CN110536895B - Scn9a反义止痛药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向人类SCN9A前mRNA中外显子4的3'剪接位点的肽核酸衍生物。所述肽核酸衍生物有效诱导细胞中缺失SCN9A外显子4的SCN9A mRNA剪接变体，并可用于安全治疗涉及Nav1.7活性的疼痛或病症。

Description

SCN9A反义止痛药
本发明涉及互补靶向人类SCN9A前mRNA的肽核酸衍生物，其用于治疗通过电压门控钠通道Nav1.7亚型介导的疼痛和障碍，并要求2017年1月24日递交的美国临时申请号62/449,738的优先权的益处，其通过参考以其全部结合到本文中。
发明背景
电压门控钠通道(VGSC)为由α和β亚基组成的跨膜蛋白。VGSC起着钠离子穿过细胞膜的通道的作用。钠通道活性由α-亚基产生。VGSC亚型根据α-亚基的亚型定义。迄今为止，至少有10种VGSC亚型，即Nav1.1、Nav1.2、......、Nav1.9和Nax。
每种VGSC亚型具有不同的α亚基，并且注定根据表达的组织而显示特征性生理作用。例如，Nav1.2亚型在中枢神经元中表达并似乎与癫痫有关[Human Mol. Genet.vol 24(5), 1459-1468 (2015)]。Nav1.5亚型在心肌细胞中大量表达。抑制Nav1.5可能导致长QT综合征和猝死[Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137-168 (2014)]。Nav1.7亚型在背根神经节中大量表达。Nav1.7活性的上调导致红斑性肢痛症[J. Med. Genet. vol 41, 171-174 (2004)]。同时，遗传缺少Nav1.7活性(即，SCN9A通道病)的人不会感到剧烈疼痛，尽管那些个体在其它感觉功能方面发现是正常的[Nature vol 444, 894-898 (2006)]。
河豚毒素(TTX)为一种在河豚(pufferfish)中发现的神经毒素。TTX毒性极大，且其在小鼠腹膜内的LD50为10 μg/Kg [Toxins vol 6, 693-755 (2014)]。口服摄入TTX可引起嘴唇和舌头感觉异常、唾液过多、出汗、头痛、震颤、麻痹、发绀、癫痫发作、不协调、腹泻、腹痛、低血压、呼吸窘迫、心律失常、昏迷等。已知TTX通过与VGSC亚型的活性位点非特异性结合而诱导这些不良反应。因此，VGSC亚型的非特异性抑制会引起严重的不良事件。
利多卡因为非特异性VGSC抑制剂，并且已广泛用作局部麻醉剂。静脉内给予时，利多卡因可诱导不期望的副作用，比如肌肉颤搐、呕吐、心律不齐、嗜睡等。这些副作用被认为是由于VGSC亚型的非特异性抑制造成的。然而，用利多卡因抑制Nav1.5可用于治疗室性心动过速。尽管如此，由于钠通道亚型的非特异性抑制作用产生的不良事件，利多卡因的全身给予被认为不适于治疗慢性疼痛。
SCN9A通道病：SCN9A (钠通道亚型9A)基因编码VGSC亚型Nav1.7的α-亚基。极少数个体没有感到严重疼痛但其它感觉功能正常。这样的个体被发现具有经突变以编码非功能性Nav1.7亚型的SCN9A基因[Nature vol 444, 894-898 (2006)]。这被称为SCN9A通道病。人类SCN9A通道病的行为表型在SCN9A敲除小鼠中复制相当多[PLoS One 9(9): e105895(2014)]。因此，选择性抑制Nav1.7亚型可用于安全地治疗人类患者的慢性疼痛。
Nav1.7选择性小分子抑制剂：反映VGSC的生理功能，VGSC亚型的活性位点在其3D结构方面相似。通过用小分子抑制剂直接靶向活性位点，选择性抑制Nav1.7亚型将是高度挑战性的。利多卡因和河豚毒素为VGSC亚型的此类非选择性抑制剂的良好实例(参考图1A)。
通过200,000种化合物库的高通量筛选活动鉴定Nav1.8选择性抑制剂，鉴定了具有超过Nav1.5 (约8倍)的适度选择性的Nav1.7抑制剂[J. Gen. Physiol. vol 131(5),399-405 (2008)]。通过电生理学测定发现1-苯并氮杂䓬-2-酮衍生物选择性抑制Nav1.7超过Nav1.5，具有适度的Nav1.7选择性(约8倍) (参考图1B)。
迄今为止，已公开了许多Nav1.7选择性小分子抑制剂，并在人类患者中评估了几种(参考图1C)。例如，在少数红斑性肢痛症患者中评估了funapide (XEN-402/TV-45070)[Pain vol 153, 80-85 (2012)]。尽管funapide显示出镇痛活性，但在相对大部分的登记患者中，funapide显示出治疗相关和剂量限制性不良事件，包括头晕和嗜睡。CNS不良事件表明，funapide的Nav1.7选择性可能不足以高到安全地治疗慢性疼痛。
Raxatrigine (CNV1014802/GSK-1014802)抑制Nav1.7以及其它VGSC亚型。然而，Raxatrigine被认为通过选择性地稳定钠通道的无活性状态来抑制钠通道的功能活性。尽管Raxatrigine抑制CNS的钠通道亚型，但在治疗剂量下耐受良好[The Pharmaceutical J.11 Mar. 2016. Nav1.7: a new channel for pain treatment]。尽管三叉神经痛患者因来自相对差的Nav1.7选择性的潜在心脏毒性而根据严格的心脏病学标准入选临床评价，但在所述患者中Raxatrigene显示出良好的镇痛活性。
PF-05089771是Nav1.7选择性抑制剂，其IC50为11 nM。PF-05089771被认为稳定Nav1.7的无活性形式[Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a-1574a (2015)]。在红斑性肢痛症患者或智齿拔除后的牙痛患者中评估了PF-05089771的治疗潜力。PF-05089771的药代动力学分析表明，负责神经性疼痛的靶组织中的低药物浓度可能是对人类患者中其镇痛活性差的可能解释[Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875-87 (2016)]。虽然已认为PF-05089771具有超过Nav1.5的优良的Nav1.7选择性，但它的分子大小似乎太大，无法在慢性神经性疼痛的治疗所关心的CNS组织中显示出良好的分布。
从结构方面对Nav1.7选择性小分子抑制剂进行了综述[Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 24, 3690-3699 (2014)]。这样的Nav1.7选择性抑制剂的分子大小往往比利多卡因(一种VGSC亚型的非选择性抑制剂)大得多。Nav1.7的选择性通过使分子大小变大而改善。每种Nav1.7选择性抑制剂被认为与Nav1.7蛋白内的不同结构域结合，并且结合结构域根据抑制剂的化学结构而变化。具有讽刺意味的是，Nav1.7选择性抑制剂的镇痛效力不强，并且从患有SCN9A通道病的人的研究结果来看未能满足预期[Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975-983 (2016)]。
其它类型的Nav1.7选择性抑制剂：发现狼蛛毒液肽ProTx-II选择性地抑制Nav1.7超过其它VGSC亚型。然而，毒液在急性炎性疼痛动物模型中显示出弱的镇痛活性[Mol. Pharmacol. vol 74, 1476-1484 (2008)]。鉴于毒液肽的电生理学在经改造以大量表达VGSC的每种亚型的HEK-293细胞中进行评估，ProTx-II可能不与原代神经元细胞中Nav1.7的活性位点结合。原代神经元细胞表达由α和β-链组成的Nav1.7，而HEK-293细胞通常被改造成只稳定表达每种VGSC亚型的α-链。
Ssm6a，一种从蜈蚣毒液分离出的46聚体肽，被发现选择性地抑制Nav1.7超过其它VGSC亚型。在经改造以过度表达Nav1.7的HEK-293细胞中观察到Nav1.7 IC50为0.3 nM。蜈蚣毒液肽在小鼠福尔马林测试(一种急性炎性疼痛模型)中显示出与吗啡相当的镇痛效力。46-聚体肽还阻止大鼠DRG细胞中的钠电流。尽管毒液肽显示出稳健的血清稳定性，但镇痛活性仅持续几个小时[Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol 110(43), 17534-17539(2013)]。
SVmab1为在过度表达每种VGSC亚型的HEK-293细胞中选择性靶向Nav1.7超过其它VGSC亚型的单克隆抗体。SVmab1在HEK-293细胞中选择性地抑制Nav1.7引起的钠电流，其IC50为30 nM。在针对小鼠福尔马林测试而静脉内(以50 mg/Kg)或鞘内(10 μg，即约0.5 mg/Kg)给予时，该单克隆抗体显示出显著的镇痛活性。基于两种给予途径的镇痛效力的差异，抑制脊髓或CNS中的Nav1.7应该是对于针对福尔马林测试的镇痛活性的主要贡献者[Cellvol 157(6), 1393-1404 (2014)]。
Nav1.7对疼痛感觉贡献的物种差异：最近，应用qPCR对得自健康志愿者的人类DRG进行VGSC亚型相对表达水平的评估[Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264-017-0132-3,在线发表于4月19日(2017)]。在人类DRG中，Nav1.7亚型的表达是总VGSC表达的约50%。Nav1.8贡献约12%。人类DRG神经元细胞与紫杉醇一起孵育24小时上调Nav1.7，但不是Nav1.8，表明Nav1.7应该是人类中神经病的首要亚型，超过Nav1.8。这些发现有力地支持了在人类SCN9A通道病中观察到的表型[Nature vol 444, 894-898 (2006)]。
同时，Nav1.8的贡献是首要的，在小鼠DRG中占据了整个VGSC表达的48%。在得自幼稚(naïve) CD小鼠(8-10周龄)的DRG中，Nav1.7的贡献为18%。因此，在将动物疼痛数据外推到人类受试者的治疗剂量时，应谨慎行事。同样，用在考虑的靶组织中的Nav1.7表达水平，需要仔细评估动物疼痛模型。
前-mRNA：在DNA (2-脱氧核糖核酸)上携带遗传信息。DNA被转录以在细胞核中产生前mRNA (前信使核糖核酸)。哺乳动物的前mRNA通常由外显子和内含子组成，而外显子和内含子彼此相互连接。外显子和内含子编号如图1D中所示。
前mRNA的剪接：如图2A所示意性说明的，通过一系列复杂反应(统称为“剪接”)缺失内含子后，将前mRNA加工成mRNA [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003)；Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005)；Nature Rev. Mol. Cell Biol.15(2), 108-121 (2014)]。
剪接通过在前mRNA和剪接衔接因子之间形成"剪接体E复合物" (即"早期剪接体复合物")来引发。在"剪接体E复合物"中，U1与外显子N和内含子N的连接处结合，和U2AF35与内含子N和外显子(N + 1)的连接处结合。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接处对于早期剪接体复合物的形成至关重要。"剪接体E复合物"在与U2另外复合时演变成"剪接体A复合物"。"剪接体A复合物"经历一系列复杂反应，以缺失或剪除内含子以邻接相邻的外显子。
核糖体蛋白合成：蛋白由mRNA (信使核糖核酸)编码。在响应细胞刺激下或自发地，DNA被转录以在细胞核中产生前mRNA (前信使核糖核酸)。将前mRNA的内含子酶促剪除以产生mRNA，然后将其易位至细胞质中。在细胞质中，称为核糖体的翻译机器复合物与mRNA结合，并在其扫描沿mRNA编码的遗传信息时进行蛋白质合成[Biochemistry vol 41,4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)]。
反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)与核酸包括DNA、mRNA和前mRNA结合的寡核苷酸被称为反义寡核苷酸(ASO)。
如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，例如，ASO能够抑制沿着mRNA的核糖体蛋白合成。ASO需要存在于细胞质内，以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白合成。
如果ASO与细胞核中的前mRNA紧密结合，ASO可能抑制或调节前mRNA剪接成mRNA。ASO需要存在于细胞核内，以抑制或调节前mRNA剪接成mRNA。剪接的这样的反义抑制产生了一个或多个缺乏ASO靶向的外显子的mRNA。这样的mRNA被称为"剪接变体"，并编码短于由全长mRNA编码的蛋白质的蛋白质。
原则上，剪接可通过抑制“剪接体E复合物”的形成来中断。如果ASO与(5'→3')外显子-内含子的连接处，即"5'剪接位点"紧密结合，则ASO阻断前mRNA和因子U1之间的复合物形成，并因此阻断“剪接体E复合物”的形成。同样地，如果ASO与(5'→3')内含子-外显子的连接处，即"3'剪接位点”紧密结合，则"剪接体E复合物"不能形成。3'剪接位点和5'剪接位点在图2B中示意地说明。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易受内源性核酸酶的降解，限制了其治疗效用。迄今为止，已深入开发和研究了许多类型的非天然(即，天然不存在的)寡核苷酸[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。与DNA和RNA相比较，它们中的一些显示出延长的代谢稳定性。图3A提供一些代表性非天然寡核苷酸的化学结构。此类寡核苷酸与DNA或RNA一样可预测地与互补核酸结合。
硫代磷酸寡核苷酸：硫代磷酸寡核苷酸(PTO)是DNA类似物，其中每个单体中骨架磷酸氧原子之一被硫原子替代。这种小的结构变化使得PTO相对抵抗核酸酶的降解[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)]。
反映了PTO和DNA的骨架的结构相似性，它们在大多数哺乳动物细胞类型中均穿透细胞膜差。然而，对于大量表达DNA转运体的一些类型的细胞，DNA和PTO显示出良好的细胞渗透性。已知全身给予的PTO易于分布至肝脏和肾脏[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]。
