CN110072879B - 雄激素受体反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了靶向人雄激素受体前‑mRNA内的"外显子5"的5'剪接位点的肽核酸衍生物。肽核酸衍生物有效地诱导细胞内雄激素受体mRNA的剪接变体，并且在局部给药时可用于安全地治疗与雄激素活性有关的皮肤病学适应症或病症。

Description

雄激素受体反义寡核苷酸
本发明涉及靶向雄激素受体前mRNA的肽核酸衍生物，用于治疗由雄激素活性介导的皮肤病学适应症或病症，并要求2016年8月8日提交的美国临时申请号62/372035的优先权益，其通过引用以其整体并入本文。
发明背景
脱发症是一种以最初在头皮上的头发丢失和头发稀疏为特征的病症。雄激素性脱发，也称为“男性型秃发”，是由毛囊和周围组织中明显的雄激素活性引起的。
虽然雄激素性脱发影响男性和女性二者，但这种病症在男性和女性中的表现往往有所不同。男性可能经历斑秃，而女性更可能经历在头皮上的全面头发稀疏。雄激素性脱发在30-50岁男性中的流行率是大约58% [J. Invest. Dermatol. vol 9, 296-300(1997)]。雄激素性脱发是由称为雄激素的男性类固醇激素的变化引起的[New Engl. J. Med. vol 341, 491-7 (1999)；Mol. Cell Endocrinol. vol 198, 89-95 (2002)]。
雄激素调节皮脂腺中皮脂的释放、毛囊中的毛发生长、全身性欲等。雄激素刺激小毫毛囊的逐渐转化，使某些区域的无色素、细而短的毛发变成更大的终末毛囊(如面部)。然而，与这种对终末毛囊的雄激素作用形成对比的是，在鬓角和头顶上，终末毛囊逐渐退化为毫毛囊，这通常被称为“雄激素反常”[Expert Opin. Drug Discov. vol 10, 269-292(2015)]。
雄激素性脱发和DHT：5a-还原酶将睾酮还原成5α-二氢睾酮(DHT)，一种比睾酮更强烈和有效的雄激素。与非秃头男性相比，在年轻秃头男性中观察到前额生长初期毛囊中DHT的生成显著增加[(Ind. J. Dermatol. Vene. Leprol. vol 79, 613-625 (2013)]。雄激素性脱发的男性比无雄激素性脱发的男性倾向于表现出较低水平的"总睾酮"。相反，雄激素性脱发男性的DHT水平高于无雄激素性脱发的男性。DHT通过5α-还原酶从睾酮产生。雄激素性脱发的男性比无雄激素性脱发的男性在毛囊中表达更高水平的5α-还原酶。DHT是毛囊的小型化和因此雄激素性脱发的主要原因[Endocrinology, vol 151, 2373-2380(2010)]。
非那雄胺和度他雄胺抑制5α-还原酶，因而降低毛囊及周围组织中雄激素受体可利用的DHT水平。这两种小分子抑制剂被用来治疗男性型秃发，尽管源于全身雄激素活性的下调的不良反应。不良反应包括性功能障碍、头晕、虚弱、头痛、流鼻涕、皮疹等[New Engl. J. Med. vol 362, 1237-8 (2010)]。
局部AR拮抗剂：雄激素通过与雄激素受体(AR)结合来表达其药理活性。AR拮抗剂结合于AR并抑制雄激素的生理学功能，因此如果适当地递送到毛囊和周围组织，可被用来治疗雄激素性脱发。为了避免因抑制全身雄激素活性而产生的副作用，将AR拮抗剂直接局部应用于头皮组织。
酮康唑除了其著名的抗真菌活性外，还具有弱的AR拮抗活性。含有2%酮康唑的洗发水(商品名为Nizoral®)已用来局部治疗雄激素性头发丢失[J. Dermatol. Sci. vol 45(1), 66-68 (2007)]。
topilutamide是一种名为fludiril的AR拮抗剂。topilutamide在许多欧洲国家作为2%局部制剂以商品名"Eucapil"上市以治疗雄激素性脱发[Dermatol. Surg. vol 28(8), 678-685 (2002)]。
在毛囊中的AR蛋白或mRNA：在患有雄激素性脱发的男性和女性受试者中，发现在前额毛囊中的AR表达高于在枕部毛囊中[J. Investig. Dermatol. vol 109, 296-300(1997)]。如果在毛囊和周围组织中用药物选择性地下调AR表达，这种药物可以安全地治疗雄激素性脱发，而不会招致因雄激素活性的全身下调引起的不良事件。在另一篇文献中，发现具有雄激素性脱发的女性显示在前额和头顶毛囊中的AR mRNA水平高于在枕部毛囊中[Genetics Mol. Res. vol 12(2), 1834-1840 (2013)]。
核糖体蛋白合成：蛋白由DNA (2-脱氧核糖核酸)编码。响应于细胞刺激，DNA被转录，在细胞核中产生前-mRNA (前信使核糖核酸)。前-mRNA的内含子经酶剪接掉，得到mRNA(信使核糖核酸)，其然后被易位到胞质室中。在胞质溶胶中，称为核糖体的翻译机器的复合体与mRNA结合，并在其扫描沿mRNA编码的遗传信息时进行蛋白质合成[Biochemistry vol41, 4503-4510 (2002)；Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)]。
以序列特异性方式(即互补地)与RNA结合的寡核苷酸被称为反义寡核苷酸(ASO)。ASO可与mRNA紧密结合，并抑制在胞质溶胶中核糖体沿mRNA的蛋白合成。ASO需要存在于细胞内，以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白合成。
剪接过程：DNA被转录以在细胞核中产生前-mRNA (前信使核糖核酸)。然后，在内含子通过一系列复杂的反应(统称为"剪接")缺失后，前-mRNA被加工成mRNA，如下图示意性概述的[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003)；Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005)；Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]。
剪接通过在前-mRNA和剪接适配子因子之间形成"剪接体E复合体" (即早期剪接体复合体)来启动。在"剪接体E复合体"中，U1与外显子N和内含子N的连接处结合，和U2AF35与内含子N和外显子(N+1)的连接处结合。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接处对于早期剪接体复合体的形成至关重要。"剪接体E复合体"在与U2另外复合后发展为"剪接体A复合体"。"剪接体A复合体"经历一系列复杂的反应来缺失或剪接掉内含子以连接相邻的外显子。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
剪接的反义抑制：在细胞核内，ASO可能与前-mRNA内某一位置紧密结合，并可干扰前-mRNA剪接为mRNA的过程，产生缺乏靶外显子的全长mRNA或mRNA变体。这样的mRNA被称为"剪接变体"，编码小于由全长mRNA编码的蛋白的蛋白。
原则上，剪接可以通过抑制"剪接体E复合体"的形成而中断。如果ASO与(5' →3')外显子-内含子的连接处(即"5'剪接位点")紧密结合，ASO阻断前-mRNA和因子U1之间的复合体形成，因此阻断"剪接体E复合体"的形成。同样，如果ASO与(5' → 3')内含子-外显子的连接处(即"3'剪接位点")紧密结合，不能形成"剪接体E复合体"。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸容易被内源性核酸酶降解，限制了其治疗功用。到目前为止，大量的非天然寡核苷酸已经得到广泛开发和研究[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.vol 33, 533-540 (2006)]。与DNA和RNA相比，发现它们中的一些显示出延长的代谢稳定性。以下提供一些代表性的非天然寡核苷酸的化学结构。这样的寡核苷酸可预测地与其互补核酸结合，就像DNA或RNA一样。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
硫代磷酸寡核苷酸：硫代磷酸寡核苷酸(PTO)是一种DNA类似物，其中每个单体中骨架磷酸氧原子之一被硫原子替换。这样的小的结构变化使PTO相对抵抗被核酸酶的降解[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)]。
反映了PTO和DNA之间骨架的结构相似性，它们在大多数哺乳动物细胞类型中都很难穿透细胞膜。然而，对于大量表达DNA转运蛋白的某些类型的细胞来说，DNA和PTO显示出良好的细胞摄取。已知全身给予的PTO可容易地分布至肝脏和肾脏[Nucleic Acids Res.vol 25, 3290-3296 (1997)]。
为了提高PTO的体外细胞膜通透性，脂质转染法已经得到了广泛实践。然而，脂质转染法物理改变细胞膜，引起细胞毒性，因此对于长期治疗应用而言是不安全的。
在过去的30年里，反义PTO和PTO的变体已被临床评估以治疗癌症、免疫病症、代谢疾病等[Biochemistryvol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.vol 33, 533-540 (2006)]。许多这样的反义药物候选物还没有成功开发，部分原因是PTO的细胞膜通透性差。为了克服差的膜通透性，对于治疗活性，需要给予高剂量的PTO。然而，已知PTO与剂量限制毒性有关，包括增加凝血时间、补体活化、肾小管肾病、库普弗细胞活化和免疫刺激(包括脾肿大、淋巴增生、单核细胞浸润) [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.vol 33, 533-540 (2006)]。
许多反义PTO被发现对显著归因于肝脏或肾脏的疾病表现出了适当的临床活性。米泊美生(Mipomersen)是一种PTO类似物，它抑制apoB-100的合成，apoB-100是一种参与LDL胆固醇运输的蛋白。米泊美生在某些动脉粥样硬化患者人群中表现出了适当的临床活性，这很可能是由于它在肝脏中的优先分布[Circulation vol 118(7), 743-753(2008)]。ISIS-113715是一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)的合成的PTO反义类似物，并发现在II型糖尿病患者中有治疗活性[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336(2004)]。
