농도와 리포펙션 조건에서 상기 TYR mRNA 및 단백질의 발현 및 마우스 B16 흑색종 세포에서 멜라닌 형성을 억제하는 그의 능력에 대해 선별하였다. 가장 유효한 siRNA를 C57BL/6 마우스의 안구에 주입하였으며 망막에서 상기 TYR mRNA를 약 60%까지 억제함을 발견하였다 [Mol . Biol . International, vol 2010, Article ID 240472 (2010)].

공유 저작물에 TYR siRNA에 대한 예가 더 있다. 예를 들어, 한 종래 기술은 과색소침착의 치료를 위해 인간 TYR mRNA를 타겟화하는 siRNA를 개시하였다 [US 7504385]. 그러나, 상기와 같은 siRNA의 실용성은 과색소침착에 대한 용도의 경우 의심이 된다. siRNA는 제조하기에 비용이 너무 많이 들며, 그의 미용학적 사용이 제한되는 경향이 있다. 더욱이 상기는 양호한 사용자 순응도를 위해 경피 투여에 의해 피부로 전달되어야 할 필요가 있다. 경피 전달은 올리고뉴클레오티드 분야에서 거대한 기술적 도전이었음에 역점을 두어 다루어야 한다.

본 발명은 하기 화학식 I에 의해 나타내는 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

상기 식에서,

n은 10과 21 사이의 정수이고;

상기 화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

3') UGUACAGAUUGUCU]의 14-머 프리-mRNA 서열과 적어도 10-머 상보성 오버랩을 갖고;

상기 화학식 I의 화합물 전체가 인간 TYR 프리-mRNA에 완전히 상보성이거나, 또는 화합물 전체 중 하나 또는 2개의 불일치로 상기 인간 TYR 프리-mRNA에 부분적으로 상보성이고;

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n 은 독립적으로 듀테리도(deuterido), 하이드리도(hydrido), 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴 라디칼을 나타내고;

X 및 Y는 독립적으로 듀테리도, 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH₂-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH₂-C(=S)-], 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아실, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬설포닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴설포닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬포스포닐 라디칼, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴포스포닐 라디칼을 나타내고;

Z는 하이드리도, 하이드록시, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시, 치환되거나 또는 비치환된 아미노, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n 중 적어도 4개는 핵염기 부분에 공유 결합된 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 갖는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택된다.

상기 화학식 I의 화합물은 인간 TYR 프리-mRNA에서 "엑손 2"의 스키핑(skipping)을 유도하고, "엑손 2"가 없는 인간 TYR mRNA 스플라이스 변형체(들) [splice variant(s)]를 생성시키며, 따라서 상기 인간 TYR 프리-mRNA를 전사하는 유전자의 기능 활성을 억제하는데 유용하다.

"n은 10과 21 사이의 정수이다"라는 조건은 글자 그대로 n이 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 정수 그룹 중에서 선택될 수 있는 정수임을 의미한다.

상기 화학식 I의 PNA 유도체에서 천연 또는 비천연 핵염기의 화학 구조를 도 1a 내지 1c에 예시한다. 본 발명의 천연(즉 자연적으로 발생하는) 또는 비천연(자연적으로 발생하지 않는) 핵염기는 비제한적으로 도 1a 내지 1c에 제공된 핵염기를 포함한다. 상기와 같은 비천연 핵염기의 제공은 허용 가능한 핵염기의 다양성을 예시하기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

상기 화학식 I의 PNA 유도체를 기재하기 위해 채택된 치환체들을 도 2a 내지 2e에 예시한다. 도 2a는 치환되거나 또는 비치환된 알킬 라디칼에 대한 예를 제공한다. 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실 아릴아실 라디칼들을 도 2b에 예시한다. 도 2c는 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노, 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬설포닐 또는 아릴설포닐, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬포스포닐 또는 아릴포스포닐 라디칼에 대한 예를 예시한다. 도 2d는 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐 또는 아릴옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬 아미노카보닐 또는 아릴아미노카보닐 라디칼에 대한 예를 제공한다. 도 2e에서 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시티오카보닐, 및 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시티오카보닐 라디칼에 대한 예를 제공한다. 상기와 같은 예시적인 치환체들의 제공은 허용 가능한 치환체의 다양성을 예시하기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 당해 분야의 숙련가는 N-말단 또는 C-말단 중의 치환체들보다 올리고뉴클레오티드 서열이, 타겟 프리-mRNA 서열에의 올리고뉴클레오티드의 서열 특이적인 결합에 가장 중요한 인자임을 쉽게 이해할 수 있다.

상기 화학식 I의 화합물은 종래 기술에 예시된 바와 같이 상보성 DNA에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 상기 화학식 I의 PNA 유도체와 그의 완전길이 상보성 DNA 또는 RNA간의 듀플렉스는 수성 완충제 중에서 확실하게 측정하기에는 너무 높은 T_m 값을 갖는다. 상기 화학식 I의 PNA 화합물은 보다 짧은 길이의 상보성 DNA에 의해서도 높은 T_m 값을 생성시킨다.

상기 화학식 I의 화합물은 인간 TYR 프리-mRNA의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합한다 [NCBI Reference Sequence: NG_0008748]. 상기 [(5'

3') UGUACAGAUUGUCU]의 14-머 서열은 인간 TYR 프리-mRNA 중의 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 위치하며, "인트론 1"로부터의 7-머 및 "엑손 2"로부터의 7-머로 이루어진다. 따라서 상기 14-머 프리-mRNA 서열은 [(5'

3') uguacag┃AUUGUCU]로서 전통적으로 나타낼 수 있으며, 여기에서 상기 인트론 및 엑손 서열을 각각 "소" 및 "대" 문자로 제공하고, 상기 인트론-엑손 접합부는 "┃"에 의해 표시한다. 프리-mRNA에 대한 전통적인 표시는 인간 TYR 프리-mRNA 중의 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguuuuguacag┃AUUGUCUGUAGCCGA]의 30-머 서열로 추가로 예시된다. 또한, 상기 30-머 프리-mRNA 서열은 상기 인간 TYR 프리-mRNA내의 상기 화학식 I의 화합물에 의해 타겟화된 3' 스플라이스 위치를 명확하게 한정하지만, TYR 엑손의 넘버링을 달리할 수도 있다.

상기 화학식 I의 화합물은 인간 TYR 유전자로부터 전사된 인간 TYR 프리-mRNA의 타겟 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하며, 상기 화합물의 타겟 엑손을 수반하는 "스플라이스오솜 초기 복합체"의 형성을 방해한다. 본 발명의 화합물은 상기 "스플라이스오솜 초기 복합체"의 형성을 입체적으로 억제하기 때문에, TYR "엑손 2"를 이어맞추기 제거하여 "엑손 2"가 없는 TYR mRNA 스플라이스 변형체(들)를 생성시킨다. 결과적으로 본 발명의 화합물은 TYR "엑손 2"의 스키핑을 유도한다.

