TWI769208B - Ｓｎａｐ２５反義寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明提供靶向人類SNAP25 前-mRNA之3'剪接位點之肽核酸衍生物。該等肽核酸衍生物強力地誘導細胞中該人類SNAP25 mRNA之至少一剪接變體，並可用於藉由局部投與而安全地治療涉及人類SNAP25蛋白之表現的皮膚病病徵或病況。

Description

SNAP25反義寡核苷酸
本發明係關於靶向人類SNAP25前-mRNA之用於治療由SNAP25蛋白介導之皮膚病病徵或病況的肽核酸衍生物，並主張2017年1月6日申請之美國臨時申請案第62/443,262號之優先權權益，該美國臨時申請案以全文引用的方式併入本文中。
內飲作用為使細胞將大分子捕捉至細胞中之過程。同時，胞外分泌為使細胞將細胞內物質或內含物分泌至細胞外的過程。存在類型豐富之細胞巧妙地採用胞外分泌來將囊泡內容物或物質分泌至細胞外。針對神經元細胞與鄰近神經元細胞或鄰近組織通信之預定生理作用，該等神經元細胞已演變為藉由胞外分泌來分泌神經傳遞素。作為胞外分泌之另一實例，肥大細胞藉由胞外分泌釋放組胺並因而募集免疫細胞。
分泌囊泡含有各種類型的囊泡物質，其將視細胞類型而變化。舉例而言，神經元細胞中之突觸前囊泡位於突觸前神經元末端中並含有神經傳遞素之混合物。囊泡膜與質膜融合以釋放神經傳遞素至突觸區中，從而在生理學上控制或影響鄰近細胞或組織。胰小島中之β-細胞具有裝有胰島素之囊泡，且該等囊泡經歷涉及膜融合之胞外分泌以回應於血糖含量而釋放胰島素至血流中。[Cell Metabolism，第5卷，237-252(2007)]
胞外分泌為涉及囊泡膜與質膜融合之細胞過程。存在兩種類型之胞外分泌，亦即「組成型」及「調節型」。「組成型」胞外分泌在無刺激信號之情況下自發地發生。同時，「調節型」胞外分泌藉由特異性刺激信號(例如，運動神經元細胞中之細胞內鈣離子濃度的增加)而觸發。[Ann.Rev.Cell Dev.Biol.第16卷，19-49(2000)]
突觸接合點中之胞外分泌：神經元細胞使用專用於神經元細胞中之被稱作「突觸接合點」之機構彼此通信。在鄰近神經元細胞之間的突觸接合點中發生的胞外分泌過程示意性地說明於圖1A中。首先，回應於諸如藉由神經元軸突感測到的鈣離子濃度變化的刺激信號，含有神經傳遞素粒子之囊泡與突觸前質膜融合。在膜融合後，神經傳遞素粒子經釋放至突觸前接合點中。接著，神經傳遞素粒子擴散並結合至鄰近神經元細胞之樹突狀膜上所表現之神經傳遞素受體。最後，該等受體在與神經傳遞素分子錯合時激活，並轉導自鄰近神經元單元之軸突傳輸之神經元信號。
肌神經接合點中之胞外分泌：運動神經元使用肌神經接合點中之胞外分泌來控制肌肉運動。在肌肉中，運動神經元之軸突分為多個軸突端以與肌肉細胞之肌膜形成接合點，亦即，肌神經接合點。[Nat.Rev.Neuroscience，第2卷，791-805(2001)]神經元軸突端與肌細胞膜之間的間隙被稱作尺寸約30nm之突觸間隙。
在呈動作電位形式之神經脈衝到達運動神經元之軸突端時，突觸傳輸在肌神經接合點處開始。運動神經元軸突藉由胞外分泌釋放神經傳遞素分子(即脊椎動物中之乙醯膽鹼)至突觸間隙中，且表現於肌細胞膜上之乙醯膽鹼受體在與乙醯膽鹼錯合時激活，其觸發肌纖維之收縮。在神經元軸突與肌細胞之間的肌神經接合點中發生的胞外分泌過程示意性地說明於圖 1B中。
SNARE蛋白及神經元胞外分泌：囊泡與神經元細胞膜之融合對於「調節型」胞外分泌至關重要。已知此等「調節型」胞外分泌藉由SNARE(可溶N-乙基順丁烯二醯亞胺-敏感因子附著蛋白受體)蛋白介導。[Ann.Rev.Cell Dev.Biol.第16卷，19-49(2000)].在神經元胞外分泌中，包含三個SNARE蛋白(亦即，囊泡締合膜蛋白(VAMP2，亦被稱作突觸泡蛋白)；位於囊泡膜中之單次跨膜蛋白(v-SNARE)；25kDa之突觸體締合蛋白(SNAP25))及突觸蛋白1A(駐存於神經元質膜之單跨膜蛋白(t-SNARE))。突觸蛋白1A及VAMP2具有C端跨膜域以用於分別錨定至囊泡及神經元質膜。藉由共價連接於蛋白質中之若干半胱胺酸殘基之軟脂醯基而便於SNAP25之膜錨定。[Am.J.Physiol.Cell Physiol.第285卷，C237-249(2003)]
神經元軸突電位激活電壓閘控之鈣通道並增加軸突內之鈣離子濃度，如此藉由將鈣離子與突出結合蛋白錯合而下拉靠近突觸前膜之突觸囊泡。接著，幫助突觸囊泡膜與軸突質膜之融合，如圖2A中示意性地說明。突觸蛋白、SNAP25與突觸泡蛋白之三元錯合物的形成驅使兩個膜緊密接近地定向並接著經歷膜融合以釋放乙醯膽鹼粒子至突觸間隙中。[Toxins第2卷，24-53(2010)]因此，SNARE蛋白之三元錯合物形成係神經傳遞素之釋放中所涉及之膜融合的基本要素。
肉毒桿菌毒素A：肉毒桿菌毒素(BTX)為藉由細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生之神經毒素。活性型之毒素為單多肽鏈(150kDa)，其由經雙硫鍵彼此繫留之重鏈(100kDa)及輕鏈(50kDa)組成。已知BTX易於吸收至神經元細胞中，裂解SNARE蛋白，阻斷乙醯膽鹼之釋 放，並因此使神經元細胞失去作為神經元細胞的最基本特徵。暴露於BTX之神經元細胞無法觸發鄰近肌纖維之收縮。
在進入神經元細胞後，BTX裂解為兩個部分，亦即，輕鏈與重鏈。輕鏈為起神經毒素作用之鋅金屬蛋白酶。BTX亞型A、C及E裂解SNAP25。同時，亞型B、D、F及G降解VAMP，且亞型C水解突觸蛋白。[Nature，第365卷，160-163(1993)].
