TW202002991A - 基質金屬蛋白酶-1之反義寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

一種治療與人類基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)基因轉錄相關的疾病或病症之方法，包含對一受試者施用如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物。
本發明提供如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，其以人類基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA前體「外顯子5」的5’剪接位點為目標。本發明中的胜肽核酸衍生物在細胞中強烈誘導人類基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA的剪接變體，且對於治療與人類基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)蛋白相關的皮膚老化的病症或疾病非常有用。

Description

基質金屬蛋白酶-1之反義寡核苷酸
本發明涉及互補標的於人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體的胜肽核酸衍生物，用於改善由基質金屬蛋白酶-1調節的皮膚老化。
皮膚老化受到了相當多的關注，因為老化的跡象在皮膚中最明顯。由於皮膚老化的預防及治療對生活品質非常重要，已經老化的人與年輕人都對相關的保健食品、化妝品、醫藥、醫療用品等感興趣。皮膚老化過程主要有兩個。一種為伴隨衰老的內生性或自然衰老，另一種為外在衰老，這是由外源性起源所引起的，如太陽曝曬、抽煙，以及營養不良。
皮膚上的紫外線照射加速了基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)的表現，進而促進膠原蛋白(真皮的主要結構成分)的降解。此外，抽煙誘導皮膚中的基質金屬蛋白酶-1的mRNA，其引起與皮膚上的紫外線照射相同的結果[J.Cosmetic Dermatology vol 6,40-50(2007)]。
膠原蛋白是各種結締組織中胞外空間的主要結構蛋白，例如皮膚、血管、骨骼、牙齒，以及肌肉。由於膠原蛋白負責支持大多數組織與細胞結構，其降解及變形可能強烈影響皮膚老化[J.Pathol.vol 211,241-251(2007)]。
基質金屬蛋白酶是從纖維母細胞、角質細胞等分泌的酶，其能夠降解各種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)以及基底膜(basement membrane，BM)。有超過26種基質金屬蛋白酶被鑑定出來，例如基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)(間質膠原蛋白酶)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)(明膠酶)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)(溶基質素)、基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)(基質溶素)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)(嗜中性膠原蛋白酶)，以及基質金屬蛋白酶-12(MMP-12)(金屬彈性蛋白酶)[J.Biol.Chem.vol 277,451-454(2002)；J.Matrix.Biol.vol 15,519-526(1997)]。
由暴露於紫外線照射以及抽煙所引起的活性氧物質已知是基質金屬蛋白酶-1過度表現的原因。在這種意義上，已經開發出用於治療皮膚老化的抗氧化劑以及用於抗氧化作用的功能性食品，例如維生素A(視黃醇)、維生素C(抗壞血酸)、維生素E(生育酚)、類胡蘿蔔素、類黃酮、綠茶，以及硒，而且目前正進行其作用機制的研究[Int.J.Food Sci.Technol.vol 73,989-996(2005)；Kor.J.Aesthet.Cosmetol.vol 11,649-654(2013)；Int.J.Mol.Med.vol 38,357-363(2016)]。
考慮到金屬蛋白酶-1在皮膚老化中的重要性，基於金屬蛋白酶-1表現的機制開發藥物或化妝品是非常有趣且必要的，其可以改善並預防皮膚老化狀況。
mRNA前體：遺傳訊息在DNA(2-去氧核糖核酸)上進行。DNA被轉錄以在細胞核中產生mRNA前體(信使核糖核酸前體)。哺乳動物的mRNA前體通常由外顯子及內含子組成，且外顯子及內含子彼此相互連接，如以下示例性所提供的。外顯子及內含子編號如下圖所示。
Figure 108111655-A0202-12-0003-1
mRNA前體的剪接：透過一系列集合稱為「剪接」的複雜反應在刪除內含子後將mRNA前體加工成mRNA，示意性的摘要如下圖所示。[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(5),386-398(2005)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.15(2),108-121(2014)]。
Figure 108111655-A0202-12-0003-2
透過在mRNA前體與剪接銜接子因子之間形成「剪接體E錯合物」(亦即，早期剪接體錯合物)來啟動剪接。在「剪接體E錯合物」中，U1與外顯子N及內含子N的接合處結合，U2AF35與內含子N及外顯子(N+1)的接合處結合。因此，外顯子/內含子或內含子/外顯子的接合處對於早期剪接體錯合物的形成是非常重要的。「剪接體E錯合物」在與U2進行額外複合後演變為「剪接體A錯合物」。 「剪接體A錯合物」經歷了一系列複雜的反應，以刪除或剪切出內含子以鄰接相鄰的外顯子。
核醣體蛋白質的合成：蛋白質由DNA(2-去氧核糖核酸)編碼。因應細胞刺激或自發地，DNA被轉錄以在細胞核中產生mRNA前體(前信使核糖核酸前體)。將mRNA前體的內含子以酵素剪接出來以產生mRNA(信使核糖核酸)，然後將其易位至細胞質中。在細胞質中，稱為核醣體的轉譯機制的錯合物與mRNA結合並在掃描沿著該mRNA編碼的遺傳訊息時進行蛋白質合成[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Cancer Res.vol 48,2659-2668(1988)]。
反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，ASO)：以序列特異性方式(亦即，互補地)與核酸(包括DNA、mRNA以及mRNA前體)結合的寡核苷酸稱為反義寡核苷酸(ASO)。
例如，如果一反義寡核苷酸與細胞質中的一mRNA緊密結合，則該反義寡核苷酸可能能夠抑制沿著該mRNA的核醣體蛋白質合成。為了抑制其標的蛋白質的核醣體蛋白質合成，反義寡核苷酸需要存在於細胞質內。
剪接的反義抑制：如果一反義寡核苷酸與細胞核中的mRNA前體緊密結合，則反義寡核苷酸)可能能夠抑制或調節mRNA前體與mRNA的剪接。為了抑制或調節mRNA前體與mRNA的剪接，反義寡核苷酸需要存在於細胞核內。這種剪接的反義抑制產生出的一條mRNA或多條mRNAs缺少被該反義寡核苷酸標的的外顯子。這樣的mRNA(s)被稱為「剪接變體」，且編碼出的蛋白質小於由全長mRNA編碼的蛋白質。
原則上，可以透過抑制「剪接體E錯合物」的形成來中斷剪接。如果一反義寡核苷酸緊密地與(5’→3’)外顯子-內含子的接合處結合，亦即「5’ 剪接位點」，則該反義寡核苷酸阻斷mRNA前體與因子U1之間形成錯合物，進而阻斷「剪接體E錯合物」的形成。同樣地，如果一反義寡核苷酸緊密地與(5’→3’)內含子-外顯子的接合處結合，亦即「3’剪接位點」，則不能形成「剪接體E錯合物」。
以下提供的附圖中示意性地說明3’剪接位點與5’剪接位點。
Figure 108111655-A0202-12-0005-49
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易受內源核酸酶的降解，限制了它們的治療效用。迄今為止，許多類型的非天然(天然狀態下未發生的)寡核苷酸已被開發並研究。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]與DNA及RNA相比，許多這類非天然寡核苷酸顯現出延長的代謝穩定性。以下提供了一些代表性非天然寡核苷酸的化學結構。這種寡核苷酸可預測地與DNA或RNA一樣與互補核酸結合。
Figure 108111655-A0202-12-0006-4
硫代磷酸寡核苷酸：硫代磷酸寡核苷酸(Phosphorothioate oligonucleotide，PTO)是一種DNA類似物，其中每個單體中的一個主股磷酸氧原子被硫原子替代。這種小的結構變化使得PTO較能抵抗核酸酶的降解[Ann.Rev.Biochem.vol 54,367-402(1985)]。
茲因硫代磷酸寡核苷酸與DNA骨架的結構相似性，它們在大多數哺乳動物細胞類型中都很難穿透細胞膜。然而，對於大量表現DNA轉運蛋白的某些類型的細胞，DNA與硫代磷酸寡核苷酸皆顯現出良好的細胞穿透性。已知全身施用的硫代磷酸寡核苷酸易於分佈到肝臟及腎臟[Nucleic Acids Res.vol 25,3290-3296(1997)]。
為了促進PTO在體外的細胞穿透，脂質轉染已經是很普遍的做法。然而，脂質轉染會物理性地改變細胞膜，將引起細胞毒性，因此對於長期體內治療用途而言不甚理想。
