KR20210010362A - 멜라노필린 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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황석준
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성기호
이연웅
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주식회사 올리패스코스메슈티컬즈
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Abstract

본 발명은 인간 MLPH 프리-mRNA "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치를 표적으로 하는 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 MLPH mRNA의 스플라이스 변형체의 생성을 강력하게 유도하며, 인간 MLPH 유전자의 전사에 관련된 피부 색소 침착의 질병 또는 질환을 치료하는 데 유용하다.

Description

멜라노필린 안티센스 올리고뉴클레오티드 {Melanophilin Antisense Oligonucleotides}
본 발명은 색소 침착 현상을 개선하는 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다.
급속한 인구 고령화와 경제 수준의 향상으로 삶의 질 및 건강한 노년에 대한 관심이 높아지고 있는 데, 노화의 징후가 피부에 잘 나타나므로 피부 노화와 색소 침착에 대한 관심이 특히 증가하고 있다. 피부 노화에 대한 대책은 삶의 질 측면에서 매우 중요한 요소로서, 건강식품, 화장품 및 관련 의약품 등이 많은 관심을 끌고 있다. 피부의 노화 요인은 시간이 지남에 따라 발생하는 자연적인 내인성 노화와 자외선, 흡연 및 영양 불균형 등과 같이 외부 요인에 의해 발생하는 외인성 노화로 나뉜다.
미백제: 항노화 화장품은 매우 빠른 속도로 성장하고 있는 데, 미백제가 그 중에서 큰 축을 이루고 있다. 기존에 개발된 미백제는 멜라닌 합성에 관여하는 다양한 기전에 기초한 소재가 많은 데, 티로시나제가 그 중에서도 대표적인 표적이다. 하지만 많은 미백 소재가 개발되었음에도 불구하고 안전성 및 기능성, 기준 및 시험방법이 확립된 소재가 많지 않으며 일부는 유해성 논란을 겪고 있다 [Int. J. Cosmetic Sci. vol 33, 210-221 (2011); Int. J. Mol. Sci. vol 10, 2440-2475 (2009); Phytother Res. Vol 21, 805-816 (2007)]. 최근에 일본에서 개발한 미백 화장품의 주요 성분인 Rhododenol®은 (로도데놀) 백반증을 유발하는 부작용이 확인되어 화장품 소재의 안전성 논란이 지속되고 있다 [Pigment Cell Melanoma Res Vol 27, 754-763 (2014)]. 따라서 안전성 논란이 있는 멜라닌 합성에 관여하는 기전이 아닌 새로운 기전을 표적으로 하는 소재를 개발하여 효능과 안전성을 확보할 필요가 있다.
또한, 다양한 티로시나제 억제제들이 존재하지만, 티로시나제에 대한 이들의 IC50 값은 대부분의 경우에 마이크로몰(μM)이다 [J. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol 32(1), 403-425 (2017)]. 상기와 같은 IC50 값은, 그들의 분자 크기를 고려할 때 불충분한 것으로 간주되며, 다른 분자 표적(들)과의 교차 반응 가능성을 일으킨다. 불충분한 억제 활성은 다량의 경피 용량을 요구하기 때문에, 피부 착색에 대한 목적하는 경피 활성 및 안전성을 충족시키기 위해서는 억제 효능의 현저한 개선이 필요하다.
멜라노필린 (melanophilin): 멜라노솜은 (melanosome) 동물에서 가장 흔하게 빛을 흡수하는 색소인 멜라닌을 합성, 저장 및 운반하는 세포소기관으로 (organelle) 직경이 500 nm에 이른다. 멜라닌 형성세포는 (melanocyte) 멜라노솜을 핵 근처에서 만들어서 세포 끝으로 이동시키고, 주변의 각질 형성세포로 (keratinocyte) 전달하여 색소 침착을 일으킨다. 멜라닌 세포 내에서 멜라노솜은 액틴 필라멘트를 (actin filament) 따라 이동하는 데, 그러한 이동에는 세 가지 단백질이 관여되어 있다. 즉, 멜라노솜에 붙어있는 연결 단백질의 한 종류인 Rab27A, 액틴 필라멘트에 부착된 운동 단백질 미오신-Va (Myosin-Va) 그리고 그 사이를 연결시켜 주는 멜라노필린 등의 세 개의 단백질들이 복합체를 이루어 멜라노솜을 이동시킨다 [Kor. J. Aesthet. Cosmetol. Vol 11, 417-426 (2013)]. 따라서 이러한 단백질들의 발현을 억제하면, 멜라노솜을 각질 형성세포로 이동시키는 것이 저해되어 색소 침착을 막을 가능성이 있다.
세 가지 단백질들 중에서 Rab27A와 미오신-Va의 발현이 억제되었을 때, 저색소증 (hypopigmentation) 뿐만 아니라 면역 손상 및 신경 손상이 일어난다고 보고되었다 [Nat. Genet. Vol 25 173-176 (2000); J. Cell Biol. Vol 152, 835-842 (2001); J. Neurol. Vol 247, 570-572 (2000)]. 반면에, 멜라노필린은 멜라닌 형성세포에서만 발현되며, 이의 발현이 억제되었을 때 저색소증만 보일 뿐 다른 합병증은 일어나지 않는다고 보고되었다 [J. Clin. Invest. Vol 112, 450-456 (2003)]. 따라서, 멜라노필린의 생성에 관여하는 작용 기전에 기초한 물질은 그 효능뿐만 아니라 안전성도 예상되어 우수한 화장품 소재 또는 색소성 피부 질환 치료제의 가능성이 커서 매우 흥미롭고 필요한 과제이다.
프리-mRNA: 유전 정보는 DNA (2-deoxyribose nucleic acid)를 통해 전달된다. DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사되는 데 포유류의 프리-mRNA는 엑손(Exon)과 인트론(Intron)으로 구성되어 있으며 서로 연결되어 있다 (도 1a 참고).
프리-mRNA 스플라이싱(Splicing): 프리-mRNA는 도 1b에서 요약한 대로 “스플라이싱”이라 부르는, 인트론의 제거로부터 시작되는 일련의 과정을 통해서 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. Vol 72, 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. Vol 6, 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. Vol 15, 108-121 (2014)].
작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35은 인트론 N과 엑손 (N+1)에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는 데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 작업이 진행된다.
리보솜(Ribosome)의 단백질 합성: 단백질은 DNA에 있는 암호에 의해 합성된다. 핵에서 DNA로부터 전사된 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 결과적으로 생성된 m-RNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry, Vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. Vol 48, 2659-2668 (1988)].
안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO, Antisense Oligonucleotide): DNA, mRNA 및 프리-mRNA에 염기서열 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드라고 한다. 만약 ASO가 세포질에서 mRNA에 강하게 결합한다면 리보솜에 의한 mRNA로부터의 단백질 합성을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 세포질 안에 있어야만 한다.
