CN110831958A - 酪氨酸酶反义寡核苷酸 - Google Patents
酪氨酸酶反义寡核苷酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110831958A CN110831958A CN201880043566.9A CN201880043566A CN110831958A CN 110831958 A CN110831958 A CN 110831958A CN 201880043566 A CN201880043566 A CN 201880043566A CN 110831958 A CN110831958 A CN 110831958A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- substituted
- unsubstituted
- formula
- misc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 title description 84
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title description 84
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 title description 84
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 title description 61
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 title description 61
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 65
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 58
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 58
- -1 hydrogen radicals Chemical class 0.000 claims description 48
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 23
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N Protium Chemical compound [1H] YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N 0.000 claims description 19
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 19
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 18
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 17
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 17
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 208000000069 hyperpigmentation Diseases 0.000 claims description 12
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 claims description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 11
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims description 11
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 10
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical group [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000005100 aryl amino carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000004685 alkoxythiocarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004457 alkyl amino carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004391 aryl sulfonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004682 aminothiocarbonyl group Chemical group NC(=S)* 0.000 claims description 4
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000005251 aryl acyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 2
- 125000001145 hydrido group Chemical group *[H] 0.000 claims description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 claims 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 3
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 67
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 101100101271 Homo sapiens TYR gene Proteins 0.000 description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 22
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 13
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960000271 arbutin Drugs 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101100101272 Mus musculus Tyr gene Proteins 0.000 description 7
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 7
- 230000036564 melanin content Effects 0.000 description 7
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N kojic acid Chemical compound OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004705 kojic acid Drugs 0.000 description 4
- WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N kojic acid Natural products OC(=O)C(N)CN1C=CC(=O)C(O)=C1 WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 229940100611 topical cream Drugs 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- GFBCWCDNXDKFRH-UHFFFAOYSA-N 4-(oxan-2-yloxy)phenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OC1OCCCC1 GFBCWCDNXDKFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 3
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- SGNZYJXNUURYCH-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydroxyindole Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC2=C1NC=C2 SGNZYJXNUURYCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YFTGOBNOJKXZJC-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid Chemical compound OC1=C(O)C=C2NC(C(=O)O)=CC2=C1 YFTGOBNOJKXZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 206010008570 Chloasma Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010015847 Non-Receptor Type 1 Protein Tyrosine Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 102100033001 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000005257 alkyl acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004670 alkyl amino thio carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- TZRFSLHOCZEXCC-HIVFKXHNSA-N chembl2219536 Chemical compound N1([C@H]2C[C@@H]([C@H](O2)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2CO)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP(O)(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP(O)(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP(O)(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H]([C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OCCOC)SP(O)(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP(O)(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OCCOC)SP(O)(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP(O)(=O)OC[C@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)C=C(C)C(N)=NC1=O TZRFSLHOCZEXCC-HIVFKXHNSA-N 0.000 description 2
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N docosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SHZIWNPUGXLXDT-UHFFFAOYSA-N ethyl hexanoate Chemical compound CCCCCC(=O)OCC SHZIWNPUGXLXDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108091060283 mipomersen Proteins 0.000 description 2
- 229960004778 mipomersen Drugs 0.000 description 2
