CN114502571B - 黑素亲和素反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向人MLPH前体mRNA“外显子2”的3’剪接位点的肽核酸衍生物。本发明的肽核酸衍生物在细胞中强力诱导人MLPH mRNA的剪接变体并且对于治疗与人MLPH蛋白相关的皮肤色素沉着疾病或病症非常有用。

Description

黑素亲和素反义寡核苷酸
技术领域
本发明涉及互补靶向人黑素亲和素前体mRNA的肽核酸衍生物，用于改善由黑素亲和素介导的皮肤色素沉着。
背景技术
随着快速人口老龄化和经济水平的提高，人们对生活质量和健康老龄化的关注度越来越高。尤其是皮肤老化和色素沉着受到了相当大的关注，因为老化迹象在皮肤中最为明显。由于皮肤老化的预防和治疗对于生活质量非常重要，相关的保健食品、化妆品、药品等越来越受到人们的关注。有两种主要的皮肤老化过程。一种是内在或自然衰老伴随衰老，另一种是外在衰老，是由外源性因素如日光照射、吸烟和营养不良引起的。
皮肤增白剂：皮肤增白剂在快速增长的抗衰老化妆品市场中扮演着重要角色。基于皮肤中黑色素生物合成的各种机制已经开发了许多皮肤增白剂，其中酪氨酸酶是最具代表性的目标。已经开发了许多皮肤美白产品，但在安全性、功能性、规范性和分析方法等方面存在争议，其中一些被怀疑是有害的[Int.J.Cosmetic Sci.vol 33,210-221(2011)；Int.J.Mol.Sci.vol 10,2440-2475(2009)；Phytother Res.vol 21,805–816(2007)]。日本开发的皮肤美白化妆品的活性成分最近被报道会诱发如白癜风等皮肤病，关于化妆品安全性问题的争论一直在持续[Pigment Cell Melanoma Res.vol 27,754–763(2014)]。因此，有必要开发与黑色素生物合成无关但靶向新创(de novo)机制的有效且安全的皮肤美白产品。
此外，虽然酪氨酸酶抑制剂种类繁多，但其针对酪氨酸酶的IC50值在大多数情况下都是微摩尔(μM)[J.Enzyme Inhibition Med.Chem.vol 32(1),403-425(2017)]。考虑其分子大小，这种IC50值被认为是不良的，并增加了与其它分子靶交叉反应的可能性。由于不良的抑制活性转化为较大的透皮剂量，因此需要显著提高抑制效力以满足针对皮肤色素沉着所需的透皮活性以及安全性。
黑素亲和素：黑素小体是在动物细胞中发现的直径为500nm的细胞器，是黑色素合成、储存和转运的场所，黑色素是动物界中最常见的吸光色素。黑素小体在细胞核附近合成，在黑色素细胞中移动到细胞末端，可转运至附近的角质形成细胞以诱导色素沉着。在黑色素细胞中，黑素小体通过三种蛋白质的三元复合物沿肌动蛋白丝移动，所述三种蛋白质是附着于黑素小体的连接蛋白Rab27A、附着于肌动蛋白丝的动力蛋白肌球蛋白-Va和连接Rab27A与肌球蛋白-Va的载体蛋白黑素亲和素[Kor.J.Aesthet.Cosmetol.vol 11,417-426(2013)]。因此，可以通过抑制这些蛋白质的表达来抑制黑素小体向附近的角质形成细胞移动和皮肤色素沉着。
在这三种蛋白质中，据报道抑制Rab27A和肌球蛋白-Va表达会诱导免疫和神经损伤以及色素减退[Nat.Genet.vol 25 173-176(2000)；J.Cell Biol.vol 152,835-842(2001)；J.Neurol.vol 247,570-572(2000)]。另一方面，据报道抑制仅在黑色素细胞中表达的黑素亲和素仅诱导色素减退而没有任何其它并发症[J.Clin.Invest.vol 112,450-456(2003)]。因此，非常感兴趣及必要地基于黑素亲和素表达机制开发用于化妆品或药物以治疗皮肤色素沉着过度的产品，其疗效和安全性值得期待。
前体-mRNA(pre-mRNA)：遗传信息在DNA(2-脱氧核糖核酸)上携带。DNA被转录以在细胞核中产生前体mRNA(前体信使核糖核酸)。哺乳动物前体mRNA通常由外显子和内含子组成，外显子和内含子相互连接，如图1a所示。
前体mRNA的剪接：在通过一系列统称为“剪接”的复杂反应缺失内含子后，前体mRNA被加工成mRNA，如图1b示意性概括示出[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(5),386-398(2005)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.15(2),108-121(2014)]。
剪接通过在前体mRNA与剪接适体因子之间形成“剪接体E复合体”(即早期剪接体复合体)启动。在“剪接体E复合体”中，U1与外显子N和内含子N的连接点结合，U2AF35与内含子N和外显子(N+1)的连接点结合。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接对于早期剪接体复合体的形成至关重要。“剪接体E复合体”在另外与U2复合后演变为“剪接体A复合体”。“剪接体A复合体”经历一系列复杂反应以缺失或剪接除去内含子以邻接相邻外显子。
核糖体蛋白质合成：蛋白质由DNA(2-脱氧核糖核酸)编码。响应细胞刺激或自发地，DNA被转录以在细胞核中产生前体mRNA(前体信使核糖核酸)。前体mRNA的内含子被酶促剪接除去以产生mRNA(信使核糖核酸)，然后被易位至细胞质中。在细胞质中，一种称为核糖体的翻译机制复合体与mRNA结合并随着其沿着mRNA扫描编码的遗传信息进行蛋白质合成[Biochemistry,vol 41,4503-4510(2002)；Cancer Res.vol 48,2659-2668(1988)]。
反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)与核酸(包括DNA、mRNA和前体mRNA)结合的寡核苷酸称为反义寡核苷酸(ASO)。
例如，如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，则ASO可能抑制沿着mRNA的核糖体蛋白质合成。ASO需要存在于细胞质内以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白质合成。
剪接的反义抑制：如果ASO与细胞核中的前体mRNA紧密结合，则ASO可能抑制或调节前体mRNA剪接为mRNA。ASO需要存在于细胞核内以抑制或调节前体mRNA剪接为mRNA。这种对剪接的反义抑制产生了一或多个缺少ASO靶向的外显子的mRNA。这种mRNA被称为“剪接变体”，编码比全长mRNA编码的蛋白质小的蛋白质。
原则上，可以通过抑制“剪接体E复合体”的形成来中断剪接。如果ASO与(5’→3’)外显子-内含子的连接点即“5’剪接位点”紧密结合，则ASO阻断前体mRNA和因子U1之间的复合体形成，从而阻断“剪接体E复合体”的形成。同样，如果ASO与(5’→3’)内含子-外显子的连接点即“3’剪接位点”紧密结合，则不能形成“剪接体E复合体”。
3’剪接位点和5’剪接位点如图1c所示。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸容易被内源性核酸酶降解，从而限制其治疗效用。迄今为止，已经开发并深入研究了许多类型的非天然(天然不存在的)寡核苷酸[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]。其中一些示出与DNA和RNA相比扩展的代谢稳定性。图2a提供了一些具有代表性的非天然寡核苷酸的化学结构。可预测这种寡核苷酸与互补核酸结合，就像DNA或RNA那样。
硫代磷酸酯寡核苷酸：硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)是一种DNA类似物，其中每个单体的一个主链磷酸根氧原子被硫原子取代。这种小的结构变化使PTO对核酸酶的降解具有相对抗性[Ann.Rev.Biochem.vol 54,367-402(1985)]。