강한 RNA 친화성은 상기 화학식 I의 화합물이, 상기 PNA 유도체가 TYR 프리-mRNA 중의 타겟 3' 스플라이스 위치와 하나 또는 2개의 불일치를 갖는 경우에 조차, TYR "엑손 2"의 스키핑을 유도할 수 있게 한다. 또한 상기 화학식 I의 PNA 유도체는 표적 스플라이스 위치 중에 하나 또는 2개의 SNP(단일 뉴클레오티드 다형성)를 갖는 TYR 돌연변이 프리-mRNA 중에서도 TYR "엑손 2"의 스키핑을 여전히 유도할 수 있다.

상기 화학식 I의 화합물은 양호한 세포 투과성을 가지며 종래 기술에 예시된 바와 같은 "네이키드 (naked)" 올리고뉴클레오티드로서 세포로 쉽게 전달될 수 있다 [PCT/KR2009/001256]. 따라서 본 발명의 화합물은 TYR 프리-mRNA 중에서 "엑손 2"의 스키핑을 유도하며, "네이키드" 올리고뉴클레오티드로서 상기 화학식 I의 화합물로 처리된 세포 중에 TYR "엑손 2"가 없는 TYR mRNA 스플라이스 변형체(들)를 생성시킨다. 상기 화학식 I의 화합물은 세포에서 타겟 엑손의 스키핑을 효능 있게 유도하기 위해 세포내로의 전달을 위한 어떠한 수단이나 제형도 필요로 하지 않는다. 상기 화학식 I의 화합물은 펨토몰-이하의 농도에서도 "네이키드" 올리고뉴클레오티드로서 본 발명의 화합물로 처리된 세포에서 TYR "엑손 2"의 스키핑을 용이하게 유도한다.

양호한 세포 또는 막 투과성 덕분에, 상기 화학식 I의 PNA 유도체를 "네이키드" 올리고뉴클레오티드로서 국소적으로 투여하여 피부에서 TYR "엑손 2"의 스키핑을 유도할 수 있다. 상기 화학식 I의 화합물은 의도된 치료학적 또는 생물학적 활성을 위해 타겟 조직내로의 경피 전달을 증가시키기 위한 제형을 필요로 하지 않는다. 대개 상기 화학식 I의 화합물을 물 및 공-용매에 용해시키며, 피코몰 이하의 농도로 국소 또는 경피 투여하여 타겟 피부에서 목적하는 치료학적 또는 생물학적 활성을 이끌어낸다. 본 발명의 화합물은 상기 국소 치료 활성을 이끌어내기 위해 심하게 또는 침습적으로 제형화할 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 상기 화학식 I의 PNA 유도체를 국소 크림 또는 로션으로서 미용 성분 또는 보조제와 함께 제형화할 수 있다. 상기와 같은 국소적인 미용 크림 또는 로션은 안면 과색소침착의 치료에 유용할 수 있다.

상기 화학식 I의 화합물을 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기, 예를 들어 비제한적으로 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 염산, 메탄설폰산, 시트르산, 트리플루오로아세트산 등과 함께 사용할 수 있다.

상기 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 보조제, 예를 들어 비제한적으로 시트르산, 염산, 타타르산, 스테아르산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에탄올, 이소프로판올, 나트륨 비카보네이트, 증류수, 보존제(들) 등과 함께 대상 (subject)에게 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물을 1 aM 내지 1 nM 초과 범위의 치료학적으로 또는 생물학적으로 유효한 농도로 대상에게 국소 투여할 수 있으며, 상기 농도 범위는 투여 스케줄, 대상의 조건 또는 상황 등에 따라 변할 것이다.

바람직하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 10과 21 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

화학식 I의 화합물 전체가 인간 TYR 프리-mRNA에 완전히 상보성이거나, 또는 화합물 전체 중 하나 또는 2개의 불일치로 상기 인간 TYR 프리-mRNA에 부분적으로 상보성이고;

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 독립적으로 듀테리도 또는 하이드리도 라디칼을 나타내고;

X 및 Y는 독립적으로 듀테리도, 하이드리도, 포르밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아실, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아미노티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시티오카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬설포닐, 치환되거나 또는 비치환된 아릴설포닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬포스포닐 라디칼, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴포스포닐 라디칼을 나타내고;

Z가 하이드리도, 하이드록시, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시, 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n이 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n 중 적어도 4개가 하기 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ에 의해 나타내는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고:

[화학식 Ⅱ]

[화학식 Ⅲ]

[화학식 Ⅳ]

상기 식들에서,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 하이드리도, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

L₁, L₂ 및 L₃은 핵염기 부분에 염기성 아미노기를 공유 결합시키는 하기 화학식 V에 의해 나타내는 공유결합성 링커이고:

[화학식 V]

상기 식에서,

Q₁ 및 Q_m은 치환되거나 또는 비치환된 메틸렌(-CH₂-) 라디칼이고, Q_m은 상기 염기성 아미노기에 직접 결합되며;

Q₂, Q₃,

, Q_m _-1은 치환되거나 또는 비치환된 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 및 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼 [-N(H)-, 또는 -N(치환체)-] 중에서 독립적으로 선택되고;

m은 1과 15 사이의 정수이다.

중요하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 11과 18 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

화학식 I의 화합물 전체가 인간 TYR 프리-mRNA에 완전히 상보성이고;

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;

X 및 Y가 독립적으로 하이드리도, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아실, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴옥시카보닐 라디칼을 나타내고;

Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n 중 적어도 4개가 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ에 의해 나타내는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 하이드리도, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

Q₁ 및 Q_m이 치환되거나 또는 비치환된 메틸렌 라디칼이고, Q_m이 염기성 아미노기에 직접 결합되며;

Q₂, Q₃,

, Q_m _-1이 치환되거나 또는 비치환된 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

m은 1과 11 사이의 정수이다.

특히 중요하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 11과 16 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;

X 및 Y가 하이드리도, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

Q₁ 및 Q_m이 메틸렌 라디칼이고, Q_m이 염기성 아미노기에 직접 결합되며;

Q₂, Q₃,

, Q_m _-1이 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

m은 1과 9 사이의 정수이다.

매우 중요하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 11과 16 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;

Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

R₁, R₃, 및 R₅가 하이드리도 라디칼이고, R₂, R₄, 및 R₆이 독립적으로 하이드리도, 또는 치환되거나 또는 비치환된 알킬 라디칼을 나타내고;

Q₂, Q₃,

, Q_m _-1이 메틸렌, 산소 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

m은 1과 9 사이의 정수이다.

