KR102194594B1 - 매트릭스메탈로프로티나제-1 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

매트릭스메탈로프로티나제-1 안티센스 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 MMP-1 프리-mRNA의 5' 스플라이스 위치를 표적으로 하는 펩티드 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명의 펩티드 핵산 유도체는 세포 내에서 인간 MMP-1 mRNA의 스플라이스 변형체의 생성을 강력하게 유도하며, 인간 MMP-1 단백질에 관련된 피부 노화 관련 질병 또는 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

매트릭스메탈로프로티나제-1 안티센스 올리고뉴클레오티드 {Matrix metalloproteinase-1 Antisense Oligonucleotides}
본 발명은 피부 노화 현상을 개선하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이다.
노화에 대한 관심이 높아지면서 피부 노화에 대한 관심도 증가하고 있다. 피부 노화에 대한 대책은 삶의 질 측면에서 매우 중요한 요소로서, 건강식품, 화장품 및 관련 의약품 등이 많은 관심을 끌고 있다. 피부의 노화 요인은 시간이 지남에 따라 발생하는 자연적인 내인성 노화와 자외선, 흡연 및 영양 불균형 등과 같이 외부 요인에 의해 발생하는 외인성 노화로 나뉜다.
피부에 태양광에 의한 자외선 노출이 클 경우 매트릭스메탈로프로티나제-1 (MMP-1)의 발현을 증가시켜 콜라겐의 분해를 촉진한다. 또한, 흡연은 피부에서 MMP-1 mRNA의 발현을 유도하여 자외선과 같은 결과를 초래한다 [J. Cosmetic Dermatology Vol 6, 40-50 (2007)].
콜라겐은 피부, 혈관, 뼈, 치아, 근육 등 모든 결합조직의 주된 단백질로서 또 다른 장기에서도 세포간 기질(matrix)로서 존재하며, 전체 구조유지와 세포 연결의 기능을 가지고 있어서 콜라겐이 변형 및 손상될 경우 피부의 노화 과정에 결정적인 영향을 미칠 수 있다 [J. Pathol . Vol 211, 241-251 (2007)].
매트릭스메탈로프로티나제는 피부의 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 등에서 분비되어 세포의 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 기질 단백질을 분해할 수 있는 효소로서, MMP-1 (interstitial collagenase), MMP-2 (gelatinase), MMP-3 (stromelysin), MMP-7 (Matrilysin), MMP-8 (neutrophil collagenase), MMP-12 (metalloelastase) 등 26 가지 이상의 MMP가 알려져 있다 [J. Biol . Chem . Vol 277, 451-454 (2002); J. Matrix. Biol . Vol 15, 519-526 (1997)].
MMP-1의 과발현은 자외선이나 흡연에 의해 생성되는 활성 산소에 의해 이루어진다고 알려져 있어서 피부 노화를 개선하기 위한 주요 방안으로 항산화제를 공급하는 방법과 항산화 능력을 갖고 있는 식품을 섭취하는 방법이 시도되고 있는데, 이러한 것들의 예로는 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코빅산), 비타민 E (토코페롤), 카로티노이드, 플라보노이드, 녹차, 셀레늄 등이 있으며, 이 물질들이 어떠한 기전으로 작용하는 지에 대한 연구가 진행되고 있다 [Int . J. Food Sci . Technol. Vol 73, 989-996 (2005); Kor . J. Aesthet . Cosmetol . Vol 11, 649-654 (2013); Int . J. Mol . Med . Vol 38, 357-363 (2016)].
피부의 노화 과정에서 MMP-1의 중요성을 감안할 때, MMP-1의 생성에 관여하는 작용 기전에 기초한 피부 노화를 개선할 수 있는 물질의 개발은 매우 흥미롭고 필요한 과제이다.
프리 - mRNA: 유전 정보는 DNA (2-deoxyribose nucleic acid)를 통해 전달된다. DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사되는데 포유류의 프리-mRNA는 엑손(Exon)과 인트론(Intron)으로 구성되어 있으며 아래 그림과 같이 서로 연결되어 있다.
프리 - mRNA 의 구조
Figure 112019047718359-pat00001

프리 - mRNA 스플라이싱 (Splicing): 프리-mRNA는 아래의 그림에서 요약한 대로 "스플라이싱"이라 부르는, 인트론의 제거로부터 시작되는 일련의 과정을 통해서 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. Vol 72, 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. Vol 6, 386-398 (2005); Nature Rev. Mol . Cell Biol. Vol 15, 108-121 (2014)].
Figure 112019047718359-pat00002
작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35은 인트론 N과 엑손 (N+1)에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 작업이 진행된다.
리보솜(Ribosome)의 단백질 합성: 단백질은 DNA에 있는 암호에 의해 합성된다. 핵에서 DNA로부터 전사된 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 결과적으로 생성된 m-RNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry Vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. Vol 48, 2659-2668 (1988)].
안티센스 올리고뉴클레오티드 ( ASO , Antisense Oligonucleotide): DNA, mRNA 및 프리-mRNA에 염기서열 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드라고 한다. 만약 ASO가 세포질에서 mRNA에 강하게 결합한다면 리보솜에 의한 mRNA로부터의 단백질 합성을 저해할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 세포질 안에 있어야만 한다.
안티센스의 스플라이싱 저해: 만약 ASO가 핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합한다면 ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 저해 혹은 조절할 수 있으며, 이 경우 ASO는 반드시 핵 안에 있어야만 한다. 이렇게 안티센스의 스플라이싱 저해에 의해 생성된 mRNA는 ASO가 표적하였던 엑손이 결여되어 있는데, 이러한 mRNA는 접합부 변형체 또는 스플라이스 변형체(splice variant)라고 불리며 원래의 단백질보다 짧은 길이의 단백질을 생성한다.
스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 저해하면 스플라이싱을 막을 수 있을 것이라 예상되는데, 실제로 ASO가 (5'
Figure 112019047718359-pat00003
3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 ASO는 프리-mRNA와 U1의 결합을 막고 결과적으로 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다. 이와 유사하게 ASO가 (5'
Figure 112019047718359-pat00004
3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하면 스플라이스오솜 E 복합체의 형성을 막는다. 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치는 다음 그림에 도시하였다.
Figure 112019047718359-pat00005

비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오티드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈(nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 올리고뉴클레오티드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp . Pharmacol . Physiol . Vol 33, 533-540 (2006)] 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비교하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오티드 중 몇몇의 화학 구조가 하기에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 예상대로 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 결합한다.
Figure 112019047718359-pat00006

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ( PTO , Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. Vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터(Transporter)가 많이 발현된 간 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로(Systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. Vol 25, 3290-3296 (1997)].
PTO의 세포투과력을 높이기 위하여, 리포펙션(Lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
과거 30년에 걸쳐, 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역질환, 대사성 질환 등의 질환을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry Vol 41, 4503-4510 (2002); Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . Vol 33, 533-540 (2006)]. 상당수의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포투과성 부족으로 성공적이지 못하였다. PTO의 세포투과력 부족을 극복하기 위해서는, 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 컴플리먼트(Complement) 활성화, 신장 독성(Tubular Nephropathy), 쿠퍼(Kupffer) 세포 활성화, 비장 비대, 림프절 비대, 단핵식균세포(Mononuclear Cell) 침윤 등 다양한 독성이 수반된다 [Clin . Exp . Pharmacol. Physiol . Vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장의 기여도가 큰 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센(Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation Vol 118, 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr . Opin . Mol . Ther. Vol 6, 331-336 (2004)].
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 RNA의 리보스(Ribose) 골격이 구조적으로 제한된 핵산으로서, 핵산 결합력이 매우 강하다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry Vol 45, 7347-7355 (2006)].
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오티드 ( PMO , Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스(2-Deoxyribose)와 포스페이트(Phosphate)가 각각 포스포로아미데이트(Phosphoamidate)와 모폴린(Morpholine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드이다 [Appl . Microbiol . Biotechnol . Vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 전하가 없다. 따라서 PMO와 mRNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 mRNA의 결합은 DNA와 mRNA의 결합보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(Hepatic Transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PMO는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸)글리신[Aeg, N-(2-aminoethyl)glycine]을 단위 골격으로 갖는 폴리펩티드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science Vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 아래 그림에 도시되었다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 결합한다 [Nature (London) Vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
Figure 112019047718359-pat00007

PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 갖고 있지 않기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. 아울러 PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(Hepatic Transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PNA는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv . Drug Delivery Rev. Vol 55, 267-280, (2003)].
변형된 핵산염기로 세포투과성을 높인 PNA: 양이온성 지질(Cationic Lipid)이 핵산염기에 공유 결합으로 연결된 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산염기는 다음과 같이 제공된다. 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 시토신과 각각 상보적으로 결합한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
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이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 리포펙션(lipofection)과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 복합체는 리포펙션으로 처리하지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 상보적인 DNA와 듀플렉스(duplex)를 형성할 때 4~5개의 변형된 핵산염기가 도입된 11~13머 (11~13-mer)의 PNA는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC 이상 높은 Tm 값을 보인다. 또한, 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합(Mismatch)에도 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 순서에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
작은 간섭 RNA ( siRNA , Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol . Mol . Biol . Rev. Vol 67, 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질 인자로 형성된 "RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체"(RISC)는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합하여 mRNA를 절단함으로써 mRNA가 단백질을 합성하는 것을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo) 효과가 잘 나타나지 않는다.
매트릭스메탈로프로티나제 -1의 siRNA: 19개의 염기 서열로 이루어진, 인간의 MMP-1 mRNA의 일부를 표적으로 하는 100 nM 농도의 MMP-1 siRNA가 인간 연골육종 (human chondrosarcoma) 세포주에서 MMP-1의 mRNA와 단백질의 형성을 저해한다는 것이 보고되었다 [J. Orthop. Res. Vol 23, 1467-1474 (2005)]. 이러한 결과는 MMP-1이 연관된 암 전이에 관한 연구 및 항암제 개발에 도움이 될 것이다.
피부 노화를 개선하기 위한 주요 방안으로 항산화제를 공급하는 방법과 항산화 능력을 갖고 있는 식품을 섭취하는 방법이 시도되고 있으며, 어느 정도의 효과를 나타내고 있으나 정확한 작용 기전은 아직 연구 중이다. 항암제 개발과 관련하여, 생체외(in vitro)에서 MMP-1의 mRNA와 단백질의 형성을 저해하는 siRNA가 발표된 바 있으나 siRNA는 제조원가가 너무 비싸서 피부 노화 개선제로 개발하기에는 제한이 있으며, 국소 투여의 효율이 낮은 문제도 있다. 따라서, MMP-1의 mRNA와 단백질의 형성을 저해라는 정확한 작용 기전에 기초하고 siRNA의 한계를 넘어서는 피부 노화 개선을 위한 물질의 개발이 필요하다.
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체와 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112019047718359-pat00009
화학식 I 중에서,
n은 10과 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 MMP-1 프리-mRNA 중 16개의 염기로 이루어진 [(5'
Figure 112019047718359-pat00010
3') CAUAUAUGGUGAGUAU] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합(Mismatch)을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn -1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn은 수소(Hydrido), 중수소(Deuterido), 치환체가 있거나 없는 알킬(Alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴(Aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 중수소, 포밀[H-C(=O)-], 아미노카보닐[NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐[NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시(Alkyloxy), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시(Aryloxy), 치환체가 있거나 없는 알킬아실(Alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실(Arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐(Alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐(Aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐(Alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐(Arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐(Alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐(Arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐(Alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐(Aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐(Alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐(Arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐(Alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐(Arylphosphonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 중수소, 하이드록시(Hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn은 아데닌(Adenine), 티민(Thymine), 구아닌(Guanine), 시토신(Cytosine), 그리고 우라실(Uracil)을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기다.
화학식 I의 화합물은 인간의 MMP-1 프리-mRNA에서 엑손 5의 스키핑(exon skipping)을 유도하여 엑손 5가 결여된 인간 MMP-1 mRNA 스플라이스 변형체를 형성함으로써 인간 MMP-1 프리-mRNA의 작용을 막는다.
"n은 10과 21사이의 정수이며"의 의미는 문자 그대로 "n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 그리고 20 중에서 선택된다"는 것이다.
화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기의 구조는 도 1a-1c에 예시되어 있다. 본 발명에서 천연 또는 비천연 핵산염기는 도 1a-1c에서 제공된 핵산염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 비천연 핵산염기들은 단지 핵산염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들은 도 2a-2e에 예시되어 있다. 도 2a는 치환체가 있거나 없는 알킬의 예들을 제공하며, 도 2b는 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예들을 예시한다. 도 2c는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴포스포닐의 예들을 나타낸다. 도 2d는 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴아미노카보닐의 예들을 제공한다. 도 2e는 치환체가 있거나 없는 알킬 또는 아릴아미노티오카보닐, 알킬 또는 아릴옥시티오카보닐의 예들을 제공한다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
이 분야의 숙련된 전문가들은 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA에 염기서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 DNA나 RNA의 듀플렉스(duplex)의 Tm 값은 너무 높아서 수용액 상에서 측정하기 힘들며, 짧은 길이의 상보적인 DNA와의 Tm 값도 상당히 높다.
화학식 I의 화합물은 인간의 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5의 5' 스플라이스 위치와 상보적으로 결합한다 [NCBI Reference Sequence: NG_011740]. [(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU]의 16머는 인간의 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5와 인트론 5의 연결 부위에 위치하며, 8머는 엑손 5에 그리고 8머는 인트론 5에 속해 있다. 이 16머는 [(5'→3') CAUAUAUG┃gugaguau] 로 표시하기도 하는데, 여기서 대문자는 엑손을 그리고 소문자는 인트론을 나타내며, "┃"는 연결 부분을 나타낸다. 전통적인 프리-mRNA의 표시 방법에 따르면, 인간의 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5와 인트론 5의 연결 부위는 30머 [(5'→3') UCCAAGCCAUAUAUG┃gugaguauggggaaa]로 표시한다.
화학식 I의 화합물은 인간의 MMP-1 유전자로부터 전사된 프리-mRNA의 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여 초기 스플라이스 복합체의 형성을 막음으로써 엑손 5가 결여된 (엑손 5 스키핑) 인간의 MMP-1 mRNA를 생성한다.
화학식 I의 화합물은 RNA에 대한 결합력이 아주 크기 때문에, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 한두 개의 부정합 (mismatch)이 있어도 엑손 5 스키핑을 일으킨다. 또한, 화학식 I의 화합물은 표적 스플라이스 위치에 한두 개의 염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 포함하는 인간의 돌연변이 MMP-1 프리-mRNA에 대해서도 엑손 5 스키핑을 일으킨다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수하여 올리고뉴클레오티드 그 자체가 쉽게 세포에 전달된다 [PCT/KR2009/001256]. 세포에 화학식 I의 화합물을 올리고뉴클레오티드 그 자체로 투여하면 인간의 MMP-1 프리-mRNA에서 엑손 5의 스키핑을 유도하여 엑손 5가 결여된 인간의 MMP-1 mRNA 스플라이스 변형체를 형성한다. 화학식 I의 화합물은 특별한 약물 전달 수단이나 제형 없이도 세포에 쉽게 전달되어 세포 안에 있는 표적 엑손의 스키핑을 강하게 유도한다. 세포에 화학식 I의 화합물을 올리고뉴클레오티드 그 자체로 투여하면 펨토몰 이하의 농도에서도 인간의 MMP-1 프리-mRNA에서 엑손 5의 스키핑을 쉽게 유도한다.
화학식 I의 화합물의 우수한 세포투과성으로 인하여 올리고뉴클레오티드 그 자체를 국소적(Topically)으로 투여하여도 엑손 5의 스키핑을 쉽게 유도한다. 화학식 I의 화합물은 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 위해 피부를 통해 표적 조직으로 전달하기 위한 제제가 필요하지 않다. 물과 조용매에 녹인 화학식 I의 화합물을 피코몰 이하의 농도로 피부에 투여하여도 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 나타낸다. 본 발명의 화합물은 피부에 치료 효과를 나타내기 위해 과도하거나 침략적인 제제화가 필요 없기는 하지만, 피부 크림이나 로션을 만들기 위해 화장품 구성물(ingredients)이나 보조제(adjuvants)를 제제에 사용할 수 있다. 그러한 피부 크림이나 로션은 피부 노화를 개선하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 원하는 생물학적 또는 치료상의 효과를 위해 1 아토몰(1 aM)에서 1 나노몰(1 nM)의 농도로 피부를 통해 투여할 수 있는데, 그 농도는 대상자의 증상이나 투여 일정에 따라 변할 수 있다.
화학식 I의 화합물은 다양한 투약 형태, 예를 들면 비제한적으로 주사제, 비강 스프레이(nasal spray), 경피 흡수(transdermal) 제형 등으로 제형화할 수 있다. 또한 화학식 I의 화합물은 치료학적으로 효과적인 용량으로 대상(subject)에게 투여할 수 있고, 투여 용량은 적응증, 투약 경로, 투약 스케쥴, 대상자의 상태 등에 따라 다양하다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨(Sodium Hydroxide), 수산화 칼륨(Potassium Hydroxide), 염산(Hydrochloric Acid), 황산(Sulfuric Acid), 메탄설폰산 (Methanesulfonic Acid), 구연산(Citric Acid), 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic Acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (Adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (Tartaric Acid), 스테아린산, 폴리프로필렌글리콜 (Polypropyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (Isopropanol), 중탄산나트륨 (Sodium Bicarbonate), 증류수, 방부제 (Preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10과 21사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 MMP-1 프리-mRNA 중 16개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 화학식 I의 화합물 전체 중 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn -1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn은 수소, 중수소 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 중수소, 포밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기다.
[화학식 Ⅱ] [화학식 Ⅲ] [화학식 Ⅳ]
Figure 112019047718359-pat00011
Figure 112019047718359-pat00012
Figure 112019047718359-pat00013

화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 또는 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산염기 부위를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
Figure 112019047718359-pat00014
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 [methylene: -CH2-, -CH(치환체)- 또는 -C(치환체)2-]이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm -1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 [methylene: -CH2-, -CH(치환체)- 또는 -C(치환체)2-], 산소(-O-), 황(-S-), 치환체가 있거나 없는 이미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
본 발명의 더 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11과 16사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 MMP-1 프리-mRNA 중 16개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn -1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기이며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm -1은 메틸렌, 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 더욱더 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11과 16 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 MMP-1 프리-mRNA 중 16개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn -1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐이며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn -1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기이며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 혹은 -CH2-O-(CH2)5- 이며; 그리고,
L2와 L3는 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
본 발명의 PNA 유도체의 구체적인 예로서는, 다음 식의 PNA 유도체 (ASO 1, 안티센스 올리고뉴클레오티드 1)와 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
(N→C) Fethoc-TA(6)C-TCA(6)-CC(1O2)A(6)-TA(6)T-A(6)T-NH2
상기 식에서,
A, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 티민, 그리고 시토신을 포함하는 PNA 모노머(monomer)이며;
C(pOq)와 A(p)는 각각, 화학식 Ⅵ과 화학식 Ⅶ로 대표되는 비천연 핵산염기인 변형된 시토신과 아데닌을 포함하는 PNA 모노머이다:
[화학식 Ⅵ] [화학식 Ⅶ]
Figure 112019047718359-pat00015
Figure 112019047718359-pat00016
화학식 Ⅵ와 화학식 Ⅶ에서,
p와 q는 정수인데, 상기 식의 PNA 유도체 즉 ASO 1에서는 p가 1 또는 6에 해당되고 q가 2에 해당되며; 그리고,
약자인 "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐", 즉 " [2-(9-fluorenyl)ethyl-1-oxy]carbonyl" 을 의미한다.
PNA 모노머인 A, G, T, C, C(pOq), A(p)의 화학적 구조는 도 3에 명확하게 제공된다. 선행 기술에서 상술한 바와 같이 [PCT/KR2009/001256], C(pOq)는 구아닌과 상보적인 결합을 하기 때문에 "변형 시토신" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 A(p)는 티민과 상보적인 결합을 하기 때문에 "변형 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 또한 화학 구조의 명확한 제시를 위해 14머 PNA 유도체인 "(N→C) Fethoc-TA(6)C-TCA(6)-CC(1O2)A(6)-TA(6)T-A(6)T-NH2" ASO 1의 구조가 도 4에 제공된다.
ASO 1은, "(5'→3') TAC-TCA-CCA-TAT-AT" 서열을 갖는 DNA와 동일하게, 프리-mRNA와 상보적 결합을 한다. 이 14머 PNA는 인간 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5와 인트론 5 결합 부분 중에서도 다음의 굵게 밑줄친 부분에 상보적으로 결합한다: [(5'→3') UCCAAGCC AUAUAUG ┃ gugagua uggggaaa].
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간 MMP-1 유전자의 전사에 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 피부 노화를 개선하기 위한 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MMP-1 유전자 전사 관련 질병 또는 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MMP-1 유전자 전사 관련 질병 또는 질환 치료용 화장품을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 노화 개선용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 피부 노화 개선용 화장품을 제공한다.
본 발명에 따르는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하여 함으로써 인간 MMP-1 유전자의 전사에 관련된 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.
또한 본 발명에 따르는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하여 함으로써 피부 노화를 개선할 수 있다.
도 1a-1c. 화학식 I PNA 유도체의 천연 및 비천연 핵산염기의 예.
도 2a-2e. 화학식 I PNA 유도체의 치환체의 예.
도 3. 천연 및 변형 핵염기를 갖는 PNA 모노머의 화학 구조.
도 4. PNA 유도체 14머 "ASO 1"의 화학 구조
도 5. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc 보호기가 붙은 PNA 모노머의 화학적 구조.
도 6a-6b. "ASO 1"의 정제 전후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 7. C18-역상 HPLC로 정제한 "ASO 1"의 ESI-TOF 매스 스팩트럼.
도 8. 인간 진피 섬유아세포 (Human Dermal Fibroblast, HDF)에서 "ASO 1"의 MMP-1 mRNA 억제 효과 (Real-Time qPCR).
도 9a-9b. HDF에서 "ASO 1"의 세포내 MMP-1 단백질 발현 억제 효과 (Western Blot 및 단백질 발현 변화 그래프).
도 10a-10b. HDF에서 "ASO 1"의 세포내 콜라겐 단백질 발현 증가 효과 (Western Blot 및 단백질 발현 변화 그래프).
도 11a-11b. HDF에서"ASO 1"의 세포외 분비 MMP-1 단백질 발현 억제 효과 (Western Blot 및 단백질 발현 변화 그래프).
도 12a-12b. HDF에서 "ASO 1"의 세포외 분비 콜라겐 단백질 발현 증가 효과 (Western Blot 및 단백질 발현 변화 그래프).
도 13. HDF에서 "ASO 1"의 세포외 분비 MMP-1 단백질 발현 억제 효과 (ELISA결과).
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
변형된 핵산염기를 가진 PNA 모노머들은 선행 기술 [PCT/KR 2009/001256]에서 공개된 방법으로, 혹은 이를 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵산염기를 가진 Fmoc[{(9-fluorenyl)methoxy}carbonyl]으로 보호된 PNA 모노머들과 천연 핵산염기를 가진 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들을 사용하여 [반응식 1]과 같이 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 화학식 I의 PNA 올리고머를 고체상으로 합성하였다. 합성에 사용된 고체상은 PCAS 바이오마트릭스사 (PCAS BioMatrix Inc., Quebec, Canada)에서 구매한 H-링크 아미드-캠마트릭스 (H-Rink Amide-ChemMatrix) 레진을 주로 사용하였다. 이렇게 합성된 PNA 올리고머는 MALDI-TOF MS로 동정되었고 C18-역상(Reverse Phase) HPLC를 이용하여 분리 및 분석되었다 (증류수/아세토니트릴 또는 증류수/메탄올, 0.1% TFA). [도 6a-6b]는 "ASO 1"을 HPLC 정제하기 전과 후의 HPLC 크로마토그램이고 [도 7]은 HPLC로 정제한 "ASO 1"에 대한 ESI/TOF/MS 스펙트럼으로서, 본 발명의 PNA 올리고머들에 대한 설명을 목적으로 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
[반응식 1]은 고체상 합성의 전형적인 과정을 도식화 하였는데 각각의 반응 과정은 다음과 같이 간략히 제공한다.
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 레진의 아민에 Fmoc 보호기가 붙어있지 않을 경우에 해당되며, 0.01 mmol (약 20 mg 레진)과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드(MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.
[반응식 1]
Figure 112019047718359-pat00017
[Fmoc 제거(DeFmoc)] 레진의 아민에 Fmoc 보호기가 붙어있을 경우에 해당되며, 0.01 mmol (약 20 mg 레진)과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링(Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol PNA monomer, 0.05 mmol HBTU, 그리고 0.1 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 2분 후에 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머의 화학적 구조는 도 5에 제공된다. 도 5에 제공된 변형 염기를 갖는 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
[캡핑(Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액(capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 레진의 N-말단 아민은 다음과 같은 방법으로 "Fethoc-OSu"와 반응하여 "Fethoc"기가 도입 된다. 0.1 mmol Fethoc-OSu와 0.1 mmol DIEA를 1 mL 무수 DMF에 녹인 후, 그 용액을 레진에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다. 본 발명에서 PNA 유도체의 합성에 사용된 "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같다.
Figure 112019047718359-pat00018
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액(cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진으로부터 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압에서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진으로부터 분리된 PNA 유도체의 조생성물(crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 6a와 6b는 "ASO 1"의 정제 전과 후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
인간 MMP-1 프리-mRNA 엑손 5의 5' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체를 위의 방법에 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 인간 MMP-1 프리-mRNA를 표적으로 하는 이러한 PNA 유도체는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
Figure 112019047718359-pat00019
표 1은 인간 MMP-1 유전자로부터 [NCBI Reference Sequence: NG_011740] 전사된 인간 MMP-1 프리-mRNA 엑손 5의 5' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합하는 PNA 유도체와 그의 매스 (Mass) 구조 분석 데이터를 제공한다. 표 1의 ASO는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
"ASO 1"은 인간 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5와 인트론 5 결합 부분 중에서도 굵게 밑줄친 부분에 상보적으로 결합하는 14머 PNA 인 [(5'→3') UCCAAGCC AUAUAUG ┃ g ugagua uggggaaa] 이다. "ASO 1"은 인간 MMP-1 프리-mRNA의 엑손 5 및 인트론 5와 각각 7머씩 상보적인 결합을 한다.
" ASO 1"과 상보적인 DNA와의 결합력 (Binding Affinity)
Tm은 UV/Vis 분광 광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브(falcon tube)에서 4 μM PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 14머 DNA를 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90oC에서 수분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 애질런트 (Agilent) 8453 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하였다. 큐벳의 온도를 분당 0.5 혹은 1.0oC 속도로 올리면서 260nm에서 흡광도 변화를 측정하고 흡광도 변화율이 가장 큰 온도, 즉, 변곡점을 PNA 올리고머와 DNA 사이의 Tm 값으로 정하였다. Tm 측정에 사용된 DNA는 대전의 (주)바이오니아(www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
PNA 유도체와 14머의 상보적인 DNA와의 Tm은 72.67 oC로 측정되었다.
화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예
인간 진피 섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts, HDF)에서 실시간 정량적 연쇄중합반응(Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT qPCR) 등을 이용하여 화학식 I PNA 유도체의 생체외(in vitro) MMP-1 안티센스 효능을 평가하였다. 이러한 안티센스 효능 평가 예들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
실시예 1. HDF 에서 실시간 qPCR (Real-Time qPCR )을 이용한 " ASO 1"의 MMP -1 mRNA 억제 효과 측정
ASO에 의한 MMP-1의 mRNA 변화를 아래와 같은 실험 과정을 통해 정량하였다.
[세포배양 & ASO 처리] HDF를 섬유아세포 기본배지(Fibroblast Basal Medium) (ATCC PCS-201-030)에 저염 섬유아세포 성장키트 (ATCC PCS-201-041), 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 조건에서 세포 배양하였다. 인간 진피 섬유아세포를 60 mm 배양접시에 3×105개 접종하고 24시간 배양하여 안정화시킨 후, "ASO 1"를 100 aM 내지 1 μM 농도로 24 시간 처리하였다. "ASO 1"를 처리하지 않은 것을 대조군 (con)으로 하였다.
[RNA분리와 cDNA합성] ASO가 처리된 세포를 수확한 후 RNeasy Mini kit (Qiagen, Cat. No. 714106)의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였으며, cDNA는 400ng의 RNA를 대상으로 프라임스크립트TM 제1 가닥 cDNA 합성키트 (PrimeScriptTMZ 1st strand cDNA Synthesis Kit) (Takara, Cat. No. 6110A)를 사용하여 제조하였다. PCR 튜브에 400ng의 RNA와 1 ㎕ 의 랜덤 헥사머(random hexamer) 그리고 1 ㎕ dNTP (10 mM)를 넣고 DEPC 물을 총 10 ㎕가 되게 하여 65℃에서 5분간 반응하였다. 여기에 프라임스크립트 알티에이즈(PrimeScript RTase) 반응 혼합물 10 ㎕를 추가로 첨가하여 30℃에서 10분간 반응한 후 42℃에서 60분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
[정량적 실시간 PCR (Quantitative Real-Time PCR)] 합성된 cDNA를 이용하여 MMP-1 mRNA 발현율을 확인하기 위해 타크만 프로브 (Taqman probe)를 이용한 실시간 (Real-Time) qPCR을 진행하였다. PCR 튜브에 cDNA, 타크만 프로브, IQ supermix (BioRad, Cat. No. 170-8862), 핵산가수분해효소가 없는 물(Nuclease free water)를 혼합하여 반응액을 제조하였다. 반응액을 제조 후 CFX96 터치 실시간 시스템 (CFX96 Touch Real-Time system, BioRad)을 이용하여 95℃ 에서 3분 동안 1차 변성(primary denaturation) 한 후 변성, 풀림(annealing), 중합(polymerization)을 각각 95℃에서 10초, 60℃에서 30초로 총 50 사이클 (cycle)을 수행하였고, 매 사이클 이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과별 용융 곡선 (melting curve)으로 검증하였다. 각 유전자의 역치 주기 (threshold cycle: Ct)값을 GAPDH의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다.
[ASO에 의한 MMP-1 mRNA의 감소 효과] 도 8과 같이, "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, ASO를 처리하였을 시에, 1 μM에서 MMP-1의 mRNA가 65%감소하는 것을 확인하였고 100 aM 내지 10nM농도에서는 10-15%정도 감소하는 것으로 확인되었다.
실시예 2. HDF 에서 " ASO 1"의 세포내 MMP -1 단백질 발현 억제 효과
ASO에 의한 MMP-1의 단백질 발현율의 변화를 확인하기 위하여 아래와 같이 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)을 수행하고 발현 밴드를 그래프로 수치화하였다.
[웨스턴 블롯팅] 세포배양은 실시예 1과 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 수세하고, RIPA 완충액 (50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate), 0.1% SDS, protease inhibitor)로 용해하였다. BCA용액(Thermo, Cat. No. 23225)를 이용하여 단백질 정량을 하였고, 동량의 단백질을 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브렌인 (polyvinylidene fluoride membrane) (Millipore, Cat. No. IPVH00010)으로 이송(transfer)한 후 5% 탈지유 완충액 (skim milk buffer)에서 1 시간 블로킹 (blocking)을 하였다. 항-MMP-1 (SantaCruz, Cat. No. 58377), 항-β-액틴 (Sigma, Cat. No. A3854)을 1차 항체로 사용하고, 각각의 항체에 따라 염소 항-마우스 (goat anti-mouse) (CST, Cat. No. 7076V)을 2차 항체로 사용하였으며, 슈퍼시그날 웨스트피코 (Supersignal Westpico) (PierAce, USA)을 이용하여 발광시키고 겔독 (Geldoc, ATTO)을 통해 발광 정도를 측정하였다. 웨스턴 블롯팅의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 이미지-J 프로그램으로 정량하여 MMP-1의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
[ASO에 의한 MMP-1 단백질 억제 효과] 세포내 MMP-1 단백질 발현율을 확인해본 결과 도 9a-9b와 같이 "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, 100 aM 내지 1 μM ASO처리시 MMP-1 단백질 발현율이 20-50% 감소하였다. 따라서, 본 발명의 MMP-1 ASO가 세포내 MMP-1의 단백질 발현 억제효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. HDF 에서 " ASO 1"의 세포내 콜라겐 단백질 발현 증가 효과
세포내 MMP-1 단백질 발현 감소에 따른 타입 I 콜라겐 (Type I Collagen) 단백질 발현 증가를 확인하기 위해 아래와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행하고 발현 밴드를 그래프로 수치화하였다.
[웨스턴 블롯팅] 세포배양은 실시예 1과 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 수세하고, RIPA 완충액 (50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, protease inhibitor)로 용해하였다. BCA용액(Thermo, Cat. No. 23225)를 이용하여 단백질 정량을 하였고, 동량의 단백질을 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브렌인 (Millipore, Cat. No. IPVH00010)으로 이송한 후 5% 탈지유 완충액에서 1 시간 블로킹을 하였다. 항- 타입 I 콜라겐 (SouthernBiotech, Cat. No. 1310-01), 항-β-액틴 (sigma, Cat. No. A3854)을 1차 항체로 사용하고, 각각의 항체에 따라 토끼 항-염소 (rabbit anti-goat) (Santacruz, Cat. No. 2768)을 2차 항체로 사용하였으며, 슈퍼시그날 웨스트피코 (Pierce, USA)을 이용하여 발광시키고 겔독(ATTO)을 통해 발광 정도를 측정하였다. 웨스턴 블롯팅의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 이미지-J (Image-J) 프로그램으로 정량하여 타입 I 콜라겐의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
[ASO에 의한 타입 I 콜라겐 단백질 증가 효과] 세포 내 타입 I 콜라겐 단백질 발현율을 확인해본 결과 도 10a-10b와 같이 "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, 100 aM 내지 1 μM ASO처리 시 타입 I 콜라겐 단백질 발현율이 30% 이상 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 ASO에 의한 세포 내 MMP-1의 단백질 발현 감소는 콜라겐 단백질 발현 증가를 유도함을 알 수 있었다.
실시예 4. " ASO 1"에 의한 세포외 분비 MMP -1 단백질 발현 억제 효과
"ASO 1"에 의한 세포내 MMP-1 단백질 발현 억제 효과는 결과적으로 활성을 나타내는 세포 외 분비 MMP-1의 단백질 발현에 영향을 미친다. 이에 ASO처리시에 세포 외 분비 MMP-1 단백질 발현 감소를 확인하기 위하여 ASO 48시간 처리 후 세포 배양액에서의 단백질 변화를 아래와 같이 웨스턴 블롯팅으로 수행하였다.
[웨스턴 블롯팅] 세포배양은 실시예 1과 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 세포 배양액을 수확하여 동량의 배양액을 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브렌인 (Millipore, Cat. No. IPVH00010)으로 이송한 후 5% 탈지유 완충액에서 1 시간 블로킹을 하였다. 항-MMP-1 (SantaCruz, Cat. No. 58377)을 1차 항체로 사용하고, 염소 항-마우스 (CST, Cat. No. 7076V) 을 2차 항체로 사용하였으며, 슈퍼시그날 웨스트피코 (Pierce, USA)을 이용하여 발광시키고 겔독(ATTO)을 통해 발광 정도를 측정하였다. 웨스턴 블롯팅의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 이미지-J 프로그램으로 정량하여 MMP-1의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
[ASO에 의한 MMP-1 단백질 억제 효과] 세포 외 분비 MMP-1 단백질 발현율을 확인해본 결과 도 11a-11b와 같이 "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, 100 pM 내지 1 μM ASO처리시 MMP-1 단백질 발현율이 10-60% 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 MMP-1 ASO가 세포 외 분비 MMP-1의 단백질 발현 억제 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 5 . " ASO 1"에 의한 세포외 분비 콜라겐 단백질 발현 증가 효과
"ASO 1"에 의한 세포 외 분비 타입 I 콜라겐 단백질 발현 증가를 확인하기 위해 아래와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행하고 발현 밴드를 그래프로 수치화하였다.
[웨스턴 블롯팅] 세포배양은 실시예 1과 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 세포 배양액를 수확하여 동량의 배양액을 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브렌인 (Millipore, Cat. No. IPVH00010)으로 이송한 후 5% 탈지유 완충액에서 1 시간 블로킹을 하였다. 항- 타입 I 콜라겐 (SouthernBiotech, Cat. No. 1310-01)을 1차 항체로 사용하고, 토끼 항-염소 (Santacruz, Cat. No. 2768)을 2차 항체로 사용하였으며, 슈퍼시그날 웨스트피코 (Pierce, USA)을 이용하여 발광시키고 겔독 (ATTO)을 통해 발광 정도를 측정하였다. 웨스턴 블롯팅의 결과를 토대로 각 밴드의 발현정도를 이미지-J 프로그램으로 정량하여 타입 I 콜라겐의 상대적인 발현양을 그래프로 변환하였다.
[ASO에 의한 분비 타입 I 콜라겐 단백질 증가효과] 세포 외 분비 타입 I 콜라겐 단백질 발현율을 확인해본 결과 도 12a-12b와 같이 "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, 1 pM 이상의 농도에서 분비 타입 I 콜라겐 단백질 발현율이 20% 이상 증가하였으며 1 μM에서는 최고 80%까지 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 ASO에 의한 세포 내 MMP-1의 단백질 발현 감소는 분비 타입 I 콜라겐 단백질 발현 증가를 유도함을 알 수 있었다.
실시예 6. " ASO 1"에 의한 MMP -1 분비 억제 효과
"ASO 1"에 의한 세포 내 MMP-1 단백질 발현 억제 효과는 결과적으로 활성을 나타내는 세포 외 분비 MMP-1의 단백질 발현에 영향을 미친다. 이에 ASO처리시에 MMP-1 분비 감소를 확인하기 위하여 ASO 48시간 처리 후 세포 배양액에서의 단백질 변화를 아래와 같이 효소면역분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)로 수행하였다.
[ELISA] 세포배양은 실시예 1과 동일하며, ASO처리후 48시간이 되었을 때 세포 배양액을 수확하여 동량의 배양액을 인간 MMP-1 ELISA 킷트 (abcam, Cat. No. ab100603)을 이용하여 MMP-1의 분비량 측정하였다. 인간 MMP-1 ELISA 킷트의 실험방법에 따라 MMP-1의 분비량를 측정하였으며 선라이즈 (Sunrise, TECAN)을 통해 흡광도를 측정하였다. 흡광도 결과를 토대로 MMP-1의 분비량을 그래프로 변환하였다.
[ASO에 의한 MMP-1 분비 억제효과] 세포 외로 분비된 MMP-1 단백질을 확인해본 결과 도 13과 같이 "ASO 1"를 처리하지 않은 대조군 (con)과 비교하여, 100 pM와 10 nM ASO처리시 MMP-1의 분비가 15-30% 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 1 μM 처리시에는 50 % 감소함을 확인하였다. 따라서, MMP-1 ASO가 MMP-1 분비를 억제하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 7. 화학식 I의 화합물을 포함하는 피부 도포용 세럼 제조 (단위: w/w%)
Figure 112019047718359-pat00020

1. A파트를 비이커에 계량 후 용해한다 (25℃).
2. B파트를 또 다른 비이커에 계량 후 용해한다 (25℃).
3. A와 B를 혼합하여 호모게나이저를 사용하여 유화한다 (25℃, 3,600rpm, 5분).
4. C파트를 계량하여 완전히 분산한 후 50메쉬로 여과한 다음 3의 유화된 제형에 투입하여 호모게나이저로 유화한다 (80℃, 3,600rpm, 5분).
5. D파트를 4의 유화된 제형에 투입하여 호모게나이저로 유화한다 (25℃, 2,500rpm, 3분).
6. 균일분산과 완전 탈포를 확인 후 작업을 종결한다.
실시예 8. 화학식 I의 화합물을 포함하는 국소용 크림 제조 (단위: w/w%)
Figure 112019047718359-pat00021
1. A파트를 비이커에 계량 후 용해한다 (80℃).
2. B파트를 또 다른 비이커에 계량 후 용해한다 (85℃).
3. A와 B를 혼합하여 호모게나이저를 사용하여 유화한다 (80℃, 3,600rpm, 5분).
4. C,D를 각각 계량하여 3의 유화한 제형에 넣고 완전 분산시킨다 (80℃, 3,600rpm, 5분).
5. 35℃까지 냉각한 후 E를 넣고 교반한다 (35℃, 3,600rpm, 3분).
6. 균일 분산 및 완전 탈포 확인 후 작업을 종료한다 (25℃).
SEQUENCE LISTING <110> OliPass Corporation Han, Seon-Young Sung, Kiho Hong, Myunghyo Oh, Youree Heo, Jeong-Seok Jang, Kang Won <120> Matrix metalloproteinase-1 antisense oligonucleotides <130> 2018DP101 <150> KR10-2018-0057352 <151> 2018-05-18 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human matrix metalloproteinase-1 targeted artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Carbamated N-terminal <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> PNA modified olegonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n is a, g, c, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n is a, g, c, or t <400> 1 tnctcncnnt ntnt 14