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 150000005208 1,4-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 124177-85-1 Chemical class NP(=O)=O UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- OMIGHNLMNHATMP-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl prop-2-enoate Chemical compound OCCOC(=O)C=C OMIGHNLMNHATMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 3-O-methyl-D-glucose Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 0.000 description 1
- ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 3-ethylnonane-1,2,3-triol Chemical compound CCCCCCC(O)(CC)C(O)CO ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014970 Ephelides Diseases 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010064503 Excessive skin Diseases 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 1
- 241000408529 Libra Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101000608782 Mus musculus Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSDRAZIPGVLSNP-UHFFFAOYSA-N O.P(=O)(O)(O)O.O.O.P(=O)(O)(O)O Chemical group O.P(=O)(O)(O)O.O.O.P(=O)(O)(O)O WSDRAZIPGVLSNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 206010064127 Solar lentigo Diseases 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000003892 Vaccinium erythrocarpum Species 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 241001135917 Vitellaria paradoxa Species 0.000 description 1
- LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N a805044 Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.OC1=CC=C(O)C=C1 LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001769 aryl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229940082500 cetostearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008278 cosmetic cream Substances 0.000 description 1
- 239000008341 cosmetic lotion Substances 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940008099 dimethicone Drugs 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N dipropylene glycol Chemical compound OCCCOCCCO SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229960000735 docosanol Drugs 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000000039 epithelial melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229940049294 glyceryl stearate se Drugs 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008172 hydrogenated vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003574 melanophore Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 231100000175 potential carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 229940057910 shea butter Drugs 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003419 tautomerization reaction Methods 0.000 description 1
- OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N tetratriacontyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100617 topical lotion Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010014402 tyrosinase-related protein-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
- C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
- C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
- C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/333—Modified A
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/336—Modified G
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/33—Alteration of splicing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
提供了靶向人酪氨酸酶mRNA前体的3'剪接位点的肽核酸衍生物。肽核酸衍生物在细胞中有效诱导人酪氨酸酶mRNA的剪接变体，并且可用于在局部施用时安全地治疗涉及人酪氨酸酶蛋白的皮肤病适应症或状况。
Description
技术领域
本发明涉及互补靶向人酪氨酸酶mRNA前体以改善酪氨酸酶介导的皮肤色素沉着的肽核酸衍生物。
背景技术
黑色素统指在生物体内产生的深色天然和聚合色素。黑色素有三种类型，即，真黑素、褐黑素和神经黑色素。真黑素和褐黑素在皮肤中合成。同时，神经黑色素是在脑中发现的黑色素，其生理功能尚待阐明。
皮肤中的黑色素可有效吸收UV(紫外线)，并在自然阳光下保护动物免受UV(紫外线)照射。因此，晒黑是动物可以保护自己免受日光下UV照射的自然过程。
在酪氨酸酶存在下，一系列复杂反应后，氨基酸酪氨酸会聚合成真黑素。真黑素是指5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)的聚合物。当酪氨酸在半胱氨酸或谷胱甘肽存在下被酪氨酸酶聚合时，会形成褐黑素。
方案1总结了在真黑素和褐黑素生物合成过程中涉及TYR(酪氨酸酶)、TYRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1，即DHICA氧化酶)和TYRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2，即DOPAchrome互变异构酶)的反应。[Int.J.Mol.Sci.vol 10,4066-4087(2009)]
方案1
鉴于酪氨酸酶(TYR)在皮肤黑色素生物合成中起着核心作用，因此TYR抑制剂已被用作或开发为化妆品成分，以减少过度皮肤色素沉着，即色素沉着过度。几篇文章综述了TYR抑制剂对黑素生成的作用。[Int.J.Cosmetic Sci.vol 33,210-221(2011)；Int.J.Mol.Sci.vol 10,2440-2475(2009)]
氢醌(1,4-二羟基苯)已被用于局部治疗色素沉着过度数十年。[JAMA vol 194(9)，965-967(1965)]。已知氢醌通过与酪氨酸酶的活性位点结合来抑制TYR活性。2006年，由于安全隐患(包括潜在致癌性)，美国FDA撤销了所有含氢醌的OTC(非处方药)产品的先前批准。氢醌诱导ROS(活性氧)破坏膜脂和包括酪氨酸酶的蛋白质。膜脂的氧化损伤永久剥夺了黑素细胞。
熊果苷(氢醌-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)是从熊果植物中提取的糖基化氢醌。在小麦和梨皮中也发现了熊果苷。像氢醌一样，熊果苷通过竞争性结合TYR的活性位点抑制黑素生成。[J.Pharmacol.Exp.Ther.vol 276(2),765-769(1996)]熊果苷对黑素细胞的细胞毒性比氢醌低。
脱氧熊果苷是熊果苷的合成衍生物，并且在TYR抑制活性方面与氢醌和熊果苷相当。脱氧熊果苷对黑素细胞的细胞毒性也比熊果苷和氢醌低。[J.Dermatol.Sci.vol55(3),179-184(2009)]。脱氧熊果素可显著改善局部治疗12周的人类受试者的皮肤亮度。[Exp.Dermatol.vol 14(8),601-608(2005)]
曲酸是在真菌发酵过程中产生的螯合剂，用于生产酱油和清酒，即日本米酒。曲酸已被用于保存或改变食品和化妆品的颜色。曲酸与TYR活性位点的铜离子螯合以抑制黑素生成。它还抑制了DOPAchrome向5,6-二羟基吲哚-2-羧酸的互变异构化。[J.Pharm.Pharmacol.vol 46(12),982-985(1994)]。尽管曲酸可以引起接触性皮炎、致敏和红斑，但已广泛用于治疗黄褐斑。[J.Drugs Dermatol.vol 6(1),32-39(2007)]
尽管存在多种TYR抑制剂，但它们在大多数情况下对TYR的IC50值为微摩尔(μM)。[J.Enzyme Inhibition Med.Chem.vol 32(1),403-425(2017)]考虑到它们的分子大小，这种IC50值被认为很差，并增加了与其他分子靶交叉反应性的可能性。由于不良的抑制活性转化为大的经皮剂量，因此抑制效力需要显著提高以满足对皮肤色素沉着和安全性的所需的经皮活性。
mRNA前体：遗传信息携带在DNA(2-脱氧核糖核酸)上。DNA被转录以在细胞核中产生mRNA前体(前信使核糖核酸)。哺乳动物mRNA前体通常由外显子和内含子组成，并且外显子和内含子相互连接，如下图所示。外显子和内含子的编号如下图所示。
mRNA前体结构的示意图
mRNA前体的剪接：内含子缺失后，通过一系列复杂反应将mRNA前体加工成mRNA，这些反应统称为“剪接”，如下图总结图示。[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；NatureRev.Mol.Cell Biol.6(5),386-398(2005)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.15(2),108-121(2014)]
通过在mRNA前体与剪接衔接子因子之间形成“剪接体E复合体”(即早期剪接复合体)来启动剪接。在“剪接体E复合体”中，U1结合到外显子N和内含子N的连接处(junction)，而U2AF35结合到内含子N和外显子(N+1)的连接处。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接处对于早期剪接体复合体的形成至关重要。与U2进一步复合后，“剪接体E复合体”演变为“剪接体A复合体”。“剪接体A复合体”经历一系列复杂反应以缺失或剪接掉内含子以连接相邻外显子。
核糖体蛋白质合成：蛋白质由DNA(2-脱氧核糖核酸)编码。响应于细胞刺激或自发地，DNA被转录以在细胞核中产生mRNA前体(前信使核糖核酸)。酶促剪接掉mRNA前体的内含子以产生mRNA(信使核糖核酸)，然后将其转移到细胞质中。在细胞质中，称为核糖体的翻译机制复合体与mRNA结合，并在扫描沿mRNA编码的遗传信息时进行蛋白质合成。[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Cancer Res.vol 48,2659-2668(1988)]