在PTO和DNA主链中反映了结构相似性，其在大多数哺乳动物细胞类型中都很难穿透细胞膜。然而，对于大量表达DNA转运蛋白的某些类型的细胞，DNA和PTO示出良好的细胞通透性。已知全身施用的PTO很容易分布到肝脏和肾脏[Nucleic Acids Res.vol 25,3290-3296(1997)]。
为在体外促进PTO细胞渗透，脂转染已被广泛采用。然而，脂转染会物理性改变细胞膜，导致细胞毒性，因此对于长期体内治疗应用而言不是理想的。
在过去的30年，反义PTO和PTO变体已被临床评估用于治疗癌症、免疫疾病、代谢疾病等[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]。许多这种反义候选药物尚未成功开发，部分原因是PTO细胞通透性不佳。为克服细胞通透性不佳的问题，需要以高剂量施用PTO才能发挥治疗作用。然而，已知PTO与剂量限制性毒性有关，包括凝血时间延长、补体激活、肾小管肾病、Kupffer细胞激活，以及免疫刺激，包括脾肿大、淋巴样增生、单个核细胞浸润[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol33,533-540(2006)]。
许多反义PTO已被发现对肝脏或肾脏有显著影响的疾病显示出应有的临床活性。Mipomersen是一种PTO类似物，其抑制apoB-100的合成，apoB-100是一种参与LDL胆固醇转运的蛋白质。Mipomersen在动脉粥样硬化患者中表现出应有的临床活性，最可能是由于其优先分布于肝脏所致[Circulation vol 118(7),743-753(2008)]。ISIS-113715是一种PTO反义类似物，其抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的合成，发现其在II型糖尿病患者中示出治疗活性[Curr.Opin.Mol.Ther.vol 6,331-336(2004)]。
锁核酸：在锁核酸(LNA)中，RNA的主链核糖环在结构上受限以增加对RNA或DNA的结合亲和性。因此，LNA可被视为高亲和性DNA或RNA类似物[Biochemistry vol 45,7347-7355(2006)]。
磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸：在磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide，PMO)中，DNA的主链磷酸酯和2-脱氧核糖分别被氨基磷酸酯和吗啉取代[Appl.Microbiol.Biotechnol.vol 71,575-586(2006)]。虽然DNA主链带负电荷，但PMO主链不带电荷。因此，PMO与mRNA之间的结合在主链之间没有静电排斥，并且趋于强于DNA和mRNA之间的结合。由于PMO在结构上与DNA非常不同，因此识别DNA的肝转运蛋白不识别PMO。PMO可表现出与PTO不同的组织分布，但PMO与PTO一样不容易穿透细胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)是一种以N-(2-氨基乙基)甘氨酸为单元主链的多肽，由Nielsen博士及其同事发现[Science vol 254,1497-1500(1991)]。PNA的化学结构和缩写命名法在图2b中示出。与DNA和RNA一样，PNA也选择性地与互补核酸结合[Nature(London)vol 365,566-568(1992)]。在与互补核酸结合时，PNA的N末端被认为相当于DNA或RNA的“5’末端”，PNA的C末端相当于DNA或RNA的“3’末端”。
与PMO一样，PNA主链不带电荷。因此，PNA与RNA之间的结合趋于比DNA与RNA之间的结合更强。由于PNA在化学结构上与DNA显著不同，因此PNA不会被识别DNA的肝转运蛋白识别，并且示出与DNA或PTO不同的组织分布谱。然而，PNA也很难穿透哺乳动物细胞膜[Adv.Drug Delivery Rev.vol 55,267-280(2003)]。
修饰的核碱基以改善PNA的膜通透性：通过引入具有与其共价连接的阳离子脂质或其等价物的修饰的核碱基，使PNA对哺乳动物细胞膜高度可渗透。图2c中提供了这种修饰的核碱基的化学结构。发现这种修饰的胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的核碱基分别与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶可预测地并互补杂交[PCT申请号PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253]。
将这种修饰的核碱基掺入PNA上类似于脂转染的情况。通过脂转染，具有磷酸主链的寡核苷酸分子被阳离子脂质分子如脂质体(lipofectamine)包裹，这种脂质体/寡核苷酸复合体与裸寡的核苷酸分子相比倾向于更容易地穿透细胞膜。
除了良好的膜通透性外，还发现这些PNA衍生物对互补核酸具有超强亲和性。例如，将4至5个修饰的核碱基引入11-mer至13-mer PNA衍生物很容易在与互补DNA形成双链体中产生20℃或更高的Tm增加(gain)。此外，这种PNA衍生物对单个碱基错配高度敏感。根据修饰碱基的类型以及PNA序列，单个碱基错配导致11-22℃的Tm损失。
小干扰RNA(siRNA)：小干扰RNA(siRNA)是指20-25个碱基对的双链RNA[Microbiol.Mol.Biol.Rev.vol 67(4),657-685(2003)]。siRNA的反义链以某种方式与蛋白质相互作用，形成“RNA诱导的沉默复合物”(RISC)。然后，RISC结合与siRNA反义链互补的mRNA的特定部分。与RISC复合的mRNA经历裂解。因此，siRNA催化诱导其靶mRNA的裂解，并因此抑制mRNA的蛋白质表达。RISC并不总是与其靶mRNA内的完全互补序列结合，这引起了对siRNA治疗脱靶效应的关注。与其它类别的具有DNA或RNA主链的寡核苷酸一样，siRNA具有较差的细胞通透性，因此在体外或体内治疗活性较差，除非经过适当配制或化学修饰以具有良好的膜通透性。
MLPH siRNA：据报道，靶向MLPH mRNA的21-mer siRNA在20μM时抑制melan-a细胞中MLPH蛋白的表达并抑制黑素小体转运和增强黑素小体的聚集[Appl.Biochem.Biotechnol.Vol 172,1882-1897(2014)]。这些结果可用于开发与nelanophilin表达相关的材料。
发明公开
要解决的问题
基于各种黑色素生物合成机制已经开发出许多皮肤美白产品，但在安全性、功能性、规范性和分析方法等方面存在争议，其中一些被怀疑是有害的。因此，有必要基于与黑色素生物合成无关的机制开发产品并确保效力和安全性。非常感兴趣和必要的是基于黑素亲和素表达机制开发用于过度皮肤色素沉着的化妆品或药物的产品，其效力和安全性可期。
所述问题的解决方案
本发明提供了式I表示的肽核酸(PNA)衍生物，或其药学上可接受的盐：
[式I]