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure 112020088639673-pat00053

    화학식 I 중에서,
    n은 11과 16사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 인간의 MMP-1 프리-mRNA 중 16개의 염기로 이루어진 [(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU] 서열과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물 전체가, 인간의 MMP-1 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X는 수소이며;
    Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐이며;
    Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기다.
    [화학식 Ⅱ] [화학식 Ⅲ] [화학식 Ⅳ]
    Figure 112020088639673-pat00054
    Figure 112020088639673-pat00055
    Figure 112020088639673-pat00056

    화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    L1은 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 혹은 -CH2-O-(CH2)5- 이며; 그리고,
    L2와 L3는 오른쪽 끝이 염기성 아미노기와 직접 연결된 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
  5. 제 4항에 있어서, 다음 식의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    (N→C) Fethoc-TA(6)C-TCA(6)-CC(1O2)A(6)-TA(6)T-A(6)T-NH2:
    상기 식에서,
    A, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산염기인 아데닌, 티민, 그리고 시토신을 포함하는 펩타이드 핵산 모노머이며;
    C(pOq)와 A(p)는 각각, 화학식 Ⅵ과 화학식 Ⅶ로 대표되는 비천연 핵산염기인 변형된 시토신과 아데닌을 포함하는 펩타이드 핵산 모노머이다:
    [화학식 Ⅵ] [화학식 Ⅶ]
    Figure 112019047718359-pat00027
    Figure 112019047718359-pat00028

    화학식 Ⅵ와 화학식 Ⅶ에서,
    p와 q는 정수인데, 상기 펩타이드 핵산 유도체 식에서는 p가 1 또는 6에 해당되고 q가 2에 해당되며; 그리고,
    약자인 "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"을 의미한다.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 4항의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 인간 MMP-1 유전자 전사의 하향 조절에 의한 피부노화 개선용 화장품.
  10. 삭제
  11. 삭제
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102304280B1 (ko) 2018-08-14 2021-09-23 올리패스 주식회사 아세틸코에이카복실라제2 안티센스 올리고뉴클레오티드

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
WO2018029517A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Olipass Corporation Androgen receptor antisense oligonucleotides
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Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105044A1 (en) * 2001-10-17 2003-06-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of matrix metalloproteinase 1 expression
AU2001250572A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
DE10238298A1 (de) * 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
EP1668024A4 (en) * 2003-09-29 2008-07-02 Topigen Pharma Inc OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASES INCLUDING INFLAMMATORY SUFFERING
US7511025B2 (en) * 2004-06-16 2009-03-31 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for inhibiting the synthesis or expression of MMP-1
KR20090098710A (ko) * 2008-03-14 2009-09-17 주식회사 씨티아이바이오 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체
KR20120073536A (ko) * 2010-12-27 2012-07-05 주식회사 파나진 다중전하를 갖는 ｐｎａ
US20150240239A1 (en) * 2014-02-27 2015-08-27 Nugen Biosience (Taiwan) Co., Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting matrix metalloproteinases 1 by interference ribonucleic acid
WO2016037071A2 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting tyr or mmp1
RU2748834C2 (ru) 2016-09-16 2021-05-31 Олипасс Корпорейшн Антисмысловые олигонуклеотиды против scn9a
WO2018122610A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Olipass Corporation Exon skipping by peptide nucleic acid derivatives

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
WO2018029517A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Olipass Corporation Androgen receptor antisense oligonucleotides
WO2018069764A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Olipass Corporation Hif 1-alpha antisense oligonucleotides

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