反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)与包括DNA、mRNA和mRNA前体的核酸结合的寡核苷酸称为反义寡核苷酸(ASO)。
例如，如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，则ASO可能能够抑制沿mRNA的核糖体蛋白质合成。ASO需存在于细胞质中以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白质合成。
剪接的反义抑制：如果ASO与细胞核中的mRNA前体紧密结合，则ASO可能能够抑制或调节mRNA前体剪接为mRNA。ASO需存在于细胞核内以抑制或调节mRNA前体剪接为mRNA。这种对剪接的反义抑制产生了一个或多个缺少ASO靶向外显子的mRNA。这种mRNA被称为“剪接变体”，并且编码的蛋白小于全长mRNA编码的蛋白。
原则上，可以通过抑制“剪接体E复合体”的形成来中断剪接。如果ASO紧密结合(5'→3')外显子-内含子的连接处，即“5'剪接位点”，则ASO阻断mRNA前体与因子U1之间的复合体形成，从而阻断“剪接体E复合体”的形成。同样，如果ASO紧密结合(5'→3')内含子-外显子的连接处，即“3'剪接位点”，则不能形成“剪接体E复合体”。
在下面提供的附图中示意性地示出了3'剪接位点和5'剪接位点。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易被内源核酸酶降解，从而限制了其治疗用途。迄今为止，已经开发并深入研究了许多类型的非天然(天然非存在的)寡核苷酸。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]与DNA和RNA相比，其中一些具有更强的代谢稳定性。以下提供了一些代表性非天然寡核苷酸的化学结构。此类寡核苷酸可预测与互补核酸结合，就像DNA或RNA一样。
硫代磷酸酯寡核苷酸：硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)是一种DNA类似物，每个单体中的一个主链磷酸氧原子被硫原子置换。如此小的结构变化使PTO相对耐核酸酶降解。[Ann.Rev.Biochem.vol 54,367-402(1985)]
反映出PTO和DNA主链的结构相似性，它们在大多数哺乳动物细胞类型中均难以穿透细胞膜。但是，对于某些类型的大量表达DNA转运蛋白的细胞，DNA和PTO表现出良好的细胞穿透性。已知全身给药的PTO易于分布到肝脏和肾脏。[Nucleic Acids Res.vol 25,3290-3296(1997)]
为促进PTO在体外的细胞穿透，脂转染已被普遍采用。但是，脂转染会物理性地改变细胞膜、引起细胞毒性，因此对于长期的体内治疗用途不是理想的。
在过去30年中，已经对反义PTO和PTO变体进行了临床评估，以治疗癌症、免疫学失调、代谢性疾病等。[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]部分由于PTO的细胞穿透性差，因此许多这种反义候选药物尚未成功开发。为克服不良的细胞穿透性，需要以高剂量施用PTO以达到治疗活性。但是，已知PTO与剂量限制性毒性有关，包括增加的凝血时间、补体激活、肾小管肾病、库普弗细胞激活和免疫刺激，包括脾肿大、淋巴样增生、单个核细胞浸润。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]
已发现许多反义PTO对肝脏或肾脏有重要贡献的疾病显示出适当的临床活性。Mipomersen是一种PTO类似物，其抑制apoB-100(一种参与LDL胆固醇转运的蛋白质)的合成。Mipomersen在动脉粥样硬化患者中表现出适当的临床活动，这最可能是由于其优先分布于肝脏。[Circulation vol 118(7),743-753(2008)]ISIS-113715是一种PTO反义类似物，抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的合成，并且发现在II型糖尿病患者中显示出治疗活性。[Curr.Opin.Mol.Ther.vol 6,331-336(2004)]
锁定核酸：在锁定核酸(LNA)中，RNA的主链核糖环在结构上受到限制，以增加对RNA或DNA的结合亲和力。因此，LNA可以被认为是高亲和力DNA或RNA类似物。[Biochemistryvol 45,7347-7355(2006)]
磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸：在磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)中，DNA的主链磷酸和2-脱氧核糖分别被磷酸酰胺和吗啉置换。[Appl.Microbiol.Biotechnol.vol 71,575-586(2006)]虽然DNA主链带负电，但PMO主链不带电。因此，PMO和mRNA之间的结合在主链之间没有静电排斥，倾向于比DNA和mRNA之间的结合更强。由于PMO与DNA在结构上非常不同，因此识别DNA或RNA的肝转运蛋白将不会识别PMO。但是，PMO不能轻易穿透细胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)是一种以N-(2-氨基乙基)甘氨酸为单位主链的多肽，由Nielsen博士及其同事发现。[Science vol 254,1497-1500(1991)]PNA的化学结构和缩写命名在下面提供的附图中示出。像DNA和RNA一样，PNA也选择性结合互补核酸。[Nature(London)vol 365,566-568(1992)]与互补核酸结合时，PNA的N端被认为是等同于DNA或RNA的“5'端”，而PNA的C端等同于DNA或RNA的“3'端”。
与PMO一样，PNA主链不带电。因此，PNA和RNA之间的结合倾向于比DNA和RNA之间的结合更强。由于PNA在化学结构上与DNA明显不同，因此PNA不会被识别DNA的肝转运蛋白识别，并且会显示出不同于DNA或PTO的组织分布谱。但是，PNA也很难穿透哺乳动物细胞膜。(Adv.Drug Delivery Rev.vol 55,267-280,2003)
改进PNA的膜通透性的修饰的核碱基：通过引入具有与其共价连接的阳离子脂质或其等同物的修饰的核碱基，可以使PNA对哺乳动物细胞膜是高渗透性的。在下面提供这种修饰的核碱基的化学结构。发现胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的这种修饰的核碱基分别可预测地和互补地与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶杂交。[PCT申请号PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253]
将这种修饰的核碱基掺入PNA模拟脂转染的情况。通过脂转染，具有磷酸酯主链的寡核苷酸分子被阳离子脂质分子如lipofectamine包裹，并且与裸露的寡核苷酸分子相比，这种lipofectamine/寡核苷酸复合体倾向于相当容易地穿透膜。
除了良好的膜渗透性外，还发现这些PNA衍生物对互补核酸具有超强的亲和力。例如，在11-聚体至13-聚体PNA衍生物中引入4至5个修饰的核碱基在互补DNA的双链体形成中容易产生20℃或更高的Tm增益。这样的PNA衍生物对单个碱基错配高度敏感。单个碱基错配导致Tm损失11至22℃，取决于修饰碱基的类型以及PNA序列。
小干扰RNA(siRNA)：小干扰RNA(siRNA)是指20-25个碱基对的双链RNA。[Microbiol.Mol.Biol.Rev.vol 67(4),657-685(2003)]siRNA的反义链以某种方式与蛋白质相互作用以形成“RNA诱导的沉默复合体”(RISC)。然后，RISC结合与siRNA反义链互补的mRNA的某一部分。与RISC复合的mRNA发生裂解。因此，siRNA催化诱导其靶mRNA的裂解，并因此抑制通过该mRNA的蛋白质表达。RISC并不总是与其靶mRNA内的完全互补序列结合，这引起了与siRNA治疗的脱靶作用有关的担忧。像其他类别具有DNA或RNA主链的寡核苷酸一样，siRNA的细胞渗透性差，因此除非适当配制或化学修饰以具有良好的膜渗透性，否则往往倾向表现出较差的体外或体内治疗活性。
酪氨酸酶siRNA：发现靶向人TYR mRNA中的19-聚体RNA序列的TYR siRNA在20nM脂转染后抑制人表皮黑素细胞(HEM)中TYR mRNA和蛋白的表达。所述siRNA下调TYR mRNA和蛋白，但不影响酪氨酸酶相关蛋白1和2的表达。所述siRNA抑制UV辐射诱导的黑素生成。[BMBReports,vol 42(3),178-183(2009)]
筛选设计用于靶向小鼠TYR mRNA的siRNA的抑制TYR mRNA和蛋白质表达的能力，以及在40nM脂转染后在小鼠B16黑色素瘤细胞中抑制黑素生成的能力。将最有效的siRNA注射到C57BL/6小鼠的眼球中并发现可抑制视网膜中TYR mRNA约60％。[Mol.Biol.International,vol 2010,Article ID 240472(2010)]
发明内容
要解决的问题
在公共领域有更多TYR siRNA的实例。例如，现有技术公开了靶向人TYRmRNA以治疗色素沉着过度的siRNA。[US7504385]然而，此类siRNA的实用性对于用于色素沉着过度是有疑问的。siRNA的生产成本太高，其美容用途往往受到限制。此外，它们需要通过透皮施用被递送到皮肤中以实现良好的使用者依从性。应当解决的是，透皮递送一直是寡核苷酸领域中的巨大技术挑战。
问题的解决方案
本发明提供了式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
[式I]
其中，
n为10至21之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人TYR mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基、氢基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氘基、氢[H]基、甲酰基[H-C(＝O)-]、氨基羰基[NH2-C(＝O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(＝S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；以及
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基的非天然核碱基。
式I的化合物诱导在人TYR mRNA前体中跳过(skipping)“外显子2”，产生缺少“外显子2”的人TYR mRNA剪接变体，因此可用于抑制转录人TYR mRNA前体的基因的功能活性。
“n是10到21之间的整数”的条件从字面上意味着n是可选自11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数组中的整数。
式I的PNA衍生物中天然或非天然核碱基的化学结构在图1a-1c中举例说明。本发明的天然(即天然存在的)或非天然(天然非存在的)核碱基包含但不限于图1a-1c中提供的核碱基。提供这种非天然核苷碱基是为了说明容许的核碱基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。
用于描述式I的PNA衍生物的取代基在图2a-2e中举例说明。图2a提供了取代或未取代的烷基的实例。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的烷基酰基芳基酰基在图2b中举例说明。图2c示出了取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基或芳基磺酰基以及取代或未取代的烷基膦酰基或芳基膦酰基的实例。图2d提供了取代或未取代的烷氧基羰基或芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基或芳基氨基羰基的实例。在图2e中提供了取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基以及取代或未取代的芳氧基硫代羰基的实例。提供这种示例取代基是为了说明容许的取代基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易地理解，相对于在N端或C端的取代基，寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶mRNA前体序列的序列特异性结合的主要因素。
如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所例示的，式I的化合物与互补DNA紧密结合。式I的PNA衍生物与其全长互补DNA或RNA之间的双链体具有太高的Tm值，以致于不能在水性缓冲液中可靠地测定。式I的PNA化合物与较短长度的互补DNA产生高Tm值。