안티센스의 스플라이싱 저해: 만약 ASO가 핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합한다면 ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 저해 혹은 조절할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 핵 안에 있어야만 한다. 이렇게 안티센스의 스플라이싱 저해에 의해 생성된 mRNA는 ASO가 표적하였던 엑손이 결여되어 있는데, 이러한 mRNA는 접합부 변형체 또는 스플라이스 변형체라고 (splice variant) 불리며 원래의 단백질보다 짧은 길이의 단백질을 생성한다.
스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 저해하면 스플라이싱을 막을 수 있을 것이라 예상되는 데, 실제로 ASO가 (5'
Figure pat00001
3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 ASO는 프리-mRNA와 U1의 결합을 막고 결과적으로 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다. 이와 유사하게 ASO가 (5'
Figure pat00002
3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다. 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치는 도 1c에 제공한다.
비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오티드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈에 (nuclease) 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 올리고뉴클레오티드가 연구되고 개발되어 왔는 데 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol 33, 533-540 (2006)] 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비교하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오티드 중 몇몇의 화학 구조가 도 2a에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 예상대로 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 결합한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(PTO, Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. Vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터(transporter)가 많이 발현된 간 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. Vol 25, 3290-3296 (1997)].
PTO의 세포투과력을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
과거 30년에 걸쳐, 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역질환, 대사성 질환 등의 질환을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry Vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol 33, 533-540 (2006)]. 상당수의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포투과성 부족으로 성공적이지 못하였다. PTO의 세포투과력 부족을 극복하기 위해서는, 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 컴플리먼트(Complement) 활성화, 신장 독성(Tubular Nephropathy), 쿠퍼(Kupffer) 세포 활성화, 비장 비대, 림프절 비대, 단핵식균세포(Mononuclear Cell) 침윤 등 다양한 독성이 수반된다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장의 기여도가 큰 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센(Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation Vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr. Opin. Mol. Ther. Vol 6, 331-336 (2004)].
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 RNA의 리보스(Ribose) 골격이 구조적으로 제한된 핵산으로서, 핵산 결합력이 매우 강하다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry Vol 45, 7347-7355 (2006)].
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO, Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스(2-Deoxyribose)와 포스페이트(Phosphate)가 각각 포스포로아미데이트(Phosphoamidate)와 모폴린(Morpholine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 전하가 없다. 따라서 PMO와 mRNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 mRNA의 결합은 DNA와 mRNA의 결합보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(hepatic transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PMO는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸)글리신[Aeg, N-(2-aminoethyl)glycine]을 단위 골격으로 갖는 폴리펩티드로서 니엘슨(Nielsen) 등에 의해 발명되었다. [Science Vol 254, 1497-1500 (1991)] PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 도 2b에 도시되었다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 결합한다 [Nature (London) Vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 갖고 있지 않기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. 아울러 PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PNA는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv. Drug Delivery Rev. Vol 55, 267-280 (2003)].
변형된 핵산염기로 세포투과성을 높인 PNA: 양이온성 지질(Cationic Lipid)이 핵산염기에 공유 결합으로 연결된 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산염기는 도 2c에 제공된다. 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 시토신과 각각 상보적으로 결합한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 리포펙션과 (lipofection) 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는 데, 그러한 복합체는 리포펙션으로 처리하지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 상보적인 DNA와 듀플렉스(duplex)를 형성할 때 4~5개의 변형된 핵산염기가 도입된 11~13머 (11~13-mer)의 PNA는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC이상 높은 Tm 값을 보인다. 또한, 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합에도 (mismatch) 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 순서에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
작은 간섭 RNA (siRNA, Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질 인자로 형성된 “RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체”는 (RISC) siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합하여 mRNA를 절단함으로써 mRNA가 단백질을 합성하는 것을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo) 효과가 잘 나타나지 않는다.
MLPH의 siRNA: 21개의 염기 서열로 이루어진, MLPH mRNA의 일부를 표적으로 하는 20 μM 농도의 MLPH siRNA를 melan-a 세포에 처리한 결과 MLPH 단백질의 형성을 저해하여 멜라노솜의 이송을 억제하고 결과적으로 멜라노솜 응집을 일으킨다는 것이 보고되었다 [Appl. Biochem. Biotechnol. Vol 172, 1882-1897 (2014)]. 이러한 결과는 멜라노필린의 생성에 관여하는 작용 기전에 기초한 물질 개발에 도움이 될 것이다.
기존에 개발된 미백제는 멜라닌 합성에 관여하는 다양한 기전에 기초한 소재가 많은 데, 많은 미백 소재가 개발되었음에도 불구하고 안전성 및 기능성, 기준 및 시험방법이 확립된 소재가 많지 않으며 일부는 유해성 논란을 겪고 있다. 따라서 안전성 논란이 있는 멜라닌 합성에 관여하는 기전이 아닌 새로운 기전을 표적으로 하는 소재를 개발하여 효능과 안전성을 확보할 필요가 있다. 멜라노필린의 생성에 관여하는 작용 기전에 기초한 물질 개발은 그 효능뿐만 아니라 안전성도 예상되어 우수한 화장품 소재 또는 색소성 피부 질환 치료제의 가능성이 커서 매우 흥미롭고 필요한 과제이다.
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 (PNA 유도체) 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00003
화학식 I 중에서,
n은 10과 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소(Hydrido), 중수소(Deuterido), 치환체가 있거나 없는 알킬(Alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴(Aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 중수소, 포밀[H-C(=O)-], 아미노카르보닐[NH2-C(=O)-], 아미노티오카르보닐[NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시(Alkyloxy), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시(Aryloxy), 치환체가 있거나 없는 알킬아실(Alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실(Arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐(Alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카르보닐(Aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카르보닐(Alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카르보닐(Arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카르보닐(Alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카르보닐(Arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카르보닐(Alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카르보닐(Aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐(Alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐(Arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐(Alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐(Arylphosphonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 중수소, 하이드록시(Hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌(Adenine), 티민(Thymine), 구아닌(Guanine), 시토신(Cytosine), 그리고 우라실(Uracil)을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 엑손 2의 스키핑(exon skipping)을 유도하여 엑손 2가 결여된 인간 MLPH mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, 인간 멜라노필린 단백질의 활성과 연관된 화장품 소재 또는 색소성 피부 질환 치료제로 유용하다.
화학식 I의 화합물을 서술하는 데 사용된 조건인 “n은 10과 21 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 그리고 20 중에서 선택된다"는 것이다.
3' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물은 인간 MLPH 유전체 DNA에서 [NCBI 참고 서열: NG_007286] 유래된 인간 MLPH 프리-mRNA에서 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합한다. 인간 MLPH 프리-mRNA에서 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 30-머 서열은, 15-머는 "인트론 1"으로 그리고 15-머는 "엑손 2"로 구성되는 3' 스플라이스 위치이다. 즉 30-머 프리-mRNA는 전통적으로 [(5'→3')ccugugacauuccag┃GUGUGACCCCGACAA]로 표시되는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 "인트론 1"과 "엑손 2"의 연결 부분을 나타낸다.
화학식 I의 PNA (Peptide Nucleic Acid) 유도체에 포함되는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기의 구조는 도 3에 예시되어 있다. 본 발명에서 천연 또는 비천연 핵산염기는 도 3에서 제공된 핵산염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 비천연 핵산염기들은 단지 핵산염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들은 도 4a-4e에 예시되어 있다. 도 4a는 치환체가 있거나 없는 알킬의 예들을 제공하며, 도 4b는 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예들을 예시한다. 도 4c는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴포스포닐의 예들을 나타낸다. 도 4d는 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴아미노카르보닐의 예들을 제공한다. 도 4e는 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴옥시티오카르보닐의 예들을 제공한다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA에 염기서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 DNA나 RNA와의 듀플렉스는 (duplex) 너무 높은 Tm 값을 가지고 있어서 완충 수용액에서 확실하게 측정하기 어렵다. 화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 짧은 길이의 DNA와도 높은 Tm 값을 나타낸다.
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 유전자로부터 전사된 프리-mRNA의 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여 초기 스플라이스 복합체의 형성을 막음으로써 엑손 2가 결여된 (엑손 2 스키핑) 인간의 MLPH mRNA를 생성한다.
화학식 I의 화합물은 RNA에 대한 결합력이 아주 크기 때문에, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 한두 개의 부정합이 있어도 엑손 2 스키핑을 일으킨다. 또한, 화학식 I의 화합물은 표적 스플라이스 위치에 한두 개의 염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 포함하는 인간의 돌연변이 MLPH 프리-mRNA에 대해서도 엑손 2 스키핑을 일으킨다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수하여 올리고뉴클레오티드 그 자체가 쉽게 세포에 전달된다 [PCT/KR2009/001256]. 세포에 화학식 I의 화합물을 올리고뉴클레오티드 그 자체로 투여하면 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 엑손 2의 스키핑을 유도하여 엑손 2가 결여된 인간의 MLPH mRNA 스플라이스 변형체를 형성한다. 화학식 I의 화합물은 특별한 제제 없이도 세포에 쉽게 전달되어 세포 안에 있는 표적 엑손의 스키핑을 강하게 유도한다. 세포에 화학식 I의 화합물을 올리고뉴클레오티드 그 자체로 투여하면 펨토몰 이하의 농도에서도 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 엑손 2의 스키핑을 쉽게 유도한다.
화학식 I의 화합물의 우수한 세포투과성으로 인하여 올리고뉴클레오티드 그 자체를 국소적으로 (topically) 투여하여도 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 엑손 2의 스키핑을 쉽게 유도한다. 화학식 I의 화합물은 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 위해 피부를 통해 표적 조직으로 전달하기 위한 제제가 필요하지 않다. 물과 조용매에 녹인 화학식 I의 화합물을 피코몰 이하의 농도로 피부에 투여하여도 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 나타낸다. 본 발명의 화합물은 피부에 치료 효과를 나타내기 위해 과도하거나 침습적인 제제가 필요 없기는 하지만, 피부 크림이나 로션을 만들기 위해 화장품 구성물(ingredients)이나 보조제(adjuvants)를 제제에 사용할 수 있다. 그러한 피부 크림이나 로션은 피부 색소 침착을 개선하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화학식 I의 화합물은 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 위해 1 아토몰(1 aM)에서 1 나노몰(1 nM)의 농도로 피부를 통해 투여할 수 있는데, 그 농도는 대상자의 증상이나 투여 일정에 따라 변할 수 있다.
화학식 I의 화합물 (PNA 유도체)은 다양한 투약 형태, 예를 들면 비제한적으로 주사제, 비강 스프레이 (nasal spray), 경피 흡수 (transdermal) 제형 등으로 제형화할 수 있다. 또한 화학식 I의 화합물은 치료학적으로 효과적인 용량으로 대상에게 (subject) 투여할 수 있고, 투여 용량은 적응증, 투약 경로, 투약 스케줄, 대상자의 상태 등에 따라 다양하다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (Sodium Hydroxide), 수산화 칼륨 (Potassium Hydroxide), 염산 (Hydrochloric Acid), 황산(Sulfuric Acid), 메탄설폰산 (Methanesulfonic Acid), 구연산 (Citric Acid), 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic Acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 PNA 유도체는 약제학적으로 허용 가능한 보조제와 (Adjuvant) 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (Tartaric Acid), 스테아린산, 폴리프로필렌글리콜 (Polypropyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (Isopropanol), 중탄산나트륨 (Sodium Bicarbonate), 증류수, 방부제 (Preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10과 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 중수소 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 중수소, 포밀, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
Figure pat00004
화학식 II, III 및 IV 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 또는 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기 부위를 연결시켜 준다:
Figure pat00005
[화학식 V]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌(methylene: -CH2-, -CH(치환체)- 또는 -C(치환체)2-]이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
본 발명의 더 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11과 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
Q2, Q3,
Figure pat00006
, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 더욱더 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11과 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐이며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는 화학식 II, 화학식 III, 또는 화학식 IV로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 혹은 -CH2-O-(CH2)5-를 나타내며; 그리고,
L2와 L3는 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
본 발명의 PNA 유도체 중 특별히 관심이 있는 것으로서 그 구체적인 예는, 다음 식의 PNA 유도체들(이하, 순서대로 ASO 1, 6, 7, 및 8로 각각 지칭함)과 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
(N→C) Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2;
(N→C) Fethoc-C(1O2)GG(6)-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)A-NH2;
(N→C) Fethoc-GG(6)G-G(6)TC-A(5)CA(5)-C(1O2)CT-G(6)GA(5)-ATG(6)-NH2; 및
(N→C) Fethoc-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)AT-G(6)TC(1O2)-NH2;
상기 PNA 유도체들의 식에서,
A, T, G, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 PNA 모노머(monomer)이며;
C(pOq), A(p)와 G(p)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII과 화학식 VIII로 대표되는, 비천연 핵산염기로 변형된 시토신, 아데닌과 구아닌을 포함하는 PNA 모노머이다;
Figure pat00007
[화학식 VI]
Figure pat00008
[화학식 VII]
Figure pat00009
[화학식 VIII]
화학식 VI, 화학식 VII 및 화학식 VIII에서,
p와 q는 정수인데, 상기 식의 PNA 유도체들 중 ASO 1을 예로 들어 설명하면, p가 1, 5, 또는 6에 해당되고 q는 2에 해당되는 것이며; 그리고,
약자인 "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카르보닐", 즉 "[2-(9-fluorenyl)ethyl-1-oxy]carbonyl"을 의미하며, "-NH2"는 비치환 "아미노"기이다.