其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中[(5’→3’)CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA]的30-mer前体mRNA序列具有至少10-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补，或与人MLPH前体mRNA部分互补，具有一或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氢基(-H)、氘基、取代的或未取代的烷基、或取代的或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢基、氘基、甲酰基[HC(＝O)-]、氨基羰基[NH2-C(＝O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(＝S)-]、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基、取代的或未取代的烷酰基、取代的或未取代的芳酰基、取代的或未取代的烷氧基羰基、取代的或未取代的芳氧基羰基、取代的或未取代的烷基氨基羰基、取代的或未取代的芳基氨基羰基、取代的或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代的或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代的或未取代的烷氧硫代羰基、取代的或未取代的芳氧硫代羰基、取代的或未取代的烷基磺酰基、取代的或未取代的芳基磺酰基、取代的或未取代的烷基膦酰基、或取代的或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、氘基、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、或取代的或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；及
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自非天然核碱基，其具有与核碱基部分共价连接的取代的或未取代的氨基。
式I的化合物诱导人MLPH前体mRNA中“外显子2”的跳过(skipping)，产生缺乏“外显子2”的人MLPH mRNA剪接变体，可用于与黑素亲和素蛋白的活性相关的过度皮肤色素沉着的化妆品或药物。
条件“n是10至21之间的整数”的字面意思是n是可选自11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的一组整数中的整数。
式I的化合物与源自人MLPH DNA[NCBI参考序列：NG_007286]的人MLPH前体mRNA的“内含子1”和“外显子2”的3’剪接位点互补结合。[(5’→3’)CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA]的30-mer序列跨越人MLPH前体mRNA中15-mer“内含子1”和15-mer“外显子2”的3’剪接位点。因此，30-mer前体mRNA序列通常可以按惯例表示为[(5’→3’)ccugugacauuccag┃GUGUGACCCCGACAA]，其中内含子和外显子序列分别以“小写”和“大写”字母示出，“内含子1”和“外显子2”连接点用“┃”表示。
式I所示PNA衍生物中天然或非天然核碱基的化学结构例示于图3。本发明的天然(即天然存在的)或非天然(非天然存在的)核碱基包括但不限于图3中提供的核碱基。提供这种非天然核碱基是为了示例说明可允许的核碱基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。
图4a-4e举例说明了用于描述式I的PNA衍生物的取代基。图4a提供了取代的或未取代的烷基的实例。取代的或未取代的烷酰基和取代的或未取代的芳酰基在图4b中举例说明。图4c示例了取代的或未取代的烷基氨基、取代的或未取代的芳基氨基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的烷基磺酰基或芳基磺酰基、以及取代的或未取代的烷基膦酰基或芳基膦酰基的实例。图4d提供了取代的或未取代的烷氧基羰基或芳氧基羰基、取代的或未取代的烷基氨基羰基或芳基氨基羰基的实例。在图4e中提供了取代的或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代的或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代的或未取代的烷氧基硫代羰基和取代的或未取代的芳氧基硫代羰基的实例。提供这种示例性取代基是为了示例说明可允许的取代基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易理解寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶前体mRNA序列在N端或C端的取代基上序列特异性结合的主要因素。
如现有技术[PCT/KR2009/001256]中举例说明的，式I的化合物与互补DNA紧密结合。式I的PNA衍生物与其全长互补DNA或RNA之间的双链体的Tm值太高而不能在水相缓冲液中可靠地确定。式I的PNA化合物与较短长度的互补DNA产生高Tm值。
式I的化合物与转录自人MLPH基因的人MLPH前体mRNA的靶3’剪接位点紧密结合，并干扰“剪接体早期复合体”的形成以产生缺乏“外显子2”(外显子2跳过)的MLPH mRNA剪接变体。
强RNA亲和性使得式I的化合物诱导MLPH“外显子2”的跳过，甚至当PNA衍生物与MLPH前体mRNA中的靶3’剪接位点具有一或两个错配时也如此。类似地，式I的PNA衍生物仍可以在靶剪接位点具有一或两个SNP(单核苷酸多态性)的MLPH突变体前体mRNA中诱导MLPH“外显子2”的跳过。
如现有技术[PCT/KR2009/001256]中示例，式I的化合物具有良好的细胞通透性并且可以作为“裸”寡核苷酸容易地递送到细胞中。因此，本发明的化合物诱导人MLPH前体mRNA中“外显子2”的跳过，在用作为“裸”寡核苷酸的式I的化合物处理的细胞中产生缺乏MLPH“外显子2”的人MLPH mRNA剪接变体。式I的化合物不需要任何手段或配制来递送到细胞中以有效诱导细胞中靶外显子的跳过。式I的化合物容易诱导用作为“裸”寡核苷酸的本发明化合物在亚飞摩尔(sub-femtomolar)浓度处理的细胞的人MLPH前体mRNA中的“外显子2”的跳过。
由于良好的细胞或膜通透性，式I的PNA衍生物可以作为“裸”寡核苷酸局部施用以诱导皮肤中MLPH“外显子2”的跳过。式I的化合物不需要配制以为了预期的治疗或生物活性而增加到靶组织的透皮递送。通常将式I的化合物溶解在水和共溶剂中，并以亚皮摩尔(sub-picomolar)浓度局部或经皮施用以在靶皮肤中引发所需的治疗或生物活性。本发明的化合物不需要大量或侵入性地配制来引发局部治疗活性。然而，式I的PNA衍生物可以与化妆品成分或佐剂一起配制为局部乳膏或洗液。这种局部化妆乳膏或洗液可用于改善皮肤色素沉着。
本发明的式I的化合物可以以1aM至高于1nM的治疗或生物学有效浓度局部施用于受试者，这将根据受试者的给药方案、病症或状况等而变化。
式I的化合物(PNA衍生物)可以不同方式配制，包括但不限于注射剂、鼻喷雾剂、透皮贴剂等。此外，式I的PNA衍生物可以治疗有效剂量施用于受试者，施用剂量可以根据受试者的适应症、施用途径、给药方案、病症或状况等而多样化。
式I的化合物可以与药学上可接受的酸或碱组合使用，所述酸或碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。
式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的佐剂组合施用给受试者，所述佐剂包括但不限于柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。
令人感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中[(5’→3’)CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCG-ACAA]的30-mer前体mRNA序列具有至少10-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补，或与人MLPH前体mRNA部分互补，具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氢基、氘基；