在過去的30年中，反義硫代磷酸寡核苷酸與硫代磷酸寡核苷酸變體已經被臨床評估用於治療癌症、免疫失調、代謝疾病等。[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]許多此類型的反義藥物候選藥尚未成功開發，部分原因是硫代磷酸寡核苷酸的細胞穿 透性差。為了克服細胞穿透性差的問題，需要以高劑量施用硫代磷酸寡核苷酸以達到治療活性。然而，已知硫代磷酸寡核苷酸與劑量限制性毒性相關，包括延長凝血時間、補體活化，腎小管腎病、肝巨噬細胞活化，以及免疫刺激，包括脾臟腫大、淋巴增生、單核細胞浸潤[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]。
已發現許多反義硫代磷酸寡核苷酸對於與肝臟或腎臟密切相關的疾病顯現出不錯的臨床活性。Mipomersen為一種硫代磷酸寡核苷酸類似物，可抑制apoB-100的合成，apoB-100為一種參與LDL膽固醇轉運的蛋白質。Mipomersen在動脈粥狀硬化患者中表現出應有的臨床活性，這很可能是由於其優先分配到肝臟的緣故。[Circulation vol 118(7),743-753(2008)]ISIS-113715為一種抑制蛋白酪胺酸磷酸酶1B(PTP1B)合成的硫代磷酸寡核苷酸反義類似物，並且發現其在第二型糖尿病患者中顯示出治療活性[Curr.Opin.Mol.Ther.vol 6,331-336(2004)]。
鎖核酸：在鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)中，RNA的骨架核糖環在結構上被限制以增加對RNA或DNA的結合親和力。因此，鎖核酸(LNA)可以被認為是高親和力的DNA或RNA類似物[Biochemistry vol 45,7347-7355(2006)]。
磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸：在磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide，PMO)中，DNA的主股磷酸酯以及2-去氧核糖分別被胺基磷酸酯以及嗎啉代替。[Appl.Microbiol.Biotechnol.vol 71,575-586(2006)]雖然DNA骨架帶負電，但磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)骨架不帶電。因此，磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸與mRNA之間的結合在主股之間沒有 靜電排斥，並且傾向於比DNA與mRNA之間的結合更強。由於磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)在結構上與DNA非常不同，因此磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)不會被識別DNA或RNA的肝轉運蛋白識別。儘管如此，磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)不容易穿透細胞膜。
胜肽核酸：胜肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)為一種具有N-(2-胺基乙基)甘胺酸作為單元骨架的多胜肽，並且由Nielsen博士及其同事發現[Science vol 254,1497-1500(1991)]。胜肽核酸的化學結構以及縮寫命名在以下提供的圖中說明。與DNA及RNA一樣，胜肽核酸也選擇性地與互補核酸結合[Nature(London)vol 365,566-568(1992)]。在與互補核酸的結合中，胜肽核酸(PNA)的N端被認為等同於DNA或RNA的「5’端」，胜肽核酸(PNA)的C端等同於DNA或RNA的「3’端」。
Figure 108111655-A0202-12-0008-6
與磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸一樣，胜肽核酸的骨幹不帶電。因此，胜肽核酸與RNA之間的結合傾向於比DNA與RNA之間的結合更強。由於胜肽核酸在化學結構上與DNA明顯不同，胜肽核酸不會被識別DNA的肝轉運蛋白識別，並且會顯示出與DNA或硫代磷酸寡核苷酸不同的組織分佈特徵。然而，胜肽核酸也很難穿透哺乳動物的細胞膜[Adv.Drug Delivery Rev.vol 55,267-280,2003]。
以經修飾的核鹼基提高胜肽核酸的膜穿透性：通過引入經修飾的核鹼基，使胜肽核酸對哺乳動物的細胞膜具有高度可穿透性。該些經修飾的核鹼基共價連接有陽離子脂質或其等價物。下文提供了這種經修飾的核鹼基的化學結構。發現胞嘧啶、腺嘌呤以及鳥糞嘌呤的這種經修飾的核鹼基分別可預測地且互補地與鳥糞嘌呤，胸腺嘧啶以及胞嘧啶雜合[PCT申請號PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253]。
Figure 108111655-A0202-12-0009-7
將這種經修飾的核鹼基摻入胜肽核酸與脂質轉染相似。透過脂質轉染，具有磷酸主股的寡核苷酸分子以陽離子脂質分子如脂質體(lipofectamine)包裹，並且與裸寡核苷酸分子相比，這種脂質轉染胺/寡核苷酸錯合物傾向於相當容易地穿透膜。
除了良好的膜穿透性之外，那些胜肽核酸衍生物被發現對互補核酸具有超強親和力。例如，將4至5個經修飾的核鹼基引入至11至13個核苷酸單體單元(mer)胜肽核酸(PNA)衍生物，在與互補DNA的雙股體形成中容易產生20℃或更高的Tm增益。這種胜肽核酸衍生物對單鹼基錯配具有高度敏感度。單鹼基錯配導致Tm損失11至22℃，這取決於經修飾的核鹼基的類型以及胜肽核酸序列。
小干擾RNA(small interfering RNA，siRNAs)：小干擾RNA(siRNAs)係指20-25個鹼基對的雙股RNA[Microbiol.Mol.Biol.Rev.vol 67(4),657-685(2003)]。小干擾RNA的反義股以某種方式與蛋白質相互作用以形成「RNA誘導的沉默錯合物」(RNA-induced Silencing Complex，RISC)。然後RNA誘導的沉默錯合物結合於mRNA中與小干擾RNA的反義股互補的部分。與RNA誘導的沉默錯合物雜合的mRNA將被剪切。因此，小干擾RNA催化誘導其目標mRNA的切割，並因此抑制mRNA的蛋白質表現。RNA誘導的沉默錯合物並非總是與其目標mRNA內的完整互補序列結合，這引起了對於小干擾RNA(siRNAs)療法的脫標效應相關的擔憂。與具有DNA或RNA骨架的其他種類的寡核苷酸一樣，小干擾RNA的細胞穿透性差，因此除非適當配製或化學修飾以具有良好的膜穿透性，否則呈現的體外或體內治療活性往往較差。
基質金屬蛋白酶-1 siRNA：根據報導，標的人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA內的19個核苷酸單體單元RNA序列的MMP-1 siRNA可在100nM脂質轉染後抑制人類軟骨肉瘤中MMP-1的mRNA以及蛋白質的表現[J.Orthop.Res.vol 23,1467-1474(2005)]。該結果可用於研究基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)相關的癌症轉移以及癌症治療的發展。
抗氧化劑以及用於抗氧化作用的功能性食品已被開發用於治療皮膚老化，但效果有限，且其作用機制尚在研究中。儘管根據報導基質金屬蛋白酶-1相關的siRNA在體外抑制基質金屬蛋白酶-1的mRNA以及蛋白質的表現， 但是siRNA的製造過於昂貴，且需要透過經皮給藥將其遞送到皮膚中以獲得良好的使用者順從性。因此，考慮到金屬蛋白酶-1在皮膚老化中的重要性，基於金屬蛋白酶-1表現的機制開發藥物與化妝品是非常有趣且必要的，其可以改善並預防皮膚老化狀況。
本發明提供由式I所表示之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類：
Figure 108111655-A0202-12-0011-8
其中，n為10到21之間的整數；該式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在人類基質金屬蛋白酶-1的信使核糖核酸前體(pre-mRNA)中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補，或與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體部分互補，具有一個或兩個錯配；S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1，以及Tn獨立地表示氫基、氘基、經取代或未經取代的烷基，或經取代或未經取代的芳基；X及Y獨立地表示為氫基、氘基、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、胺基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、經取代或未經取代的烷基、經取代 或未經取代的芳基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的烷基醯基、經取代或未經取代的芳基醯基、經取代或未經取代的烷氧基羰基、經取代或未經取代的芳氧基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基羰基、經取代或未經取代的芳基胺基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的芳基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的烷氧基硫代羰基、經取代或未經取代的芳氧基硫代羰基、經取代或未經取代的烷基磺醯基、經取代或未經取代的芳基磺醯基、經取代或未經取代的烷基膦基，或經取代或未經取代的芳基膦基；Z表示為氫基、氘基、羥基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的胺基、經取代或未經取代的烷基、或經取代或未經取代的芳基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；以及，B1、B2、...、Bn-1，以及Bn中的至少四個獨立地選自非天然核鹼基，其具有與該核鹼基基團共價連接的經取代或未經取代的胺基。