PNA 모노머인 A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) 및 G(pOq)의 화학적 구조는 도 5에 명확하게 제공된다. 선행 기술에서 상술한 바와 같이 [PCT/KR2009/001256], C(pOq)는 구아닌과 상보적인 결합을 하기 때문에 “변형 시토신” PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 A(p)는 티민과 상보적인 결합을 하기 때문에 “변형 아데닌” PNA 모노머로, G(p)는 시토신과 상보적인 결합을 하기 때문에 “변형 구아닌” PNA 모노머로 인식된다. 또한 화학 구조의 명확한 제시를 위해 14-머 PNA 유도체인 "(N→C) Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2" ASO 1 (Antisense Oligonucleotide 1)의 구조가 도 6에 제공된다.
ASO 1은 "(5'→3') GGT-CAC-ACC-TGG-AA" 서열을 갖는 DNA와 동일하게 프리-mRNA와 상보적 결합을 한다. 이 14-머 PNA는 인간 MLPH 프리-mRNA의 인트론 1과 엑손 2 결합 부분 중에서도 굵게 밑줄친 부분에 상보적으로 결합한다: [(5'→3') ccugugaca uuccag ┃ GUGUGACC CCGACAA].
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간 MLPH 유전자의 전사에 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 피부 색소 침착을 치료 또는 개선하기 위한 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MLPH 유전자 전사 관련 질병 또는 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MLPH 유전자 전사 관련 징후 또는 증상 개선용 화장품을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 색소 침착 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 색소 침착 개선용 화장품을 제공한다.
본 발명에 따르는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여함으로써 인간 MLPH 유전자의 전사에 관련된 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에 따르는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여함으로써 인간 MLPH 유전자의 전사에 관련된 징후 또는 증상을 개선할 수 있다.
또한 본 발명에 따르는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하여 함으로써 피부 색소 침착을 개선할 수 있다.
도 1a. 프리-mRNA의 구조 .
도 1b. 인트론 N을 제거하는 스플라이싱 과정의 도식화.
도 1c. 스플라이스오솜 E 복합체에 대한 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치의 도식화.
도 2a. DNA와 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 2b. PNA의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 2c. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기의 예.
도 3a-3c. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 4a. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 치환체의 예로서, 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 4b. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 치환체의 예로서, 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 4c. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 치환체의 예로서, 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 4d. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 치환체의 예로서, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카르보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카르보닐의 예.
도 4e. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 있어서 선택될 수 있는 치환체의 예로서, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카르보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카르보닐의 예.
도 5. A (아데닌), G (구아닌), T (티민), C (시토신), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) 및 G(pOq)로 축약된 PNA 모노머의 화학 구조.
도 6. "(N→C) Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2"로 축약된 14-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 7. 본 발명의 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc-PNA 모노머의 화학 구조.
도 8. 본 발명의 고체상 펩타이드 합성에서 전형적인 모노머 신장주기의 도식화.
도 9a. "ASO 2"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 9b. "ASO 2"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 10. HPLC로 정제한 "ASO 2"의 ES-TOF 질량 스펙트럼 데이터.
도 11a-11d. “ASO 2”, “ASO 3”, “ASO 4” 및 “ASO 5”를 처리한 흑색종 melan-a 세포에서의 실시간 qPCR 데이터.
도 12a-12c. “ASO 3”, “ASO 4” 및 “ASO 5”를 처리한 흑색종 melan-a 세포에서의 전기영동 결과.
도 13a-13d. “ASO 2”, “ASO 3”, “ASO 4” 및 “ASO 5”를 처리한 흑색종 melan-a 세포에서의 웨스턴 블럿 데이터.
도 14a. 음성 대조군 및 siRNA 또는 ASO를 처리한 세포에서 멜라노솜의 응집 정도를 평가하기 위한 현미경 촬영 이미지.
도 14b. 멜라노솜 응집의 정량 측정 도표.
도 15. “ASO 1”을 처리한 인간 멜라닌세포에서 실시간 qPCR 데이터.
도 16. “ASO 1”을 처리한 인간 멜라닌세포에서 웨스턴 블럿 데이터.
도 17. “ASO 1”을 처리한 인간 멜라닌세포에서 멜라노솜의 응집 정도를 평가하기 위한 현미경 촬영 이미지와 멜라노솜 응집 세포 비율.
도 18. “ASO 1”을 처리한 인간 멜라닌세포에서 상대적인 세포 생존율.
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
변형된 핵산염기를 가진 PNA 모노머들은 선행 기술 [PCT/KR 2009/001256]에서 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 합성하였다. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머의 화학적 구조는 도 7에 제공된다. 도 7에 제공된 변형 염기를 갖는 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다. 변형된 핵산염기를 가진 Fmoc[{(9-fluorenyl)methoxy}carbonyl]으로 보호된 PNA 모노머들과 천연 핵산염기를 가진 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들을 사용하여 도 8과 같이 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 화학식 I의 PNA 올리고머를 고체상으로 합성하였다. 합성에 사용된 고체상은 PCAS 바이오마트릭스사 (PCAS BioMatrix Inc., Quebec, Canada)에서 구매한 H-링크 아미드-캠마트릭스 (H-Rink Amide-ChemMatrix) 레진을 주로 사용하였다. 이렇게 합성된 PNA 올리고머는 C18-역상(Reverse Phase) HPLC (증류수/아세토니트릴 또는 증류수/메탄올, 0.1% TFA)를 이용하여 분리 정제하고, ESI/TOF/MS를 포함하는 질량분석기로 동정하였다. 도 9a-9B는 “ASO 2”을 HPLC 정제하기 전과 후의 HPLC 크로마토그램이고 도 10은 HPLC로 정제한 “ASO 2”에 대한 ESI/TOF/MS 스펙트럼으로서, 본 발명의 PNA 올리고머들에 대한 설명을 목적으로 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
도 8은 고체상 합성의 전형적인 과정을 도식화 하였는데 각각의 반응 과정은 다음과 같이 간략히 제공한다.
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 레진의 아민에 Fmoc 보호기가 붙어있지 않을 경우에 해당되며, 0.01 mmol (약 20 mg 레진)과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드(MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc 제거(DeFmoc)] 레진의 아민에 Fmoc 보호기가 붙어있을 경우에 해당되며, 0.01 mmol (약 20 mg 레진)과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링(Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol PNA monomer, 0.05 mmol HBTU, 그리고 0.1 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 2분 후에 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[캡핑(Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액(capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 레진의 N-말단 아민은 다음과 같은 방법으로 "Fethoc-OSu"와 반응하여 "Fethoc"기가 도입 된다. 0.1 mmol Fethoc-OSu와 0.1 mmol DIEA를 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같다.