锁核酸：在锁核酸(LNA)中，RNA的骨架核糖环在结构上受到限制，以增加对RNA或DNA的结合亲和力。因此，LNA可以被认为是一种高亲和力的DNA或RNA类似物[Biochemistryvol 45, 7347-7355 (2006)]。像PTO一样，LNA也显示差的细胞膜通透性。
二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸：在二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO)中，DNA的骨架磷酸和2-脱氧核糖分别被亚氨基磷酸和吗啉替换[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol71, 575-586 (2006)]。尽管DNA骨架带负电，但PMO骨架不带电。因此，PMO和mRNA之间的结合不受骨架之间的静电排斥，而且倾向于比DNA和mRNA之间的结合更强。由于PMO与DNA在结构上有很大的不同，所以PMO将不会被识别DNA或RNA的肝转运蛋白识别。然而，PMO也不容易穿透细胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)是一种具有N-(2-氨基乙基)甘氨酸作为单元骨架的多肽，并由Nielsen博士及其同事发现[Science vol 254, 1497-1500 (1991)]。原型PNA的化学结构和缩写名称用下文提供的图举例说明。像DNA和RNA一样，PNA也选择性地与互补核酸结合[Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]。在与互补核酸结合时，PNA的N-末端被视为相当于DNA或RNA的"5'-端"，而PNA的C-末端被视为相当于DNA或RNA的"3'-端"。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
同PMO一样，PNA骨架是不带电的。因此，PNA和RNA之间的结合倾向于比DNA和RNA之间的结合更强。因为PNA与DNA在化学结构上有明显的不同，所以PNA不会被识别DNA的肝转运蛋白识别，并且显示出与DNA或PTO不同的组织分布特征。然而，PNA也很难穿透哺乳动物细胞膜(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)。
提高PNA的膜通透性的修饰的核碱基：通过引入共价连接阳离子脂质或其等价物的修饰的核碱基，使PNA对哺乳动物细胞膜是高度可渗透的。这样的修饰的核碱基的化学结构见上文。已发现胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的这样的修饰的核碱基分别与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶可预测地和互补地杂交[PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253]。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
将这样的修饰的核碱基掺入到PNA上类似于脂质转染法的情况。通过脂质转染法，寡核苷酸分子用阳离子脂质分子(如lipofectamine)包裹，并且与裸寡核苷酸分子相比，这种lipofectamine/寡核苷酸复合体倾向于更容易穿透细胞膜。
除了良好的膜通透性外，发现那些PNA衍生物还对互补核酸具有极强的亲和力。例如，将4-5个修饰的核碱基引入到11-至13-聚体PNA衍生物上，在与互补DNA形成的双链体中，容易获得20℃或更高的Tm增加。这样的PNA衍生物对单碱基错配高度敏感。单碱基错配导致Tm丢失11-22℃，这取决于修饰的碱基的类型以及PNA序列。
AR反义寡核苷酸(AR ASO)：在原则上，靶向AR mRNA的ASO可抑制雄激素受体的核糖体蛋白合成。有报道称，AR ASO抑制AR在细胞中的表达。例如，EZN-4176，一种互补靶向ARmRNA的LNA/DNA gapmer，下调了前列腺癌的动物模型的肿瘤中以及肿瘤细胞中的AR表达[Mol. Cancer. Ther. vol 10(12), 2309-2319 (2011)]。
靶向AR mRNA的外显子1或者外显子8的ASO抑制了在对用恩杂鲁胺(Enzalutamide) (一种AR拮抗剂)化疗抵抗的前列腺癌的动物模型的肿瘤中以及前列腺癌细胞中的AR表达[Clin. Cancer Res. vol 21(7), 1675-1687 (2015)]。
局部应用AR ASO下调毛囊中的AR：下调毛囊及周围组织中雄激素的活性可通过抑制毛囊及周围组织中的AR表达实现。如果ASO被递送到毛囊和周围组织中，则毛囊中的AR表达可用AR ASO下调。
为了避免因全身雄激素活性下调所致的副作用，需要在毛囊和周围组织中局部下调AR表达，以治疗雄激素性脱发。如果ASO被制备或配制成容易递送至毛囊中，在头皮上局部应用AR ASO是在毛囊和周围组织中局部抑制AR表达的最安全的方式。迄今为止，AR ASO几乎没有用于雄激素性脱发的局部治疗。AR ASO已被评价主要用于全身给药以治疗对雄激素剥夺疗法抵抗的前列腺癌。
附图简述
图1(A)-(C). 对式I的肽核酸衍生物可选择的天然或非天然(修饰)的核碱基的实例。
图2(A)-(E). 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代基的实例。
图3. 具有天然或修饰的核碱基的PNA单体的化学结构。
图4. N-或C-末端取代基的缩写的化学结构。
图5(A). "(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的PNA衍生物的化学结构。
图5(B). "(N → C)苯甲酰基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的PNA衍生物的化学结构。
图6. 用来合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。
图7(A)-(B). 分别在HPLC纯化之前和之后"ASO 1"的C18-反相HPLC色谱图。
图8(A). 用0 aM (阴性对照)、3 aM、30 aM、300 aM或3 fM "ASO 5"处理的MCF7细胞的巢式PCR产物的电泳分析。
图8(B). 外显子4-5跳跃的PCR条带的示意图和测序数据。
图9(A). 用0 zM (阴性对照)，或1 zM-1 aM的"ASO 5"处理5小时的MCF7细胞中外显子4-6的相对水平变化(统计分析用student's t-检验进行)。
图9(B). 用0 zM (阴性对照)，或1 zM-1 aM的"ASO 1"处理5小时的MCF7细胞中外显子4-6的相对水平变化(统计分析用student's t-检验进行)。
图9(C). 用0 zM (阴性对照)，或1 zM-1 aM的"ASO 10"处理5小时的MCF7细胞中外显子4-6的相对水平变化(统计分析用student's t-检验进行)。
图10(A). 用0 zM (阴性对照)，或100 zM-300 aM的"ASO 1"处理的MCF7细胞的蛋白质印迹数据。
图10(B). 用0 zM (阴性对照)，或10 zM-30 aM的"ASO 5"处理的MCF7细胞的蛋白质印迹数据。
图11(A). 对于毛发去除后的天数，在毛发去除的皮肤区域中按组的毛发生长图像。
图11(B). 相对于阴性对照(媒介)组，"ASO 1"治疗组的相对亮度评分(统计分析用student's t-检验进行)。
图12. 从用0 fM (阴性对照，媒介)、0.2 fM或1 fM的"ASO 1"治疗的动物获得的皮肤样品的AR IHC (红色)和DAPI (蓝色)荧光图像的代表性集合。
图13. "ASO 5"治疗组相对于阴性对照(媒介)组的相对亮度评分(统计分析用student's t-检验进行)。
图14(A). "ASO 10"治疗组相对于阴性对照(媒介)组的相对亮度评分(统计分析用student's t-检验进行)。
图14(B). 从用0 (阴性对照，媒介)、1、5或25 fM的"ASO 10"治疗的动物获得的皮肤样品的AR IHC (红色)和DAPI (蓝色)荧光图像的代表性集合。
图15. 用0 (阴性对照)、1、10、100或1,000 zM的"ASO 10"处理24小时的MCF7细胞中，相对于阴性对照，通过TaqMan测定的相对AR mRNA水平的qPCR数据(统计分析用student's t-检验进行)。
图16. 从用0 (阴性对照)、0.01或0.1 pmole/Kg的"ASO 10"经皮下给予(2X每周，持续4周)的小鼠获得的组织样品的AR IHC (红色)和DAPI (蓝色)荧光图像的代表性集合。
发明概述
本发明提供一种由式I表示的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
其中，
n是10-21的整数；
式I化合物与人雄激素受体前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少9-聚体互补重叠；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代、氢代、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代[H]、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基，或取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少4个独立地选自具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基的非天然核碱基。
式I化合物诱导人AR前-mRNA的可变剪接，得到缺乏"外显子5"的AR mRNA剪接变体，因而在局部给药时可用于安全地治疗与雄激素活性有关的皮肤病学适应症或病症。
发明描述
本发明提供一种由式I表示的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
其中，
n是10-21的整数；