式I化合物誘導人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中「外顯子5」的跳躍，產生缺乏「外顯子5」的人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA剪接變體，因此可用於抑制人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體基因轉錄的功能活性。
「n為10至21之間的整數」的條件字面意思是n為可從11、12、13、14、15、16、17、18、19，以及20的整數組中選擇的整數。
式I的胜肽核酸衍生物中天然或非天然核鹼基的化學結構在第一a圖至第一c圖中舉例說明。本發明的天然(即，天然存在的)或非天然的(天然未發 生的)核鹼基包括，但不限於，第一a圖至第一c圖中提供的核鹼基。提供這種非天然核鹼基是為了說明可允許的核鹼基之多樣性，因此不應解釋為限制本發明之範圍。
用於描述式I的胜肽核酸衍生物的取代基在第二a圖至第二e圖中舉例說明。第二a圖提供了經取代或未經取代的烷基之實例。經取代或未經取代的烷基醯基以及經取代或未經取代的芳基醯基在第二b圖中舉例說明。第二c圖說明了經取代或未經取代的烷基胺基、經取代或未經取代的芳基胺基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的烷基磺醯基或芳基磺醯基，以及經取代或未經取代的烷基膦醯基或芳基膦醯基之實例。第二d圖提供了經取代或未經取代的烷氧基羰基或芳氧基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基羰基或芳基胺基羰基之實例。第二e圖提供了經取代或未經取代的烷基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的芳基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的烷氧基硫代羰基，以及經取代或未經取代的芳氧基硫代羰基之實例。提供這種示例性取代基是為了說明允許的取代基之多樣性，因此不應解釋為限制本發明之範圍。本領域技術人員可以容易地發現寡核苷酸序列是寡核苷酸與目標mRNA前體序列的序列特異性結合的重要因子，而不是結合至N-端或C-端的取代基。
如習知技術[PCT/KR2009/001256]中舉例說明的，式I化合物與互補DNA緊密結合。式I的胜肽核酸衍生物與其全長互補DNA或RNA之間的雙股體具有很高而無法在水性緩衝液中被可靠地測定的Tm值。式I的胜肽核酸化合物以較短長度的互補DNA取得高Tm值。
式I化合物互補地結合人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體的「外顯子5」的5’剪接位點。[NCBI參考序列：NG_011740]。[(5'→3') CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元序列跨越人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中「外顯子5」以及「內含子5」的交界處，由來自「外顯子5」的8個核苷酸單體單元以及來自「內含子5」的8個核苷酸單體單元組成。因此，該16個核苷酸單體單元的mRNA前體序列可以通常表示為[(5'→3')CAUAUAUG|gugaguau]，其中該外顯子以及該內含子序列分別以「大寫」及「小寫」字母提供，且該外顯子-內含子交界處以「|」表示。mRNA前體的常規表示透過跨越人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中「外顯子5」以及「內含子5」的交界處的[(5'→3')UCCAAGCCAUAUAUG|gugaguauggggaaa]的30個核苷酸單體單元序列進一步說明。
式I化合物與從人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄而來的人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體的目標5'剪接位點緊密結合，並干擾「剪接體早期錯合物」的形成以產生缺少「外顯子5」(跳過外顯子5)的基質金屬蛋白酶-1的mRNA剪接變體。
即使當胜肽核酸衍生物與基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的目標5’剪接位點具有一個或兩個錯配時，強RNA親和力也足以促使式I化合物誘導基質金屬蛋白酶-1「外顯子5」的跳躍。類似地，式I的胜肽核酸衍生物仍可誘導在目標剪接位點中具有一個或兩個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)的基質金屬蛋白酶-1的突變體mRNA前體中跳過基質金屬蛋白酶-1「外顯子5」。
式I化合物具有良好的細胞穿透性，且可以「裸」寡核苷酸的型態而容易地被遞送到細胞中，如習知技術[PCT/KR2009/001256]中所例示的。因此，本發明化合物誘導基質金屬蛋白酶-1 mRNA前體中「外顯子5」的跳躍，並 且在以「裸露的」寡核苷酸型態之式I化合物處理的細胞中產生缺乏基質金屬蛋白酶-1「外顯子5」的基質金屬蛋白酶-1的mRNA剪接變體。式I化合物不需要任何用於遞送到細胞中的方法或製劑以有效誘導細胞中目標外顯子的跳躍。式I化合物容易誘導經次毫微微摩爾濃度之「裸」寡核苷酸型態的本發明化合物處理的細胞中基質金屬蛋白酶-1「外顯子5」的跳躍。
由於良好的細胞或膜穿透性，式I的胜肽核酸衍生物可以作為「裸」寡核苷酸局部施用，以誘導皮膚中基質金屬蛋白酶-1「外顯子5」的跳躍。式I化合物不需要製劑來增加對目標組織的透過皮膚遞送以達到預期的治療或生物活性。通常將式I化合物溶於水及共溶劑中，並以次微微摩爾濃度局部或透過皮膚施用以在目標皮膚中引發所需的治療或生物活性。本發明的化合物不需要大量或侵入性地配製以引發局部治療活性。然而，式I的胜肽核酸衍生物可以與化妝品成分或佐劑一起配製為局部乳膏或乳液。這種局部美容霜或乳液可用於治療皮膚老化。
本發明化合物可以以1aM至高於1nM的治療或生物有效濃度局部施用於受試者，其濃度將根據受試者的給藥方案、條件或情況等而變化。
式I的胜肽核酸衍生物可以配製為不同劑型，包括，但不限於，注射劑、鼻噴霧劑、透皮貼劑等。另外，式I的胜肽核酸衍生物可以治療有效劑量施用於受試者，且施用劑量可以根據適應症、給藥途徑、給藥方案、該受試者的條件或情況等而多樣化。
式I化合物可以與醫藥上可接受的酸或鹼組合使用，包括，但不限於，氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、甲磺酸、檸檬酸、三氟乙酸等。
式I的胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類可以與醫藥上可接受的佐劑組合施用於受試者，該佐劑包括，但不限於，檸檬酸、鹽酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、異丙醇、碳酸氫鈉、蒸餾水、防腐劑等。
令人感興趣的為式I的一胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類：其中，n為10到21之間的整數；該式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的信使核糖核酸前體(pre-mRNA)中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補，或與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體部分互補，具有一個或兩個錯配；S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1，以及Tn獨立地表示氫基、氘基；X及Y獨立地表示為氫基、氘基、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、胺基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的烷基醯基、經取代或未經取代的芳基醯基、經取代或未經取代的烷氧基羰基、經取代或未經取代的芳氧基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基羰基、經取代或未經取代的芳基胺基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的芳基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的烷氧基硫代羰基、經取代或未經取代的芳氧基硫代羰基、經取代或未經取代的烷 基磺醯基、經取代或未經取代的芳基磺醯基、經取代或未經取代的烷基膦基，或經取代或未經取代的芳基膦基；Z表示為氫基、羥基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基，或經取代或未經取代的胺基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn中的至少四個獨立地選自式II、式III，或式IV所表示的非天然核鹼基：