Figure pat00010
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액(cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진으로부터 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압에서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진으로부터 분리된 PNA 유도체의 조생성물(crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 9a와 9b는 "ASO 2"의 정제 전과 후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
인간 MLPH 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체를 위의 방법에 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 인간 MLPH 프리-mRNA를 표적으로 하는 이러한 PNA 유도체는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
인간 MLPH 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체와 매스 구조 분석 데이타.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
theor.a obs.b
ASO 1 Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2 4664.183 4664.193
ASO 6 Fethoc-C(1O2)GG(6)-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)A-NH2 5679.643 5679.673
ASO 7 Fethoc-GG(6)G-G(6)TC-A(5)CA(5)-C(1O2)CT-G(6)GA(5)-ATG(6)-NH2 5987.803 5987.870
ASO 8 Fethoc-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)AT-G(6)TC(1O2)-NH2 5920.738 5920.798
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 1은 인간 MLPH 유전자로부터 [NCBI 참고 서열: NG_007286] 전사된 인간 MLPH 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체와 매스 구조 분석 데이터를 제공한다. 표 1의 ASO는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
"ASO 1"은 인간 MLPH 프리-mRNA의 인트론 1과 엑손 2 결합 부분에서 다음의 30-머 RNA 서열 중 굵게 밑줄친 부분에 상보적으로 결합하는 14-머 PNA이다: [(5'→3') ccugugaca uuccag ┃ GUGUGACC CCGACAA]. "ASO 1"은 인간 MLPH 프리-mRNA의 인트론 1과 6머, 그리고 엑손 2와 8머의 상보적인 결합을 한다.
쥐 MLPH 프리-mRNA에 상보적인 PNA 유도체에 대한 합성 예
시중에서 쉽게 구할 수 있는 생쥐 피부 유래 멜라닌 생성세포를 (MELAN-A) 이용한 효능 평가를 수행하기 위하여, 쥐 MLPH 유전체 DNA에서 [NCBI 참고 서열: NC_000067] 유래된 쥐 MLPH 프리-mRNA에서 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체를 합성하였다. 쥐 MLPH 프리-mRNA에서 [(5'→3') CCUGUGACUUUCUAGGUGUGGCCUGGAUGA] 30-머 서열은, 15-머는 "인트론 1"으로 그리고 15-머는 "엑손 2"로 구성되는 3' 스플라이스 위치이다. 즉 30-머 프리-mRNA는 전통적으로 [(5'→3')ccugugacuuucuag┃UGUGGCCUGGAUGA]로 표시되는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 "인트론 1"과 "엑손 2"의 연결 부분을 나타낸다.
MLPH 프리-mRNA를 표적으로 하는 이러한 PNA 유도체는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
쥐 MLPH 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체와 매스 구조 분석 데이타.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
theor.a obs.b
ASO 2 Fethoc-GG(5)C-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TA(6)G-A(6)A-NH2 4662.215 4662.225
ASO 3 Fethoc-C(12)CA(5)-GG(6)C-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TA(5)G-A(5)A-NH2 5594.637 5594.510
ASO 4 Fethoc-GG(6)C-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TA(5)G-A(5)AA(5)-GTC(1O2)-NH2 5900.745 5900.555
ASO 5 Fethoc-CA(5)G-G(6)CC-A(5)CA(5)-C(1O2)CT-A(5)GA(5)-AA(5)G-NH2 5902.819 5912.324
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 2는 쥐 MLPH 유전자로부터 전사된 쥐 MLPH 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체와 매스 구조 분석 데이터를 제공한다. 표 2의 PNA 유도체는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
"ASO 3"은 쥐 MLPH 프리-mRNA의 인트론 1과 엑손 2 결합 부분에서 다음의 RNA 서열 중 굵게 밑줄친 부분에 상보적으로 결합하는 17머 PNA이다: [(5'→3') ccugugacu uuctag ┃ GUGUGGCCUGG AUGA]. "ASO 3"은 쥐 MLPH 프리-mRNA의 인트론 1과 6머, 그리고 엑손 2와 11머의 상보적인 결합을 한다.
“ASO”와 상보적인 DNA와의 결합력(Binding Affinity)
화학식 I PNA 유도체의 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA들과의 결합력을 측정하였다. 결합력은 PNA와 상보적인 10-머 DNA 이중나선의 Tm 값으로 평가하였다. PNA와 전체 길이의 상보적인 DNA 이중나선의 Tm 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 Tm 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다. 따라서 10-머 길이의 DNA와의 Tm 값을 측정하여 전체 길이의 결합력을 예측하였다.
Tm은 UV/Vis 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브(falcon tube)에서 320 마이크로리터(μL)의 50 마이크로몰(μM) PNA 올리고머와 320 마이크로리터(μL)의 50 마이크로몰(μM)인 상보적인 10-머 DNA를 완충 용액(pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl) 3.36 mL에 섞은 후, 90oC에서 수분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 애질런트(Agilent) 8453 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하였다. 큐벳의 온도를 분당 0.5 혹은 1.0oC 속도로 올리면서 260nm에서 흡광도 변화를 측정하고 흡광도 변화율이 가장 큰 온도, 즉, 변곡점을 PNA 올리고머와 10-머 DNA 사이의 Tm 값으로 정하였다. Tm 측정에 사용된 DNA는 대전의 (주)바이오니아(www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
화학식 I PNA 유도체의 Tm 값은 상당히 높게 나타났는 데, 그 결과들은 표 3에 요약되었다.
PNA 유도체와 N-말단이나 C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA들과의 Tm 값.
PNA 예 Tm 값, oC
N-말단 10-머 DNA C-말단 10-머 DNA
ASO 1 81.02 90.37
ASO 6 76.07 86.47
ASO 7 85.47 77.22
ASO 8 83.52 73.12
예를 들면, “ASO 1”은 PNA에서 밑 줄 및 굵게 표시된 [(N→C) Fethoc- GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-T G(5)G-A(6)A-NH2] N-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA와 81.02oC의 Tm 값이 측정되었다. 반면에, “ASO 1”은 PNA에서 밑줄 및 굵게 표시된 [(N→C) GG(5)T-C A(6)C-A(6)C(1O2)C- TG(5)G-A(6)A -NH2] C-말단이 표적인 상보적인 10-머 DNA와 90.37oC의 Tm 값이 측정되었다.
화학식 I PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예
생쥐 유래 세포인 쥐 흑색종 Melan-a와 인간 멜라닌 세포에서 실시간 정량적 연쇄 중합반응 (Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 등을 이용하여 PNA 유도체들의 MLPH 안티센스 (antisense) 효능을 평가하였다. 이러한 안티센스 효능 평가 예들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
실시예 1. 쥐 흑색종 Melan-a 세포에서 ASO들이 MLPH 발현에 끼치는 영향 평가.
쥐 흑색종 (melanoma) Melan-a 세포에서 ASO 2, ASO 3, ASO 4 및 ASO 5가 MLPH 발현에 어떤 영향을 어느 정도 끼치는가를 아래와 같은 실험 과정을 통해 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 쥐 흑색종 Melan-a 세포를 RPMI 1640 (GIBCO, Cat. No.11875-093) 배지에 10% 소 혈청 (Fetal Bovine Serum) (Cat. No. 10099-41, GIBCO)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Cat. No. 15140-122, GIBCO) 및 200 nM TPA(Sigma, Cat. No.79346)를 첨가하여 사용하였고, 37oC, 5% CO2 조건에서 세포 배양하였다. 쥐 흑색종 Melan-a 세포를 60 mm 배양접시에 2×105개 접종하고 24시간 배양하여 안정화시킨 후, ASO 2, ASO 3, ASO 4 및 ASO 5를 각각 0 (음성 대조용), 100 zM, 10 aM, 1 fM 및 1 μM의 농도로 48 시간 처리하였다.
[RNA분리 및 cDNA 합성] ASO가 처리된 세포를 수확한 후 알니지 미니 키트 (RNeasy Mini kit) (Qiagen, Cat. No. 714106)의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였으며, cDNA는 500ng의 RNA를 대상으로 프라임스크립트 첫번째 가닥 cDNA 합성 키트 (PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis kit) (Takara, Cat. No.6110A)를 사용하여 제조하였다. PCR 튜브에 500ng의 RNA와 1 ㎕의 무작위 헥사머 그리고 1 ㎕ dNTP (10 mM)를 넣고 DEPC 처리수를 총 10 ㎕가 되게 하여 65℃에서 5분간 반응하였다. 여기에 PrimeScript RTase 반응 혼합물 10 ㎕를 추가로 첨가하여 30℃에서 10분간 반응한 후 42℃에서 60분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
[실시간 qPCR] 합성된 cDNA를 이용하여 MLPH mRNA 발현율을 확인하기 위해 택만 탐색을 이용한 실시간 qPCR을 진행하였다. PCR 튜브에 cDNA, 택만 탐색 (Thermo, Cat. No.Mm00453498_m1), IQ supermix (BioRad, Cat. No.170-8862) 및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 반응액을 제조하였다. 반응액 제조 후 CFX96 Touch Real-Time system (BioRad)을 이용하여 95℃에서 3 분 동안 진행한 후, 40주기의 95℃ 10 초, 60℃ 30 초를 수행하였고, 매 cycle 이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과 별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle (Ct)값을 GAPDH의 Ct값으로 표준화한 후, 상대적인 MLPH mRNA의 발현량을 비교하여 분석하였다.
도 11a, 도 11b, 도 11c 및 도 11d는 각각 ASO 2, ASO 3, ASO 4 및 ASO 5를 처리한 세포에서 상대적인 MLPH mRNA의 발현량을 제공한다. ASO 2를 제외한 ASO 3, ASO 4 및 ASO 5를 처리한 세포에서 용량 의존적으로 감소하였다 (독립표본 T-검정).
[엑손 스키핑] 합성된 cDNA를 이용하여 MLPH 엑손 스키핑을 확인하기 위해 표준 PCR을 수행하였다. 표준 PCR은 PCR 프리믹스를 (바이오니아, Cat. No. K-2612, 대한민국) 사용하여 수행하였고 실험에 사용된 프라이머는 순방향- (5'→3') TAG CTC AGT GCA CCC TGA CA , 역방향- (5'→3') GAG AGA CCG GAT CAC TTT GG 이다. PCR은 95℃에서 5 분간 진행한 후, 25주기의 95℃ 1분, 59℃ 1분 및 72℃ 2분을 진행하고 72℃에서 3분간 추가로 진행하였다.
중합효소 반응이 완료된 산물 10 ㎕를 2% 아가로스 겔 (Agarose Gel) 상에서 전기영동하고, 타겟 크기의 밴드를 추출하여 생거 시퀀싱을 통해 엑손 스키핑 시퀀스를 동정하였다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 각각 ASO 3, ASO 4 및 ASO 5를 처리한 세포에서의 전기영동 결과를 제공한다. ASO 4를 처리한 세포에서는 엑손 스키핑에 해당하는 밴드가 관찰되지 않았으며, ASO 5를 1 μM을 처리한 세포에서는 엑손 2의 스키핑에 해당하는 밴드가 약하게 관찰되었고, ASO 3를 1 μM을 처리한 세포에서는 전장 즉 전체 길이 MLPH mRNA에 해당하는 밴드 대신 엑손 2의 스키핑에 해당하는 밴드만 관찰되었다. 즉, ASO 3는 1 μM 농도에서 MLPH 프리-mRNA의 3' 스플라이스 위치를 표적하여 엑손 2가 스키핑된 MLPH mRNA의 스플라이스 변형체를 생성한다.
[웨스턴 블럿] 세포배양은 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 수세하고, RIPA buffer (Cell Signaling, Cat. No.9806)로 용해하였다. BCA용액(Thermo, Cat. No.23225)를 이용하여 단백질 정량을 하였고, 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE gel을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 (Millipore, Cat. No. IPVH00010) 전달한 후 5 % 탈지유 완충용액에서 1 시간 블로킹을 하였다. 항-MLPH와 (Proteintech, Cat. No.10338-1AP) 항-β-액틴을 (Sigma, Cat. No. A3854) 1차 항체로 사용하고, 각각의 항체에 따라 goat anti-Rabbit을 (CST, Cat. No. 7074) 2차 항체로 사용하였으며, HRP 기질을 (Millipore, Cat. No. WBKLS0500) 이용하여 발광시키고 겔독을 (Geldoc, ATTO) 통해 발광 정도를 측정 하였다. 웨스턴 블럿의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 Image-J 프로그램으로 정량하여 MLPH의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
도 13a, 도 13b, 도 13 C 및 도 13 D는 각각 ASO 2, ASO 3, ASO 4 및 ASO 5를 처리한 세포에서의 MLPH 단백질 발현량을 제공한다. 전체적으로 ASO를 처리한 세포에서 MLPH 단백질 발현량이 감소하였는데, 그 중에서도 특히 ASO 3를 처리한 세포에서 MLPH 단백질 발현량이 용량 의존적으로 감소하였다 (독립표본 T-검정).