式I的化合物与人TYR mRNA前体的“外显子2”的3'剪接位点互补结合。[NCBI参考序列：NG_0008748][(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]的14-聚体序列跨越人TYRmRNA前体中“内含子1”和“外显子2”的连接处，并由来自“内含子1”的7-聚体和来自“外显子2”的7-聚体组成。因此，14-聚体mRNA前体序列通常可表示为[(5'→3')uguacag┃AUUGUCU]，其中内含子和外显子序列分别以“小写”和“大写”字母提供，而内含子外显子连接处用“┃”表示。mRNA前体的常规表示形式由30-聚体序列[(5'→3')ggguguuuuguacag┃AUUGUCUGUAGCCGA]进一步说明，该序列跨越人TYRmRNA前体中的“内含子1”和“外显子2”的连接处。另外，尽管可以另外报道TYR外显子的编号，但是30-聚体mRNA前体序列明确地定义了在人TYR mRNA前体内式I化合物靶向的3'剪接位点。
式I的化合物与从人TYR基因转录的人TYR mRNA前体的靶3'剪接位点紧密结合，并干扰涉及该化合物靶外显子的“剪接体早期复合体”的形成。由于本发明的化合物在空间上抑制“剪接体早期复合体”的形成，因此剪接掉TYR“外显子2”以产生缺乏“外显子2”的TYRmRNA剪接变体。因此，本发明的化合物诱导跳过TYR“外显子2”。
即使当PNA衍生物与TYR mRNA前体中的靶3'剪接位点具有一或两个错配时，强RNA亲和力也可以使式I的化合物诱导跳过TYR“外显子2”。类似地，式I的PNA衍生物仍可诱导在靶剪接位点具有一个或两个SNP(单核苷酸多态性)的TYR突变体mRNA前体中跳过TYR“外显子2”。
式I的化合物具有良好的细胞渗透性并且可以容易地作为“裸”寡核苷酸递送到细胞中，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所例示的。因此，本发明的化合物在TYRmRNA前体中诱导跳过“外显子2”，并在用式I化合物作为“裸”寡核苷酸处理的细胞中产生缺少TYR“外显子2”的TYR mRNA剪接变体。式I的化合物不需要任何手段或制剂用于递送到细胞中以有效诱导细胞中跳过靶外显子。式I的化合物在亚飞摩尔浓度下容易地诱导用本发明化合物作为“裸”寡核苷酸处理的细胞中跳过TYR“外显子2”。
由于良好的细胞或膜渗透性，式I的PNA衍生物可以作为“裸”寡核苷酸局部施用以在皮肤中诱导跳过TYR“外显子2”。式I的化合物不需要为预期的治疗或生物学活性而增加透皮递送至靶组织的制剂。通常，将式I的化合物溶于水和助溶剂中，并以亚皮摩尔浓度局部或透皮施用以在靶皮肤中引起所需的治疗或生物学活性。不需要大量或侵入性地配制本发明的化合物以引起局部治疗活性。然而，式I的PNA衍生物可以与化妆品成分或佐剂一起配制成局部乳膏或洗剂。这样的局部美容霜或洗剂可用于处理面部色素沉着过度。
式I的化合物可以与药学上可接受的酸或碱联合使用，所述酸或碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。
可以将式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的佐剂联合施用给受试者，所述佐剂包括但不限于柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。
本发明的化合物可以以1aM至高于1nM的治疗或生物学有效浓度局部施用于受试者，该浓度将根据给药方案、受试者的状况或情况等而变化。
优选的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为10至21之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人TYR mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基或氢基；
X和Y独立地表示氘基、氢基、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代基或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接到核碱基部分：
其中，
Q1和Qm是取代的或未取代的亚甲基(-CH2-)，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)和取代或未取代的氨基[[-N(H)-或-N(取代基)-]；以及
m是1到15之间的整数。
感兴趣的是式I的PNA寡聚物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至18之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地表示氢基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、或取代或未取代的芳氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到11之间的整数。
特别令人感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷基酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到9之间的整数。
高度感兴趣的是式I的PNA寡聚物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷基酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢基，并且R2、R4和R6独立地表示氢基或取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基；以及
m是1到9之间的整数。
更感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷基酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基；以及
m是1到9之间的整数。
最感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人TYR mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人TYR mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X是氢基；
Y表示取代或未取代的烷基酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
L1表示右端直接与碱性氨基基团连接的-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-；以及
L2和L3独立地选自右端直接与碱性氨基基团连接的-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-。
特别感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐，所述衍生物选自以下提供的化合物：
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2；
(N→C)Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2；
(N→C)Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2；
(N→C)Fethoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH2；
(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2；
(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2；
(N→C)Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2；
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2；
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2；以及
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2：
其中，
A、G、T和C分别是具有天然腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)分别是具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体；
其中，
p和q是整数；以及
N-端和C-端取代基的缩写具体描述如下：“Fmoc-”是“[(9-芴基)甲氧基]羰基-”的缩写；“Fethoc-”表示“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”；“Ac-”表示“乙酰基”；“Benzoyl-”表示“苯羰基-”；“Piv-”表示“新戊酰基-”；“Methyl-”表示“甲基-”；“n-Propyl-”表示“1-(正丙基)-”；“H-”表示“氢-”基团；“p-Toluenesulfonyl”表示(4-甲基苯)-1-磺酰基-”；“-Lys-”表示氨基酸残基“赖氨酸”；“-Val-”表示氨基酸残基“缬氨酸”；“-Leu-”表示氨基酸残基“亮氨酸”；“-Arg-”表示氨基酸残基“精氨酸”；“-Gly-”表示氨基酸残基“甘氨酸”；“[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”表示“[N-1-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”；“Benzyl-”表示“1-(苯基)甲基-”；“Phenyl-”表示“苯基-”；“Me-”表示“甲基-”；并且“-NH2”表示未取代的“-氨基”基团。
图3总体并明确地提供了PNA单体的化学结构，缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)。如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所讨论的，由于C(pOq)与“鸟嘌呤”的杂交，其被认为是“修饰的胞嘧啶”PNA单体。由于A(p)和A(pOq)与“胸腺嘧啶”的杂交，其被视为“修饰的腺嘌呤”PNA单体。同样，由于G(p)和G(pOq)与“胞嘧啶”碱基配对，它们被认为是“修饰的鸟嘌呤”PNA单体。
图4明确地说明了用于使本发明式I的PNA衍生物的N-端或C-端多样化的取代基的各种缩写的化学结构。
为说明用于此类PNA衍生物的缩写，缩写为“(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2”的13-聚体PNA衍生物的化学结构在图5a中提供。作为另一说明，缩写为“(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2”的15-聚体PNA衍生物的化学结构在图5b中提供。
图5a中指定的“(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2”的13-聚体PNA序列等同于用于与mRNA前体互补结合的DNA序列“(5'→3')CAG-ACA-ATC-TGT-A”。13-聚体PNA与跨越人TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”连接处的30-聚体RNA序列
内“粗体”和“下划线”标记的13-聚体序列具有13-聚体互补重叠。
图5b中指定的“(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2”的15-聚体PNA序列等同于与mRNA前体互补结合的DNA序列“(5'→3')AGA-CAA-TCT-GTA-CAA”。15-聚体PNA与跨越人TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”连接处的30-聚体RNA序列
内“粗体”和“下划线”标记的15-聚体序列具有15-聚体互补重叠。
17-聚体PNA序列“(N→C)Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2”等同于互补结合mRNA前体的DNA序列“(5'→3')ACT-GAC-TAT-CTG-TAC-AA”。17-聚体PNA与跨越人TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”连接处的30-聚体RNA序列内“粗体”和“下划线”标记的15-聚体序列具有15-聚体互补重叠。两个错配用引号即“”标记。
本发明的一个方面提供了用于治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况的药物组合物，其包含根据本发明的肽核酸衍生物。
本发明的一个方面提供了用于治疗色素沉着过度的药物组合物，其包含根据本发明的肽核酸衍生物。由黑色素过度生产引起的色素沉着过度的实例包括黄褐斑、痤疮疤痕、肝斑、雀斑、老年斑和光化性损害。
本发明的一个方面提供了一种治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况的方法，包括施用根据本发明的肽核酸衍生物。施用途径可以是例如局部施用。