为了促进PTO的体外细胞穿透，已普遍实行脂质转染。然而，脂质转染在物理上改变细胞膜，导致细胞毒性，并因此对长期体内治疗使用是不理想的。
在过去的30年中，反义PTO和PTO的变体已被临床评估以治疗癌症、免疫障碍、代谢疾病等[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。许多这种反义药物候选物尚未成功开发，这部分地由于PTO的细胞渗透性差造成。为了克服差的细胞渗透性，对治疗活性，PTO需要以高剂量给予。然而，已知PTO与剂量限制性毒性相关，包括凝血时间增加、补体激活、肾小管肾病、库普弗(Kupffer)细胞活化和免疫刺激，包括脾肿大、淋巴样增生、单核细胞浸润[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。
已发现许多反义PTO对于具有来自肝脏或肾脏的显著贡献的疾病显示出适当的临床活性。米泊美生(Mipomersen)为PTO类似物，其抑制apoB-100的合成，apoB-100为一种参与LDL胆固醇转运的蛋白质。米泊美生在动脉粥样硬化患者群体中显示出适当的临床活性，最有可能是由于其优先分布于肝脏造成的[Circulationvol 118(7), 743-753 (2008)]。ISIS-113715为一种抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)的合成的PTO反义类似物，并且发现在II型糖尿病患者中显示出治疗活性[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336(2004)]。
锁定核酸：在锁定核酸(LNA)中，RNA的骨架核糖环在结构上被限制以增加对RNA或DNA的结合亲和力。因此，LNA可被认为是高亲和力DNA或RNA类似物[Biochemistry vol 45,7347-7355 (2006)]。LNA也显示出差的细胞渗透性。
二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸：在二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO)中，DNA的骨架磷酸酯和2-脱氧核糖分别被氨基磷酸酯和吗啉替代[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol71, 575-586 (2006)]。尽管DNA骨架荷负电，但PMO骨架不荷电。因此，PMO和mRNA之间的结合在骨架之间没有静电排斥，并且往往比DNA和mRNA之间的结合更强。由于PMO在化学结构上与DNA显著不同，PMO不会被识别DNA或RNA的肝转运体识别。然而，PMO不易于穿透细胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)为以N-(2-氨基乙基)甘氨酸为单元骨架的多肽，并且由Peter Nielsen及同事发现[Science vol 254, 1497-1500 (1991)]。PNA的化学结构和缩写命名在图3B中说明。如同DNA和RNA一样，PNA也选择性地与互补核酸结合[Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]。在与互补核酸结合时，PNA的N-末端被认为等同于DNA或RNA的"5'-末端"，和PNA的C-末端被认为等同于DNA或RNA的"3'-末端"。
如同PMO一样，PNA骨架不荷电。因此，PNA和RNA之间的结合往往比DNA和RNA之间的结合更强。由于PNA在化学结构上与DNA显著不同，因此PNA不会被识别DNA的肝转运体识别，并且显示出与DNA或PTO不同的组织分布概况。然而，PNA也穿透哺乳动物细胞膜差(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)。
改善PNA的膜渗透性的修饰的核碱基：通过用与修饰的核碱基共价连接的阳离子脂质或其等同物引入修饰的核碱基，使PNA对哺乳动物细胞膜高度可渗透。在图3C中提供了此类修饰的核碱基的化学结构。发现胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的此类修饰的核碱基分别可预测地和互补地与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶杂交[PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253]。
将这样的修饰的核碱基掺入PNA上模拟脂质转染的情况。通过脂质转染，具有磷酸骨架的寡核苷酸分子被阳离子脂质分子例如lipofectamine包裹，并且与裸寡核苷酸分子相比较，这种lipofectamine/寡核苷酸复合物往往相当易于穿透细胞膜。
除良好的膜渗透性之外，发现那些修饰的PNA衍生物对互补核酸显示出超强亲和力。例如，在与互补DNA形成双链体时，将4-5个修饰的核碱基引入到11-聚体至13-聚体PNA衍生物上易于产生20℃或更高的Tm增加。这样的PNA衍生物对单碱基错配高度敏感。单碱基错配导致Tm降低11-22℃，这取决于修饰的碱基的类型以及PNA序列。
小干扰RNA (siRNA)：小干扰RNA (siRNA)是指20-25个碱基对的双链RNA[Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]。siRNA的反义链以某种方式与蛋白质相互作用以形成"RNA-诱导的沉默复合物" (RISC)。然后RISC结合于与siRNA的反义链互补的mRNA的某一部分。与RISC复合的mRNA经历切割。因此，siRNA催化诱导其靶mRNA的切割，随后抑制通过mRNA的蛋白质表达。RISC并不总是与其靶mRNA内的完全互补序列结合，这引发与siRNA疗法的脱靶效应相关的担忧。与具有DNA或RNA骨架的其它类别的寡核苷酸一样，siRNA具有差的细胞渗透性，并因此往往显示出差的体外或体内治疗活性，除非经适当配制或化学修饰以具有良好的膜渗透性。
SCN9A siRNA：现有技术公开了靶向人类SCN9A mRNA的外显子8内的19-聚体序列[(5' →3') GAUUAUGGCUACACGAGCU]的siRNA [US专利8183221]。在鞘内输注时，siRNA被认为在神经性疼痛和炎性疼痛的动物模型中显示出治疗活性。siRNA据说下调大鼠DRG细胞中的Nav1.7表达。
SCN9A ASO：对于互补靶向大鼠SCN9A mRNA的2'-O-甲氧基乙基PTO ASO评估了其在单次皮下注射30 mg ASO/受试者时，抑制大鼠中Nav1.7蛋白在DRG中表达的能力。ASO在给药后第4周抑制Nav1.7蛋白在DRG中的表达超过80%。这些SCN9A ASO通过Randall-Selitto试验抑制机械性疼痛。其疗效主要与DRG中Nav1.7蛋白的表达水平有关[Pain,Mohan和Fitzsimmons et al.印刷中]。
SCN9A前mRNA剪接的反义抑制：到目前为止，还没有关于SCN9A ASO诱导SCN9A前mRNA选择性剪接的报道情况。
附图简述
图1A. 电压门控钠通道的非选择性小分子抑制剂利多卡因和河豚毒素的化学结构。
图1B. Nav1.7的1-苯并氮杂䓬-2-酮抑制剂，其显示对Nav1.7超过Nav1.5的适度选择性。
图1C. 电压门控钠通道的选择性小分子抑制剂funapide、raxatrigene和PF-05089771的化学结构。
图2A. 前mRNA内的外显子和内含子编号的示意图。
图2B. 导致内含子N缺失的剪接过程的示意图。
图2C. 与剪接体E复合物相关的3'剪接位点和5'剪接位点的示意图。
图3A. DNA和非天然核酸的代表性化学结构。
图3B. PNA的化学结构和缩写命名图示。
图3C. 用于改善肽核酸的细胞渗透性的修饰的核碱基的实例。
图4. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的天然或非天然(修饰的)核碱基的实例。
图5A. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代或未取代的烷基的实例。
图5B. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基的实例。
图5C. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基的实例。
图5D. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基的实例。
图5E. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基和取代或未取代的烷氧基硫代羰基的实例。
图6. 简称为A (腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T (胸腺嘧啶)、C (胞嘧啶)、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。
图7. 用于描述式I化合物中N-末端或C-末端取代基的缩略语的化学结构。
图8. 表示为"(N → C)Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2"的14-聚体PNA衍生物的化学结构。
图9. 缩写为"(N → C)Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2"的16-聚体PNA衍生物的化学结构。
图10. 用于合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。
图11. 本发明的SPPS中采用的典型单体延长循环的示意图。
图12A. HPLC纯化前“ASO 2”的C18-反相HPLC色谱图。
图12B. HPLC纯化后“ASO 2”的C18-反相HPLC色谱图。
图13. HPLC纯化后用“ASO 2”获得的ES-TOF质谱数据。
图14A. 在0 (阴性对照)、10或100 zM用“ASO 7”处理5小时的PC3细胞的SCN9A巢式RT-PCR产物的电泳数据。
图14B. 指定给外显子4-5的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图14C. 在0 (阴性对照)、1、10、100或1000 aM用“ASO 7”处理24小时的PC3细胞的SCN9A巢式RT-PCR产物的电泳数据。
图15A. 在0 (阴性对照)、0.1、1或10 aM用“ASO 7”处理24小时的PC3细胞中全长SCN9A mRNA的qPCR数据。cDNA通过一步PCR合成。(误差棒指示标准误差；和*表示p <0.05)。
图15B. 在0 (阴性对照)、0.1、1或10 aM用“ASO 7”处理24小时的PC3细胞中全长SCN9A mRNA的qPCR数据。cDNA使用随机六聚体合成。(误差棒指示标准误差；和**表示p <0.05)。
图16A. 在以0 (阴性对照)、1、3或10 pmole/Kg皮下给予(每2天一次) “ASO 7”的SD大鼠中，由L5/16结扎诱导的异常性疼痛的逆转。采用室内历史背景，添加了普瑞巴林30mpk的von frey阈值。(经student’s t-检验，*表示p < 0.05)。
图16B. 在以0 (阴性对照)、20 pmole/Kg QD、100 pmole/Kg QD、500 pmole/KgQD和100 pmole/Kg Q2D皮下接受“ASO 2”的SD大鼠中，由SNL (L5/L6结扎)诱导的异常性疼痛的逆转。采用室内历史背景，添加了普瑞巴林30 mpk的von frey阈值(经student’s t-检验，*表示p < 0.05)。
图17A. 在0 (阴性对照)、100或1000 zM，用“ASO 7”孵育30小时后，具有"L5/L6结扎"的大鼠L5 DRG 神经元细胞中细胞荧光强度的平均迹线(左)，以及用"CoroNa Green"处理的DRG神经元细胞的样品荧光图像(右)。
图17B. 在0 (阴性对照)、100或1000 zM，用“ASO 7”孵育30小时后，无"L5/L6结扎"的大鼠L5 DRG 神经元细胞中细胞荧光强度的平均迹线。
图18A. 在皮下给予100 pmole/Kg "ASO 1"的大鼠中，用DPNP诱导的异常性疼痛的逆转(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*表示p < 0.05)。
图18B. 在第0、2或4天皮下给予60 pmole/Kg "ASO 2"或30 pmole/Kg "ASO 6"的大鼠中，由DPNP诱导的异常性疼痛的逆转。采用室内历史背景，添加了无DPNP的von frey阈值(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*和**分别表示p < 0.05和p < 0.01)。
图19A. 以0 (阴性对照)、10、30或100 pmole/Kg皮下给予"ASO 7"的大鼠中由足底注射5%福尔马林诱导的疼痛的抑制作用(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*p< 0.05)。
图19B. 以0 (阴性对照)、15、50或150 pmole/Kg皮下给予"ASO 10"的大鼠中由足底注射5%福尔马林诱导的疼痛的抑制作用(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*p < 0.05)。
图20A. 在以0 (阴性对照)、1、6或30 pmole/Kg皮下给予"ASO 7"的大鼠中，按组在L5 DRG中的Nav1.7表达的代表性IHC图像。
图20B. 以0 (阴性对照)、1、6或30 pmole/Kg皮下给予"ASO 7"的大鼠中，在L5DRG中的相对Nav1.7表达水平(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*表示p < 0.05和**表示p < 0.01)。
图21A. 以1 (在第3和7天上升至30 pmole/Kg)、3和10 pmole/Kg皮下给予"ASO10"的L5/L6结扎的大鼠的异常性疼痛的逆转(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*表示p < 0.05)。
图21B. 以100 pmole/Kg (每4或5天一次)皮下给予"ASO 10"，或口服给予普瑞巴林30 mpk的L5/L6结扎的大鼠的异常性疼痛的逆转。