[멜라노솜 응집] 세포배양은 동일하며, 멜라노솜의 응집이 일어났는지 확인하기 위해 양성 대조군으로 멜라노필린 siRNA를 처리하여 비교하였다. siRNA 처리는 다음과 같이 진행하였다.
siRNA는　대한민국 대전의 바이오니아 사에서 구매하여 사용하였으며, 센스 (5'→3') GGGCAAAAUACAAAAGGAG, 안티센스 (5'→3')CUCCUUUUGUAUUUUGCCC의 서열을 갖고 있다. 60 mm배양접시에서 흑색종 Melan-a 세포를 24시간 배양한 후 Opti-MEM(Gibco,　Cat.No.31985-070) 배양액 3mL로 교체하였다. 1.5 mL 에펜도르프 튜브에　Opti-MEM 500 ㎕와　리포펙타민2000 (Invitrogen, Cat.No.11668-019) 5 ㎕을 넣어주고, siRNA 10 μM 저장 용액을 3 mL 넣은 다음 (siRNA 최종 농도: 10 nM) 15분간 상온에서 방치한다. Opti-MEM 3mL가 들어있는 배양접시에 가하고 6시간 동안 37oC 인큐베이터에서 배양한 다음 새 배양 배지로 교체하였다.
siRNA 및 ASO처리 후 24시간 또는 48시간이 되었을 때 멜라노솜의 응집 정도를 평가하기 위하여 명시야 현미경을 (bright field microscope) 이용하여 100배 비율에서 촬영하였다. 도 14a는 음성 대조군 및 siRNA 또는 ASO를 처리한 세포에서 멜라노솜의 응집 정도를 평가하기 위한 현미경 촬영 이미지를 제공하며, 도 14b는 멜라노솜 응집 세포의 수를 제공한다.
도 14a 및 도 14b에서 보듯이, 음성 대조군에 비해 멜라노필린 siRNA 및 ASO를 24시간 또는 48시간 처리한 세포에서 멜라노솜의 응집이 많이 발생하였다. 이는 멜라노필린 siRNA 및 ASO가 멜라노필린의 발현을 억제하여 멜라노솜의 이송을 방해함으로써 세포 안에 많이 남게 된 멜라노솜이 응집한 것으로 해석된다. 즉 멜라노필린 siRNA 및 ASO는 멜라노솜의 이송을 방해함으로써 색소 침착을 억제하는 효과를 기대할 수 있다.
실시예 2. 인간 멜라닌 세포에서 ASO들이 MLPH 발현에 끼치는 영향 평가.
인간 멜라닌 세포에서 "ASO 1"이 MLPH 발현에 어떤 영향을 어느 정도 끼치는가를 아래와 같은 실험 과정을 통해 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 인간 멜라닌 세포 (Lonza, Cat. No. CC-2586) 를 권장하는 멜라닌 세포 전용 배지(Lonza, Cat. No. CC-3249)에 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO, Cat. No.15140-122)을 첨가하여 사용하였고, 37oC, 5 % CO2 조건에서 세포 배양하였다. 인간 멜라닌 세포를 60 mm 배양접시에 3Х105개 접종하고 24 시간 배양하여 안정화시킨 후, "ASO 1"을 각 0(음성 대조용)과 1 μM 농도로 24 시간 및 48 시간 처리하였다.
[RNA분리와 cDNA합성] "ASO 1"이 처리된 세포를 수확한 후 알니지 미니 키트 (Qiagen, Cat. No. 714106)를 이용하여 그 키트의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였으며, cDNA는 500ng의 RNA를 대상으로 프라임스크립트 첫번째 가닥 cDNA 합성 키트 (Takara, Cat. No.6110A)를 사용하여 제조하였다. PCR 튜브에 500ng의 RNA와 1 ㎕의 무작위 헥사머 그리고 1 ㎕ dNTP (10 mM)를 넣고 DEPC 처리수를 총 10 ㎕가 되게 하여 65℃에서 5분간 반응하였다. 여기에 PrimeScript RTase 반응 혼합물 10 ㎕를 추가로 첨가하여 30℃에서 10분간 반응한 후 42℃에서 60분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
[실시간 qPCR] 합성된 cDNA를 이용하여 MLPH mRNA 발현율을 확인하기 위해 택만 탐색을 이용한 실시간 qPCR을 진행하였다. PCR tube에 cDNA, TaqMan Probe(Thermo, Cat. No. Hs00983107_m1), IQ supermix (BioRad, Cat. No.170-8862)및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 반응액을 제조하였다. 반응액 제조 후 CFX96 Touch Real-Time system (BioRad)을 이용하여 95℃에서 3 분 동안 진행한 후, 40주기의 95℃ 10 초와 60℃ 30 초를 수행하였고, 매 cycle 이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과 별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle (Ct)값을 GAPDH의 Ct값으로 표준화한 후, 상대적인 MLPH mRNA의 발현량을 비교하여 분석하였다.
도 15는 "ASO 1"을 처리한 세포에서 상대적인 MLPH mRNA의 발현량을 제공하는 데, ASO 1"을 1 μM을 48시간 처리하였을 때 mRNA발현량이 감소하였다. (독립표본 t-검정)
[웨스턴 블럿] 세포배양은 동일하며, "ASO 1" 처리 후 각각 24시간과 48시간이 되었을 때 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 수세하고, RIPA 완충액 (Cell Signaling, Cat. No.9806)로 용해하였다. BCA용액을 이용하여 단백질 정량을 하였고, 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE gel을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 전달한 후 5 % 탈지유 완충용액에서 1 시간 블로킹을 하였다. 항-MLPH (Novus, Cat. No.NBP2-45883)와 항-β-액틴 (Sigma, Cat. No. A3854)을 1차 항체로 사용하고, 각각의 항체에 따라 Horse anti-mouse (CST, Cat. No.7076)을 2차 항체로 사용하였으며, HRP 기질 (Millipore, Cat. No. WBKLS0500)을 이용하여 발광시키고 겔독 (Geldoc, ATTO)을 통해 발광 정도를 측정 하였다. 웨스턴 블럿의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 Image-J 프로그램으로 정량하여 MLPH의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
도 16은 ASO 1"을 처리한 세포에서 상대적인 MLPH 단백질 발현량을 제공하는 데, ASO 1"을 1 μM의 농도로 48시간 처리하였을 때 단백질 발현량이 감소하였다. (독립표본 t-검정)
[면역형광염색] 세포배양은 동일하며, "ASO 1" 처리 후 48시간이 되었을 때 배양된 세포를 수확하여 4% 포름알데히드로 고정하였다. 0.25% 트리톤 엑스-100으로 투과화(permeabilization) 후 1% Bovine Seum Albumin(BSA)에 서 1 시간 blocking을 하였다. Anti-Tubulin (abcam, Cat. No.ab44928)과 anti-Trp1 (Novus, Cat. No. NBP2-53252)1차 항체로 사용하고, FITC가 달린 Rabbit anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, Cat. No.315-095-003)와 Fluor 594이 달린 goat anti-Rabbit (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 111-585-144)를 2차 항체를 사용하였다. DAPI(Thermo Fisher, Cat. No. 62248)을 이용하여 counter staining을 진행하였다. Axio Scan Z1(Carl Zeiss)통해 100배 비율에서 형광 발현 양상을 확인하였다. 전체 세포수에서 Trp1이 핵 부근에 염색되어 있는 세포수의 비율을 그래프로 변환하여 멜라노솜 응집율을 제공하였다.
