KR20120073536A

KR20120073536A - 다중전하를 갖는 ｐｎａ

Info

Publication number: KR20120073536A
Application number: KR1020100135333A
Authority: KR
Inventors: 김성기; 박창식; 조군호; 오수영; 윤진원; 주영순; 최성록; 김선영
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2010-12-27
Publication date: 2012-07-05

Abstract

본 발명은 PNA를 안티진(antigene)이나 안티센스(antisense)의 활용에의 제한점이었던 수용액상의 용해도 및 엉김 현상을 개선하고, 세포투과력을 높이기 위한 방법으로서 PNA에 부가적인CPPs의 도입이나 Cell Penetrating Reaget등의 부가적인 물질의 사용없이 PNA의 세포투과력 개선 및 기존의 PNA의 세포투과시 사용하는 농도보다 낮은 농도에서의 사용을 가능하게 하여 PNA를 안티진(antigene)이나 안티센스(antisense)에 활용함에 있다.

Description

다중전하를 갖는 ＰＮＡ{Peptide Nucleic Acid having multi-charge}

본 발명은 디에네이즈(DNase)나 뉴클레이즈(Nuclease) 와 같은 생체 내 효소에 안정한 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)말단에 쌍극성 이온을 도입하여 charge interation으로 인한 원형(Cyclic Type) 혹은 이합체(Dimer) 형성을 유도해 PNA를 Nanostructure화하여 수용액상에서의 용해도 증가 및 엉김현상을 최소화하고, 향상된 세포투과력을 얻는 것을 특징으로 한다.

안티진(anitigene)및 안티센스(antisense) 치료법은 특정 질병과 관련된 단백질의 발현 전에 이러한 단백질의 발현과 관련된 DNA및 mRNA(messenger RNA) 를 저해해 질병을 유발하는 단백질 생산 자체를 저해하는 보다 근원적이고 고도화된 치료법의 하나이다. 안티센스 DNA(antisense DNA)의 경우 질병 유전자로부터 유래하는 DNA 및RNA에 담겨 있는 유전 정보의 해독을 방해함으로서 정상적인 세포와 암세포를 서로 구분하지 못하고 모두 사멸시킬 수 있는 기존의 항암제등의 치료제와 달리 암세포와 관련된 단백질 발현 만을 선택적으로 저해할 수 있는 우수한 특이성(specificity)을 갖는다. 이러한 안티진(anitigene)및 안티센스(antisense) 치료제는 뇌종양 뿐만 아니라 전립선 암, 유방암, 폐암, 흑색종 등의 다양한 암에서의 활용 가능성이 높다(Hengmi CuiNature et al., 2008, 451, 202-206).

이러한 안티센스(antisense) 및 안티진(antigene) 치료제로 올리고뉴크레오타이드(oligonucleotide)가 사용 될 수 있으나, DNA나 RNA와 같은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 는 생체내에 존재하는 디에네이즈(DNase)나 뉴클레이즈(Nuclease) 와 같은 생체 내 효소에 의해 쉽게 분해되는 경향이 있어 생체내 사용시 특정 단백질의 발현 저해를 위해 타겟이 되는 RNA 및 DNA와의 결합 전에 분해될 가능성이 높다(Peyman et al., Chem. Rev. 1990, 90, 543 - 584.; Eugen Uhlmann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2796 - 2823). 또한 올리고뉴트레오타이드(oligonucleotide)는 그 자체적으로 세포내 투과도가 상당히 떨어지는 경향을 보이며, DNA나 RNA는 특별한 세포 투과 시약을 사용하지 않으면 세포내 투과가 효과적이 않는 것으로 알려져 있다.

따라서 올리고뉴크레오타이드(oligonucleotide)에 대해서 디에네이즈(DNase)나 뉴클레이즈(Nuclease) 와 같은 생체 내 효소에 의한 안전성 및 세포내 투과도의 개선을 위해 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)의 포스페이트(phosphate)기, 리보오스 고리, 혹은 핵산 염기를 변환하여 그 물성을 최적화하려는 노력이 진행되어 왔다(U.Englisch and D. H. Gauss, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 613-629; A. D. Mesmaeker et al. Curr. Opinion Struct. Biol. 1995, 5, 343-355; P. E. Nielsen, Curr. Opin. Biotech., 2001, 12, 16-20.).