매우 더 중요하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 11과 16 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;

Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n이 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;

B₁, B₂,

, B_n _-1, 및 B_n 중 적어도 5개가 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ에 의해 나타내는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 하이드리도 라디칼이고;

Q₂, Q₃,

, Q_m _-1이 메틸렌, 및 산소 라디칼 중에서 독립적으로 선택되고;

m은 1과 9 사이의 정수이다.

가장 중요하게는 다음 조건의 화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

n이 11과 16 사이의 정수이고;

화학식 I의 화합물은, 인간 TYR 프리-mRNA 중에 [(5'

S₁, S₂,

, S_n _-1, S_n, T₁, T₂,

, T_n _-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;

X가 하이드리도 라디칼이고;

Y가 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐 라디칼을 나타내고;

Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;

B₁, B₂,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 하이드리도 라디칼이고;

L₁이 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, 또는 -CH₂-O-(CH₂)₅-를 나타내고, 이때 우측 단부가 염기성 아미노기에 직접 결합되며;

L₂ 및 L₃이 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, 및 -(CH₂)₈- 중에서 독립적으로 선택되고, 이때 우측 단부가 염기성 아미노기에 직접 결합된다.

특별히 중요하게는 하기에 제공된 화합물들의 그룹 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1O2)C-NH₂;

(N

C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH₂;

(N

C) Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH₂;

(N

C) Fethoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH₂;

(N

C) Fethoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH₂;

(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH₂;

(N

C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH₂;

(N

C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂;

(N

C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;

(N

C) Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH₂;

(N

C) Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;

(N

C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N

C) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N

C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH₂;

(N

C) Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH₂;

(N

C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH₂;

(N

C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH₂; 및

(N

C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH₂:

상기에서,

A, G, T, 및 C는 각각 아데닌, 구아닌, 티민 및 시토신의 천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체들이고;

C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)는 각각 하기 화학식 Ⅵ, 화학식 Ⅶ, 화학식 Ⅷ, 화학식 Ⅸ, 및 화학식 Ⅹ에 의해 나타내는 비천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체들이다:

[화학식 Ⅵ]

[화학식 Ⅶ]

[화학식 Ⅷ]

[화학식 Ⅸ]

[화학식 Ⅹ]

상기 식들에서,

p 및 q는 정수이고;

N- 및 C-말단 치환체들에 대한 약어는 하기와 같이 구체적으로 기재된 바와 같다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "Methyl-"은 "메틸-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; "-NH₂"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.

도 3은 A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)로서 약기된 PNA 단량체들에 대한 화학 구조를 집합적이고 명료하게 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 단량체로 인식된다. A(p) 및 A(p0q)는 "티민"과 상보결합하기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 단량체로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(p0q)는 "시토신"과 염기 짝을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 단량체로 인식된다.

도 4는 본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 명료하게 예시한다.

상기와 같은 PNA 유도체에 사용된 약어들을 예시하기 위해서, "(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂"로서 약기된 13-머 PNA 유도체의 화학 구조를 도 5a에 제공한다. 또 다른 예시로서, "(N

C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂"로서 약기된 15-머 PNA 유도체의 화학 구조를 도 5b에 제공한다.

도 5a에 명시된 "(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂"의 13-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'

3') CAG-ACA-ATC-TGT-A"의 DNA 서열과 동등하다. 상기 13-머 PNA는 인간 TYR 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguuuug uacag ┃ AUUGUCUG UAGCCGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 13-머 상보성 오버랩을 갖는다.

도 5b에 명시된 "(N

C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂"의 15-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'

3') AGA-CAA-TCT-GTA-CAA"의 DNA 서열과 동등하다. 상기 15-머 PNA는 인간 TYR 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguu uuguacag ┃ AUUGUCU GUAGCCGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 15-머 서열과 15-머 상보성 오버랩을 갖는다.

"(N

C) Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH₂"의 17-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'

3') ACT-GAC-TAT-CTG-TAC-AA"의 DNA 서열과 동등하다. 상기 17-머 PNA는 인간 TYR 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguu uuguacag ┃ AU "U" GUC "U" GU AGCCGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 15-머 서열과 15-머 상보성 오버랩을 갖는다. 두 개의 불일치에는 인용부호 ""로 표시하였습니다.

본 발명의 하나의 태양은, 본 발명에 따르는 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 티로시나아제 유전자의 발현을 수반하는 질병 또는 질환의 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 태양은, 본 발명에 따르는 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 과색소침착 치료용 조성물을 제공한다. 멜라닌 과다 생성에 의한 과색소침착의 예로서는, 흑반 (melasma), 여드름 흉터 (acne scarring), 갈색 기미 (liver spots), 주근깨 (freckle), 검버섯 (age spots) 및 화학 선 손상 (actinic damage) 등이 포함된다.

본 발명의 하나의 태양은, 본 발명에 따르는 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여, 인간 티로시나아제 유전자의 발현을 수반하는 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 여기에서 투여는 예를 들면 국소 투여 경로를 이용할 수 있다.

본 발명의 하나의 태양은, 본 발명에 따르는른 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여, 과색소침착을 치료하는 방법을 제공한다. 여기에서 투여는 예를 들면 국소 투여 경로를 이용할 수 있다.

도 1a-1c. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 대해 선택 가능한 천연 또는 비천연 (변형된) 핵염기들의 예.
도 2a-2e. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 대해 선택 가능한 치환체들의 예.
도 3. 천연 또는 변형된 핵염기를 갖는 PNA 단량체의 화학 구조들.
도 4. N- 또는 C-말단 치환체의 약어들에 대한 화학 구조.
도 5a. 13-머 PNA 유도체 "(N

C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂"의 화학 구조.
도 5b. 15-머 PNA 유도체 "(N

C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂"의 화학 구조.
도 6. 본 발명의 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc-PNA 단량체의 화학 구조.
도 7a-7b. 각각 HPLC 정제 전 및 후의 "ASO 1"의 C₁₈-역상 HPLC 크로마토그램.
도 8. C₁₈-RP 프렙 HPLC에 의해 정제된 "ASO 1"의 ESI-TOF 질량 스펙트럼.
도 9a. 0(음성 대조용), 1, 10 또는 1,000 aM "ASO 1M"로 처리된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 네스티드(nested) PCR 산물의 전기영동 분석.
도 9b. 엑손(2-3)의 스키핑에 지정될 수 있는 PCR 산물에 대한 상거(Sanger) 서열분석 데이터.
도 10a. 0(음성 대조용), 1, 10, 100 또는 1,000 aM의 "ASO 1M"로 처리된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 완전길이 TYR mRNA 수준의 변화 (표준 오차에 의한 오차 막대).
도 10b. 0 zM(음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 또는 10 aM(즉 10,000 zM)의 "ASO 1M"로 24시간 동안 처리된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 TYR 웨스턴 블럿 데이터.
도 11. 1, 10, 100 또는 1,000 aM의 "ASO 1M", 또는 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 알부틴으로 처리된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 멜라닌 함량의 변화 (표준 오차에 의한 오차 막대).
도 12. 0 zM(음성 대조용), 1 zM, 100 zM 또는 10 aM의 "ASO 1"로 처리된 인간 1차 상피 멜라닌 세포에서 qPCR에 의한 완전길이 TYR mRNA 수준의 변화 (표준 오차에 의한 오차 막대).