图22. 从在第0天和第4天给予"ASO 10"的处理组(顶部面板图像)和从阴性对照组(底部面板图像)中获得的脊髓样品的Nav1.7表达(红色)、神经元细胞体(绿色)和细胞核(蓝色)的IHC图像(每组N = 3)。
图23A. 在0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM，用"ASO 10"处理24小时的 L5 DRG神经元细胞中Nav1.7表达的蛋白质印迹数据。
图23B. 在0 (阴性对照)、10、30、100或300 zM下，在用"ASO 10"处理24小时的 L5DRG神经元细胞中，通过一步PCR的cDNA合成(左图)和使用随机六聚体的cDNA合成(右图)的全长SCN9A mRNA的qPCR数据(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*表示p < 0.05和**表示p < 0.01)。
图23C. 在0 (阴性对照)、10、30或100 zM下，用"ASO 10"处理约6小时的 L5 DRG神经元细胞中的钠电流数据的合并平均值(左侧图)；和阴性对照细胞和用100 zM "ASO10"处理约6小时的细胞的合并钠电流数据的平均迹线(右侧图)。钠电流数据按细胞大小归一化而合并(N指每组用于数据分析而合并的细胞数；误差棒指示标准误差；和经student’st-检验，*表示p < 0.05)。
图24A. 在第0、3和6天，以0 (阴性对照)、5、25、125或625 fmole/Kg皮下给予"ASO7"的SD大鼠中由L5/L6结扎诱导的异常性疼痛的逆转。包括作为阳性对照的普瑞巴林30mg/Kg po处理组(每组N = 8；和误差棒指示标准误差)。
图24B. 在第0和1天，以0 (阴性对照)或100 pmole/Kg皮下给予"ASO 2"的大鼠中Randall-Selitto试验的疼痛阈值的变化(误差棒指示标准误差；经student’s t-检验，*表示p < 0.05)。
发明概述
本发明提供一种由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
式I
其中，
n为10-25之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A 前-mRNA完全互补，或者与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和，
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自非天然核碱基，其具有共价连接于所述核碱基部分的取代或未取代的氨基。
式I化合物诱导人类SCN9A前mRNA中"外显子4"的跳跃，得到缺失"外显子4"的人类SCN9A mRNA 剪接变体，因此可用于治疗疼痛或涉及Nav1.7活性的病症。
发明详述
本发明提供一种由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
式I
其中，
n为10-25之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补，或者与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和，
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自非天然核碱基，其具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基。
式I化合物诱导 人类SCN9A前mRNA中"外显子4"的跳跃，得到缺失"外显子4"的人类SCN9A mRNA 剪接变体，因此可用于治疗疼痛，或涉及Nav1.7活性的病症。
在式I化合物的某些实施方案中，n是选自11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的整数。
式I化合物互补地结合于3'剪接位点，该剪接位点跨越从基因组DNA [NCBI参考序列: NC_000002.12]中读出的人类SCN9A前mRNA中内含子3和外显子4的连接处。人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体序列是由来自"内含子3"的7-聚体和来自"外显子4"的7-聚体组成的3'剪接位点序列。因此14-聚体前mRNA序列通常可以表示为[(5' → 3') uguuuag┃GUACACU]，其中内含子和外显子序列分别用"小写"和"大写"字母表示，而"内含子3"和"外显子4"之间的连接处标记为"┃"。
前mRNA的常规表示还用[(5' → 3') gaaucuuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]的30-聚体序列举例说明，该序列跨越人类SCN9A前mRNA中"内含子3"和"外显子4"的连接处。外显子编号可根据报告的SCN9A mRNA转录物而异。30-聚体SCN9A序列的提供是为了明确地识别式Ⅰ化合物的目标剪接位点，而不管SCN9A mRNA的所报告的外显子编号如何。
式I的PNA衍生物中天然(即自然存在的)或非天然(即非自然存在的)核碱基的化学结构如图4所示。本发明的天然或非天然核碱基包括但不限于图4中提供的核碱基。作为实例的此类天然和非天然核碱基的提供是为了说明允许的核碱基的多样性，因此不应被解释为限制本发明的范围。
用来描述式I的PNA衍生物的取代基示于图5A-5E中。图5A提供了取代或未取代的烷基的例子。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基在图5B中举例说明。图5C说明取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基的例子。图5D提供了取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基的例子。在图5E中，提供了取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基和取代或未取代的烷氧基硫代羰基的例子。作为例子的此类取代基的提供是为了说明允许的取代基的多样性，因此不应被解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以很容易地发现，寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶前mRNA序列的序列特异性结合的首要因素，超过在N-末端或C-末端的取代基。
式I化合物紧密结合在互补DNA上，就像在现有技术[PCT/KR2009/001256]中所举例说明的一样。式I的PNA衍生物及其全长互补DNA或RNA之间的双链体具有太高的Tm值，以致无法在水性缓冲液中可靠地测定。式I的PNA化合物与较短长度的互补DNA具有高Tm值。
式I化合物 与从人类SCN9A基因转录的人类SCN9A前mRNA的靶3'剪接位点紧密结合，并干扰涉及该化合物靶外显子的"剪接体早期复合物"的形成。由于本发明的化合物在空间上抑制了"剪接体早期复合物"的形成，所以SCN9A "外显子4"被剪除以产生缺失"外显子4"的SCN9A mRNA剪接变体。因此，本发明的化合物诱导在SCN9A mRNA中"外显子4"的跳跃。
由于所述化合物对互补前mRNA序列有很强的亲和力，本发明的化合物还可以与具有一或两个错配的部分互补的前mRNA序列紧密结合，并导致SCN9A前mRNA内的靶外显子的跳跃。例如，即使式I的14-聚体PNA衍生物与SCN9A前mRNA有单一错配，14-聚体SCN9A ASO仍然诱导SCN9A mRNA中的"外显子4"的跳跃。
式I化合物具有良好的细胞渗透性且可以像现有技术[PCT/KR2009/001256]中的例子一样，以"裸"寡核苷酸的形式很容易地被递送到细胞中。因此本发明的化合物诱导SCN9A前mRNA中的"外显子4"的跳跃，在用式I化合物作为"裸"寡核苷酸处理的细胞中产生缺失SCN9A"外显子4"的SCN9A mRNA剪接变体。所述化合物不需要用于递送至细胞的任何方式或制剂以有效地诱导细胞内靶外显子的跳跃。式I化合物很容易诱导用亚飞摩尔浓度的作为"裸"寡核苷酸的本发明的化合物处理的细胞中SCN9A "外显子4"的跳跃。
用式I化合物作为"裸寡核苷酸"处理的细胞表达较低水平的全长SCN9A mRNA，因此显示出比未经化合物处理的细胞更弱的Nav1.7功能活性。当作为"裸寡核苷酸"全身给予时，式I化合物抑制Nav1.7在神经元细胞或组织中的表达。因此所述化合物可用于治疗疼痛，或涉及Nav1.7的过度表达的疾病。
式I的PNA衍生物可作为"裸"寡核苷酸全身给予以诱导SCN9A "外显子4"在靶组织中的跳跃，因此抑制全长SCN9A mRNA的表达。式I化合物不需要特定的制剂来增加对靶组织的全身递送，以达到预期的治疗或生物活性。通常，式I化合物溶于PBS或盐水，并全身给予以在靶组织中引发所需的治疗活性。本发明的化合物不需要经过大量或侵入性配制来引发全身的治疗活性。
式I化合物可与药学上可接受的酸或碱组合使用，酸或碱包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。
式I的PNA化合物或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的辅剂组合给予受试者，辅剂包括(但不限于)柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。
本发明的化合物可以1 fmole/Kg至高于1 nmole/Kg的治疗剂量全身给予受试者，这将根据给药方案、受试者的病症或病情等而变化。
优选的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为10-25之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补，或与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代、氢代、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和，
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由以下式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
式II　　　　　　　　　式III　　　　　　　式IV
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3为由式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
式V
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)和取代或未取代的氨基[-N(H)-，或–N(取代基)-]；和，
m为1-15之间的整数。
在某些这样的实施方案中，S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代或氢代基团，和Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基或者取代或未取代的氨基。在其它这样的实施方案中，S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn中的至少一个独立地表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基，和/或Z表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基。
在某些实施方案中，式V中的m为选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的整数。
令人感兴趣的为式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-21之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前RNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补，或与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧和氨基；和，
m为1-11之间的整数。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基或者取代或未取代的芳氧基羰基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的另一个实施方案中，X和Y的至少一个独立地表示取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基。
特别令人感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基、氧和氨基；和，
m为1-9之间的整数。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的另一个实施方案中，X和Y的至少一个独立地表示取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基。
高度感兴趣的为式I的PNA寡聚体，或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物 与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢代基团，和R2、R4和R6独立地表示氢代或者取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基团；和，
m为1-8之间的整数。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的另一个实施方案中，X和Y的至少一个独立地表示取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的芳基酰基。
更高度感兴趣的为 式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐:
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和，
m为1-8之间的整数。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，X和Y的至少一个独立地表示取代或未取代的芳基酰基。