그중 뉴클레이즈(Nuclease)나 디에네이즈(DNase)와 같은 생체 내 효소에 안정한 특성과 상보적인 DNA와 RNA와의 결합력이 DNA보다 강한PNA(Peptide Nucleic Acid)는 안티센스(antisense) 및 안티진(antigene)에의 활용에의 큰 장점을 갖고 있다. 덴마크의 Buchardt, Nielsen, Egholm, Berg 등에 의해 보고된 PNA (peptide nucleic acid) 는 (P. E. Nielsen, et al., Science, 1991, 254, 1497) DNA의 포스페이트-리보오스고리 기본 골격을 N-(2-아미노에틸)글리신 폴리아미드 기본 골격으로 대체하고 천연 또는 인공의 핵산염기를 메틸렌카르보닐 링커로 N-(2-아미노에틸)글리신의 중심 질소원자와 연결한 DNA 유사체이다. 획기적인 구조의 변화에도 불구하고 PNA는 DNA 뿐만 아니라 RNA와 와트슨-클릭(Watson-Crick) 염기 짝이룸 규칙에 따라 염기배열에 따른 상보적인 결합을 할 수 있을 뿐만 아니라 PNA는 상보적인 핵산과 결합함에 있어서 기본 골격이 전기적으로 중성이므로 전기적 반발을 최소화하여 DNA 및 RNA에 비해 강한 친화력을 갖는 경향이 있다(S. K. Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481; B. Hyrup et al., J. Am. Chem.Soc., 1994, 116, 7964-7970; M. Egholm et al., Nature, 1993, 365, 566-568; K. L. Dueholm et al., New J. Chem., 1997, 21, 19-31; P. Wittung et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7049-7054; M. Leijon et al., Biochemistry, 1994, 9820-9825.).

하지만 PNA역시 DNA와 유사하게 그 자체적으로는 세포투과도가 떨어지는 단점을 가지고 있으며, 전기적으로 중성인 성질은 PNA의 수용액에서의 용해도 감소와 엉김현상의 원인이 되었다(Eugen Uhlmann et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2796-2823). 이러한 단점을 극복하며 PNA를 안티센스(antisense) 및 안티진(antigene)에 사용하기 위해 PNA의 세포투과도를 높이기 위한 많은 노력들이 있어왔다.

방식의 Microinjection은 15-20mer의 anti-T-Ag PNA의 경우 1uM의 PNA농도에서40~50%의 Inhibition 효율을 보였다. 하지만 Microinjection 방법은 작은 scale의 실험에서만 사용 될 수 있는 제한된 방법이다(K. G. Au et al., Science, 258, 1481-1485, 1992).

PNA의 세포투과를 위한 더 손쉬운 방법은 Electroporation하는 방법이다. Telomerase PNA의 경우 mismatch PNA는 inhibition 효율을 보이지 않았으나하지 full match의 경우 60% 이상을 inhibition하는 효율을 보였다. 하지만 전기 펄스를 사용하는 Electoporation 방법은 세포 손상을 유발 할 수 있음으로 치료 목적으로 사용하는 것에는 한계가 있다(D.R. Corey, Oncogene, 18, 6191-6200, 1999).

세포막이나 membrane defect를 갖는 세포에 micromolar 농도의 PNA를 처리하여 Ribosomal RNA를 Inhibition한 예가 보고된 바가 있으며(P.E. Nielsen et al., Nat. Biotechnol, 16, 355-358, 1998) HIV-1에 감염된 Human lymphoma cell 에 20 uM이상의 PNA를 처리하여 Ribosomal frameshift의 효과적인 방해를 하는 것이 보고된 바 있다(H, Mitsuya et al., J. Virol, 74, 4621-4633, 2000). 하지만 이러한 직접 처리시의 PNA의 세포투과 과정에 대해서 정확히 알려져 있지 않으나 고농도로 사용하는 PNA로 인해 Subtoxic stress를 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 고농도의 PNA를 사용하는 것은 그리 효율적인 방법이 아니다.