PNA 올리고머의 제조를 위한 일반적인 과정

PNA 올리고머를 약간의, 그러나 합당한 변형과 함께 종래 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 개시된 방법에 따라 Fmoc-화학에 기반한 고상 펩타이드 합성(SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드(PCAS BioMatrix Inc.)(캐나다 퀘백 소재)로부터 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스(H-Rink Amide-ChemMatrix)였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체를 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 또는 약간 변형시켜 합성하였다. 변형된 핵염기를 갖는 상기와 같은 Fmoc-PNA 단량체 및 천연 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체를 사용하여 본 발명의 PNA 유도체들을 합성하였다. PNA 올리고머를 C₁₈-역상 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올)에 의해 정제하고 ESI/TOF/MS를 포함한 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.

반응식 2는 상기 연구의 SPPS에서 채택된 전형적인 단량체 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. 반응식 2의 각 반응 단계를 하기와 같이 간략하게 제공한다.

[반응식 2]

[H-링크-켐매트릭스 수지의 활성화]

1.5 ㎖의 20% 피페리딘/DMF 중의 상기 켐매트릭스 수지 0.01 mmol(약 20 ㎎ 수지)을 20분 동안 리브라(libra) 튜브에서 와동시키고, 상기 DeFmoc 용액을 여과하였다. 상기 수지를 1.5 ㎖ 염화 메틸렌(MC), 1.5 ㎖ 디메틸포름아미드(DMF), 1.5 ㎖ MC, 1.5 ㎖ DMF, 및 1.5 ㎖ MC로 각각 30초 동안 연속해서 세척하였다. 상기 고체 지지체상에 생성되는 유리 아민에 Fmoc-PNA 단량체 또는 Fmoc-보호된 아미노산 유도체와의 커플링을 수행하였다.

[DeFmoc]

상기 수지를 1.5 ㎖의 20% 피페리딘/DMF 중에서 7분 동안 와동시키고, 상기 DeFmoc 용액을 여과하였다. 상기 수지를 1.5 ㎖ MC, 1.5 ㎖ DMF, 1.5 ㎖ MC, 1.5 ㎖ DMF, 및 1.5 ㎖ MC로 각각 30초 동안 연속해서 세척하였다. 상기 고체 지지체상에 생성되는 유리 아민에 Fmoc-PNA 단량체와의 커플링을 즉시 수행하였다.

[Fmoc-PNA 단량체와의 커플링]

상기 고체 지지체상의 유리 아민을 하기와 같이 Fmoc-PNA 단량체와 커플링시켰다. 0.04 mmol의 PNA 단량체, 0.05 mmol HBTU, 및 10 mmol DIEA를 1 ㎖ 무수 DMF 중에서 2분 동안 배양하고 유리 아민이 있는 수지에 가하였다. 상기 수지 용액을 1시간 동안 와동시키고 반응 매질을 여과하였다. 이어서 상기 수지를 1.5 ㎖ MC, 1.5 ㎖ DMF, 및 1.5 ㎖ MC로 연속해서 각각 30초 동안 세척하였다. 본 발명에 사용된 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체의 화학 구조를 도 6에 제공한다. 상기 도 6에 제공된 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체들은 예로서 간주되어야 하며, 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안 된다. 당해 분야의 숙련가는 화학식 I의 PNA 유도체를 합성하기 위한 Fmoc-PNA 단량체 중의 다수의 변화들을 쉽게 이해할 수 있다.

[캡핑]

상기 커플링 반응에 따라, 반응하지 않은 유리 아민을 1.5 ㎖ 캡핑 용액(DMF 중의 5% 아세트산 무수물 및 6% 2,6-류티딘) 중에서 5분간 진탕시킴으로써 캡핑하였다. 이어서 상기 캡핑 용액을 여과하고 1.5 ㎖ MC, 1.5 ㎖ DMF, 및 1.5 ㎖ MC로 연속해서 각각 30초 동안 세척하였다.

[N-말단 중에 "Fethoc-" 라디칼의 도입]

"Fethoc-" 라디칼을, 염기성 커플링 조건하에서 상기 수지상의 유리 아민을 "Fethoc-OSu"와 반응시킴으로써 N-말단에 도입시켰다. "Fethoc-OSu" [CAS No. 179337-69-0, C₂₀H₁₇NO₅, MW 351.36]의 화학 구조는 하기와 같이 제공된다.

[수지로부터 분리]

상기 수지에 결합된 PNA 올리고머를 1.5 ㎖의 분리 용액(트리플루오로아세트산 중의 2.5% 트리이소프로필실란 및 2.5% 물) 중에서 3시간 동안 진탕시킴으로써 상기 수지로부터 분리시켰다. 상기 수지를 여과하고 여액을 감압하에서 농축시켰다. 생성 잔사를 디에틸에테르로 처리하고 생성되는 침전물을 여과하여 수집한 다음 역상 HPLC로 정제하였다.

[HPLC 분석 및 정제]

수지로부터의 분리에 이어서, PNA 유도체의 조 생성물을, 0.1% TFA를 함유하는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올(구배 방법)을 용리제로 사용하여 C₁₈-역상 HPLC로 정제하였다. 도 7a 및 7b는 각각 HPLC 정제 전후의 "ASO 1"에 대한 예시적인 HPLC 크로마토그램이다. "ASO 1"의 올리고머 서열은 표 1에 제공된 바와 같다.

화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 실시예

인간 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 타겟화하기 위해서, 본 발명의 PNA 유도체를 상기에 제공된 합성 과정에 따라 또는 이를 약간 변형시켜 제조하였다. 상기 인간 TYR 프리-mRNA를 타겟화하는 상기와 같은 PNA 유도체의 제공은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위한 것이며, 이를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

인간 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 타겟화하는 PNA 유도체들 및 이들의 질량 분광분석법에 의한 구조 특성화 데이터
PNA 예	PNA 서열(N → C)	정확한 질량, m/z
PNA 예	PNA 서열(N → C)	theor.^a	obs.^b
ASO 1	Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂	4258.96	4260.99
ASO 2	Fethoc-AC(1O2)A-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-TA(5)C(1O2)-AA(5)-NH₂	5532.55	5532.54
ASO 3	Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1O2)C-NH₂	4592.11	4592.11
^a)이론상 정확한 질량, ^b)관측된 정확한 질량

표 1은 인간 TYR 유전자 [NCBI 참조 서열: NG_0008748]로부터 판독된 인간 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 타겟화하는 PNA 유도체들과 이들의 질량 분광분석법에 의한 구조 특성화 데이터를 제공한다. 표 1의 TYR ASO들의 제공은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위한 것이며, 이를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

"ASO 1"은 인간 TYR 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguuuug uacag ┃ AUUGU - CUG UAGCCGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 13-머 상보성 오버랩을 갖는다. 따라서 "ASO 1"은 상기 인간 TYR 프리-mRNA 내에 "인트론 1"과의 5-머 오버랩 및 "엑손 2"와의 8-머 오버랩을 갖는다.