最高度感兴趣的为式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物 与人类SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X是氢代基团；
Y表示取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接连接于碱性氨基；和，
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接连接于碱性氨基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，Y表示取代或未取代的烷基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基。
在式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐的另一个实施方案中，Y表示取代或未取代的芳基酰基。
特别感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐，所述PNA衍生物选自以下提供的化合物：
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2；
(N → C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2；
(N → C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N → C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) 苯磺酰基-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2；
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2；
(N → C) 甲基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2；
(N → C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2；
(N → C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2；
(N → C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2；
(N → C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2；
(N → C) [N-(2-苯乙基)氨基]羰基-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) N,N-苯基-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 对-甲苯磺酰基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 对-甲苯磺酰基-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 正丙基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 苄基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH2；
(N → C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 甲基磺酰基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 正己基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 正己酰基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) 正己酰基-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；
(N → C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2；
(N → C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2；
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2；
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2；
(N → C) 对-甲苯磺酰基-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2；
(N → C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2；
(N → C) 丙酰基-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2；
(N → C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2；
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2；和，
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2：
其中，
A、G、T和C为分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)为分别具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体：
式VI　　　　　　　　　式VII　　　　　　　　　　式VIII
式IX　　　　　　　　　　　　式X
其中，
p和q是整数；和，
N-和C-末端取代基的缩写具体定义如下："Fmoc-"为"[(9-芴基)甲氧基]羰基-"的缩写；"Fethoc-"代表"[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基"；"Ac-"代表"乙酰基-"；"正己酰基-"代表"1-(正己酰基)-"；"苯甲酰基-"代表"苯羰基-"；"Piv-"代表"新戊酰-"；"正丙基-"代表"1-(正丙基)-"；"正己基-"代表"1-(正己基)-"；"H-"代表"氢代-"；"对-甲苯磺酰基"代表"(4-甲基苯)-1-磺酰基-"；"苯磺酰基"代表"苯-1-磺酰基-"；"甲基磺酰基"代表"甲基-1-磺酰基-"；"-Lys-"代表氨基酸残基"赖氨酸"；"-Val-"代表氨基酸残基"缬氨酸"；"-Leu-"代表氨基酸残基"亮氨酸"；"-Arg-"代表氨基酸残基"精氨酸"；"-Gly-"代表氨基酸残基"甘氨酸"；"[N-(2-苯乙基)氨基]羰基-"代表"[N-1-(2-苯乙基)-氨基]羰基-"；"苄基-"代表"1-(苯基)甲基-"；"苯基-"代表"phenyl-"；"Me-"代表"甲基-"；"-HEX-"代表"6-氨基-1-己酰基-"，"FAM-"代表"5或6-荧光素-羰基-" (异构体混合物)，和"-NH2"代表未取代的"-氨基"。
图6共同提供缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。如现有技术[PCT/KR2009/001256]讨论的那样，C(pOq)被认为是对应于“胞嘧啶”的修饰的PNA单体，因为其优选杂交于“鸟嘌呤”。A(p)和A(pOq)被视为作为“腺嘌呤”起作用的修饰的PNA单体，因为其对“胸腺嘧啶”具有紧密亲和力。同样地，G(p)和G(pOq)被认为是等同于“鸟嘌呤”的修饰的PNA单体，因为其与“胞嘧啶”互补碱基配对。
图7明确地提供了用于在式I的PNA衍生物的N-末端或C-末端引入多样化的取代基的各种缩略语的化学结构。
为了说明PNA衍生物的缩写，表示为"(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2"的14-聚体PNA衍生物的化学结构在图8中提供。作为另一种说明，缩写为"(N → C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2"的16-聚体PNA衍生物的化学结构在图9中提供。
"(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2"的14-聚体PNA序列等同于"(5' → 3') AAG-TGT-ACC-TAA-AC"的DNA序列，其与20-聚体前mRNA序列具有14-聚体互补重叠，如在跨越人类SCN9A前mRNA内的内含子3和外显子4的连接处的[(5'→ 3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]中用"粗体"和"下划线"标记的。
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2"的18-聚体PNA序列等同于"(5' → 3') AAG-TGT-ACC-TAA-ACA-CAA"的DNA序列，其与20-聚体SCN9A前mRNA序列具有18-聚体互补重叠，如在[(5' → 3')uuguguuuag┃GUACACUUUU]中用"粗体"和"下划线"标记的。
"(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2"的18-聚体PNA序列等同于"(5' → 3') AAG-TCT-ACC-TAA-ACA-CTA"的DNA序列，其与20-聚体SCN9A前mRNA序列具有16-聚体互补重叠，如在[(5' → 3')u"u"guguuuag┃GUA"C"ACUUUU]中用"粗体"和"下划线"标记的。因此18-聚体PNA与人类SCN9A前mRNA的外显子4的3'剪接位点有两个单一错配。在内含子3和外显子4中发现两个单一错配，如用引号(" ")标记的。
"(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2"的14-聚体PNA序列等同于"(5' → 3') AAG-TGT-ACC-TAA-AG"的DNA序列，其与20-聚体SCN9A前mRNA序列具有13-聚体互补重叠，如在[(5' → 3')uugu"g"uuuag┃GUACACUUUU]中用"粗体"和"下划线"标记的。因此，14-聚体PNA与人类SCN9A前mRNA的外显子4的3'剪接位点有单个错配。在内含子3中发现单个错配，如用引号(" ")标记的。
发明详述
用于制备PNA寡聚体的一般程序
根据现有技术[US6,133,444; WO96/40685]公开的方法，如果需要的话，具有微小修改，通过基于Fmoc化学的固相肽合成(SPPS)来合成PNA寡聚体。用于该研究的固体载体为购自PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)的H-Rink Amide-ChemMatrix。具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体如现有技术[PCT/KR 2009/001256]所述或具有微小修改来合成。这种具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体和具有天然核碱基的Fmoc-PNA单体被用于合成本发明的PNA衍生物。具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体在图10中提供。然而，对于本领域技术人员而言，在这样的PNA单体上的保护基团有很多细微的变化，显然是有可能的。因此图10中Fmoc-PNA单体应作为例子，因而不应被视为限制本发明的范围。PNA寡聚体通过C18-反相HPLC (水/乙腈或水/甲醇，含0.1% TFA)纯化，并通过质谱法(包括ESI/TOF/MS)表征。
图11示意性说明了本研究的SPPS中采用的典型单体延长循环，合成细节提供如下。然而，对于本领域技术人员而言，在自动肽合成仪或手动肽合成仪上有效地运行这种SPPS反应显然可存在许多微小变化。每个反应步骤简要提供如下。
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化] 将在1.5 mL 20%哌啶/DMF中的0.01 mmolChemMatrix树脂(约20 mg树脂)在libra管中涡旋20分钟，并滤掉DeFmoc溶液。将树脂用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5 mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。使固体载体上生成的游离胺经受与Fmoc-PNA单体或与Fmoc保护的氨基酸衍生物偶联。
[DeFmoc] 将树脂在1.5 mL 20%哌啶/DMF中涡旋7分钟，并滤掉DeFmoc溶液。将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。使固体载体上生成的游离胺立即经受与Fmoc-PNA单体的偶联。
[与Fmoc-PNA单体偶联] 使固体载体上的游离胺与Fmoc-PNA单体如下进行偶联。将0.04 mmol Fmoc-PNA单体、0.05 mmol HBTU [2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐]和10 mmol DIEA (N,N-二异丙基乙胺)在1 mL无水DMF中温育2分钟，并加入含游离胺的树脂中。将树脂溶液涡旋1小时，并滤掉反应介质。然后将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。
[封端] 偶联反应后，通过在1.5 mL封端溶液(DMF中的5%乙酸酐和6% 2,6-二甲基吡啶)中振荡5分钟，使未反应的游离胺封端。然后滤掉封端溶液，并用1.5 mL MC、1.5 mLDMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。
[N-末端“Fethoc-”基团的引入] 通过在通常的碱性偶联条件下，使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，将“Fethoc-”基团引入到N-末端。“Fethoc-OSu”[CAS号179337-69-0，C20H17NO5，MW 351.36]的化学结构提供如下。