Figure 108111655-A0202-12-0018-9
其中，R1、R2、R3、R4、R5以及R6獨立地選自氫基，以及經取代或未經取代的烷基；L1、L2以及L3為由式V所表示之共價連接基，其將該鹼性胺基與該核鹼基基團共價連接：
Figure 108111655-A0202-12-0018-10
其中，Q1以及Qm為經取代或未經取代的亞甲基(-CH2-)，且Qm與該鹼性胺基直接連接；Q2、Q3、...、以及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代的亞甲基、氧(-O-)、硫(-S-)，以及經取代或未經取代的胺基[-N(H)-，或-N(取代基)-]；以及，m為1至15之間的整數。
更令人感興趣的為式I的一胜肽核酸(PNA)衍生物或其醫藥上可接受之鹽類： 其中，n為11至16之間的整數；該式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補；S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1，以及Tn為氫基；X及Y獨立地表示為氫基、經取代或未經取代的烷基醯基，或經取代或未經取代的烷氧基羰基；Z表示為經取代或未經取代的胺基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn中的至少五個獨立地選自式II、式III，或式IV所表示的非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5以及R6為氫基；Q1以及Qm為亞甲基，且Qm與該鹼性胺基直接連接；Q2、Q3、...、以及Qm-1獨立地選自亞甲基以及氧基；以及，m為1至9之間的整數。
特別令人感興趣的為式I的一胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類：其中，n為11至16之間的整數； 該式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補；S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1，以及Tn為氫基；X為氫基；Y表示為經取代或未經取代的烷氧基羰基；Z表示為經取代或未經取代的胺基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B1、B2、...、Bn-1，以及Bn中的至少五個獨立地選自式II、式III，或式IV所表示的非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5以及R6為氫基；L1表示為-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-，或-CH2-O-(CH2)5-，其右端與該鹼性胺基直接相連；以及，L2及L3獨立地選自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-，以及-(CH2)8-，其右端與該鹼性胺基直接連接。
特別令人感興趣的為式I的一胜肽核酸衍生物，其為以下提供之化合物(ASO 1，反義寡核苷酸1)或其醫藥上可接受之鹽類：(N→C)Fethoc-TA(6)C-TCA(6)-CC(1O2)A(6)-TA(6)T-A(6)T-NH2其中， A、T，以及C分別為具有一腺嘌呤、胸腺嘧啶，以及胞嘧啶的天然核鹼基的胜肽核酸單體；C(pOq)以及A(p)分別為具有一由式VI以及式VII表示的非天然核鹼基的胜肽核酸單體；
Figure 108111655-A0202-12-0021-11
其中，p以及q為整數，且在ASO1中p為1或6以及q為2；以及，「Fethoc-」為「[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基」的縮寫，以及「-NH2」為未經取代的「-胺基」基團的縮寫。
第三圖共同且明確地提供了縮寫為A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)，以及G(pOq)的胜肽核酸單體之化學結構。如習知技術[PCT/KR2009/001256]中所討論的，由於C(pOq)與「鳥糞嘌呤」的雜合而被認為是「經修飾的胞嘧啶」的胜肽核酸單體。A(p)以及A(pOq)被視為是「經修飾的腺嘌呤」的胜肽核酸單體，因為它們與「胸腺嘧啶」雜合。
為了說明用於這種胜肽核酸衍生物的縮寫，在第四圖中提供反義寡核苷酸1的化學結構。
反義寡核苷酸1相當於「(5'→3')TAC-TCA-CCA-TAT-AT」的DNA序列，用於與mRNA前體的互補結合。該14個核苷酸單體單元的胜肽核酸 具有與跨越人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的「外顯子5」以及「內含子5」交界處的[(5'→3')UCCAAGCC AUAUAUG | gugagua uggggaaa]的30個核苷酸單體單元RNA序列中以「粗體」及「底線」標示的該14個核苷酸單體單元序列互補重疊的那14個核苷酸單體單元。
於某些具體實施例中，本發明提供治療一受試者中與人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄相關的疾病或病症之方法，包含對該受試者施用本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明提供治療一受試者皮膚老化之方法，包含對該受試者施用本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明提供用於治療與人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄相關的疾病或病症之醫藥組合物，其包含本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明提供用於治療與人類基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)基因轉錄相關的疾病或病症之化妝品組合物，其包括本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明提供用於治療皮膚老化之醫藥組合物，其包括本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明提供用於治療皮膚老化之化妝品組合物，其包含本發明之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類。
可以透過施用式I之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類來治療與人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄相關的疾病或病症。
可以透過施用式I之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類來治療與皮膚老化相關的疾病或病症。
第一a圖至第一c圖為可用於式I的胜肽核酸衍生物的可選擇的天然或非天然(修飾的)核鹼基之實例。
第二a圖至第二e圖為可用於式I的胜肽核酸衍生物的可選擇的取代基之實例。
第三圖為具有天然或經修飾的核鹼基的胜肽核酸單體之化學結構。
第四圖為「反義寡核苷酸1」的化學結構。
第五圖為用於合成本發明胜肽核酸衍生物的Fmoc-胜肽核酸單體的化學結構。
第六a圖至第六b圖為HPLC純化前後的「反義寡核苷酸1」的C18-反相HPLC色層分析圖。
第七圖為透過C18-RP製備型HPLC純化的「反義寡核苷酸1」的ESI-TOF質譜。
第八圖為人類真皮纖維母細胞(human dermal fibroblasts，HDF)中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1的mRNA形成的抑制作用(即時qPCR)。
第九a圖至第九b圖為人類真皮纖維母細胞中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的抑制作用(用於蛋白質表現程度變化的西方墨點分析法與量化圖)。
第十a圖至第十b圖為人類真皮纖維母細胞中「反義寡核苷酸1」增強膠原蛋白的表現(用於蛋白質表現程度變化的西方墨點分析法與量化圖)。
第十一a圖至第十一b圖為細胞外液中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1蛋白表現的抑制作用(用於蛋白質表現程度變化的西方墨點分析法與量化圖)。
第十二a圖至第十二b圖為細胞外液中「反義寡核苷酸1」增強膠原蛋白的表現(用於蛋白質表現程度變化的西方墨點分析法與量化圖)。
第十三圖為細胞外液中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的抑制作用(ELISA)。
製備胜肽核酸(PNA)寡聚物的一般程序