X和Y独立地表示氢基、氘基、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基、取代的或未取代的烷基酰基、取代的或未取代的芳基酰基、取代的或未取代的烷氧基羰基、取代的或未取代的芳氧基羰基、取代的或未取代的烷基氨基羰基、取代的或未取代的芳基氨基羰基、取代的或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代的或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代的或未取代的烷氧基硫代羰基、取代的或未取代的芳氧基硫代羰基、取代的或未取代的烷基磺酰基、取代的或未取代的芳基磺酰基、取代的或未取代的烷基膦酰基、或取代的或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基、或取代的或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代的或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价接头，其将碱性氨基与核碱基部分共价连接：
[式V]
其中，
Q1和Qm是取代的或未取代的亚甲基[-CH2-、-CH(取代基)-、-C(取代基)2-]，Qm与碱性氨基直接连接；
Q2、Q3、…和Qm-1独立地选自取代的或未取代的亚甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)和取代的或未取代的氨基[-N(H)-，或-N(取代基)-]；及
m是1至15之间的整数。
特别感兴趣的是式I的PNA寡聚物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至19之间的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中[(5’→3’)CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA]的30-mer前体mRNA序列具有至少10-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基；
X和Y独立地表示氢基、取代的或未取代的烷基酰基、或取代的或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代的或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
Q1和Qm是亚甲基，Qm与碱性氨基直接连接；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基；及
m是1至9之间的整数。
更特别感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至19之间的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中[(5’→3’)CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA]的30-mer前体mRNA序列具有至少10-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基；
X是氢基；
Y表示取代的或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代的或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-；及
L2和L3独立地选自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、和-(CH2)8-。
特别令人感兴趣的是本发明的PNA衍生物，其选自以下提供的一组化合物(以下分别称为ASO 1、6、7和8)，或其药学上可接受的盐：
(N→C)Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2；
(N→C)Fethoc-C(1O2)GG(6)-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)A-NH2；
(N→C)Fethoc-GG(6)G-G(6)TC-A(5)CA(5)-C(1O2)CT-G(6)GA(5)-ATG(6)-NH2；及
(N→C)Fethoc-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)AT-G(6)TC(1O2)-NH2；
其中，
A、T、G和C分别是具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)和G(p)是分别由式VI、式VII和式VIII表示的具有非天然核碱基的PNA单体；
其中，
p和q是整数，例如在ASO 1的情况下，p是1、5或6，以及q是2；及
“Fethoc-”是“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”的缩写，“-NH2”是未取代的“-氨基”基团的缩写。
图5总体明确地提供了缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所讨论的，C(pOq)由于其与“鸟嘌呤”的杂交而被认为是“修饰的胞嘧啶”PNA单体。A(p)因与“胸腺嘧啶”杂交而被视为“修饰的腺嘌呤”PNA单体，而G(p)因与“胞嘧啶”杂交而被视为“修饰的鸟嘌呤”PNA单体。此外，为示例说明用于这种PNA衍生物的缩写，14-mer ASO 1“(N→C)Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2”的化学结构在图6中明确提供。
ASO 1相当于“(5’→3’)GGT-CAC-ACC-TGG-AA”的DNA序列，与前体mRNA互补结合。所述14-mer PNA与跨越人MLPH前体mRNA中“内含子1”和“外显子2”的连接点的[(5’→3’)]的标记为“粗体”和“下划线”RNA序列具有14-mer互补重叠。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者中与人MLPH基因转录相关的疾病或病症的方法，包括为所述受试者施用本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者皮肤色素沉着的方法，包括为所述受试者施用本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗与人MLPH基因转录相关的疾病或病症的药物组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗与人MLPH基因转录相关的疾病或病症的化妆品组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗皮肤色素沉着的药物组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗皮肤色素沉着的化妆品组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
发明效果
与人MLPH基因转录相关的疾病或病症可以通过施用式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐治疗。