[从树脂裂解] 通过在1.5 mL裂解溶液(三氟乙酸中的2.5%三异丙基硅烷和2.5%水)中振荡3小时，从树脂上裂解结合于树脂的PNA寡聚体。滤掉树脂，并减压浓缩滤液。生成的残余物用乙醚研磨，并经过滤收集生成的沉淀，用于通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化] 从树脂上裂解后，通过C18-反相HPLC纯化每个PNA衍生物的粗产物，用含有0.1% TFA的水/乙腈或水/甲醇(梯度法)洗脱。图12A和12B分别为HPLC纯化前后“ASO 2”的示例性HPLC色谱图。“ASO 2”的寡聚体序列如表1中所提供。
式I的PNA衍生物的合成实施例
为了互补靶向跨越人类SCN9A前mRNA内的内含子3和外显子4的连接处的3'剪接位点，根据以上提供的合成程序或具有微小修改制备本发明的PNA衍生物。提供靶向人类SCN9A前mRNA的这样的PNA衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，并且不应解释为限制本发明的范围。
表1提供互补靶向人类SCN9A前mRNA中“外显子4”的3'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱法的结构表征数据。表1中提供SCN9A ASO是为了举例说明式I的PNA衍生物，并且不应解释为限制本发明的范围。
表1. 互补靶向跨越人类SCN9A前mRNA内的内含子3和外显子4的连接处的3'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论准确质量,b) 观察准确质量
图12A为用“ASO 2”的粗产物获得的HPLC色谱图。粗产物通过C18-反相(RP)制备型HPLC纯化。图12B为“ASO 2”的纯化产物的HPLC色谱图。“ASO 2”的纯度通过制备型HPLC纯化显著提高。图13提供用“ASO 2”的纯化产物获得的ESI-TOF质谱。提供“ASO 2”的分析数据是为了说明式I的PNA衍生物如何在本发明中被纯化和鉴定，并且不应解释为限制本发明的范围。
PNA衍生物对互补DNA的结合亲和力
评估表1中的PNA衍生物对互补地靶向PNA的N-末端或C-末端的10聚体DNA的结合亲和力。通过PNA和10-聚体互补DNA之间双链体的Tm值评价结合亲和力。表1中的PNA衍生物与完全互补DNA之间的双链体显示出Tm值太高而不能在水性缓冲溶液中被可靠地测定，因为缓冲溶液在Tm测量期间往往煮沸。
Tm 值如下在UV/Vis分光计上进行测定。将4 μM PNA寡聚体和4 μM互补10-聚体DNA在4 mL水性缓冲液(pH 7.16, 10 mM磷酸钠、100 mM NaCl)中的混合溶液在15 mL聚丙烯falcon管中于90℃下温育1分钟，并缓慢冷却至环境温度。然后将溶液转移至配备有气密盖的3 mL石英UV比色皿中，并如现有技术[PCT/KR2009/001256]所述或具有微小修改，在UV/可见光分光光度计上，于260 nm处经受Tm测量。用于Tm测量的10-聚体互补DNA购自Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, South Korea)并且无需进一步纯化即可使用。
对于与10-聚体DNA的互补结合，观察到的式I的PNA衍生物的Tm值是非常高的，并提供在表2中，未校正。例如，"ASO 7"显示出与靶向PNA的N-末端10-聚体(如在[(N → C)Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2]中被标记为"粗体"和"下划线")的10聚体互补DNA [即(5' → 3') AGG-TAC-ACT-T]的双链体的Tm值为77.0℃。与此同时，"ASO 7"显示出与靶向PNA的C-末端10-聚体(如在[(N → C)Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC (1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2]中被标记为"粗体"和"下划线")的10聚体互补DNA [即(5' →3') GTT-TAG-GTA-C]的双链体的Tm为69.0℃。
表2. 表1中的PNA和靶向PNA的N-末端或C-末端的10聚体互补DNA之间的Tm值。
式I的PNA衍生物的生物学活性的实施例
评估式I的PNA衍生物的体外和体内生物学活性。以下提供的生物学实施例是为了说明式I的PNA衍生物在细胞和动物中的反义活性，因此不应被解释为将本发明的范围局限于表1所列的化合物。
实施例1. PC3细胞中由"ASO 7"诱导的外显子跳跃(A)
表1中指定的"ASO 7"是互补结合于跨越人类SCN9A前mRNA内的内含子3和外显子4的连接处的3'剪接位点的14-聚体序列的14-聚体ASO。3'剪接位点内的14-聚体靶序列在[(5' → 3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]中被标记为"粗体"和"下划线"。"ASO 7"与内含子3具有6-聚体互补重叠，和与外显子4具有8-聚体互补重叠。
鉴于已知PC3细胞(目录号CRL1435, ATCC)大量表达人类SCN9A mRNA [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)]，"ASO 7"对其诱导PC3细胞中外显子4跳跃的能力评价如下。
[细胞培养和ASO处理] 在0 (阴性对照)、1、10或100 zM下，用"ASO 7"处理在含有5 mL F-12K培养基的60 mm培养皿中生长的PC3细胞。
[RNA提取和通过一步PCR合成cDNA] 在与"ASO 7"一起孵育5小时后，根据制造商的说明书，使用“通用型RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。使用SuperScript®一步法RT-PCR试剂盒和Platinum®Taq聚合酶(目录号10928-042, Invitrogen)，针对一组外显子特异性引物[外显子2_正向: (5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT；和外显子9_反向: (5' → 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]，根据以下循环条件：50℃ 30分钟和94℃ 2分钟，随后15个循环的94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下2分钟，使200 ng RNA模板经受25μL逆转录反应。
[巢式PCR扩增] 然后根据以下循环条件：95℃ 2分钟，随后34个循环的95℃下30秒、55℃下30秒和72℃下1分钟，使1 μL cDNA经历针对[外显子2n_正向: (5' → 3')CCACCGGACTGGACCAAAAA；和外显子9n_反向: (5' → 3') GCTAAGAAGGC-CCAGCTGAA]的一组外显子特异性引物的20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)。
[外显子跳跃产物的鉴定] 使PCR产物在2%琼脂糖凝胶上经受电泳分离。收集目标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图14A提供了巢式PCR产物的电泳数据，其中"ASO 7"处理的细胞产生了一条很强的PCR带，可归因于外显子4-5的跳跃。然而，在用10或100 zM ASO处理的样品中，全长SCN9AmRNA的PCR条带往往强于阴性对照样本。在巢式PCR中，奇怪的剂量反应模式可能是由于在"ASO 7"的外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”造成的转录上调的结果[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。Sanger测序证实，外显子跳跃PCR产物是外显子4-5的跳跃，如在图14B中所示。
实施例2.PC3细胞中由"ASO 7"诱导的外显子跳跃(B)
如在"实施例1"中评价"ASO 7"诱导PC3细胞中"外显子4"跳跃的能力，除非另外指明。在该实验中，在0 (阴性对照)、1、10、100和1,000 aM用"ASO 7"处理PC3细胞24小时。巢式PCR反应针对[外显子3/6_正向: (5' → 3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT；和外显子9_反向:(5' → 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]的一组引物执行，所述引物经设计以扩增具有外显子3和外显子6的连接处序列的产物。
"外显子3/6_正向"的引物序列更选择性地识别"外显子3和外显子6的连接处"超过在全长SCN9A mRNA中发现的"外显子3和外显子4的连接处"。引物序列被设计以比全长SCN9A mRNA更灵敏地检测缺失外显子4-5的SCN9A剪接变体。这样的外显子跳跃引物将有助于检测代谢稳定性差的mRNA剪接变体，因为全长mRNA往往显示经过数十亿年内的进化获得的良好代谢稳定性。
图14C提供了巢式PCR产物的电泳数据，其中用"ASO 7"处理的细胞产生了一条很强的PCR带，可归因于外显子4-5的跳跃。Sanger测序证实，外显子跳跃PCR产物是外显子4-5的跳跃。
实施例3. 用"ASO 7"处理的PC3细胞中SCN9A mRNA的qPCR(A)
"ASO 7"通过SCN9A 巢式qPCR对其诱导PC3细胞中人类SCN9A mRNA水平的变化的能力如下所述进行评价。
[ASO处理] 在0 (阴性对照)、0.1、1或10 aM，用"ASO 7"处理PC3细胞(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取和通过一步法PCR合成cDNA] 在与"ASO 7"一起孵育24小时后，如在"实施例1"中所述，提取总RNA并经受一步PCR扩增。
[巢式qPCR扩增] 将cDNA溶液稀释100倍，并根据以下循环条件：95℃ 30秒钟，随后40个循环的95℃下5秒和60℃下30秒，使1 μL每种稀释的PCR产物经受针对[外显子3_正向: (5' → 3') TGACCATGAATAACCCAC；和外显子4_反向: (5' → 3')GCAAGGATTTTTACAAGT]的一组外显子特异性引物的20 μL实时PCR反应。用[(5' → 3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]的TaqMan探针进行qPCR反应，所述探针靶向全长SCN9A mRNA内的外显子3和外显子4的连接处。
图15A总结了观察到的qPCR数据，其中全长SCN9A mRNA水平在用"ASO 7"处理的细胞中显著降低约35-45% (student's t-检验)。
实施例4. 用"ASO 7"处理的PC3细胞中SCN9A mRNA的qPCR (B)
如在"实施例3"中通过SCN9A 巢式qPCR评价"ASO 7"诱导PC3细胞中人类SCN9AmRNA水平变化的能力，除非另外指明。cDNA使用随机六聚体合成，并经受针对TaqMan探针的SCN9A qPCR反应。
图15B提供了观察到的qPCR数据，其中全长SCN9A mRNA水平在用"ASO 7"处理的细胞中显著降低约50-60% (student's t-检验)。
实施例5. 由L5/L6脊髓神经结扎诱导大鼠的脊髓神经病
脊髓神经结扎(SNL)诱导背根神经节(DRG)和脊髓的神经病，并已广泛用作神经性疼痛的模型[Pain vol 50(3), 355-363 (1992)]。然而，依脊髓神经束如何结扎而定，存在SNL的若干变化。DRG中神经病的程度和持续时间似乎根据脊髓神经束如何结扎而变化[Pain vol 43(2), 205-218 (1990)]。根据内部经验，L5和L6脊髓神经双结扎(即，"L5/L6结扎")比单一结扎L5脊髓神经(即"L5结扎")引起的神经病更严重，且持续时间更长。
[L5/L6结扎的SNL手术] 用zoletil/rompun麻醉雄性SD大鼠。然后使L5和L6脊髓神经束(左侧)暴露并紧紧结扎。然后根据适当的无菌程序闭合和夹住肌肉和皮肤。
[神经性疼痛的诱导] SNL手术后6-7天，如下所述，用电子von Frey麻醉度计(型号2390, IITC Inc. Life Science)，通过von Frey评分，刺激结扎侧的爪。Von Frey评分每天进行一次，直到药理学评估分组为止。
[电子Von Frey评分] 在将每只动物于为von Frey评分定制的塑料笼中稳定不到30分钟后，使每只动物的左后爪经受von Frey评分6次，在评分之间间隔几分钟。弃去第一轮评分的得分，因为在第一轮评分期间动物没有稳定下来。在剩余的5个得分中，最高和最低得分被排除。然后将剩余3个得分的平均值作为动物的von Frey得分。
实施例6. 通过"ASO 7"逆转患有脊髓神经病的大鼠的异常性疼痛(1)
"ASO 7"是与从大鼠基因组DNA [NCBI参考序列: NC_000002.12]中读出的大鼠SCN9A前mRNA部分互补的14-聚体SCN9A ASO，在靶序列的3'-末端有单一错配。大鼠SCN9A前mRNA内"ASO 7"的靶13-聚体序列被指定为“粗体”和“下划线”，如在 [(5' → 3')uuuc"c"uuuag┃GUACACUUUU]的20-聚体SCN9A前mRNA序列中所标记的，其中在内含子3中发现的单一错配用引号(" ")标记。
如下所述评估"ASO 7"在患有由"L5/L6结扎"诱导的脊髓神经病的大鼠中逆转异常性疼痛的能力。
[SNL手术和分组] 在第-10天，使雄性SD大鼠(6周龄, Harlan Laboratories,Italy)接受"L5/L6结扎"。从第-4天开始，每天按von Frey评分刺激动物。在第0天，根据个体在第0天的von Frey评分，选择30只动物，分为4组：阴性对照组(即，无ASO处理)，和1、3和6 pmole/Kg "ASO 7"的3个处理组(每组6或9只动物)。
[ASO处理和Von Frey评分] 大鼠于第0、2、4、6、8、10天下午皮下接受0 (阴性对照)、1、3或6 pmole/Kg的"ASO 7"。在早晨，通过“实施例5”中所述的电子Von Frey评分法对异常性疼痛进行评分。ASO作为"裸"寡核苷酸，即溶解在PBS中给予。