표 2는 마우스 게놈 DNA [NCBI 참조 서열: NC_000073으로부터 입수되었다]로부터 판독된 마우스 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 타겟화하는 "ASO 1M" 및 그의 질량 분광분석법에 의한 구조 특성화 데이터를 제공한다. "ASO 1M"의 제공은 마우스 기원의 세포에서 안티센스 활성을 평가하기 위한 것이다.

마우스 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 타겟화하는 PNA 유도체들 및 이들의 질량 분광분석법에 의한 구조 특성화 데이터
PNA 예	PNA 서열(N → C)	정확한 질량, m/z
		theor.^a	obs.^b
ASO 1M	Fethoc-CA(5)A-A(5)TG-A(5)TC(1O2)-TG(6)T-G-NH₂	4289.95	4289.96
^a)이론상 정확한 질량, ^b)관측된 정확한 질량

마우스 TYR 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 엑손 2의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') aauuguuuuucacag│AUCAUUUGUAGCAGA]의 30-머 RNA 서열을 마우스 TYR 유전자 [NCBI 수납 번호: NC_000073]로부터 판독하였다.

"ASO 1M"은 상기 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 (5'

3') CAA-ATG-ATC-TGT-G"의 DNA 서열과 동등하다. "ASO 1M"은 마우스 TYR 프리-mRNA 중의 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') aauuguuuuu cacag │ A UCAUUUG UAGCAGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 13-머 상보성 오버랩을 갖는다.

인간 TYR 프리-mRNA에 대한 "ASO 1"처럼, "ASO 1M"은 마우스 TYR 프리-mRNA 내에 "인트론 1"과의 5-머 오버랩 및 "엑손 2"와의 8-머 오버랩을 갖는다. "ASO 1M"은 인간 기원의 세포에서 "ASO 1"의 안티센스 활성에 대한 양호한 대용 화합물로서 작용할 수 있다.

도 7a는 "ASO 1"의 조 생성물에 대해 획득된 HPLC 크로마토그램이다. 상기 조 생성물을 C₁₈-RP 분취 HPLC에 의해 정제시켰다. 도 7b는 "ASO 1"의 정제된 생성물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. "ASO 1"의 순도는 상기 분취 HPLC 정제에 따라 현저하게 개선되었다. 도 8은 "ASO 1"의 정제된 생성물에 대해 획득된 ESI-TOF 질량 스펙트럼을 제공한다. "ASO 1"에 대한 분석 데이터의 제공은 화학식 I의 PNA 유도체를 본 발명에서 어떻게 정제하고 확인하는 가를 예시하기 위한 것이며, 이를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

상보성 DNA에 대한 모델 PNA 유도체의 결합 친화성

표 1 및 2에서 PNA 유도체들을, N-말단 또는 C-말단을 상보적으로 타겟화하는 10-머 DNA에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 상기 결합 친화성을 PNA와 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대한 T_m 값에 의해 평가하였다. 상기 PNA 유도체와 완전 상보성 DNA간의 듀플렉스는 수성 완충액 중에서 확실하게 측정하기에 너무 높은 T_m 값을 나타내는데, 그 이유는 상기 완충액이 상기 T_m 측정 중에 비등하는 경향이 있기 때문이다.

T_m 값을 하기와 같이 UV/Vis 분광계상에서 측정하였다. 15 ㎖ 폴리프로필렌 팔콘 튜브 중의 4 ㎖ 수성 완충제(pH 7.16, 10 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM NaCl) 중의 4 μM PNA 올리고머 및 4 μM 상보성 10-머 DNA의 혼합 용액을 1분 동안 90 ℃에서 유지하고 실온으로 서서히 냉각시켰다. 이어서 상기 용액을 기밀식 뚜껑이 구비된 3 ㎖ 석영 UV 큐벳으로 옮기고, 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에 기재된 바와 같이 또는 약간 변형시켜 UV/가시 분광광도계상에서 260 ㎚에서 T_m 측정을 수행하였다. T_m 측정을 위한 10-머 상보성 DNA를 바이오니어(Bioneer)(www.bioneer.com, 대한민국 대전 소재)로부터 구입하고 추가의 정제 없이 사용하였다.

화학식 I의 PNA 유도체의 관찰된 T_m 값은 10-머 DNA에의 상보성 결합의 경우 매우 높으며, 이를 표 3에 제공한다. 예를 들어, "ASO 1"은 [(N

C) Fethoc- CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-T G(6)T-A(5)-NH₂]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같은 PNA 중의 N-말단 10-머를 타겟화하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 78.0 ℃의 T_m 값을 나타내었다. 반면에, "ASO 1"은 [(N

C) Fethoc-CA(5)G- ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5) -NH₂]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같은 PNA 중의 C-말단 10-머를 타겟화하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 73.0 ℃의 T_m 값을 나타내었다.

PNA의 N-말단 또는 C-말단을 타겟화하는 10-머 상보성 DNA와 PNA간의 T_m 값들
PNA	T_m 값, ℃
PNA	N-말단에 대한 10-머 DNA	C-말단에 대한 10-머 DNA
ASO 1	78.0	73.0
ASO 1M	72.0	72.0

화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성들에 대한 실시예

본 발명에서 PNA 유도체를 B16F10 마우스 흑색종 세포 및 인간 멜라닌세포에서 시험관내 TYR 안티센스 활성에 대해 평가하였다. 생물학적 실시예를 화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 프로파일을 예시하기 위한 예로서 제공하였으며, 따라서 이를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

실시예 1. "ASO 1M"에 의해 유도된 엑손 스키핑

표 2에 명시된 "ASO 1M"은 마우스 TYR 프리-mRNA 중의 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') aauuguuuuu cacag │ AUCAUUUG UAGCAGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 13-머 상보성 오버랩을 갖는다. 반면에, "ASO 1M"은 인간 TYR 프리-mRNA 중의 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 접합부에 걸쳐 있는 [(5'

3') ggguguuuug"u" acag ┃ AU "UG" U "C" UG UAGCCGA]의 30-머 RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같은 4개의 불일치와 함께 9-머 상보성을 갖는다. 상기 4개의 불일치는 따옴표(" ")로 표시되었다.

비록 "ASO 1M"이 인간 TYR 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치와 4개의 불일치를 갖지만, 마우스 B16F10 흑색종 세포에서 TYR "엑손 2"의 스키핑을 유도하는 "ASO 1M"의 능력에 대해 평가하였다. "ASO 1M"(마우스 TYR 프리-mRNA에 완전히 상보성이다)은 "ASO 1"(인간 TYR 프리-mRNA에 완전히 상보성이다)에 대한 양호한 대용 화합물로서 작용할 수 있다.

[세포 배양 & ASO 처리]

B16F10 마우스 흑색종 세포(Cat. Number CRL-6475, ATCC)를 10% FBS, 1% 스트렙토마이신/페니실린, 및 0.01 ㎎/㎖ 소 인슐린이 보충된 DMEM(둘베코의 변형된 이글스 필수 최소 배지)에서 유지시켰다. 5 ㎖ DMEM을 함유하는 60 ㎜ 배양 디쉬에서 증식된 B16F10 세포를 0(음성 대조용), 1, 10, 100 또는 1000 aM의 "ASO 1M"과 5시간 동안 배양하였다.

[RNA 추출 & 1-단계 PCR에 의한 cDNA 합성]

5시간 동안의 배양에 이어서, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트(Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'

3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; 및 엑손 4_역방향: (5'

3') AGAGC-GGTATGAAAGGAA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄(Platinum)(등록상표) Taq 폴리머라제(Cat. No. 10928-042, 인비트로젠(Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script)(등록상표) 원 스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 ㎕ 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 52 ℃ 30초 및 72 ℃ 40초.

[네스티드 PCR 증폭]

1 ㎕의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 1n_순방향: (5'

3') GAGAACTAACTGGGGATGA; 및 엑손 4n_역방향: (5'

3') CGATAGGTGCATTGGCTT]의 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95 ℃ 5분에 이어서 30 주기의 95 ℃ 30초, 52 ℃ 30초 및 72 ℃ 40초.

[엑손 스키핑 생성물의 확인]

상기 PCR 산물에, 2% 아가로스 젤상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 상거(Sanger) 서열분석에 의해 분석하였다.

도 9a는 상기 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공한다. "AS0 1M" 처리가 없는 세포는, 2개의 강한 PCR 밴드, 완전길이 TYR mRNA에 대한 하나, 및 엑손 2 및 3이 없는 스플라이스 변형체 TYR mRNA에 대한 다른 하나를 생성시켰다. 따라서 상기 엑손 2-3의 스키핑은 자발적으로 발생하는 것으로 생각된다. 그러나, 1 내지 1,000 aM의 "ASO 1M"로 처리된 세포는 오직 엑손 2 및 3이 없는 스플라이스 변형체 TYR mRNA만을 생성시켰다. 따라서 "ASO 1M"은 B16F10 흑색종 세포에서 엑손 2-3 스키핑의 경향을 증가시킨다. 상기 엑손 스키핑 PCR 산물은 도 9b에 도시된 바와 같이 엑손 2-3의 스키핑인 것으로 서열분석되었다.

실시예 2. "ASO 1M"로 처리된 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 TYR mRNA에 대한 qPCR.

"ASO 1M"을 하기에 기재하는 바와 같이 B16F10 세포에서 마우스 TYR mRNA 수준의 변화를 유도하는 그의 능력에 대해 TYR 네스티드 qPCR에 의해 평가하였다.

[세포 배양 & ASO 처리]

5 ㎖ DMEM을 함유하는 60 ㎜ 배양 디쉬에서 증식된 B16F10 세포를 0(음성 대조용), 1, 10, 100 또는 1000 aM의 "ASO 1M"로 처리하였다 (용량당 2개의 배양 디쉬).

[RNA 추출 & 1-단계 PCR에 의한 cDNA 합성]

5시간 동안 "ASO 1M"과의 배양에 이어서, 전체 RNA를 제조사의 설명에 따라 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트"(Cat. No. 9767, 타카라)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5'

3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; 및 엑손 4_역방향: (5'

3') AGAGCGGTATGAAAGGAA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원 스텝 RT-PCR 키트(인비트로젠, 미국 소재)를 사용하여 25 ㎕ 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 52 ℃ 30초 및 72 ℃ 40초.

[네스티드 qPCR 증폭]

cDNA 용액을 100배까지 희석하고, 1 ㎕의 각각 희석된 PCR 산물에, 하기의 주기 조건에 따라 엑손 2 및 엑손 3의 접합부에 걸쳐 있는 Taqman 탐침 세트(Cat. No. Mm00495818_m1, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로 20 ㎕ 실시간 PCR 반응을 수행하였다: 95 ℃ 3분에 이어서 30 주기의 95 ℃ 10초, 및 60 ℃ 30초.

[통계학적 분석]

상기 네스티드 qPCR 실험을 독립적으로 4회 반복하고, 각 실험으로부터의 개별적인 mRNA 수준을 "ASO 1M" 처리가 없는 mRNA 수준에 대해 표준화하였다. 상기 4개의 별도의 실험 전부로부터 획득된 mRNA 수준을, 스튜던츠 t-검정에 의한 통계학적 분석을 위해 모았다. 이와 같이하여 상기 RNA 샘플의 수는 농도당 8개이다.

도 10a는 상기에서 모은 qPCR 데이터를 제공하며, 여기에서 완전길이 mRNA 수준은 1 내지 1,000 aM의 "ASO 1M"로 처리된 세포에서 약 40%까지 현저하게 감소하였다.

실시예 3. "ASO 1M"에 의한 B16F10 흑색종 세포에서 TYR 단백질 발현의 억제.

"ASO 1M"을 하기에 기재하는 바와 같이 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 TYR 단백질 발현을 하향 조절하는 그의 능력에 대해 평가하였다.

5 ㎖ DMEM을 함유하는 60 ㎜ 배양 디쉬에서 증식된 B16F10 세포를 0 zM(음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 또는 10 aM의 "ASO 1M"으로 처리하였다. 24시간 후에, 세포를 저온 PBS(포스페이트 완충된 염수)로 2회 세척하고, 이어서 1X 프로테아제 억제제 칵테일(Cat. No. P8340, 시그마(Sigma))이 보충된 200 ㎕ 1X 세포 용해 완충제(Cat. No. 9803, 셀 시그널링 테크(Cell Signaling Tech))에 의한 용해를 수행하였다. 1.5 ㎖ e-튜브 중의 200 ㎕의 각 용해물을 100 ㎕ 5X 샘플 완충제와 혼합하고 100 ℃에서 5분 동안 비등시켰다. 20 ㎕의 상기 용해물에, 4 내지 15% 구배 TGX 젤(Cat No. 456-1086, 바이오 래드(Bio-Rad))상에서 전기영동 분리를 수행하고, 0.45 ㎛ PVDF 멤브레인상에서 단백질 전달을 수행하였다. 상기 멤브레인을 항-TYR 항체(Cat. No. 9319, 셀 시그널링 테크) 및 항-β-액틴 항체(Cat. No. a3845, 시그마)로 탐침 조사하였다(probed).