根據習知技術[US6,133,444；WO96/40685]中公開的方法並進行微小但適當的修改，透過基於Fmoc化學的固相胜肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)來合成胜肽核酸寡聚體。在本研究中使用的固體載體係購自PCAS BioMatrix Inc.(魁北克，加拿大)的H-Rink Amide-ChemMatrix。具有經修飾的核鹼基的Fmoc-胜肽核酸單體如習知技術[PCT/KR 2009/001256]中所述或經過微小修改而合成。這種具有經修飾的核鹼基的Fmoc-胜肽核酸單體與具有天然存在的核鹼基的Fmoc-胜肽核酸單體被用於合成本發明之胜肽核酸衍生物。藉由C18-反相HPLC(水/乙腈或水/甲醇，含有0.1% TFA)來純化胜肽核酸寡聚體，並透過包括ESI/TOF/MS的質譜法定性。
方案1說明了本研究的固相胜肽合成(SPPS)中採用的典型單體延伸循環，合成細節如下所述。然而，對於本領域技術人員而言，在自動胜肽合成儀或手動胜肽合成儀上有效地進行這種固相胜肽合成(SPPS)反應有明顯可能的許多微小變化。方案1中的每個反應步驟簡要地提供如下。
Figure 108111655-A0202-12-0025-12
[DeFmoc]將樹脂在1.5mL 20%哌啶/DMF中震盪7分鐘，濾出DeFmoc溶液。將樹脂依次以1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲醯胺(DMF)、1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲醯胺(DMF)，以及1.5mL二氯甲烷(MC)洗滌30秒。將得到的固體載體上的游離胺立即與Fmoc-胜肽核酸單體偶聯。
[與Fmoc-胜肽核酸體偶聯]如下將固體載體上的游離胺與Fmoc-胜肽核酸單體偶聯。將0.04mmol胜肽核酸單體、0.05mmol HBTU，以及10mmol DIEA在1mL無水DMF中作用2分鐘，並與游離胺加入到樹脂中。將樹脂溶液震盪1小時，濾出反應介質。然後將樹脂依次以1.5mL MC、1.5mL DMF，以及1.5mL MC洗滌30秒。第六圖中提供了用於本發明的具有經修飾的核鹼基的Fmoc- 胜肽核酸單體之化學結構。第六圖中提供的具有經修飾的核鹼基的Fmoc-胜肽核酸單體應作為實例，因此不應視為限制本發明之範圍。本領域技術人員可以容易地發現Fmoc-胜肽核酸單體的許多變化以合成式I的胜肽核酸衍生物。
[封端反應]偶聯反應後，透過在1.5mL封端溶液(5%乙酸酐與6% 2,6-二甲基吡啶的DMF溶液)中振盪5分鐘使未反應的游離胺封端。然後將封端溶液濾出並依次以1.5mL MC、1.5mL DMF，以及1.5mL MC洗滌30秒。
[在N-端引入「Fethoc-」自由基]透過在鹼性偶聯條件下使樹脂上的游離胺與「Fethoc-OSu」反應，將「Fethoc-」基團引入N-端。「Fethoc-OSu」[CAS No.179337-69-0，C20H17NO5，分子量351.36]的化學結構如下。
Figure 108111655-A0202-12-0026-13
[從樹脂上裂解]透過在1.5mL裂解溶液(2.5%三異丙基矽烷與2.5%三氟乙酸水溶液)中振盪3小時，從樹脂上裂解與樹脂結合的胜肽核酸寡聚物。濾除樹脂，減壓濃縮濾液。將得到的殘餘物與二乙醚一起研磨，過濾收集得到的沉澱物，透過反相HPLC純化。
[HPLC分析及純化]在從樹脂上裂解後，以經水/乙腈或含有0.1% TFA的水/甲醇(梯度方法)沖滌的C18-反相HPLC純化胜肽核酸衍生物的粗產物。 第六a圖及第六b圖分別為HPLC純化之前及之後「反義寡核苷酸」的示例性HPLC色層分析圖。
式I的胜肽核酸衍生物之合成實施例
為了使人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中「外顯子5」的5’剪接位點成為互補標的，根據上文提供的合成程序或稍作修改製備本發明之胜肽核酸(PNA)衍生物。提供以人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體為標的之此類胜肽核酸衍生物是舉例說明式I的胜肽核酸衍生物，而不應解釋為限制本發明之範圍。
[表格1]胜肽核酸衍生物互補地以人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中「外顯子5」的5'剪接位點為目標以及透過質譜分析法的描述結構特徵資料。
Figure 108111655-A0202-12-0027-14
表1提供了胜肽核酸衍生物，其互補地以從人類基質金屬蛋白酶-1基因[NCBI參考序列：NG_011740]讀出的人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的「外顯子5」的5'剪接位點為目標以及透過質譜分析法的描述結構特徵資料。表1中提供本發明之胜肽核酸衍生物為舉例說明式I的胜肽核酸衍生物，不應解釋為限制本發明之範圍。
「反義寡核苷酸1」具有與跨越人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的「外顯子5」以及「內含子5」交界處的[(5'→3')UCCAAGCC AUAUAUG | gugagua uggggaaa]的30個核苷酸單體單元RNA序列中以「粗體」及「底線」標示的該14個核苷酸單體單元序列互補重疊的那14個核苷酸單體單元。因此，「反義寡核苷酸1」在人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體內與「外顯子5」有7個核苷酸單體單元的重疊以及與「內含子5」有7個核苷酸單體單元的重疊。
「反義寡核苷酸1」對互補DNA的結合親和力
如下在UV/Vis光譜儀上測定Tm值。將置於15mL聚丙烯falcon試管中的4μM胜肽核酸寡聚體與4μM互補10個核苷酸單體單元DNA在4mL水性緩衝液(pH 7.16，10mM磷酸鈉，100mM NaCl)的混合溶液在90℃作用1分鐘並緩慢冷卻降至環境溫度。然後將溶液轉移到裝有氣密蓋的3mL石英UV比色管中，於UV/可見光分光光度計(Agilent 8453)上進行260nm的Tm測量。記錄260nm處的吸光度變化，同時將比色管的溫度升高0.5或1.0℃/分鐘。從吸光度-溫度曲線，讀出顯示吸光度最大增加率的溫度作為胜肽核酸與DNA之間的黏合溫度Tm。用於Tm測量的14個核苷酸單體單元(mer)互補DNA購自Bioneer公司(www.bioneer.com，大田廣域市，韓國)並且無需進一步純化即可使用。
對於具有14核苷酸單體單元互補DNA的雙股體，「反義寡核苷酸1」顯示Tm值為72.67℃。
式I的胜肽核酸衍生物的生物活性的實施例
透過使用即時定量聚合酶連鎖反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT qPCR)等評估本發明中的胜肽核酸衍生物在人類真皮纖維母細胞(human dermal fibroblasts，HDF)中的體外基質金屬蛋白酶-1的反義活性(antisense activities)。提供生物學實施例作為實例以說明式I的胜肽核酸衍生物的生物學特徵，因此不應解釋為限制本發明之範圍。
實施例1. 人類真皮纖維母細胞中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1的mRNA形成的抑制作用。
如下所述，透過西方墨點分析法評估「反義寡核苷酸1」下調人類真皮纖維母細胞中基質金屬蛋白酶-1的mRNA形成的能力。
[細胞培養及ASO治療]將人類真皮纖維母細胞維持在纖維母細胞基礎培養基(ATCC PCS-201-030)中，補充有纖維母細胞生長套組-低血清(ATCC PCS-201-041)以及1%鏈黴素/青黴素，其在37℃以及5% CO2的條件下生長。將在60mm培養皿中穩定培養24小時的人類真皮纖維母細胞(HDF)(3×105)與0(陰性對照)以及100aM至1M的「反義寡核苷酸1(ASO 1)」一起培養24小時。
[RNA萃取及cDNA合成]使用RNeasy Mini套組(Qiagen公司，型號714106)根據製造商的說明自反義寡核苷酸1處理的細胞中萃取總RNA，並透過使用PrimeScriptTM第一股cDNA合成套組(Takara公司，型號6110A)從400ng的RNA製備cDNA。向加入400ng RNA、1 l隨機六聚體，以及1 l dNTP(10mM)混合物的PCR管中加入DEPC處理過的水至總體積10 l，在65℃下反應5分鐘。透過向反應混合物中加入10 l PrimeScript RTase並在30℃下反應10分鐘以及隨後在42℃下反應60分鐘來合成cDNA。
[定量即時PCR]為了評估人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA的表現程度，使用Taqman探針以合成的cDNA進行即時qPCR。cDNA、Taqman探針、IQ supermix(BioRad公司，型號170-8862)，以及PCR管中的無核酸酶水的混合物透過使用CFX96 Touch即時系統(BioRad公司)根據指定的循環條件進行反應如下：95℃ 3分鐘(初級變性)，接著進行50個循環的95℃ 10秒(變性)、60℃ 30秒(黏合)，以及72℃ 30秒(聚合)。在每個循環結束時測量螢光強度，並透過熔解曲線評估PCR的結果。在每個基因的閾值循環(Ct)透過GAPDH標準化後，比較並分析閾值循環(Ct)的變化。
[ASO降低基質金屬蛋白酶-1的mRNA]如第八圖中可見，相較於對照實驗，在1μM「反義寡核苷酸1(ASO 1)」處理時基質金屬蛋白酶-1的mRNA 的減少量為65%，在100aM至10nM「反義寡核苷酸1」處理時分別減少10%至15%。
實施例2 在人類真皮纖維母細胞中透過「反義寡核苷酸1」抑制基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現。
如下所述，透過西方墨點分析法評估「反義寡核苷酸1」下調人類真皮纖維母細胞中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的能力。
[西方墨點分析法]人類真皮纖維母細胞如實施例1所述方式培養，48小時後以冷的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細胞2次，並溶於50mM Tris-Cl(pH7.5)、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%去氧膽酸鈉，以及0.1% SDS，蛋白酶抑制劑中。以BCA溶液(Thermo公司，型號23225)定量蛋白質，並以8% SDS-PAGE凝膠純化。將蛋白質轉移到PVDF膜(聚二氟亞乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)(Millipore公司，型號IPVH00010)上，將其在脫脂乳緩衝液中阻隔1小時。以抗基質金屬蛋白酶-1的抗體(SantaCruz公司，型號58377)以及抗β-肌動蛋白的抗體(Sigma公司，型號A3854)作為初級抗體，以山羊抗小鼠抗體(CST公司，型號7076V)作為二級抗體來探測膜。使用SuperSignalTM West Pico(PierAce公司，美國)檢測化學發光訊號，並使用Gel Doc系統(ATTO公司)測量訊號強度。基於每個條帶的西方墨點分析法結果，以Image-J程式定量基質金屬蛋白酶-1的相對表現程度。
[ASO抑制基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)蛋白的表現]如第九a圖及第九b圖所示，相較於對照實驗，以100aM至1μM「反義寡核苷酸1」處理時，基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現程度降低的量為20%至50%。因此，「反義寡核 苷酸1」被證明顯示其能夠下調人類真皮纖維母細胞中基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現。
實施例3. 透過人類真皮纖維母細胞中的「反義寡核苷酸1」增強膠原蛋白之表現。
如下所述，透過西方墨點分析法評估「反義寡核苷酸1」，其上調與基質金屬蛋白酶-1蛋白表現降低相關的人類真皮纖維母細胞中第I型膠原蛋白表現的能力。
[西方墨點分析法]人類真皮纖維母細胞如實施例1所述方式培養，48小時後以冷的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細胞2次，並溶於50mM Tris-Cl(pH7.5)、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%去氧膽酸鈉，以及0.1% SDS，蛋白酶抑制劑中。以BCA溶液(Thermo公司，型號23225)定量蛋白質，並以8% SDS-PAGE凝膠純化。將蛋白質轉移到PVDF膜(聚二氟亞乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)(Millipore公司，型號IPVH00010)上，將其在脫脂乳緩衝液中阻隔1小時。以抗基質金屬蛋白酶-1的抗體(SantaCruz公司，型號58377)以及抗β-肌動蛋白的抗體(Sigma公司，型號A3854)作為初級抗體，以兔抗山羊抗體(Santacruz公司，型號2768)作為二級抗體來探測膜。使用SuperSignalTM West Pico(PierAce公司，美國)檢測化學發光訊號，並使用Gel Doc系統(ATTO公司)測量訊號強度。基於每個條帶的西方墨點分析法結果，以Image-J程式定量基質金屬蛋白酶-1的相對表現程度。
[ASO增強第I型膠原蛋白的表現]如第十a圖及第十b圖所示，相較於對照實驗，以100aM至1μM「反義寡核苷酸1」處理時，第I型膠原蛋白表現程度增加的量超過30%。因此，證明由「反義寡核苷酸1」誘導的基質金屬蛋 白酶-1蛋白質表現減少顯示其上調人類真皮纖維母細胞中第I型膠原蛋白表現的能力。
實施例4. 細胞外液中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的抑制作用(西方墨點分析法)。
細胞中「反義寡核苷酸1」誘導的基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現降低的結果可能影響細胞外分泌的基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現程度。在該意義上，透過西方墨點分析法評價「反義寡核苷酸1」，其在如下所述「反義寡核苷酸1」處理後48小時下調細胞培養液中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的能力。
[西方墨點分析法]人類真皮纖維母細胞如實施例1所述方式培養，48小時後收集細胞培養液，並以8% SDS-PAGE凝膠純化。將分離的蛋白質轉移到PVDF膜(聚二氟亞乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)(Millipore公司，型號IPVH00010)上，將其在脫脂乳緩衝液中阻隔1小時。以抗基質金屬蛋白酶-1的抗體(SantaCruz公司，型號58377)作為初級抗體，以山羊抗小鼠抗體(CST公司，型號7076V)作為二級抗體來探測膜。使用SuperSignalTM West Pico(PierAce公司，美國)檢測化學發光訊號，並使用Gel Doc系統(ATTO公司)測量訊號強度。基於每個條帶的西方墨點分析法結果，以Image-J程式定量基質金屬蛋白酶-1的相對表現程度。
[ASO抑制基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現]如第十一a圖及第十一b圖所示，相較於對照實驗，以100pM至1μM「反義寡核苷酸1」處理時，在細胞外液中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現程度降低的量為10%至60%。因此，證明「反義寡核苷酸1」顯示其下調細胞外液中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的能力。
實施例5. 透過細胞外液中的「反義寡核苷酸1」增強膠原蛋白之表現。
如下所述，透過西方墨點分析法評估「反義寡核苷酸1」上調細胞外液中第I型膠原蛋白表現的能力。
[西方墨點分析法]人類真皮纖維母細胞如實施例1所述方式培養，48小時後收集細胞培養液，並以8% SDS-PAGE凝膠純化。將分離的蛋白質轉移到PVDF膜(聚二氟亞乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)(Millipore公司，型號IPVH00010)上，將其在脫脂乳緩衝液中阻隔1小時。以抗基質金屬蛋白酶-1的抗體(SantaCruz公司，型號58377)作為初級抗體，以兔抗山羊抗體(Santacruz公司，型號2768)作為二級抗體來探測膜。使用SuperSignalTM West Pico(PierAce公司，美國)檢測化學發光訊號，並使用Gel Doc系統(ATTO公司)測量訊號強度。基於每個條帶的西方墨點分析法結果，以Image-J程式定量基質金屬蛋白酶-1的相對表現程度。
[ASO增強第I型膠原蛋白的表現]如第十二a圖及第十二b圖所示，相較於對照實驗，以1pM及1M「反義寡核苷酸1(ASO 1)」處理時，第I型膠原蛋白表現程度增加的量分別為20%及80%。因此，證實了人類真皮纖維母細胞中由「反義寡核苷酸1」誘導的基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現降低顯示其上調細胞外液中第I型膠原蛋白表現的能力。
實施例6. 細胞外液中「反義寡核苷酸1」對基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的抑制作用(ELISA)。
細胞中「反義寡核苷酸1」誘導的基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現降低的結果可能影響細胞外分泌的基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現程度。在這種意義上，「反義寡核苷酸1」通過酵素連結免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)評估其在以「反義寡核苷酸1」處理後48小時下調細胞培養液中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的能力，如下所述。
[ELISA]人類真皮纖維母細胞如實施例1所述方式培養，根據製造商的指示，透過吸光度(Sunrise，TECAN公司)以人類基質金屬蛋白酶-1 ELISA套組(abcam公司，型號ab100603)評估48小時後所收集的細胞培養液中基質金屬蛋白酶-1的表現程度。
[ASO抑制基質金屬蛋白酶-1蛋白質的表現]如第十三圖所示，相較於對照實驗，以100pM至10nM以及1M「反義寡核苷酸1」處理時，基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現程度降低的量分別為15%至30%以及50%。因此，證明「反義寡核苷酸1」顯示其下調細胞外液中基質金屬蛋白酶-1蛋白質表現的能力。
實施例7. 含有式I化合物的局部精華液之製備(w/w%)
將式I化合物，例如「反義寡核苷酸1」配製為精華液，用於局部施用於受試者。如下所述方法製備局部精華液。鑑於可能存在許多局部精華液的變化，應該將該製劑作為實施例，不應解釋為限制本發明之範圍。
Figure 108111655-A0202-12-0034-50
Figure 108111655-A0202-12-0035-16
於另一燒杯中，分別在25℃下將A部分及B部分的混合物質溶解。透過以3,600rpm均質器在25℃下將A部分及B部分混合並乳化5分鐘。將乳化的C部分透過50目濾網過濾，將濾液加入到A部分與B部分的混合物中。透過以3,600rpm均質器在80℃下將所得混合物乳化5分鐘。在將D部分加入到A、B，以及C部分的混合物中後，透過以2,500rpm均質器在25℃下將所得混合物乳化3分鐘。最後確保均勻分散並完全脫泡。
實施例8. 含有式I化合物的局部乳膏之製備(w/w%)
將式I化合物，例如「反義寡核苷酸1」配製成乳膏，用於局部施用於受試者。如下所述方式製備局部乳膏。鑑於可能存在許多局部乳膏的變化，應該將該製劑作為實例，不應解釋為限制本發明之範圍。
於另一個燒杯中，分別在80℃及85℃下溶解A部分及B部分的物質。透過使用3,600rpm均質器在80℃下混合A部分及B部分並乳化5分鐘。在將C及D部分加入到A及B部分的混合物中後，透過以3,600rpm均質器在80℃下將所得混合物乳化5分鐘。在35℃下將E部分加入到A、B、C，以及D部分的混合物中後，透過以3,600rpm均質器在35℃下將所得混合物乳化3分鐘。最後確保均勻分散並在25℃完全脫氣。
Figure 108111655-A0202-12-0035-17
Figure 108111655-A0202-12-0036-18
<110> OliPass Corporation Han,Seon-Young Sung,Kiho Hong,Myunghyo Oh,Youree Heo,Jeong-Seok Jang,Kang Won
<120> 基質金屬蛋白酶-1之反義寡核苷酸
<130> 2018DP101
<150> KR10-2018-0057352
<151> 2018-05-18
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> human matrix metalloproteinase-1 targeted artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Carbamated N-terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> PNA modified olegonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> n is a,g,c,or t
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(6)
<223> n is a,g,c,or t
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(8)
<223> n is a,g,c,or t
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> n is a,g,c,or t
<220>
<221> modified_base
<222> (11)..(11)
<223> n is a,g,c,or t
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(13)
<223> n is a,g,c,or t
<400> 1
Figure 108111655-A0202-12-0038-20

Claims (11)

  1. 一種由 式I表示之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類：
    Figure 108111655-A0202-13-0001-21
     其中，n為10到21之間的整數；該 式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在人類基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)的信使核糖核酸前體(pre-mRNA)中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該 式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補，或與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體部分互補，具有一個或兩個錯配；S 1、S 2、...、S n-1、S n、T 1、T 2、...、T n-1，以及T n獨立地表示氫基、氘基、經取代或未經取代的烷基，或經取代或未經取代的芳基；X及Y獨立地表示為氫基、氘基、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH 2-C(=O)-]、胺基硫代羰基[NH 2-C(=S)-]、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的烷基醯基、經取代或未經取代的芳基醯基、經取代或未經取代的烷氧基羰基、經取代或未經取代的芳氧基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基羰基、經取代或未經取代的芳基胺基羰基、經取 代或未經取代的烷基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的芳基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的烷氧基硫代羰基、經取代或未經取代的芳氧基硫代羰基、經取代或未經取代的烷基磺醯基、經取代或未經取代的芳基磺醯基、經取代或未經取代的烷基膦基，或經取代或未經取代的芳基膦基；Z表示為氫基、氘基、羥基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的胺基、經取代或未經取代的烷基、或經取代或未經取代的芳基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；以及，B 1、B 2、...、B n-1，以及B n中的至少四個獨立地選自非天然核鹼基，其具有與該核鹼基基團共價連接的經取代或未經取代的胺基。
  2. 如申請專利範圍第1項之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上之鹽類：其中，n為10到21之間的整數；該 式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的信使核糖核酸前體中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該 式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補，或與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體部分互補，具有一個或兩個錯配；S 1、S 2、...、S n-1、S n、T 1、T 2、...、T n-1，以及T n獨立地表示氫基、氘基； X及Y獨立地表示為氫基、氘基、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH 2-C(=O)-]、胺基硫代羰基[NH 2-C(=S)-]、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的烷基醯基、經取代或未經取代的芳基醯基、經取代或未經取代的烷氧基羰基、經取代或未經取代的芳氧基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基羰基、經取代或未經取代的芳基胺基羰基、經取代或未經取代的烷基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的芳基胺基硫代羰基、經取代或未經取代的烷氧基硫代羰基、經取代或未經取代的芳氧基硫代羰基、經取代或未經取代的烷基磺醯基、經取代或未經取代的芳基磺醯基、經取代或未經取代的烷基膦基，或經取代或未經取代的芳基膦基；Z表示為氫基、羥基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的芳氧基，或經取代或未經取代的胺基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n中的至少四個獨立地選自 式II、 式III，或 式IV所表示的非天然核鹼基：
    Figure 108111655-A0202-13-0004-22
     其中，R 1、R 2、R 3、R 4、R 5以及R 6獨立地選自氫基，以及經取代或未經取代的烷基；L 1、L 2以及L 3為由 式V所表示之共價連接基，其將該鹼性胺基與該核鹼基基團共價連接：
    Figure 108111655-A0202-13-0004-51