肉毒桿菌毒素A之美容用途：肉毒桿菌毒素A最初由Allergan研發，以用於主要處理面部皺紋之美容用途。Botox®為Allergan所註冊之知名品牌，且在公共領域中常被視為與BTX與同義。
鑒於其生理活性，BTX A原則上可用於治療包含頭頸、眼瞼、四肢、鄂部及聲帶之過度活動性肌肉收縮或痙攣的多種病症。此外，BTX可用於治療包括流涎過多及多汗症之分泌過多病症。[Indian J.Dermatol.第55卷，8-14(2010)]
Botox®注射劑在2002年經US FDA審批通過，以用於處理面部皺紋，並且在由熟練的皮膚科醫生恰當運用時被視為安全的。然而，BTX因其毒性而臭名昭著。例如，若以1.3~2.1ng/kg經靜脈內注射，則估計A型及B型BTX對人類係致命的。[Indian J.Dermatol.第55卷，8-14(2010)]仍然擔心BTX用於美容用途的安全性。面部麻痹、肌肉無力及吞咽困難係在投與了肌肉內BTX注射劑之個體中所觀察到的最常見不良事件。更嚴重的副作用由歸因於過度劑量或技術不佳之局部肌肉內注射之全身暴露導致，且包括頭痛、類流感綜合症及過敏反應。已知反覆BTX注射誘導抗原反應，其限制BTX之美容用途。相比美容用途，來自治療用途的副作用可更嚴重，且該等副作用可包括心律不整、心臟病發作、癲癇、呼 吸停止及死亡。[J.Am.Acad.Dermatol.第53卷，407-415(2005)]
為了將接收用於美容用途之BTX注射劑之個體中之副作用降至最低，BTX之局域化或局部遞送將為極佳的，以代替習知的肌肉內局部注射路線。BTX為大小為150K之巨分子。在不依賴浸潤性調配物的情況下局部遞送BTX深入至真皮下方之肌肉層仍極具挑戰性。
阿基瑞林(Argireline)：阿基瑞林為自SNAP25蛋白之N端衍生之合成性六肽。阿基瑞林係作為用於面部皺紋之美容產品出售。六肽經宣稱為拮抗利用SNAP25蛋白形成SNARE錯合物。六肽模仿BTX之功能，且將可用於在局部投與後減少面部皺紋。阿基瑞林經報導為在局部使用後減少人類個體之面部皺紋。[Am.J.Clin.Dermatol.第14(2)卷，147-153(2013)]
前-mRNA：遺傳資訊攜載於DNA(2-去氧核糖核酸)上。DNA經轉錄以在胞核中形成前-mRNA(信使核糖核酸前體)。哺乳動物前-mRNA通常由外顯子及內含子構成，且外顯子與內含子彼此互連，如下文示意性地提供。外顯子及內含子係如圖2B中示意性說明般編號。
前-mRNA之剪接：在藉由統稱為「剪接」之一系列錯合反應刪除內含子之後，將前-mRNA加工成mRNA，如圖3A中示意性地概述。[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(5),386-398(2005)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.15(2),108-121(2014)]藉由在前-mRNA與剪接適配因子之間形成「剪接體E錯合物」(亦即，早期剪接體錯合物)來起始剪接。在「剪接體E錯合物」中，U1結合至外顯子N與內含子N之接合點，且U2AF35結合至內含子N與外顯子(N+1)之接合點。因此，外顯子/內含子或內含子/外顯子之接合點對於早期剪接體錯合物之 形成很關鍵。在另外與U2錯合後，「剪接體E錯合物」演變成「剪接體A錯合物」。「剪接體A錯合物」經歷一系列錯合反應以刪除或剪接出內含子以便鄰接鄰近外顯子。
核糖體蛋白合成：蛋白藉由DNA(2-去氧核糖核酸)編碼。回應於細胞刺激或以自發方式，DNA經轉錄以在胞核中形成前-mRNA(信使核糖核酸前體)。以酶促之方式剪接出前-mRNA之內含子，得到mRNA(信使核糖核酸)，其接著經易位至細胞質中。在細胞質中，被稱作核糖體之轉譯機構的錯合物結合至mRNA，並在其掃描沿mRNA編碼之遺傳資訊時進行蛋白合成。[Biochemistry第41卷，4503-4510(2002)；Cancer Res.第48卷，2659-2668(1988)]
反義寡核苷酸(ASO)：以序列特異性方式(亦即互補地)結合於包括DNA、mRNA及前-mRNA之核酸之寡核苷酸被稱作反義寡核苷酸(ASO)。
例如，若ASO緊密地結合於細胞質中之mRNA，則ASO可能夠抑制沿著mRNA之核糖體蛋白合成。ASO需要存在於細胞質內以便抑制其靶蛋白之核糖體蛋白合成。
若ASO緊密地結合於胞核中之前-mRNA，則ASO可能夠對將前-mRNA剪接成mRNA進行抑制或調節。ASO需要存在於胞核內以便對將前-mRNA剪接成mRNA進行抑制或調節。對剪接之此類反義抑制產生缺少經ASO標靶之外顯子的一或多種mRNA。此類mRNA被稱作「剪接變體」，且其對小於由全長mRNA編碼之蛋白的蛋白進行編碼。
大體上，剪接可由抑制「剪接體E錯合物」之形成中斷。若ASO緊密地結合於(5'→3')外顯子-內含子接合點(亦即，「5'剪接位點」)，則ASO 阻斷前-mRNA與因子U1之間的錯合物形成，且因此阻斷「剪接體E錯合物」之形成。同樣，若ASO緊密地結合於(5'→3')內含子-外顯子之接合點(亦即，「3'剪接位點」)，則「剪接體E錯合物」無法形成。3'剪接位點及5'剪接位點經示意性地說明圖3B中。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸容易藉由內源性核酸酶降解，從而限制其治療效用。到目前為止，已集中開發並研究許多類型之非天然(亦即非天然產生的)寡核苷酸。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]其中之一些展示出與DNA及RNA相比經擴展的代謝穩定性。圖4A中提供一些代表性非天然寡核苷酸之化學結構。該等寡核苷酸如DNA或RNA一樣可預測性地結合於互補核酸。
硫代磷酸酯寡核苷酸：硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)係其中主鏈磷酸酯氧原子中之一者每單體經硫原子置換的DNA類似物。此類小結構變化使得PTO相對地對藉由內源性核酸酶降解有抵抗性。[Ann.Rev.Biochem.第54卷，367-402(1985)]
在反映出PTO及DNA之主鏈之結構類似性的情況下，PTO及DNA兩者對大部分哺乳動物細胞類型之細胞膜的穿透不良。然而，對於充分表現DNA之輸送體之一些類型之細胞，DNA及PTO展示出良好的細胞穿透。已知全身性投與之PTO易於分佈至肝及腎。[Nucleic Acids Res.第25卷，3290-3296(1997)]
為了便於PTO之活體外細胞穿透，已普遍採用脂質體轉染。然而，脂質體轉染實際上會改變細胞膜，引發細胞毒性，並因此對於長期活體內治療用途並非係理想的。
在過去的30年內，反義PTO及PTO之變體已在治療癌症、免疫性病 症、代謝疾病等等方面經過臨床評估。[Biochemistry第41卷，4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]由於PTO之不良細胞滲透率，並未成功開發許多此類反義藥物候選。為了解決不良細胞滲透率，PTO需要以高劑量投與以獲得治療活性。然而，已知PTO展示出：劑量限制性毒性，其包括增加之凝聚時間、補體活化、外科腎病、柯弗氏細胞活化；及免疫刺激，其包括脾增大、淋巴增生、單核細胞浸潤。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]
已發現許多反義PTO展示出對於在肝或腎中占極大比重之疾病的臨床活性。米泊美生(Mipomersen)為抑制apoB-100之合成的PTO類似物，apoB-100係參與LDL膽固醇轉運之蛋白。米泊美生最可能由於其較佳分佈至肝而顯現出在動脈粥樣硬化患者群體中之治療活性。[Circulation第118(7)卷，743-753(2008)]ISIS-113715為抑制蛋白酪胺酸磷酸酯酶1B(PTP1B)之合成的PTO反義類似物，並發現其展示出在II型糖尿病患者中之治療活性。[Curr.Opin.Mol.Ther.第6卷，331-336(2004)]
鎖核酸：在鎖核酸(LNA)中，RNA之主鏈核糖環在結構上受限，以增加對於RNA或DNA之結合親和力。因此，LNA可被視為高親和力DNA或RNA類似物。[Biochemistry第45卷，7347-7355(2006)]
二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡核苷酸：在二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡核苷酸(PMO)中，DNA之主鏈磷酸酯及2-去氧核糖分別經胺基磷酸酯及嗎啉置換。[Appl.Microbiol.Biotechnol.第71卷，575-586(2006)]在DNA主鏈帶負電時，PMO主鏈不帶電。因此，PMO與RNA之間的結合不含主鏈之間的靜電排斥，並往往會比DNA與RNA之間的結合更穩固。由於PMO在結構上與DNA極為不同，所以PMO將不會由識別DNA或RNA之肝輸送體 識別。儘管如此，PMO不容易穿透細胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)係具有N-(2-胺基乙基)甘胺酸作為單元主鏈之多肽，並係由Nielsen博士及其同事發現。[Science第254卷，1497-1500(1991)]圖4B中說明PNA之化學結構及縮略命名。如同DNA及RNA，PNA亦選擇性結合於互補核酸。[Nature(London)第365卷，566-568(1992)]在結合於互補核酸時，PNA之N端被視為等效於DNA或RNA之「5'端」，且PNA之C端被視為等效於DNA或RNA「3'端」。
如同PMO，PNA主鏈不帶電。因此，PNA與RNA之間的結合往往會比DNA與RNA之間的結合更穩固。由於PNA之化學結構明顯不同於DNA，所以PNA將不會由識別DNA之肝輸送體識別，並將展示出與DNA或PTO不同的組織分佈輪廓。然而，PNA對哺乳動物細胞膜之穿透亦不良。(Adv.Drug Delivery Rev.第55卷，267-280,2003)
改良PNA之膜滲透率之經修飾核鹼基：藉由引入經修飾核鹼基(亦即鹼基)使PNA對於哺乳動物細胞膜係高度可滲透的，其中陽離子脂質或其等效物與該等經修飾核鹼基共價連接，如圖4C中所例示。發現胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤之此類經修飾核鹼基分別可預測地及互補地與鳥嘌呤、胸嘧啶及胞嘧啶雜交。[PCT申請案第PCT/KR2009/001256號；EP2268607；US8680253]
將此類經修飾核鹼基併入至PNA上模擬了脂質體轉染之情境。藉由脂質體轉染，用諸如脂染胺之陽離子脂質分子包裹具有磷酸酯主鏈之寡核苷酸分子，且此類脂染胺/寡核苷酸錯合物與裸寡核苷酸分子相比往往會相當容易地穿透細胞膜。
除良好膜滲透率以外，還發現彼等PNA衍生物具有對於互補核酸之 超強親和力。舉例而言，將4至5個經修飾核鹼基引入至11-mer或13-mer PNA衍生物易於在利用互補DNA之雙螺旋體形成中產生20℃或更高之Tm增益。此類PNA衍生物對單鹼基錯配高度敏感。取決於經修飾鹼基之類型以及PNA序列，單鹼基錯配導致11至22℃之Tm損失。
小干擾RNA(siRNA)：小干擾RNA(siRNA)係指20-至25個鹼基對之雙股RNA。[Microbiol.Mol.Biol.Rev.第67(4)卷，657-685(2003)]siRNA之反義股在某種程度上與蛋白質相互作用以形成「RNA誘導沉默錯合物」(RISC)。接著，RISC結合於與siRNA之反義股互補之mRNA的特定部分。與RISC錯合之mRNA經歷裂解，得到雙股siRNA之另一複本。因而，siRNA以催化方式誘導其目標mRNA之裂解，並因此藉由mRNA抑制蛋白質表現。RISC並非始終結合於其目標mRNA內之完整互補序列，其引起對siRNA療法中之脫靶效應之擔憂。如同具有DNA或RNA主鏈之其他類別之寡核苷酸，siRNA具有不良細胞滲透率且因此往往會展示出不良的活體外或活體內治療活性，除非經恰當調配或經化學改質以展示出良好膜滲透率。
SNAP25 ASO及siRNA：主要將SNAP25 ASO及siRNA作為生物工具來進行評估，以更好地理解SNAP25蛋白在神經元細胞中之生理作用。[Nature第364卷，445-448(1993)；Eur.J.Neurosci.第20(6)卷，1593-1603(2004)；EMBO Reports第14(7)卷645-651(2013)；J.Biol.Chem.第281(38)卷，28174-28184(2006)]尚待研究下調SNAP25蛋白之活性之寡核苷酸之局部用途，以便安全地模仿BTX之有益的治療活性。應注意，經皮遞送一直係寡核苷酸領域中之巨大的技術挑戰。
本發明提供由式I表示之肽核酸衍生物或其醫藥學上可接受之鹽：
Figure 106146552-A0305-02-0013-1
其中，n為介於10與25之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補，或帶一或兩個錯配而與人類SNAP25前-mRNA部分地互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn獨立地表示氘[D]、氫[H]、經取代或未經取代之烷基、或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示表示氫、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、胺基硫羰基[NH2-C(=S)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或未經取代之烷氧基硫羰基、經取代或未經取代之芳氧基硫羰基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、經取代或未經取代之芳基磺醯基、經取代或未經取代之烷基膦醯基、或經取代或未經取代之芳基膦醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基、或經取代 或未經取代之芳基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；及，B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自其中經取代或未經取代之胺基共價連接於核鹼基部分之非天然核鹼基。
式I化合物誘導跳過人類SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」，產生缺少「外顯子7」之人類SNAP25 mRNA剪接變體，並因此可用於抑制轉錄人類SNAP25前-mRNA之基因的功能活性。
圖1A. 在兩個鄰近神經元細胞之間的突觸接合點中發生的胞外分泌過程的示意性說明。
圖1B.在神經元軸突與肌細胞之間的肌神經接合點中發生的胞外分泌過程的示意性說明。
圖2A.突觸囊泡膜與軸突質膜融合之示意性說明。
圖2B.前-mRNA內之外顯子及內含子之編號的示意性說明。
圖3A.導致刪除內含子N之剪接過程之示意性說明。
圖3B.關於剪接體E錯合物之3'剪接位點與5'剪接位點之示意性說明。
圖4A. DNA及非天然核酸之代表性化學結構。
圖4B.PNA之化學結構及縮略命名之說明。
圖4C.用於改良肽核酸之細胞滲透率之經修飾核鹼基之實例。
圖5.對於式I之肽核酸衍生物可選之天然或非天然(經修飾)核鹼基的實例。
圖6A.對於式I之肽核酸衍生物可選之經取代或未經取代之烷基的實 例。
圖6B.對於式I之肽核酸衍生物可選之經取代或未經取代之烷基醯基及經取代或未經取代之芳基醯基的實例。
圖6C.對於式I之肽核酸衍生物可選之經取代烷基胺基、經取代芳基胺基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、經取代或未經取代之芳基磺醯基、經取代或未經取代之烷基膦醯基及經取代或未經取代之芳基膦醯基的實例。
圖6D.對於式I之肽核酸衍生物可選之經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基及經取代或未經取代之芳基胺基羰基的實例。
圖6E.對於式I之肽核酸衍生物可選之經取代或未經取代之烷氧基硫羰基、經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基及經取代或未經取代之芳氧基硫羰基的實例。
圖7.縮寫為A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)、T(胸嘧啶)、C(胞嘧啶)、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)之PNA單體的化學結構。
圖8.用以描述PNA之N端或C端之取代基的縮寫之化學結構。
圖9.縮寫為「(N→C)Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2」之14-mer PNA衍生物之化學結構。
圖10.縮寫為「(N→C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2」之15-mer PNA衍生物之化學結構。
圖11.用於合成本發明之PNA衍生物之例示性Fmoc-PNA單體之化學結構。
圖12.本發明之SPPS中所採用之典型單體伸長循環之示意性說明。
圖13A.HPLC純化前之「ASO 1」之C18-逆相HPLC層析圖。
圖13B.HPLC純化後之「ASO 1」之C18-逆相HPLC層析圖。
圖14.在HPLC純化後利用「ASO 1」獲得之ES-TOF質譜資料。
圖15A.經0(陰性對照)、10、100或1,000zM「ASO 3」處理之PC12細胞中之巢式PCR產物之電泳分析資料(頂部)；以及說明全長mRNA及具有外顯子跳躍之剪接變體mRNA的PCR產物之擴增子尺寸的圖(底部)。
圖15B.經分配至外顯子5-7之跳躍之PCR產物的桑格定序資料。圖15B中由上至下所揭示的3個核酸序列皆相同且編列為SEQ ID NO：16。
圖16A.經0(陰性對照)、10、100或1,000zM之「ASO 3」處理之PC12細胞中之全長SNAP25 mRNA含量的變化。(按標準誤差之誤差桿)
圖16B.經0(陰性對照)、10、100或1,000zM之「ASO 1」處理之PC12細胞中之全長SNAP25 mRNA含量的變化。(按標準誤差之誤差桿)
圖17A.在0zM(陰性對照)、1zM、10zM、30zM、100zM、300zM、1aM、3aM或10aM下經「ASO 3」處理48小時之PC12細胞中之SNAP25西方墨點資料(頂部圖)及針對β-肌動蛋白歸一化之相對SNAP25表現量(底部圖)。.
圖17B.在0(陰性對照)、100或1,000zM下經「ASO 1」處理48小時抑或72小時之PC12細胞中之SNAP25西方墨點資料。
圖18.在0(陰性對照)、1、10及100fM下經局部投與「ASO 1」之小鼠(每日兩次，持續四天)的皮膚樣品的SNAP25 IHC影像。
圖19A.在0zM(陰性對照)、1zM、10zM、100zM、1aM、10aM或100aM下經「ASO 3」處理48小時之SiMa細胞中之SNAP25西方墨點 資料(頂部圖)及針對β-肌動蛋白歸一化之相對SNAP25表現量(底部圖)。
圖19B.經0zM(陰性對照)、1zM、10zM、100zM、1aM、10aM或100zM之「ASO 3」處理之SiMa細胞中之全長SNAP25 mRNA含量的變化。(按標準誤差之誤差桿)
本發明提供由式I表示之肽核酸衍生物或其醫藥學上可接受之鹽：
Figure 106146552-A0305-02-0017-2
其中，n為介於10與25之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補，或帶一或兩個錯配而與人類SNAP25前-mRNA部分地互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn獨立地表示氘[D]、氫[H]、經取代或未經取代之烷基、或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示表示氫、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、胺基硫羰基[NH2-C(=S)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或未經取代之烷氧基硫羰基、經取代或未經取代之芳氧 基硫羰基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、經取代或未經取代之芳基磺醯基、經取代或未經取代之烷基膦醯基、或經取代或未經取代之芳基膦醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基、或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；及，B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自其中經取代或未經取代之胺基共價連接於核鹼基部分之非天然核鹼基。
式I化合物誘導跳過人類SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」，產生缺少「外顯子7」之人類SNAP25 mRNA剪接變體，並因此可用於抑制轉錄人類SNAP25前-mRNA之基因的功能活性。
用以描述式I化合物之條件「n為介於10與25之間的整數」在字面上表述n為可選自11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及24之整數之群組的整數。
式I化合物互補地結合於自人類SNAP25基因讀出[存取自NCBI參考序列：NG_029626.1]之人類SNAP25前-mRNA之「外顯子7」之3'剪接位點。跨越人類SNAP25前-mRNA中「內含子6」與「外顯子7」之接合點的14-mer序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]為由來自「內含子6」之7-mer及來自「外顯子7」之7-mer組成的3'剪接位點。因此，14-mer前-mRNA序列可習知地表示為[(5'→3')aucccag┃GGUAACA(SEQ ID NO：1)]，其中內含子及外顯子序列分別以「小寫」 字母及「大寫」字母表示，且內含子-外顯子接合點以「┃」標記。前-mRNA之習知標誌由跨越人類SNAP25前-mRNA中「內含子6」與「外顯子7」之接合點的30-mer序列[(5'→3')cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC(SEQ ID NO：2)]進一步說明。外顯子編號可取決於所報導之SNAP25 mRNA轉錄物變化。提供30-merSNAP25序列係為了明確地識別式I化合物之目標剪接位點而不論SNAP25 mRNA之外顯子編號為何。
式I之PNA衍生物中之天然(亦即天然產生的)或非天然(亦即非天然產生的)核鹼基之化學結構例示於圖5中。本發明之天然或非天然核鹼基包含(但不限於)圖5中所提供之核鹼基。提供此類天然及非天然核鹼基係為了說明容許核鹼基之多樣性，且因此不應解釋為限制本發明之範疇。
用以描述式I之PNA衍生物之取代基例示於圖6A至E中。圖6A提供經取代或未經取代之烷基之實例。經取代或未經取代之烷基醯基及經取代或未經取代之芳基醯基例示於圖6B中。圖6C說明經取代烷基胺基、經取代芳基胺基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、或未經取代之芳基磺醯基、經取代或未經取代之烷基膦醯基及經取代或未經取代之芳基膦醯基的實例。圖6D提供經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基及經取代或未經取代之芳基胺基羰基的實例。在圖6E中提供經取代或未經取代之烷氧基硫羰基、經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基及經取代或未經取代之芳氧基硫羰基的實例。提供此類取代基作為實例係為了說明容許核鹼基之多樣性，且因此不應解釋為限制本發明之範疇。本領域技術人員可易於想到寡核苷酸序列係寡核 苷酸與目標前-mRNA序列經取代基在N端或C端的序列特異性結合的決定性因素。
式I化合物緊密結合於如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所例示之互補DNA。式I之PNA衍生物與其全長互補DNA或RNA之間的雙螺旋體具有過高而無法在緩衝溶液中可靠地測定之Tm值。式I之PNA化合物產生高Tm值及長度較短之互補DNA。
式I化合物緊密結合於自人類SNAP25基因轉錄之人類SNAP25前-mRNA之目標3'剪接位點，並干擾包含該化合物之目標外顯子之「剪接體早期錯合物」之形成。由於本發明化合物在空間上抑制「剪接體早期錯合物」之形成，所以剪接出SNAP25「外顯子7」，得到缺少「外顯子7」之SNAP25 mRNA剪接變體。因此，本發明化合物誘導跳過SNAP25「外顯子7」。
歸因於該化合物對於互補前-mRNA序列之強親和力，本發明化合物亦可帶一或兩個錯配而緊密結合於部分互補前-mRNA序列，並誘導跳過SNAP25前-mRNA內之目標外顯子。
式I化合物具有良好細胞滲透率且可易於作為「裸」寡核苷酸遞送至細胞中，如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所例示。因此，本發明化合物誘導跳過SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」，以得到經作為「裸」寡核苷酸之式I化合物處理之細胞中缺少SNAP25「外顯子7」之SNAP25 mRNA剪接變體。式I化合物並不需要用於遞送至細胞中以強力誘導跳過細胞中之目標外顯子的任何構件或調配物。式I化合物容易誘導在經作為次飛莫耳濃度之「裸」寡核苷酸之本發明化合物處理之細胞中跳過SNAP25「外顯子7」。
歸因於良好細胞或膜滲透率，式I之PNA衍生物可作為「裸」寡核苷酸局部投與，以誘導在目標皮膚中跳過SNAP25「外顯子7」。該化合物並不需要調配物來增加至目標組織中的經皮遞送以獲得預期治療或生物活性。通常，式I化合物溶解於水及助溶劑中，且以次皮莫耳濃度局部或經皮投與，以引發在真皮投與位點周圍之所需治療或生物活性。本發明化合物不需要高濃度或浸潤式地調配來引發局部治療活性。
式I化合物可與醫藥學上可接受之酸或鹼組合使用，該醫藥學上可接受之酸或鹼組包括但不限於氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氯酸、甲磺酸、檸檬酸、三氟乙酸等等。
式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽可與醫藥學上可接受之佐劑一起投與給個體，該醫藥學上可接受之佐劑包括但不限於檸檬酸、氫氯酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、異丙醇、小蘇打(sodium bicarbonate)、蒸餾水、防腐劑等等。
本發明化合物可以在1aM(亦即10-18M)至高於1nM範圍中之治療或生物有效濃度局部投與給個體，該濃度將取決於個體之給藥時程、病況或情況等而變化。
較佳為式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽：其中，n為介於10與25之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補，或帶一或兩個錯配而與人類SNAP25前-mRNA部分地互補； S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基、或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示表示氫、甲醯基、胺基羰基、胺基硫羰基、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或未經取代之烷氧基硫羰基、經取代或未經取代之芳氧基硫羰基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、經取代或未經取代之芳基磺醯基、經取代或未經取代之烷基膦醯基、或經取代或未經取代之芳基膦醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基、或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；及，B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：
Figure 106146552-A0305-02-0022-3
其中，R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫及經取代或未經取代之烷 基；L1、L2及L3係由式V表示之共價連接基團，其將鹼性胺基共價連接於核鹼基部分；
Figure 106146552-A0305-02-0023-5
其中，Q1及Qm係經取代或未經取代之亞甲基(-CH2-)，且Qm直接連接於鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代之亞甲基、氧(-O-)、硫(-S-)及經取代或未經取代之胺基[-N(H)-、或-N(取代基)-]；及，m為介於1與15之間的整數。
用以描述式V之條件「m為介於1與15之間的整數」在字面上表述m為可選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14之整數之群組的整數。
所關注的係式I之PNA寡聚物或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為介於11與21之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補，或帶一或兩個錯配而與人類SNAP25前-mRNA部分地互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、 經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、或經取代或未經取代之芳基磺醯基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm係經取代或未經取代之亞甲基，且Qm直接連接於鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代之亞甲基、氧及胺基；及，m為介於1與11之間的整數。
尤其關注的係式I之PNA衍生物或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為介於11與19之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、 經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基、經取代或未經取代之烷基磺醯基、或經取代或未經取代之芳基磺醯基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接於鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧及胺基；及，m為介於1與9之間的整數。
高度關注的係式I之PNA寡聚物或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為介於11與19之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基； B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：R1、R3及R5為氫基，且R2、R4及R6獨立地表示氫、或經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接於鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基；及，m為介於1與8之間的整數。
高度關注的係式I之PNA衍生物或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為介於11與19之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基： R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接於鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自亞甲基及氧基；及，m為介於1與8之間的整數。
最高度關注的係式I之PNA衍生物或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為介於11與19之間的整數；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；式I化合物與人類SNAP25前-mRNA完全互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫基；X為氫基；Y表示經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳基醯基、或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接連接於鹼性胺基；及L2及L3獨立地選自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、- (CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-及-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接連接於鹼性胺基。
特別關注的係式I之PNA衍生物或其醫藥學上可接受之鹽，該式I之PNA衍生物選自下文所提供之化合物之群組：(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；(N→C)Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；(N→C)Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；(N→C)Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；(N→C)Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；(N→C)Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH2；(N→C)Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；(N→C)Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)T-Lys-NH2；(N→C)H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH2；(N→C)苯甲醯基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH2；(N→C)苯甲醯基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)正己醯基-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)正丙基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2； (N→C)Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；(N→C)[N-(2-苯乙基)胺基]羰基-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-Arg-NH2；(N→C)正苯甲醯基-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)N-Me-N-苯基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)對甲苯磺醯基-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-Lys-NH2(N→C)Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；(N→C)苯磺醯基-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)T-NH2；(N→C)苯基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；(N→C)Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2；(N→C)Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH2；(N→C)Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2；(N→C)Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2； (N→C)苯甲基-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2；(N→C)Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH2；(N→C)Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)A-NH2；(N→C)Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2；(N→C)Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2；(N→C)Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2；(N→C)Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；(N→C)Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；及(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2：其中，A、G、T及C分別為具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸嘧啶及胞嘧啶之天然核鹼基的PNA單體；C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)分別為具有由式VI、式VII、式VIII、式IX及式X表示之非天然核鹼基之PNA單體：
Figure 106146552-A0305-02-0031-6
其中，p及q為整數；及，N端及C端取代基之縮寫具體定義如下：「Fmoc-」為「[(9-茀基)甲氧基]羰基-」之縮寫；「Fethoc-」為「[2-(9-茀基)乙基-1-氧基]羰基」之縮寫；「Ac-」為「乙醯基-」之縮寫；「苯甲醯基-」為「苯羰基-」之縮寫；「Piv-」為「特戊醯基-」之縮寫；「正丙基-」為「1-(正丙基)-」之縮寫；「H-」為「氫-」基之縮寫；「對甲苯磺醯基」為「(4-甲苯)-1-磺醯基-」之縮寫；「-Lys-」為胺基酸殘基「離胺酸」之縮寫；「-Val-」為胺基酸殘基「纈胺酸」之縮寫；「-Leu-」為胺基酸殘基「白胺酸」之縮寫；「-Arg-」為胺基酸殘基「精胺酸」之縮寫；「-Gly-」為胺基酸殘基「甘胺酸」之縮寫；「[N-(2-苯乙基)胺基]羰基-」為「[N-1-(2-苯基乙基)胺基]羰基-」之縮寫；「苯甲基-」為「1-(苯基)甲基-」之縮寫；「苯基-」為「苯基-」之縮寫；「Me-」為「甲基-」之縮寫；「-HEX-」為「6-胺基-1-己醯基-」之縮寫；「FAM-」為「5或6-螢光素-羰基-(異構混合物)」之縮寫，且「-NH2」為未經取代之「-胺基」之縮寫。
圖7總體提供縮寫為A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p) 及G(pOq)之PNA單體的化學結構。如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所論述，歸因於其較佳地雜交為「鳥嘌呤」，C(pOq)被視為對應於「胞嘧啶」之經修飾PNA單體。A(p)及A(pOq)被視為充當「腺嘌呤」之經修飾PNA單體，係因為其具有對於「胸嘧啶」之緊密親和力。同樣，歸因於其與「胞嘧啶」富有成效的鹼基配對，G(p)及G(pOq)被認為係等效於「鳥嘌呤」之經修飾PNA單體。
圖8明確地提供用以引入本發明中之式I之PNA衍生物的N端或C端之多樣性的取代基的多種縮寫的化學結構。
為了說明用於此類PNA衍生物之縮寫，經縮寫為「(N→C)Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2」之14-mer PNA衍生物之化學結構提供於圖9中。作為另一說明，經縮寫為「(N→C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2」之15-mer PNA衍生物之化學結構提供於圖10中。
16-mer PNA序列「(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2」等效於DNA序列「(5'→3')ATT-TGT-TAC-CCT-GGG-A(SEQ ID NO：3)」，以便與前-mRNA互補結合。16-mer PNA與在跨越人類SNAP25前-mRNA中之「內含子6」與「外顯子7」之接合點的30-mer前-mRNA序列[(5'→3')cucuuugga ucccag ┃ GGUAACAAAU GAUGC(SEQ ID NO：2)]中經標記為「黑體」及「加底線」之人類SNAP25前-mRNA有16-mer互補重疊。
14-mer PNA序列「(N→C)Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2」等效於DNA序列「(5'→3')TAC-CCT-GGG-ATC-CA(SEQ ID NO：4)」，以便與前-mRNA互補結合。14-mer PNA與在30-mer前-mRNA序列[(5'→3')cucuu uggaucccag ┃ GGUA ACAAAUGAUGC(SEQ ID NO：2)]中經標記為「黑體」及「加底線」之人類SNAP25前-mRNA有14-mer互補重疊。
16-mer PNA序列「(N→C)Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2」等效於DNA序列「(5'→3')ATC-TGT-TAC-CCT-GGG-A(SEQ ID NO：5)」，以便與前-mRNA互補結合。16-mer PNA與在30-mer前-mRNA序列[(5'→3')cucuuugga ucccag ┃ GGUAACA "A" AU GAUGC(SEQ ID NO：2)]中標記為「黑體」及「加底線」之16-mer序列有15-mer互補重疊，其中單個錯配以引號("")標記。16-mer PNA與SNAP25「外顯子7」之3'剪接位點部分互補，具有與「外顯子7」之單一錯配。
用於製備PNA寡聚物之通用程序
PNA寡聚物係基於Fmoc-化學性、根據先前技術[US 6,133,444；WO 96/40685]中揭示之在需要時稍作修改的方法，藉由固相肽合成(SPPS)來合成。此研究中所採用之固體載體為購自PCAS BioMatrix Inc.(Quebec,Canada)之H-Rink Amide-ChemMatrix。具有經修飾核鹼基之Fmoc-PNA單體係如先前技術[PCT/KR 2009/001256]中所描述或稍作修改來合成。具有經修飾核鹼基之此類Fmoc-PNA單體及具有天然核鹼基之Fmoc-PNA單體用於合成本發明之PNA衍生物。具有經修飾核鹼基之Fmoc-PNA單體提供於圖11中。然而，對於本領域之技術人員而言，在此類PNA單體上之保護基團有可能明顯存在許多微小變化。因此，圖11中之Fmoc-PNA單體應被視為實例，且因此不應被視為限制本發明之範疇。PNA寡聚物係藉由C18-逆相HPLC(水/乙腈或水/甲醇以及0.1%TFA)純 化，並藉由包括ESI/TOF/MS之質譜分析表徵。
圖12示意性地說明此研究之SPPS中所採用之典型單體伸長循環，且合成細節提供如下文。然而，對於本領域之技術人員而言，在於自動肽合成器或手動肽合成器上有效執行此類SPPS反應的過程中有可能明顯存在許多微小變化。每一反應步驟簡要提供如下。
[H-Rink-ChemMatrix樹脂之活化]將1.5mL 20%哌啶/DMF中之0.01mmol ChemMatrix樹脂(約20mg樹脂)在libra試管中渦旋20分鐘，且濾出DeFmoc溶液。連續地用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲醯胺(DMF)、1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC來分別將樹脂洗滌30秒。使固體載體上之所得游離胺經受與Fmoc-PNA單體或與Fmoc保護胺基酸衍生物之偶合。
[DeFmoc]將樹脂在1.5mL 20%哌啶/DMF中渦旋7分鐘，且濾出DeFmoc溶液。連續地用1.5mL MC、1.5mL DMF、1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC來分別將樹脂洗滌30秒。緊接著使固體載體上之所得游離胺經受與Fmoc-PNA單體之偶合。
[與Fmoc-PNA單體之偶合]固體載體上之游離胺與Fmoc-PNA單體偶合如下。將0.04mmol Fmoc-PNA單體、0.05mmol HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲
Figure 106146552-A0305-02-0034-33
六氟磷酸鹽]及10mmol DIEA(N,N-二異丙基乙胺)在1mL無水DMF保溫2分鐘，並添加至具有游離胺之樹脂。將樹脂溶液渦旋1小時，並濾出反應介質。接著，連續地用1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC來分別將樹脂洗滌30秒。
[封端]在偶合反應後，藉由在1.5mL封端溶液(5%乙酸酐及6% 2,6-二甲基吡啶於DMF中)搖動5分鐘來將未反應之游離胺封端。接著，將封 端溶液濾出，並連續地用1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC來分別洗滌30秒。
[在N端引入「Fethoc-」基]藉由使樹脂上之游離胺與「Fethoc-OSu」在常見鹼性偶合條件下發生反應來將「Fethoc-」基引入至N端。「Fethoc-OSu」之化學結構[CAS編號179337-69-0，C20H17NO5，MW 351.36]經提供如下。
Figure 106146552-A0305-02-0035-7
[自樹脂裂解]藉由在1.5mL裂解溶液(2.5%三異丙基矽烷及2.5%水於三氟乙酸中)搖動3小時，自樹脂裂解結合於樹脂之PNA寡聚物。濾出樹脂且減壓濃縮濾液。將所得殘餘物用二乙醚濕磨，且藉由過濾收集所得沈澱，以用於藉由逆相HPLC純化。
[HPLC分析及純化]在自樹脂裂解後，藉由用含有0.1% TFA之水/乙腈或水/甲醇(梯度方法)溶離的C18-逆相HPLC來純化PNA衍生物之粗產物。圖13A及圖13B分別為在HPLC純化之前及之後的「ASO 1」的例示性HPLC層析圖。「ASO 1」之寡聚物序列提供於表1中。
式I之PNA衍生物之合成實例
為了互補地靶向人類SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」之3'剪接位點，根據上文所提供或稍作修改之合成程序來製備本發明之PNA衍生物。提供靶向人類SNAP25前-mRNA之此類PNA衍生物係為了例示式I之PNA衍生物，且不應解釋為限制本發明之範疇。
表1提供互補地靶向人類SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」之3'剪 接位點的PNA衍生物以及依據質譜分析之結構表徵資料。在表1中提供SNAP25 ASO係為了例示式I之PNA衍生物，且不應解釋為限制本發明之範疇。
Figure 106146552-A0305-02-0036-8
a)理論準確質量，b)觀測到的準確質量
圖13A為用「ASO 1」之粗產物獲得之HPLC層析圖。藉由C18-RP製備型HPLC純化該粗產物。圖13B為「ASO 1」之純化產物之HPLC層析圖。在製備型HPLC純化後，「ASO 1」之純度顯著改良。圖14提供用「ASO 1」之純化產物獲得之ESI-TOF質譜。提供「ASO 1」之分析資料係為了說明在本發明中純化及識別式I之PNA衍生物的方式，且不應解釋為限制本發明之範疇。
模型PNA衍生物對於互補DNA之結合親和力
評估表1中之互補地靶向N端或C端之PNA衍生物對於10-mer DNA之結合親和力。藉由PNA與10-mer互補DNA之間的雙螺旋體的Tm值來評定結合親和力。表1中之PNA衍生物與完全互補DNA之間的雙螺旋體展示出過高而無法在緩衝水溶液中可靠地測定之Tm值，係因為該緩衝溶液往往會在Tm量測期間煮沸。
如下在UV/Vis質譜儀上測定Tm值。將4μM PNA寡聚物及4μM補充10-mer DNA於4mL緩衝溶液(pH 7.16，10mM磷酸鈉，100mM NaCl)中之混合溶液在15mL聚丙烯法爾康試管(falcon tube)中於90℃下保溫一分鐘，並緩緩冷卻至環境溫度。接著，將溶液轉移至裝備有氣密罩之3mL石英UV光析管中，並使其經受在UV/可見光分光光度計上於260nm處之Tm量測，如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所描述或略有修改。用於Tm量測之10-mer互補DNA購自Bioneer(www.bioneer.com,Dajeon,Republic of Korea)且無需進一步純化即使用。
式I之PNA衍生物之觀測到的Tm值對於與10-mer DNA互補結合而言極高，且未經校正地提供於表2中。舉例而言，「ASO 3」展示出與10-mer互補DNA之雙螺旋體的Tm值為77.3℃，該10-mer互補DNA靶向在[(N→ C)Fethoc- TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G G(5)G-A(6)T-NH2]中經標記為「黑體」及「加底線」之PNA中的N端10-mer。同時，「ASO 3」展示出與10-mer互補DNA的雙螺旋體之Tm為88.7℃，該10-mer互補DNA靶向在[(N→C)Fethoc-TG(5)T-T A(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T -NH2]中經標記為「黑體」及「加底線」之PNA中的C端10-mer。
Figure 106146552-A0305-02-0038-9
式I之PNA衍生物之生物活性的實例
評估表1中所指定之式I之PNA衍生物在鼠源PC12細胞及人源SiMa細胞中之SNAP25反義活性及其在局部投與後抑制C57BL/6小鼠皮膚中之SNAP25表現的能力。提供生物實例作為實例，以說明式I之PNA衍生物之反義活性，且因此不應解釋為將本發明之範疇限制於表1中所列之化合物。
實例1.由「ASO 3」誘導之外顯子跳躍
所指定之「ASO 3」為與跨越人類SNAP25前-mRNA中「內含子6」與「外顯子7」之接合點之3'剪接位點中之14-mer序列完全互補的14-mer ASO。「ASO 3」與在30-mer前-mRNA序列[(5'→3')cucuuugg aucccag ┃ GGUAACA AAUGAUGC(SEQ ID NO：2)]中經標記為「黑體」及「加底線」之14-mer前-mRNA序列互補地重疊。「ASO 3」與「內含子6」有7-mer重疊，且與「外顯子7」有另外7-mer重疊。
同時，14-mer ASO與自大鼠基因DNA讀出[存取自NCBI參考序列：NC_005012]之大鼠SNAP25前-mRNA有13-mer互補重疊，該大鼠SNAP25前-mRNA在25-mer前-mRNA序列[(5'→3')ugg"c" ucccag ┃ GGUAACA AACGAUGC(SEQ ID NO：6)]中經標記為「黑體」及「加底線」，其中單一錯配以引用(" ")符號標記。
評估「ASO 3」在如下所提供之PC12細胞(目錄號CRL-1721，ATCC)中誘導外顯子跳躍之能力。
[細胞培養及ASO處理]在37℃之5% CO2氛圍下，將PC12細胞保持在補充有5% FBS、10%馬血清、1%鏈黴素/青黴素、1% L-麩醯胺酸及1%丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基中。用0(陰性對照)、10、100或1,000zM之「ASO 3」來處理在含有5mL培養基之60mm培養皿中生長之細胞。
[藉由一步PCR之RNA提取及cDNA合成]在用「ASO 3」保溫42小時後，將細胞用100μg/mL環己醯亞胺另外處理6小時，以便凍結核糖體轉譯。接著，使用「通用RNA提取套組」(目錄號9767，Takara)根據製造商之說明書來提取總RNA。根據以下循環條件，針對一組外顯子特異性引子[外顯子1_forward：(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA(SEQ ID NO：7)；及外顯子14_reverse：(5'→3')AGCATCTTTGTTGCACGTTG(SEQ ID NO：8)]，使用具有Platinum® Taq聚合酶之Super Script®單步RT-PCR套組(目錄號10928-042，Invitrogen)使200ng RNA範本經受25μl逆轉 錄反應：50℃下30分鐘及94℃下2分鐘，接著係在94℃下30秒，在50℃下30秒及在72℃下1分鐘的40次循環。
[巢式PCR擴增]根據以下循環條件，針對一組外顯子特異性引子[外顯子1_forward：(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA(SEQ ID NO：7)；及外顯子14n_reverse：(5'→3')TTGTTGGAGTCAGCGCCT(SEQ ID NO：9)]，使1μL cDNA經受20μL巢式PCR反應(目錄號K2612，Bioneer)：95℃下2分鐘，接著係在95℃下30秒，在55℃下30秒及在72℃下1分鐘的34次循環。
[識別外顯子跳躍產物]使PCR產物經受2%瓊脂糖凝膠上之電泳分離。收集目標尺寸之條帶並藉由桑格定序分析。
圖15A提供PCR產物之電泳資料，其中10zM ASO處理樣本產生可分配給5-7之跳躍之微弱PCR條帶。即使細胞經環己醯亞胺處理以藉由凍結核糖體轉譯來使全長mRNA不穩定，仍僅微弱地偵測到外顯子跳躍條帶。因此，可分配給外顯子5-7之跳躍的SNAP25 mRNA剪接變體很可能展示出與全長mRNA相比在細胞中之不良代謝穩定性。外顯子跳躍PCR產物經定序為外顯子5-7之跳躍，如圖15B中所展示。由於在不考慮ASO濃度之情況下觀測到分配給外顯子6之跳躍之PCR產物，所以認為外顯子6之跳躍自發地發生。
全長SNAP25 mRNA之強度在經10zM「ASO 3」處理之細胞中減小最多。隨著ASO濃度自10增加至1,000zM，全長mRNA強度逐漸增加至陰性對照(亦即，未經ASO處理)之強度。巢式PCR資料中之反向劑量反應型態可能係歸因於藉由在利用「ASO 3」之外顯子跳躍期間累積之「外顯子內含子環狀RNA(EIciRNA)」進行轉錄上調。[Nature Struc.Mol. Biol.第22(3)卷，256-264(2015)]
實例2.經「ASO 3」處理之PC12細胞中之SNAP25 mRNA的qPCR.
如下藉由SNAP25巢氏qPCR評估「ASO 3」誘導PC12細胞中之大鼠SNAP25 mRNA含量之變化的能力。
[細胞培養及ASO處理]用0(陰性對照)、10、100或1,000zM之「ASO 3」來處理在含有5mL培養基之60mm培養皿中生長之PC12細胞。(每ASO濃度2個培養皿)
[藉由一步RT-PCR之RNA提取及cDNA合成]在用「SNAP-ASO 3」保溫42小時後，將細胞用100μg/mL環己醯亞胺另外處理6小時，以便凍結核糖體轉譯。接著，使用「通用RNA提取套組」(目錄號9767，Takara)自細胞中提取總RNA，且根據一下循環條件，針對一組外顯子特異性引子[外顯子1_forward：(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA(SEQ ID NO：7)；及外顯子14_reverse：(5'→3')AGCATCTTTGTTGCACGTTG(SEQ ID NO：8)]使用單步RT-PCR套組(Invitrogen,USA)使200ng RNA範本經受25μl逆轉錄反應：50℃下30分鐘及94℃下2分鐘，接著係在94℃下30秒，在55℃下30秒及在72℃下1分鐘之20次循環。
[巢式qPCR擴增]根據以下循環條件，針對一組外顯子特異性引子[外顯子7q_forward：(5'→3')ATGGATGAAAACCTAGAGC(SEQ ID NO：10)；及外顯子8q_reverse：(5'→3')CTTCCCAGCA-TCTTTGTT(SEQ ID NO：11)]，使1μL稀釋100X之各cDNA溶液經受20μL即時PCR反應：95℃下3分鐘，接著係在95℃下10秒及在60℃下30秒的40次循環。用靶向外顯子7與外顯子8之接合點的Taqman探針[(5'→3')5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ(SEQ ID NO：12)]追蹤 qPCR反應以具體地定量全長SNAP25 mRNA。
圖16A提供qPCR資料，其中全長mRNA含量分別在經10zM及100zM之「ASO 3」處理之細胞中顯著減少約50%及20%(史都登氏試驗法)。然而，經1,000zM「ASO 3」處理之細胞中之全長mRNA含量略高於未經ASO處理(亦即陰性對照)之細胞的含量。qPCR資料之反向劑量反應型態與在「實例1」中所描述之外顯子跳躍期間觀測到的全長mRNA含量之劑量反應型態相當一致，表明在ASO劑量自10增加至1,000zM時之轉錄上調。
實例3.經「ASO 1」處理之PC12細胞中之SNAP25 mRNA的qPCR.
表1中所指定之「ASO 1」為與跨越人類SNAP25前-mRNA中內含子6與外顯子7之接合點之3'剪接位點中之16-mer序列完全互補的16-mer ASO。「ASO 1」與在30-mer人類前-mRNA序列[(5'→3')cucuuugga ucccag ┃ GGUAACAAAU GAUGC(SEQ ID NO：2)]中經標記為「黑體」及「加底線」之16-mer目標序列互補地重疊。「ASO 1」與內含子6有6-mer重疊並與外顯子7有10-mer重疊。然而，ASO與在25-mer前-mRNA序列[(5'→3')uggc ucccag ┃ GGUAACAAA "C"GAUGC(SEQ ID NO：6)]中標記為「黑體」及「加底線」之大鼠SNAP25前-mRNA有單一錯配，其中單一錯配以引用(" ")符號標記。
藉由SNAP25巢式qPCR評估「ASO 1」誘導如「實例2」中所描述之PC12細胞中之大鼠SNAP25 mRNA含量之變化，除非另有提及。
圖16B提供qPCR資料，其中全長mRNA含量分別在經10zM、100zM及1,000zM之「SNAP-ASO 1」處理之細胞中顯著減少約50%、40%及70%(史都登氏試驗法)。與在「ASO 3」之情況下相同，當劑量自10增 加至100zM時，利用「ASO 1」部分地再現反響劑量反應型態。然而，考慮到全長mRNA含量隨著ASO濃度增加至1,000zM而進一步減小，「ASO 1」之外顯子跳躍功效似乎比「ASO 3」之功效強。
實例4.藉由「ASO 3」抑制PC12細胞中之SNAP25蛋白表現
如下評估「ASO 3」抑制SNAP25蛋白在PC12細胞中表現的能力。
PC12細胞生長於含有5mL培養基之60mm培養皿中，並用0zM(陰性對照)、1zM、10zM、30zM、100zM、300zM、1aM、3aM或10aM「ASO 3」處理48小時。存在用於陰性對照之4個培養皿來補償西方墨點分析期間之潛在技術偽影。
[細胞分解]接著，利用補充有1% SDS及1×蛋白酶抑制劑混合物(cOmplete Mini,Roche)之200μl 1×RIPA緩衝液(目錄號9806，Cell Signaling Tech)使細胞在冰上經受分解。將溶解產物收集在1.5mL微量試管中，與100μl 5×樣本緩衝液混合，並煮沸5分鐘。
[西方墨點]使溶解產物經受4-15% TGX-PAGE梯度凝膠(目錄號456-1086，Bio-Rad)上之電泳分離，並接著轉移至0.45μM PVDF膜。利用抗SNAP25抗體(目錄號S9684，Sigma)及抗β-肌動蛋白抗體(目錄號A3845，Sigma)來探測膜。
圖17A提供用PC12細胞溶解產物獲得之SNAP25西方墨點資料(頂部圖)以及藉由密度量測術針對β-肌動蛋白歸一化之相對SNAP25表現量(底部圖)。SNAP25蛋白含量在經「ASO 3」處理之細胞中減少10至60%。陰性對照(亦即0zM「ASO 3」)之表現量為4個樣本之平均表現量。
實例5.藉由「ASO 1」抑制PC12細胞中之SNAP25蛋白表現
評估「ASO 1」如「實例4」中所描述抑制PC12細胞中之SNAP25蛋 白表現之能力，除非另有提及。將PC12細胞用0(陰性對照)、100或1,000zM之「ASO 1」處理48小時或72小時。(各ASO濃度用一個培養皿)
圖17B提供48小時(左)及72小時(右)之ASO處理的西方墨點資料。「ASO 1」在兩個時間點顯著地抑制SNAP25蛋白在PC12細胞中之表現。
實例6.抑制小鼠中局部投與「ASO 1」之皮膚中之SNAP25蛋白表現
「ASO 1」與小鼠SNAP25前-mRNA中之「外顯子7」之3'剪接位點完全互補。評估「ASO 1」在局部投與後抑制SNAP25蛋白在皮膚中之表現的能力，如下文所描述。
[除毛及分組]在第0天，用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉8個雌性C57BL/6小鼠(5週大)，並用剪刀切割背上的毛髮(約3cm×4cm)。將小鼠隨機分配成四個群組，亦即，未經ASO處理之群組(陰性對照)及3個1fM、10fM及100fM「ASO 1」處理組。(每組2個動物)
[局部投與]藉由在補充有3%(v/v)丙三醇之30%(v/v)乙醇水溶液中將儲備母溶液稀釋至0(陰性對照)、1、10及100fM「ASO 1」來製備「ASO 1」之局部用溶液。在第0天至第4天期間，在使用棉球除毛之背部皮膚中，每天2次(上午及傍晚)向各動物局部投與約100μL局部用溶液。
[皮膚取樣]在第4天下午，在用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉後處死動物，以便對局部經ASO處理之皮膚的部分取樣。接著，使皮膚樣品經受對於SNAP25蛋白之免疫組織化學(IHC)分析，如下文所描述。
[SNAP25 IHC]將皮膚樣品冰凍切片，並連續用1：200稀釋之初級抗SNAP25抗體(目錄號ab41455，Abcam)、1：200稀釋之二級抗IgG(目錄號BA-1100，Vector)且接著用1：200稀釋之Dylight 594-抗生蛋白鏈菌素(目錄號SA-5594，Vector,CA,USA)免疫染色以獲得紅色螢光標誌。抗 SNAP25抗體探測SNAP25蛋白之C端。在Zeiss幻燈片掃描器上捕捉IHC影像，以評估全長SANP25表現量之變化。另外執行DAPI染色以侷限真皮微結構。
圖18提供按組之SNAP25 IHC影像之代表性集合。在陰性對照組中，全長SNAP25蛋白表現在真皮下方之肌肉層中較高。認為肌肉層中之SNAP25蛋白表現來源於嵌入肌肉中之運動神經元軸突中之SNAP25蛋白表現。肌肉層中之全長SNAP25蛋白表現在ASO處理組中顯著減小。在100fM「ASO 1」處理組中觀測到最顯著減小。皮膚中之全長SNAP25蛋白表現之抑制程度比在PC12細胞中觀測到的程度更強(參考「實例5」)。
考慮到BTX已廣泛用於藉由注射來處理面部皺紋(用於抗衰老)，抑制真皮下方之肌肉層中之SNAP25蛋白表現具有藥理及治療重要性。BTX注射劑與一定餾分之注射劑潛在地分佈至有安全問題之肌肉組織的風險相關。例如，若BTX分佈至肺平滑肌組織，則個體處於肺機能不全之高風險下。
SNAP25抑制活性取決於目標組織中之ASO濃度。在局部投與後，ASO濃度在投與ASO之真皮層遠端的組織中快速減小。有安全問題之目標組織有可能暴露於濃度足夠高以引起安全問題的濃度之ASO。因此，用於局部用途之式I之PNA衍生物的安全性以及個體順應性區別性地優於BTX注射劑。
實例7.藉由「ASO 3」抑制SiMa細胞中之SNAP25蛋白表現.
如下評估「ASO 3」抑制SNAP25蛋白在SiMa人類神經母細胞瘤細胞中之表現的能力。
[細胞培養及ASO]在37℃之5% CO2氛圍下，將SiMa細胞(目錄號 ACC164，DSMZ)保持在補充有10% FBS、1%鏈黴素/青黴素、1% L-麩醯胺酸及1%丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基中。SiMa細胞生長於含有5mL培養基之60mm培養皿中，並用0zM(陰性對照)、1zM至100aM之「ASO 3」處理48小時。存在用於陰性對照之3個培養皿來補償西方墨點分析期間之潛在技術偽影。
[分解]利用補充有0.1% SDS及1×蛋白酶抑制劑混合物(cOmplete Mini,Roche)之200μl 1×RIPA緩衝液(目錄號9806，Cell Signaling Tech)使細胞經受在冰上分解。接著，將溶解產物收集在1.5mL微量試管中，與100μl 5×樣本緩衝液混合，並煮沸5分鐘.
[西方墨點]使溶解產物經受12% SDS-PAGE凝膠上之電泳分離，並轉移至0.2μM聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。利用抗SNAP25抗體(目錄ab41455，Sigma)及抗β-肌動蛋白抗體(目錄號A3845，Sigma)探測膜。
圖19A提供用細胞溶解產物獲得之SNAP25西方墨點資料(頂部圖)以及藉由密度量測術針對β-肌動蛋白歸一化之相對SNAP25表現量(底部圖)。陰性對照(亦即0zM「ASO 3」)之表現量為3個樣本之平均表現量。SNAP25蛋白含量在經「ASO 3」處理之細胞中減少40至50%。
SNAP25實例8.經「ASO 3」處理之SiMa細胞中之SNAP25 mRNA的qPCR.
如下藉由SNAP25巢式qPCR評估「ASO 3」誘導SiMa細胞中之人類SNAP25 mRNA含量之變化的能力。
[細胞培養及ASO處理]SiMa細胞生長於含有5mL培養基之60mm培養皿中，並用0zM(陰性對照)、1zM、10zM、100zM或1aM、10aM或100aM之「ASO 3」處理。(每ASO濃度2個培養皿)
[RNA提取及cDNA合成]使用「RNeasy Mini Kit」(目錄號74106，Qiagen)根據製造商之說明書自細胞中提取總RNA。針對無規六聚物，使用PrimeScript第1股cDNA合成套組(目錄號6110B，Takara)使200ng RNA範本經受25μl逆轉錄反應。
[qPCR擴增]針對一組外顯子特異性引子[外顯子6_forward：(5'→3')GACGAAC-GGGAGCAGATG(SEQ ID NO：14)；及外顯子8_reverse(2)：(5'→3')ATCTCATTGCCCATATCCAGG(SEQ ID NO：15)]，以靶向外顯子6與外顯子7之接合點之Taqman探針[(5'→3')56-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ(SEQ ID NO：13)]來監測PCR反應。循環條件：95℃下3分鐘，接著係在95℃下15秒及在60℃下30秒之40次循環。
圖19B提供qPCR資料，其中全長人類SNAP25 mRNA含量在經1zM、100zM、1aM及100aM之「ASO 3」處理之細胞中顯著減少20及40%(史都登氏試驗法)。經100aM之ASO處理之細胞展示出40%之最強抑制率。
<110> 韓商奧利通公司(OLIPASS CORPORATION)
<120> SNAP25反義寡核苷酸
<130> OSH-00670(32567-00670)
<140> TW106146552
<141> 2016-12-05
<150> US62/443,262
<151> 2017-01-06
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
Figure 106146552-A0305-02-0048-11
<210> 2
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
Figure 106146552-A0305-02-0048-12
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 3
Figure 106146552-A0305-02-0048-13
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 4
Figure 106146552-A0305-02-0048-14
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 5
Figure 106146552-A0305-02-0049-15
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 家鼠種
<400> 6
Figure 106146552-A0305-02-0049-16
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 7
Figure 106146552-A0305-02-0049-18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 8
Figure 106146552-A0305-02-0049-19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 9
Figure 106146552-A0305-02-0049-20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 10
Figure 106146552-A0305-02-0050-21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 11
Figure 106146552-A0305-02-0050-22
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成探針
<400> 12
Figure 106146552-A0305-02-0050-23
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成探針
<400> 13
Figure 106146552-A0305-02-0050-24
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 14
Figure 106146552-A0305-02-0051-25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 15
Figure 106146552-A0305-02-0051-26
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 16
Figure 106146552-A0305-02-0051-27
Figure 106146552-A0101-11-0002-1

Claims (5)

  1. 一種由式I表示之肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽：
    Figure 106146552-A0305-02-0052-28
     其中，n為介於13與25之間的整數；該式I化合物與人類SNAP25前-mRNA中之14-mer前-mRNA序列[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA(SEQ ID NO：1)]有至少10-mer互補重疊；該式I化合物與該人類SNAP25前-mRNA完全互補，或帶一或兩個錯配而與該人類SNAP25前-mRNA部分地互補；S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1及Tn為氫[H]基；X及Y獨立地表示表示氫或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示胺基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基及非天然核鹼基；及，B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：
    Figure 106146552-A0305-02-0052-29
     其中R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；L1、L2及L3係各自獨立地為由式V表示之共價連接基團，其將鹼性胺基共價連接於該核鹼基部分：
    Figure 106146552-A0305-02-0053-31
     其中Q1及Qm係亞甲基(-CH2-)，且Qm直接連接於該鹼性胺基；Q2、Q3、…及Qm-1獨立地選自亞甲基或氧(-O-)基；及，m為介於1與15之間的整數。
  2. 如請求項1之肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽：其中，n為介於13與19之間的整數；該式I化合物與該人類SNAP25前-mRNA完全互補；X為氫基；Y表示經取代或未經取代之烷氧基羰基；B1、B2、…、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及非天然核鹼基；B1、B2、…、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接連接於該鹼性胺基；及 L2及L3獨立地選自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-及-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接連接於該鹼性胺基。
  3. 如請求項1之肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽，該肽核酸衍生物選自以下所提供之肽核酸衍生物的群組：(N→C)Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；及(N→C)Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；其中，A、G、T及C分別為具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸嘧啶及胞嘧啶之天然核鹼基的PNA單體；C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)分別為具有由式VI、式VII、式VIII、式IX及式X表示之非天然核鹼基之PNA單體：
    Figure 106146552-A0305-02-0054-32
     其中，p及q為整數；及， N端及C端取代基之縮寫具體定義如下：「Fethoc-」為「[2-(9-茀基)乙基-1-氧基]羰基」之縮寫，且「-NH2」為未經取代之「-胺基」。
  4. 一種如請求項1至3中任一項之肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽之用途，其係用以製備用於治療由SNAP25基因過度表現介導之皮膚病病徵或病況之藥物。
  5. 如請求項4之用途，其中該藥物係用於局部投與。
TW106146552A 2017-01-06 2017-12-29 Ｓｎａｐ２５反義寡核苷酸 TWI769208B (zh)

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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102304280B1 (ko) 2018-08-14 2021-09-23 올리패스 주식회사 아세틸코에이카복실라제2 안티센스 올리고뉴클레오티드

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6617422B1 (en) * 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
CN102015628A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 Cti生物公司 具有良好细胞穿透和强核酸亲和性的肽核酸衍生物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1273614C (zh) 2001-09-14 2006-09-06 中国科学院上海生命科学研究院 突触小体缔合性膜蛋白25及其应用
US20190345202A1 (en) * 2016-08-08 2019-11-14 Olipass Corporation Androgen receptor antisense oligonucleotides
RU2748834C2 (ru) * 2016-09-16 2021-05-31 Олипасс Корпорейшн Антисмысловые олигонуклеотиды против scn9a
CN110248956B (zh) * 2016-10-11 2023-02-21 奥利通公司 HIF-1α反义寡核苷酸
CN110506051A (zh) * 2016-12-30 2019-11-26 奥利通公司 通过肽核酸衍生物的外显子跳跃

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6617422B1 (en) * 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
CN102015628A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 Cti生物公司 具有良好细胞穿透和强核酸亲和性的肽核酸衍生物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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期刊 Andrew M Siwkowski et al., Identification and functional validation of PNAs that inhibit murine CD40 expression by redirection of splicing.Nucleic Acids Res.2004 May 17; 32(9):2695-706. doi: 10.1093/nar/gkh584.Print 2004. *

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