도 10b는 B16F10 세포에서의 TYR 단백질 발현에 대한 웨스턴 블럿 데이터를 제공한다. TYR 발현의 밴드 강도는 "ASO 1M" 처리가 없는 용매물, 즉 음성 대조용에서보다 "AS0 1M" 처리한 용해물에서 상당히 더 약하였다. 상기 TYR 단백질 및 mRNA 수준은 상기 ASO 처리에 의해 필적하게 감소하였다 ("실시예 2" 참조).

실시예 4. "ASO 1M"에 의한 B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌 형성의 억제

"ASO 1M"을 하기 기재한 바와 같이 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 멜라닌 형성을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다.

5 ㎖ DMEM을 함유하는 60 ㎜ 배양 디쉬에서 계대-배양된 B16F10 세포를 무처리(음성 대조용), 1 내지 1,000 aM의 "ASO 1M", 또는 양성 대조용으로서 10 또는 100 ㎍/㎖ 알부틴으로 처리하였다 (용량당 2개의 배양 디쉬). 24시간 후에, 세포를 저온 PBS로 2회 세척하고, 200 ㎕ 1N NaOH로 용해시켰다. 각 용해물을 1.5 ㎖ e-튜브에 수집하고, 실온에서 밤새 유지시켰다. 각 용해물 중의 멜라닌 함량을 ELISA 판독기상에서 475 ㎚에서 흡광도에 의해 측정하였다. 동일한 실험을 상이한 계대의 세포를 사용하여 4회 반복하였다. 4개의 멜라닌 함량 데이터 세트를, 처리 없는 멜라닌 함량(음성 대조용)에 대한 스튜던츠 t-검정에 의한 통계학적 분석을 위해 모았다.

도 11은 "ASO 1M" 또는 알부틴과 24시간 배양에 따른 B16F10 세포 중의 멜라닌 함량의 변화를 요약한다. 상기 멜라닌 함량은 각각 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 알부틴으로 처리된 세포에서 약 15% 및 25%까지 현저하게 감소하였다. "ASO 1M"로 처리된 세포의 경우에, 상기 멜라닌 함량은 높은 용량 의존성 없이 약 15%까지 현저하게 감소하였다. "ASO 1M"의 억제 활성은 10 ㎍/㎖ 알부틴의 경우에 필적하였다.

실시예 5. 화학식 I의 화합물을 함유하는 국소 크림의 제조

화학식 I의 화합물, 예를 들어 "ASO 2"를 대상 (subject)에게 국소 적용하기 위한 크림으로서 제형화하였다. 상기 국소 크림은 하기에 기재하는 바와 같은 제제였다. 다수의 다양한 국소 크림들이 존재할 수 있음을 고려하면, 상기 제제는 일례로서 간주되어야 하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

[용액 A의 제조]

비이커에서, 탈이온수(196 g), EDTA 이나트륨(0.06 g), 글리세린(15 g), 디프로필렌 글리콜(30 g), 페녹시에탄올(0.9 g), 에틸헥실글리세린(0.9 g), 하이드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체(2.4 g), 및 1 nM의 "ASO 2" 수용액(0.3 ㎖)을 혼합하였다. 상기 혼합물을 호모믹서를 사용하여 70 내지 75 ℃에서 균질화시켰다.

[용액 B의 제조]

또 다른 비이커에서, 70 내지 75 ℃에서 세테아릴 에틸헥사노에이트(12 g), 디메티콘(6 g), 스테아르산/수소화된 식물성 오일/베헤닐 알콜/세테아릴 알콜(15 g), 부티로스페르뮴 파르키이(쉬어) 버터(9 g), 및 폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트/글리세릴 스테아레이트 SE/메틸 글루코스 세스퀴스테아레이트(6 g)를 혼합하였다.

[국소 크림의 제조]

"용액 A" 및 "용액 B"를 호모 믹서를 사용하여 7,200 rpm 및 70 내지 75 ℃에서 3분 동안 혼합하고 균질화시켰다. 상기 혼합물을 실온으로 서서히 냉각시켜 1 pM의 "ASO 2"를 함유하는 국소 크림을 생성시켰다.

실시예 6. "ASO 1"로 처리된 인간 멜라닌세포 중의 TYR mRNA에 대한 qPCR

표 1에 명시된 "ASO 1"은 [(5'

3') ggguguuuug uacag ┃ AUUGUCUG UAGCCGA]의 30-머 인간 TYR 프리-mRNA 서열에 "진하게" "밑줄 그어" 표시한 바와 같은 인간 TYR 중의 인트론 1 및 엑손 2의 접합부에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보성인 13-머 TYR ASO이다.

"ASO 1"을 하기와 같이 인간 1차 상피 멜라닌세포에서 TYR mRNA 수준의 변화를 유도하는 그의 능력에 대해 TYR 네스티드 qPCR에 의해 평가하였다.

[세포 배양 & ASO 처리]

1차 상피 멜라닌세포(Cat. Number PCS-200-013, ATCC)를 성인 멜라닌세포 성장 키트 성분(Adult Melanocyte Growth Kit Component)(Cat. Number PCS-200-042, ATCC)이 보충된 피부세포 기초 배지(Dermal Cell Basal Medium)(Cat Number PCS-200-030, ATCC)에서 유지시켰다. 5 ㎖ 배양 배지를 함유하는 60 ㎜ 배양 디쉬에서 증식된 멜라닌세포를 0 zM(음성 대조용), 1 zM, 100 zM, 또는 10 aM의 "ASO 1"로 처리하였다 (농도당 3개의 배양 디쉬).

[RNA 추출 & 1-단계 PCR에 의한 cDNA 합성]

5시간 동안 "ASO 1"과의 배양에 이어서, 전체 RNA를 "RNeasy 미니 키트"(Cat. Number 74106, 퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형에, 하기의 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향(2): (5'

3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; 및 엑손 5_역방향: (5'

3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄(등록상표) Taq 폴리머라제(Cat. No. 10928-042, 인비트로젠)를 갖는 슈퍼 스크립트(등록상표) 원 스텝 RT-PCR 키트를 사용하여 25 ㎕ 역전사 반응을 수행하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 50 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.