式I化合物与人雄激素受体前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少9-聚体互补重叠；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代、氢代、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代[H]、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基，或取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少4个独立地选自具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基的非天然核碱基。
式I化合物诱导人AR前-mRNA的可变剪接，得到缺乏"外显子5"的AR mRNA剪接变体，因而在局部给药时可用于安全地治疗与雄激素活性有关的皮肤病学适应症或病症。
"n是10-21的整数"的条件字面上表示n是可从一组整数11、12、13、14、15、16、17、18、19和20选择的整数。
式I化合物紧密结合于从人AR基因[NCBI参考序列: NC_000023.11]转录的人AR前-mRNA的"外显子5"的5'剪接位点。由来自"外显子5"的20-聚体和来自"内含子5"的20-聚体组成的40-聚体AR前-mRNA序列明确地读为[(5' → 3') GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG-GUAAGGAAAAGGGAAGUGGG]，尽管外显子和内含子号可根据AR mRNA转录子而变化。40-聚体前-mRNA序列可备选地表示为[(5' → 3') GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG┃guaaggaaaagggaaguggg]，其中外显子和内含子序列分别用"大写"和"小写"字母表示，外显子/内含子连接处用"┃"表示。
用于描述本发明的式I化合物的[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体前-mRNA序列由AR "外显子5"中的9-聚体和AR "内含子5"中的8-聚体组成。因此17-聚体前-mRNA序列可备选地读为[(5' →3') CCUUGCCUG┃guaaggaa]。
式I化合物紧密结合于人AR前-mRNA中的外显子5的靶5'剪接位点，并干扰涉及化合物的靶外显子的"剪接体早期复合体"的形成。因为本发明的化合物在空间上抑制"剪接体早期复合体"的形成，AR "外显子5"被剪接掉以产生AR mRNA剪接变体或缺乏"外显子5"的变体。因此本发明的化合物诱导"外显子5"的跳跃。
式I化合物紧密结合于互补DNA，如在现有技术[PCT/KR2009/001256]中举例说明的。式I的PNA衍生物及其全长互补DNA或RNA之间的双链体显示Tm值过高，无法在水性缓冲液中可靠地测定。式I的PNA化合物与较短长度(例如10-聚体)的互补DNA仍然得到高的Tm值。
由于高结合亲和力，本发明的PNA衍生物有效地诱导细胞中"外显子5"的跳跃，甚至与"外显子5"的5'剪接位点有小至9-聚体的互补重叠也是如此，但如此少量的重叠可能增加与其他前-mRNA交叉反应性的风险。如果本发明的PNA衍生物被用于局部治疗目的，则预测交叉反应性的风险将大大减弱。
式I的PNA衍生物的天然或非天然核碱基的化学结构在图1(A)-(C)中举例说明。本发明的天然(即天然存在的)或非天然(即非-天然存在的)核碱基包含但不限于在图1(A)-(C)中提供的核碱基。提供这样的非天然核碱基是为了说明允许的核碱基的多样性，因此不应被解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以很容易地发现，非天然核碱基的变化对于式I的PNA化合物中的特定位置是可能的，只要这样的变化符合与其靶前-mRNA序列的所需互补性。
图2(A)-(E)举例说明了用于描述式I的PNA衍生物的取代基。图2(A)提供取代或未取代的烷基的例子。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的烷基酰基芳基酰基在图2(B)中举例说明。图2(C)举例说明了取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基或芳基磺酰基，和取代或未取代的烷基膦酰基或芳基膦酰基的例子。图2(D)提供了取代或未取代的烷氧基羰基或芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基或芳基氨基羰基的例子。图2(E)提供了取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基，和取代或未取代的芳氧基硫代羰基的例子。提供这样的示例性取代基是为了说明允许的取代基的多样性，因此不应被解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以很容易地发现，寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶前-mRNA序列的序列特异性结合的最重要因素，超过在N-末端或C-末端的取代基。
式I化合物具有良好的细胞通透性，如果作为"裸"寡核苷酸处理，可以很容易地递送到细胞中，如在现有技术[PCT/KR2009/001256]中举例说明的。因此，本发明的化合物在用式I化合物作为"裸"寡核苷酸处理的细胞中诱导"外显子5"在人AR前-mRNA中的跳跃，以产生缺乏AR "外显子5"的AR mRNA剪接变体。式I化合物不需要用于递送到细胞内以有效地在细胞内诱导靶外显子的跳跃的任何方法或制剂。式I化合物容易地在用亚飞摩尔浓度的本发明化合物作为"裸"寡核苷酸处理的细胞中诱导AR "外显子5"的跳跃。
由于良好的细胞或膜通透性，可将式I的PNA衍生物作为"裸"寡核苷酸局部给予，来诱导目标皮肤中AR "外显子5"的跳跃。式I化合物不需要制剂来增加用于局部治疗或生物活性的经皮递送。通常，式I化合物溶于水和共溶剂中，并在亚皮摩尔浓度下局部或经皮给药，以引发目标皮肤所需的治疗或生物活性。本发明的化合物不需要大量或侵入性配制以引发局部治疗活性。
式I化合物可与药学上可接受的酸或碱结合使用，所述酸或碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。
式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的辅助剂组合给予受试者，所述辅助剂包括但不限于柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。
本发明的化合物可在范围从1 aM至大于1 nM的治疗或生物有效浓度下局部给予受试者，所述浓度根据给药时间表、受试者的病症或情况等而变化。
优选的是式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10-21的整数；
式I化合物与人雄激素受体前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少9-聚体互补重叠；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代、氢代、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代[H]、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基，或取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少3个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代，和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价键，它将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)，和取代或未取代的氨基[-N(H)-，或–N(取代基)-]；和
m是1-15的整数。
感兴趣的是式I的PNA寡聚体，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10-18的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少9-聚体互补重叠；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基，或取代或未取代的芳氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代，和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧和氨基；和
m是1-11的整数。
特别感兴趣的是式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11-16的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体AR前-mRNA序列具有至少11-聚体互补重叠；
式I化合物与人AR前-mRNA内的前-mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地选自氢代、取代或未取代的烷基酰基，或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代，和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自亚甲基、氧和氨基；和
m是1-10的整数。
高度感兴趣的是式I的PNA寡聚体，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11-16的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少12-聚体互补重叠；
式I化合物与人AR前-mRNA内的前-mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地选自氢代、取代或未取代的烷基酰基，或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢代基团，和R2、R4和R6独立地表示氢代，或取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基团；和
m是1-10的整数。