本发明的一个方面提供了治疗色素沉着过度的方法，包括施用根据本发明的肽核酸衍生物。施用途径可以是例如局部施用。
本发明的一个方面提供了根据本发明的肽核酸衍生物在制备用于治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况的药物中的用途。
本发明的一个方面提供了根据本发明的肽核酸衍生物在制备用于治疗色素沉着过度的药物中的用途。
附图说明
图1a-1c.可选择用于式I的肽核酸衍生物的天然或非天然(修饰)核碱基的实例。
图2a-2e.可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例。
图3.具有天然或修饰核碱基的PNA单体的化学结构。
图4.N或C端取代基的缩写的化学结构。
图5a.13-聚体PNA衍生物“(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2”的化学结构。
图5b.15-聚体PNA衍生物“(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2”的化学结构。
图6.用于合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。
图7a-7b.HPLC纯化前后的“ASO 1”的C18反相HPLC色谱图。
图8.通过C18-RP制备型HPLC纯化的“ASO 1”的ESI-TOF质谱。
图9a.用0(阴性对照)、1、10或1000aM“ASO 1M”处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中巢式PCR产物的电泳分析。
图9b.可分配给跳过外显子(2-3)的PCR产物的Sanger测序数据。
图10a.qPCR检测在用0(阴性对照)、1、10、100或1000aM“ASO 1M”处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中全长TYR mRNA水平的变化。(误差棒为标准误差)
图10b.在用0zM(阴性对照)、10zM、100zM、1aM或10aM(即10000zM)“ASO 1M”处理24小时的B16F10小鼠黑素瘤细胞中TYR免疫印迹数据。
图11.用1、10、100或1000aM的“ASO 1M”或10μg/mL或100μg/mL熊果苷处理的B16F10小鼠黑素瘤细胞中黑色素含量的变化。(误差棒为标准误差)
图12.通过qPCR在用0zM(阴性对照)、1zM、100zM或10aM的“ASO 1”处理的人原代上皮黑素细胞中全长TYR mRNA水平的变化。(误差棒为标准误差)
实施本发明的最佳方式
制备PNA寡聚物的一般程序
根据现有技术[US6,133,444；WO96/40685]中公开的进行了稍微但适当改动的方法，基于Fmoc-化学通过固相肽合成(SPPS)合成PNA寡聚物。本研究中使用的固相载体是从PCAS BioMatrix Inc.(Quebec，Canada)购买的H-Rink Amide-ChemMatrix。如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所述或稍加改动，合成具有修饰核碱基的Fmoc-PNA单体。具有修饰核碱基的此类Fmoc-PNA单体和具有天然存在核碱基的Fmoc-PNA单体被用于合成本发明的PNA衍生物。PNA寡聚物通过C18反相HPLC(具有0.1％TFA的水/乙腈或水/甲醇)纯化并通过包括ESI/TOF/MS的质谱法鉴定。
方案2说明了该研究的SPPS中采用的典型单体延伸循环，其合成细节提供如下。然而，对于本领域技术人员而言，在自动肽合成仪或手动肽合成仪上有效运行此类SPPS反应显然可能有很多细微变化。方案2中的每个反应步骤简述如下。
方案2
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化]将1.5mL 20％哌啶/DMF中的0.01mmol(约20mg树脂)ChemMatrix树脂在libra管中涡旋20分钟，然后滤出DeFmoc溶液。用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC将树脂依次各洗涤30秒。使固相载体上的所得游离胺与Fmoc-PNA单体或与Fmoc保护的氨基酸衍生物偶联。
[DeFmoc]将树脂在1.5mL 20％哌啶/DMF中涡旋7分钟，然后滤出DeFmoc溶液。分别用1.5mL MC、1.5mL DMF、1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC将树脂依次洗涤30秒。固相载体上的所得游离胺立即与Fmoc-PNA单体偶联。
[与Fmoc-PNA单体的偶联]如下将固相载体上的游离胺与Fmoc-PNA单体偶联。将0.04mmol的PNA单体、0.05mmol的HBTU和10mmol的DIEA在1mL无水DMF中孵育2分钟，并与游离胺一起添加到树脂中。将该树脂溶液涡旋1小时并将反应介质滤出。分别用1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC依次洗涤树脂30秒。图6提供了用于本发明的具有修饰核碱基的Fmoc-PNA单体的化学结构。图6中提供的具有修饰核碱基的Fmoc-PNA单体应作为实例，因此不应视为限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易找出Fmoc-PNA单体的许多变化以合成式I的PNA衍生物。
[封端]偶联反应后，通过将未反应的游离胺在1.5mL封端溶液(DMF中的5％乙酸酐和6％2,6-leutidine)中振摇5分钟将其封端。然后滤出封端溶液并分别用1.5mLMC、1.5mLDMF和1.5mL MC依次洗涤30秒。
[在N-末端引入“Fethoc-”基]通过在碱性偶联条件下使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，将“Fethoc-”基引入N-末端。如下提供“Fethoc-OSu”的化学结构[CASNo.179337-69-0，C20H17NO5，MW 351.36]。
[从树脂裂解]通过在1.5mL裂解溶液(三氟乙酸中2.5％三异丙基硅烷和2.5％水)中摇动3小时从树脂裂解与树脂结合的PNA寡聚物。滤出树脂并在减压下浓缩过滤物。将所得残余物用二乙醚研磨并将所得沉淀物通过过滤收集以通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化]从树脂裂解后，用含有0.1％TFA的C18-反相HPLC洗脱水/乙腈或水/甲醇(梯度法)纯化PNA衍生物的粗产物。图7a和7b分别是HPLC纯化之前和之后“ASO 1”的示例性HPLC色谱图。表1提供了“ASO 1”的寡聚物序列。
式I的PNA衍生物的合成实例
为了互补靶向人TYR mRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点，根据以上提供的合成程序或稍加改动制备了本发明的PNA衍生物。提供靶向人TYR mRNA前体的此类PNA衍生物是为了例示式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
表1：互补靶向人TYR mRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点的PNA衍生物及通过质谱法的结构表征数据
a)理论的准确质量，b)观测的准确质量
表1提供了互补靶向从人TYR基因[NCBI参考序列：NG_0008748]读出的人TYRmRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱法的结构表征数据。表1中提供TYR ASO是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
“ASO 1”与跨越人TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”的连接处的30-聚体RNA序列内“粗体”和“下划线”标记的13-聚体序列具有13-聚体互补重叠。因此，，“ASO 1”具有与人TYR mRNA前体中“内含子1”的5-聚体重叠和与“外显子2”的8-聚体重叠。
表2提供了互补靶向从小鼠基因组DNA[可从NCBI参考序列：NC_000073获得]读取的小鼠TYR mRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点的“ASO 1M”以及通过质谱法的结构表征数据。提供“ASO 1M”是为了评估小鼠来源细胞中的反义活性。
表2：互补靶向小鼠TYR mRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点的PNA衍生物及通过质谱法的结构表征数据
a)理论的准确质量，b)观测的准确质量
从小鼠TYR基因[NCBI基因登记号：NC_000073]读取跨越小鼠TYR mRNA前体中内含子1和外显子2的连接处的30-聚体RNA序列[(5'→3')aauuguuuuucacag│AUCAUUUGUAGCAGA]。
“ASO 1M”等同于与mRNA前体互补结合的DNA序列“(5'→3')CAA-ATG-ATC-TGT-G”。“ASO 1M”与跨越小鼠TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”的连接处的30-聚体RNA序列内“粗体”和“下划线”标记的13-聚体序列具有13-聚体互补重叠。
像针对人TYR mRNA前体的“ASO 1”一样，“ASO 1M”具有与小鼠TYR mRNA前体中的“内含子1”的5-聚体重叠和“外显子2”的8-聚体重叠。“ASO 1M”可以作为人源细胞中“ASO1”的反义活性的良好替代化合物。
图7a是使用“ASO 1”的粗产物获得的HPLC色谱图。粗产物通过C18-RP制备型HPLC纯化。图7b是“ASO 1”的纯化产物的HPLC色谱图。制备型HPLC纯化后，“ASO1”的纯度显著提高。图8提供了用“ASO 1”的纯化产物获得的ESI-TOF质谱。提供“ASO 1”的分析数据是为了说明如何在本发明中纯化和鉴定式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
模型PNA衍生物与互补DNA的结合亲和力
评价表1和表2中的PNA衍生物对互补靶向N-末端或C-末端的10-聚体DNA的结合亲和力。通过Tm值评估PNA和10-聚体互补DNA之间双链体的结合亲和力。PNA衍生物和完全互补DNA之间的双链体显示Tm值太高，以至于无法在水性缓冲溶液中可靠地确定，因为缓冲溶液在Tm测量期间趋于沸腾。
Tm值在UV/Vis光谱仪上如下测定。将在15mL聚丙烯离心管中的4μM的PNA寡聚物和4μM互补10-聚体DNA在4mL水性缓冲液(pH 7.16、10mM磷酸钠、100mMNaCl)中的混合溶液在90℃孵育1分钟并缓慢冷却降至环境温度。然后将溶液转移到装有气密帽的3mL石英UV比色皿中，并按照现有技术[PCT/KR2009/001256]所述或稍加改动在UV/可见分光光度计上进行260nm处的Tm测量。用于Tm测量的10-聚体互补DNA购自Bioneer(www.bioneer.com，Dajeon，Republic of Korea)，无需进一步纯化即可使用。
对于与10-聚体DNA的互补结合，观测的式I的PNA衍生物的Tm值非常高，见表3。例如，“ASO 1”显示双链体的Tm值为78.0℃，其中10-聚体互补DNA靶向在
中“粗体”和“下划线”标记的PNA中的N-末端10-聚体。同时，“ASO 1”显示双链体的Tm为73.0℃，其中10-聚体互补DNA靶向在
中“粗体”和“下划线”标记的PNA中的C-末端10-聚体。
表3：PNA和靶向PNA的N-末端或C-末端的10-聚体互补DNA之间的Tm值
式I的PNA衍生物的生物活性的实例
评价了本发明PNA衍生物在B16F10小鼠黑素瘤细胞和人黑素细胞中的体外TYR反义活性。提供生物学实施例作为实例以说明式I的PNA衍生物的生物学概况，不应解释为限制本发明的范围。
实施例1.“ASO 1M”诱导跳过外显子
表2中指定的“ASO 1M”与跨越小鼠TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”的连接处的30-聚体RNA序列内“粗体”和“下划线”标记的序列的13-聚体序列具有13-聚体互补重叠。同时，“ASO1M”具有与跨越人TYR mRNA前体中“内含子1”和“外显子2”的连接处的30-聚体RNA序列
互补的9-聚体互补以及4个错配，如“粗体”和“下划线”标记。4个错配用引号(“”)标记。
尽管“ASO 1M”与人TYR mRNA前体中“外显子2”的3'剪接位点有4个错配，评价了“ASO 1M”在小鼠B16F10黑色素瘤细胞中诱导跳过TYR“外显子2”的能力。与小鼠TYR mRNA前体完全互补的“ASO 1M”可以作为与人TYR mRNA前体完全互补的“ASO 1”的良好替代化合物。
[细胞培养和ASO处理]将B16F10小鼠黑素瘤细胞(目录号CRL-6475，ATCC)保持在补充有10％FBS、1％链霉素/青霉素和0.01mg/ml牛胰岛素的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s essential minimum medium)中。在含有5mL的DMEM的60mm培养皿中生长的B16F10细胞与“ASO 1M”分别在0(阴性对照)、1、10、100或1000aM孵育5小时。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成]温育5小时后，根据制造商的说明使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9776，Takara)提取总RNA。200ng的RNA模板用于25μL逆转录反应，使用
One-Step RT-PCR试剂盒和
Taq聚合酶(目录号10928-042，Invitrogen)针对一组外显子特异性引物[外显子1_正向：(5'→3')GTAAGTTTGGATTTGGGG和外显子4_反向：(5'→3')AGAGC-GGTATGAAAGGAA]根据以下循环条件进行：50℃进行30分钟和94℃进行2分钟，然后进行15个循环的94℃30秒、52℃30秒和72℃40秒。
[巢式PCR扩增]1μL的cDNA在20μL的巢式PCR反应(目录号K2612，Bioneer)中针对一组引物[外显子1n_正向：(5'→3')GAGAACTAACTGGGGATGA；和外显子4n_反向：(5'→3')CGATAGGTGCATTGGCTT]进一步扩增，根据如下指定的循环条件进行：95℃进行5分钟，然后30个循环的95℃30秒、52℃、30秒和72℃40秒。
[外显子跳过产物的鉴定]将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集目标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图9a提供了PCR产物的电泳数据。未经“ASO 1M”处理的细胞产生两条强PCR带，一条为全长TYR mRNA，另一条为缺乏外显子2和3的剪接变体TYR mRNA。因此，跳过外显子2-3被认为是自发发生的。然而，以1至1000aM的“ASO 1M”处理的细胞仅产生缺少外显子2和3的剪接变体TYR mRNA。因此，“ASO 1M”增加了B16F10黑色素瘤细胞中跳过外显子2-3的倾向。如图9b所示，将外显子跳过PCR产物测序为跳过外显子2-3。
实施例2.“ASO 1M”处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中TYR mRNA的qPCR
如下所述，通过TYR巢式qPCR评估“ASO 1M”在B16F10细胞中诱导小鼠TYRmRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理]在含有5mL的DMEM的60mm培养皿中生长的B16F10细胞用“ASO 1M”以0(阴性对照)、1、10、100或1000aM处理。(每剂2个培养皿)
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成]用“ASO 1”孵育5小时后，根据制造商的说明使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767，Takara)从细胞提取总RNA。200ng的RNA模板用于25μL逆转录反应，使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen，USA)针对一组外显子特异性引物[外显子1_正向：(5′→3′)GTAAGTTTGGATTTG-GGG和外显子4_反向：(5'→3')AGAGCGGTATGAAAGGAA]，根据以下循环条件进行：50℃进行30分钟和94℃进行2分钟，然后是15个循环的94℃30秒、52℃30秒和72℃40秒。
[巢式qPCR扩增]将cDNA溶液稀释100倍，1μL的每种稀释的PCR产物与跨越外显子2和外显子3(目录号：Mm00495818_m1，Thermo Fisher Scientific)的连接处的Taqman探针组进行20μL的Real-Time PCR反应，根据以下循环条件进行：95℃进行3分钟，然后是30个循环的95℃10秒和60℃30秒。
[统计分析]巢式qPCR实验独立重复四次，每个实验的各个mRNA水平针对未经“ASO1M”处理的mRNA水平进行标准化。汇集从所有4个独立实验获得的mRNA水平用于通过学生t-检验进行统计分析。因此，RNA样品的数量是每浓度8个。
图10a提供了汇总的qPCR数据，其中在用“ASO 1M”以1至1000aM处理的细胞中，全长mRNA水平显著降低了约40％。
实施例3.“ASO 1M”抑制B16F10黑色素瘤细胞中TYR蛋白表达
如下所述评估“ASO 1M”下调B16F10小鼠黑素瘤细胞中TYR蛋白表达的能力。
在含有5mL的DMEM的60mm培养皿中生长的B16F10细胞用0zM(阴性对照)、10zM、100zM、1aM或10aM的“ASO 1M”处理。24小时后，将细胞用冷PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，然后用补充有1X蛋白酶抑制剂混合物(目录号P8340,Sigma)的200μL的1X细胞裂解缓冲液(目录号9803，Cell Signaling Tech)进行裂解。将1.5mL e-tube中的200μL每种裂解物与100μL的5X样品缓冲液混合，并在100℃煮沸5分钟。在4-15％梯度的TGX凝胶(目录号456-1086，Bio-Rad)上，对20μL的裂解物进行电泳分离，并在0.45μm的PVDF膜上进行蛋白质转移。用抗TYR抗体(目录号9319，Cell Signaling Tech)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号a3845，Sigma)探测膜。
图10b提供了B16F10细胞中TYR蛋白表达的蛋白质印迹数据。与不用“ASO 1M”处理的裂解物(即阴性对照)相比，“ASO 1M”处理的裂解物中TYR表达的条带强度明显弱。通过ASO处理，TYR蛋白和mRNA水平下降相当。(参见“实施例2”)
实施例4.“ASO 1M”抑制B16F10黑色素瘤细胞中黑素生成
如下所述评估“ASO 1M”在B16F10小鼠黑素瘤细胞中抑制黑素生成的能力。
在含有5mL DMEM的60mm培养皿中亚培养的B16F10细胞什么都不用(阴性对照)处理、用1至1000aM的“ASO 1M”处理或10或100μg/mL熊果素处理作为阳性对照。(每剂2个培养皿)24小时后，将细胞用冷PBS洗涤2次，并用200μL的1N NaOH裂解。将每种裂解物收集在1.5mL e-tube中，并在室温下放置过夜。通过在ELISA读数器上在475nm处的吸光度确定每种裂解物中的黑色素含量。使用不同传代的细胞重复相同实验四次。收集四组黑色素含量数据，通过学生t检验针对未经处理的黑色素含量进行统计分析(阴性对照)。
图11总结了用“ASO 1M”或熊果苷孵育24小时后，B16F10细胞中黑色素含量的变化。在用10μg/mL和100μg/mL熊果苷处理的细胞中，黑色素含量分别显著降低了约15％和25％。用“ASO 1M”处理的细胞，黑色素含量显著降低了约15％，而没有很大剂量依赖性。“ASO 1M”的抑制活性与10μg/mL熊果苷相当。
实施例5.含式I的化合物的局部乳膏的制备
将式I的化合物，例如“ASO 2”配制成乳膏，用于局部施用于受试者。局部乳膏是如下所述的制剂。鉴于局部乳膏可能有很多变化，该制备应作为实例，而不应解释为限制本发明的范围。
[溶液A的制备]在烧杯中，混合去离子水(196g)、EDTA二钠(0.06g)、甘油(15g)、双丙二醇(30g)、苯氧乙醇(0.9g)、乙基己基甘油(0.9g)、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物(2.4g)和1nM的“ASO 2”水溶液(0.3mL)。将该混合物在70至75℃使用均质混合器均质化。
[溶液B的制备]在另一个烧杯中，在70至75℃混合鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯(cetearyl ethylhexanoate)(12g)、二甲硅油(6g)、硬脂酸/氢化植物油/山嵛醇/鲸蜡硬脂醇(15g)、乳木果(Shea)油(9g)和聚甘油基-3-甲基葡糖二硬脂酸酯/硬脂酸甘油酯SE/甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯(6g)。
[局部乳膏的制备]将“溶液A”和“溶液B”混合，在7200rpm和70-75℃用均质混合器均质化3分钟。将混合物缓慢冷却至室温，得到含有1pM“ASO 2”的局部乳膏。
实施例6.用“ASO 1”处理的人黑素细胞中TYR mRNA的qPCR
表1中指定的“ASO 1”是一种13-聚体TYR ASO，其与跨越人TYR中内含子1和外显子2的连接处的3'剪接位点完全互补，如30-聚体人TYR mRNA前体序列
中“粗体”和“下划线”标记的。
通过TYR巢式qPCR评估“ASO 1”在人原代表皮黑素细胞中诱导TYR mRNA水平变化的能力，如下所述。
[细胞培养和ASO处理]将原代表皮黑素细胞(目录号PCS-200-013，ATCC)保持在补充有成人黑素细胞生长试剂盒成分(目录号PCS-200-042，ATCC)的真皮细胞基础培养基(目录号PCS-200-030，ATCC)中。在含有5mL培养基的60mm培养皿中生长的黑素细胞在0zM(阴性对照)、1zM、100zM或10aM的“ASO 1”处理。(每浓度3个培养皿)
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成]用“ASO 1”孵育5小时后，根据制造商的说明使用“RNeasy迷你试剂盒”(目录号74106，Qiagen)提取总RNA。200ng的RNA模板用于25μL逆转录反应，使用Super 
One-Step RT-PCR试剂盒和
Taq聚合酶(目录号：10928-042,Invitrogen)针对一组外显子特异性引物[外显子1_正向(2)：(5'→3')CTCTTTGTCTGGATGCATT；和外显子5_反向:(5'→3')CTGTGGTAATCCTCTTTCT]根据指定的以下循环条件进行：50℃进行30分钟和94℃进行2分钟，然后是15个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟。
[巢式PCR扩增]在20μL巢式PCR反应中(目录号K2612，Bioneer)针对一组外显子特异性引物[外显子2n_正向：(5'→3')GATAAAGCTGCCAATTTC；和外显子3n_反向：(5'→3')TTGTGCATGCTGCTTTGA]针对Taqman探针[(5'→3')5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]进一步扩增1μL的cDNA。循环条件：95℃进行3分钟，然后是40个循环的95℃10秒和60℃30秒。
图12提供了qPCR数据，其中在以1zM至10aM的“ASO 1”处理的人黑素细胞中，全长TYR mRNA水平降低了约30％。在以1zM和10aM的“ASO 1”处理的细胞中，观测到的下降是显著的(学生t-检验)。
序列表
<110> 奥利通公司
<120> 酪氨酸酶反义寡核苷酸
<130> 2018op103ar
<150> KR10-2017-0093605
<151> 2017-07-24
<150> KR10-2017-0167558
<151> 2017-12-07
<160> 38
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 1
cngacnatnt ntn 13
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 2
anngncantc tnnc 14
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 3
cngacnatnt ntn 13
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 4
cngacnatnt ntn 13
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 5
cngacnatnt ntn 13
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Mono-alkylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 6
cngacnatnt ntn 13
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Mono-alkylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 7
cngacnatnt ntn 13
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 8
cngacnatnt ntn 13
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Sulfonylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 9
cngacnatnt ntn 13
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 10
cngacnatnt ntn 13
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 11