도 17은 "ASO 1"을 처리한 세포에서 (붉은색으로 염색된) Trp1의 발현 양상을 통하여 멜라노좀 응집 정도를 제공한다. "ASO 1"을 1 μM의 농도로 48시간 처리하였을 때 세포골격인 tubulin에 비하여 Trp1의 경우 DAPI로 염색된 핵 부근에서 붉은색이 나타는 것으로 보아 멜라노솜의 이동이 억제되어 멜라노솜이 응집되어 있는 것을 확인하였다. (독립표본 t-검정)
[수용성 염화 테트라졸륨-1] 세포배양은 동일하며, 인간 멜라닌 세포를 96 well에 1Х103개 접종하여 수용성 염화 테트라졸륨-1분석법을 수행하였다. "ASO 1"을 1 fM, 1 pM, 1 nM, 1 μM, 그리고 10 μM로 각각 처리 후 24시간, 48시간, 72시간까지 24 시간 간격으로 96 well에 배양된 세포에 반응액인 EZ-CYTOX (DoGen, Cat. No. EZ-3000)을 배양액의 1/10의 양으로 첨가하여 2 시간 동안 세포 배양기에서 반응시켰다. 반응 종료 후, 상온에서 1분간 흔들어 시료가 균일하게 되면 450 nm 파장에서 확인하여 상대적인 흡광도를 그래프로 변환하였다.
도 18는 "ASO 1"을 처리한 세포의 생존률을 제공한다. 1 fM, 1 pM, 1 nM, 1 μM, 그리고 10 μM의 5개 농도로 "ASO 1"을 24시간, 48시간, 72시간 처리하였을 때 약물 처리 후 72시간까지 모든 농도에서 90% 이상의 세포가 생존하는 것을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> OliPass Cosmeceuticals Han, Seon-Young Hwang, SeokJoon Kim, Ji Eun Sung, Kiho Lee, Yeonwoong <120> Melanophilin Antisense Oligonucleotides <130> 2020dp101, 2020op101pct <150> KR10-2019-0087228 <151> 2019-07-18 <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> PNA modified oligonucleotide, human melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <400> 1 gntcncnnct ngna 14 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> PNA modified oligonucleotide, human melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n is a, g, c, or t <400> 2 ngngntcncn nctngna 17 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> PNA modified oligonucleotide, human melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> n is a, g, c, or t <400> 3 gngntcncnn ctngnatn 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> PNA modified oligonucleotide, human melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> n is a, g, c, or t <400> 4 gntcncnnct ngnatntn 18 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> PNA modified oligonucleotide, mouse melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <400> 5 gnccncnnct ngna 14 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> PNA modified oligonucleotide, mouse melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n is a, g, c, or t <400> 6 ncngnccncn nctngna 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> PNA modified oligonucleotide, mouse melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> n is a, g, c, or t <400> 7 gnccncnnct ngnangtn 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PNA modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> PNA modified oligonucleotide, mouse melanophilin targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> n is a, g, c, or t <400> 8 cngnccncnn ctngnang 18 <210> 9 <211> 30 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccugugacau uccaggugug accccgacaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 10 ccugugacuu ucuaggugug gccuggauga 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 11 tagctcagtg caccctgaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 12 gagagaccgg atcactttgg 20 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Mouse MLPH targeted siRNA <400> 13 gggcaaaaua caaaaggag 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Mouse MLPH targeted siRNA <400> 14 cuccuuuugu auuuugccc 19

Claims (11)

  1. 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pat00011

    화학식 I 중에서,
    n은 10과 21 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 중수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    X와 Y는 수소, 중수소, 포밀, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 수소, 중수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 10과 21 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소, 중수소 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    X와 Y는 수소, 중수소, 포밀, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카르보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다
    Figure pat00012

    화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 또는 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기를 연결시켜 준다:
    Figure pat00013
    [화학식 Ⅴ]
    화학식 V 중에서,
    Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌[-CH2-, -CH(치환체)- 또는 -C(치환체)2-]이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
    Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 15 사이의 정수이다.
  3. 제 2항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11과 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
    Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 9 사이의 정수이다.
  4. 제 3항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11과 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은 인간의 MLPH 프리-mRNA에서 30개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CCUGUGACAUUCCAGGUGUGACCCCGACAA] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MLPH 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X는 수소이며;
    Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카르보닐이며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    L1은 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 혹은 -CH2-O-(CH2)5-를나타내며; 그리고,
    L2와 L3는 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
  5. 제 4항에 있어서, 다음 식의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N→C) Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2;
    (N→C) Fethoc-C(1O2)GG(6)-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)A-NH2;
    (N→C) Fethoc-GG(6)G-G(6)TC-A(5)CA(5)-C(1O2)CT-G(6)GA(5)-ATG(6)-NH2; 및
    (N→C) Fethoc-GG(6)T-CA(5)C-A(5)C(1O2)C-TG(6)G-A(5)AT-G(6)TC(1O2)-NH2;
    상기 식에서,
    A, T, G, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 펩타이드 핵산 모노머이며;
    C(pOq), A(p)와 G(p)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII과 화학식 VIII로 대표되는, 비천연 핵산염기로 변형된 시토신, 아데닌과 구아닌을 포함하는 펩타이드 핵산 모노머이다:
    Figure pat00014
    [화학식 VI]
    Figure pat00015
    [화학식 VII]
    Figure pat00016
    [화학식 VIII]
    화학식 VI, 화학식 VII과 화학식 VIII에서,
    p와 q는 정수인데, 상기 식의 PNA 유도체들 중 (N→C) Fethoc-GG(5)T-CA(6)C-A(6)C(1O2)C-TG(5)G-A(6)A-NH2에서는 p가 1, 5, 또는 6에 해당되고 q는 2에 해당되며; 그리고,
    약자인 "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카르보닐"을 의미한다.
  6. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간 MLPH 유전자의 전사에 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 사용 방법.
  7. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 피부 색소 침착을 치료 또는 개선하기 위한 사용 방법.
  8. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MLPH 유전자 전사 관련 질병 또는 질환 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MLPH 유전자 전사 관련 징후 또는 증상 개선용 화장품.
  10. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 색소 침착 치료용 약학 조성물.
  11. 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 색소 침착 개선용 화장품.
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