更高度感兴趣的是式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11-16的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少12-聚体互补重叠；
式I化合物与人AR前-mRNA内的前-mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X和Y独立地选自氢代、取代或未取代的烷基酰基，或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶，和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
Q1和Qm是亚甲基，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和
m是1-8的整数。
最高度感兴趣的是式I的PNA衍生物，或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11-15的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少11-聚体互补重叠；
式I化合物与人AR前-mRNA内的前-mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X是氢代基团；
Y表示取代或未取代的烷基酰基，或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶，和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
L1表示右端直接连接到碱性氨基的-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-；和，
L2和L3独立地选自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-，其右端与碱性氨基直接相连。
特别感兴趣的是式I的PNA衍生物，其选自以下提供的化合物，或其药学上可接受的盐：
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Ac-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Piv-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 甲基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 正丙基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fmoc-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-Lys-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fmoc-Val-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2；
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-TG(6)C(1O5)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2；
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2；
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 对甲苯磺酰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GT-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)A(5)A-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-AG(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-Arg-NH2；
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) 苄基-C(1O2)TT-A(2O2)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) 苯基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Val-Lys-NH2；
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fmoc-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2；
(N → C) Piv-Arg-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2；
(N → C) N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) [N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-Leu-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O3)TT-A(5)CC-A(5)GG(5)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2；
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2；
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2；
(N → C) Me-Gly-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2；
(N → C) Fethoc-Lys-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-NH2；和
(N → C) Fethoc-Arg-TCC(1O2)-TTA(5)-CCA(6)-GG(5)C-Lys-NH2；
其中，
A、G、T和C是分别含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)是具有分别由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体；
Figure DEST_PATH_IMAGE019
其中，
p和q是整数；和，
对于N-和C-末端取代基的缩写具体描述如下："Fmoc-"是表示"[(9-芴基)甲氧基]羰基-"的缩写；"Fethoc-"表示"[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基"；"Ac-"表示"乙酰基-"；"苯甲酰基-"表示"苯羰基-"；"Piv-"表示"新戊酰基-"；"Methyl-"表示"甲基-"；"正丙基-"表示"1-(正丙基)-"；"H-"表示"氢代-"基团；"对甲苯磺酰基"表示"(4-甲基苯)-1-磺酰基-"；"-Lys-"表示氨基酸残基"赖氨酸"；"-Val-"表示氨基酸残基"缬氨酸"；"-Leu-"表示氨基酸残基"亮氨酸"；"-Arg-"表示氨基酸残基"精氨酸"；"-Gly-"表示氨基酸残基"甘氨酸"；"[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-"表示"[N-1-(2-苯基乙基)氨基]羰基-"；"苄基-"表示"1-(苯基)甲基-"；"Phenyl-"表示"苯基-"；"Me-"表示"甲基-"；和"-NH2"表示未取代的"-氨基"基团。
图3集体和明确地提供了缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。如在现有技术[PCT/KR2009/001256]中讨论的，C(pOq)被视为"修饰的胞嘧啶" PNA单体，这是因为它与"鸟嘌呤"杂交。A(p)和A(pOq)被视为"修饰的腺嘌呤" PNA单体，这是因为它们与"胸腺嘧啶"杂交。同样地，G(p)和G(pOq)被视为"修饰的鸟嘌呤" PNA单体，这是因为它们与"胞嘧啶"碱基配对。
图4明确地说明了取代基的各种缩写的化学结构，这些取代基用于使本发明的式I的PNA衍生物的N-末端或C-末端多样化。
为了说明PNA衍生物的缩写，缩写为"(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的PNA衍生物的化学结构在图5(A)中提供。作为另一个示例说明，缩写为"(N → C)苯甲酰基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的PNA衍生物的化学结构在图5(B)中提供。
在结合于其与前-mRNA互补结合中，"(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的13-聚体PNA序列相当于"(5' → 3') GAA-GCC-AGG-CAA-G"的DNA序列。该13-聚体PNA与在人AR前-mRNA内跨越"外显子5"和"内含子5"连接处的20-聚体RNA序列[(5' → 3') GCCUUGCCUG┃g"uaag"gaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的9-聚体序列具有9-聚体互补重叠。值得注意的是，"内含子5"中的4个单一错配被标记为"uaag"。
"(N → C)苯甲酰基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"的13-聚体PNA序列相当于"(5' → 3') CTT-ACC-AGG-CAA-G"的DNA序列，其与在人AR前-mRNA内跨越"外显子5"和"内含子5"连接处的20-聚体RNA序列[(5' → 3')GCCUUGCCUG┃guaaggaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的13-聚体序列具有13-聚体互补重叠。
