CN110506052A - Snap25反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

提供靶向人类SNAP25前mRNA的3'剪接位点的肽核酸衍生物。所述肽核酸衍生物至少有效诱导细胞中人类SNAP25 mRNA的剪接变体，并可用于通过局部给予安全治疗涉及人类SNAP25蛋白表达的皮肤病适应症或病症。

Description

SNAP25反义寡核苷酸
本发明涉及用于治疗由SNAP25蛋白介导的皮肤病适应症或病症的靶向人类SNAP25前mRNA的肽核酸衍生物，并要求2017年1月6日递交的美国临时申请号62/443,262的优先权的益处，所述临时申请通过参考以其全部结合到本文中。
发明背景
胞吞作用为细胞将大分子摄入细胞的过程。与此同时，胞吐作用为细胞分泌细胞内物质或内容物到细胞外的过程。有大量类型的细胞巧妙地采用胞吐作用来分泌囊泡内容物或物质到细胞外。神经元细胞已经演变成通过胞吐作用分泌神经递质，用于其注定的与相邻神经元细胞或相邻组织进行通讯的生理作用。作为胞吐作用的另一个实例，肥大细胞通过胞吐作用释放组胺并且结果募集免疫细胞。
分泌囊泡含有各种类型的囊泡物质，其将根据细胞类型而变化。例如，神经元细胞中的突触前囊泡位于突触前神经元末梢并含有神经递质的混合物。囊泡膜与细胞质膜融合以将神经递质释放到突触区域，以生理控制或影响相邻的细胞或组织。胰岛中的β-细胞具有含有胰岛素的囊泡，并且囊泡经历涉及膜融合的胞吐作用以在响应血糖水平时将胰岛素释放到血流中[Cell Metabolism, vol 5, 237-252 (2007)]。
胞吐作用为涉及囊泡膜与细胞质膜融合的细胞过程。有两种类型的胞吐作用，即“组成型”和“调节型”。“组成型”胞吐作用在没有刺激信号的情况下自发发生。与此同时，“调节型”胞吐作用由特定的刺激信号(例如运动神经元细胞中细胞内钙离子浓度的增加)触发[Ann. Rev. Cell Dev. Biol. vol 16, 19-49 (2000)]。
突触接头处的胞吐作用：神经元细胞使用专门用于神经元细胞的称为“突触接头”的机器彼此通讯。在相邻神经元细胞之间的突触接头处发生的胞吐作用过程在图1A中示意性地说明。首先，含有神经递质颗粒的囊泡响应刺激信号(比如神经元轴突感知的钙离子浓度的变化)与突触前细胞质膜融合。在膜融合后，神经递质颗粒被释放到突触前接头。然后神经递质颗粒扩散并与在相邻神经元细胞的树突膜上表达的神经递质受体结合。最后，受体在与神经递质分子复合后被激活，并转导从相邻神经元细胞的轴突传递的神经元信号。
神经肌肉接头处的胞吐作用：运动神经元利用神经肌肉接头处的胞吐作用控制肌肉的运动。在肌肉中，运动神经元的轴突分支成许多轴突末梢，以与肌细胞的肌纤维膜形成接头，即神经肌肉接头[Nat. Rev. Neuroscience, vol 2, 791-805 (2001)]。神经元轴突末梢和肌细胞膜之间的间隙称为突触间隙，尺寸为约30 nm。
当动作电位形式的神经脉冲到达运动神经元的轴突末梢时，在神经肌肉接头处开始突触传递。运动神经元轴突通过胞吐作用将神经递质分子(即脊椎动物体内的乙酰胆碱)释放到突触间隙中，并且在肌细胞膜上表达的乙酰胆碱受体在与乙酰胆碱复合后激活，这触发肌纤维的收缩。在神经元轴突和肌细胞之间的神经肌肉接头中发生的胞吐作用过程在图1B中示意性地说明。
SNARE蛋白和神经元胞吐作用：囊泡和神经元细胞膜的融合对于“调节型”胞吐作用为必需的。已知这种“调节型”胞吐作用由SNARE (可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)蛋白介导[Ann. Rev. Cell Dev. Biol. vol 16, 19-49 (2000)]。在神经元胞吐作用中涉及3种SNARE蛋白，即囊泡相关膜蛋白(VAMP2，也称为小突触囊泡蛋白)，一种位于囊泡膜中的单通道跨膜蛋白(v-SNARE)；25 kDa的突触小体相关蛋白(SNAP25)；和突触融合蛋白1A，一种位于神经元质膜中的单跨膜蛋白(t-SNARE)。突触融合蛋白1A和VAMP2具有C-末端跨膜结构域，用于分别锚定到囊泡和神经元质膜中。通过与蛋白质中的几个半胱氨酸残基共价连接的棕榈酰基促进SNAP25的膜锚定[Am. J. Physiol. Cell Physiol.vol 285, C237-249 (2003)]。
神经元轴突电位激活电压门控钙通道并增加轴突内的钙离子浓度，其通过钙离子与突触结合蛋白的复合来拉下突触前膜附近的突触囊泡。然后如图2A中示意性说明的，辅助突触囊泡膜与轴突质膜的融合。突触融合蛋白、SNAP25和小突触囊泡蛋白的三元复合物的形成驱使两个膜紧密靠近地定向，并然后经历膜融合，以将乙酰胆碱颗粒释放到突触间隙中[Toxins vol 2, 24-53 (2010)]。因此，SNARE蛋白的三元复合物形成为参与神经递质释放的膜融合的必需要素。
肉毒毒素A：肉毒毒素(BTX)为由细菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素。毒素的活性形式为单个多肽链(150 kDa)，其由以二硫键彼此拴系的重链(100kDa)和轻链(50 kDa)组成。已知BTX易于被摄入神经元细胞中，切割SNARE蛋白，阻断乙酰胆碱的释放，并且结果剥夺神经元细胞作为神经元细胞的必需特征。暴露于BTX的神经元细胞未能触发相邻肌纤维的收缩。
进入神经元细胞后，BTX被切割成两部分，即轻链和重链。轻链为锌金属蛋白酶，负责作为神经毒素的作用。BTX亚型A、C和E切割SNAP25。与此同时，亚型B、D、F和G降解VAMP，和亚型C水解突触融合蛋白[Nature, vol 365, 160-163 (1993)]。
肉毒毒素A的美容用途：肉毒毒素A最初由Allergan开发用于美容用途，主要用于治疗面部皱纹。Botox®为由Allergan注册的著名品牌名称，并且在公共社区中经常被视为与BTX同义。
鉴于其生理活性，BTX A原则上可用于治疗许多涉及肌肉收缩过度活跃或者头颈部、眼睑、四肢、颌和声带痉挛的障碍。另外，BTX可用于治疗过度分泌性障碍，包括多涎和多汗症[Indian J. Dermatol. vol 55, 8-14 (2010)]。