cngacnatnt ntn 13
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 12
cngacnatnt ntn 13
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 13
cngacnatnt ntn 13
<210> 14
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 14
cngacnatnt ntn 13
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Mono-alkylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 15
cngacnatnt ntn 13
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Mono-arylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 16
cngacnatnt ntn 13
<210> 17
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Ureated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 17
cngacnatnt ntn 13
<210> 18
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 18
cngacnatnt ntn 13
<210> 19
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Acetylated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 19
cngacnatnt ntn 13
<210> 20
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<400> 20
cnganantnt nta 13
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 21
ctnacnatnt ntn 13
<210> 22
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 22
cngatnatnt ntn 13
<210> 23
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 23
tngacnatnt ntn 13
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<400> 24
tcngannatn tntn 14
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 25
cngacnatnt ntnc 14
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<400> 26
anacnatntn tnc 13
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<400> 27
anacnatntn tncna 15
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> modified base
<400> 28
anagncantc tntnnan 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> modified base
<400> 29
antgnctntc tntanna 17
<210> 30
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<400> 30
gncantctnt nnan 14
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> modified base
<400> 31
anagncantc tntncnana 19
<210> 32
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<400> 32
antctntncn ana 13
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> modified base
<400> 33
anagncantc tntncnana 19
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> modified base
<400> 34
gntanagnca atctntnc 18
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 35
gntncagnca atntg 15
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 36
gntncanacn atntg 15
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> modified base
<400> 37
gntncagncn atntg 15
<210> 38
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse tyrosinase targetted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> PNA modified oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> modified base
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> modified base
<400> 38
cnantgntnt ntg 13
Claims (14)
1.一种由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
[式I]
其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人酪氨酸酶mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基、氢基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氘基、氢[H]基、甲酰基[H-C(＝O)-]、氨基羰基[NH2-C(＝O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(＝S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；以及
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基的非天然核碱基。
2.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人酪氨酸酶mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基或氢基；
X和Y独立地表示氘基、氢基、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代基或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接到核碱基部分：
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)和取代或未取代的氨基[[-N(H)-或-N(取代基)-]；以及
m是1到15之间的整数。
3.根据权利要求2所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至18之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地表示氢基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、或取代或未取代的芳氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到11之间的整数。
4.根据权利要求3所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到9之间的整数。
5.根据权利要求4所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢基，并且R2、R4和R6独立地代表氢基或取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基；以及
m是1到9之间的整数。
6.根据权利要求5所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基；以及
m是1到9之间的整数。
7.根据权利要求6所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X是氢基；
Y代表取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
L1表示右端直接与碱性氨基基团连接的-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-；以及
L2和L3独立地选自右端直接与碱性氨基基团连接的-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-。
8.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述肽核酸衍生物选自以下提供的肽核酸衍生物：
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2；
(N→C)Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2；
(N→C)Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2；
(N→C)Fethoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH2；
(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2；
(N→C)Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2；
(N→C)Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2；
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2：
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2：以及
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2：
其中，
A、G、T和C分别是具有天然腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)分别是具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体；
其中，
p和q是整数；以及
N-端和C-端取代基的缩写具体描述如下：“Fmoc-”是“[(9-芴基)甲氧基]羰基-”的缩写；“Fethoc-”表示“[[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”；“Ac-”表示“乙酰基”；“Benzoyl-”表示“苯羰基-”；“Piv-”表示“新戊酰基-”；“Methyl-”表示“甲基-”；“n-Propyl-”表示“1-(正丙基)-”；“H-”表示“氢-”基团；“p-Toluenesulfonyl”表示(4-甲基苯)-1-磺酰基”-；“-Lys-”表示氨基酸残基“赖氨酸”；“-Val-”表示氨基酸残基“缬氨酸”；“-Leu-”表示氨基酸残基“亮氨酸”；“-Arg-”表示氨基酸残基“精氨酸”；“-Gly-”表示氨基酸残基“甘氨酸”；“[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”表示“[N-1-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”；“Benzyl-”表示“1-(苯基)甲基-”；“Phenyl-”表示“苯基-”；“Me-”表示“甲基-”；并且“-NH2”表示未取代的“-氨基”基团。
9.一种用于治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况药物组合物，其包含根据权利要求1所述的肽核酸衍生物。