PNA의 세포투과를 위한 다양한 unmodified 방법이 있으나 안티센스(antisense)나 안티진(antigene)에의 활용에 있어서 더 효과적이고 일반적인 방법이 요구됨에 따라 다양한 conjugation 방법들이 도입되었다. 일반적으로 CPPs(Cell Penetrating Peptides)와 결합하여 세포막의 active channel 등을 이용하려는 노력과, PNA에 양이온을 도입함으로써 세포 투과도를 높이려는 노력 등이 진행되어 왔다. 하지만CPPs 등을 도입하는 방법은 상대적으로 큰 부가적 요소를 도입해야 하는 번거로움과 세포 종류에 따른 결과 편차 등의 문제가 있으며, 세포내에서의 엔도좀(Endosome) 형성은 안티진(antigene) 및 안티센스(antisense) 활성에 제한 요소인 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라 micromolar농도에서 EC₅₀ 값을 나타내는 것으로 알려져 있다(Peter E. Nielsen Chemistry & Biodiversity, 2010, 7, 786-804). 양이온을 도입하는 경우도 CPP 도입시 생기는 문제점 뿐만 아니라 상대적으로 세포투과도가 떨어지는 문제가 있다(Koppelhus et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2002, 12, 51-63; Nucleic Acids. Res., 33, 6837-6849, 2005;).

세포투과력을 높이기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine)이나 리포펙타민2000 (Lipofectamine 2000) 등의 세포투과 시약(Cell penetrating reagent)을 사용하는 방법이 많이 사용되고 있으나 역시 세포투과를 위한 부가적인 물질을 쓴다는 부담이 있으며, 세포투과 시약의 독성 및 부가적인 작용에 대해서는 특별히 알려진 바가 없다.

PNA의 세포투과에 대한 연구는 Microinjection으로 시작되었다. 세포내로 직접 주입하는 방식의 Microinjection은 15-20mer의 anti-T-Ag PNA의 경우 1uM의 PNA농도에서40~50%의 Inhibition 효율을 보였다. 하지만 Microinjection 방법은 작은 scale의 실험에서만 사용 될 수 있는 제한된 방법이다(Au et al., Science, 258, 1481-1485, 1992).

PNA의 세포투과를 위한 더 손쉬운 방법은 Electroporation하는 방법이다. Telomerase PNA의 경우 mismatch PNA는 inhibition 효율을 보이지 않았으나하지 full match의 경우 60% 이상을 inhibition하는 효율을 보였다. 하지만 전기 펄스를 사용하는 Electoporation 방법은 세포 손상을 유발 할 수 있음으로 치료 목적으로 사용하는 것에는 한계가 있다 (Corey, Oncogene, 18, 6191-6200, 1999).

세포막이나 membrane defect를 갖는 세포에 micromolar 농도의 PNA를 처리하여 Ribosomal RNA를 Inhibition한 예가 보고된 바가 있으며(Nielsen et al., Nat. Biotechnol, 16, 355-358, 1998) HIV-1에 감염된 Human lymphoma cell 에 20 uM이상의 PNA를 처리하여 Ribosomal frameshift의 효과적인 방해를 하는 것이 보고된 바 있다( Mitsuya et al., J. Virol, 74, 4621-4633, 2000). 하지만 이러한 직접 처리시의 PNA의 세포투과 과정에 대해서 정확히 알려져 있지 않으나 고농도로 사용하는 PNA로 인해 Subtoxic stress를 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 고농도의 PNA를 사용하는 것은 그리 효율적인 방법이 아니다.

PNA의 세포투과를 위한 다양한 unmodified 방법이 있으나 안티센스(antisense)나 안티진(antigene)에의 활용에 있어서 더 효과적이고 일반적인 방법이 요구됨에 따라 다양한 conjugation 방법들이 도입되었다. 일반적으로 CPPs(Cell Penetrating Peptides)와 결합하여 세포막의 active channel 등을 이용하려는 노력과, PNA에 양이온을 도입함으로써 세포 투과도를 높이려는 노력 등이 진행되어 왔다. 하지만CPPs 등을 도입하는 방법은 상대적으로 큰 부가적 요소를 도입해야 하는 번거로움과 세포 종류에 따른 결과 편차 등의 문제가 있으며, 세포내에서의 엔도좀(Endosome) 형성은 안티진(antigene) 및 안티센스(antisense) 활성에 제한 요소인 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라 micromolar농도에서 EC50 값을 나타내는 것으로 알려져 있다. (Nielsen et al., Chemistry & Biodiversity, 2010, 7, 786-804) 양이온을 도입하는 경우도 CPP 도입시 생기는 문제점 뿐만 아니라 상대적으로 세포투과도가 떨어지는 문제가 있다(Koppelhus et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2002, 12, 51-63; Nucleic Acids. Res., 33, 6837-6849, 2005).