过度皮肤色素沉着可以通过施用式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐治疗。
附图简述
图1a：前体mRNA结构的图示。
图1b：去除内含子N的剪接过程示意图。
图1c：剪接体E复合体中3’剪接位点和5’剪接位点的示意图。
图2a：DNA和代表性非天然寡核苷酸的化学结构。
图2b：原型PNA的化学结构和缩写命名法。
图2c：开发修饰的核碱基以改善PNA的膜通透性。
图3a-3c：可选择用于式I的肽核酸衍生物的天然或非天然(修饰的)核碱基的实例。
图4a：可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例，取代的或未取代的烷基。
图4b：可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例，取代的或未取代的烷基酰基及取代的或未取代的芳基酰基。
图4c：可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例，取代的烷基氨基，取代的芳基氨基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的烷基磺酰基，取代的或未取代的芳基磺酰基，取代的或未取代的烷基膦酰基和取代的或未取代的芳基磺酰基。
图4d：可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例，取代的或未取代的烷氧基羰基和取代的或未取代的芳氧基羰基，取代的或未取代的烷基氨基羰基，以及取代的或未取代的芳基氨基羰基。
图4e：可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代基的实例，取代的或未取代的烷氧基硫代羰基和取代的或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代的或未取代的芳基氨基硫代羰基，以及取代的或未取代的芳氧基硫代羰基。
图5：缩写的PNA单体、A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的化学结构。
图6：缩写的14-mer“(N→C)Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2”的化学结构。
图7：用于合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。
图8：本发明的SPPS中采用的典型单体延长循环的示意图。
图9a：HPLC纯化前针对“ASO 2”的C18-反相HPLC色谱图。
图9b：HPLC纯化后针对“ASO 2”的C18-反相HPLC色谱图。
图10：HPLC纯化后使用“ASO 2”获得的ES-TOF质谱数据。
图11a-11d：用“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的黑色素瘤melan-a中的实时qPCR数据。
图12a-12c：用“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的黑色素瘤melan-a中的电泳分析数据。
图13a-13d：用“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的黑色素瘤melan-a中的Western印迹数据。
图14a：评估用siRNA和ASO处理的黑色素瘤melan-a中黑素小体聚集水平的显微镜数字图像。
图14b：量化的黑素小体聚集水平。
图15：用“ASO 1”处理的人黑色素细胞的实时qPCR数据。
图16：用“ASO 1”处理的人黑色素细胞中的Western印迹数据。
图17：评估用“ASO 1”处理的人黑色素细胞中黑素小体聚集水平和相对黑素小体聚集水平的显微镜数字图像。
图18：用“ASO 1”处理的人黑色素细胞的相对存活率。
进行本发明的最佳模式
制备PNA寡聚物的一般过程
具有修饰的核碱基的PNA单体如现有技术[PCT/KR 2009/001256]中所述或稍作修改来合成。图7中提供了用于合成本发明PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。图7中的Fmoc-PNA [Fmoc＝{(9-芴基)甲氧基}羰基]单体应作为实例，因此不应被视为限制本发明的范围。这种具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体和具有天然存在的核碱基的Fmoc-PNA单体用于通过固相肽合成(SPPS)合成PNA寡聚物，如图8中提供的基于Fmoc-化学根据现有技术[US6,133,444；WO96/40685]进行了少量但适当的修改的方法。这项研究中使用的固体支持物是购自PCAS BioMatrix Inc.(Quebec,Canada)的H-Rink Amide-ChemMatrix树脂。PNA寡聚物通过C18反相HPLC(水/乙腈或水/甲醇，含0.1％TFA)纯化并通过包括ESI/TOF/MS的质谱分析法鉴定。图9a和9b分别是在HPLC纯化之前和之后“ASO 2”的示例性HPLC色谱图。图10是在HPLC纯化后“ASO 2”的ESI/TOF/MS谱图，仅以寡聚物为例，不应视为限制本发明的范围。
图8示例了在本发明的SPPS中采用的典型单体延长循环，每个反应步骤简述如下。
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化]当树脂上的胺未用Fmoc保护时，将在1.5mL的20％哌啶/DMF中0.01mmol(约20mg树脂)的ChemMatrix树脂在Libra管中涡旋20分钟，并过滤掉DeFmoc溶液。将树脂分别用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5mL的MC、1.5mL的DMF和1.5mL的MC依次洗涤30秒。将固体支持物上所得游离胺与Fmoc-PNA单体进行偶联。
[DeFmoc]当树脂上的胺用Fmoc保护时，将在1.5mL的20％哌啶/DMF中的0.01mmol(约20mg)树脂悬浮液涡旋7分钟，并过滤掉DeFmoc溶液。将树脂分别用1.5mL的MC、1.5mL的DMF、1.5mL的MC、1.5mL的DMF和1.5mL的MC依次洗涤30秒。将固体支持物上所得游离胺立即与Fmoc-PNA单体偶联。
[与Fmoc-PNA单体偶联]如下所述将固体支持物上的游离胺与Fmoc-PNA单体偶联。将0.04mmol的PNA单体、0.05mmol的HBTU和0.1mmol的DIEA在1mL无水DMF中温育2分钟，与游离胺一起加入树脂中。将树脂溶液涡旋1小时并滤出反应介质。然后将树脂用1.5mL的MC、1.5mL的DMF和1.5mL的MC依次洗涤30秒。
[加帽]在偶联反应后，将未反应的游离胺通过在1.5mL加帽溶液(DMF中的5％乙酸酐和6％的2,6-leutidine)中振荡5分钟进行加帽。然后过滤掉加帽溶液并用1.5mL的MC、1.5mL的DMF和1.5mL的MC依次洗涤30秒。
[在N-末端引入“Fethoc-”基团]通过以下方法使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，从而将“Fethoc-”基团引入N-末端。将在1mL无水DMF中的0.1mmol的Fethoc-OSu和0.1mmol的DIEA溶液中的树脂悬浮液涡旋1小时，然后过滤掉溶液。将树脂用1.5mL的MC、1.5mL的DMF和1.5mL的MC依次洗涤30秒。本发明中使用的“Fethoc-OSu”[CAS号179337-69-0，C20H17NO5，MW 351.36]的化学结构提供如下。
[从树脂裂解]通过在1.5mL裂解溶液(在三氟乙酸中的2.5％三异丙基硅烷和2.5％水)中摇动3小时，将与树脂结合的PNA寡聚物从树脂上裂解下来。滤出树脂，减压浓缩滤液。所得残余物用乙醚研磨，所得沉淀物通过过滤收集以通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化]从树脂裂解后，将PNA衍生物的粗产物通过C18-反相HPLC纯化，含有0.1％TFA的洗脱水/乙腈或水/甲醇(梯度法)。图9a和9b分别是在HPLC纯化之前和之后“ASO 2”的示例性HPLC色谱图。
式I的PNA衍生物的合成实例
为互补靶向人MLPH前体mRNA中“外显子2”的3’剪接位点，根据上文提供的合成过程或稍加修改制备本发明的PNA衍生物。提供这种靶向人MLPH前体mRNA的PNA衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
[表1]互补靶向人MLPH前体mRNA中“外显子2”的3’剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱分析的结构鉴定数据。
a)理论精确质量，b)观察的精确质量
表1提供了互补靶向从人MLPH基因[NCBI参考序列：NG_007286]读取的人MLPH前体mRNA中“外显子2”的3’剪接位点的PNA衍生物，以及通过质谱分析的结构鉴定数据。表1提供本发明的肽核酸衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
“ASO 1”与跨越人MLPH前体mRNA中“内含子1”和“外显子2”的连接点的30-mer RNA序列[(5’→3’)]内“粗体”和“下划线”标示的14-mer序列具有14-mer互补重叠。因此，“ASO 1”与人MLPH前体mRNA内的“内含子1”具有6-mer重叠和与“外显子2”具有8-mer重叠。
互补靶向小鼠MLPH前体mRNA的PNA衍生物的合成实例
为便于对容易获得的小鼠melan-a的功效评估，制备互补靶向跨越从小鼠MLPH基因[NCBI参考序列：NC_000067]读取的小鼠MLPH前体mRNA中“内含子1”和“外显子2”的连接点的3’剪接位点的本发明的PNA衍生物。所述30-mer序列[(5’→3’)CCUGUGACUUUCUAGGUGUGGCCUGGAUGA]跨越小鼠MLPH前体mRNA中15-mer“内含子1”和15-mer“外显子2”的3’剪接位点。因此，所述30-mer前体mRNA序列可以按惯例表示为[(5’→3’)ccugugacuuucuag┃GUGUGGCCUGGAUGA]，其中内含子和外显子序列分别用“小写”和“大写”字母提供，“内含子1”和“外显子2”的连接点用“┃”表示。
提供这种靶向小鼠MLPH前体mRNA的PNA衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
[表2]互补靶向小鼠MLPH前体mRNA中“外显子2”的3’剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱分析的结构鉴定数据。
a)理论精确质量，b)观察的精确质量
表2提供了互补靶向从小鼠MLPH基因读取的小鼠MLPH前体mRNA中“外显子2”的3’剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱分析的结构鉴定数据。表2中提供本发明的肽核酸衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。
“ASO 3”与跨越小鼠MLPH前体mRNA中“内含子1”和“外显子2”连接点的RNA序列[(5’→3’)]中以“粗体”和“下划线”标示的序列具有17-mer互补重叠。因此，“ASO 3”与小鼠MLPH前体mRNA内的“内含子1”具有6-mer重叠和与“外显子2”具有11-mer重叠。
“ASO”与互补DNA的结合亲和性
评估式I的PNA衍生物对互补靶向N-末端或C-末端的10-mer DNA的结合亲和性。通过PNA与10-mer互补DNA之间双链体的Tm值评估结合亲和性。PNA衍生物与完全互补的DNA之间的双链体示出Tm值太高，以至于无法在缓冲水溶液中可靠地确定，因为在Tm测量期间所述缓冲溶液趋于沸腾。可以基于PNA与10-mer互补DNA之间双链体的Tm值预测和比较全长PNA的Tm值。
Tm值在UV/Vis分光计上如下测定。将320μL的50μM PNA寡聚物、320μL的50μM互补10-mer DNA和3.36mL水缓冲液(pH 7.16，10mM磷酸钠、100mM NaCl)的混合溶液在15mL聚丙烯Falcon管中在90℃温育几分钟，然后慢慢冷却至环境温度。然后将溶液移至配备气密盖的3mL石英UV比色皿中，并将比色皿安装在Agilent 8453UV/可见光分光光度计上。随着比色皿温度每分钟增加0.5或1℃，记录在260nm的吸光度变化。从吸光度vs温度曲线中，示出吸光度增加率最大的温度被读取为PNA与10-mer DNA之间的Tm。用于Tm测量的DNA购自Bioneer(www.bioneer.com,Dajeon,Republic of Korea)，无需进一步纯化即可使用。
观察的式I的PNA衍生物的Tm值非常高，结果在表3中提供。
[表3]PNA与靶向PNA的N末端或C末端的10-mer互补DNA之间的Tm值。
例如，“ASO 1”示出与靶向在 中以“粗体”和“下划线”标示的PNA中N末端10-mer的10-mer互补DNA的双链体的Tm值为81.02℃。同时，“ASO1”示出与靶向在中以“粗体”和“下划线”标示的PNA中C末端10-mer的10-mer互补DNA的双链体的Tm值为90.37℃。
式I的PNA衍生物的生物活性的实施例
通过使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)等评估本发明的PNA衍生物在小鼠黑色素瘤melan-a和人黑色素细胞中的体外MLPH反义活性。提供生物学实例作为示例以说明式I的PNA衍生物的生物学谱，因此不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：ASO在小鼠黑色素瘤Melan-a中对于MLPH表达的影响
如下文所述评估“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”影响小鼠黑色素瘤melan-a中MLPH表达的能力。
[细胞培养&ASO处理]将小鼠黑色素瘤melan-a在补加了10％FBS(胎牛血清)(Cat.No.10099-41，GIBCO)、1％链霉素/青霉素(Cat.No.15140-122，GIBCO)和200nM TPA(Sigma，Cat.No.79346)的RPMI 1640(GIBCO,Cat.No.11875-093)中在5％CO2大气下在37℃生长。将小鼠黑色素瘤melan-a(2×105)在60mm培养皿中生长24小时以进行稳定，不经处理(阴性对照)或用“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”或“ASO 5”在100zM、10aM、1fM或1μM处理48小时。
[RNA提取&cDNA合成]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Cat.No.714106)根据制造商的说明从ASO处理的细胞提取总RNA及使用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis试剂盒(Takara，Cat.No.6110A)从500ng RNA制备cDNA。向在PCR管中的500ng RNA、1μL随机六聚体和1μL dNTP(10mM)的混合物中加入DEPC处理的水，使总体积为10μL，在65℃反应5分钟。加入10μL PrimeScript RTase反应混合物及相继在30℃反应10分钟和在42℃反应60分钟，从而合成cDNA。
[实时qPCR]为评估小鼠MLPH mRNA的表达水平，使用Taqman探针对合成的cDNA进行实时qPCR。将在PCR管中的cDNA、Taqman探针(Thermo，Cat.No.Mm00453498_m1)、IQsupermix(BioRad，Cat.No.170-8862)和无核酸酶水的混合物使用CFX96 Touch Real-Time系统(BioRad)根据以下指定的循环条件进行反应：95℃反应3分钟，然后40个如下循环：95℃10秒及在60℃30秒。在每个循环结束时测量荧光强度并通过解链曲线评估PCR结果。在将每个基因的阈值循环(Ct)通过GAPDH的阈值循环(Ct)标准化后，比较和分析小鼠MLPH mRNA的相对表达水平。
图11a、图11b、图11c和图11d分别提供了“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的细胞中小鼠MLPH mRNA的相对表达水平。“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”(不是“ASO 2”)处理的细胞中小鼠MLPH mRNA的相对表达水平以剂量依赖性方式降低。(进行Student T检验以核查结果的统计学显著性)。
[外显子跳过]为评估小鼠MLPH mRNA的外显子跳过水平，使用合成的cDNA使用PCRPreMix(Bioneer,Cat.No.K-2612,South Korea)针对一组引物[正向：(5’→3’)TAG CTCAGT GCA CCC TGA CA；反向：(5’→3’)GAG AGA CCG GAT CAC TTT GG]根据以下循环条件进行标准PCR：95℃5分钟，然后25个如下循环：95℃1分钟、59℃1分钟、72℃2分钟，以及在72℃再反应3分钟。
将PCR产物(10μL)在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。通过Sanger测序收集和分析靶条带以评估外显子跳过序列。
图12a、图12b和图12c分别提供了“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的细胞的电泳分离结果。虽然用“ASO 4”处理的细胞没有产生外显子跳过条带，但用1μM“ASO 5”处理的细胞微弱地产生外显子2跳过条带，用1μM“ASO 3”处理的细胞产生外显子2跳过条带，而不是全长MLPH mRNA条带。因此，“ASO 3”靶向在3’剪接位点的MLPH前体mRNA，在1μM产生外显子2跳过的剪接变体MLPH mRNA。
[Western印迹]将细胞如上生长。在用每种ASO处理48小时后，收集细胞，然后用冷PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤2次并溶解在RIPA缓冲液(Cell Signaling，Cat.No.9806)中。将蛋白质用BCA溶液(Thermo，Cat.No.23225)定量并通过10％SDS-PAGE凝胶纯化。将蛋白质移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)(Millipore，Cat.No.IPVH00010)上，在5％脱脂乳缓冲液中封闭1小时。将抗MLPH(Proteintech，Cat.No.10338-1AP)和抗-β-肌动蛋白(Sigma，Cat.No.A3854)用作一抗，以及山羊抗兔抗体(CST，Cat.No.7074)用作二抗，对所述膜进行探查。HRP底物(Millipore，Cat.No.WBKLS0500)用于检测化学发光信号并使用Gel Doc系统(ATTO)测量信号强度。基于每个条带的Western印迹结果，使用Image-J程序量化MLPH的相对表达水平并转化为图形。
图13a、图13b、图13c和图13d分别提供了在“ASO 2”、“ASO 3”、“ASO 4”和“ASO 5”处理的细胞中小鼠MLPH蛋白的相对表达水平。总体而言，在ASO处理的细胞中，小鼠MLPH蛋白的相对表达水平降低，尤其是在“ASO 3”处理的细胞中，所述水平以剂量依赖性方式降低。(进行Student T检验以核查结果的统计学显著性)。
[黑素小体聚集]将细胞如上生长。为评估黑素小体聚集的程度，使用黑素亲和素siRNA作为阳性对照。黑素亲和素siRNA购自South Korea的Daejeon的Bioneer，其有义序列为(5’→3’)GGGCAAAAUACAAAAGGAG以及反义序列为(5’→3’)5’-CUCCUUUUGUAUUUUGCCC-3’。将黑色素瘤melan-a在60mm培养皿中生长24小时并将培养基更换为3mL的Opti-MEM(Gibco,Cat.No.31985-070)。向在1.5mL Eppendorf管中的500μL Opti-MEM和5μLlipofectamin2000(Invitrogen，Cat.No.11668-019)的混合物中加入3mL 10μM siRNA原液(siRNA终浓度：10nM)。15分钟后，将所得溶液加入到含有3mL Opti-MEM的培养皿中并在37℃培养6小时，然后加入新培养基。
在siRNA或ASO处理后24或48小时，为评估黑素小体聚集的程度，在两个数量级用明视野显微镜对细胞进行拍照。图14a提供了阴性对照、siRNA处理的细胞和ASO处理的细胞的显微镜数字图像，以评估黑素小体聚集的程度，图14b提供了黑素小体聚集细胞的数量。
从图14a和14b中可以看出，与阴性对照相比，用siRNA或ASO处理24或48小时的细胞产生更多的黑素小体聚集，这可以解释为黑素亲和素siRNA或ASO抑制MLPH蛋白的表达及抑制黑素小体转运并增强黑素小体的聚集。因此，黑素亲和素siRNA或ASO有望通过抑制黑素小体转运来抑制皮肤色素沉着。
实施例2：ASO在人黑色素细胞中对MLPH表达的影响
如下所述评估“ASO 1”影响人黑色素细胞中MLPH表达的能力。
[细胞培养&ASO处理]将人黑色素细胞(Lonza，Cat.No.CC-2586)在补充有1％链霉素/青霉素(GIBCO,Cat.No.15140-122)的黑色素细胞专用培养基(Lonza,Cat.No.CC-3249)中在5％CO2大气下在37℃生长。将人黑色素细胞(3×105)在60mm培养皿中生长24小时以稳定，不经处理(阴性对照)或用“ASO 1”在1μM处理24或48小时。
[RNA提取&cDNA合成]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Cat.No.714106)按照制造商的说明，从用“ASO 1”处理的细胞提取总RNA。使用PrimeScriptTM 1st strand cDNA合成试剂盒(Takara，Cat.No.6110A)从500ng RNA制备cDNA。向在PCR管中的500ng RNA、1μL随机六聚体和1μL dNTP(10mM)的混合物中加入DEPC处理的水，使总体积为10μL，在65℃反应5分钟。通过加入10μL PrimeScript RTase反应混合物及相继在30℃反应10分钟和在42℃反应60分钟，从而合成cDNA。
[实时qPCR]为评估人MLPH mRNA的表达水平，使用Taqman探针用合成的cDNA进行实时qPCR。将在PCR管中的cDNA、Taqman探针(Thermo，Cat.No.Hs00983107_m1)、IQsupermix(BioRad，Cat.No.170-8862)和无核酸酶水的混合物使用CFX96 Touch Real-Time系统(BioRad)根据如下指定的循环条件进行反应：在95℃3分钟，然后进行40个循环：95℃10秒和60℃30秒。在每个循环结束时测量荧光强度并通过解链曲线评估PCR结果。每个基因的阈值循环(Ct)通过GAPDH的阈值循环(Ct)标准化后，比较和分析人MLPH mRNA的相对表达水平。