"(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2"的13-聚体PNA序列相当于"(5' → 3') CTT-ACC-AGG-CTA-G"的DNA序列，其与在人AR前-mRNA内跨越"外显子5"和"内含子5"连接处的20-聚体RNA序列[(5' → 3') GCCU"U"GCCUG┃guaaggaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的12-聚体序列具有12-聚体互补重叠。值得注意的是，外显子5中的单一错配标记为"U"。
"(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2"的17-聚体PNA序列相当于"(5' → 3') TTT-TCC-TTA-CCA-GGC-AA"的DNA序列，其与在人AR前-mRNA内跨越"外显子5"和"内含子5"连接处的20-聚体RNA序列[(5' → 3') GCCUUGCCUG┃guaaggaaaa ]中标记为"黑体"和"带下划线"的17-聚体序列具有17-聚体互补重叠。
本发明提供一种式I的PNA衍生物，其选自下面列出的特别优选的化合物，或其药学上可接受的盐：
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2；
(N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2；
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-TG(6)C(1O2)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2；
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2；
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 对甲苯磺酰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2；
(N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2；
(N → C) N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2；
(N → C) [N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2；
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2；
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2；和
(N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2。
发明详述
制备PNA寡聚体的通用程序
PNA寡聚体根据现有技术[US6,133,444；WO96/40685]中公开的方法，对其进行了细微而适当的修改，通过基于Fmoc-化学的固相肽合成法(SPPS)进行合成。在本研究中采用的固体载体是从PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)购买的H-Rink Amide-ChemMatrix。按现有技术[PCT/KR 2009/001256]所述或经细微修改，合成了具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体。这样的具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体和具有天然存在的核碱基的Fmoc-PNA单体被用来合成本发明的PNA衍生物。PNA寡聚体通过C18-反相HPLC (水/乙腈或水/甲醇(含0.1% TFA))纯化并通过质谱法进行特征鉴定。
方案1举例说明了用于本发明的SPPS的典型单体延长循环，并在下文提供了程序细节。然而，对于本领域的技术人员来说，在自动肽合成器或人工肽合成器上有效地运行这类SPPS反应方面，许多细微的变化是明显可能的。方案1中的每个反应步骤如下简要提供。
方案1
Figure DEST_PATH_IMAGE021
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化]将在1.5mL 20%哌啶/DMF中的0.01mmol(约20mg树脂) ChemMatrix树脂在libra管中涡旋20min，和过滤掉DeFmoc溶液。树脂用1.5 mL二氯甲烷(MC)、1.5 mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC连续洗涤各30sec。固体载体上所得到的游离胺进行与Fmoc-PNA单体或者与Fmoc-保护的氨基酸衍生物的偶联。
[DeFmoc]将树脂在1.5 mL 20%哌啶/DMF中涡旋7 min，和过滤掉DeFmoc溶液。树脂用1.5 mLMC、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续洗涤各30 sec。固体载体上所得到的游离胺立即进行与Fmoc-PNA单体的偶联。
[与Fmoc-PNA单体的偶联]固体载体上的游离胺与Fmoc-PNA单体如下偶联。将0.04mmol PNA单体、0.05 mmol HBTU和10 mmol DIEA在1 mL无水DMF中孵育2 min，并加入到含游离胺的树脂中。将树脂溶液涡旋1小时并过滤掉反应介质。然后树脂用1.5 mL MC、1.5 mLDMF和1.5 mL MC连续洗涤各30 sec。用于本发明的含有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体的化学结构在图6中提供。在图6中提供的含有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体应作为例子，因而不应视为限制本发明的范围。本领域技术人员可以很容易地找出合成式I的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的许多变化。
[封端]偶联反应后，通过在1.5 mL 封端溶液(在DMF中5%乙酸酐和6% 2,6-二甲基吡啶)中振荡5 min，使未反应的游离胺封端。然后过滤掉封端溶液并用1.5 mL MC、1.5 mLDMF和1.5 mL MC连续洗涤各30 sec。
[在N-末端引入"Fethoc-"基团] 通过使树脂上的游离胺与"Fethoc-OSu"在碱性偶联条件下反应，将"Fethoc-"基团引入N-末端。"Fethoc-OSu" [CAS No. 179337-69-0,C20H17NO5, MW 351.36]的化学结构提供如下。
Figure DEST_PATH_IMAGE023
[从树脂裂解] 通过在1.5 mL裂解溶液(在三氟乙酸中2.5%三异丙基硅烷和2.5%水)中振荡3小时，从树脂裂解结合于树脂的PNA寡聚体。过滤掉树脂并在减压下浓缩滤液。残留物用乙醚研磨，和通过过滤收集得到的沉淀，用于通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化] 从树脂裂解后，PNA衍生物的粗产物通过C18-反相HPLC纯化，用含有0.1% TFA的水/乙腈或水/甲醇(梯度方法)洗脱。图7 (A)和7(B)是分别在HPLC纯化之前和之后"ASO 1"的示例性HPLC色谱图。"ASO 1"的寡聚体序列如在表1中所提供。
式I的PNA衍生物的合成实施例
本发明的PNA衍生物按照以上提供的合成程序或经过细微修改来制备。表1提供本发明的AR ASO的实例以及通过质谱的结构表征数据。表1中提供AR ASO是为了举例说明式I的PNA衍生物，和不应解释为限制本发明的范围。
表1. 式I的PNA衍生物和通过质谱的结构鉴定
Figure DEST_PATH_IMAGE025
PNA对10-聚体互补DNA的结合亲和力
评价表1中的PNA衍生物对互补靶向N-末端或者C-末端的10-聚体DNA的结合亲和力。结合亲和力通过PNA和10-聚体互补DNA之间的双链体的Tm值评价。表1中的PNA衍生物和完全互补的DNA之间的双链体显示Tm值过高，无法在水性缓冲溶液中可靠地测定，这是因为在Tm测量过程中，缓冲溶液趋于沸腾。
Tm值在UV/Vis光谱仪上如下测定。将4 μM PNA寡聚体和4 μM互补10-聚体DNA在4mL水性缓冲液(pH 7.16, 10mM磷酸钠、100 mM NaCl)中的混合溶液在15 mL聚丙烯falcon管中于90℃孵育1分钟，和在几分钟内慢慢冷却到环境温度。然后将溶液转移到装配有密封盖的3 mL石英UV比色皿中，并按现有技术[PCT/KR2009/001256]所述的或经细微修改，在Agilent 8453 UV/可见光分光光度计或类似仪器上在260 nm处进行Tm测量。用于Tm测量的10-聚体互补DNA从Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Republic of Korea)购得，且不经进一步纯化而使用。
对于与10-聚体DNA的互补结合，式I的PNA衍生物的观察到的Tm值非常高，且在表2中提供。例如，"ASO 5"显示与10-聚体互补DNA的双链体的Tm值为86.1℃，所述10-聚体互补DNA靶向在[(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2]中标记为"黑体"和"带下划线"的PNA内N-末端10-聚体。同时，"ASO 5"显示与10-聚体互补DNA的双链体的Tm为81.3℃，所述10-聚体互补DNA靶向在[(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5) GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2]中标记为"黑体"和"带下划线"的PNA内C-末端10-聚体。
表2. 表中PNA和靶向PNA的N-末端或C-末端的10-聚体互补DNA之间的Tm值
Figure DEST_PATH_IMAGE027
式I的PNA衍生物的生物学活性的实施例
评估了式I的PNA衍生物在体外和体内的生物学活性。以下提供的生物学实施例作为实例来提供，以说明式I的此类PNA衍生物的生物学概况，因此不应被解释为限制了本发明的范围。
实施例1. 由"ASO 5"诱导的外显子跳跃
表1中指定的"ASO 5"是13-聚体反义寡核苷酸，其与在20-聚体RNA序列[(5' →3') GCCUUGCCUG┃guaaggaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的13-聚体序列具有13-聚体全互补重叠，所述20-聚体RNA序列跨越人AR前-mRNA内的"外显子5"和"内含子5"的连接处。