[逆转异常性疼痛] 图16A总结von Frey评分的观察结果。阴性对照组中的动物在分组后12天的时间内平均von Frey评分(缩回阈值)稳定在约6和7 g之间。"ASO 7"从第4天起及以后显著逆转(student's t-检验)异常性疼痛。尽管所有处理组的治疗活性都是相当的，但6 pmole/Kg组从第一次给药后第2天开始显示治疗活性。
虽然这项特定评估中没有包括阳性对照比较组，但根据室内评价，10-12 g的vonFrey评分在口服给予30 mg/Kg的普瑞巴林的大鼠(有L5/L6结扎")中经常被观察到。因此在这种特定的神经性疼痛模型中，1-6 pmole/Kg的"ASO 7"的功效相当于30 mg/Kg的普瑞巴林。
实施例7. "ASO 2"在患有脊髓神经病的大鼠中逆转异常性疼痛
表1中规定的"ASO 2"是与3'剪接位点完全互补的13-聚体ASO，所述剪接位点跨越人类SCN9A前mRNA的内含子3和外显子4的连接处，如在[(5' → 3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]中用"粗体"和"下划线"标记的。"ASO 2"与内含子3具有5-聚体重叠，和与外显子4具有8-聚体重叠。"ASO 2"的靶序列在大鼠SCN9A前mRNA中是保守的。
如在"实施例6"中所述，评估"ASO 2"在患有由"L5/L6结扎"诱导的脊髓神经病的大鼠中逆转异常性疼痛的能力，除非另外指明。
[分组和ASO处理] 雄性SD大鼠(5周龄，Harlan Laboratories, Italy)在第-16天经受SNL操作。在0天，选择30只大鼠并分成5组：阴性对照组(即，无ASO处理)，和4个处理组：20 pmole/Kg QD (即，每日一次)、100 pmole/Kg QD、500 pmole/Kg QD和100 pmole/KgQ2D (即，每两日一次)的"ASO 2" (每组6只动物)。根据QD和Q2D的给药方案，在第0-13天期间，皮下给予动物"ASO 2"。ASO作为"裸"寡核苷酸，即溶于PBS中给予。
[异常性疼痛评分] 在第0-14天期间，根据如在"实施例5"中描述的von Frey方法，对异常性疼痛评分。在第7天，对右爪(未结扎侧)进行von Frey评分。
[异常性疼痛的逆转] 图16B总结了von Frey评分的观测结果。阴性对照组动物在分组后14天的时间内呈现平均von Frey阈值得分稳定在约6-8g之间。
在结扎侧的爪的情况下，除100 pmole/Kg QD组外，在给予20 pmole/Kg QD、100pmole/Kg Q2D和500 pmole/Kg QD的动物中，在第1天及其后，异常性疼痛明显逆转(student's t-检验)。然而，在第14天，100 pmole/Kg QD也显著逆转异常性疼痛。
在未结扎侧的爪的情况下，ASO处理组在第7天的von Frey得分高于阴性对照组的得分。观察到的von Frey得分为15.3 g (阴性对照)、17.6 g (20 pmole/Kg QD)、19.2 g(100 pmole/Kg QD)、20.1 g (100 pmole/Kg Q2D)和19.5 g (500 pmole/Kg QD)。然而，在ASO处理组和阴性对照组之间没有显著差异。
实施例8. 通过"ASO 7"抑制由L5/L6脊髓神经结扎激活的大鼠L5 DRG细胞中的钠电流
细胞钠电流通常用膜片钳测量。当钠离子进入细胞时，细胞内钠离子水平增加。细胞内钠水平可以用钠离子敏感染料来评估。"CoroNa Green"为具有冠醚型的钠离子特异性螯合剂的染料。在螯合钠离子时，"CoroNa Green"发出绿色荧光。"CoroNa Green"已用于间接测量细胞钠水平。发现通过"CoroNa Green"测量的钠水平与通过钠离子膜片钳测量的钠离子电流很好地相关[Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150(2009)]。
如下使用“CoroNa Green”对"ASO 7"下调在大鼠DRG细胞中的钠离子电流的能力进行评估。
[DRG提取] 在第0天，使雄性SD大鼠(6周龄, Harlan Laboratories, Italy)经受如在"实施例5"中所述的"L5/L6结扎"。大鼠在4周内偶尔接受von Frey评分。在第31天，处死显示出von Frey评分低的大鼠，以提取左侧(结扎侧)和右侧(非结扎侧) L5 DRG。提取后立即将DRG浸泡在0.5 mL PBS中。
[L5 DRG神经元细胞的制备] DRG细胞根据在文献[Methods Mol Biol. vol 846,179-187 (2012)；PLoS One vol 8(4)；e60558 (2013)]中公开的程序来制备，其连续简要描述如下：① 将DRG转移到含0.2 mL在HBSS (Hank's平衡盐溶液，目录号14025-092, LifeTechnologies)中的0.125%胶原酶(胶原酶类型IV，目录号C5138-100MG, Sigma)的1.5 mLe-管，用剪刀切成尽可能小的碎片，并用5% CO2和95% RH在37℃、CO2孵化器中孵育20 min；② 将50 μL 0.25%胰蛋白酶/EDTA加入到e-管中，将其保存在孵化器中另外10 min；③ 向e-管中装入1 mL完全DMEM培养基，并以600 g经受离心沉淀5 min；④ 使产生的颗粒悬浮在4 mLNeurobasal-A培养基(Neurobasal®培养基, 目录号21103-049, Gibco)中，所述培养基补充有2X B-27 (B-27®无血清补充剂，目录号17504-044, Gibco)、1X青霉素-链霉素、1XL-谷氨酰胺，和将1 mL细胞悬液小心地接种在层粘连蛋白涂覆的、置于一个35 mm培养皿中的盖波片(目录号GG-25-1.5-层粘连蛋白, Neuvitro)上；⑤ 接种后一天，在培养皿中又小心地添加另外1 mL的新鲜Neurobasal-A培养基；⑥ 接种后2天，用补充有1 mM Ara-C (胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷, 目录号C1768-100MG, Sigma)的2 mL新鲜Neurobasal-A培养基代替培养基，以选择性地抑制除了DRG神经元细胞以外的细胞的生长；⑦ 接种后4天，再用补充有1 mM Ara-C的2 mL新鲜Neurobasal-A培养基替代培养基；和⑧ 接种后5或6天，DRG神经元细胞用ASO处理。
[ASO处理和CoroNa测定] 有"L5/L6结扎"或没有"L5/L6结扎"的L5 DRG神经元细胞用"ASO 7"在0 (阴性对照)、100或1,000 zM下处理。30小时后，细胞用2 mL HBSS洗涤，然后加入2 mL新鲜HBSS。然后细胞用5 μM "CoroNa Green" (目录号C36676, LifeTechnologies)于37 ℃处理。30 min后，细胞用2 mL HBSS洗涤2次，加入2 mL新鲜HBSS。培养盘安装在配有CCD摄像机的奥林巴斯荧光显微镜(BX53型, Olympus)上，以连续捕捉细胞的绿色荧光图像。用10 mM NaCl急性处理细胞，然后在300秒内以数字方式记录细胞荧光强度的变化。每帧(即每种ASO浓度)有4-5个细胞。来自每个个体细胞的荧光强度以秒的分辨率示踪。使用ImageJ程序(版本1.50i, NIH)对来自个体细胞的细胞内荧光强度迹线平均化，图13(A)和13(B)分别为具有"L5/L6结扎"和没有"L5/L6结扎"的细胞提供了平均迹线。以平均荧光强度迹线作为在0 (阴性对照)、100或1,000 zM下用"ASO 7"处理的细胞的个体细胞内钠浓度迹线。
[CoroNa测定结果] 在用"L5/L6结扎"刺激的DRG神经元细胞中[参考图17A]，在100 zM或1 aM下用"ASO 7"处理显著抑制平均细胞荧光强度。在150 sec的时间点，例如，在ASO处理的细胞中，平均细胞荧光强度(即，钠电流)降低80-85%。
在无"L5/L6结扎"的DRG神经元细胞中[参考图17B]，在1 aM下用"ASO 7"处理诱导了平均细胞荧光强度的降低。然而，在150秒的时间点观察到的降低为约50%，并没有如在用"L5/L6结扎"刺激的细胞中那样显著。此外，在100 zM下用"ASO 7"处理不能抑制无"L5/L6刺激"的神经元细胞中的钠电流。
已知无神经性刺激的DRG神经元细胞表达VGSC的各种亚型，包括Nav1.7、Nav1.8、Nav1.2等。Nav1.7亚型显示了在没有刺激的情况下对DRG神经元细胞中的整个钠电流的有限贡献[Nat Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)]。无"L5/L6结扎"的大鼠DRG神经元细胞可以模拟这样的没有神经病的DRG神经元细胞。观察到的无"L5/L6结扎"的DRG细胞中钠电流的抑制可能仅反映来自Nav1.7亚型的钠电流的贡献。
同时，已知神经元细胞为响应持续性神经病而上调Nav1.7表达[J Biol Chem.vol 279(28), 29341-29350 (2004)；J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)]。具有"L5/L6结扎"的大鼠DRG神经元细胞可以模拟有神经病的DRG神经元细胞。在100 zM和1aM下，"ASO 7"均抑制由"L5/L6结扎"刺激的神经元细胞中的钠电流80-85%。具有"L5/L6结扎"的DRG细胞中"ASO 7"对钠电流的较高抑制与慢性神经病的神经元细胞中的Nav1.7上调一致。
一并考虑在有和没有"L5/L6结扎"的大鼠DRG神经元细胞中观察到的结果，得出"ASO 7"有选择性地抑制Nav1.7亚型的表达的结论。"ASO 7"似乎在有神经病的神经元细胞中比无神经病的那些细胞中更有效地抑制Nav1.7表达。
实施例9."ASO 1"在具有DPNP的大鼠中逆转异常性疼痛
表1中规定的"ASO 1"是与3'剪接位点完全互补的16-聚体ASO，所述剪接位点跨越人类SCN9A前mRNA的内含子3和外显子4的连接处，如在 [(5' → 3')uuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]的25-聚体SCN9A前mRNA序列中"粗体"和"下划线"所标记的。"ASO 1"与内含子3具有5-聚体重叠，和与外显子4具有11-聚体重叠。"ASO 1"与大鼠SCN9A前mRNA完全互补。
评价"ASO 1"逆转由糖尿病性周围神经性疼痛(DPNP)诱发的大鼠异常性疼痛的能力。
[DPNP的诱导和分组] 在第0天，将溶于柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中的链脲菌素以60mg/Kg经腹膜内给予体重约200 g的雄性SD大鼠，以诱导I型糖尿病[J. Ethnopharmacol.vol 72(1-2), 69-76 (2000)]。在第10天，具有DPNP的大鼠被随机分为两组：阴性对照(只有媒介，PBS)和100 pmole/Kg "ASO 1"，并根据如下所述使用von Frey微丝的第10天个体动物的von Frey评分(每组N = 8)。
[通过Up & Down方法的Von Frey评分] 根据“Up＆Down”方法，用一组von Frey微丝(Touch Test®)对异常性疼痛进行评分[J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63(1994)]。
[ASO给予和异常性疼痛评分] 使"ASO 1"溶于PBS并在第11、13、15、17和19天皮下给予大鼠。在第11、13、15、17和19天在给药后2小时，以及另外在第21天和第23天，对异常性疼痛进行评分，以评估最终剂量后治疗活性的持续时间。
[异常性疼痛的逆转] 图18A总结了von Frey评分的观测结果。阴性对照组动物在第10-23天内呈现出稳定在6-7g之间的平均von Frey阈值。在接受100 pmole/Kg "ASO 1"的动物中，第一次给药后2小时，即第11天，异常性疼痛明显逆转(student's t-检验)约80%。当反复给予ASO至第19天时，治疗活性略有增加，但逐渐增加到约90%。鉴于治疗活性在最后剂量后2天，即在第21天完全被消除，"ASO 1"可能没有足够长的药效学半衰期，以支持每两天一次(即Q2D)的给药方案。
尽管如此，"ASO 1"显示如果用在第11天的von Frey评分来判断，逆转异常性疼痛的起效时间为几个小时。
实施例10. "ASO 2"和"ASO 6"在具有DPNP的大鼠中逆转异常性疼痛
"ASO 6"是互补地结合于3'剪接位点的13-聚体序列的13-聚体ASO，所述剪接位点跨越在人类SCN9A前mRNA中内含子3和外显子4的连接处，如在[(5' → 3')uuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]的25-聚体SCN9A前mRNA序列中"粗体"和"下划线"所标记的。"ASO 6"与内含子3具有5-聚体重叠，和与外显子4具有8-聚体重叠。虽然"ASO 2"和"ASO 6"靶向人类SCN9A前mRNA的相同序列，但"ASO 6"被认为对互补RNA具有比"ASO 2"更强的亲和力。
如在"实施例9"中所述，评价"ASO 2"和"ASO 6"逆转由DPNP诱发的大鼠异常性疼痛的能力，除非另外指明。
在第-10天，通过腹膜内注射60 mg/Kg的链脲菌素，在雄性SD大鼠(6周龄, HarlanLaboratories, Italy)中诱导糖尿病。在第0天，选择显示出最低von Frey评分的18只动物并分成3组：阴性对照(只有媒介，PBS)、60 pmole/Kg "ASO 2"和30 pmole/Kg "ASO 6" (每组N = 6)。在第0、2和4天，用媒介或溶于PBS中的ASO皮下给予大鼠。如在"实施例5"中所述，通过电子von Frey方法对异常性疼痛进行评分。
[异常性疼痛的逆转] 图18B总结了观测的von Frey评分。阴性对照组动物在第0-9天内呈现稳定在约10-12 g的平均von Frey阈值。
在接受60 pmole/Kg "ASO 2"的动物中，在第0天第一个剂量后第4天，异常性疼痛逐渐地逆转至无糖尿病性神经病的基线水平(即按内部历史阈值的完全恢复水平)。在第4天最后给药后，治疗活性显著地(student's t-检验)持续另外3天。
在接受30 pmole/Kg "ASO 6"的动物中，治疗活性在第2天显著地升高(student'st-检验)，并在第4天最后给药后持续另外4天。因此，"ASO 6"比"ASO 2"更有效地逆转异常性疼痛。与"实施例9"中的"ASO 1"不同，"ASO 6"显示了足够长的治疗活性持续时间，以支持大鼠每周2次的给药方案。