图15提供了人MLPH mRNA在“ASO 1”处理的细胞中的相对表达水平，在1μM的“ASO1”处理48小时的细胞中所述水平降低。(进行Student T检验以核查结果的统计学显著性)。
[Western印迹]将细胞如上生长。用“ASO 1”处理24和48小时后，分别收集细胞，然后用冷PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤2次并溶解在RIPA缓冲液(Cell Signaling，Cat.No.9806)中。将蛋白质用BCA溶液(Thermo，Cat.No.23225)定量并通过10％SDS-PAGE凝胶纯化。将蛋白质移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)(Millipore，Cat.No.IPVH00010)上，在5％脱脂乳缓冲液中封闭1小时。将抗MLPH(Novus，Cat.No.NBP2-45883)和抗β-肌动蛋白(Sigma，Cat.No.A3854)用作一抗，马抗兔抗体(CST，Cat.No.7076)用作二抗，对所述膜进行探查。HRP底物(Millipore，Cat.No.WBKLS0500)用于检测化学发光信号并使用Gel Doc系统(ATTO)测量信号强度。基于每个条带的Western印迹结果，用Image-J程序量化MLPH的相对表达水平并转化为图形。
图16提供了人MLPH蛋白的相对表达水平，在1μM的“ASO 1”处理细胞48小时后的水平降低。(进行Student T检验以核查结果的统计学显著性)。
[免疫荧光染色]将细胞如上生长，在“ASO 1”处理48小时后收集细胞，用4％甲醛固定，在用0.25％TritonX-100透化后在1％牛血清白蛋白中封闭1小时。将样品依次用作为一抗的抗微管蛋白(abcam，Cat.No.ab44928)和抗Trp1(Novus，Cat.No.NBP2-53252)及作为二抗的FITC附着的兔抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat.No.315-095-003)和Fluor 594附着的山羊抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch,Cat.No.111-585-144)进行免疫染色。使用DAPI(Thermo Fisher,Cat.No.62248)进行复染，并用Axio Scan Z1(CarlZeiss)在两个数量级上评估荧光数字图像。将细胞核附近的Trp1染成红色的细胞数与总细胞数的比率转换为图形。
图17通过Trp 1的红色染色提供了“ASO 1”处理的细胞中黑素小体聚集的程度。在1μM的“ASO 1”处理48小时的细胞中，与细胞骨架微管蛋白相比，靠近DAPI染色的细胞核的Trp 1红色染色提示通过抑制黑素小体运动的黑素小体聚集。(进行Student T检验以核查结果的统计学显著性)。
[水溶性氯四唑-1]将细胞如上生长并对在96孔板中生长的人黑色素细胞(1×103)进行水溶性氯四唑-1测定。在用1fM、1pM、1nM、1μM和10μM“ASO 1”处理24、48和72小时后，将1/10培养基量的EZ-CYTOX(DoGen，Cat.No.EZ-3000)加入96孔板中的细胞，将所得混合物在温育器中反应2小时。在室温振荡1分钟均质后，测量450nm处的相对吸光度并将其转换为图形。
图18提供了“ASO 1”处理的细胞的存活率。在用1fM、1pM、1nM、1μM和10μM的“ASO1”处理24、48、72小时后，72小时后在每个浓度，“ASO 1”处理的细胞的存活率均高于90％。

Claims (6)

1.式I表示的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐，其用于诱导人MLPH前体mRNA中外显子2跳过：
[式I]
其中，
n是14至17的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中的 的30-mer前体mRNA序列中以“粗体”和“下划线”标示的序列具有至少14-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地表示氢基或取代的或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代的或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；及
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少三个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代的或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价接头，其将碱性氨基与核碱基部分共价连接：
[式V]
其中，
Q1和Qm是取代的或未取代的亚甲基，并且Qm与碱性氨基直接连接；
Q2、Q3、…和Qm-1独立地选自取代的或未取代的亚甲基和氧基(-O-)；及
m是1至15之间的整数。
2.权利要求1的肽核酸衍生物，或其药物学盐：
其中，
n是14至17的整数；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA中 的30-mer前体mRNA序列中以“粗体”和“下划线”标示的序列具有至少14-mer互补重叠；
式I的化合物与人MLPH前体mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基；
X是氢基；
Y表示取代的或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代的或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的天然核碱基以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-；及
L2和L3独立地选自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-。
3.权利要求2的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述肽核酸衍生物选自以下提供的一组肽核酸衍生物：
(N→C)Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2；
其中，
A、T、G和C分别是具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的天然核碱基的肽核酸的单体；
C(pOq)、A(p)和G(p)分别是具有式VI、式VII和式VIII表示的非天然核碱基的肽核酸的单体；
其中，
p和q是整数，在(N→C)Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2中p是1、5或6以及q是2；及
“Fethoc-”是“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”的缩写。
4.权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗对象中皮肤色素沉着的药物的用途。
5.一种治疗皮肤色素沉着的药物组合物，其包含权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
6.一种治疗皮肤色素沉着的化妆品组合物，其包含权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。
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