Botox®注射剂于2002年被美国FDA批准用于治疗面部皱纹，并且如果由熟练的皮肤科医生正确实施，则认为是安全的。然而，BTX因其毒性而众所周知。例如，如果以1.3~2.1ng/kg静脉内注射，则估计A和B型BTX对人类是致命的[Indian J. Dermatol. vol 55, 8-14 (2010)]。仍然担忧BTX用于美容用途的安全性。面神经麻痹、肌肉无力和吞咽困难为在给予肌内BTX注射的受试者中观察到的最常见的不良事件。由于给药过量或局部肌内注射的技能差导致的全身暴露引起更严重的副作用，包括头痛、流感样综合征和过敏反应。已知重复注射BTX诱导抗原反应，这限制BTX的美容用途。来自治疗用途的副作用可能比美容用途更严重，并且可能包括心律失常、心脏病发作、癫痫发作、呼吸停止和死亡[J. Am. Acad. Dermatol. vol 53, 407-415 (2005)]。
为了最小化接受BTX注射用于美容用途的受试者的副作用，将非常优选的是局部化或局部传递BTX代替肌内局部注射的常规途径。BTX为150K大小的大分子。将BTX局部传递到真皮下的肌肉层深处而不依赖于侵入性制剂仍然是一个极大的挑战。
阿基瑞林：阿基瑞林为一种衍生自SNAP25蛋白的N-末端的合成六肽。阿基瑞林作为面部皱纹的美容产品销售。据称该六肽可拮抗含SNAP25蛋白的SNARE复合物的形成。该六肽模拟BTX的功能，并且可用于在局部给予后减少面部皱纹。据报道，阿基瑞林可在局部使用后减少人类受试者的面部皱纹[Am. J. Clin. Dermatol. vol 14(2), 147-153(2013)]。
前mRNA：遗传信息在DNA (2-脱氧核糖核酸)上携带。DNA被转录以在细胞核中产生前mRNA (前信使核糖核酸)。哺乳动物前mRNA通常由外显子和内含子组成，并且外显子和内含子彼此相互连接，如以下示意性地提供的那样。外显子和内含子编号如图2B中示意性地说明的那样。
前mRNA的剪接：在通过一系列复杂反应(统称为“剪接”)缺失内含子后，将前mRNA加工成mRNA，如图3A中示意性地概述的那样[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336(2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]。剪接通过在前mRNA和剪接衔接因子之间形成“剪接体E复合物”(即早期剪接体复合物)来引发。在“剪接体E复合物”中，U1与外显子N和内含子N的连接处结合，和U2AF35与内含子N和外显子(N + 1)的连接处结合。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接处对于早期剪接体复合物的形成至关重要。“剪接体E复合物”在与U2另外复合时演变成“剪接体A复合物”。“剪接体A复合物”经历一系列复杂反应，以缺失或剪除内含子以邻接相邻的外显子。
核糖体蛋白质合成：蛋白质由DNA (2-脱氧核糖核酸)编码。响应于细胞刺激或自发地，DNA被转录以在细胞核中产生前mRNA (前信使核糖核酸)。将前mRNA的内含子酶促剪除以产生mRNA (信使核糖核酸)，然后将其易位至细胞质。在细胞质中，称为核糖体的翻译机器的复合物与mRNA结合，并在其扫描沿mRNA编码的遗传信息时进行蛋白质合成[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668(1988)]。
反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)与核酸(包括DNA、mRNA和前mRNA)结合的寡核苷酸称为反义寡核苷酸(ASO)。
例如，如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，则ASO可能够抑制沿mRNA的核糖体蛋白质合成。ASO需要存在于细胞质内以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白质合成。
如果ASO与细胞核中的前mRNA紧密结合，则ASO可能够抑制或调节前mRNA剪接成mRNA。ASO需要存在于细胞核内以抑制或调节前mRNA剪接成mRNA。剪接的这种反义抑制产生缺少由ASO靶向的外显子的一种或多种mRNA。这种mRNA称为“剪接变体”，并且其编码的蛋白质短于由全长mRNA编码的蛋白质。
原则上，剪接可通过抑制“剪接体E复合物”的形成来中断。如果ASO与(5'→3')外显子-内含子的连接处，即“5'剪接位点”紧密结合，则ASO阻断前mRNA和因子U1之间的复合物形成，并因此阻断“剪接体E复合物”的形成。同样地，如果ASO与(5'→3')内含子-外显子的连接处，即“3'剪接位点”紧密结合，则“剪接体E复合物”不能形成。3'剪接位点和5'剪接位点在图3B中示意性地说明。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易受经内源性核酸酶降解的影响，限制了其治疗效用。迄今为止，已深入开发和研究了许多类型的非天然(即非天然存在的)寡核苷酸[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。与DNA和RNA相比较，其中一些显示出延长的代谢稳定性。图4A中提供一些代表性非天然寡核苷酸的化学结构。这种寡核苷酸与DNA或RNA一样可预测地与互补核酸结合。
硫代磷酸寡核苷酸：硫代磷酸寡核苷酸(PTO)为DNA类似物，其中每个单体的骨架磷酸氧原子之一被硫原子替代。这种小的结构变化使得PTO相对抵抗内源性核酸酶的降解[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)]。
反映了PTO和DNA骨架的结构相似性，它们在大多数哺乳动物细胞类型中均穿透细胞膜差。然而，对于大量表达DNA转运蛋白的一些类型的细胞，DNA和PTO显示出良好的细胞穿透性。已知全身给予的PTO易于分布到肝脏和肾脏[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]。
为了促进PTO的体外细胞穿透，已普遍使用脂质转染。然而，脂质转染在物理上改变细胞膜，引发细胞毒性，并因此对长期体内治疗使用是不理想的。
在过去的30年中，反义PTO和PTO的变体已被临床评估用于治疗癌症、免疫障碍、代谢疾病等[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。许多这种反义药物候选物尚未成功开发，部分是由于PTO的细胞渗透性差造成的。为了克服细胞渗透性差，PTO需要以高剂量给予用于获得治疗活性。然而，已知PTO显示出剂量限制性毒性，包括凝血时间增加、补体激活、肾小管肾病、库普弗细胞活化和免疫刺激，包括脾肿大、淋巴样增生、单核细胞浸润[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。
已发现许多反义PTO对于具有来自肝脏或肾脏的显著贡献的疾病显示出临床活性。米泊美生为PTO类似物，其抑制apoB-100的合成，apoB-100为参与LDL胆固醇转运的蛋白质。米泊美生在动脉粥样硬化患者群体中显示出临床活性，最有可能是由于其优先分布于肝脏造成的[Circulationvol 118(7), 743-753 (2008)]。ISIS-113715为抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)的合成的PTO反义类似物，并且发现在II型糖尿病患者中显示出治疗活性[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)]。
锁定核酸：在锁定核酸(LNA)中，RNA的骨架核糖环在结构上被限制以增加对RNA或DNA的结合亲和力。因此，LNA可认为是高亲和力DNA或RNA类似物[Biochemistry vol 45,7347-7355 (2006)]。
二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸：在二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO)中，DNA的骨架磷酸酯和2-脱氧核糖分别被氨基磷酸酯和吗啉替代[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol71, 575-586 (2006)]。尽管DNA骨架荷负电，但PMO骨架不荷电。因此，PMO和RNA之间的结合在骨架之间没有静电排斥，并且往往比DNA和RNA之间的结合更强。由于PMO在结构上与DNA非常不同，因此PMO不会被识别DNA或RNA的肝转运蛋白识别。然而，PMO不易于穿透细胞膜。
肽核酸：肽核酸(PNA)为以N-(2-氨基乙基)甘氨酸为单元骨架的多肽，并且由Nielsen博士及同事发现[Science vol 254, 1497-1500 (1991)]。PNA的化学结构和缩写命名如图4B所示。如同DNA和RNA一样，PNA也选择性地与互补核酸结合[Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]。在与互补核酸结合时，PNA的N-末端被认为等同于DNA或RNA的“5'-末端”，和PNA的C-末端被认为等同于DNA或RNA的“3'-末端”。
如同PMO一样，PNA骨架不荷电。因此，PNA和RNA之间的结合往往比DNA和RNA之间的结合更强。由于PNA在化学结构上与DNA显著不同，因此PNA不会被识别DNA的肝转运蛋白识别，并且显示出与DNA或PTO不同的组织分布概况。然而，PNA的哺乳动物细胞膜穿透性也差(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003)。
改善PNA的膜渗透性的修饰的核碱基：通过用与修饰的核碱基共价连接的阳离子脂质或其等同物引入修饰的核碱基(即碱基)，使PNA对哺乳动物细胞膜高度可渗透，如图4C举例说明的那样。发现胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的这种修饰的核碱基分别可预测地和互补地与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶杂交[PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607;US8680253]。
将这种修饰的核碱基掺入PNA上模拟脂质转染的情况。通过脂质转染，具有磷酸骨架的寡核苷酸分子被阳离子脂质分子比如lipofectamine包裹，并且与裸寡核苷酸分子相比较，这种lipofectamine/寡核苷酸复合物往往相当易于穿透细胞膜。
除良好的膜渗透性之外，发现那些PNA衍生物对互补核酸具有超强亲和力。例如，在与互补DNA形成双链体时，将4-5个修饰的核碱基引入到11-13聚体PNA衍生物上易于产生20℃或更高的Tm增加。这种PNA衍生物对单碱基错配高度敏感。单碱基错配导致Tm降低11-22℃，这取决于修饰的碱基的类型以及PNA序列。
小干扰RNA (siRNA)：小干扰RNA (siRNA)是指20-25个碱基对的双链RNA[Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]。siRNA的反义链以某种方式与蛋白质相互作用以形成“RNA诱导沉默复合物”(RISC)。然后RISC结合于与siRNA的反义链互补的mRNA的某一部分。与RISC复合的mRNA经历切割，以产生双链siRNA的另一拷贝。因此，siRNA催化诱导其靶mRNA的切割，并因此抑制通过mRNA的蛋白质表达。RISC并不总是与其靶mRNA内的完全互补序列结合，这引发对siRNA疗法中脱靶效应的担忧。如同具有DNA或RNA骨架的其他类别寡核苷酸一样，siRNA具有差的细胞渗透性，并因此往往显示出体外或体内治疗活性差，除非经适当配制或化学修饰以显示出良好的膜渗透性。
SNAP25 ASO和siRNA：SNAP25 ASO和siRNA主要作为生物学工具进行评估，以更好地理解SNAP25蛋白在神经元细胞中的生理作用[Nature vol 364, 445-448 (1993); Eur. J. Neurosci.vol 20(6), 1593-1603 (2004); EMBO Reports vol 14(7) 645-651(2013); J. Biol. Chem.vol 281(38), 28174-28184 (2006)]。下调SNAP25蛋白活性的寡核苷酸尚未被研究用于局部使用以安全地模拟BTX的有益治疗活性。应该注意的是，透皮传递一直是寡核苷酸领域的巨大技术挑战。
附图简述
图1A. 在两个相邻神经元细胞之间的突触接头处发生的胞吐作用过程的示意图。
图1B. 在神经元轴突和肌细胞之间的神经肌肉接头处发生的胞吐作用过程的示意图。
图2A. 突触囊泡膜与轴突质膜融合的示意图。
图2B. 前mRNA内的外显子和内含子编号的示意图。
图3A. 导致内含子N的缺失的剪接过程的示意图。
图3B. 与剪接体E复合物相关的3'剪接位点和5'剪接位点的示意图。
图4A. DNA和非天然核酸的代表性化学结构。
图4B. PNA的化学结构和缩写命名的图示。
图4C. 用于改善肽核酸的细胞渗透性的修饰的核碱基的实例。
图5. 对式I的肽核酸衍生物可选择的天然或非天然(修饰的)核碱基的实例。
图6A. 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代或未取代的烷基的实例。
图6B. 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基的实例。
图6C. 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基的实例。
图6D. 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基的实例。
图6E. 对式I的肽核酸衍生物可选择的取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基和取代或未取代的烷氧基硫代羰基的实例。
图7. 缩写为A (腺嘌呤)、G (鸟嘌呤)、T (胸腺嘧啶)、C (胞嘧啶)、C (pOq)、A(p)、A (pOq)、G (p)和G (pOq)的PNA单体的化学结构。
图8. 用于描述PNA的N-末端或C-末端的取代基的缩写的化学结构。
图9. 缩写为"(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2"的14聚体PNA衍生物的化学结构。
图10. 缩写为"(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2"的15聚体PNA衍生物的化学结构。
图11. 用于合成本发明PNA衍生物的示例性Fmoc-PNA单体的化学结构。
图12. 用于本发明的SPPS的典型单体延伸循环的示意图。
图13A. HPLC纯化之前“ASO 1”的C18-反相HPLC色谱图。
图13B. HPLC纯化之后“ASO 1”的C18-反相HPLC色谱图。
图14. HPLC纯化之后用“ASO 1”获得的ES-TOF质谱数据。
图15A. 用0 (阴性对照)、10、100或1000 zM “ASO 3”处理的PC12细胞中的巢式PCR产物的电泳分析数据(上图)，以及图解说明全长mRNA和具有外显子跳跃的剪接变体mRNA的PCR产物的扩增子大小的图表(下图)。
图15B. 指定给外显子5-7的跳跃的PCR产物的Sanger测序数据。
图16A. 用0 (阴性对照)、10、100或1000 zM的“ASO 3”处理的PC12细胞中全长SNAP25 mRNA水平的变化(误差棒指示标准误差)。
图16B. 用0 (阴性对照)、10、100或1000 zM的“ASO 1”处理的PC12细胞中全长SNAP25 mRNA水平的变化(误差棒指示标准误差)。
图17A. 在用0 zM (阴性对照)、1 zM、10 zM、30 zM、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM或10 aM的“ASO 3”处理48小时的PC12细胞中的SNAP25蛋白质印迹数据(上图)和针对β-肌动蛋白标准化的相对SNAP25表达水平(下图)。
图17B. 用0 (阴性对照)、100或1000 zM的“ASO 1”处理48小时或72小时的PC12细胞中的SNAP25蛋白质印迹数据。
图18. 局部给予0 (阴性对照)、1、10和100 fM的“ASO 1” BID持续4天的小鼠的皮肤样品的SNAP25 IHC图像。
图19A. 在用0 zM (阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM、1 aM、10 aM或100 aM的“ASO3”处理48小时的SiMa细胞中的SNAP25蛋白质印迹数据(上图)和针对β-肌动蛋白标准化的相对SNAP25表达水平(下图)。
图19B. 用0 zM (阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM、1 aM、10 aM或100 aM的“ASO3”处理的SiMa细胞中全长SNAP25 mRNA水平的变化(误差棒指示标准误差)。
发明概述
本发明提供由以下式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
式I
其中，
n为10-25之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前RNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或者取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自非天然核碱基，其具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基。
式I的化合物诱导人类SNAP25前mRNA中“外显子7”的跳跃，产生缺少“外显子7”的人类SNAP25 mRNA剪接变体，并因此可用于抑制转录人类SNAP25前mRNA的基因的功能活性。
发明描述
本发明提供由以下式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
式I
其中，
n为10-25之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或者取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自非天然核碱基，其具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基。
式I的化合物诱导人类SNAP25前mRNA中“外显子7”的跳跃，产生缺少“外显子7”的人类SNAP25 mRNA剪接变体，并因此可用于抑制转录人类SNAP25前mRNA的基因的功能活性。
用于描述式I化合物的“n为10-25之间的整数”的条件字面上表明n为可选自整数11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的整数。
式I的化合物与从人类SNAP25基因[从NCBI参考序列：NG_029626.1获得]读取的人类SNAP25前mRNA的“外显子7”的3'剪接位点互补结合。跨越人类SNAP25前mRNA中“内含子6”和“外显子7”的连接处的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体序列为由来自“内含子6”的7聚体和来自“外显子7”的7聚体组成的3'剪接位点。因此，14聚体前mRNA序列可常规表示为[(5'→3') aucccag┃GGUAACA]，其中内含子和外显子序列分别用“小写”和“大写”字母表示，并且内含子-外显子连接处用“┃”标记。前mRNA的常规表示通过跨越人类SNAP25前mRNA中“内含子6”和“外显子7”的连接处的[(5'→3') cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]的30聚体序列进一步说明。外显子编号可根据所报道的SNAP25 mRNA转录物而变化。提供30聚体SNAP25序列是为了明确鉴定式I化合物的靶剪接位点，而不管SNAP25 mRNA的外显子编号如何。
式I的PNA衍生物中天然(即天然存在的)或非天然(即非天然存在的)核碱基的化学结构在图5中举例说明。本发明的天然或非天然核碱基包括(但不限于)图5中提供的核碱基。提供这种天然和非天然核碱基是为了说明可允许的核碱基多样性，并因此不应解释为限制本发明的范围。
用于描述式I的PNA衍生物的取代基在图6A-E中举例说明。图6A提供取代或未取代的烷基的实例。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基在图6B中举例说明。图6C说明取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基的实例。图6D提供取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基的实例。在图6E中，提供取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基和取代或未取代的烷氧基硫代羰基的实例。提供这种取代基作为实例是为了说明可允许的取代基多样性，并因此不应解释为限制本发明的范围。本领域的技术人员可易于发现，寡核苷酸序列超过N-末端或C-末端取代基，为寡核苷酸与靶前mRNA序列的序列特异性结合的最重要因素。
如现有技术[PCT/KR2009/001256]中举例说明的那样，式I的化合物与互补DNA紧密结合。式I的PNA衍生物与其全长互补DNA或RNA之间的双链体具有太高的Tm值而不能在水性缓冲液中可靠地测定。式I的PNA化合物与较短长度的互补DNA产生高Tm值。
式I化合物与从人类SNAP25基因转录的人类SNAP25前mRNA的靶3'剪接位点紧密结合，并干扰涉及所述化合物的靶外显子的“剪接体早期复合物”的形成。由于本发明的化合物在空间上抑制“剪接体早期复合物”的形成，因此SNAP25“外显子7”被剪除，产生缺少“外显子7”的SNAP25 mRNA剪接变体。因此，本发明的化合物诱导SNAP25“外显子7”的跳跃。
由于所述化合物对互补前mRNA序列的强亲和力，本发明的化合物还可与具有1或2个错配的部分互补的前mRNA序列紧密结合，并诱导SNAP25前mRNA内的靶外显子的跳跃。
式I的化合物具有良好的细胞渗透性，并且可作为“裸”寡核苷酸易于传递到细胞中，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中举例说明的那样。因此，本发明的化合物诱导SNAP25前mRNA中“外显子7”的跳跃，以在用作为“裸”寡核苷酸的式I化合物处理的细胞中产生缺少SNAP25 “外显子7”的SNAP25 mRNA剪接变体。式I的化合物不需要任何用于传递到细胞中以有效诱导细胞中靶外显子的跳跃的手段或制剂。式I的化合物易于诱导用亚飞摩尔浓度的作为“裸”寡核苷酸的本发明化合物处理的细胞中SNAP25“外显子7”的跳跃。
由于良好的细胞或膜渗透性，式I的PNA衍生物可作为“裸”寡核苷酸局部给予，以诱导目标皮肤中SNAP25“外显子7”的跳跃。所述化合物不需要制剂来增加向目标组织的透皮传递以获得预期的治疗或生物活性。通常使式I化合物溶于水和共溶剂中，并以亚皮摩尔浓度局部或透皮给予，以在皮肤给予部位周围引发期望的治疗或生物活性。本发明的化合物不需要大量或侵入性地配制以引发局部治疗活性。
式I的化合物可与药学上可接受的酸或碱组合使用，酸或碱包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。
式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的辅剂组合给予受试者，辅剂包括(但不限于)柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。
本发明的化合物可以1 aM (即10-18 M)-高于1 nM范围内的治疗或生物有效浓度局部给予受试者，这将根据给药方案、受试者的病症或情况等而变化。
优选的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为10-25之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代、氢代、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或者取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由以下式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
式II　 　　　　　式III 　　　　　　　式IV
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3为由以下式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
式V
其中，
Q1和Qm为取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)和取代或未取代的氨基[-N(H)-或-N(取代基)-]；和
m为1-15之间的整数。
用于描述式V的“m为1-15之间的整数”的条件字面上表明m为可选自整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的整数。
令人感兴趣的为式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-21之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为取代或未取代的亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧和氨基；和
m为1-11之间的整数。
特别感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基、氧和氨基；和
m为1-9之间的整数。
高度感兴趣的为式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5为氢代，和R2、R4和R6独立地表示氢代或者取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基团；和
m为1-8之间的整数。
更高度感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和
m为1-8之间的整数。
最高度感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X为氢代；
Y表示取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接连接于碱性氨基；和
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接连接于碱性氨基。
特别感兴趣的为式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐，所述PNA衍生物选自以下提供的化合物：
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)T-Lys-NH2；
(N→C) H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH2；
(N→C)苯甲酰基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH2；
(N→C)苯甲酰基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正己酰基-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) [N-(2-苯乙基)氨基]羰基-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-Arg-NH2；
(N→C) n-苯甲酰基-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) N-Me-N-苯基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)对甲苯磺酰基-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-Lys-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C)苯磺酰基-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C)苯基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2；
(N→C) Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2；
(N→C)苄基-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2；
(N→C) Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)A-NH2；
(N→C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2；
(N→C) Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；和
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2：
其中，
A、G、T和C为分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)为分别具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体；
式VI 　　　　　　　式VII 　　　　　　　　式VIII
式IX 　　　　　　　　　　式X
其中，
p和q为整数；和
N-和C-末端取代基的缩写具体定义如下：“Fmoc-”为“[(9-芴基)甲氧基]羰基-”的缩写；“Fethoc-”代表“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”；“Ac-”代表“乙酰基-”；“苯甲酰基-”代表“苯羰基-”；“Piv-”代表“新戊酰-”；“正丙基-”代表“1-(正丙基)-”；“H-”代表“氢代-”基团；“对甲苯磺酰基”代表“(4-甲基苯)-1-磺酰基-”；“-Lys-”代表氨基酸残基“赖氨酸”；“-Val-”代表氨基酸残基“缬氨酸”；“-Leu-”代表氨基酸残基“亮氨酸”；“-Arg-”代表氨基酸残基“精氨酸”；“-Gly-”代表氨基酸残基“甘氨酸”；“[N-(2-苯乙基)氨基]羰基-”代表“[N-1-(2-苯乙基)氨基]羰基-”；“苄基-”代表“1-(苯基)甲基-”；“苯基-”代表“phenyl-”；“Me-”代表“甲基-”；“-HEX-”代表“6-氨基-1-己酰基-”；“FAM-”代表“5或6-荧光素-羰基-(异构体混合物)”；和“-NH2”代表未取代的“-氨基”。
图7共同提供缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。如现有技术[PCT/KR2009/001256]讨论的那样，C(pOq)被认为是对应于“胞嘧啶”的修饰的PNA单体，因为其优选杂交于“鸟嘌呤”。A(p)和A(pOq)被视为作为“腺嘌呤”起作用的修饰的PNA单体，因为其对“胸腺嘧啶”具有紧密亲和力。同样地，G(p)和G(pOq)被认为是等同于“鸟嘌呤”的修饰的PNA单体，因为其与“胞嘧啶”产生碱基配对。
图8明确提供用于在本发明的式I的PNA衍生物的N-末端或C-末端引入多样性的取代基的各种缩写的化学结构。
为了说明用于这种PNA衍生物的缩写，缩写为“(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2”的14聚体PNA衍生物的化学结构提供在图9中。作为另一个图示，缩写为“(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2”的15聚体PNA衍生物的化学结构提供在图10中。
“(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2”的16聚体PNA序列等同于“(5'→3') ATT-TGT-TAC-CCT-GGG-A”的DNA序列，用于与前mRNA互补结合。该16聚体PNA与人类SNAP25前mRNA具有16聚体互补重叠，如在跨越人类SNAP25前mRNA内的“内含子6”和“外显子7”的连接处的[(5'→3') cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]的30聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”。
“(N→C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2”的14聚体PNA序列等同于“(5'→3') TAC-CCT-GGG-ATC-CA”的DNA序列，用于与前mRNA互补结合。该14聚体PNA与人类SNAP25前mRNA具有14聚体互补重叠，如在[(5'→3') cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]的30聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”。
“(N→C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2”的16聚体PNA序列等同于“(5'→3') ATC-TGT-TAC-CCT-GGG-A”的DNA序列，用于与前mRNA互补结合。该16聚体PNA与该16聚体序列具有15聚体互补重叠，如在[(5'→3') cucuuuggaucccag┃GGUAACA"A"AUGAUGC]的30聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”，其中单一错配用引号符号(" ")标记。该16聚体PNA与SNAP25“外显子7”的3'剪接位点部分互补，与“外显子7”具有单一错配。
发明详述
用于制备PNA寡聚体的一般程序
根据现有技术[US6133444; WO96/40685]公开的方法，如果需要的话具有微小修改，通过基于Fmoc化学的固相肽合成(SPPS)来合成PNA寡聚体。用于该研究的固体载体为购自PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)的H-Rink Amide-ChemMatrix。具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体如现有技术[PCT/KR 2009/001256]所述或具有微小修改来合成。这种具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体和具有天然核碱基的Fmoc-PNA单体用于合成本发明的PNA衍生物。具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体在图11中提供。然而，对于本领域技术人员而言，对于这种PNA单体上的保护基团，显然可能存在许多微小的变化。因此，图11中的Fmoc-PNA单体应视为实例，并因此不应视为限制本发明的范围。PNA寡聚体通过C18-反相HPLC(水/乙腈或水/甲醇，含0.1% TFA)纯化，并通过质谱法(包括ESI/TOF/MS)表征。
图12示意性地说明用于本研究的SPPS的典型单体延伸循环，并且合成细节提供如下。然而，对于本领域技术人员而言，在自动肽合成仪或手动肽合成仪上有效地运行这种SPPS反应显然可能存在许多微小变化。每个反应步骤简要提供如下。
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化]将在1.5 mL 20%哌啶/DMF中的0.01 mmol (约20 mg树脂) ChemMatrix树脂在libra管中涡旋20分钟，并滤掉DeFmoc溶液。将树脂用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5 mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。使固体载体上生成的游离胺经受与Fmoc-PNA单体或与Fmoc保护的氨基酸衍生物偶联。
[DeFmoc]将树脂在1.5 mL 20%哌啶/DMF中涡旋7分钟，并滤掉DeFmoc溶液。将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。使固体载体上生成的游离胺立即经受与Fmoc-PNA单体偶联。