[其它]随着糖尿病的持续，阴性对照组的动物在von Frey评分期间显示出身体崩溃的征兆。处理组中的动物对von Frey挑战活跃且有反应，这与ASO的治疗活性是一致的。
实施例11. "ASO 7"在大鼠福尔马林试验中的镇痛活性
由足底注射20 μL 2%福尔马林诱导的疼痛在全部SCN9A KO小鼠中显著减轻。抑制程度对于阶段I(福尔马林注射后0-10 min)和阶段II(福尔马林注射后15-45 min)分别是73%和86% [PLoS One vol 9(9), e105895 (Sep 2014)]。
"ASO 7"在大鼠SCN9A前mRNA的5'-末端具有单一错配，并对其在大鼠福尔马林试验中的镇痛活性评价如下。
[分组和ASO处理] 在第-6天，将24只雄性SD大鼠(6周龄, Harlan Laboratories,Italy)随机分成4组：阴性对照(无ASO处理)和3个"ASO 7"处理组，即10、30和100 pmole/Kg(每组N = 6)。每组动物在第-6和-2天皮下接受0 (阴性对照)、10、30或100 pmole/Kg的"ASO 7"。"ASO 7"在PBS中稀释用于注射。
[福尔马林试验]在第0天，在左后爪经足底注射50 μL 5%福尔马林诱导急性疼痛。注射福尔马林后，每只大鼠在注射福尔马林后立即进行一小时的单独录像记录。回放录像以在视觉上对每个受害的动物的疼痛反应进行评分。
[镇痛活性] 图19A总结了在福尔马林注射后不同时间点各组观察到的疼痛评分。处理组10、30和100 pmole/Kg的阶段II疼痛反应(10和40 min之间的AUC)分别显著地降低(经student's t-检验，*p < 0.05) 33%、36%和32%。同时，处理组10、30和100 pmole/Kg的阶段I疼痛反应(0和10 min之间的AUC)分别降低14%、40%和43%，无统计学意义。
实施例12. "ASO 10"在大鼠福尔马林试验中的镇痛活性
表1中指定的"ASO 10"是部分地互补于人类SCN9A前mRNA的14-聚体SCN9A ASO，其在靶标前mRNA序列的5'-末端具有单一错配，如在[(5' → 3') uugu"g"uuuag┃GUACACUUUUACUGG]的25-聚体SCN9A前mRNA序列中"粗体"和"下划线"所标记的，其中内含子3中的单一错配用引号(" ")标记。同时，"ASO 10"完全互补于跨越大鼠SCN9A前mRNA中内含子3和外显子4的连接处的3'剪接位点，如在[(5' → 3') uuuccuuuag┃GUACACUUUU]的20-聚体大鼠SCN9A前mRNA序列中"粗体"和"下划线"所标记的。"ASO 10"具有与内含子3的6-聚体重叠和与外显子4的8-聚体重叠。
如在"实施例11"中所述，对"ASO 10"在大鼠福尔马林试验中的镇痛活性进行评价，除非另外指明。
[分组和ASO处理] 将36只雄性SD大鼠(7周龄, Harlan Laboratories, Italy)随机分成4组：阴性对照(无ASO处理)和3个"ASO 10"处理组，即15、50和150 pmole/Kg (每组N= 9)。每组动物在第-6和-2天皮下给予0 (阴性对照)、15、50或150 pmole/Kg的"ASO 10"。ASO作为PBS中的溶液给予。
[镇痛活性] 图19B总结了在各个时间点各组观察到的疼痛评分。处理组15和50pmole/Kg的阶段II疼痛反应(10和40 min之间的AUC)分别显著地降低(student's t-检验)17%和41%。同时，处理组15和50 pmole/Kg的阶段I疼痛反应(0和10 min之间的AUC)分别显著地降低38%和50%。
有趣的是，150 pmole/Kg组在阶段I和阶段II中均未能显示出治疗活性。150pmole/Kg的"ASO 10"将是过量的，其诱导用"ASO 10"的外显子跳跃期间累积的"外显子内含子环状RNA (EIciRNA)"造成的转录上调[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
实施例13. 经受足底注射福尔马林而受害的大鼠中"ASO 7"对L5 DRG中Nav1.7表达的抑制作用
通过IHC (免疫组织化学)评价"ASO 7"抑制足底注射福尔马林而受害的雄性SD大鼠的L5 DRG中Nav1.7表达的能力，如下所述。
[ASO处理和福尔马林注射]在第-5天，雄性SD大鼠(6周龄, HarlanLaboratories, Italy)被随机分成4组：阴性对照(无ASO处理)和3个"ASO 7"处理组，即1、6和30 pmole/Kg。在第-5和-1天，每组动物皮下接受0 (阴性对照)、1、6或30 pmole/Kg的"ASO 7"。"ASO 7"在PBS中稀释并用于注射。在第0天，所有的动物接受50 μL 5%福尔马林的单次足底注射。
[提取L5 DRG和Nav1.7 IHC] 在第8天，用zoletil/rompun麻醉大鼠，并对福尔马林注射侧的L5 DRG取样(每组N = 2)。如下简要描述的，DRG样品经受Nav1.7 IHC。
将DRG样品冷冻切片，并经受用1:500稀释的第一抗-Nav1.7抗体(目录号ASC-008,Alomone)，用1:200稀释的第二抗-IgG (目录号BA-1100, Vector)，然后用1:200稀释的用于红色荧光标记的Dylight 594-链酶抗生物素(目录号SA-5594, Vector, CA, USA)进行系列免疫染色。IHC图像在Zeis玻片扫描仪上对于DRG中的Nav1.7表达而捕获。
[L5 DRG中Nav1.7表达的抑制作用] 图20A按组提供了一组具有代表性的Nav1.7IHC图像。阴性对照组中Nav1.7在DRG中的表达显著高于ASO处理组中的表达。
使用NIH ImageJ程序对每幅单独的IHC图像中的红色水平进行数字化评分，并对个体水平进行分组统计分析(每组N = 2)。图20B汇总了按组数字量化的Nav1.7表达水平。Nav1.7表达水平在所有ASO处理组中均显著地降低(student's t-检验)约50-60%。
实施例14. "ASO 10"逆转具有脊髓神经病的大鼠的异常性疼痛(1)
如在"实施例6"中所述，评估"ASO 10"在患有由"L5/L6结扎"诱导的脊髓神经病的大鼠中逆转异常性疼痛的能力，除非另外指明。
[分组] 在第-14天，雄性SD大鼠(5周龄, Harlan Laboratories, Italy)经受"L5/L6结扎"。在第0天，36只动物基于其在第0天的单独von Frey评分进行选择，并分成4组：阴性对照组(即，无ASO处理)，3个ASO处理组，即1、3和10 pmole/Kg (每组N = 9)。
[ASO处理和Von Frey评分] 大鼠在第0、3和7天下午经皮下接受0 (阴性对照)、3和10 pmole/Kg的"ASO 10"。在1 pmole/Kg处理组中，在第0天的初始剂量为1 pmole/Kg，然后由于在第2和3天1 pmole/Kg缺乏治疗活性，在3和7天上升至30 pmole/Kg。
[逆转异常性疼痛] 图21A总结观察到的von Frey评分。阴性对照组中的动物在分组后9天内的平均von Frey评分(缩回阈值)稳定在约6和7 g之间。
用3-30 pmole/Kg的"ASO 10"给予1周内逐渐并显著地逆转异常性疼痛。所有处理组的治疗活性稳定在约13 g的von Frey评分。
然而，在1 pmole/Kg组中，第3天剂量从1 pmole/Kg升至30 pmole/Kg后，治疗活性开始恢复。如果将约18 g的历史背景阈值视为无"L5/L6"结扎的von Frey评分，在剂量增加至30 pmole/Kg后在第6天，异常性疼痛显著地逆转约40%。镇痛效率在第8天增加至约60%。
在3 pmole/Kg组中，异常性疼痛在第6天显著地逆转(student's t-检验)，效率适度(约40-50%)。治疗效果在第8天增加至65+%。
在10 pmole/Kg组中，异常性疼痛在第4天显著地逆转，效率为约25-30%。治疗效果在第9天增加至约60%。然而，疗效从第6天起维持停滞状态。
实施例15. "ASO 10"逆转具有脊髓神经病的大鼠的异常性疼痛(2)
如在"实施例6"中所述，评估"ASO 10"在患有由"L5/L6结扎"诱导的脊髓神经病的大鼠中逆转异常性疼痛的能力，除非另外指明。
[分组] 在第-10天，雄性SD大鼠(6周龄, Harlan Laboratories, Italy)经受"L5/L6结扎"。在第0天，36只动物基于其在第0天的单独von Frey评分进行选择，并随机分成4组：阴性对照组(即，无ASO处理)，2个100 pmole/Kg的ASO处理组，每4或5天给药一次，和普瑞巴林30 mg/Kg的阳性对照组(每组N = 9)。
[ASO处理和Von Frey评分] 大鼠在下午经皮下接受0 (阴性对照)、100 pmole/Kg(第0和4天)、100 pmole/Kg (第0和5天)的"ASO 10"。每天早上都要对异常性疼痛进行评分。在von Frey评分之前1小时，口服给予阳性对照组的大鼠普瑞巴林30 mg/Kg。ASO作为PBS中的溶液给予。
[异常性疼痛的逆转] 图21B总结了观测的von Frey评分。阴性对照组动物在第一次ASO处理后7天内呈现稳定在约6-7 g之间的平均von Frey评分(缩回阈值)。普瑞巴林30mg/Kg组的大鼠显示出约10-11 g的平均von Frey评分，虽然因为镇静作用在第7天观察到的评分是约13g。
在每4天一次的ASO处理组中，在第3、6和7天，异常性疼痛在所有被试场合均有明显的逆转(student's t-检验)，并在第3和6天显著优于普瑞巴林30 mg/Kg。因此，大鼠每4天一次的给药频率似乎适合于维持优于普瑞巴林30 mpk的治疗活性。值得注意的是，异常性疼痛在第8天被逆转至针对内部历史背景的没有脊髓神经病的基础水平的约90%。
在每5天一次的ASO处理组中，在第3、6和7天，异常性疼痛在所有被试场合均有明显的逆转(student's t-检验)，并仅在第3天显著优于普瑞巴林30 mg/Kg。因此，每5天一次的给药频率似乎太长而不能确保治疗活性显著地优于普瑞巴林 30 mg/Kg。
[脊髓中的Nav1.7表达] 在第7天，用zoletil/rompun麻醉动物，用补充有福尔马林的PBS灌注以保持脊髓的结构完整性，并进行脊髓取样(每组N = 3)。将脊髓样品加工成石蜡块，用Nav1.7抗体(目录号ASC-008, Alomone)对Nav1.7表达(红色染色)和用Neu抗体(目录号Ab104224, Abcam)对神经元细胞体(绿色染色)进行系列IHC。细胞核用DAPI染色(蓝色)。
图22提供了在Zeiss切片扫描仪上捕获的IHC图像。第0天和第4天给予的ASO处理组的脊髓样品的Nav1.7表达水平与阴性对照组的脊髓样品的表达水平比较有明显降低。因此，当皮下给药时，ASO似乎已经很容易地分布至脊髓，并抑制Nav1.7在脊髓中的表达。
实施例16. "ASO 10"抑制大鼠DRG神经元细胞中的Nav1.7表达
如下所述，评估"ASO 10"抑制Nav1.7在大鼠L5 DRG神经元细胞中的表达的能力。
[L5 DRG神经元细胞的准备] 如在"实施例5"中所述，雄性SD大鼠(7周龄, HarlanLaboratories, Italy)经受牢固的"L5/L6结扎"。7天后，用zoletil/rompun麻醉4只大鼠，用于提取结扎侧的L5 DRG。如在"实施例8"中所述，合并DRG并处理以制备DRG神经元细胞。
[ASO处理] DRG神经元细胞用"ASO 10"在0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM下处理24小时，然后经受裂解用于针对Nav1.7抗体(目录号ab85015, Abcam)的蛋白质印迹，该抗体探测Nav1.7蛋白的C-末端。β-肌动蛋白被探测以供参考。"ASO 10"原液在DDW中溶解，并等分至培养基中。
[Nav1.7表达的抑制作用] 图23A提供用在0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM下"ASO 10"处理的DRG神经元细胞获得的蛋白质印迹数据。所有的裂解物产生一个170-200K的强带，其为Nav1.7蛋白的代谢产物。只有阴性对照和10 zM "ASO 10"的裂解物检出在220-240K的全长Nav1.7蛋白带。因此，与100-1000 zM的"ASO 10"一起孵育24小时后，Nav1.7在大鼠DRG神经元细胞中的表达被完全抑制。
"ASO 10"是与大鼠SCN9A前mRNA完全互补的14-聚体ASO，而"ASO 7"是与人类SCN9A前mRNA完全互补的14-聚体ASO。用"ASO 10"获得的在大鼠神经元细胞中的SCN9A抑制谱可以可预测地外推到人类神经元细胞中"ASO 7"的SCN9A抑制谱。
实施例17. 用由一步PCR合成的cDNA的"ASO 10"处理的大鼠DRG神经元细胞的SCN9A mRNA的qPCR
如下所述，通过SCN9A 巢式qPCR评价"ASO 10"在大鼠DRG细胞中诱导大鼠SCN9AmRNA水平变化的能力。
[L5 DRG神经元细胞的准备] 用zoletil/rompun麻醉雄性SD大鼠(6周龄, HarlanLaboratories, Italy)以提取L5 DRG。如在"实施例8"中所述对L5 DRG样品进行处理以制备L5 DRG神经元细胞。
[ASO处理] 在0 (阴性对照)、10、30、100或300 zM下，用"ASO 10"处理大鼠L5 DRG神经元细胞(每个ASO浓度一个培养皿)。"ASO 10"原液在DDW中溶解，并等分至培养基中。
[RNA提取和一步PCR合成cDNA] 在与"ASO 10"一起孵育24小时后，根据生产商的指示，使用“通用RNA提取试剂盒(目录号9767, Takara)，从细胞提取总RNA。根据以下循环条件：50℃ 30 min和94℃ 2 min，随后15个循环的94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下2分钟，使用针对[外显子2_正向: (5' → 3') CAATCTTCCG-TTTCAACGCC，和外显子10_反向:(5' → 3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT]的一组外显子特异性引物的一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，使200 ng RNA模板经受25 μL逆转录反应。
[巢式qPCR扩增] cDNA溶液(每种ASO浓度重复一次)稀释100倍，根据以下循环条件：95℃ 30秒，随后40个循环的95℃下5秒和60℃下30秒，使1 μL每种稀释的cDNA溶液用TaqMan探针(目录号Rn01514993_mH, ThermoFisher)经历20 μL实时PCR反应，所述探针靶向在SCN9A前mRNA中的外显子3和外显子4的连接处。
图23B的左侧图总结了观察到的qPCR数据，其中在用"ASO 10"处理的细胞中，全长SCN9A mRNA水平显著地降低(student's t-检验)约50-60%。
实施例18.用由随机六聚体合成的cDNA的"ASO 10"处理的大鼠DRG神经元细胞的SCN9A mRNA的qPCR
通过SCN9A qPCR评价"ASO 10"抑制SCN9A mRNA在大鼠L5 DRG神经元细胞中表达的能力。如在"实施例17"中所述制备总RNA，并使用随机六聚体进行cDNA合成。cDNA溶液(每种ASO浓度重复一次)稀释100倍，根据以下循环条件：95℃ 30秒，随后40个循环的95℃下5秒和60℃下30秒，使1 μL每种稀释的PCR产物用TaqMan探针经历20 μL实时PCR反应，所述探针靶向SCN9A外显子3和外显子4的连接处。
cDNA溶液还经受对于GAPDH mRNA的qPCR扩增。SCN9A mRNA的Ct值相对于GAPDHmRNA的Ct值标准化。
图23B中的右侧图提供相对于GAPDH标准化的SCN9A qPCR数据。全长SCN9A mRNA表达水平在用"ASO 10"处理的细胞中显著地降低(student's t-检验)约45-75%。
实施例19. "ASO 10"抑制L5 DRG神经元细胞中的钠电流(1)
如下评价"ASO 10"抑制大鼠L5 DRG神经元细胞中的钠电流的能力。
[DRG神经元细胞的准备] 如在"实施例5"中所述，对雄性SD大鼠(5周龄, DaehanBiolink, South Korea, www.dbl.co.kr)进行牢固的"L5/L6结扎"。结扎后10-14天，用zoletil/rompun麻醉大鼠以提取结扎侧的L5 DRG。如下所述准备L5 DRG神经元细胞。
① 将从大鼠中急性提取的L5 DRG转移到含有0.2 mL在HBSS (Hank's平衡盐溶液溶液, 目录号14025-092, Life Technologies)中的0.125%胶原酶(胶原酶类型IV，目录号C5138-100MG, Sigma)的1.5 mL e-管中，用剪刀切成尽可能小的碎片，然后用5% CO2和95%RH在37℃、CO2孵化器中孵育20 min；② 然后将50 μL 0.25%胰蛋白酶/EDTA加入到e-管中，将其保存在孵化器中另外10 min；③ 向e-管中装入1 mL完全DMEM培养基，并以600 g经历离心沉淀5 min；④ 然后使产生的颗粒悬浮并转移到含有约15 mL Neurobasal-A培养基的15 mL密封falcon管中；⑤ 转移后约1小时，将0.5 mL细胞悬液小心地接种到层粘连蛋白-涂覆的、位于24-孔板培养皿的孔中的盖玻片上；⑥ 培养板在37℃的CO2孵化器中孵育2小时，以使细胞附着在盖玻片上。
[ASO处理] 如上准备的L5 DRG神经元细胞用"ASO 10"在0 (阴性对照)、10、30或100 zM下处理，并在孵化器中维持4小时。在补充有0.1%(v/v)吐温80的DDW中制备ASO原液。每种原液(包括仅用于阴性对照的媒介)等分加入到培养基，以含有0.0001% (v/v)吐温80用于膜片钳试验。
[人工膜片钳试验] 然后使DRG神经元细胞在钠膜片钳装置(Axopatch 200BAmplifier, Axon Instruments)上经受钠电流人工膜片钳试验。膜片钳试验通常花费4小时。因此，认为细胞已经用ASO处理4-8小时(即平均约6小时)。
[数据汇集与分析] 在几个独立的场合重复上述实验，以提高每ASO剂量的统计能力。只有来自TTX-敏感细胞的钠电流数据被包括在用于统计分析的汇集中。
图23C概述了汇总的相对于DRG神经元细胞的细胞大小标准化的钠电流数据。随着ASO浓度从10 zM增加到100 zM，钠电流逐渐减小。用100 zM "ASO 10"处理平均约6小时的细胞中的钠电流显著减少约40%。鉴于DRG神经元细胞不仅表达Nav1.7，而且还表达电压门控钠通道的其它亚型，在100 zM "ASO 10"时，所观察到的钠电流下降约40%应视为被"ASO10"敲除Nav1.7的标记。
实施例20. "ASO 10"抑制L5 DRG神经元细胞中的钠电流(2)
对来自多个供应商的大鼠进行的内部评估表明，Nav1.7在L5 DRG中的表达水平将随着年龄和供货商的不同而变化很大。如在"实施例19"中所述，评价"ASO 10"抑制不同来源的大鼠L5 DRG神经元细胞中钠电流的能力，除非另外指明。
[DRG神经元细胞的准备] 如在"实施例5"中所述，雄性SD大鼠(5周龄, HarlanLaboratories/Envigo, Denmark)经受牢固的"L5/L6结扎"。结扎后10-14天，用zoletil/rompun麻醉大鼠，用于提取结扎侧的L5 DRG。如下所述制备L5 DRG神经元细胞。
[ASO处理] 用"ASO 10"在0 (阴性对照)或100 zM下处理如上制备的L5 DRG神经元细胞，并在孵化器里保持4小时。ASO原液在DDW中制备。
在用100 zM "ASO 10"处理平均约6小时的细胞中，相对于细胞大小标准化的钠电流显著降低约55%(P<0.05) (对于阴性对照N = 14；和对于100 zM "ASO 10"，N = 15)。对于阴性对照的标准化钠电流在该实施例比在"实施例19"中高37%。因此，在来自该实施例的Harlan Laboratories的大鼠中，Nav1.7对DRG神经元细胞中的钠电流的贡献应该比来自"实施例19"的Daehan Biolink的大鼠高得多。
实施例21. "ASO 7"逆转具有脊髓神经病的大鼠的异常性疼痛(2)
如在"实施例6"中所述，评价"ASO 7"逆转具有由"L5/L6结扎"诱导的脊髓神经病的大鼠的异常性疼痛的能力，除非另外指明。
[SNL手术和分组] 在第-10天，使雄性SD大鼠(5周龄, Daehan Biolink, SouthKorea, www.dbl.co.kr)经受"L5/L6结扎"。在第0天，基于在第0天的最低的单独von Frey评分选择48只动物，并随机分成6组：阴性对照组(即，无ASO处理)、普瑞巴林30 mg/Kg和 5、25、125和625 fmole/Kg "ASO 7"的4个处理组(每组8只动物)。
[ASO处理和Von Frey评分] 大鼠在第0、3、6和9天下午，皮下接受0 (阴性对照)、1、3或6 pmole/Kg的"ASO 7"。通过在"实施例5"中所述的电子von Frey评分法在早晨对异常性疼痛进行评分。普瑞巴林是在每次von Fret评分场合前一小时口服给予的。ASO作为补充有0.1%吐温80的PBS溶液给予。
[异常性疼痛的逆转] 图24A总结了von Frey评分的观测结果。阴性对照组动物在第4-8天内呈现出稳定在约6 g的平均von Frey评分(缩回阈值)。同时，普瑞巴林30 mg/Kg组(即，阳性对照组)显示出稳定在约10 g的平均von Frey评分。鉴于在幼稚动物(即未结扎和治疗)中观察到约21 g的平均von Frey评分，普瑞巴林处理组在第2、4和6天明显逆转异常性疼痛20-30%。
"ASO 7"在5 fmole/Kg时在第2-8天，在25和125 fmole/Kg时在第2、4和6天，和在625 fmole/Kg时在第4和6天，显著地逆转(student's t-检验)异常性疼痛。最活跃的组是5fmole/Kg组，尽管在各ASO处理组之间没有显著差异。普瑞巴林也在第2-8天期间显著地逆转异常性疼痛20-30%。最活跃的组是显示出逆转异常性疼痛约40%的5 fmole/Kg组，尽管在各ASO处理组之间没有显著差异。然而，处理组的效果与普瑞巴林组的效果没有显著差异。
实施例22. "ASO 2"针对大鼠亚慢性炎性疼痛的镇痛作用
如下所述，评价"ASO 2"抑制通过足底注射弗氏完全佐剂(FCA)受害的大鼠的亚慢性炎性疼痛的能力。
[亚慢性炎症的诱导] 在第-17天，雄性SD大鼠(7周龄)在左后爪接受足底注射100μL FCA (目录号F5881-6X10ML, Sigma)。
[炎性疼痛评分和分组] 通过Randall-Selitto试验，使用电子Randall-Selitto装置[2390型, IITC Life sciences]，对左后爪的炎性疼痛进行评分。在疼痛评分之前，大鼠在吊床上适应10分钟(每组N = 5)。
在第0天，选择在数天内稳定地显示出最低疼痛阈值评分的10只动物用于分组。将10只动物分成2组：阴性对照组(无ASO处理)和处理组("ASO 2" 100 pmole/Kg)。
[ASO处理和疼痛评估] 处理组动物在第0天下午和第1天早晨接受100 pmole/Kg的"ASO 2"。使ASO溶于PBS并皮下给予。在第1天给药后2小时，和在第4天早晨，评价疼痛。
[镇痛活性] 图24B总结了观察到的疼痛评分。与第0天的值相比，ASO处理组在第1天的疼痛阈值增加至约27 g，而阴性对照组的阈值下降到约3 g。爪水肿诱发前的疼痛阈值是约23 g。因此ASO给予完全逆转炎性疼痛至无爪水肿的水平。然而，"ASO 2"的镇痛活性在第4天完全清除。

Claims (11)

1.一种用于诱导人SCN9A前mRNA内的外显子4跳跃的由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为10-25之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前-mRNA完全互补，或者与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn表示氢代[H]基团；
X和Y独立地表示氢代或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和，
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代基团；
L1、L2和L3为由式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
其中，
Q1和Qm为亚甲基(-CH2-)，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧(-O-)基团；和，
m为1-15之间的整数。
2.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-21之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补，或者与人类SCN9A前mRNA具有1或2个错配而部分互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代基团；
Q1和Qm为取代或未取代的亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基和氧基团；和，
m为1-11之间的整数。
3.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代基团；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和，
m为1-9之间的整数。
4.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和，
m为1-8之间的整数。
5.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和，
m为1-8之间的整数。
6.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA内的[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]的14-聚体前mRNA序列具有至少10-聚体互补重叠；
式I化合物与人类SCN9A前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X是氢代基团；
Y表示取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接连接于碱性氨基；和，
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接连接于碱性氨基。
7.依据权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述肽核酸衍生物选自以下提供的肽核酸衍生物：
(N→C)Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2；
(N→C)Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2；
(N→C)Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2；和
(N→C)Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2：
其中，
A、G、T和C为分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；C(pOq)、A(p)和G(p)为分别具有由式VI、式VII和式IX表示的非天然核碱基的PNA单体：
其中，
p和q是整数；和，
N-和C-末端取代基的缩写具体定义如下：“Fethoc-”为“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”的缩写；和“-NH2”为未取代的“-氨基”的缩写。
8.权利要求1-7中任一项的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗涉及Nav1.7活性的病症或疼痛的药物中的用途。
9.权利要求1-7中任一项的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗慢性疼痛的药物中的用途。
10.权利要求1-7中任一项的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经性疼痛的药物中的用途。
11.权利要求1-7中任一项的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗涉及Nav1.7活性的疼痛的药物中的用途。
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