通过AR巢式PCR对"ASO 5"在MCF7细胞(Cat. Number: HTB-22, ATCC)中诱导AR "外显子5"跳跃的能力进行评估。采用的程序详述如下。
[细胞培养和ASO处理] 于37℃，在5% CO2气氛下，使MCF7细胞在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素和0.01 mg/ml牛胰岛素的EMEM培养基中生长。细胞在60 mm培养皿中传代培养，然后用3 aM-3 fM的"ASO 5"处理。
[RNA提取]MCF7细胞在有或没有"ASO 5"的情况下孵育3小时。根据制造商的指示，使用“通用RNA提取试剂盒” (Cat. No. 9767, Takara)，从在60 mm培养皿中的细胞提取总RNA。
[通过一步PCR合成cDNA]针对一组基因特异性引物[外显子3_正向: (5' → 3')TGGGTGTCACTATGGAGC，和外显子9_反向: (5' → 3') GGGTGT-GGAAATAGATGGG]，使用SuperScript® One-Step RT-PCR试剂盒与platinum® Taq聚合酶(Cat. No. 10928-042,Invitrogen)，将100 ng的RNA模板用于25 μL逆转录反应，循环条件如下：50℃ 30 min和94℃ 2 min，接着是94℃ 30 sec、55℃ 30 sec和72℃ 1 min的39个循环。
[巢式PCR扩增]在整个扩增过程中，使用了一种独特的扩增技术(每个循环随着退火温度的升高而改进)，其在一个温度范围内，而不是在一个特定的退火温度下(即传统的PCR方法)有效和特异性地运行。针对一组引物[外显子3_正向: (5' → 3') TGGGTG-TCACTATGGAGC，和外显子7n_反向: (5' → 3') GGGGTGATTTGGAGCCAT]，使1 μL的cDNA在20μL巢式PCR (Invitrogen)反应中进一步扩增，循环条件如下：初始10个循环[94℃ 30 sec，47℃ 40 sec (每个循环+0.5℃)，72℃ 40 sec]，接着20个循环[94℃ 30 sec，50℃ 30sec，和72℃ 40 sec]。
[外显子跳跃产物的鉴定] PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集目标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。在图8(A)中，有3个处理相关的PCR产物条带可分配至缺乏"外显子5"的AR mRNA剪接变体。已发现"ASO 5"诱导"外显子5"、"外显子4-5"和"外显子4-6"的跳跃，虽然跳跃产物的比率似乎取决于ASO浓度。作为Sanger测序的实例，图8(B)提供了图8(A)中"外显子4-5"的跳跃条带的实际测序数据。
实施例2. 在用"ASO 5"处理的MCF7细胞中AR mRNA水平的qPCR评估
通过具有SYBR绿色检测的qPCR评估"ASO 5"下调人AR mRNA的能力。
将MCF7细胞在60 mm培养皿中的5 mL培养基中传代培养，并用0 zM (阴性对照)-1aM (2个培养皿/各个浓度)的"ASO 5"处理。5小时后，根据制造商的指示(Cat. No. 9767,Takara)，用"MiniBEST通用RNA提取试剂盒"提取总RNA。按照制造商的指示(Cat. No.6110A, Takara)，使用500 ng的RNA模板合成cDNA，用于50 μL逆转录反应(使用Oligo-dT)。然后针对覆盖"外显子3"至"外显子9"的一组引物[外显子3_正向: (5' → 3')TGGGTGTCACTATGGAGC，和外显子9_反向: (5' → 3') GGGTG-TGGAAATAGAT-GGG]，使cDNA进行第1次PCR，循环条件如下：94℃ 2 min，接着94℃ 15 sec、55 ℃ 30 sec和72 ℃ 2 min的15个循环。
将第1次PCR产物稀释2,000倍，并针对数组外显子特异性引物组[对于外显子4，外显子4_正向(q): (5' → 3') GACCATGTTTTGCCCATTG和外显子4_反向(q): (5' → 3')GGCTCTTTTGAAGAAGACC；对于外显子5，外显子5_正向(q): (5' → 3')GAAACAGAAGTA-CCTGTGC和外显子5_反向(q): (5' → 3') GTCATCCCTGCTTCATAAC；和对于外显子6，外显子6_正向(q): (5' → 3')CGGAAGCTGAAGAAACTTG和外显子6_反向(q): (5' → 3')CACTTGACCACGTGTACAAG]，使1 μL各个稀释的PCR产物进行20 μL实时PCR反应。PCR反应通过SYBR Green (Takara, Japan)监测。循环条件：95℃ 3 min，接着95℃ 5 sec和60℃ 30sec的40个循环。
图9(A)提供从中获得的qPCR数据。当ASO浓度从0 zM增加至100 zM时，外显子4-6的相对表达水平显著降低。在100 zM时，外显子信使水平下降约50-60%。然而，在1 aM时，外显子信使水平反弹至接近阴性对照(无ASO处理)的水平。qPCR数据的奇怪剂量响应模式可能是由于通过在用"ASO 5"的外显子跳跃过程中积累的"外显子内含子环状RNA(EIciRNA)"的转录上调所致[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
实施例3. 在用"ASO 1"处理的MCF细胞中的AR mRNA水平的qPCR评估
虽然表1中指定的"ASO 1"是13-聚体反义寡核苷酸，其最初被设计以互补靶向人AR mRNA内"外显子5"和"外显子6"的连接处。"ASO 1"与在跨越人AR前-mRNA内"外显子5"和"内含子5"连接处的20-聚体RNA序列[(5' → 3') GCCUUGCCUG┃g"uaag"gaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的9-聚体序列具有9-聚体互补重叠。值得注意的是，在内含子5中的4个单一错配被标记为"uaag"。因此，"ASO 1"可被视为靶向人AR前-mRNA的反义寡核苷酸，虽然在13-聚体序列中只有9-聚体互补重叠。
依据在"实施例2"中描述的方案，通过qPCR评估"ASO 1"下调人AR mRNA的能力。
图9(B)提供从中获得的qPCR数据。当ASO浓度从0 zM增加至100 zM时，"外显子4-6"的相对表达水平显著降低。在100 zM时，外显子信使水平降低80%以上。然而，在1 aM时，外显子信使水平反弹至阴性对照(无ASO处理)的约60%。qPCR数据的奇怪剂量响应模式可能是由于通过在用"ASO 5"的外显子跳跃过程中积累的"外显子内含子环状RNA (EIciRNA)"的转录上调所致[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
实施例4. 在用"ASO 10"处理的MCF细胞中的AR mRNA水平的qPCR评估
表1中指定的"ASO 10"是12-聚体反义寡核苷酸，其与在跨越人AR前-mRNA的"外显子5"和"内含子5"的连接处的20-聚体前-mRNA序列[(5' → 3') GCCUUGCCUG┃guaaggaaaa]中标记为"黑体"和"带下划线"的12-聚体序列具有12-聚体全互补重叠。
依据在"实施例2"中描述的方案，通过qPCR评估"ASO 10"下调人AR mRNA (全长)的能力。
图9(C)提供从中获得的qPCR数据。在用1 zM-1,000 zM的"ASO 10"处理的MCF7细胞中，"外显子4-6"的相对表达水平显著下降60 ~ 80%。
实施例5. "ASO 1"下调AR的蛋白质印迹分析
MCF7细胞在含有5 ml培养基的60 mm培养皿中传代培养，并用0 zM (阴性对照)，或100 zM-300 aM的"ASO 1"处理。对于4个阴性对照，使用4个培养皿。48小时后，细胞用冷PBS洗涤2次，然后用补充有1X蛋白酶抑制剂(Cat. No. P8340, Sigma)的200 μL 1X细胞裂解缓冲液(Cat. No. 9803, Cell Signaling Tech)进行裂解。将裂解物收集到1.5 ml e-管中。将200 μL的各裂解物与100 μL 3X样品缓冲液混合，并于100 ℃沸腾5 min。使20 μL的各裂解物(总共12个裂解物，4个阴性对照和8个ASO处理样品)在8% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移到0.2 μm PVDF膜上。用抗-AR抗体(Cat. No. 5153, Cell SignalingTech)和抗-β-肌动蛋白抗体(Cat. No. sc4778, Santa Cruz)探查膜。图10(A)提供从中获得的AR蛋白质印迹数据。多个(阴性)对照样品被用来克服蛋白质印迹程序的技术伪像。除了对于(阴性) "对照4"的AR条带外，用ASO处理的裂解物的AR条带强度明显弱于未经ASO处理的裂解物的AR条带强度，这清楚地表明"ASO 1"抑制全长AR蛋白在MCF7细胞中的表达。
实施例6. "ASO 5"下调AR的蛋白质印迹分析
依据在"实施例5"中描述的程序，评估了10 zM-30 aM的"ASO 5"抑制AR蛋白在MCF7细胞中的表达的能力。
图10(B)提供用0 zM (阴性对照，无ASO处理)，或10 zM-30 aM的"ASO 5"处理的MCF7细胞获得的AR蛋白质印迹数据。多个(阴性)对照样品被用来克服蛋白质印迹程序的技术伪像。用ASO处理的裂解物的AR条带强度明显弱于未经ASO处理的邻近裂解物的AR条带强度，这清楚地表明"ASO 1"抑制全长AR蛋白在MCF7细胞中的表达。
实施例7. 通过局部给予小鼠"ASO 1"促进毛发生长
如下局部给予"ASO 1"后，评估其在C57BL/6小鼠中促进毛发生长的能力。人AR前-mRNA中的"ASO 1"的靶序列在小鼠AR前-mRNA中是保守的。因此，小鼠中的体内治疗结果可外推至人类的情况，而无太多不确定性。
[毛发去除和分组]在第0天，7周龄的雌性C57BL/6小鼠用舒泰(zoletil)/甲苯噻嗪(rompun)麻醉，并分别用理发剪和蜡剪去和除去背部的毛发。选择具有无缺陷(即无瑕疵)毛发去除的小鼠并随机分为3组(每组7只动物)。
[局部给予] 通过在补充有3%(v/v)甘油的30%(v/v)乙醇水溶液中，将"ASO 1"的储备母液稀释至0.2 fM或1 fM来制备"ASO 1"的局部溶液。在第3、7、10和14天，使用棉球将约100 μL的0 (阴性对照)、0.2或1 fM "ASO 1"局部给予各只动物的背部。
[对于毛发生长的数字图像评分]为评分毛发生长，将动物麻醉并如图11(A)所示，用数码相机以固定值的曝光时间和照度按组拍照。选择每只动物的毛发去除区域的数字图像，并使用"ImageJ"程序对所选区域的平均亮度进行评分。较低的亮度分数被认为是较快的毛发生长。按组合并各只动物的亮度分数，并通过student's t-检验进行统计分析。图11(B)总结了ASO治疗组相对于对照组的相对亮度分数。治疗组的相对亮度分数倾向于随着天数而减少。在第13天，1 fM组的亮度分数显著低于非-治疗组。因此，结论是局部给予1 fM的"ASO 1"时促进毛发生长。
[按毛发重量评分]在第21天，麻醉动物并用理发剪剃去背部的毛发。将来自各只动物的毛发样品按组合并，并称重以评估第0天至第21天的毛发生长。对于对照组，平均毛发重量是70.5 mg/动物，对于0.2 fM治疗组是90.8 mg/动物，和对于1 fM治疗组是94.4mg/动物。因此，结论是局部给予0.2 fM以及1 fM的"ASO 1"促进毛发生长。
[皮肤样品的AR IHC]在第21天剃毛后，根据分组，小鼠接受了媒介或者"ASO 1"的单次局部给药。在第24天，对去毛区域的皮肤取样针对雄激素受体进行免疫组织化学(IHC)分析。皮肤样品被冷冻切片，并用1:100稀释的第一抗-AR抗体(Cat. No. sc-816, SantaCruz)，用1:200稀释的第二抗-IgG (Cat No. BA-1100, Vector)，然后用1:200稀释的Dylight 594-链酶抗生物素(Cat No. SA-5594, Vector, CA, USA) (用于红色荧光标记)连续进行免疫染色。在用"ASO 1"局部处理后，对于AR表达水平的变化，IHC图像在Olympus荧光显微镜上捕获。
图12是一组具有代表性的AR IHC图像，显示在局部给予0.2 fM或1 fM的"ASO 1"后，毛囊中的AR表达在毛囊中受到明显抑制。提供了DAPI染色图像来定位IHC图像中的毛囊。有趣的是注意到，在局部给予0.2 fM或1 fM的"ASO 1"后，甚至在真皮下的肌肉层中AR表达也下降。因此，在局部给药时，"ASO 1"很容易地被递送到真皮和真皮下的肌肉层中，并有效抑制AR的表达。
实施例8. 通过局部给予小鼠"ASO 5"促进毛发生长
如下详述的，局部给予"ASO 5"后，评估其在C57BL/6小鼠中促进毛发生长的能力。人AR前-mRNA中的"ASO 5"的靶序列在小鼠AR前-mRNA中是保守的。因此，小鼠中的体内治疗结果可外推至人类的情况，而无太多不确定性。
[毛发去除和分组]在第0天，7周龄的雌性C57BL/6小鼠用舒泰(zoletil)/甲苯噻嗪(rompun)麻醉，并分别用理发剪和蜡剪去和除去背部的毛发。选择具有无缺陷(即无瑕疵)毛发去除的小鼠并随机分为3组(每组10只动物)。
[局部给予] 通过在补充有3%(v/v)甘油的30%(v/v)乙醇水溶液中，将"ASO 5"的储备母液稀释至1、5或25 fM来制备"ASO 5"的局部溶液。在第3、7、10、14和21天，使用棉球将约100 μL的各ASO溶液或媒介(阴性对照)局部给予至动物的背部。
[对于毛发生长的数字图像评分]图13总结了ASO治疗组相对于阴性对照组的相对亮度分数。ASO治疗组的相对亮度分数倾向于随着天数而减少。在第17天，1 fM和25 fM的治疗组的亮度分数显著低于非-治疗组。因此，结论是局部给予1-25 fM的"ASO 5"时促进毛发生长。
[按头发重量评分]在第21天，麻醉动物，剃去背部的毛发并收集。将来自各只动物的毛发样品按组合并，并称重以评价第0天和第21天之间的毛发生长。与对照组比较，治疗组的毛发重量得到显著增加。1 fM、5 fM和25 fM组的平均毛发重量分别是阴性对照组的293%、306%和278%。因此，结论是"ASO 5"以1-25 fM局部给予后促进毛发生长。
在第21天剃毛后，动物接受媒介或1 fM、5 fM或25 fM的"ASO 5"的单次局部给药。在第53天，通过用理发剪剃毛收集背部的毛发，以确定第21天和第53天之间的毛发生长的总量。1 fM、5 fM和25 fM组的平均毛发重量分别是非-治疗组的1,630%、1,450%和771%。因此，结论是"ASO 5"以1-25 fM局部给予后促进毛发生长。
实施例9. 通过局部给予小鼠"ASO 10"促进毛发生长
如下详述的，局部给予"ASO 10"后，评估其在C57BL/6小鼠中促进毛发生长的能力。人AR前-mRNA中的"ASO 10"的靶序列在小鼠AR前-mRNA中是保守的。因此，小鼠中的体内治疗结果可外推至人类的情况，而无太多不确定性。
[毛发去除和分组]在第0天，7周龄的雌性C57BL/6小鼠用舒泰(zoletil)/甲苯噻嗪(rompun)麻醉，并分别用理发剪和蜡剪去和除去背部的毛发。选择具有无缺陷(即无瑕疵)毛发去除的小鼠并随机分为3组(每组9只动物)。
[局部给予] 通过在补充有3%(v/v)甘油的30%(v/v)乙醇水溶液中，将"ASO 10"的储备母液稀释至1、5或25 fM来制备"ASO 10"的局部溶液。在第2天，使用棉球将约100 μL的各ASO溶液或媒介(阴性对照)局部给予至动物的背部。
[对于毛发生长的数字图像评分]图14(A)总结了ASO治疗组相对于对照组的相对亮度分数。治疗组的相对亮度分数倾向于随着天数而减少。在第27天，1 fM和5 fM的治疗组的亮度分数显著低于非-治疗组。因此，结论是局部给予1-5 fM的"ASO 10"时促进毛发生长。
[按头发重量评分]在第27天，麻醉动物，剃去背部的毛发并收集。将来自各只动物的毛发样品按组合并，并称重以评价第0天和第27天之间的毛发生长。与对照组比较，治疗组的毛发重量得到适度增加。1 fM、5 fM和25 fM组的平均毛发重量分别是非-治疗组的115%、114%和119%。因此，结论是"ASO 10"以1-25 fM局部给予后促进毛发生长。
[皮肤样品的AR免疫组织化学] 在第27天剃去毛发后，动物在第27天和第29天进一步局部接受媒介或1、5或25 fM的"ASO 10"。在第30天收集背部的皮肤样品用于针对雄激素受体进行免疫组织化学分析。如在"实施例7"中所述，对皮肤样品针对雄激素受体进行免疫染色。IHC图像在Zeiss幻灯片扫描仪上捕获。图14(B)是一组代表性的AR IHC图像。有趣的是注意到，与阴性对照组相比，ASO治疗组的毛囊数量明显增加。由于治疗组的毛囊数量明显增加，清楚地说明治疗组的毛囊中的AR表达下降是困难的。然而，与对照组相比，治疗组的真皮下肌肉层中的AR表达明显下降。观察到5 fM治疗组下降最明显。一并考虑用"ASO10"治疗的动物中的IHC结果，在所有试验剂量下，最为显著的是在5 fM时，"ASO 10"通过抑制AR表达以增加毛囊的数量来促进毛发的生长。
实施例10. 在用"ASO 10"处理的MCF7细胞中，通过TaqMan测定的AR mRNA水平的qPCR评价
采用TaqMan探针，通过qPCR评价"ASO 10"下调人AR mRNA的能力。
MCF7细胞在60 mm培养皿中在5 mL培养基中传代培养，并用0 zM (阴性对照)-1aM的"ASO 10"处理(2个培养皿/每个浓度)。24小时后，根据制造商的指示(Cat. No. 9767,Takara)，用"MiniBEST通用RNA提取试剂盒"提取总RNA。
对于20 μL逆转录反应，使用One-Step RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，针对[外显子3_正向: (5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC；和外显子9_反向: (5' → 3') GGGTGT-GGAAATAGATGGG]的一组外显子特异性引物，使用400 ng的RNA模板来合成cDNA，循环条件如下：50℃ 30 min和94℃ 2 min，接着94℃ 30 sec、50℃ 30 sec和72℃ 1 min的15个循环。
将cDNA溶液稀释50倍，和针对[外显子4_正向: (5' → 3')TTGTCCATCTTGTCGTCTT；和外显子5_反向: (5' → 3') CCTCTC-CTTCCTCCTGTA]的一组外显子特异性引物，使1 μL的各个稀释的PCR产物进行20 μL实时PCR反应，循环条件如下：95℃3 min，接着95℃ 15 sec和60℃ 30 sec的40个循环。qPCR反应使用[(5' → 3')TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ]的TaqMan探针监测。
图15提供从中获得的qPCR数据。在用1 zM-1 aM的"ASO 10"处理的MCF7细胞中，外显子4-6的相对表达水平显著下降约50-70%。
实施例11. 在皮下给予"ASO 10"的小鼠中，通过IHC的AR表达的下调
如下评价"ASO 10"抑制小鼠中AR表达的能力。
将12周龄雄性C57BL/6小鼠随机分成3组：阴性对照(无ASO治疗)、0.01 pmole/Kg"ASO 10"和0.1 pmole/Kg "ASO 10" (每组3只动物)。根据剂量分组，小鼠皮下接受媒介或者溶于媒介(PBS)的ASO，2X每周，持续4周。最终给药后3天，用舒泰/甲苯噻嗪麻醉动物并进行组织或器官取样，用于通过石蜡块的AR IHC。
用1:100稀释的第一抗体(Cat. No. sc-816, Santa Cruz)、1:200稀释的第二抗兔IgG (Cat. No. BA-1100, VECTOR)和1:200稀释的Dylight 594-链酶抗生物素(Cat.No. SA-5594, VECTOR)连续探查AR蛋白。用DAPI对核染色。IHC荧光图像在Zeiss幻灯片扫描仪上捕获。
图16提供了用已知大量表达AR蛋白的组织获得的AR IHC图像(红色)。注意，IHC图像以DAPI (蓝色)共定位提供。长期皮下暴露于"ASO 10"后，随着ASO剂量从0.01 pmole/Kg增加到0.1 pmole/Kg，在注射部位远端的表皮、肝脏、睾丸和前列腺中AR表达明显下降。因此，在全身暴露时，"ASO 10"明确抑制小鼠中的AR蛋白表达。

Claims (8)

1.一种用于诱导人雄激素受体前mRNA中外显子跳跃的由式I表示的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，
n是10-21的整数；