     其中，Q 1以及Q m為經取代或未經取代的亞甲基(-CH 2-)，且Q m與該鹼性胺基直接連接；Q 2、Q 3、...、以及Q m-1獨立地選自經取代或未經取代的亞甲基、氧(-O-)、硫(-S-)，以及經取代或未經取代的胺基[-N(H)-，或-N(取代基)-]；以及，m為1至15之間的整數。
  3. 如申請專利範圍第2項之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上之鹽類： 其中，n為11至16之間的整數；該 式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該 式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補；S 1、S 2、...、S n-1、S n、T 1、T 2、...、T n-1，以及T n為氫基；X及Y獨立地表示為氫基、經取代或未經取代的烷基醯基，或經取代或未經取代的烷氧基羰基；Z表示為經取代或未經取代的胺基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n中的至少五個獨立地選自 式II、 式III，或 式IV所表示的非天然核鹼基：R 1、R 2、R 3、R 4、R 5以及R 6為氫基；Q 1以及Q m為亞甲基，且Q m與該鹼性胺基直接連接；Q 2、Q 3、...、以及Q m-1獨立地選自亞甲基以及氧基；以及，m為1至9之間的整數。
  4. 如申請專利範圍第3項之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上之鹽類：其中，n為11至16之間的整數； 該 式I化合物具有至少一10個核苷酸單體單元，與在該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體中的序列為[(5’→3’)CAUAUAUGGUGAGUAU]的16個核苷酸單體單元mRNA前體序列互補重疊；該 式I化合物與該人類基質金屬蛋白酶-1的mRNA前體完全互補；S 1、S 2、...、S n-1、S n、T 1、T 2、...、T n-1，以及T n為氫基；X為氫基；Y表示為經取代或未經取代的烷氧基羰基；Z表示為經取代或未經取代的胺基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n獨立地選自天然核鹼基，包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶，以及非天然的核鹼基；B 1、B 2、...、B n-1，以及B n中的至少五個獨立地選自 式II、 式III，或 式IV所表示的非天然核鹼基：R 1、R 2、R 3、R 4、R 5以及R 6為氫基；L 1表示為-(CH 2) 2-O-(CH 2) 2-、-CH 2-O-(CH 2) 2-、-CH 2-O-(CH 2) 3-、-CH 2-O-(CH 2) 4-，或-CH 2-O-(CH 2) 5-，其右端與該鹼性胺基直接相連；以及，L 2及L 3獨立地選自-(CH 2) 2-O-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-O-(CH 2) 2-、-(CH 2) 2-O-(CH 2) 3-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-，以及-(CH 2) 8-，其右端與該鹼性胺基直接連接。
  5. 如申請專利範圍第4項之胜肽核酸衍生物，其為以下之胜肽核酸衍生物或其醫藥上可接受之鹽類：(N→C)Fethoc-TA(6)C-TCA(6)-CC(1O2)A(6)-TA(6)T-A(6)T-NH 2其中， A、T，以及C分別為具有一腺嘌呤、胸腺嘧啶，以及胞嘧啶的天然核鹼基的胜肽核酸單體；C(pOq)以及A(p)分別為具有一由 式VI以及 式VII表示的非天然核鹼基的胜肽核酸單體；
    Figure 108111655-A0202-13-0007-24
     其中，p以及q為整數，且p為1或6，以及q為2；以及，「Fethoc-」為「[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基」的縮寫。
  6. 一種治療與人類基質金屬蛋白酶-1)基因轉錄相關的疾病或病症之方法，包含對一受試者施用如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
  7. 一種治療皮膚老化之方法，包含對一受試者施用如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
  8. 一種用於治療與人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄相關的疾病或病症之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
  9. 一種用於治療與人類基質金屬蛋白酶-1基因轉錄相關的疾病或病症之化妝品組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
  10. 一種治療皮膚老化之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
  11. 一種用於治療皮膚老化之化妝品組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之胜肽核酸衍生物，或其醫藥上可接受之鹽類。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102304280B1 (ko) 2018-08-14 2021-09-23 올리패스 주식회사 아세틸코에이카복실라제2 안티센스 올리고뉴클레오티드

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US6617422B1 (en) * 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
US20030105044A1 (en) * 2001-10-17 2003-06-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of matrix metalloproteinase 1 expression
AU2001250572A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
DE10238298A1 (de) * 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
WO2005030787A2 (en) * 2003-09-29 2005-04-07 Topigen Pharmaceutique Inc. Oligonucleotide compositions and methods for treating disease including inflammatory conditions
US7511025B2 (en) * 2004-06-16 2009-03-31 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for inhibiting the synthesis or expression of MMP-1
KR20090098710A (ko) * 2008-03-14 2009-09-17 주식회사 씨티아이바이오 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체
KR20120073536A (ko) * 2010-12-27 2012-07-05 주식회사 파나진 다중전하를 갖는 ｐｎａ
US20150240239A1 (en) * 2014-02-27 2015-08-27 Nugen Biosience (Taiwan) Co., Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting matrix metalloproteinases 1 by interference ribonucleic acid
CN107073294A (zh) * 2014-09-05 2017-08-18 阿克赛医药公司 使用靶向tyr或mmp1的核酸治疗老化和皮肤病症的方法
EP3497114B1 (en) * 2016-08-08 2024-10-16 Olipass Corporation Androgen receptor antisense oligonucleotides
JP6997177B2 (ja) * 2016-09-16 2022-02-04 オリパス コーポレーション Ｓｃｎ９ａアンチセンスオリゴヌクレオチド
EP3526239B1 (en) * 2016-10-11 2021-11-03 Olipass Corporation Hif 1-alpha antisense oligonucleotides
CA3046904A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Olipass Corporation Exon skipping by peptide nucleic acid derivatives

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