[네스티드 qPCR 증폭]

1 ㎕의 cDNA를 a Taqman 탐침 [(5'

3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN- AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]에 대한 [엑손 2n_순방향: (5'

3') GATAAAGCTGCCAATTTC; 및 엑손 3n_역방향: (5'

3') TTGTGCATGCTGCTTTGA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다. 주기 조건: 95 ℃ 3분에 이어서 40 주기의 95 ℃ 10초, 및 60 ℃ 30초.

도 12는 상기 qPCR 데이터를 제공하며, 여기에서 완전길이 TYR mRMA 수준은 1 zM 내지 10 aM의 "ASO 1"로 처리된 인간 멜라닌 세포에서 약 30%까지 감소하였다. 관측된 감소는 1 zM 및 10 aM의 "ASO 1"로 처리된 세포에서 유의수준이었다(스튜던츠 t-검정).

SEQUENCE LISTING <110> Jung, Daram Park, HyeMi Han, Seon-Young Kim, Soyoung <120> Tyrosinase antisense oligonucleotides <130> 2018op101pct & 2018dp103 <150> KR10-2017-0093605 <151> 2017-07-24 <150> KR10-2017-0167558 <151> 2017-12-07 <160> 38 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 1 cngacnatnt ntn 13 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 2 anngncantc tnnc 14 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Acetylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 3 cngacnatnt ntn 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Acetylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 4 cngacnatnt ntn 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Acetylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 5 cngacnatnt ntn 13 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Mono-alkylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 6 cngacnatnt ntn 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Mono-alkylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 7 cngacnatnt ntn 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 8 cngacnatnt ntn 13 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Sulfonylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 9 cngacnatnt ntn 13 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Acetylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 10 cngacnatnt ntn 13 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Acetylated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> modified base <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> modified base <400> 11 cngacnatnt ntn 13 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human tyrosinase targetted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> PNA modified oligonucleotide <220> 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Claims

하기 화학식 I에 의해 나타내는 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]

상기 식에서,
n은 10과 21 사이의 정수이고;
상기 화학식 I의 화합물은, 인간 티로시나아제 프리-mRNA 중에 [(5'
3') UGUACAGAUUGUCU]의 14-머 프리-mRNA 서열과 적어도 10-머 상보성 오버랩을 갖고;
상기 화학식 I의 화합물 전체가 인간 티로시나아제 프리-mRNA에 완전히 상보성이고;
S₁, S₂,
, S_n-1, S_n, T₁, T₂,
, T_n-1, 및 T_n 은 하이드리도(hydrido) 라디칼을 나타내고;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 치환되거나 또는 비치환된 아릴아실, 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐, 치환되거나 또는 비치환된 알킬아미노카보닐, 또는 치환되거나 또는 비치환된 아릴설포닐 라디칼을 나타내고;
Z는 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;
B₁, B₂,
, B_n-1, 및 B_n은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;
B₁, B₂,
, B_n-1, 및 B_n 중 적어도 4개가 하기 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ에 의해 나타내는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고:

상기 화학식 II, III 및 IV 중에서,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 하이드리도 라디칼이고;
L₁, L₂ 및 L₃은 핵염기 부분에 염기성 아미노기를 공유 결합시키는 하기 화학식 V에 의해 나타내는 공유결합성 링커이고:
[화학식 V]

상기 식에서,
Q₁ 및 Q_m은 메틸렌(-CH₂-) 라디칼이고, Q_m은 상기 염기성 아미노기에 직접 결합되며;
Q₂, Q₃,
, Q_m-1은 메틸렌과 산소(-O-) 중에서 독립적으로 선택되고;
m은 1과 15 사이의 정수이다.
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제 1 항에 있어서, 다음의 조건의 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
n이 11과 16 사이의 정수이고;
화학식 I의 화합물은, 인간 티로시나아제 프리-mRNA 중에 [(5'
3') UGUACAGAUUGUCU]의 14-머 프리-mRNA 서열과 적어도 10-머 상보성 오버랩을 갖고;
화학식 I의 화합물 전체가 인간 티로시나아제 프리-mRNA에 완전히 상보성이고;
S₁, S₂,
, S_n-1, S_n, T₁, T₂,
, T_n-1, 및 T_n이 하이드리도 라디칼이고;
X가 하이드리도 라디칼이고;
Y가 치환되거나 또는 비치환된 알킬아실, 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬옥시카보닐 라디칼을 나타내고;
Z가 치환되거나 또는 비치환된 아미노 라디칼을 나타내고;
B₁, B₂,
, B_n-1, 및 B_n이 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;
B₁, B₂,
, B_n-1, 및 B_n 중 적어도 5개가 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ에 의해 나타내는 비천연 핵염기 중에서 독립적으로 선택되고;
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆이 하이드리도 라디칼이고;
L₁이 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₂-, -CH₂-O-(CH₂)₃-, -CH₂-O-(CH₂)₄-, 또는 -CH₂-O-(CH₂)₅-를 나타내고, 이때 우측 단부가 염기성 아미노기에 직접 결합되며;
L₂및 L₃이 -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₇-, 및 -(CH₂)₈- 중에서 독립적으로 선택되고, 이때 우측 단부가 염기성 아미노기에 직접 결합된다.
제 1 항에 있어서,
하기에 제공된 펩타이드 핵산 유도체들의 그룹 중에서 선택된 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
(N
C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N
C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH₂;
(N
C) Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;
(N
C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH₂;
(N
C) Fethoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH₂;

(N
C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH₂;
(N
C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH₂;
(N
C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂;
(N
C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;

(N
C) Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;
(N
C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N
C) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;
(N
C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH₂;
(N
C) Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH₂;
(N
C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH₂;
(N
C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH₂;
(N
C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH₂; 및
(N
C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-TA(5)C(1O2)-AA(5)-NH₂:
상기에서,
A, G, T, 및 C는 각각 아데닌, 구아닌, 티민 및 시토신의 천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체들이고;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)는 각각 하기 화학식 Ⅵ, 화학식 Ⅶ, 화학식 Ⅷ, 화학식 Ⅸ, 및 화학식 Ⅹ에 의해 나타내는 비천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체들이다:
[화학식 Ⅵ]

[화학식 Ⅶ]

[화학식 Ⅷ]

[화학식 Ⅸ]

[화학식 Ⅹ]

상기 식들에서,
p 및 q는 정수이고;
N- 및 C-말단 치환체들에 대한 약어는 하기와 같이 구체적으로 기재된 바와 같다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "Methyl-"은 "메틸-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; "-NH₂"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
제 1 항에 따른 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 티로시나아제 유전자의 하향 조절에 의한, 과도한 피부 착색의 치료용 조성물.
제 1 항에 따른 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 과도한 멜라닌 형성에 의한 과색소침착의 치료용 조성물.
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