10.一种用于治疗色素沉着过度的药物组合物，其包含根据权利要求1所述的肽核酸衍生物。
11.一种治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况的方法，包括施用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物。
12.一种治疗色素沉着过度的方法，包括施用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物。
13.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物在制备用于治疗涉及人酪氨酸酶基因表达的疾病或状况的药物中的用途。
14.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物在制备用于治疗色素沉着过度的药物中的用途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20170093605 | 2017-07-24 | ||
| KR10-2017-0093605 | 2017-07-24 | ||
| KR1020170167558A KR20190011181A (ko) | 2017-07-24 | 2017-12-07 | 티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드 |
| KR10-2017-0167558 | 2017-12-07 | ||
| PCT/KR2018/008143 WO2019022434A1 (en) | 2017-07-24 | 2018-07-19 | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OF TYROSINASE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110831958A true CN110831958A (zh) | 2020-02-21 |
| CN110831958B CN110831958B (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=65367910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880043566.9A Active CN110831958B (zh) | 2017-07-24 | 2018-07-19 | 酪氨酸酶反义寡核苷酸 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230148418A1 (zh) |
| EP (1) | EP3658570B1 (zh) |
| JP (1) | JP7109532B2 (zh) |
| KR (1) | KR20190011181A (zh) |
| CN (1) | CN110831958B (zh) |
| AR (1) | AR112761A1 (zh) |
| AU (1) | AU2018308224B9 (zh) |
| BR (1) | BR112020000461A2 (zh) |
| CA (1) | CA3069570A1 (zh) |
| ES (1) | ES2906396T3 (zh) |
| MX (1) | MX2019015246A (zh) |
| SG (1) | SG11201912447RA (zh) |
| TW (1) | TWI782999B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688697A (zh) * | 2002-03-19 | 2005-10-26 | 孟山都技术公司 | 尿黑酸异戊二烯基转移酶(“hpt”)核酸和多肽以及它们的用途 |
| CN101001868A (zh) * | 2004-06-17 | 2007-07-18 | 曼康公司 | 表位类似物 |
| FR2909383A1 (fr) * | 2006-12-05 | 2008-06-06 | L V M H Rech Groupement D Inte | Nouveaux oligonucleotides et utilisation d'oligonucleotides interagissant avec le gene codant pour la tyrosinase related protein-1 (trp-1) pour en moduler son expression comme agents depigmentants. |
| KR20090098710A (ko) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | 주식회사 씨티아이바이오 | 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5719262A (en) * | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
| US20040215006A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of tyrosinase expression |
| US20050215506A1 (en) * | 2001-12-20 | 2005-09-29 | Bennett C F | Modulation of tyrosinase expression |
| US7504385B2 (en) * | 2003-12-17 | 2009-03-17 | Avon Products, Inc. | si-RNA-mediated gene silencing technology to inhibit tyrosinase and reduce pigmentation |
| KR100569773B1 (ko) * | 2003-12-22 | 2006-04-10 | 한국전자통신연구원 | 이동통신 시스템의 프레임 구성 장치 및 프레임 구성 방법 |
| FR2890074B1 (fr) * | 2005-09-01 | 2007-11-23 | Lvmh Rech | Nouveaux oligonucleotides anti-genes specifiques de la tyrosinase comme agents depigmentants |
| JP7305542B2 (ja) * | 2016-12-30 | 2023-07-10 | オリパス コーポレーション | ペプチド核酸誘導体によるエクソンスキッピング |
-
2017
- 2017-12-07 KR KR1020170167558A patent/KR20190011181A/ko unknown
-
2018
- 2018-07-02 TW TW107122732A patent/TWI782999B/zh active
- 2018-07-19 BR BR112020000461-8A patent/BR112020000461A2/pt unknown
- 2018-07-19 JP JP2020503851A patent/JP7109532B2/ja active Active
- 2018-07-19 EP EP18837280.9A patent/EP3658570B1/en active Active
- 2018-07-19 US US16/630,688 patent/US20230148418A1/en active Pending
- 2018-07-19 ES ES18837280T patent/ES2906396T3/es active Active
- 2018-07-19 SG SG11201912447RA patent/SG11201912447RA/en unknown
- 2018-07-19 CN CN201880043566.9A patent/CN110831958B/zh active Active
- 2018-07-19 CA CA3069570A patent/CA3069570A1/en active Pending
- 2018-07-19 MX MX2019015246A patent/MX2019015246A/es unknown
- 2018-07-19 AU AU2018308224A patent/AU2018308224B9/en active Active
- 2018-07-23 AR ARP180102055A patent/AR112761A1/es unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688697A (zh) * | 2002-03-19 | 2005-10-26 | 孟山都技术公司 | 尿黑酸异戊二烯基转移酶(“hpt”)核酸和多肽以及它们的用途 |
| CN101001868A (zh) * | 2004-06-17 | 2007-07-18 | 曼康公司 | 表位类似物 |
| FR2909383A1 (fr) * | 2006-12-05 | 2008-06-06 | L V M H Rech Groupement D Inte | Nouveaux oligonucleotides et utilisation d'oligonucleotides interagissant avec le gene codant pour la tyrosinase related protein-1 (trp-1) pour en moduler son expression comme agents depigmentants. |
| KR20090098710A (ko) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | 주식회사 씨티아이바이오 | 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230148418A1 (en) | 2023-05-11 |
| AU2018308224B9 (en) | 2022-03-31 |
| RU2019142512A (ru) | 2021-08-24 |
| JP2020528899A (ja) | 2020-10-01 |
| AU2018308224A1 (en) | 2020-02-06 |
| KR20190011181A (ko) | 2019-02-01 |
| SG11201912447RA (en) | 2020-02-27 |
| BR112020000461A2 (pt) | 2020-07-21 |
| ES2906396T3 (es) | 2022-04-18 |
| JP7109532B2 (ja) | 2022-07-29 |
| RU2019142512A3 (zh) | 2021-11-08 |
| EP3658570B1 (en) | 2021-12-01 |
| AR112761A1 (es) | 2019-12-11 |
| CA3069570A1 (en) | 2019-01-31 |
| TW201907958A (zh) | 2019-03-01 |
| AU2018308224B2 (en) | 2022-03-24 |
| EP3658570A4 (en) | 2021-04-14 |
| TWI782999B (zh) | 2022-11-11 |
| CN110831958B (zh) | 2023-07-04 |
| MX2019015246A (es) | 2020-07-20 |
| EP3658570A1 (en) | 2020-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109996807B (zh) | Scn9a反义寡核苷酸 | |
| KR102236495B1 (ko) | 티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드 | |
| AU2017385962B2 (en) | Exon skipping by peptide nucleic acid derivatives | |
| CN114502571B (zh) | 黑素亲和素反义寡核苷酸 | |
| KR102511482B1 (ko) | 히프 1-알파 안티센스 올리고뉴클레오티드 | |
| JP2024038106A (ja) | アセチル－ｃｏａカルボキシラーゼ２アンチセンスオリゴヌクレオチド | |
| CN110831958B (zh) | 酪氨酸酶反义寡核苷酸 | |
| RU2778786C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы | |
| RU2778786C9 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы | |
| CN112041447A (zh) | 基质金属蛋白酶-1反义寡核苷酸 | |
| KR20190095961A (ko) | Snap25 안티센스 올리고뉴클레오타이드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |