TWI775764B - 雄激素受體反義寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明提供靶向人類雄激素受體前mRNA內之「外顯子5」之5'剪接位點的肽核酸衍生物。該等肽核酸衍生物強效地誘導細胞中之該雄激素受體mRNA的剪接變異體，且適用於在局部投與後安全地治療涉及雄激素活性的皮膚學病症或病狀。

Description

雄激素受體反義寡核苷酸
本發明係關於病狀靶向雄激素受體前mRNA以用於治療由雄激素活性介導之皮膚學病症或病狀的肽核酸衍生物，且主張受益於2016年8月8日申請之美國臨時申請案第62/372035號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。
脫髮為特徵在於首先在頭皮上掉髮及毛髮稀化的病症。亦稱作「男性型禿髮」之雄激素性脫髮係由毛囊及周圍組織中之明顯的雄激素活性造成的。
雖然雄激素性脫髮影響男性及女性兩者，但該病症通常在男性與女性中以不同方式展示。男性有可能經歷點禿，而女性更可能經歷頭皮上之整體毛髮稀化。雄激素性脫髮在年齡30至50之男性中的發病率為大致58%[J.Invest.Dermatol.第9卷，296-300(1997)]。雄激素性脫髮係由被稱為雄激素之男性類固醇激素的改變造成的[New Engl.J.Med.第341卷，491-7(1999)；Mol.Cell Endocrinol.第198卷，89-95(2002)]。
雄激素調節皮脂腺中之皮脂的釋放、毛囊中之毛髮生長、系統性性慾等。雄激素刺激較小絨毛毛囊之逐漸轉化，使得一些區域中之未經著色的細且短的毛髮撐大終端毛囊(例如，臉部)。然而，與終端毛囊上之此雄 激素作用相比，在兩鬢及頭皮頂點上發生終端毛囊逐漸退化成絨毛毛囊，此通常稱作『雄激素悖論』。[Expert Opin.Drug Discov.第10卷，269-292(2015)]
雄激素性脫髮及DHT：5α-還原酶將睪固酮還原成5α-二氫睪固酮(DHT)，一種比睪固酮更強且有效的雄激素。與未禿髮男性相比，在年輕的禿髮男性中觀測到前額毛囊中之DHT產量顯著增加。[(Ind.J.Dermatol.Vene.Leprol.第79卷，613-625(2013)]具有雄激素性脫髮之男性傾向於展示比不具有雄激素性脫髮之彼等更低水準之「總睪固酮」。實際上，DHT水準在具有雄激素性脫髮之男性中比在不具有雄激素性脫髮之彼等中更高。DHT係由睪固酮利用5α-還原酶產生的。具有雄激素性脫髮之男性在毛囊中表現比不具有雄激素性脫髮之彼等更高水準之5α-還原酶。DHT對毛囊之小型化，及因此雄激素性脫髮高度負責。[Endocrinology，第151卷，2373-2380(2010)]
非那雄安(Finasteride)及度他雄胺(dutasteride)抑制5α-還原酶，且因此減少可供毛囊及周圍組織中之雄激素受體使用的DHT水準。該兩種小分子抑制劑已用於治療男性型禿髮，而不管來源於系統性雄激素活性之下調的不良影響。不良影響包括性功能障礙、眩暈、虛弱、頭痛、流鼻涕、皮疹等。[New Engl.J.Med.第362卷，1237-8(2010)]。
局部AR拮抗劑：雄激素藉由結合至雄激素受體(AR)表現其等藥理學活性。AR拮抗劑結合至AR且抑制雄激素之生理性功能，且因此當恰當地遞送至毛囊及周圍組織時，可用於治療雄激素性脫髮。為避免藉由抑制系統性雄激素活性所引發之副作用，直接局部投與AR拮抗劑至頭皮組織。
酮康唑(Ketoconazole)具有除其出名的抗真菌活性以外的較弱的AR 拮抗活性。含有2%酮康唑之洗髮精(以商業品牌名稱為Nizoral®)已用於局部治療雄激素性脫髮。[J.Dermatol.Sci.第45(1)卷，66-68(2007)]
托皮魯麥德(Topilutamide)為稱為弗魯得瑞(fludiril)之AR拮抗劑。托皮魯麥德作為治療雄激素性脫髮之2%局部配方在多個歐洲國家中以品牌名稱「Eucapil」市售。[Dermatol.Surg.第28(8)卷，678-685(2002)]
毛囊中之AR蛋白質或mRNA：在具有雄激素性脫髮之男性及女性個體中，發現AR表現在前額毛囊中比在枕骨毛囊中更高。[J.Investig.Dermatol.第109卷，296-300(1997)]若AR表現選擇性地在毛囊及周圍組織中由試劑下調，則此類試劑可安全地治療雄激素性脫髮而不引起由雄激素活性之系統性下調而造成的不良跡象。在另一文獻中，發現具有雄激素性脫髮之女性展示在前額及頭頂毛囊中比在枕骨毛囊中更高水準之AR mRNA。[Genetics Mol.Res.第12(2)卷，1834-1840(2013)]
核糖體蛋白合成：蛋白質由DNA(2-去氧核糖核酸)編碼。回應於細胞刺激，DNA經轉錄以在細胞核中產生前mRNA(前信使核糖核酸)。前mRNA之內含子以酶方式剪接出，以產生mRNA(信使核糖核酸)，其隨後易位至胞溶質區室。在胞溶質中，稱作核糖體之轉譯機制錯合物結合至mRNA且當其沿mRNA掃描編碼之遺傳性資訊時進行蛋白質合成。[Biochemistry第41卷，4503-4510(2002)；Cancer Res.第48卷，2659-2668(1988)]
以序列特異性方式(亦即互補)結合於RNA之寡核苷酸稱作反義寡核苷酸(ASO)。ASO可緊密地結合至mRNA且在胞溶質中抑制由核糖體沿mRNA合成蛋白質。ASO需要存在於細胞內以便抑制其靶蛋白之核糖體蛋白合成。
剪接過程：DNA經轉錄以在細胞核中產生前mRNA(前信使核糖核酸)。隨後在缺失內含子之後利用如下文圖式中示意性彙總之統稱為「剪接」的一系列複雜反應將前mRNA加工成mRNA。[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(5),386-398(2005)；Nature Rev.Mol.Cell Biol.15(2),108-121(2014)]
藉由在前mRNA與剪接銜接子因子之間形成「剪接體E複合物」(亦即早期剪接體複合物)來開始剪接。在「剪接體E複合物」中，U1結合至外顯子N及內含子N之接合點，且U2AF35結合至內含子N及外顯子(N+1)之接合點。因此外顯子/內含子或內含子/外顯子之接合點對於形成早期剪接體複合物係關鍵的。「剪接體E複合物」演變成「剪接體A複合物」，之後與U2額外複合。「剪接體A複合物」經受一系列複雜反應以刪除或剪接出內含子以鄰接相鄰的外顯子。
Figure 106126503-A0305-02-0005-1
剪接之反義抑制：在細胞核中，ASO可緊密地結合至前mRNA內之某一位置，且可干擾將前mRNA剪接成mRNA之剪接過程，從而產生全長mRNA或缺少靶向外顯子之mRNA變異體。此類mRNA稱作「剪接變異體」，編碼小於由全長mRNA編碼之蛋白質的蛋白質。
原理上，剪接可由抑制「剪接體E複合物」之形成來中斷。若ASO緊密地結合至(5'→3')外顯子-內含子之接合點(亦即「5'剪接位點」)，則ASO阻斷在前mRNA與因子U1之間的複合物形成，及因此阻斷「剪接體E複合物」之形成。同樣地，若ASO緊密地結合至(5'→3')內含子-外顯子之接合點(亦即「3'剪接位點」)，則不能形成「剪接體E複合物」。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易受內源性核酸酶降解影響，從而限制其等治療性效用。迄今為止，已深入地研發且研究大量非天然寡核苷酸。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]發現其中之一些展示相比於DNA及RNA經擴展的代謝穩定性。下文所提供為少量代表性非天然寡核苷酸之化學結構。此類寡核苷酸可預測地如DNA或RNA一樣結合至其互補核酸。
Figure 106126503-A0305-02-0006-2
B：核鹼基
硫代磷酸酯寡核苷酸：硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)為DNA類似物，其中主鏈磷酸根氧原子中之一者經硫原子/單體置換。此較小的結構性改變使得PTO對核酸酶降解具有相當地抵抗性。[Ann.Rev.Biochem.第54卷，367-402(1985)]
反映PTO與DNA之間的主鏈的結構類似性，其等均較差地滲透大多數哺乳動物細胞類型中之細胞膜。然而，對於充分表現DNA之轉運體的 一些細胞類型，DNA及PTO展示良好的細胞吸收。已知全身性投與PTO易於分配至肝及腎臟。[Nucleic Acids Res.第25卷，3290-3296(1997)]
為增大PTO之活體外細胞膜滲透性，已廣泛實施脂質體轉染。然而，脂質體轉染物理上改變細胞膜，造成細胞毒性，且因此對於長期醫療使用將係不安全的。
歷經過去的30年，反義PTO及PTO變異體已經臨床評估以治療癌症、免疫病症、代謝疾病等。[Biochemistry第41卷，4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]部分歸因於PTO之不良的膜滲透性，此類反義候選藥物之多種尚未成功地研發。為克服不良的膜滲透性，為了治療活性，PTO需要高劑量投與。然而，已知PTO與包括凝血時間增加、補體活化、管狀腎病變、庫普弗細胞活化(Kupffer cell activation)之劑量限制毒性及包括脾腫大、淋巴增生、單核細胞浸潤之免疫刺激相關。[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.第33卷，533-540(2006)]
已發現多種反義PTO展示對於具有自肝或腎臟有顯著貢獻之疾病的適當臨床活性。米泊美生(Mipomersen)為抑制apoB-100(一種涉及LDL膽固醇轉運之蛋白質)之合成的PTO類似物。米泊美生在一定數目之動脈粥樣硬化患者中體現適當臨床活性，最可能係歸因於其較佳的分佈至肝。[Circulation第118(7)卷，743-753(2008)]ISIS-113715為抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶1B(PTP1B)之合成的PTO反義類似物，且發現其在II型糖尿病患者中展示治療活性。[Curr.Opin.Mol.Ther.第6卷，331-336(2004)]
鎖核酸：在鎖核酸(LNA)中，RNA之主鏈核糖環在結構上受限以提高RNA或DNA之結合親和力。因此，LNA可視為高親和力DNA或RNA類 似物。[Biochemistry第45卷，7347-7355(2006)]類似於PTO，LNA亦展示不良的細胞膜滲透性。
二胺基磷酸酯嗎啉基寡核苷酸：在二胺基磷酸酯嗎啉基寡核苷酸(PMO)中，DNA之主鏈磷酸酯及2-去氧核糖分別經胺基磷酸酯及嗎啉置換。[Appl.Microbiol.Biotechnol.第71卷，575-586(2006)]儘管DNA主鏈帶負電，但PMO主鏈不帶電。因此PMO與mRNA之間的結合不含主鏈之間的靜電排斥，且傾向於比DNA與mRNA之間的結合更堅固。由於PMO在結構上與DNA極其不同，所以PMO將不被識別DNA或RNA之肝臟轉運體識別。然而，PMO亦不易於滲透細胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)為N-(2-胺基乙基)甘胺酸作為單元主鏈之多肽，且由Nielsen博士及同事發現。[Science第254卷，1497-1500(1991)]藉由下文所提供之圖式說明原型PNA之化學結構及縮寫命名。類似於DNA及RNA，PNA亦選擇性地結合至互補核酸。[Nature(倫敦)第365卷，566-568(1992)]在結合至互補核酸中，PNA之N端視為等效於DNA或RNA之「5'端」，且PNA之C端等效於DNA或RNA之「3'端」。
Figure 106126503-A0305-02-0008-3
類似於PMO，PNA主鏈不帶電。因此，PNA與RNA之間的結合傾向於比DNA與RNA之間的結合更堅固。由於PNA在化學結構上明顯地不同於DNA，所以PNA將不被識別DNA之肝臟轉運體識別，且將展示不同於DNA或PTO之組織分佈特徵。然而，PNA亦較差地滲透哺乳動物細胞膜。(Adv.Drug Delivery Rev.第55卷，267-280,2003)
修飾核鹼基以改良PNA之膜滲透性：藉由引入具有陽離子型脂質或共價附接於其上之其等效物的經修飾之核鹼基使得PNA對哺乳動物細胞膜高度可滲透。此類經修飾之核鹼基之化學結構提供於上文。發現胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤之此類經修飾之核鹼基分別與鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶可預測地且互補地雜交。[PCT專利申請案第PCT/KR2009/001256號；EP2268607；US8680253]
Figure 106126503-A0305-02-0009-4
此類經修飾之核鹼基併入至PNA上類似於脂質體轉染之情形。藉由脂質體轉染，寡核苷酸分子纏繞有諸如脂染胺之陽離子型脂質分子，且此類脂染胺/寡核苷酸複合物相比於裸寡核苷酸分子傾向於更容易地滲透細胞膜。
除良好膜滲透性以外，發現彼等PNA衍生物具有對於互補核酸之超強親和力。舉例而言，將4個至5個經修飾之核鹼基引入至11-聚體至13-聚體PNA衍生物上，易於產生20℃之Tm增益或與互補DNA之更高度雙螺旋形成。此類PNA衍生物對單鹼基錯配高度敏感。單鹼基錯配視經修飾鹼基類型以及PNA序列而定產生11℃至22℃之Tm耗損。
AR反義寡核苷酸(AR ASO)：原理上，靶向AR mRNA之ASO可抑制雄激素受體之核糖體蛋白合成。存在抑制細胞中之AR表現的AR ASO報告案例。舉例而言，EZN-4176(一種互補地靶向AR mRNA之LNA/DNA間 隔體)下調腫瘤細胞以及前列腺癌之動物模型之腫瘤中之AR表現。[Mol.Cancer.Ther.第10(12)卷，2309-2319(2011)]
靶向AR mRNA之外顯子1或外顯子8之ASO抑制前列腺癌細胞以及前列腺癌之對用恩雜魯胺(Enzalutamide)(一種AR拮抗劑)的化學治療具有耐受性之動物模型的腫瘤中的AR表現。[Clin.Cancer Res.第21(7)卷，1675-1687(2015)]
藉由局部施用AR ASO下調毛囊中之AR：毛囊及周圍組織中之雄激素活性的下調可藉由抑制毛囊及周圍組織中之AR表現來達成。若ASO遞送至毛囊及周圍組織中，則毛囊中之AR表現可用AR ASO下調。
為避免下調系統性雄激素活性之副作用，需要使AR表現在毛囊及周圍組織中局部下調以用於治療雄激素性脫髮。若ASO經製得或調配以易於遞送至毛囊中，則局部施用AR ASO至頭皮表皮將為抑制毛囊及周圍組織中之AR局部表現的最安全模式。迄今為止，對於局部治療雄激素性脫髮，已幾乎不使用AR ASO。已主要評估AR ASO用於系統性投與以治療對雄激素消融療法具有耐受性的前列腺癌。
本發明提供一種由式I表示之肽核酸衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：
Figure 106126503-A0305-02-0010-5
其中，n為10與21之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3') CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示氫[H]、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷磺醯基，或經取代或未經取代之芳磺醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；以及B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自具有與核鹼基部分共價連接之經取代或未經取代之胺基的非天然核鹼基。
式I化合物誘發人類AR前mRNA之替代性剪接，產生缺少「外顯子5」之AR mRNA剪接變異體，且因此適用於在局部投與後安全地治療涉及雄激素活性的皮膚學病症或病狀。
圖1(A)至圖1(C). 可選用於式I之肽核酸衍生物的天然或非天然(經修飾之)核鹼基之實例。
圖2(A)至圖2(E). 可選用於式I之肽核酸衍生物的取代基實例。
圖3. 具有天然或經修飾之核鹼基之PNA單體的化學結構。
圖4. N端或C端取代基之縮寫的化學結構。
圖5(A). 「(N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)」之PNA衍生物的化學結構。
圖5(B). 「(N→C)苯甲醯基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)」之PNA衍生物的化學結構。
圖6. 合成本發明之PNA衍生物所採用之Fmoc-PNA單體的化學結構。
圖7(A)至圖7(B). 分別在HPLC純化之前及之後的「ASO 1」之C18-逆相HPLC層析圖。
圖8(A). 對用0 aM(陰性對照)、3 aM、30 aM、300 aM或3 fM「ASO 5」處理之MCF7細胞之巢式PCR產物的電泳分析。
圖8(B). 用於外顯子4至外顯子5之跳躍之PCR帶之示意性圖示以及定序分析資料。
圖9(A). 用0 zM(陰性對照)或1 zM至1 aM之「ASO 5」處理5小時的MCF7細胞中之外顯子4至外顯子6之相對水準的改變。(史都登氏t-測試(student's t-test)之統計分析)
圖9(B). 用0 zM(陰性對照)或1 zM至1 aM之「ASO 1」處理5小時的MCF7細胞中之外顯子4至外顯子6之相對水準的改變。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖9(C). 用0 zM(陰性對照)或1 zM至1 aM之「ASO 10」處理5小時的MCF7細胞中之外顯子4至外顯子6之相對水準的改變。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖10(A). 用0 zM(陰性對照)或100 zM至300 aM之「ASO 1」處理的MCF7細胞之西方墨點資料。
圖10(B). 用0 zM(陰性對照)或10 zM至30 aM之「ASO 5」處理的MCF7細胞之西方墨點資料。
圖11(A). 在脫毛之後的數天中，脫毛之表皮區域中之按組的毛髮生長影像。
圖11(B). 「ASO 1」處理組相對於陰性對照(媒劑)組之相對亮度記分。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖12. 自用0 fM(陰性對照，媒劑)、0.2 fM或1 fM之「ASO 1」處理之動物中獲得的表皮樣品之AR IHC(紅色)及DAPI(藍色)螢光影像的代表集。
圖13. 「ASO 5」處理組相對於陰性對照(媒劑)組之相對亮度記分。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖14(A). 「ASO 10」處理組相對於陰性對照(媒劑)組之相對亮度記分。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖14(B). 自用0 fM(陰性對照，媒劑)、1 fM、5 fM或25 fM之「ASO 10」處理之動物中獲得的表皮樣品之AR IHC(紅色)及DAPI(藍色)螢光影像的代表集。
圖15. 利用用0 zM(陰性對照)、1 zM、10 zM、100 zM或1,000 zM之「ASO 10」處理24小時之MCF7細胞相對於陰性對照中之塔克曼分析法(TaqMan assay)之相對AR mRNA水準的qPCR資料。(史都登氏t-測試之統計分析)
圖16. 自每週2次皮下持續4週投與0皮莫耳/公斤(陰性對照)、0.01皮 莫耳/公斤或0.1皮莫耳/公斤之「ASO 10」的小鼠中獲得之組織樣品之AR IHC(紅色)及DAPI(藍色)螢光影像的代表集。
本發明提供一種由式I表示之肽核酸衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：
Figure 106126503-A0305-02-0014-6
其中，n為10與21之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示氫[H]、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷磺醯基，或經取代或未經取代之芳磺醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基； B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；以及B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自具有與核鹼基部分共價連接之經取代或未經取代之胺基的非天然核鹼基。
式I化合物誘發人類AR前mRNA之替代性剪接，產生缺少「外顯子5」之AR mRNA剪接變異體，且因此適用於在局部投與後安全地治療涉及雄激素活性的皮膚學病症或病狀。
「n為10與21之間的整數」的條件字面上陳述，n為可選自11、12、13、14、15、16、17、18、19及20之整數之群的整數。
式I化合物緊密地結合至由人類AR基因轉錄的人類AR前mRNA之「外顯子5」之5'剪接位點。[NCBI參考序列：NC_000023.11]儘管外顯子及內含子數目可視AR mRNA轉錄而變化，但由來自「外顯子5」之20-聚體及來自「內含子5」之20-聚體構成的40聚體AR前mRNA序列明確地讀取[(5'→3')GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG-GUAAGGAAAAGGGAAGUGGG(SEQ ID NO：2)]。40-聚體前mRNA序列可替代地表示為[(5'→3')GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG｜guaaggaaaagggaaguggg(SEQ ID NO：2)]，其中外顯子序列及內含子序列分別用「大寫」字母及「小寫」字母表示，且外顯子/內含子接合點用「｜」表示。
用於描述本發明中之式I化合物之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體前mRNA序列由AR「外顯子5」中之9-聚體及AR「內含子5」中之8-聚體構成。因此，17-聚體前mRNA序列可替代地讀取[(5'→3')CCUUGCCUG｜ guaaggaa(SEQ ID NO：1)]。
式I化合物緊密地結合至人類AR前mRNA中之外顯子5之靶向5'剪接位點，且干擾涉及化合物之靶向外顯子的「剪接體早期複合物」之形成。由於本發明之化合物在空間上抑制「剪接體早期複合物」之形成，所以AR「外顯子5」經剪接出以得到缺少「外顯子5」之一或多種AR mRNA剪接變異體。因此，本發明之化合物誘導「外顯子5」之跳躍。
式I化合物緊密地結合至如例示於先前技術[PCT/KR2009/001256]中之互補DNA。式I之PNA衍生物與其全長互補DNA或RNA之間的雙螺旋展示過高以不能在水性緩衝劑中可靠地測定的Tm值。式I之PNA化合物仍與較短長度(例如，10-聚體)之互補DNA產生較高的Tm值。
由於較高的結合親和力，本發明之PNA衍生物強效地誘導細胞中之「外顯子5」之跳躍，即使與「外顯子5」之5'剪接位點具有少至9-聚體的互補重疊，但此較少數目之重疊可增加與其他前mRNA交叉反應性的風險。若本發明之PNA衍生物用於局部治療性目的，則預測交叉反應性之風險大大降低。
式I之PNA衍生物中之天然或非天然核鹼基之化學結構例示於圖1(A)至圖1(C)。本發明之天然(亦即天然存在)或非天然(亦即非天然存在)核鹼基包含(但不限於)圖1(A)至圖1(C)中所提供之核鹼基。此類非天然核鹼基之提供係為了說明可允許核鹼基之多樣性，且因此不應解釋為限制本發明之範疇。熟習此項技術者可容易地理解，只要非天然核鹼基之變異體滿足與其靶向前mRNA序列之所需互補，則此類變異體對於式I之PNA化合物中的特定位置係可能的。
用於描述式I之PNA衍生物的取代基例示於圖2(A)至圖2(E)。圖2(A) 提供經取代或未經取代之烷基之實例。經取代或未經取代之烷基醯基及經取代或未經取代之烷基醯基或芳醯基例示於圖2(B)中。圖2(C)說明經取代或未經取代之烷基胺基、經取代或未經取代之芳胺基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷磺醯基或芳磺醯基，及經取代或未經取代之烷基膦醯基或芳基膦醯基的實例。圖2(D)提供經取代或未經取代之烷氧基羰基或芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷基胺基羰基或芳基胺基羰基的實例。在圖2(E)中提供經取代或未經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或未經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或未經取代之烷氧基硫羰基，及經取代或未經取代之芳氧基硫羰基的實例。此類例示性取代基之提供係為了說明可允許取代基之多樣性，且因此不應解釋為限制本發明之範疇。熟習此項技術者可容易地理解，寡核苷酸序列為寡核苷酸與靶向前mRNA序列在N端或C端中之取代基上的序列特異性結合的首要因素。
式I化合物具有良好的細胞滲透性且若如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所例示之「裸」寡核苷酸形式處理，則可容易地遞送至細胞中。因此，本發明之化合物誘導人類AR前mRNA中之「外顯子5」之跳躍以在用作為「裸」寡核苷酸之式I化合物處理的細胞中產生缺少AR「外顯子5」之AR mRNA剪接變異體。式I化合物不需要任何方法或調配以用於傳送至細胞中以強效地誘導細胞中之靶向外顯子之跳躍。式I化合物容易誘導用作為「裸」寡核苷酸之本發明之化合物以低於飛莫耳濃度處理的細胞中之AR「外顯子5」之跳躍。
由於良好的細胞或膜滲透性，式I之PNA衍生物可作為「裸」寡核苷酸局部投與以誘導靶向表皮中之AR「外顯子5」之跳躍。式I化合物不需要調配以提高用於局部治療或生物活性之經皮遞送。通常將式I化合物溶 解於水及共溶劑中，且以低於皮莫耳濃度局部或經皮投與以在靶向表皮中誘發所需要的治療活性或生物活性。本發明之化合物不需要經大量地或侵人性地調配以誘發局部治療活性。
式I化合物可與包括(但不限於)以下的醫藥學上可接受之酸或鹼組合使用：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氯酸、甲磺酸、檸檬酸、三氟乙酸等。
式I之PNA衍生物或其醫藥學上可接受之鹽可與包括(但不限於)以下的醫藥學上可接受之佐劑組合投與個體：檸檬酸、氫氯酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、異丙醇、碳酸氫鈉、蒸餾水、防腐劑等。
本發明之化合物可以介於1 aM至高於1nM範圍內之治療上或生物學上之有效濃度局部投與個體，該有效濃度將視給藥時程、個體之病狀或情境等而變化。
較佳為式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為10與21之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示氫[H]、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基 羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷磺醯基，或經取代或未經取代之芳磺醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；以及B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少三者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：
Figure 106126503-A0305-02-0019-7
其中，R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；L1、L2及L3為將鹼性胺基與核鹼基部分共價連接之由式V表示之共價連接基團：
Figure 106126503-A0305-02-0019-8
其中，Q1及Qm為經取代或未經取代之亞甲基(-CH2-)，且Qm直接連接至鹼性胺基； Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代之亞甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)，及經取代或未經取代之胺基[-N(H)-或-N(取代基)-]；以及m為1與15之間的整數。
所關注的係式I之PNA寡聚物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為10與18之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基，或經取代或未經取代之芳氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基及胺基；以及 m為1與11之間的整數。
尤其受關注的係式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與16之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體AR前mRNA序列具有至少11-聚體互補重疊；式I化合物與人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基及胺基；以及m為1與10之間的整數。
高度關注的係式I之PNA寡聚物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中， n為11與16之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少12-聚體互補重疊；式I化合物與人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R3及R5為氫基，且R2、R4及R6獨立地表示氫，或經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基；以及m為1與10之間的整數。
更高度關注的係式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與16之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至 少12-聚體互補重疊；式I化合物與人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基；以及m為1與8之間的整數。
最關注的係式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與15之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少11-聚體互補重疊；式I化合物與人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X為氫基； Y表示經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R2及R6為氫基；L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右末端直接連接至鹼性胺基；以及， L2及L3獨立地選自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-及-(CH2)8-，其中右末端直接連接至鹼性胺基。
特別關注的係選自下文中所提供之化合物之群的式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Ac-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)苯甲醯基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G- NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Piv-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)甲基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)正丙基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Val-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2(SEQ ID NO：3)； (N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-TG(6)C(1O5)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2(SEQ ID NO：27)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G- NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)對甲苯磺醯基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(5EQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GT-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：32)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)A(5)A-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-AG(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：29)； (N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-Arg-NH2(SEQ ID NO：29)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：21)；(N→C)Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2(SEQ ID NO：22)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)苯甲基-C(1O2)TT-A(2O2)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)苯基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Val-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fmoc-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Piv-Arg-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-Leu-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O3)TT-A(5)CC-A(5)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：7)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：30)； (N→C)Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)；(N→C)Me-Gly-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)；(N→C)Fethoc-Lys-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-NH2(SEQ ID NO：24)；以及(N→C)Fethoc-Arg-TCC(1O2)-TTA(5)-CCA(6)-GG(5)C-Lys-NH2(SEQ ID NO：26)：其中，A、G、T及C分別為具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶之天然核鹼基的PNA單體；C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)分別為具有由式VI、式VII、式VIII、式IX及式X表示之非天然核鹼基的PNA單體；
Figure 106126503-A0305-02-0030-9
其中，p及q為整數；以及N端及C端取代基之縮寫如以下特定描述：「Fmoc-」為「[(9-茀基)甲 氧基]羰基-」之縮寫；「Fethoc-」為「[2-(9-茀基)乙基-1-氧基]羰基」之縮寫；「Ac-」為「乙醯基-」之縮寫；「苯甲醯基-」為「苯羰基-」之縮寫；「Piv-」為「新戊醯基-」之縮寫；「甲基-(Methyl-)」為「甲基-(methyl-)」之縮寫；「正丙基-(n-Propyl-)」為「1-(正丙基)-」之縮寫；「H-」為「氫-」基團之縮寫；「對甲苯磺醯基」為「(4-甲苯)-1-磺醯基-」之縮寫；「-Lys-」為胺基酸殘基「離胺酸」之縮寫；「-Val-」為胺基酸殘基「纈胺酸」之縮寫；「-Leu-」為胺基酸殘基「白胺酸」之縮寫；「-Arg-」為胺基酸殘基「精胺酸」之縮寫；「-Gly-」為胺基酸殘基「甘胺酸」之縮寫；「[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-」為「[N-1-(2-苯基乙基)胺基]羰基-」之縮寫；「苯甲基-」為「1-(苯基)甲基-」之縮寫；「苯基-(Phenyl-)」為「苯基-(phenyl-)」之縮寫；「Me-」為「甲基-」之縮寫；以及「-NH2」為未經取代「-胺基」之縮寫。
圖3集體地且明確地提供縮寫為A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)之PNA單體的化學結構。如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所論述，C(pOq)由於其與「鳥嘌呤」雜交而視為「經修飾之胞嘧啶」PNA單體。A(p)及A(pOq)因其等與「胸腺嘧啶」雜交而視為「經修飾之腺嘌呤」PNA單體。同樣地，G(p)及G(pOq)因其等與「胞嘧啶」鹼基配對而視為「經修飾之鳥嘌呤」PNA單體。
圖4明確地說明用於使本發明中之式I之PNA衍生物的N端或C端多樣化的取代基之多種縮寫的化學結構。
為說明PNA衍生物之縮寫，縮寫為「(N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)」之PNA衍生物的化學結構提供於圖5(A)中。如另一說明，縮寫為「(N→C)苯甲醯基- Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)」之PNA衍生物的化學結構提供於圖5(B)中。
「(N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)」之13-聚體PNA序列在結合於與其前mRNA互補結合上等效於「(5'→3')GAA-GCC-AGG-CAA-G(SEQ ID NO：3)」之DNA序列。13-聚體PNA與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」及「內含子5」之接合點的20-聚體RNA序列[(5'→3')GC CUUGCCUG｜g 「uaag」gaaaa(SEQ ID NO：4)]中之標記為「粗體」及「帶下劃線」的9-聚體序列具有9-聚體互補重疊。應注意，「內含子5」中之四個單錯配標記為「uaag」。
「(N→C)苯甲醯基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)」之13-聚體PNA序列等效於「(5'→3')CTT-ACC-AGG-CAA-G(SEQ ID NO：5)」之DNA序列，該DNA序列與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」及「內含子5」之接合點的20-聚體RNA序列[(5'→3')GC CUUGCCUG｜guaag gaaaa(SEQ ID NO：4)]中的標記為「粗體」及「帶下劃線」的13-聚體序列具有13-聚體互補重疊。
「(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)」之13-聚體PNA序列等效於「(5'→3')CTT-ACC-AGG-CTA-G(SEQ ID NO：6)」之DNA序列，該DNA序列與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」及「內含子5」之接合點的20-聚體RNA序列[(5'→3')GC CU 「U」 GCCUG ｜ guaag gaaaa(SEQ ID NO：4)]中的標記「粗體」及「帶下劃線」的12-聚體序列具有12-聚體互補重疊。應注意，外顯子5中之單錯配標記為「U」。
「(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：7)」之17-聚體PNA序列等效於「(5'→3')TTT-TCC-TTA-CCA-GGC-AA(SEQ ID NO：7)」之DNA序列，該DNA序列與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」及「內含子5」之接合點的20-聚體RNA序列[(5'→3')GCC UUGCCUG｜guaaggaaaa (SEQ ID NO：4)]中的標記為「粗體」及「帶下劃線」之17-聚體序列具有17-聚體互補重疊。
本發明提供一種選自下文所列出之特定較佳化合物之群之式I之PNA衍生物、或其醫藥學上可接受之鹽：(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fethoc-TG(6)C(1O2)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2(SEQ ID NO：27)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys- NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)對甲苯磺醯基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：29)； (N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：21)；(N→C)Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2(SEQ ID NO：22)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：7)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：30)；以及(N→C)Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)。
本發明之實施方式
用於製備PNA寡聚物之通用程序
根據具有少量但適當修改之先前技術[US6,133,444；WO96/40685]中所揭示之方法利用基於Fmoc-化學的固相肽合成(SPPS)來合成PNA寡聚物。此研究中所採用之固體載體為購自PCAS BioMatrix Inc.(魁北克，加拿大)之H-Rink Amide-ChemMatrix。具有經修飾之核鹼基的Fmoc-PNA單體如先前技術[PCT/KR 2009/001256]中所描述或在少量修改下合成。具有經修飾之核鹼基的此類Fmoc-PNA單體及具有天然存在之核鹼基的Fmoc-PNA單體用於合成本發明之PNA衍生物。PNA寡聚物利用C18-逆相HPLC(具有0.1% TFA之水/乙腈或水/甲醇)純化且由質譜法特徵化。
流程1說明本發明之SPPS中所採用之典型單體延伸週期，且程序細節提供於下文中。然而，對於熟習此項技術者而言，許多輕微差異在自動肽合成器或手動肽合成器上有效運行此類SPPS反應中係顯然可能的。流程1中之各反應步驟簡要地提供如下。
流程1
Figure 106126503-A0305-02-0037-10
[H-Rink-ChemMatrix樹脂之活化]將含0.01mmol(ca 20mg樹脂)ChemMatrix樹脂之1.5mL 20%哌啶/DMF渦旋在利寶拉管(libra tube)中20min，且過濾出DeFmoc溶液。用1.5mL氯化甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲醯胺(DMF)、1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC連續洗滌樹脂各30秒。使固體載體上之所得游離胺與Fmoc-PNA單體或Fmoc保護之胺基酸衍生物進行偶合。
[DeFmoc]使樹脂在1.5mL 20%哌啶/DMF中渦旋7min，且過濾出DeFmoc溶液。用1.5mL MC、1.5mL DMF、1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC連續洗滌樹脂各30秒。使固體載體上之所得游離胺緊接著與Fmoc-PNA單體進行偶合。
[與Fmoc-PNA單體偶合]固體載體上之游離胺如下與Fmoc-PNA單體偶合。將0.04mmol PNA單體、0.05mmol HBTU及10mmol DIEA在1mL無水DMF中培育2min，並且向樹脂添加游離胺。使樹脂溶液渦旋1小時且過濾出反應介質。隨後用1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC連續洗滌樹脂各30秒。用於本發明之具有經修飾之核鹼基的Fmoc-PNA單體之化學結構提供於圖6中。提供於圖6中之具有經修飾之核鹼基的Fmoc-PNA 單體應視為實例，且因此不應用於限制本發明之範疇。熟習此項技術者可容易地理解Fmoc-PNA單體中之多個變異體以合成式I之PNA衍生物。
[封端]在偶合反應之後，未反應之游離胺藉由在1.5mL封端溶液(含5%乙酸酐及6% 2,6-盧剔啶(2,6-leutidine)之DMF)中搖動5min來封端。隨後過濾出封端溶液且用1.5mL MC、1.5mL DMF及1.5mL MC連續洗滌各30秒。
[將「Fethoc-」基團引入N端]藉由使樹脂上之游離胺與「Fethoc-OSu」在鹼性偶合條件下反應將「Fethoc-」基團引入至N端。「Fethoc-OSu」[CAS編號179337-69-0，C20H17NO5、MW 351.36]之化學結構提供如下。
Figure 106126503-A0305-02-0038-11
[自樹脂裂解]結合至樹脂之PNA寡聚物藉由在1.5mL裂解溶液(含2.5%三-異丙基矽烷及2.5%水之三氟乙酸)中搖動3小時來自樹脂裂解。過濾出樹脂且在減壓下濃縮濾液。用二乙醚濕磨殘餘物，且藉由過濾採集所得沈澱物以用於利用逆相HPLC之純化。
[HPLC分析及純化]在自樹脂裂解之後，PNA衍生物之粗產物利用C18-逆相HPLC溶離含有0.1% TFA之水/乙腈或水/甲醇(梯度方法)來純化。圖7(A)及圖7(B)分別為在HPLC純化之前及之後的「ASO 1」之例示性HPLC層析圖。「ASO 1」之寡聚物序列如提供於表1中。
式I之PNA衍生物之合成實例
根據上文所提供或具有少量修改之合成程序製備本發明之PNA衍生 物。表1提供本發明之AR ASO之實例以及質譜法之結構性特徵資料。表1中提供之AR ASO係為了例示式I之PNA衍生物，且不應解釋為限制本發明之範疇。
Figure 106126503-A0305-02-0039-12
PNA對於10-聚體互補DNA之結合親和力
評估表1中之PNA衍生物對於互補靶向N端或C端之10-聚體DNA的結合親和力。由Tm值評定PNA與10-聚體互補DNA之間的雙螺旋之結合親和力。表1中之PNA衍生物與完全互補DNA之間的雙螺旋展示過高以不能在水性緩衝溶液中可靠地測定的Tm值，此係由於該緩衝溶液傾向於在Tm量測期間沸騰。
如下在UV/Vis光譜儀上測定Tm值。在90℃下，將在15mL聚丙烯法爾康管(falcon tube)中之4μM PNA寡聚物及4μM互補10-聚體DNA於4mL水性緩衝液(pH 7.16，10mM磷酸鈉，100mM NaCl)中之混合溶液培育一分鐘且歷經數分鐘緩慢冷卻至環境溫度。隨後將溶液轉移至配備有氣密式蓋之3mL石英UV比色管中，且使其在Agilent 8453 UV/可見分光光度計或如先前技術[PCT/KR2009/001256]中所描述或具有少量修改之類似者上在260nm下進行Tm量測。用於Tm量測之10-聚體互補DNA購自Bioneer(www.bioneer.com,Dajeon，韓國共和國)且不經進一步純化即使用。
式I之PNA衍生物之所觀測Tm值對於與10-聚體DNA之互補結合非常高且提供於表2中。舉例而言，「ASO 5」展示與靶向標記為[(N→C)Fethoc- C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2) AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)]中之「粗體」及「帶下劃線」之PNA內的N端10-聚體的10-聚體互補DNA雙螺旋的Tm值為86.1℃。同時，「ASO 5」展示與靶向標記為[(N→C)Fethoc-C(1O2)TT- A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G -NH2(SEQ ID NO：5)]中之「粗體」及「帶下劃線」之PNA內的C端10-聚體的10-聚體互補DNA雙螺旋的Tm值為81.3℃。
Figure 106126503-A0305-02-0041-13
針對式I之PNA衍生物之生物活性的實例
評估式I之PNA衍生物的其等活體外及活體內生物活性。下文所提供之生物實例作為實例提供以說明此類式I之PNA衍生物的生物特徵，且因此不應解釋為限制本發明之範疇。
實例1.由「ASO 5」誘導之外顯子跳躍。
表1中所指定之「ASO 5」為13-聚體反義寡核苷酸，其與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」及「內含子5」之接合點的的20-聚體RNA序列[(5'→3')GC CUUGCCUG｜guaag gaaaa(SEQ ID NO：4)]中的標記為「粗體」及「帶下劃線」之13-聚體序列具有13-聚體完全互補重疊。
藉由AR巢式PCR評估「ASO 5」誘導MCF7細胞(目錄號；HTB-22，ATCC)中之AR「外顯子5」之跳躍的能力。所採用之程序詳述如下。
[細胞培養及ASO處理]使MCF7細胞在補充有10% FBS、1%鏈黴素/青黴素及0.01mg/ml牛胰島素之EMEM介質中在5% CO2氛圍下在37℃下生長。在用3 aM至3 fM之「ASO 5」處理之前，使細胞在60mm培養皿中繼代培養。
[RNA提取]在具有或不具有「ASO 5」之情況下培育MCF7細胞3小時。根據製造商之說明書使用「通用RNA提取套組」(目錄號9767，Takara)自60mm培養皿中之細胞中提取總RNA。
[利用一步PCR之cDNA合成]使用具有針對一組基因特異性引子[外顯子3_forward；(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC(SEQ ID NO：8)，及外顯子9_reverse：(5'→3')GGGTGT-GGAAATAGATGGG(SEQ ID NO：9)]之platinum® Taq聚合酶之SuperScript®一步RT-PCR套組(目錄號10928-042，Invitrogen)根據以下循環條件將100ng RNA模版用於25μL反轉錄反應中：在50℃下30min及在94℃下2min，之後進行39次在94℃下30秒、在55℃下30秒及在72℃下1min的循環。
[巢式PCR擴增]在整個擴增過程中，使用在一溫度範圍內而非在一個特定退火溫度下有效且特定工作的獨特的擴增技術(隨著每一循環增加退火溫度而修整)(亦即習知的PCR方法)。使1μL cDNA在針對一組引子[外顯子3_forward：(5'→3')TGGGTG-TCACTATGGAGC(SEQ ID NO：8)，及外顯子7n_reverse：(5'→3')GGGGTGATTTGGAGCCAT(SEQ ID NO：10)]之20μL巢式PCR(Invitrogen)反應中根據以下循環條件進一步擴增：初始10次循環[在94℃下30秒、在47℃下40秒(每一循環+0.5℃)、在72℃下40秒]，之後20次循環[在94℃下30秒、在50℃下30秒，及在72℃下40秒]。
[外顯子跳躍產物之鑑別]使PCR產物經受2%瓊脂糖凝膠電泳分離。收集靶標大小之帶並利用桑格定序(Sanger Sequencing)進行分析。在圖8(A)中，存在可指定至缺少「外顯子5」之AR mRNA剪接變異體的三種處理相關的PCR產物帶。發現「ASO 5」誘導「外顯子5」、「外顯子4至外顯子5」及「外顯子4至外顯子6」之跳躍，但跳躍產物之比率似乎視ASO濃度而定。圖8(B)提供作為桑格定序之一實例的用於圖8(A)中之「外顯子4至外顯子5」之跳躍帶的實際定序資料。
實例2.對用「ASO 5」處理之MCF7細胞中之AR mRNA水準的qPCR評估。
利用具有SYBR綠色偵測之qPCR評估「ASO 5」下調人類AR mRNA的能力。
使MCF7細胞在60mm培養皿中之5mL培養基中繼代培養，且以0 zM(陰性對照)至1 aM(2個培養皿/各濃度)之「ASO 5」處理或與其一起繼代培養。5小時之後，用「MiniBEST通用RNA提取套組」(目錄號9767，Takara)根據製造商之說明書提取總RNA。使用Oligo-dT(目錄號6110A，Takara)根據製造商之說明書將500ng RNA模版用於合成用於50μL反轉錄反應之cDNA。隨後使cDNA根據以下循環條件經受針對涵蓋「外顯子3」至「外顯子9」[外顯子3_forward：(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC(SEQ ID NO：8)，及外顯子9_reverse：(5'→3')GGGTG-TGGAAATAGAT-GGG(SEQ ID NO：9)]之一組引子的第1次PCR：在94℃下2min，之後進行15次在94℃下15秒、在55℃下30秒及在72℃下2min的循環。
將第1次PCR產物稀釋2,000倍，且使1μL之各稀釋PCR產物經受針對一組外顯子特異性引子[外顯子4_forward(q)：(5'→3')GACCATGTTTTGCCCATTG(SEQ ID NO：11)及外顯子4_reverse(q)：外顯子4之(5'→3')GGCTCTTTTGAAGAAGACC(SEQ ID NO：12)；外顯子5_forward(q)：(5'→3')GAAACAGAAGTA-CCTGTGC(SEQ ID NO：13)及外顯子5_reverse(q)：外顯子5之(5'→3')GTCATCCCTGCTTCATAAC(SEQ ID NO：14)；以及外顯子6_forward(q)：(5'→3')CGGAAGCTGAAGAAACTTG(SEQ ID NO：15) 及外顯子6_reverse(q)：外顯子6之(5'→3')CACTTGACCACGTGTACAAG(SEQ ID NO：16)]的20μL即時PCR反應。利用SYBR綠色(Takara,Japan)監測PCR反應。循環條件：在95℃下3min，之後進行40次在95℃下5秒及在60℃下30秒的循環。
圖9(A)提供自其獲得之qPCR資料。外顯子4至外顯子6之相對表現量在ASO濃度自0 zM增加至100 zM時而顯著降低。在100 zM下，外顯子訊息水準降低ca 50%至60%。然而，在1 aM下，外顯子訊息水準反回至陰性對照(無ASO處理)之水準附近。qPCR資料之罕見劑量反應模式可歸因於在外顯子跳躍期間藉由「ASO 5」積聚之「外顯子內含子環狀RNA(EIciRNA)」的轉錄上調。[Nature Struc.Mol.Biol.第22(3)卷，256-264(2015)]
實例3.對用「ASO 1」處理之MCF細胞中之AR mRNA水準的qPCR評估。
儘管表1中所指定之「ASO 1」為最初經設計以互補靶向人類AR mRNA內之「外顯子5」與「外顯子6」之接合點的13-聚體反義寡核苷酸。「ASO 1」與跨越人類AR前mRNA內之「外顯子5」與「內含子5」之接合點的20-聚體RNA序列[(5'→3')GC CUUGCCUG｜g 「uaag」gaaaa(SEQ ID NO：4)]中的標記為「粗體」及「帶下劃線」之9-聚體序列具有9-聚體互補重疊。應注意，內含子5中之四個單錯配標記為「uaag」。因此，「ASO 1」可視為靶向人類AR前mRNA之反義寡核苷酸，但在13-聚體序列中僅具有9-聚體互補重疊。
利用qPCR根據「實例2」中所描述之方法評估「ASO 1」下調人類AR mRNA之能力。
圖9(B)提供自其獲得的qPCR資料。「外顯子4至外顯子6」之相對表現量在ASO濃度自0 zM增加至100 zM時而顯著降低。在100 zM下，外顯子訊息水準降低超過80%。然而，在1 aM下，外顯子訊息水準反回至陰性對照(無ASO處理)之ca 60%。qPCR資料之罕見劑量反應模式可歸因於在外顯子跳躍期間藉由「ASO 5」積聚之「外顯子內含子環狀RNA(EIciRNA)」的轉錄上調。[Nature Struc.Mol.Biol.第22(3)卷，256-264(2015)]
實例4.對用「ASO 10」處理之MCF細胞中之AR mRNA水準的qPCR評估。
表1中所指定之「ASO 10」為12-聚體反義寡核苷酸，其與跨越人類AR前mRNA之「外顯子5」與「內含子5」之接合點的20-聚體前mRNA序列[(5'→3')GCC UUGCCUG｜guaag gaaaa(SEQ ID NO：4)]中的標記為「粗體」及「帶下劃線」的12-聚體序列具有12-聚體完全互補重疊。
利用qPCR根據「實例2」中所描述之方法評估「ASO 10」下調人類AR mRNA(全長)之能力。
圖9(C)提供自其獲得之qPCR資料。「外顯子4至外顯子6」之相對表現量在用1 zM至1,000 zM之「ASO 10」處理的MCF7細胞中顯著降低60%至80%。
實例5.對利用「ASO 1」下調AR的西方墨點分析。
使MCF7細胞在含有5ml培養基之60mm培養皿中繼代培養，且用0 zM(陰性對照)，或100 zM至300 aM之「ASO 1」處理。4個培養皿用於4個陰性對照。48小時後，用冷的PBS將細胞洗滌2次，且隨後使其在補充有1×蛋白酶抑制劑(目錄號P8340，Sigma)之200μL 1×細胞溶解緩衝液(目 錄號9803，Cell Signaling Tech)下經受溶解。將溶解物收集在1.5ml e-管中。將200μL之各溶解物與100μL 3×樣品緩衝液混合，且在100℃下煮沸5min。使20μL之各溶解物(總共12份溶解物，4份陰性對照及8份ASO處理樣品)經受8% SDS-PAGE凝膠電泳分離，且轉移至0.2μm PVDF膜上。該膜用抗AR抗體(目錄號5153，Cell Signaling Tech)及抗β-肌動蛋白抗體(目錄號sc4778，Santa Cruz)來探測。圖10(A)提供自其獲得之AR西方墨點資料。多個(陰性)對照樣品用於克服西方墨點法程序之技術誤差。除(陰性)「對照4」之AR帶之外，在ASO處理下之溶解物的AR帶強度比無ASO處理之溶解物的彼強度顯著更弱，此明確地指示「ASO 1」抑制全長AR蛋白質在MCF7細胞中之表現。
實例6.對利用「ASO 5」下調AR的西方墨點分析。
根據「實例5」中所描述之程序評估「ASO 5」在10 zM至30 aM下抑制MCF7細胞中之AR蛋白質表現的能力。
圖10(B)提供用0 zM(陰性對照，無ASO處理)，或10 zM至30 aM之「ASO 5」處理之MCF7細胞獲得的AR西方墨點資料。多個(陰性)對照樣品用於克服西方墨點法程序之技術誤差。用ASO處理之溶解物的AR帶強度比無ASO處理之相鄰溶解物之彼強度顯著更弱，此明確地指示「ASO 1」抑制全長AR蛋白質在MCF7細胞中之表現。
實例7.藉由在小鼠中局部投與「ASO 1」促進毛髮生長。
評估「ASO 1」在如下局部投與之後促進C57BL/6小鼠中毛髮生長之能力。人類AR前mRNA中之「ASO 1」之靶標序列在小鼠AR前mRNA中係保守的。因此，在沒有太多模擬兩可之情況下，小鼠中之活體內治療結果可趨近人類案例。
[脫毛及分組]在第0天，用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉7週齡雌性C57BL/6小鼠，且分別用剪刀及蠟將背部毛髮剪掉並移除。選擇完美(亦即無瑕疵)脫毛之小鼠且隨機分配成三個組(7隻動物/組)。
[局部投與]藉由將「ASO 1」之母儲備溶液在補充有3%(v/v)丙三醇之30%(v/v)乙醇水溶液中稀釋至0.2 fM或1 fM來製備「ASO 1」之局部用溶液。在第3天、第7天、第10天及第14天使用棉球將約100μL之0 fM(陰性對照)、0.2 fM或1 fM「ASO 1」局部投與各動物之背部。
[用於毛髮生長之數位影像記分]為對毛髮生長記分，使動物麻醉並在固定值之暴露時間及照明下使用數位攝影機如圖11(A)中所示逐組拍照。選擇各動物之脫毛區域的數位影像且使用「ImageJ」程式以數位方式對所選擇之區域上的平均亮度進行記分。較低的亮度記分視為更快的毛髮生長。將個別動物之亮度記分按組合併，且利用史都登氏t-測試對其進行統計分析。圖11(B)彙總ASO處理組相對於對照組之相對亮度記分。相對亮度記分在處理組中傾向於隨天數減小。在第13天，1 fM組在亮度記分上比未處理組顯著更低。因此，推斷「ASO 1」在以1 fM局部投與之後促進毛髮生長。
[毛髮重量之記分]在第21天，使動物麻醉並用剪刀剪掉背部毛髮。將來自個別動物之毛髮樣品按組合併，且稱重以評估在第0天與第21天之間的毛髮生長。平均毛髮重量對於對照組為70.5毫克/動物、對於0.2 fM處理組為90.8毫克/動物，且對於1 fM處理組為94.4毫克/動物。因此，推斷「ASO 1」以0.2 fM以及1 fM局部投與之後促進毛髮生長。
[表皮樣品之AR IHC]在第21天修剃之後，根據組使小鼠接受單次局部投與媒劑或「ASO 1」。在第24天，取樣脫毛區域之表皮以用於針對雄 激素受體之免疫組織化學(IHC)分析。將表皮樣品低溫切片並且用初級抗AR抗體(目錄號sc-816，Santa Cruz)以1：100稀釋液、用二級抗IgG(目錄號BA-1100，Vector)以1：200稀釋液，且隨後用紅色螢光標記之Dylight 594-鏈黴親和素(目錄號SA-5594，Vector，加州，美國)以1：200稀釋液連續對其進行免疫染色。對於在用「ASO 1」局部處理之後的AR表現量的改變，在Olympus螢光顯微鏡上捕獲IHC影像。
圖12為證實在以0.2 fM或1 fM局部投與「ASO 1」之後，在毛囊中明顯地抑制毛囊中之AR表現的AR IHC影像之代表集。提供DAPI染色影像以定位IHC影像中之毛囊。令人關注的係注意到在以0.2 fM或1 fM局部投與「ASO 1」之後，AR表現甚至在真皮下方之肌肉層中降低。因此，「ASO 1」在局部投與後容易地遞送至真皮以及在真皮下方之肌肉層中，且強效地抑制AR之表現。
實例8.藉由在小鼠中局部投與「ASO 5」來促進毛髮生長。
評估「ASO 5」在如下詳述局部投與後促進C57BL/6小鼠中之毛髮生長的能力。人類AR前mRNA中之「ASO 5」之靶標序列在小鼠AR前mRNA中係保守的。因此，在不非常模糊之情況下，小鼠中之活體內治療結果可趨近人類案例。
[脫毛及分組]在第0天，用舒泰/隆朋麻醉7週齡雌性C57BL/6小鼠，且分別用剪刀及蠟將背部毛髮剪除並移除。選擇完美(亦即無瑕疵)脫毛之小鼠且隨機分配成三個組(10隻動物/組)。
[局部投與]藉由將「ASO 5」之母儲備溶液在補充有3%(v/v)丙三醇之30%(v/v)乙醇水溶液中稀釋至1 fM、5 fM或25 fM來製備「ASO 5」之局部用溶液。在第3天、第7天、第10天、第14天及第21天使用棉球將約 100μL之各ASO溶液或媒劑(陰性對照)局部投與動物之背部。
[用於毛髮生長之數位影像記分]圖13彙總ASO處理組相對於陰性對照組之相對亮度記分。相對亮度記分在ASO處理組中傾向於隨天數減小。在第17天，1 fM及25 fM之處理組在亮度記分上比未處理組顯著更低。因此，推斷「ASO 5」在以1 fM至25 fM局部投與之後促進毛髮生長。
[毛髮重量之記分]在第21天，使動物麻醉且剪除背部毛髮並收集。將來自個別動物之毛髮樣品按組合併，且稱重以評估在第0天與第21天之間的毛髮生長。處理組相比於對照組在毛髮重量上得到明顯的增加。1 fM、5 fM及25 fM組之平均毛髮重量分別為陰性對照組之293%、306%及278%。因此，推斷「ASO 5」在以1 fM至25 fM局部投與之後促進毛髮生長。
在第21天修剃之後，使動物接受單次局部投與媒劑或1 fM、5 fM或25 fM之「ASO 5」。在第53天，藉由剪刀修剃來收集背部毛髮以測定在第21天與第53天之間的毛髮生長總量。1 fM、5 fM及25 fM組之平均毛髮重量分別為未處理組之1,630%、1,450%及771%。因此，推斷「ASO 5」在以1 fM至25 fM局部投與之後促進毛髮生長。
實例9.藉由在小鼠中局部投與「ASO 10」來促進毛髮生長。
評估「ASO 10」在如下詳述局部投與後促進C57BL/6小鼠中之毛髮生長的能力。人類AR前mRNA中之「ASO 10」之靶標序列在小鼠AR前mRNA中係保守的。因此，在不非常模糊之情況下，小鼠中之活體內治療結果可趨近人類案例。
[脫毛及分組]在第0天，用舒泰/隆朋麻醉7週齡雌性C57BL/6小鼠，且分別用剪刀及蠟將背部毛髮剪除並移除。選擇完美(亦即無瑕疵)脫毛之 小鼠且隨機分配成三個組(9隻動物/組)。
[局部投與]藉由將「ASO 10」之母儲備溶液在補充有3%(v/v)丙三醇之30%(v/v)乙醇水溶液中稀釋至1 fM、5 fM或25 fM來製備「ASO 10」之局部用溶液。在第2天使用棉球將約100μL之各ASO溶液或媒劑(陰性對照)局部投與動物之背部。
[用於毛髮生長之數位影像記分]圖14(A)彙總經ASO處理組相對於對照組之相對亮度記分。相對亮度記分在處理組中傾向於隨天數減小。在第27天，1 fM及5 fM之處理組在亮度記分上比未處理組顯著更低。因此，推斷「ASO 10」在以1 fM至5 fM局部投與之後促進毛髮生長。
[毛髮重量之記分]在第27天，使動物麻醉且剪除背部毛髮並收集。將來自個別動物之毛髮樣品按組合併，且稱量以評估在第0天與第27天之間的毛髮生長。處理組相比於對照組在毛髮重量上得到適當增加。1 fM、5 fM及25 fM組之平均毛髮重量分別為未處理組之115%、114%及119%。因此，推斷「ASO 10」在以1 fM至25 fM局部投與之後促進毛髮生長。
[表皮樣品之AR免疫組織化學]在第27天剪除毛髮之後，在第27天及第29天使動物局部接受其他媒劑或1 fM、5 fM或25 fM之「ASO 10」。在第30天收集背部表皮樣品以用於針對雄激素受體之免疫組織化學分析。如「實例7」中所描述，對表皮樣品進行針對雄激素受體之免疫染色。在Zeiss載玻片掃描儀上捕獲IHC影像。圖14(B)為AR IHC影像之代表集。令人關注的係注意到ASO處理組中之毛囊數目相比於陰性對照組明顯地增加。難以清晰地表明毛囊中之AR表現在處理組中減少係歸因於處理組中之毛囊數目的明顯增加。儘管如此，處理組中之真皮下方之肌肉層中的AR表現相比於對照組明顯地減少。在5 fM處理組中觀測到最顯著的減 少。綜合用「ASO 10」處理之動物中的IHC結果而言，「ASO 10」藉由在所有測試劑量(最顯著地5 fM)下抑制AR表現以增加毛囊數目來促進毛髮生長。
實例10.利用在用「ASO 10」處理之MCF7細胞中之塔克曼分析法(TaqMan Assay)對AR mRNA水準之qPCR評估。
利用qPCR採用塔克曼探針來評估「ASO 10」下調人類AR mRNA的能力。
使MCF7細胞在60mm培養皿中之5mL培養基中繼代培養，且用0zM(陰性對照)至1 aM(2個培養皿/各濃度)之「ASO 10」處理或與其一起培養。24小時後，利用「MiniBEST通用RNA提取套組」(目錄號9767，Takara)根據製造商之說明書提取總RNA。
使用針對[外顯子3_forward：(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC(SEQ ID NO：8)；以及外顯子9_reverse：(5'→3')GGGTGT-GGAAATAGATGGG(SEQ ID NO：9)]之一組外顯子特異性引子之一步RT-PCR套組(Invitrogen)，將400ng RNA模版根據以下循環條件用於合成用於20μL反轉錄反應之cDNA：50℃下30min及94℃下2min，之後15次94℃下30秒、在50℃下30秒及在72℃下1min的循環。
將cDNA溶液稀釋50倍，且使1μL各稀釋PCR產物針對[外顯子4_forward：(5'→3')TTGTCCATCTTGTCGTCTT(SEQ ID NO：17)；以及外顯子5_reverse：(5'→3')CCTCTC-CTTCCTCCTGTA(SEQ ID NO：18)]之一組外顯子特異性引子根據以下循環條件經受20μL即時PCR反應：95℃下3min，之後40次在95℃下15秒及在60℃下30秒的循環。用[(5'→3')TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC(SEQ ID NO：19)- 3IABkFQ]之塔克曼探針監測qPCR反應。
圖15提供自其獲得之qPCR資料。外顯子4至外顯子6之相對表現量在用1 zM至1 aM之「ASO 10」處理的MCF7細胞中顯著減少ca 50%至70%。
實例11.在皮下投與「ASO 10」之小鼠中利用IHC下調AR表現。
如下評估「ASO 10」抑制小鼠中之AR表現的能力。
將12週齡雄性C57BL/6小鼠隨機分配成陰性對照(無ASO處理)，0.01pmol/Kg「ASO 10」及0.1pmol/Kg「ASO 10」之3個組。(3隻動物/組)根據投藥組，使小鼠每週2次持續4週皮下接受媒劑或溶解於媒劑(PBS)中之ASO。在最後投藥後三天，用舒泰/隆朋麻醉動物並利用石蠟塊對其進行組織或器官取樣以用於AR IHC。
用初級抗體(目錄號sc-816，Santa Cruz)以1：100稀釋液、二級抗兔IgG(目錄號BA-1100，VECTOR)以1：200稀釋液，及Dylight 594-鏈黴親和素(目錄號SA-5594，VECTOR)以1：200連續探測AR蛋白質。用DAPI對細胞核進行染色。在Zeiss載玻片掃描儀上捕獲IHC螢光影像。
圖16提供藉由已知充分表現AR蛋白質之組織獲得的AR IHC影像(紅色)。應注意，IHC影像提供為與DAPI(藍色)共定位。在長期皮下暴露於「ASO 10」後，當ASO劑量自0.01皮莫耳/公斤增加至0.1皮莫耳/公斤時，注入位點、肝、睪丸及前列腺之遠端表皮中之AR表現明顯減少。因此，「ASO 10」在全身暴露後明確地抑制小鼠中之AR蛋白質表現。
<110> 韓商奧利通公司(OLIPASS CORPORATION)
<120> 雄激素受體反義寡核苷酸
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<150> PCT/IB2017/000697
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<150> US 62/372,035
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<210> 15
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<223> 人工序列描述：合成引子
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<210> 22
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<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
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Figure 106126503-A0305-02-0060-45
Figure 106126503-A0101-11-0001-2

Claims (11)

  1. 一種由式I表示之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：
    Figure 106126503-A0305-02-0061-46
     其中，n為10與21之間的整數；式I化合物與人類雄激素受體(androgen receptor，AR)前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示氫[H]、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷磺醯基，或經取代或未經取代之芳磺醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌 呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；以及B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自具有與該核鹼基部分共價連接之經取代或未經取代之胺基的非天然核鹼基。
  2. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為10與21之間的整數；該式I化合物與該人類雄激素受體前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn獨立地表示氘、氫、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；X及Y獨立地表示氫[H]、甲醯基[H-C(=O)-]、胺基羰基[NH2-C(=O)-]、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基、經取代或未經取代之芳氧基羰基、經取代或未經取代之烷胺基羰基、經取代或未經取代之芳基胺基羰基、經取代或未經取代之烷磺醯基，或經取代或未經取代之芳磺醯基；Z表示氫、羥基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之芳氧基、經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之烷基，或經取代或未經取代之芳基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌 呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；以及B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少三者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基：
    Figure 106126503-A0305-02-0063-47
     其中，R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；L1、L2及L3為將鹼性胺基與核鹼基部分共價連接之由式V表示之共價連接基團：
    Figure 106126503-A0305-02-0063-48
     其中，Q1及Qm為經取代或未經取代之亞甲基(-CH2-)，且Qm直接連接至該鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代之亞甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)，及經取代或未經取代之胺基[-N(H)-或-N(取代基)-]；以及m為1與15之間的整數。
  3. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中， n為10與18之間的整數；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之該17-聚體RNA序列具有至少9-聚體互補重疊；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地表示氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之烷基醯基、經取代或未經取代之芳醯基、經取代或未經取代之烷氧基羰基，或經取代或未經取代之芳氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為經取代或未經取代之亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自經取代或未經取代之亞甲基、氧基及胺基；以及m為1與11之間的整數。
  4. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中， n為11與16之間的整數；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之該17-聚體AR前mRNA序列具有至少11-聚體互補重疊；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少四者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6獨立地選自氫，及經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基及胺基；以及m為1與10之間的整數。
  5. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與16之間的整數； 該式I化合物與該人類AR前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之該17-聚體RNA序列具有至少12-聚體互補重疊；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶之天然核鹼基，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R3及R5為氫基，且R2、R4及R6獨立地表示氫，或經取代或未經取代之烷基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基、氧基；以及m為1與10之間的整數。
  6. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與16之間的整數；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之[(5'→ 3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之該17-聚體RNA序列具有至少12-聚體互補重疊；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X及Y獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；Q1及Qm為亞甲基，且Qm直接連接至鹼性胺基；Q2、Q3、……、及Qm-1獨立地選自亞甲基，及氧基團；以及m為1與8之間的整數。
  7. 如請求項1之肽核酸衍生物，或其醫藥學上可接受之鹽：其中，n為11與15之間的整數；該式I化合物與該人類AR前mRNA內之[(5'→3')CCUUGCCUGGUAAGGAA(SEQ ID NO：1)]之該17-聚體RNA序列具有至少11-聚體互補重疊； 該式I化合物與該人類AR前mRNA內之前mRNA序列完全互補；該式I化合物誘導在該人類AR前mRNA內之外顯子5之跳躍；S1、S2、……、Sn-1、Sn、T1、T2、……、Tn-1及Tn為氫基；X為氫基；Y表示經取代或未經取代之烷基醯基，或經取代或未經取代之烷氧基羰基；Z表示經取代或未經取代之胺基；B1、B2、……、Bn-1及Bn獨立地選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶，及非天然核鹼基；B1、B2、……、Bn-1及Bn中之至少五者獨立地選自由式II、式III或式IV表示之非天然核鹼基；R1、R2、R3、R4、R5及R6為氫基；L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右末端直接連接至鹼性胺基；以及，L2及L3獨立地選自-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-及-(CH2)8-，其中右末端直接連接至該鹼性胺基。
  8. 如請求項1之肽核酸衍生物，其選自提供於下文中之肽核酸衍生物之群，或其醫藥學上可接受之鹽：(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)； (N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Ac-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)苯甲醯基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Piv-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)甲基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)正丙基-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Lys-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-Val-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)- G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-TG(6)C(1O5)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2(SEQ ID NO：27)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ TD NO：5)； (N→C)H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)對甲苯磺醯基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GT-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：32)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)A(5)A-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-AG(5)G-C(1O2)AA(5)-G- NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：29)；(N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-Arg-NH2(SEQ ID NO：29)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：21)；(N→C)Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2(SEQ ID NO：22)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)苯甲基-C(1O2)TT-A(2O2)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)苯基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)； (N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Val-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fmoc-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N←C)H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N←C)Piv-Arg-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-Leu-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O3)TT-A(5)CC-A(5)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：7)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：30)；(N→C)Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)；(N→C)Me-Gly-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)；(N→C)Fethoc-Lys-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-NH2(SEQ ID NO：24)；以及(N→C)Fethoc-Arg-TCC(1O2)-TTA(5)-CCA(6)-GG(5)C-Lys-NH2(SEQ ID NO：26)：其中，A、G、T及C分別為具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶之天然核鹼基的PNA單體；C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及G(pOq)分別為具有由式VI、式VII、式VIII、式IX及式X表示之非天然核鹼基的PNA單體；
    Figure 106126503-A0305-02-0074-49
    Figure 106126503-A0305-02-0075-50
     其中，p及q為整數；以及N端及C端取代基之縮寫如以下特定描述：「Fmoc-」為「[(9-茀基)甲氧基]羰基-」之縮寫；「Fethoc-」為「[2-(9-茀基)乙基-1-氧基]羰基」之縮寫；「Ac-」為「乙醯基-」之縮寫；「苯甲醯基-」為「苯羰基-」之縮寫；「Piv-」為「新戊醯基-」之縮寫；「甲基-(Methyl-)」為「甲基-(methyl-)」之縮寫；「正丙基-(n-Propyl-)」為「1-(正丙基)-(1-(n-propyl)-)」之縮寫；「H-」為「氫-」基團之縮寫；「對甲苯磺醯基」為「(4-甲苯)-1-磺醯基-」之縮寫；「-Lys-」為胺基酸殘基「離胺酸」之縮寫；「-Val-」為胺基酸殘基「纈胺酸」之縮寫；「-Leu-」為胺基酸殘基「白胺酸」之縮寫；「-Arg-」為胺基酸殘基「精胺酸」之縮寫；「-Gly-」為胺基酸殘基「甘胺酸」之縮寫；「[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-」為「[N-1-(2-苯基乙基)胺基]羰基-」之縮寫；「苯甲基-」為「1-(苯基)甲基-」之縮寫；「苯基-(Phenyl-)」為「苯基-(phenyl-)」之縮寫；「Me-」為「甲基-」之縮寫；以及「-NH2」為未經取代之「-胺基」之縮寫。
  9. 如請求項1之肽核酸衍生物，其選自提供於下文中之化合物之群，或其醫藥學上可接受之鹽：(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)； (N→C)Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH(SEQ ID NO：3)2；(N→C)Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2(SEQ ID NO：3)；(N→C)Fethoc-TG(6)C(1O2)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2(SEQ ID NO：27)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：6)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)正丙基-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G- NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)對甲苯磺醯基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)苯甲醯基-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：29)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2(SEQ ID NO：28)；(N→C)Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：21)；(N→C)Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2(SEQ ID NO：22)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)； (N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)N-苯基-N-甲基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)[N-(2-苯基乙基)胺基]羰基-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2(SEQ ID NO：5)；(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2(SEQ ID NO：23)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：7)；(N→C)Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2(SEQ ID NO：30)；以及(N←C)Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2(SEQ ID NO：25)。
  10. 一種如請求項1之肽核酸衍生物之用途，其用於製備用以治療涉及雄激素活性之皮膚學病症或病狀之藥物，其中該藥物係用於局部投與。
  11. 一種如請求項1之肽核酸衍生物之用途，其用於製備用以治療雄激素性脫髮之藥物，其中該藥物係用於局部投與。
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