KR20190055066A - 안드로겐 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 "엑손 5"의 5' 스플라이스 부위를 표적화하는 펩타이드 핵산 유도체가 제공된다. 펩타이드 핵산 유도체는 세포 내 안드로겐 수용체 mRNA의 스플라이스 변이체를 강력하게 유도하며, 국소 투여시 안드로겐성 활성과 관련된 피부 징후 또는 증상을 안전하게 치료하는데 유용하다.

Description

안드로겐 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 안드로겐성 활성에 의해 매개되는 피부 징후 또는 증상을 치료하기 위한 안드로겐 수용체 프리-mRNA를 표적화하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이며, 본원에서 그 전체가 참조 문헌으로 인용되는 것인, 2016년 8월 8일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/372035 호의 우선권의 이익을 주장한다.
탈모증(alopecia)은 초기에 두피에서 모발이 빠지고 모발이 가늘어지는 것을 특징으로 하는 장애이다. "남성형 대머리(male pattern baldness)"라고도 지칭되는 안드로겐성 탈모증은 모낭 및 주변 조직에서의 명백한 안드로겐성 활성에 의해 유발된다.
안드로겐성 탈모증은 남성과 여성 모두에게 영향을 미치지만, 이 장애는 종종 남성 대 여성에서 상이하게 나타난다. 남성은 원형 탈모(spot baldness)를 겪을 가능성이 높으며 여성은 두피에서 모발이 전체적으로 가늘어질 가능성이 더 높다. 30 내지 50 세 남성의 안드로겐성 탈모증의 유병률은 약 58%이다 [J. Invest. Dermatol. vol 9, 296-300 (1997)]. 안드로겐성 탈모증은 안드로겐으로 알려진 남성 스테로이드 호르몬의 변화에 의해 유발된다 [New Engl. J. Med. vol 341, 491-7 (1999); Mol. Cell Endocrinol. vol 198, 89-95 (2002)].
안드로겐은 피지선에서의 피지의 분비, 모낭에서의 모발 성장, 전신 리비도 등을 조절한다. 안드로겐은 일부 영역에서 무색소의 미세하고 짧은 털을 생성하는 작은 연모 모낭의 더 큰 종모 모낭으로의 점진적 변형 (예를 들어, 얼굴)을 자극한다. 그러나, 종모 모낭에 대한 이러한 안드로겐성 활성과는 대조적으로, 흔히 '안드로겐 패러독스'라고 불리는 종모 모낭의 연모 모낭으로의 점진적 퇴행이 관자놀이(temple) 및 두정(scalp vertex)에서 발생한다 [Expert Opin. Drug Discov. vol 10, 269-292 (2015)].
안드로겐성 탈모증 및 DHT: 5α-환원효소는 테스토스테론을 테스토스테론보다 더 강력하고 효과적인 안드로겐인 5α-디히드로테스토스테론 (DHT)으로 환원시킨다. 전두 성장기 모낭에서의 DHT 생성의 실질적 증가는 비-대머리 남성에 비해 머리가 벗겨지기 시작하는 젊은 남성에서 관찰되었다 [(Ind. J. Dermatol. Vene. Leprol. vol 79, 613-625 (2013)]. 안드로겐성 탈모증을 갖는 남성은 안드로겐성 탈모증이 없는 남성보다 "총 테스토스테론"의 수준이 낮게 나타나는 경향이 있다. 대신, DHT 수준은 안드로겐성 탈모증이 없는 남성보다 안드로겐성 탈모증을 갖는 남성에서 더 높다. DHT는 5α-환원효소에 의해 테스토스테론으로부터 생성된다. 안드로겐성 탈모증을 갖는 남성은 안드로겐성 탈모증이 없는 남성보다 모낭에서의 5α-환원효소의 수준이 더 높다. DHT는 모낭의 축소 및 이에 따른 안드로겐성 탈모증의 주된 원인이다 [Endocrinology, vol 151, 2373-2380 (2010)].
피나스테리드(finasteride) 및 두타스테리드(dutasteride)는 5α-환원효소를 억제하여, 모낭 및 주변 조직의 안드로겐 수용체에 유효한 DHT 수준을 감소시킨다. 상기 2 가지의 저분자 억제제는 전신 안드로겐성 활성의 하향-조절에서 기인하는 부작용에도 불구하고 남성형 대머리를 치료하는데 사용되어왔다. 부작용에는 성기능장애, 어지럼증, 무력증, 두통, 콧물, 피부발진 등이 있다 [New Engl. J. Med. vol 362, 1237-8 (2010)].
국소 AR 길항제: 안드로겐은 안드로겐 수용체 (AR)에 결합함으로써 약리작용을 나타낸다. AR 길항제는 AR에 결합하여 안드로겐의 생리적 기능을 억제하므로, 모낭 및 주변 조직에 제대로 전달된다면 안드로겐성 탈모증을 치료하는데 사용될 수 있다. 전신 안드로겐성 활성의 억제에 따른 부작용을 회피하기 위하여, AR 길항제는 두피 조직에 직접적으로 국소 투여된다.
케토코나졸(ketoconazole)은 유명한 항진균 작용 외에도 약한 AR 길항 작용을 가지고 있다. 2% 케토코나졸을 함유하는 샴푸 (상품명 Nizoral®)가 안드로겐성 탈모를 국소적으로 치료하기 위해 사용되어왔다 [J. Dermatol. Sci. vol 45(1), 66-68 (2007)].
토피루타미드(topilutamide)는 플루디릴(fludiril)로 알려진 AR 길항제이다. 토피루타미드는 "Eucapil"이라는 브랜드명으로 여러 유럽 국가에서 안드로겐성 탈모증을 치료하기 위한 2% 국소 제형으로 시판되고 있다 [Dermatol. Surg. vol 28(8), 678-685 (2002)].
모낭 내 AR 단백질 또는 mRNA: 안드로겐성 탈모증을 갖는 남성 및 여성 대상체에서, AR 발현은 후두 모낭보다 전두 모낭에서 더 높은 것으로 밝혀졌다 [J. Investig. Dermatol. vol 109, 296-300 (1997)]. AR 발현이 모낭 및 주변 조직에서 선택적으로 약제에 의해 하향-조절되면, 이러한 약제는 안드로겐성 활성의 전신 하향-조절에 의해 야기되는 부작용 없이 안드로겐성 탈모증을 안전하게 치료할 수 있다. 또 다른 문헌에서, 안드로겐성 탈모증을 갖는 여성은 후두 모낭보다 전두 및 두정 모낭에서 AR mRNA의 수준이 더 높은 것으로 밝혀졌다 [Genetics Mol. Res. vol 12(2), 1834-1840 (2013)].
리보솜 단백질 합성: 단백질은 DNA (2-데옥시리보오스 핵산)에 의해 코딩된다. 세포성 자극에 반응하여, DNA는 전사되어 핵 내에서 프리-mRNA (프리-메신저 리보핵산)를 생성한다. 프리-mRNA의 인트론은 mRNA (메신저 리보핵산)를 생성하기 위해 효소적으로 스플라이싱되고, 이는 이후 세포질 구획으로 이동된다. 세포질에서, 리보솜이라고 불리는 번역 기구의 복합체는 mRNA에 결합하여 mRNA를 따라 코딩된 유전정보를 스캔함으로써 단백질 합성을 수행한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
서열 특이적 방식으로 (즉, 상보적으로) RNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO)라고 불린다. ASO는 mRNA에 단단히 결합하여, 세포질에서 mRNA를 따라 리보솜에 의한 단백질 합성을 억제할 수 있다. ASO는 이의 표적 단백질의 리보솜 단백질 합성을 억제하기 위하여 세포 내에 존재할 필요가 있다.
스플라이싱 프로세스: DNA는 전사되어 핵 내에서 프리-mRNA (프리-메신저 리보핵산)를 생성한다. 프리-mRNA는 이후 아래의 도해에서 개략적으로 요약된 바와 같이 일괄하여 "스플라이싱"이라고 불리는 일련의 복합 반응에 의해 인트론이 제거된 후 mRNA로 프로세싱된다 [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].
스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 어댑터 인자 사이에 "스플라이시오솜(splicesome) E 복합체" (즉, 초기 스플라이시오솜 복합체)를 형성함으로써 개시된다. "스플라이시오솜 E 복합체"에서, U1은 엑손 N 및 인트론 N의 이음부에 결합하고, U2AF35는 인트론 N 및 엑손 (N+1)의 이음부에 결합한다. 따라서, 엑손/인트론 또는 인트론/엑손의 이음부들은 초기 스플라이시오솜 복합체의 형성에 중요하다. "스플라이시오솜 E 복합체"는 U2와의 추가적인 복합체형성 후 "스플라이시오솜 A 복합체"로 진화한다. "스플라이시오솜 A 복합체"는 인접한 엑손에 붙어있기 위해 인트론을 제거 또는 스플라이싱하기 위한 일련의 복합 반응을 거친다.
Figure pct00001
스플라이싱의 안티센스 억제: 핵에서, ASO는 프리-mRNA 내의 특정 위치에 단단히 결합할 수 있으며, 프리-mRNA의 mRNA로의 스플라이싱 프로세스에 간섭하여 표적 엑손이 결여된 전장 mRNA 또는 mRNA 변이체(들)을 생성할 수 있다. 이러한 mRNA(들)은 "스플라이스 변이체(들)"이라고 불리며, 전장 mRNA에 의해 코딩된 단백질보다 작은 단백질(들)을 코딩한다.
원칙적으로, 스플라이싱은 "스플라이시오솜 E 복합체"의 형성을 억제함으로써 중단될 수 있다. ASO가 (5' → 3') 엑손-인트론의 이음부, 즉 "5' 스플라이스 부위"에 단단히 결합하면, ASO는 프리-mRNA와 인자 U1 사이의 복합체 형성, 및 이에 따라 "스플라이시오솜 E 복합체"의 형성을 차단한다. 마찬가지로, "스플라이시오솜 E 복합체"는 ASO가 (5' → 3') 인트론-엑손의 이음부, 즉 "3' 스플라이스 부위"에 단단히 결합하면 형성될 수 없다.
비천연 올리고뉴클레오타이드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드는 내인성 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽기 때문에 이들의 치료적 유용성은 제한적이다. 현재까지, 다수의 비천연 올리고뉴클레오타이드가 집중적으로 개발 및 연구되어왔다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 이들 중 일부는 DNA 및 RNA와 비교하여 대사안정성이 증대된 것으로 밝혀졌다. 아래에 몇 가지 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학구조가 제시되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA가 그러하듯 이의 상보적 핵산에 예측가능하게 결합한다.
Figure pct00002
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 (PTO)는 단량체 당 백본(backbone) 인산염 산소 원자들 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화로 인해 PTO는 뉴클레아제에 의한 분해에 비교적 내성을 갖게 되었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA 사이의 백본의 구조적 유사성을 반영하여, 이들 둘 모두는 대부분의 포유류 세포 유형의 세포막을 잘 침투하지 못한다. 그러나, DNA에 대한 수송체(들)을 풍부하게 발현하는 일부 유형의 세포의 경우, DNA 및 PTO는 양호한 세포성 흡수를 나타낸다. 전신 투여된 PTO는 간 및 신장으로 쉽게 분포하는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].
PTO의 시험관내 세포막 투과성을 증가시키기 위하여, 리포펙션(lipofection)이 광범위하게 실시되어왔다. 그러나, 리포펙션은 세포막을 물리적으로 변화시켜 세포독성을 유발하므로, 장기적인 치료 용도에 안전하지 못할 것이다.
지난 30 년 동안, 암, 면역 질환, 대사 질환 등을 치료하기 위해 안티센스 PTO 및 PTO 변이체가 임상적으로 평가되어왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 이러한 안티센스 약물 후보의 다수가, 부분적으로는 PTO의 불량한 세포막 투과성 때문에 성공적으로 개발되지 못했다. 불량한 막 투과성을 극복하기 위하여, PTO는 치료 활성을 위해 고용량으로 투여될 필요가 있다. 그러나, PTO는 증가된 응고 시간, 보체 활성화, 요세관 신장병(tubular nephrophaty), 쿠퍼 세포 활성화, 및 비장 비대증, 림프구양 증식, 단핵 세포 침윤을 비롯한 면역 자극을 포함하는, 용량-제한 독성과 관련된 것으로 알려져 있다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
많은 안티센스 PTO가 간 또는 신장에서 상당한 기여를 하는 질환에 대한 적절한 임상적 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포멀슨(mipomersen)은 LDL 콜레스테롤 수송에 관여하는 단백질인 apoB-100의 합성을 억제하는 PTO 유사체이다. 미포멀슨은 가장 가능성 있게는 이의 간에서의 우선적 분포로 인해, 죽상동맥경화증 환자의 특정 집단에서 적절한 임상적 작용을 나타냈다 [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 단백질 티로신 포스파타아제 1B (PTP1B)의 합성을 억제하는 PTO 안티센스 유사체이며, II 형 당뇨병 환자에서 치료 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
잠긴 핵산 (Locked Nucleic Acid): 잠긴 핵산 (LNA)에서, RNA의 백본 리보오스 고리는 RNA 또는 DNA에 대한 결합 친화성이 증가하도록 구조적으로 속박된다. 따라서, LNA는 고 친화성 DNA 또는 RNA 유사체로 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)]. PTO와 마찬가지로, LNA 또한 불량한 세포막 투과성을 나타낸다.
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 (PMO)에서, DNA의 백본 인산염 및 2-데옥시리보오스는 각각 포스포아미디트 및 모르폴린으로 대체된다 [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 백본은 음으로 하전되지만, PMO 백본은 하전되지 않는다. 따라서, PMO와 mRNA 사이의 결합은 백본 사이의 정전기적 반발이 없으며, DNA와 mRNA 사이의 결합보다 강한 경향이 있다. PMO는 DNA와 구조적으로 매우 상이하기 때문에, PMO는 DNA 또는 RNA를 인식하는 간 수송체(들)에 의해 인식되지 않을 것이다. 그러나, PMO 역시 쉽게 세포막을 침투하지 않는다.
펩타이드 핵산: 펩타이드 핵산 (PNA)은 단위 백본으로서 N-(2-아미노에틸)글리신을 갖는 폴리펩타이드이며, Dr. Nielsen 및 동료들에 의해 발견되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. 프로토타입 PNA의 화학구조 및 축약형 명명법은 아래에 제공된 그림으로 예시된다. DNA 및 RNA와 마찬가지로, PNA 또한 상보적 핵산에 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적 핵산에 결합함에 있어서, PNA의 N-말단은 DNA 또는 RNA의 "5'-말단"에 대응하는 것으로 간주되고, PNA의 C-말단은 DNA 또는 RNA의 "3'-말단"에 대응하는 것으로 간주된다.
Figure pct00003
PMO와 마찬가지로, PNA 백본은 하전되지 않는다. 따라서, PNA와 RNA 사이의 결합은 DNA와 RNA 사이의 결합보다 강한 경향이 있다. PNA는 DNA와 화학구조상 현저하게 상이하기 때문에, PNA는 DNA를 인식하는 간 수송체(들)에 의해 인식되지 않을 것이며, DNA 또는 PTO의 것과는 상이한 조직 분포 프로파일을 나타낼 것이다. 그러나, PNA 또한 포유류 세포막을 잘 침투하지 못한다 (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).
PNA의 막 투과성을 향상시키기 위한 개질 핵염기: PNA는 공유결합된 양이온성 지질 또는 이의 등가물을 갖는 개질 핵염기를 도입함으로써 포유류 세포막에 매우 투과성이 되었다. 이러한 개질 핵염기의 화학구조를 위에 제공하였다. 이러한 시토신, 아데닌 및 구아닌의 개질 핵염기는 각각 구아닌, 티민 및 시토신과 예측가능하고 상보적으로 혼성화되는 것으로 밝혀졌다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
Figure pct00004
PNA 상에 이러한 개질 핵염기의 도입은 리포펙션의 상황과 유사하다. 리포펙션에 의하여, 올리고뉴클레오타이드 분자는 리포펙타민과 같은 양이온성 지질 분자로 랩핑되고, 이러한 리포펙타민/올리고뉴클레오타이드 복합체는 네이키드(naked) 올리고뉴클레오타이드 분자에 비하여 오히려 쉽게 세포막을 침투하는 경향이 있다.
양호한 막 투과성 이외에, 이들 PNA 유도체는 상보적 핵산에 대하여 매우 강한 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 11- 내지 13-mer의 PNA 유도체 상에 4 내지 5 개의 개질 핵염기를 도입하면, 상보적 DNA와의 듀플렉스 형성에서 20℃ 또는 그 이상의 Tm 증가가 쉽게 나타났다. 이러한 PNA 유도체는 단일 염기 미스매치에 매우 민감하다. 단일 염기 미스매치는 PNA 서열뿐만 아니라 개질 염기의 유형에 따라 11 내지 22℃의 Tm 손실을 초래하였다.
AR 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AR ASO): 원칙적으로, AR mRNA를 표적화하는 ASO는 안드로겐 수용체의 리보솜 단백질 합성을 억제할 수 있다. 세포에서 AR 발현을 억제하는 AR ASO의 보고된 사례가 존재한다. 예를 들어, AR mRNA를 상보적으로 표적화하는 LNA/DNA 갭머(gapmer)인 EZN-4176은, 전립선암 동물 모델의 종양뿐만 아니라 종양 세포에서도 AR 발현을 하향-조절하였다 [Mol. Cancer. Ther. vol 10(12), 2309-2319 (2011)].
AR mRNA의 엑손 1 또는 엑손 8을 표적화하는 ASO는 AR 길항제인 엔잘루타미드(Enzalutamide)를 사용하는 화학요법에 내성인 전립선암 동물 모델의 종양뿐만 아니라 전립선암 세포에서도 AR 발현을 억제하였다 [Clin. Cancer Res. vol 21(7), 1675-1687 (2015)].
AR ASO의 국소 적용에 의한 모낭에서의 AR 하향-조절: 모낭 및 주변 조직에서의 안드로겐성 활성의 하향-조절은 모낭 및 주변 조직에서 AR 발현을 억제함으로써 달성될 수 있다. ASO가 모낭 및 주변 조직으로 전달된다면, 모낭에서의 AR 발현은 AR ASO로 하향-조절될 수 있다.
전신 안드로겐성 활성의 하향-조절에 따른 부작용을 피하기 위하여, 안드로겐성 탈모증의 치료를 위해 모낭 및 주변 조직에 국소적으로 AR 발현을 하향-조절하는 것이 바람직하다. ASO가 모낭으로 쉽게 전달되도록 제조 또는 제형화된다면, 두피 피부에 대한 AR ASO의 국소 적용은 모낭 및 주변 조직에서 AR 발현을 국소적으로 억제하는 가장 안전한 방법이 될 것이다. 현재까지, AR ASO는 안드로겐성 탈모증의 국소 치료에 거의 사용되지 않았다. AR ASO는 안드로겐 제거 요법(androgen ablation therapy)에 내성인 전립선암을 치료하기 위한 전신 투여로 주로 평가되었다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I로 표시되는 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00005
여기서,
n은 10 내지 21의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 독립적으로 듀터리도(deuterido), 하이드리도(hydrido), 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카르보닐 [NH2-C(=O)-], 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴술포닐 라디칼을 나타내며;
Z는 하이드리도, 히드록시, 치환 또는 비-치환 알킬옥시, 치환 또는 비-치환 아릴옥시, 치환 또는 비-치환 아미노, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 핵염기 모이어티에 공유결합된 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 갖는 비천연 핵염기로부터 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA의 대안적 스플라이싱을 유도하고, "엑손 5"가 결여된 AR mRNA 스플라이스 변이체(들)을 생성하며, 따라서 국소 투여시 안드로겐성 활성과 관련된 피부 징후 또는 증상을 안전하게 치료하는데 유용하다.
발명의 설명
본 발명은 화학식 I로 표시되는 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00006
여기서,
n은 10 내지 21의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 독립적으로 듀터리도, 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카르보닐 [NH2-C(=O)-], 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴술포닐 라디칼을 나타내며;
Z는 하이드리도, 히드록시, 치환 또는 비-치환 알킬옥시, 치환 또는 비-치환 아릴옥시, 치환 또는 비-치환 아미노, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 핵염기 모이어티에 공유결합된 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 갖는 비천연 핵염기로부터 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA의 대안적 스플라이싱을 유도하고, "엑손 5"가 결여된 AR mRNA 스플라이스 변이체(들)을 생성하며, 따라서 국소 투여시 안드로겐성 활성과 관련된 피부 징후 또는 증상을 안전하게 치료하는데 유용하다.
"n은 10 내지 21의 정수"라는 조건은 문자 그대로 n이 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 정수 그룹으로부터 선택가능한 정수라는 것을 말한다.
화학식 I의 화합물은 인간 AR 유전자로부터 전사된 인간 AR 프리-mRNA의 "엑손 5"의 5' 스플라이스 부위에 단단히 결합한다 [NCBI Reference Sequence: NC_000023.11]. 엑손 및 인트론 번호는 AR mRNA 전사물에 따라 다를 수 있지만, "엑손 5"의 20-mer 및 "인트론 5"의 20-mer로 구성된 40-mer AR 프리-mRNA 서열은 명확하게 [(5' → 3') GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG-GUAAGGAAAAGGGAAGUGGG]로 판독된다. 상기 40-mer 프리-mRNA 서열은 대안적으로 [(5' → 3') GUGGGCCAAGGCCUUGCCUG┃guaaggaaaagggaaguggg]로 표시될 수 있되, 엑손 및 인트론 서열은 각각 "대문자" 및 "소문자"로 표현되고, 엑손/인트론 이음부는 "┃"로 표현된다.
본 발명에서 화학식 I의 화합물을 설명하기 위해 채택된 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer 프리-mRNA 서열은 AR "엑손 5"의 9-mer 및 AR "인트론 5"의 8-mer로 구성된다. 따라서, 상기 17-mer 프리-mRNA 서열은 대안적으로 [(5' → 3') CCUUGCCUG┃guaaggaa]로 판독될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA의 엑손 5의 표적 5' 스플라이스 부위에 단단히 결합하고, 화합물의 표적 엑손과 관련된 "스플라이시오솜 초기 복합체"의 형성을 방해한다. 본 발명의 화합물은 "스플라이시오솜 초기 복합체"의 형성을 입체적으로 억제하기 때문에, AR "엑손 5"는 스플라이싱되어 "엑손 5"가 결여된 AR mRNA 스플라이스 변이체 또는 변이체들을 생성한다. 결과적으로, 본 발명의 화합물은 "엑손 5"의 스키핑(skipping)을 유도한다.
화학식 I의 화합물은 선행기술 [PCT/KR2009/001256]에 예시된 바와 같이 상보적 DNA에 단단히 결합한다. 화학식 I의 PNA 유도체와 이의 전장 상보적 DNA 또는 RNA 사이의 듀플렉스는 수성 완충액에서 신뢰성 있게 측정되기에는 너무 높은 Tm 값을 나타낸다. 화학식 I의 PNA 화합물은 여전히 더 짧은 길이의, 예를 들어 10-mer의 상보적 DNA로 높은 Tm 값을 산출한다.
높은 결합 친화성으로 인하여, 본 발명의 PNA 유도체는 "엑손 5"의 5' 스플라이스 부위와 9-mer만큼 적은 상보적 중첩을 갖는 경우에도 세포에서 "엑손 5"의 스키핑을 강력하게 유도하지만, 이러한 적은 수의 중첩은 다른 프리-mRNA와의 교차 반응성의 위험을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 PNA 유도체가 국소 치료 목적으로 사용된다면, 교차 반응성의 위험은 상당히 약화될 것으로 예상된다.
화학식 I의 PNA 유도체에서의 천연 또는 비천연 핵염기의 화학구조가 도 1(a)-(c)에 예시되어 있다. 본 발명의 천연 (즉, 자연발생적) 또는 비천연 (즉, 비-자연발생적) 핵염기는, 비제한적으로, 도 1(a)-(c)에 제공된 핵염기를 포함한다. 이러한 비천연 핵염기의 제공은 허용 가능한 핵염기의 다양성을 설명하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 비천연 핵염기의 변형이 그 표적 프리-mRNA 서열과 목적하는 상보성을 충족시키는 한, 화학식 I의 PNA 화합물의 특정 위치에 대해 이러한 변형이 가능하다는 것을 쉽게 알 수 있다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위해 채택된 치환기가 도 2(a)-(e)에 예시되어 있다. 도 2(a)는 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼의 예를 제공한다. 치환 또는 비-치환 알킬아실 및 치환 또는 비-치환 알킬아실 아릴아실 라디칼은 도 2(b)에 예시되어 있다. 도 2(c)는 치환 또는 비-치환 알킬아미노, 치환 또는 비-치환 아릴아미노, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐 또는 아릴술포닐, 및 치환 또는 비-치환 알킬포스포닐 또는 아릴포스포닐 라디칼의 예를 나타낸다. 도 2(d)는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 또는 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬 아미노카르보닐 또는 아릴아미노카르보닐 라디칼의 예를 제공한다. 도 2(e)는 치환 또는 비-치환 알킬아미노티오카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노티오카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬옥시티오카르보닐, 및 치환 또는 비-치환 아릴옥시티오카르보닐 라디칼의 예를 제공한다. 이러한 예시적 치환체의 제공은 허용 가능한 치환체의 다양성을 설명하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 올리고뉴클레오타이드 서열이 N-말단 또는 C-말단의 치환체에 대하여, 올리고뉴클레오타이드의 표적 프리-mRNA 서열에 대한 서열 특이적 결합을 위한 가장 중요한 인자라는 것을 쉽게 알 수 있다.
화학식 I의 화합물은 양호한 세포 투과성을 가지며, 선행기술 [PCT/KR2009/001256]에 예시된 바와 같이 "네이키드" 올리고뉴클레오타이드로서 처리된다면 세포 내로 쉽게 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 "네이키드" 올리고뉴클레오타이드로서 화학식 I의 화합물로 처리된 세포에서 AR "엑손 5"가 결여된 AR mRNA 스플라이스 변이체(들)을 생성하기 위해 인간 AR 프리-mRNA에서 "엑손 5"의 스키핑을 유도한다. 화학식 I의 화합물은 세포에서 표적 엑손의 스키핑을 강력하게 유도하기 위하여 세포 내로 전달하기 위한 임의의 수단 또는 제형화를 필요로 하지 않는다. 화학식 I의 화합물은 서브-펨토몰 농도의 "네이키드" 올리고뉴클레오타이드로서 본 발명의 화합물로 처리된 세포에서 AR "엑손 5"의 스키핑을 쉽게 유도한다.
양호한 세포 또는 막 투과성으로 인하여, 화학식 I의 PNA 유도체는 표적 피부에서 AR "엑손 5"의 스키핑을 유도하기 위해 "네이키드" 올리고뉴클레오타이드로서 국소 투여될 수 있다. 화학식 I의 화합물은 국소 치료적 또는 생물학적 작용을 위하여 경피 전달을 증가시키기 위한 제형화를 필요로 하지 않는다. 화학식 I의 화합물은 주로 물 및 공용매에 용해되고, 서브-피코몰 농도로 국소 또는 경피 투여되어 표적 피부에서 목적하는 치료적 또는 생물학적 작용을 이끌어낸다. 본 발명의 화합물은 국소 치료 활성을 이끌어내기 위해 심하게 또는 침습적으로 제형화될 필요가 없다.
화학식 I의 화합물은, 비제한적으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 염산, 메탄술폰산, 시트르산, 트리플루오로아세트산 등을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기와 조합하여 사용될 수 있다.
화학식 I의 PNA 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은, 비제한적으로, 시트르산, 염산, 타르타르산, 스테아르산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에탄올, 이소프로판올, 중탄산나트륨, 증류수, 보존제 등을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 애주번트와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 1 aM 내지 1 nM 이상의 범위의 치료적 또는 생물학적 유효 농도로 대상체에게 국소 투여될 수 있으며, 이는 대상체의 투여 스케줄, 상태 또는 상황 등에 따라 달라질 수 있다.
화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 바람직하다:
여기서,
n은 10 내지 21의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 독립적으로 듀터리도, 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카르보닐 [NH2-C(=O)-], 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴술포닐 라디칼을 나타내며;
Z는 하이드리도, 히드록시, 치환 또는 비-치환 알킬옥시, 치환 또는 비-치환 아릴옥시, 치환 또는 비-치환 아미노, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 3 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택된다:
Figure pct00007
여기서,
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되고;
L1, L2 및 L3은 염기성 아미노 그룹을 핵염기 모이어티에 공유결합시키는 화학식 V로 표시되는 공유 링커이다:
Figure pct00008
여기서,
Q1 및 Qm은 치환 또는 비-치환 메틸렌 (-CH2-) 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 치환 또는 비-치환 메틸렌, 산소 (-O-), 황 (-S-), 및 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼 [-N(H)-, 또는 -N(치환체)-]로부터 선택되고;
m은 1 내지 15의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 관심있는 것이다:
여기서,
n은 10 내지 18의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이고;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐 라디칼을 나타내며;
Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되며;
Q1 및 Qm은 치환 또는 비-치환 메틸렌 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 치환 또는 비-치환 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼로부터 선택되고;
m은 1 내지 11의 정수이다.
화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 특히 관심있는 것이다:
여기서,
n은 11 내지 16의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer AR 프리-mRNA 서열과 적어도 11-mer의 상보적 중첩을 가지며;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되고;
Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이며, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있고;
Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼로부터 선택되며;
m은 1 내지 10의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 매우 관심있는 것이다:
여기서,
n은 11 내지 16의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 12-mer의 상보적 중첩을 가지며;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
R1, R3, 및 R5는 하이드리도 라디칼이고, R2, R4, 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 또는 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼을 나타내며;
Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 산소 라디칼로부터 선택되고;
m은 1 내지 10의 정수이다.
화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 더 많이 관심있는 것이다:
여기서,
n은 11 내지 16의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 12-mer의 상보적 중첩을 가지며;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 하이드리도 라디칼이고;
Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이며, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있고;
Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 및 산소 라디칼로부터 선택되며;
m은 1 내지 8의 정수이다.
화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 가장 관심있는 것이다:
여기서,
n은 11 내지 15의 정수이고;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 11-mer의 상보적 중첩을 가지며;
화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
X는 하이드리도 라디칼이고;
Y는 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼을 나타내며;
Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내고;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되고;
R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 하이드리도 라디칼이며;
L1은 우측 단부가 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 -CH2-O-(CH2)5-를 나타내고;
L2 및 L3는 독립적으로 우측 단부가 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 및 -(CH2)8-로부터 선택된다.
아래에 제공된 화합물 그룹으로부터 선택되는 화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 특히 관심있는 것이다:
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Ac-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 벤조일-GA(5)A-GC(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Piv-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 메틸-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) n-프로필-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) Fmoc-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-Lys-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) Fmoc-Val-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2;
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-TG(6)C(1O5)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2;
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) n-프로필-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) n-프로필-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) p-톨루엔술포닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 벤조일-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 벤조일-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GT-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)A(5)A-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-AG(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-Arg-NH2;
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) 벤질-C(1O2)TT-A(2O2)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) 페닐-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Val-Lys-NH2;
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fmoc-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
(N → C) Piv-Arg-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
(N → C) N-페닐-N-메틸-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) [N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 벤조일-Leu-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O3)TT-A(5)CC-A(5)GG(5)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
(N → C) Me-Gly-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-NH2; 및
(N → C) Fethoc-Arg-TCC(1O2)-TTA(5)-CCA(6)-GG(5)C-Lys-NH2:
여기서,
A, G, T 및 C는 각각 아데닌, 구아닌, 티민 및 시토신의 천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체이고;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX 및 화학식 X로 표시되는 비천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체이며;
Figure pct00009
여기서,
p 및 q는 정수이고;,
N- 및 C-말단 치환체의 축약형은 구체적으로 다음과 같이 기재된 바와 같다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카르보닐-"; "Fethoc-"은 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카르보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "메틸-"은 "메틸-"; "n-프로필-"은 "1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 그룹; "p-톨루엔술포닐"은 "(4-메틸벤젠)-1-술포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "라이신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"은 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-"; "벤질-"은 "1-(페닐)메틸-"; "페닐-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; 및 "-NH2"는 비-치환 "아미노" 그룹의 축약형이다.
도 3은 A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)로 축약되는 PNA 단량체의 화학구조를 집합적으로 및 명확하게 제공한다. 선행기술 [PCT/KR2009/001256]에 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"에 대한 이의 혼성화로 인해 "개질 시토신" PNA 단량체로 간주된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"에 대한 이들의 혼성화로 인해 "개질 아데닌" PNA 단량체로 간주된다. 마찬가지로, G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과의 이들의 염기짝짓기 때문에 "개질 구아닌" PNA 단량체로 간주된다.
도 4는 본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단을 다양화하기 위해 사용된 치환체의 다양한 축약형에 대한 화학구조를 명확하게 예시한다.
PNA 유도체의 축약형을 예시하기 위하여, "(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"로 축약된 PNA 유도체에 대한 화학구조가 도 5(a)에 제공된다. 다른 예시로서, "(N → C) 벤조일-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"로 축약된 PNA 유도체에 대한 화학구조가 도 5(b)에 제공된다.
"(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"의 13-mer PNA 서열은 프리-mRNA와 이의 상보적 결합에 결합함에 있어서 "(5' → 3') GAA-GCC-AGG-CAA-G"의 DNA 서열에 대응한다. 13-mer PNA는 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' → 3') GC CUUGCCUG ┃ g "uaag"gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 9-mer 서열과 9-mer의 상보적 중첩을 갖는다. "인트론 5"에서 4 개의 단일 미스매치가 "uaag"로 표시되어 있음을 알 수 있다.
"(N → C) 벤조일-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"의 13-mer PNA 서열은, 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' → 3') GC CUUGCCUG ┃ guaag gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 13-mer 서열과 13-mer의 상보적 중첩을 갖는 "(5' → 3') CTT-ACC-AGG-CAA-G"의 DNA 서열에 대응한다.
"(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2"의 13-mer PNA 서열은, 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' → 3') GC CU "U" GCCUG ┃ guaag gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 12-mer 서열과 12-mer의 상보적 중첩을 갖는 "(5' → 3') CTT-ACC-AGG-CTA-G"의 DNA 서열에 대응한다. 엑손 5에서 단일 미스매치가 "U"로 표시되어 있음을 알 수 있다.
"(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2"의 17-mer PNA 서열은, 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' → 3') GCC UUGCCUG ┃ guaaggaaaa ]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 17-mer 서열과 17-mer의 상보적 중첩을 갖는 "(5' → 3') TTT-TCC-TTA-CCA-GGC-AA"의 DNA 서열에 대응한다.
본 발명은 아래에 열거된 특히 바람직한 화합물 그룹으로부터 선택되는 화학식 I의 PNA 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2;
(N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2;
(N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(6)C(1O2)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2;
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) n-프로필-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) n-프로필-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) p-톨루엔술포닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) 벤조일-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2;
(N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;;
(N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
(N → C) N-페닐-N-메틸-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
(N → C) [N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2; 및
(N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2.
도 1(a)-(c). 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 대해 선택가능한 천연 또는 비천연 (개질) 핵염기의 예.
도 2(a)-(e). 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체에 대해 선택가능한 치환체의 예.
도 3. 천연 또는 개질 핵염기를 갖는 PNA 단량체의 화학구조.
도 4. N- 또는 C-말단 치환체의 축약형에 대한 화학구조.
도 5(a). "(N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"의 PNA 유도체에 대한 화학구조.
도 5(b). "(N → C) 벤조일-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2"의 PNA 유도체에 대한 화학구조.
도 6. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하기 위해 사용된 Fmoc-PNA 단량체에 대한 화학구조.
도 7(a)-(b). 각각 HPLC 정제 전후의 "ASO 1"에 대한 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 8(a). 0 aM (음성 대조군), 3 aM, 30 aM, 300 aM 또는 3 fM "ASO 5"로 처리된 MCF7 세포의 네스티드(nested) PCR 산물의 전기영동 분석.
도 8(b). 시퀀싱 데이터와 함께 엑손 4-5의 스키핑에 대한 PCR 밴드의 도식적 표현.
도 9(a). 5 시간 동안 0 zM (음성 대조군), 또는 1 zM 내지 1 aM의 "ASO 5"로 처리된 MCF7 세포에서의 엑손 4-6의 상대적 수준의 변화. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 9(b). 5 시간 동안 0 zM (음성 대조군), 또는 1 zM 내지 1 aM의 "ASO 1"로 처리된 MCF7 세포에서의 엑손 4-6의 상대적 수준의 변화. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 9(c). 5 시간 동안 0 zM (음성 대조군), 또는 1 zM 내지 1 aM의 "ASO 10"으로 처리된 MCF7 세포에서의 엑손 4-6의 상대적 수준의 변화. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 10(a). 0 zM (음성 대조군), 또는 100 zM 내지 300 aM의 "ASO 1"로 처리된 MCF7 세포에 대한 웨스턴 블롯 데이터.
도 10(b). 0 zM (음성 대조군), 또는 10 zM 내지 30 aM의 "ASO 5"로 처리된 MCF7 세포에 대한 웨스턴 블롯 데이터.
도 11(a). 제모 후 경과한 일수에 따른 제모된 피부 부위의 그룹 별 모발 성장 이미지.
도 11(b). 음성 대조군 (비히클) 그룹에 대한 "ASO 1" 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 12. 0 fM (음성 대조군, 비히클), 0.2 fM 또는 1 fM의 "ASO 1"로 처리된 동물로부터 얻어진 피부 샘플에 대한 AR IHC (적색) 및 DAPI (청색) 형광 이미지의 대표적인 세트.
도 13. 음성 대조군 (비히클) 그룹에 대한 "ASO 5" 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 14(a). 음성 대조군 (비히클) 그룹에 대한 "ASO 10" 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 14(b). 0 (음성 대조군, 비히클), 1, 5 또는 25 fM의 "ASO 10"으로 처리된 동물로부터 얻어진 피부 샘플에 대한 AR IHC (적색) 및 DAPI (청색) 형광 이미지의 대표적인 세트.
도 15. 음성 대조군에 대하여, 24 시간 동안 0 (음성 대조군), 1, 10, 100 또는 1,000 zM의 "ASO 10"으로 처리된 MCF7 세포에서의 TaqMan 분석에 의한 상대적 AR mRNA 수준에 대한 qPCR 데이터. (스튜던트 t-검정에 의한 통계 분석)
도 16. 0 (음성 대조군), 0.01 또는 0.1 pmole/Kg의 "ASO 10"이 4 주 동안 매주 2회 피하 투여된 마우스로부터 얻어진 조직 샘플에 대한 AR IHC (적색) 및 DAPI (청색) 형광 이미지의 대표적인 세트.
발명의 상세한 설명
PNA 올리고머의 제조를 위한 일반적 절차
PNA 올리고머는 선행기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 개시된 방법에 따라 Fmoc-화학에 기초한 고상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis) (SPPS)에 의해, 사소하지만 적절한 변경과 함께 합성되었다. 이 연구에서 사용된 고체 지지체는 PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)에서 구입한 H-Rink Amide-ChemMatrix였다. 개질 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체는 선행기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 또는 사소한 변경과 함께 합성되었다. 이러한 개질 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체 및 자연발생적 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체는 본 발명의 PNA 유도체를 합성하기 위해 사용되었다. PNA 올리고머는 C18-역상 HPLC (0.1% TFA 함유 물/메탄올 또는 물/아세토니트릴)로 정제되었으며 질량분광법으로 특성화되었다.
도식 1은 본 발명의 SPPS에서 채택된 전형적인 단량체 신장(elongation) 사이클을 보여주며, 절차의 세부 사항은 아래에 제공된다. 그러나, 당업자에게 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기상에서 이러한 SPPS 반응을 효과적으로 수행함에 있어서 많은 사소한 변형이 명백하게 가능하다. 도식 1의 각 반응 단계는 다음과 같이 간단히 제공된다.
도식 1
Figure pct00010
[H-Rink-ChemMatrix 수지의 활성화] 1.5 mL의 20% 피페리딘/DMF 중 ChemMatrix 수지 0.01 mmol (약 20 mg의 수지)을 libra 튜브에서 20 분 동안 볼텍싱하고, DeFmoc 용액을 여과하였다. 수지를 연속적으로 1.5 mL의 메틸렌 클로라이드 (MC), 1.5 mL의 디메틸포름아마이드 (DMF), 1.5 mL의 MC, 1.5 mL의 DMF, 및 1.5 mL의 MC로 각각 30 초 동안 세척하였다. 고체 지지체 상에 생성된 유리 아민을 Fmoc-PNA 단량체 또는 Fmoc-보호된 아미노산 유도체와 커플링시켰다.
[DeFmoc] 수지를 1.5 mL의 20% 피페리딘/DMF에서 7 분 동안 볼텍싱하고, DeFmoc 용액을 여과하였다. 수지를 연속적으로 1.5 mL의 MC, 1.5 mL의 DMF, 1.5 mL의 MC, 1.5 mL의 DMF, 및 1.5 mL의 MC로 각각 30 초 동안 세척하였다. 고체 지지체 상에 생성된 유리 아민을 즉시 Fmoc-PNA 단량체와 커플링시켰다.
[Fmoc-PNA 단량체와의 커플링] 고체 지지체 상의 유리 아민을 다음과 같이 Fmoc-PNA 단량체와 커플링시켰다. 0.04 mmol의 PNA 단량체, 0.05 mmol의 HBTU, 및 10 mmol의 DIEA를 1 mL의 무수 DMF에서 2 분 동안 항온처리하고, 유리 아민과 함께 수지에 첨가하였다. 수지 용액을 1 시간 동안 볼텍싱하고, 반응 매질을 여과하였다. 이어서, 수지를 연속적으로 1.5 mL의 MC, 1.5 mL의 DMF, 및 1.5 mL의 MC로 각각 30 초 동안 세척하였다. 본 발명에 사용된 개질 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체의 화학구조를 도 6에 제공하였다. 도 6에 제공된 개질 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 단량체는 예로서 간주하여야 하고, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 당업자는 화학식 I의 PNA 유도체를 합성하기 위한 Fmoc-PNA 단량체의 다수의 변형을 쉽게 알 수 있다.
[캡핑] 커플링 반응 후, 미반응 유리 아민을 1.5 mL의 캡핑 용액 (DMF 중 5% 무수 아세트산 및 6% 2,6-류티딘)에서 5 분 동안 셰이킹함으로써 캡핑하였다. 이어서, 캡핑 용액을 여과하고, 연속적으로 1.5 mL의 MC, 1.5 mL의 DMF, 및 1.5 mL의 MC로 각각 30 초 동안 세척하였다.
[N-말단에 "Fethoc-" 라디칼의 도입] 수지 상의 유리 아민을 "Fethoc-OSu"와 염기성 커플링 조건하에서 반응시킴으로써 "Fethoc-" 라디칼을 N-말단에 도입하였다. "Fethoc-OSu"의 화학구조 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36]를 다음과 같이 제공한다.
Figure pct00011
[수지로부터의 절단] 수지에 결합된 PNA 올리고머를 1.5 mL의 절단 용액 (트리플루오로아세트산 중 2.5% 트리-이소프로필실란 및 2.5% 물)에서 3 시간 동안 셰이킹함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고, 여과된 액체를 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 디에틸에테르로 혼화하고, 생성된 침전물을 역상 HPLC에 의한 정제를 위해 여과에 의해 수집하였다.
[HPLC 분석 및 정제] 수지로부터의 절단 후, PNA 유도체의 조생성물을 0.1% TFA를 함유하는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올을 용리하는 C18-역상 HPLC (구배법)에 의해 정제하였다. 도 7(a) 및 7(b)는 각각 HPLC 정제 전후의 "ASO 1"에 대한 예시적 HPLC 크로마토그램이다. "ASO 1"의 올리고머 서열은 표 1에 제공된 바와 같다.
화학식 I의 PNA 유도체의 합성예
본 발명의 PNA 유도체를 상기 제공된 합성 절차에 따라 또는 사소한 변경과 함께 제조하였다. 표 1은 본 발명의 AR ASO의 예를 질량분광법에 의한 구조적 특성화 데이터와 함께 제공한다. 표 1에서의 AR ASO의 제공은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
표 1. 화학식 I의 PNA 유도체 및 질량분광법에 의한 구조 확인.
Figure pct00012
10-mer 상보적 DNA에 대한 PNA의 결합 친화성
표 1의 PNA 유도체를, N-말단 또는 C-말단을 상보적으로 표적화하는 10-mer DNA에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결합 친화성은 PNA와 10-mer 상보적 DNA 사이의 듀플렉스에 대한 Tm 값으로 평가하였다. 표 1의 PNA 유도체와, 완전히 상보적인 DNA 사이의 듀플렉스는 수성 완충액에서 신뢰성 있게 측정되기에 너무 높은 Tm 값을 나타내는데, 이는 Tm 측정 중에 완충액이 증발하는 경향이 있기 때문이다.
Tm 값을 다음과 같이 UV/Vis 분광계로 측정하였다. 15 mL의 폴리프로필렌 팔콘 튜브 내의, 4 mL의 수성 완충액 (pH 7.16, 10 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl) 중 4 μM의 PNA 올리고머 및 4 μM의 상보적 10-mer DNA의 혼합 용액을 90℃에서 1 분 동안 항온처리하고, 몇 분에 걸쳐 주위 온도로 천천히 냉각시켰다. 이어서, 용액을 기밀 캡이 장착된 3 mL의 석영 UV 큐벳으로 옮기고, Agilent 8453 UV/Visible 분광광도계로 260 nm에서 또는 선행기술 [PCT/KR2009/001256]에 기재된 바와 유사한 것으로 또는 사소한 변경과 함께 Tm을 측정하였다. Tm 측정을 위한 10-mer 상보적 DNA는 Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Republic of Korea)에서 구입하였으며 추가 정제 없이 사용하였다.
화학식 I의 PNA 유도체의 관찰된 Tm 값은 10-mer DNA에 대한 상보적 결합에 대해 매우 높으며, 표 2에 제공된다. 예를 들어, "ASO 5"는 [(N → C) Fethoc- C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2) AA(5)-G-NH2]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 PNA 내의 N-말단 10-mer를 표적화하는 10-mer 상보적 DNA와의 듀플렉스에 대해 86.1℃의 Tm 값을 나타냈다. 한편, "ASO 5"는 [(N → C) Fethoc-C(1O2)TT- A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G -NH2]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 PNA 내의 C-말단 10-mer를 표적화하는 10-mer 상보적 DNA와의 듀플렉스에 대해 81.3℃의 Tm을 나타냈다.
표 2. 표의 PNA와, PNA의 N-말단 또는 C-말단을 표적화하는 10-mer 상보적 DNA 사이의 Tm 값.
Figure pct00013
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 생물학적 작용의 예
화학식 I의 PNA 유도체를 시험관내 및 생체내에서 이들의 생물학적 작용에 대해 평가하였다. 아래에 제공된 생물학적 예들은 화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 프로파일을 설명하기 위한 예로서 제공된 것이므로, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. "ASO 5"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1에 명시된 "ASO 5"는 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' → 3') GC CUUGCCUG ┃ guaag gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 13-mer 서열과 13-mer의 완전 상보적 중첩을 갖는 13-mer 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
MCF7 세포 (Cat. Number: HTB-22, ATCC)에서 AR "엑손 5"의 스키핑을 유도하는 "ASO 5"의 능력을 AR 네스티드 PCR로 평가하였다. 사용된 절차의 세부 사항은 다음과 같다.
[세포 배양 & ASO 처리] MCF7 세포를 10% FBS, 1% 스트렙토마이신/페니실린, 및 0.01 mg/ml 소 인슐린으로 보충된 EMEM 배지에서 5% CO2 대기하 37℃에서 성장시켰다. 세포를 3 aM 내지 3 fM의 "ASO 5"로 처리하기 전, 60 mm 배양접시에서 계대배양하였다.
[RNA 추출] MCF7 세포를 "ASO 5"와 함께 또는 "ASO 5" 없이 3 시간 동안 항온 배양하였다. 총 RNA를 "Universal RNA Extraction Kit" (Cat. No. 9767, Takara)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 60 mm 배양접시 내 세포로부터 추출하였다.
[원-스텝 PCR에 의한 cDNA 합성] 100 ng의 RNA 주형을 다음의 사이클 조건에 따라 유전자-특이적 프라이머 세트 [엑손 3_정방향: (5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC, 및 엑손 9_역방향: (5' → 3') GGGTGT-GGAAATAGATGGG]에 대해 platinum® Taq 중합효소를 갖는 Super Script® 원-스텝 RT-PCR 키트 (Cat. No. 10928-042, Invitrogen)를 사용하는 25 μL의 역전사 반응에 사용하였다: 50℃에서 30 분 및 94℃에서 2 분, 이어서 39 사이클의 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초, 및 72℃에서 1 분.
[네스티드 PCR 증폭] 증폭 프로세스 전반에 걸쳐, 하나의 특정 어닐링 온도 (즉, 통상적인 PCR 방법) 보다는, 온도 범위에 걸쳐 효과적으로 및 특이적으로 작용하는 고유 증폭 기술 (사이클 당 어닐링 온도를 증가하는 것으로 수정)을 사용하였다. 1 μL의 cDNA를 다음의 사이클 조건에 따라 프라이머 세트 [엑손 3_정방향: (5' → 3') TGGGTG-TCACTATGGAGC, 및 엑손 7n_역방향: (5' → 3') GGGGTGATTTGGAGCCAT]에 대해 20 μL의 네스티드 PCR (Invitrogen) 반응에서 추가로 증폭시켰다: 초기 10 사이클 [94℃에서 30 초, 47℃에서 40 초 (매 사이클마다 +0.5℃, 72℃에서 40 초], 이어서 20 사이클 [94℃에서 30 초, 50℃에서 30 초, 및 72℃에서 40 초].
[엑손 스키핑 산물의 동정] PCR 산물을 2% 아가로오스 겔 상에서 전기영동 분리하였다. 표적 크기의 밴드를 수집하고 생거 시퀀싱(Sanger Sequencing)으로 분석하였다. 도 8(a)에, "엑손 5"가 결여된 AR mRNA 스플라이스 변이체로 지정가능한 3 개의 처리-관련 PCR 산물 밴드가 있었다. 스키핑 산물의 비율은 ASO 농도에 의존하는 것처럼 보였지만, "ASO 5"는 "엑손 5", "엑손 4-5", 및 "엑손 4-6"의 스키핑을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 도 8(b)는 생거 시퀀싱에 대한 예로서 도 8(a)의 "엑손 4-5"의 스키핑 밴드에 대한 실제 시퀀싱 데이터를 제공한다.
실시예 2. "ASO 5"로 처리된 MCF7 세포에서 AR mRNA 수준의 qPCR 평가.
인간 AR mRNA를 하향-조절하는 "ASO 5"의 능력을 SYBR 그린 검출을 사용하는 qPCR로 평가하였다.
MCF7 세포를 60 mm 배양접시 내 5 mL 배지에서 계대배양하고, 0 zM (음성 대조군) 내지 1 aM (각 농도 당 2 배양접시)의 "ASO 5"로 처리하였다. 5 시간 후, 총 RNA를 "MiniBEST Universal RNA Extraction Kit"를 제조사의 지침에 따라 사용하여 추출하였다 (Cat. No. 9767, Takara). 500 ng의 RNA 주형을 Oligo-dT를 제조사의 지침에 따라 사용하는 50 μL의 역전사 반응에 사용하여 cDNA를 합성하였다 (Cat. No. 6110A, Takara). 이어서, cDNA를 다음의 사이클 조건에 따라 "엑손 3" 내지 "엑손 9" [엑손 3_정방향: (5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC, 및 엑손 9_역방향: (5' → 3') GGGTG-TGGAAATAGAT-GGG]을 포괄하는 프라이머 세트에 대해 1st PCR을 수행하였다: 94℃에서 2 분, 이어서 15 사이클의 94℃에서 15 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 2 분.
1st PCR 산물을 2,000 배로 희석하고, 1 μL의 각 희석된 PCR 산물을 엑손 특이적 프라이머 세트들 [엑손 4의 경우 엑손 4_정방향(q): (5' → 3') GACCATGTTTTGCCCATTG 및 엑손 4_역방향(q): (5' → 3') GGCTCTTTTGAAGAAGACC; 엑손 5의 경우 엑손 5_정방향(q): (5' → 3') GAAACAGAAGTA-CCTGTGC 및 엑손 5_역방향(q): (5' → 3') GTCATCCCTGCTTCATAAC; 및 엑손 6의 경우 엑손 6_정방향(q): (5' → 3') CGGAAGCTGAAGAAACTTG 및 엑손 6_역방향(q): (5' → 3') CACTTGACCACGTGTACAAG]의 세트에 대해 20 μL의 실시간 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 SYBR 그린 (Takara, Japan)으로 모니터링하였다. 사이클 조건: 95℃에서 3 분, 이어서 40 사이클의 95℃에서 5 초, 및 60℃에서 30 초.
도 9(a)는 이로부터 얻어진 qPCR 데이터를 제공한다. 엑손 4-6의 상대적 발현 수준은 ASO 농도가 0 zM에서 100 zM으로 증가함에 따라 유의하게 감소하였다. 100 zM에서, 엑손 메시지 수준은 약 50 내지 60%까지 감소하였다. 그러나, 1 aM에서, 엑손 메시지 수준은 음성 대조군 (ASO 처리 없음)의 수준 근처로 되돌아왔다. qPCR 데이터의 이상한 용량 반응 패턴은 "ASO 5"로 엑손 스키핑 동안 축적된 "엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수 있다 [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
실시예 3. "ASO 1"로 처리된 MCF 세포에서 AR mRNA 수준의 qPCR 평가.
표 1에 명시된 "ASO 1"은 원래 인간 AR mRNA 내의 "엑손 5" 및 "엑손 6"의 이음부를 상보적으로 표적화하도록 설계된 13-mer 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. "ASO 1"은 인간 AR 프리-mRNA 내의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer RNA 서열 [(5' →3') GC CUUGCCUG ┃ g "uaag"gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 9-mer 서열과 9-mer의 상보적 중첩을 갖는다. 인트론 5에서 4 개의 단일 미스매치가 "uaag"로 표시되어 있음을 알 수 있다. 따라서, "ASO 1"은 13-mer 서열 중 9-mer의 상보적 중첩만을 갖지만, 인간 AR 프리-mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 간주될 수 있다.
인간 AR mRNA를 하향-조절하는 "ASO 1"의 능력을 "실시예 2"에 기재된 프로토콜에 따라 qPCR로 평가하였다.
도 9(b)는 이로부터 얻어진 qPCR 데이터를 제공한다. "엑손 4-6"의 상대적 발현 수준은 ASO 농도가 0 zM에서 100 zM으로 증가함에 따라 유의하게 감소하였다. 100 zM에서, 엑손 메시지 수준은 80% 이상까지 감소하였다. 그러나, 1 aM에서, 엑손 메시지 수준은 음성 대조군 (ASO 처리 없음)의 약 60%로 되돌아왔다. qPCR 데이터의 이상한 용량 반응 패턴은 "ASO 5"로 엑손 스키핑 동안 축적된 "엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수 있다 [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
실시예 4. "ASO 10"으로 처리된 MCF 세포에서 AR mRNA 수준의 qPCR 평가.
표 1에 명시된 "ASO 10"은 인간 AR 프리-mRNA의 "엑손 5" 및 "인트론 5"의 이음부에 걸친 20-mer 프리-mRNA 서열 [(5' →3') GCC UUGCCUG ┃ guaag gaaaa]에서 "굵은 글씨" 및 "밑줄"로 표시된 12-mer 서열과 12-mer의 완전 상보적 중첩을 갖는 12-mer 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
인간 AR mRNA (전장)를 하향-조절하는 "ASO 10"의 능력을 "실시예 2"에 기재된 프로토콜에 따라 qPCR로 평가하였다.
도 9(c)는 이로부터 얻어진 qPCR 데이터를 제공한다. "엑손 4-6"의 상대적 발현 수준은 1 zM 내지 1,000 zM의 "ASO 10"으로 처리된 MCF7 세포에서 60 ~ 80%까지 유의하게 감소하였다.
실시예 5. "ASO 1"에 의한 AR 하향조절의 웨스턴 블롯 분석.
MCF7 세포를 5 ml 배지를 함유하는 60 mm 배양접시에서 계대배양하고, 0 zM (음성 대조군), 또는 100 zM 내지 300 aM의 "ASO 1"로 처리하였다. 4 개의 음성 대조군에 대하여 4 개의 배양접시를 사용하였다. 48 시간 후, 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척하고, 이어서 1X 프로테아제 억제제 (Cat. No. P8340, Sigma)가 보충된 200 μL의 1X 세포 용해 완충액 (Cat. No. 9803, Cell Signaling Tech)으로 용해시켰다. 용해물을 1.5 ml의 e-튜브에 수집하였다. 200 μL의 각 용해물을 100 μL의 3X 샘플 완충액과 혼합하고, 20 μL의 각 용해물 (총 12 개의 용해물)을 100℃에서 5 분 동안 끓였다. 4 개의 음성 대조군 및 8 개의 ASO 처리 샘플)을 8% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동 분리하고, 0.2 μm의 PVDF 막 상으로 옮겼다. 막은 항-AR 항체 (Cat. No. 5153, Cell Signaling Tech) 및 항-β액틴 항체 (Cat. No. sc4778, Santa Cruz)로 프로빙되었다. 도 10(a)는 이로부터 얻어진 AR 웨스턴 블롯 데이터를 제공한다. 웨스턴 블롯 절차의 기술적 인공 산물(artifacts)을 극복하기 위하여 다수의 (음성) 대조군 샘플을 사용하였다. (음성) "대조군 4"에 대한 AR 밴드를 제외하고, ASO 처리한 용해물의 AR 밴드 강도는 ASO 처리하지 않은 용해물의 것보다 상당히 약했으며, 이는 "ASO 1"이 MCF7 세포에서 전장 AR 단백질의 발현을 억제한다는 것을 명확하게 나타낸다.
실시예 6. "ASO 5"에 의한 AR 하향조절의 웨스턴 블롯 분석.
MCF7 세포에서 10 zM 내지 30 aM으로 AR 단백질 발현을 억제하는 "ASO 5"의 능력을 "실시예 5"에 기재된 절차에 따라 평가하였다.
도 10(b)는 0 zM (음성 대조군, ASO 처리 없음), 또는 10 zM 내지 30 aM의 "ASO 5"로 처리된 MCF7 세포로 얻어진 AR 웨스턴 블롯 데이터를 제공한다. 웨스턴 블롯 절차의 기술적 인공 산물을 극복하기 위하여 다수의 (음성) 대조군 샘플을 사용하였다. ASO 처리한 용해물의 AR 밴드 강도는 ASO 처리하지 않은 인접한 용해물의 것보다 상당히 약했으며, 이는 "ASO 1"이 MCF7 세포에서 전장 AR 단백질의 발현을 억제한다는 것을 명확하게 나타낸다.
실시예 7. 마우스에서 "ASO 1"의 국소 투여에 의해 촉진된 모발 성장.
국소 투여시 C57BL/6 마우스의 모발 성장을 촉진시키는 "ASO 1"의 능력을 다음과 같이 평가하였다. 인간 AR 프리-mRNA에서의 "ASO 1"의 표적 서열은 마우스 AR 프리-mRNA에서 보존된다. 따라서, 마우스에서의 생체내 치료 결과는 많은 모호함 없이 인간의 경우에 외삽될 수 있다.
[제모 및 분류] 0 일째에, 7 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 졸레틸/럼푼으로 마취시키고, 등의 모발을 각각 클리퍼 및 왁스로 자르고 제거하였다. 흠 없는 (즉, 티 없는) 제모 마우스를 선택하여 3 개의 그룹으로 (그룹 당 7 마리의 동물) 무작위로 할당하였다.
[국소 투여] "ASO 1"의 국소 용액을 3% (v/v) 글리세린이 보충된 수성 30% (v/v) 에탄올에서 "ASO 1"의 모 원액을 0.2 fM 또는 1 fM으로 희석함으로써 제조하였다. 3, 7, 10, 및 14 일째에, 약 100 μL의 0 (음성 대조군), 0.2, 또는 1 fM "ASO 1"을 면봉을 사용하여 각 동물의 등에 국소 투여하였다.
[모발 성장에 대한 디지털 이미지 스코어링] 모발 성장을 스코어링하기 위하여, 동물을 마취시키고 도 11(a)에 나타난 바와 같이 디지털 카메라를 사용하여 고정된 값의 노출 시간 및 조명에서 그룹 별로 사진촬영하였다. 각 동물의 제모 부위에 대한 디지털 이미지를 선택하고 "ImageJ" 프로그램을 사용하여 선택한 부위에 대한 평균 밝기를 디지털 방식으로 스코어링하였다. 낮은 밝기 스코어는 빠른 모발 성장으로 간주된다. 개별 동물의 밝기 스코어를 그룹 별로 조합하고, 스튜던트 t-검정으로 통계 분석하였다. 도 11(b)는 대조군 그룹에 대한 ASO 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어를 요약한다. 상대적 밝기 스코어는 처리 그룹의 일수에 따라 감소하는 경향을 보였다. 13 일째에, 1 fM 그룹은 비-처리 그룹보다 밝기 스코어가 유의하게 낮았다. 따라서, "ASO 1"은 1 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
[모발 무게에 의한 스코어링] 21 일째에, 동물을 마취시키고 등의 모발을 클리퍼로 잘랐다. 개별 동물로부터의 모발 샘플을 그룹 별로 조합하고, 무게를 측정하여 0 일과 21 일 사이의 모발 성장을 평가하였다. 평균 모발 무게는 70.5 mg/대조군 그룹의 동물, 90.8 mg/0.2 fM 처리 그룹의 동물, 및 94.4 mg/1 fM 처리 그룹의 동물이었다. 따라서, "ASO 1"은 1 fM뿐만 아니라 0.2 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
[피부 샘플의 AR IHC] 21 일째의 면도 후, 마우스는 그룹에 따라 비히클 또는 "ASO 1"의 단일 국소 투여를 받았다. 24 일째에, 제모된 피부 부위를 안드로겐 수용체에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC) 분석을 위해 샘플링하였다. 피부 샘플을 동결-절편시키고, 적색 형광 태그를 위하여 연속적으로 1:100으로 희석한 1차 항-AR 항체 (Cat. No. sc-816, Santa Cruz), 1:200으로 희석한 2차 항-IgG (Cat No. BA-1100, Vector), 그리고 이어서 1:200으로 희석한 Dylight 594-스텝타비딘 (Cat No. SA-5594, Vector, CA, USA)으로 면역염색하였다. IHC 이미지는 "ASO 1"로 국소 처리시 AR 발현 수준의 변화에 대해 Olympus 형광현미경 상에 포착되었다.
도 12는 모낭에서의 AR 발현이 0.2 fM 또는 1 fM의 "ASO 1"의 국소 투여시 모낭에서 현저하게 억제되었음을 입증하는 AR IHC 이미지의 대표적인 세트이다. DAPI 염색 이미지는 IHC 이미지 내 모낭의 위치 파악을 위해 제공되었다. 흥미롭게도, AR 발현은 0.2 fM 또는 1 fM의 "ASO 1"의 국소 투여시 진피 밑의 근육층에서도 감소하였다. 따라서, "ASO 1"은 국소 투여시 진피 밑의 근육층뿐만 아니라 진피로도 쉽게 전달되며, AR의 발현을 강력하게 억제한다.
실시예 8. 마우스에서 "ASO 5"의 국소 투여에 의해 촉진된 모발 성장.
국소 투여시 C57BL/6 마우스의 모발 성장을 촉진시키는 "ASO 5"의 능력을 아래에 상세히 설명한 바와 같이 평가하였다. 인간 AR 프리-mRNA에서의 "ASO 5"의 표적 서열은 마우스 AR 프리-mRNA에서 보존된다. 따라서, 마우스에서의 생체내 치료 결과는 많은 모호함 없이 인간의 경우에 외삽될 수 있다.
[제모 및 분류] 0 일째에, 7 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 졸레틸/럼푼으로 마취시키고, 등의 모발을 각각 클리퍼 및 왁스로 자르고 제거하였다. 흠 없는 (즉, 티 없는) 제모 마우스를 선택하여 3 개의 그룹으로 (그룹 당 10 마리의 동물) 무작위로 할당하였다.
[국소 투여] "ASO 5"의 국소 용액을 3% (v/v) 글리세린이 보충된 수성 30% (v/v) 에탄올에서 "ASO 5"의 모 원액을 1, 5, 또는 25 fM으로 희석함으로써 제조하였다. 3, 7, 10, 14 및 21 일째에, 약 100 μL의 각 ASO 용액 또는 비히클 (음성 대조군)을 면봉을 사용하여 동물의 등에 국소 투여하였다.
[모발 성장에 대한 디지털 이미지 스코어링] 도 13은 음성 대조군 그룹에 대한 ASO 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어를 요약한다. 상대적 밝기 스코어는 ASO 처리 그룹의 일수에 따라 감소하는 경향을 보였다. 17 일째에, 1 fM 및 25 fM의 처리 그룹은 비-처리 그룹보다 밝기 스코어가 유의하게 낮았다. 따라서, "ASO 5"는 1 내지 25 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
[모발 무게에 의한 스코어링] 21 일째에, 동물을 마취시키고 등의 모발을 자르고 수집하였다. 개별 동물로부터의 모발 샘플을 그룹 별로 조합하고, 무게를 측정하여 0 일과 21 일 사이의 모발 성장을 평가하였다. 처리 그룹은 대조군 그룹에 비하여 모발 무게가 현저하게 증가하였다. 1 fM, 5 fM, 및 25 fM 그룹의 평균 모발 무게는 각각 음성 대조군 그룹의 293%, 306%, 및 278%이었다. 따라서, "ASO 5"는 1 내지 25 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
21 일째의 면도 후, 동물들은 비히클 또는 1 fM, 5 fM, 또는 25 fM의 "ASO 5"의 단일 국소 투여를 받았다. 53 일째에, 등의 모발을 클리퍼로 면도함으로써 수집하여 21 일과 53 일 사이의 모발 성장의 총량을 측정하였다. 1 fM, 5 fM, 및 25 fM 그룹의 평균 모발 무게는 각각 비-처리 그룹의 1,630%, 1,450%, 및 771%이었다. 따라서, "ASO 5"는 1 내지 25 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
실시예 9. 마우스에서 "ASO 10"의 국소 투여에 의해 촉진된 모발 성장.
국소 투여시 C57BL/6 마우스의 모발 성장을 촉진시키는 "ASO 10"의 능력을 아래에 상세히 설명한 바와 같이 평가하였다. 인간 AR 프리-mRNA에서의 "ASO 10"의 표적 서열은 마우스 AR 프리-mRNA에서 보존된다. 따라서, 마우스에서의 생체내 치료 결과는 많은 모호함 없이 인간의 경우에 외삽될 수 있다.
[제모 및 분류] 0 일째에, 7 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 졸레틸/럼푼으로 마취시키고, 등의 모발을 각각 클리퍼 및 왁스로 자르고 제거하였다. 흠 없는 (즉, 티 없는) 제모 마우스를 선택하여 3 개의 그룹으로 (그룹 당 9 마리의 동물) 무작위로 할당하였다.
[국소 투여] "ASO 10"의 국소 용액을 3% (v/v) 글리세린이 보충된 수성 30% (v/v) 에탄올에서 "ASO 10"의 모 원액을 1, 5, 또는 25 fM으로 희석함으로써 제조하였다. 2 일째에, 약 100 μL의 각 ASO 용액 또는 비히클 (음성 대조군)을 면봉을 사용하여 동물의 등에 국소 투여하였다.
[모발 성장에 대한 디지털 이미지 스코어링] 도 14(a)는 대조군 그룹에 대한 ASO 처리 그룹의 상대적 밝기 스코어를 요약한다. 상대적 밝기 스코어는 처리 그룹의 일수에 따라 감소하는 경향을 보였다. 27 일째에, 1 fM 및 5 fM의 처리 그룹은 비-처리 그룹보다 밝기 스코어가 유의하게 낮았다. 따라서, "ASO 10"은 1 내지 5 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
[모발 무게에 의한 스코어링] 27 일째에, 동물을 마취시키고 등의 모발을 자르고 수집하였다. 개별 동물로부터의 모발 샘플을 그룹 별로 조합하고, 무게를 측정하여 0 일과 27 일 사이의 모발 성장을 평가하였다. 처리 그룹은 대조군 그룹에 비하여 모발 무게가 꽤 증가하였다. 1 fM, 5 fM, 및 25 fM 그룹의 평균 모발 무게는 각각 비-처리 그룹의 115%, 114%, 및 119%이었다. 따라서, "ASO 10"은 1 내지 25 fM으로 국소 투여시 모발 성장을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
[피부 샘플의 AR 면역조직화학] 27 일째의 제모 후, 동물들은 27 및 29 일째에 비히클 또는 1, 5, 또는 25 fM의 “ASO 10"을 추가로 국소 투여받았다. 30 일째에, 등의 피부 샘플을 안드로겐 수용체에 대한 면역조직화학 분석을 위해 수집하였다. 피부 샘플을 “실시예 7"에 기재된 바와 같이 안드로겐 수용체에 대해 면역염색하였다. IHC 이미지는 Zeiss 슬라이드 스캐너 상에 포착되었다. 도 14(b)는 AR IHC 이미지의 대표적인 세트이다. 흥미롭게도, 모낭의 수는 음성 대조군 그룹에 비하여 ASO 처리 그룹에서 현저하게 증가하였다. 처리 그룹에서 모낭의 수가 현저하게 증가했기 때문에 처리 그룹에서 모낭의 AR 발현이 감소한 것이라고 확실히 말하기는 어려울 것이다. 그럼에도 불구하고, 진피 밑의 근육층에서의 AR 발현은 대조군 그룹에 비하여 처리 그룹에서 현저하게 감소하였다. 가장 눈에 띄는 감소는 5 fM 처리 그룹에서 관찰되었다. “ASO 10"으로 처리된 동물의 IHC 결과를 종합해보면, “ASO 10"은 모든 시험된 용량에서 AR 발현을 억제하여 모낭의 수를 증가시킴으로써 모발 성장을 촉진시켰으며, 5 fM에서 가장 두드러졌다.
실시예 10. “ASO 10"으로 처리된 MCF7 세포에서 TaqMan 분석에 의한 AR mRNA 수준의 qPCR 평가.
인간 AR mRNA를 하향-조절하는 “ASO 10"의 능력을 TaqMan 프로브를 채택한 qPCR로 평가하였다.
MCF7 세포를 60 mm 배양접시 내 5 mL 배지에서 계대배양하고, 0 zM (음성 대조군) 내지 1 aM (각 농도 당 2 배양접시)의 "ASO 10"으로 처리하였다. 24 시간 후, 총 RNA를 "MiniBEST Universal RNA Extraction Kit"를 제조사의 지침에 따라 사용하여 추출하였다 (Cat. No. 9767, Takara).
400 ng의 RNA 주형을 다음의 사이클 조건에 따라 엑손 특이적 프라이머 세트 [엑손 3_정방향: (5' →3') TGGGTGTCACTATGGAGC ; 및 엑손 9_역방향: (5' → 3') GGGTGT- GGAAATAGATGGG]에 대해 One-Step RT-PCR 키트 (Invitrogen)를 사용하는 20 μL의 역전사 반응에 사용하여 cDNA를 합성하였다: 50℃에서 30 분 및 94℃에서 2 분, 이어서 15 사이클의 94℃에서 30 초, 50℃에서 30 초, 및 72℃에서 1 분.
cDNA 용액을 50 배로 희석하고, 1 μL의 각 희석된 PCR 산물을 다음의 사이클 조건에 따라 엑손 특이적 프라이머 세트 [엑손 4_정방향: (5' → 3') TTGTCCATCTTGTCGTCTT; 및 엑손 5_역방향: (5' → 3') CCTCTC-CTTCCTCCTGTA]에 대해 20 μL의 실시간 PCR 반응시켰다: 95℃에서 3 분, 이어서 40 사이클의 95℃에서 15 초, 및 60℃에서 30 초. qPCR 반응을 [(5' → 3') TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ]의 TaqMan 프로브로 모니터링하였다.
도 15는 이로부터 얻어진 qPCR 데이터를 제공한다. 엑손 4-6의 상대적 발현 수준은 1 zM 내지 1 aM의 "ASO 10"으로 처리된 MCF7 세포에서 약 50 내지 70%까지 유의하게 감소하였다.
실시예 11. "ASO 10"으로 피하투여된 마우스에서 IHC에 의한 AR 발현의 하향-조절.
마우스에서 AR 발현을 억제하는 "ASO 10"의 능력을 다음과 같이 평가하였다.
12 주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 음성 대조군 (ASO 처리 없음), 0.01 pmole/Kg "ASO 10" 및 0.1 pmole/Kg "ASO 10"의 3 개의 그룹 (그룹 당 3 마리의 동물)으로 무작위로 할당하였다. 마우스는 투여 그룹에 따라 비히클 또는 비히클에 용해된 ASO를 4 주 동안 매주 2회 피하 투여받았다. 최종 투여 3 일 후, 동물을 졸레틸/럼푼으로 마취시키고 AR IHC를 위한 조직 또는 기관 샘플링을 파라핀 블록으로 수행하였다.
AR 단백질은 연속적으로 1:100으로 희석한 1차 항체 (Cat. No. sc-816, Santa Cruz), 1:200으로 희석한 2차 항-토끼 IgG (Cat. No. BA-1100, VECTOR), 그리고 1:200으로 희석한 Dylight 594-스트렙타비딘 (Cat. No. SA-5594, VECTOR)으로 프로빙되었다. 핵은 DAPI로 염색하였다. IHC 형광 이미지는 Zeiss 슬라이드 스캐너 상에 포착되었다.
도 16은 AR 단백질을 풍부하게 발현하는 것으로 알려진 조직으로 얻어진 AR IHC 이미지 (적색)를 제공한다. IHC 이미지는 DAPI (파란색)와 동일 위치에 함께 제공된 것을 알 수 있다. "ASO 10"에 만성 피하 노출시, AR 발현은 ASO 용량이 0.01 pmole/Kg에서 0.1 pmole/Kg으로 증가함에 따라 주사 부위, 간, 고환 및 전립선에서 원거리의 표피에서 현저하게 감소하였다. 따라서, "ASO 10"은 전신 노출시 마우스에서 AR 단백질 발현을 명확하게 억제한다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00014

    n은 10 내지 21의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 독립적으로 듀터리도, 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카르보닐 [NH2-C(=O)-], 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴술포닐 라디칼을 나타내며;
    Z는 하이드리도, 히드록시, 치환 또는 비-치환 알킬옥시, 치환 또는 비-치환 아릴옥시, 치환 또는 비-치환 아미노, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 핵염기 모이어티에 공유결합된 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 갖는 비천연 핵염기로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    n은 10 내지 21의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 안드로겐 수용체 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 독립적으로 듀터리도, 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도 [H], 포르밀 [H-C(=O)-], 아미노카르보닐 [NH2-C(=O)-], 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 아릴아미노카르보닐, 치환 또는 비-치환 알킬술포닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴술포닐 라디칼을 나타내며;
    Z는 하이드리도, 히드록시, 치환 또는 비-치환 알킬옥시, 치환 또는 비-치환 아릴옥시, 치환 또는 비-치환 아미노, 치환 또는 비-치환 알킬, 또는 치환 또는 비-치환 아릴 라디칼을 나타내고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 3 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되고:
    Figure pct00015

    여기서,
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되고;
    L1, L2 및 L3은 염기성 아미노 그룹을 핵염기 모이어티에 공유결합시키는 화학식 V로 표시되는 공유 링커이며:
    Figure pct00016

    여기서,
    Q1 및 Qm은 치환 또는 비-치환 메틸렌 (-CH2-) 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
    Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 치환 또는 비-치환 메틸렌, 산소 (-O-), 황 (-S-), 및 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼 [-N(H)-, 또는 -N(치환체)-]로부터 선택되고;
    m은 1 내지 15의 정수인 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  3. 제1항에 있어서,
    n은 10 내지 18의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 9-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이고;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬, 치환 또는 비-치환 아릴, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 치환 또는 비-치환 아릴아실, 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐, 또는 치환 또는 비-치환 아릴옥시카르보닐 라디칼을 나타내며;
    Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되고;
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되며;
    Q1 및 Qm은 치환 또는 비-치환 메틸렌 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
    Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 치환 또는 비-치환 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼로부터 선택되고;
    m은 1 내지 11의 정수인 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  4. 제1항에 있어서,
    n은 11 내지 16의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer AR 프리-mRNA 서열과 적어도 11-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
    Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 4 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 및 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼로부터 선택되고;
    Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이며, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있고;
    Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 산소, 및 아미노 라디칼로부터 선택되며;
    m은 1 내지 10의 정수인 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  5. 제1항에 있어서,
    n은 11 내지 16의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 12-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
    Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실을 비롯한 천연 핵염기, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    R1, R3, 및 R5는 하이드리도 라디칼이고, R2, R4, 및 R6은 독립적으로 하이드리도, 또는 치환 또는 비-치환 알킬 라디칼을 나타내며;
    Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있으며;
    Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 산소 라디칼로부터 선택되고;
    m은 1 내지 10의 정수인 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  6. 제1항에 있어서,
    n은 11 내지 16의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 12-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
    X 및 Y는 독립적으로 하이드리도, 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼로부터 선택되고;
    Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기로부터 선택되고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 하이드리도 라디칼이고;
    Q1 및 Qm은 메틸렌 라디칼이며, Qm은 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있고;
    Q2, Q3, …, 및 Qm-1은 독립적으로 메틸렌, 및 산소 라디칼로부터 선택되며;
    m은 1 내지 8의 정수인 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  7. 제1항에 있어서,
    n은 11 내지 15의 정수이고;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 [(5' → 3') CCUUGCCUGGUAAGGAA]의 17-mer RNA 서열과 적어도 11-mer의 상보적 중첩을 가지며;
    화학식 I의 화합물은 인간 AR 프리-mRNA 내의 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적이고;
    S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1, 및 Tn은 하이드리도 라디칼이며;
    X는 하이드리도 라디칼이고;
    Y는 치환 또는 비-치환 알킬아실, 또는 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼을 나타내며;
    Z는 치환 또는 비-치환 아미노 라디칼을 나타내고;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn은 독립적으로 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 및 비천연 핵염기로부터 선택되며;
    B1, B2, …, Bn-1, 및 Bn 중 적어도 5 개는 독립적으로 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV로 표시되는 비천연 핵염기로부터 선택되고;
    R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 하이드리도 라디칼이며;
    L1은 우측 단부가 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 -CH2-O-(CH2)5-를 나타내고;
    L2 및 L3는 독립적으로 우측 단부가 염기성 아미노 그룹에 직접 결합되어 있는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 및 -(CH2)8-로부터 선택되는 것인, 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적 염.
  8. 제1항에 있어서,
    아래에 제공된 펩타이드 핵산 유도체 그룹으로부터 선택되는 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Ac-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 벤조일-GA(5)A-GC(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Piv-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 메틸-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) n-프로필-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-Lys-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2
    (N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) Fmoc-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-Lys-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) Fmoc-Val-Gly-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-TG(6)C(1O5)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2;
    (N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
    (N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) n-프로필-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) n-프로필-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) p-톨루엔술포닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 벤조일-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 벤조일-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GT-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)A(5)A-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-AG(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-Arg-NH2;
    (N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) 벤질-C(1O2)TT-A(2O2)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) 페닐-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Val-Lys-NH2;
    (N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fmoc-Lys-Val-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) H-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
    (N → C) Piv-Arg-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
    (N → C) N-페닐-N-메틸-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) [N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 벤조일-Leu-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O3)TT-A(5)CC-A(5)GG(5)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
    (N → C) Me-Gly-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-NH2; 및
    (N → C) Fethoc-Arg-TCC(1O2)-TTA(5)-CCA(6)-GG(5)C-Lys-NH2이되,
    여기서,
    A, G, T 및 C는 각각 아데닌, 구아닌, 티민 및 시토신의 천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체이고;
    C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 및 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX 및 화학식 X로 표시되는 비천연 핵염기를 갖는 PNA 단량체이며;
    Figure pct00017

    여기서,
    p 및 q는 정수이고;,
    N- 및 C-말단 치환체의 축약형은 구체적으로 다음과 같이 기재된 바와 같다:
    "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카르보닐-"; "Fethoc-"은 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카르보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "벤조일-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "메틸-"은 "메틸-"; "n-프로필-"은 "1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 그룹; "p-톨루엔술포닐"은 "(4-메틸벤젠)-1-술포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "라이신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"은 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-"; "벤질-"은 "1-(페닐)메틸-"; "페닐-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-"; 및 "-NH2"는 비-치환 "아미노" 그룹의 축약형이다.
  9. 제1항에 있어서,
    아래에 제공된 화합물 그룹으로부터 선택되는 펩타이드 핵산 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
    (N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)A-GC(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-GA(6)A-GC(1O2)C-A(6)GG-C(1O2)AA(6)-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-G(6)AA(5)-GC(1O3)C-A(7)GG(5)-CA(5)A-G-NH2;
    (N → C) Fmoc-GA(5)A-GC(2O2)C-A(6)GG-C(1O5)AA(6)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-TG(6)C(1O2)-GGA(6)-AG(6)C-CA(6)G-GC(1O2)A-A(6)GG(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(5)GG-C(1O3)AA(5)-G-Val-Lys-NH2;
    (N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
    (N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) n-프로필-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) n-프로필-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) p-톨루엔술포닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) 벤조일-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O5)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG-C(1O2)AA(3)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2;
    (N → C) Fethoc-GA(5)T-AC(1O2)C-A(5)GG(6)-CAA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(7)GG(5)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(2O2)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Piv-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2;
    (N → C) N-페닐-N-메틸-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2;
    (N → C) [N-(2-페닐에틸)아미노]카르보닐-CTT-A(5)C(1O2)C-A(4)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2;
    (N → C) Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2;
    (N → C) Fethoc-TTT-TCC(1O2)-TTA(6)-CC(1O3)A(6)-G-Lys-NH2; 및
    (N → C) Fethoc-TC(2O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GG(6)C-A(6)A-NH2.
  10. 제1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체의 국소 투여에 의한, 안드로겐성 활성과 관련된 피부 징후 또는 증상의 치료 방법.
  11. 제1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체의 국소 투여에 의한, 안드로겐성 탈모증의 치료 방법.
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