式I化合物与人雄激素受体前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少9-聚体互补重叠；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氢代基团；
X和Y独立地表示氢代[H]或取代或未取代的烷氧基羰基基团；
Z表示取代或未取代的氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少3个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
L1、L2和L3是由式V表示的共价键，它将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，和Qm被直接连接到碱性氨基；
Q2、Q3、…，和Qm-1独立地选自亚甲基和氧(-O-)；和
m是1-15的整数。
2.依据权利要求1的肽核酸衍生物，或其药用盐：
其中，
n是11-15的整数；
式I化合物与人AR前-mRNA内[(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]的17-聚体RNA序列具有至少11-聚体互补重叠；
式I化合物与人AR前-mRNA内的前-mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢代基团；
X是氢代基团；
Y表示取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢代基团；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-，或-CH2-O-(CH2)5-，其右端与碱性氨基直接相连；和，
L2和L3独立地选自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-，其右端与碱性氨基直接相连。
3.依据权利要求1的肽核酸衍生物，其是以下肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐：
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2；
其中，
A、G、T和C是分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)和A(p)是具有分别由式VI和式VII表示的非天然核碱基的PNA单体；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中，
p和q是整数；和，
"Fethoc-"是表示"[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基"的缩写。
4.依据权利要求1的肽核酸衍生物，其是以下化合物，或其药学上可接受的盐：
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2
其中，
A、G、T和C是分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)和G(p)是具有分别由式VI、式VII和式IX表示的非天然核碱基的PNA单体；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
其中p和q是整数；和"Fethoc-"是表示"[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基"的缩写。
5.依据权利要求1-4中任一项的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗与雄激素活性有关的皮肤病学适应症或病症的药物中的用途。
6.依据权利要求5的用途，其中所述药物用于局部给予。
7.依据权利要求1-4中任一项的肽核酸衍生物，或其药学上可接受的盐在制备用于治疗雄激素性脱发的药物中的用途。
8.依据权利要求7的用途，其中所述药物用于局部给予。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018122610A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Olipass Corporation Exon skipping by peptide nucleic acid derivatives
KR102483119B1 (ko) 2017-01-06 2023-01-02 올리패스 주식회사 Snap25 안티센스 올리고뉴클레오타이드
RU2762293C2 (ru) 2017-01-24 2021-12-17 Олипасс Корпорейшн Антисмысловое для scn9a обезболивающее средство
TWI832851B (zh) * 2018-05-18 2024-02-21 韓商奧利通公司 基質金屬蛋白酶-1之反義寡核苷酸
KR102304280B1 (ko) * 2018-08-14 2021-09-23 올리패스 주식회사 아세틸코에이카복실라제2 안티센스 올리고뉴클레오티드

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994018835A1 (en) * 1993-02-19 1994-09-01 Genta Incorporated Treatment of androgen-associated baldness using antisense oligomers
WO2000001813A2 (en) * 1998-06-30 2000-01-13 The University Of British Columbia Peptide inhibitors of androgen-independent activation of androgen receptor
CN101932709A (zh) * 2007-11-26 2010-12-29 桑塔里斯制药公司 靶向雄激素受体的lna拮抗剂
CN102015628A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 Cti生物公司 具有良好细胞穿透和强核酸亲和性的肽核酸衍生物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3239393A (en) * 1991-12-12 1993-07-19 Scios Nova Inc. Fluorenyl derivatives and their use as anti-inflammatory agents
US6133444A (en) 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
US6617422B1 (en) * 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
WO2002097134A2 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified peptide nucleic acid
AU2004273828A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating androgen-independent prostate cancer
US8450290B2 (en) * 2007-11-26 2013-05-28 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating androgen receptor dependent disorders including cancers
US9523094B2 (en) * 2012-10-11 2016-12-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating kennedy's disease
WO2018012261A1 (ja) 2016-07-14 2018-01-18 株式会社日立製作所 電気品収容用筐体及びその製作方法
WO2018122610A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Olipass Corporation Exon skipping by peptide nucleic acid derivatives

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994018835A1 (en) * 1993-02-19 1994-09-01 Genta Incorporated Treatment of androgen-associated baldness using antisense oligomers
WO2000001813A2 (en) * 1998-06-30 2000-01-13 The University Of British Columbia Peptide inhibitors of androgen-independent activation of androgen receptor
CN101932709A (zh) * 2007-11-26 2010-12-29 桑塔里斯制药公司 靶向雄激素受体的lna拮抗剂
CN102015628A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 Cti生物公司 具有良好细胞穿透和强核酸亲和性的肽核酸衍生物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Generation 2.5 antisense oligonucleotides targeting the androgen receptor and its splice variants suppress enzalutamide-resistant prostate cancer cell growth;Yoshiaki Yamamoto等;《Clin Cancer Res.》;20150129;第21卷(第7期);1675-1687 *

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