이상에서 본 바와 같이 PNA의 세포투과를 위한 다양한 방법들이 제안되었으나 PNA에 부과적인 부분도입을 필요로 하며 세포내 독성등을 갖는 등 치료 목적의 안티진(antigene)이나 안티센스(antisense)에의 활용에의 문제점이 있으며 PNA의 안티진(anitigene)이나 안티센스(antisense)에 활용하기 위해서는 PNA에 부가적인 요소를 최소화하여 세포내 독성등의 부작용을 최소화할 수 있는 새로운 방법이 필요한 상황이다.

매우 작은 크기를 갖는 Nano partical 은 partical shape이 같다면, 그 크기에(반경) 의존해 세포를 투과한다는 연구 결과가 보고되었다(Amidon et al. Pharmaceutical Research. 14, 1568-1573, 1997; Chi-Hwa Wang et al., Journal of Controlled Release, 118, 7-17, 2007). 100nm 이하의 partical이 Caco-2 셀에 partical 크기에 작을수록 Caco-2 셀을 잘 통과하는 경향을 보였다.

PNA의 Neutral한 특성은 DNA와의 Duplex 형성시 DNA/DNA 상호 결합과는 다르게 정전기적 반발력이 없기 때문에 DNA와의 결합세기를 증가시키는 작용하지만, 제한된 수용액상의 용해도와 엉김현상의 원인이 되기도 한다. 이러한 수용액상의 용해도 증가와 엉김현상의 감소를 위해 PNA 말단에 Amino acid를 도입하거나 PNA 의 기본골격에 Positive charge를 도입한 PNA등, 전하를 이용하여 PNA의 수용액상의 용해도 증가 및 엉김현상 감소를 위한 여러가지 시도들이 있었으며 이러한 시도는 PNA에 증가된 수용액상의 용해도 및 엉김현상 감소를 주었다(Eugen Uhlmann et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2796 - 2823).

또한 양쪽 말단에 양,음 전하를 동시에 갖는 쌍극성 이온(Zwitterions)을 갖는 화합물의 경우 말단 양쪽의 쌍극성 이온간의 정전기적 작용에 의한 분자 내 혹은 분자간 결합의 형성에 의하여 원형태(Cyclic Type) 혹은 이합체(Dimer)의 형태가 된다는 연구 결과가 보고되었다. 이러한 한 쌍의 쌍극성 이온을 갖는 화합물은 일반적으로 일정 농도 이하에서는 주로 원형태(Cyclic Type)를 유지하며, 일정 농도 이상에서는 이합체(Dimer) 형태로 존재하는 것으로 알려져 있으며 그러한 구조체의 반경은 대략 3nm 정도의 크기이다(Frank Reinhold et al., J.AM.SOC., 128, 1430-1431, 2006).

PNA의 양쪽 말단에 쌍극성 이온을 도입하면 도입된 전하에 의해 PNA의 수용액상의 용해도 증가와 엉김현상의 감소를 기대할 수 있을 것이며, 농도에 따라서 원형태(Cyclic Type) 혹은 이합체(Dimer)로 존재할 것으로 예상된다. 이러한 구조는 PNA의 sequence길이에 따라 차이가 있겠지만 대략 반경10~20nm 정도가 될것으로 예상되며, 이정도 크기의 Nano 크기 구조체는 PNA 가 세포투과시 세포투과율 증가에 크게 기여할 것으로 예상된다.

PNA의 양쪽 말단에 쌍극성 이온의 도입은 charge를 갖고 있는 γPNA monomer의 사용으로 가능하다. γPNA monomer는 아미노산인Lysine과 Glutamic acid를 이용하여 PNA의 기본골격에 음전하 및 양전하를 도입한 변형된 PNA monomer로서, Lysine으로는 양전하를 Glutamic acid로는 음전하를PNA의 기본골격의 γ(감마) 위치에 도입할 수 있다.

PNA 올리고머 합성시 5',3' 말단 각각에 Lysine, Glutamic acid를 도입한 γPNA monomer를 하나씩 도입하면 PNA 말단에 쌍극성 이온을 한 개씩 도입한 PNA 올리고머를 합성할 수 있으며, 쌍극성 이온의 도입 개수는 한쪽 말단에 1개의 쌍극성 이온에서부터 2개,3개 등 γPNA monomer 의 개수에 따라 그 조절이 가능하고, 세포투과도 결과에 의하면 말단에1개씩의 쌍극성 이온이 도입된 PNA에서도 예상하는 원형태(Cyclic Type) 혹은 이합체(Dimer) 구조가 될 것으로 예상된다.

이러한 PNA의 말단에 쌍극성 이온을 도입하는 방법은 Lysine과 Glutamic acid를 이용한 γPNA monomer를 사용하는 방법뿐만 아니라, 기본적인 γPNA monomer 합성시 사용하는 Lysine과 Glutamic acid를 아마이드 축합시켜 만든 화합물을 γPNA monomer 합성시에 Lysine, Glutamic acid를 대신 사용하여 한 monomer에 쌍극성 이온을 동시에 갖는 변형된 γPNA monomer을 합성하여 사용할 수 있을 뿐만 아니라 γPNA monomer 가 아닌 Lysine,Glutamic acid 등의 다양한 전하를 갖는 Amino acid 을 PNA 말단에 도입하는 방법으로도 가능하다. 또한 γPNA monomer 와 유사하게 Lysine과 Glutamic acid를 아마이드 축합시켜 변형시킨 아미노 에시드를 PNA 올리고머 말단에 도입함으로서 쌍극성이온의 도입이 가능하다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 디에네이즈(DNase)나 뉴클레이즈(Nuclease) 와 같은 생체 내 효소에 안정한 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)말단에 쌍극성 이온을 도입하여 charge interation으로 인한 원형(Cyclic Type) 혹은 이합체(Dimer) 형성을 유도해 PNA를 Nanostructure화하여 수용액상에서의 용해도 증가 및 엉김현상을 최소화하고, 향상된 세포투과력을 얻는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다중전하를 갖는 PNA는 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,

n은 8 혹은 8보다 큰 정수이며;

A₁, A₂, …, A_n 은 각각 수소 또는 보호되거나 비보호된 천연 혹은 비천연의 α-아미노산의 곁사슬이고;

C 및 D는 서로 독립적으로 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬 옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴 옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 체환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 이들에 한정되는 것은 아니며;

E는 수소 또는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;

B₁, B₂,…, B_n 은 각각 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신 및 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기나 비천연 핵산 염기 중에서 선택된다.]

상기 화학식 1에서 A1, A2, …, An 에 대해 구체적으로 예를 들면 화학식 1-1 내지 화학식 1-8로 표시되는 α-아미노산의 잔기를 포함하고 있다.

화학식 1로 표현되는 PNA의 올리고머의 전하에 의한 원형의 구조체 혹은 이합체(dimer)는 모식도는 도1에 나타내었다.

도 1은 본 발명에 따른 PNA 올리고머의 전하에 의한 원형의 구조체 혹은 이합체(dimer)의 모식도이다.
도 2는 실시예 3에서의 농도에 따른 miR-20b 안티센스 PNA의 효과 평가결과이다.
도 3은 γK, γE monomer 및 γ(+,-) monomer 이다.

이하, 본 발명의 구성 요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 구성요소의 기술적 범위를 실시예들에 예시한 것들로 한정하고자 하는 것은 아니다. 더욱이, 상기 기술의 당업자들은 본 발명의 근본적인 개념과 그 실행을 쉽게 수정하거나 변경할 수 있을 것이다.

-약어 목록-

Fmoc = (9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐[(9Hfluoren-9-yl)methoxycarbonyl]

Bts = 벤조[d]티아졸-2-설포닐[(Benzo[d]thiazole-2-sulfonyl)]

t-Boc = t-부틸옥시카르보닐

-일반적 단량체 합성 방법-

본 발명의 분자들에 대한 NMR 스텍트럼은 Varian Inova 300 MHz, Varian Inova 600 MHz NMR Spectrometer를 이용하였고, 화합물에 대한 질량 분석은 Electrospray mass spectra (ESI-MS) 을 이용하였다. 본 발명의 PNA올리고머는 Agilent Technologies HP 1100 Series컬럼을 이용하여 분석 및 정제하였고 질량 분석은 AXIMA-CFR (Shimadzu Biotech)를 이용하였다.

변형된 PNA 모노머들의 합성은 L형의 α-아미노산을 출발물질로 합성하였으며 반응식 1에 따르거나 약간 변형하여 문헌에 보고된 변형된 PNA 모노머 합성 방법에 따라 합성되었다(Goon Ho Joe et al., Bull. Korean. Chem. Soc., 31, 7, 2010; Rosangela marchelli, Chirality, 21, 245-253, 2009; David R. Liu et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 4646-4659).

L형의 α-아미노산을 출발물질로 N,O-Dimethylhydroxyamine.hydrochloride 와 펩타이드 축합시켜 화합물 a를 얻고, -78℃ 에서 LiAlH₄ 로 Reduction후 Ethyl glycinate과 Reductive amination하여 화합물 c를 얻고, Nucleobase acetic aicd와 펩타이드 축합시켜 화합물 d를 얻은 후, LiOH를 사용한 가수분해를 통해 화합물 e를 얻었다. Fmoc등 LiOH를 사용한 가수분해시 탈보호기화되는 보호기의 경우 가수분해 후 보호기화 과정을 실시하였다.

[반응식1]

본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 대한민국 등록특허 10-0464261 방법에 따라 Benzothiazolesulfonyl(Bts)기로 보호된 PNA 단량체로부터 합성될 수 있으며, 변형된 PNA의 경우는 Fmoc 또는 tBoc으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수도 있다[P.E. Nielsen(Ed.) “ Peptide Nucleic Acids:Protocols and Applications” 2^nd Ed.(Horizon Bioscience, 2004) PNA 합성법은 이에 제한되지는 않는다.

-PNA 올리고머의 일반적 합성방법-

PNA 올리고머는 대한민국 등록특허 10-0464261의 방법에 따라 Bts기로 보호된 PNA 단량체 및 Fmoc 기로 보호된 변형된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법 (solid phase synthesis)으로 합성되었다.

-PNA 셀투과도 측정-

PNA 의 셀투과도 측정은 Luciferase분석법을 사용하였으며, Promega사의 Luciferase assay Protocol에 따라 실시하였다. A549 Cell을 사용하여 실시하였다.

실시예 1: 안티센스 PNA의 합성

PNA의 마이크로RNA에 대한 안티센스 효과를 확인하기 위하여, 특정 마이크로RNA(miR16, miR20b)에 대해 상보적인 서열을 갖는 안티센스 PNA를 합성하였다. 마이크로RNA는 보통 21 내지 25개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있는데, 그 중 염기서열 2번부터 8번까지는 씨드 서열(seed sequence)로 알려져 있다.

실시예	PNA 올리고머 이름	염기서열(N->C)	Mer 수
실시예1	PNA16-1	C^#GCCAATATTTACGTGCTGCT^#A	22mer
실시예2	PNA20b-2	C^#TC^#CTGCACTATGAGCACT^#TT^#G	22mer
^# Lysine 변형된 PNAMonomer, ^* Glutamic acid 변형된 PNA Monomer

실시예 2: 농도에 따른 miR-16 안티센스 PNA의 효과 평가

마이크로RNA 16에 대한 안티센스 PNA의 효과를 농도별로 확인해보기 위하여, A549 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR16에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 각각 10, 50, 100, 200, 500 및 1000 nM 농도의 안티센스 PNA(1번)와 함께 A549 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. miR16용 안티센스 PNA 대신 대조 PNA(con-R)도 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 3: 농도에 따른 miR-20b 안티센스 PNA의 효과 평가

마이크로RNA 20b 에 대한 안티센스 PNA의 효과를 농도별로 확인해보기 위하여, A549 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR16에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 각각 10, 50, 100, 200, 500 및 1000 nM 농도의 안티센스 PNA(2번)와 함께 A549 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. miR16용 안티센스 PNA 대신 대조 PNA(con-R)도 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 200 nM 이상의 농도로 miR16용 안티센스 PNA를 처리하였을 때 miR16에 대한 안티센스의 효과가 가장 높았다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 다중전하를 갖는 PNA.
[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,
n은 8 혹은 8보다 큰 정수이며;
A₁, A₂, …, A_n 은 각각 수소 또는 보호되거나 비보호된 천연 혹은 비천연의 α-아미노산의 곁사슬이고;
C 및 D는 서로 독립적으로 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬 옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴 옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 체환체가 있거나 없는 아실, 치환체가 있거나 없는 설포닐 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
E는 수소 또는 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
B₁, B₂,…, B_n 은 각각 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신 및 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기나 비천연 핵산 염기 중에서 선택된다.]
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1에서 A1, A2, …, An 은 하기 화학식 1-1 내지 화학식 1-8로부터 선택되는 α-아미노산의 잔기인 것을 특징으로 하는 다중전하를 갖는 PNA.