[与Fmoc-PNA单体偶联]使固体载体上的游离胺与Fmoc-PNA单体如下进行偶联。将0.04 mmol Fmoc-PNA单体、0.05 mmol HBTU [2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐]和10 mmol DIEA (N,N-二异丙基乙胺)在1 mL无水DMF中温育2分钟，并加入到含游离胺的树脂中。将树脂溶液涡旋1小时，并滤掉反应介质。然后将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。
[封端]偶联反应后，通过在1.5 mL封端溶液(5%乙酸酐和6% 2,6-二甲基吡啶，在DMF中)中振荡5分钟，使未反应的游离胺封端。然后滤掉封端溶液，并用1.5 mL MC、1.5 mLDMF和1.5 mL MC连续各自洗涤30秒。
[N-末端“Fethoc-”基团的引入]通过在通常的碱性偶联条件下使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，将“Fethoc-”基团引入到N-末端。“Fethoc-OSu”[CAS号179337-69-0，C20H17NO5，MW 351.36]的化学结构提供如下。
[从树脂裂解]通过在1.5 mL裂解溶液(2.5%三异丙基硅烷和2.5%水，在三氟乙酸中)中振荡3小时，从树脂上裂解结合于树脂的PNA寡聚体。滤掉树脂，并减压浓缩滤液。生成的残余物用乙醚研磨，并经过滤收集生成的沉淀，用于通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化]从树脂裂解后，通过C18-反相HPLC纯化PNA衍生物的粗品产物，用含有0.1% TFA的水/乙腈或水/甲醇(梯度法)洗脱。图13A和13B分别为HPLC纯化前后“ASO1”的示例性HPLC色谱图。“ASO 1”的寡聚体序列如表1中所提供。
式I的PNA衍生物的合成实例
为了互补地靶向人类SNAP25前mRNA中“外显子7”的3'剪接位点，根据以上提供的合成程序或具有微小修改，制备本发明的PNA衍生物。提供靶向人类SNAP25前mRNA的这种PNA衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，并且不应解释为限制本发明的范围。
表1提供互补靶向人类SNAP25前mRNA中“外显子7”的3'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱法的结构表征数据。表1中提供SNAP25 ASO是为了举例说明式I的PNA衍生物，并且不应解释为限制本发明的范围。
表1. 互补靶向跨越人类SNAP25前mRNA中“内含子6”和“外显子7”的连接处的3'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论准确质量，b) 观测准确质量
图13A为用“ASO 1”的粗品产物获得的HPLC色谱图。粗品产物通过C18-RP制备型HPLC纯化。图13B为“ASO 1”的纯化产物的HPLC色谱图。“ASO 1”的纯度在制备型HPLC纯化后显著提高。图14提供用“ASO 1”的纯化产物获得的ESI-TOF质谱。提供“ASO 1”的分析数据是为了说明式I的PNA衍生物如何在本发明中纯化和鉴定，并且不应解释为限制本发明的范围。
模型PNA衍生物与互补DNA的结合亲和力
评估表1中的PNA衍生物对互补靶向N-末端或C-末端的10聚体DNA的结合亲和力。通过PNA和10聚体互补DNA之间双链体的Tm值评价结合亲和力。表1中的PNA衍生物与完全互补DNA之间的双链体显示出Tm值太高而不能在水性缓冲溶液中可靠地测定，因为缓冲溶液在Tm测量期间往往煮沸。
Tm值如下在UV/Vis分光计上进行测定。将4 μM PNA寡聚体和4 μM互补10聚体DNA在4 mL水性缓冲液(pH 7.16, 10 mM磷酸钠, 100 mM NaCl)中的混合溶液在15 mL聚丙烯falcon管中于90℃下温育1分钟，并缓慢冷却至环境温度。然后将溶液转移至配备有气密盖的3 mL石英UV比色皿中，并如现有技术[PCT/KR2009/001256]所述或具有微小修改，在UV/可见光分光光度计上经受Tm测量(260 nm)。用于Tm测量的10聚体互补DNA购自Bioneer(www.bioneer.com, Dajeon, Republic of Korea)并且无需进一步纯化而使用。
对于与10聚体DNA的互补结合，观察到的式I的PNA衍生物的Tm值非常高，并且在表2中提供为未校正的。例如，“ASO 3”显示出与10聚体互补DNA的双链体的Tm值为77.3℃，所述10聚体互补DNA靶向PNA中的N-末端10聚体，其在[(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C (1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2]中标为“粗体”和“下划线”。与此同时，“ASO 3”显示出与10聚体互补DNA的双链体的Tm为88.7℃，所述10聚体互补DNA靶向PNA中的C-末端10聚体，其在[(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2]中标为“粗体”和“下划线”。
表2. 表中的PNA和靶向PNA的N-末端或C-末端的10聚体互补DNA之间的Tm值。
式I的PNA衍生物的生物学活性的实例
评估表1中详列的式I的PNA衍生物在大鼠来源的PC12细胞和人类来源的SiMa细胞中的SNAP25反义活性，以及其在局部给予后在C57BL/6小鼠皮肤中抑制SNAP25表达的能力。作为实例提供生物学实施例，以说明式I的PNA衍生物的反义活性，并因此不应解释为将本发明的范围限制于表1中列出的化合物。
实施例1. “ASO 3”诱导的外显子跳跃
指定的“ASO 3”为14聚体ASO，其与跨越人类SNAP25前mRNA内“内含子6”和“外显子7”的连接处的3'剪接位点中的14聚体序列完全互补。“ASO 3”与如在[(5'→3')cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]的30聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”的14聚体前mRNA序列互补重叠。“ASO 3”与“内含子6”具有7聚体重叠，和与“外显子7”具有另一个7聚体重叠。
与此同时，14聚体ASO与从大鼠基因组DNA[从NCBI参考序列：NC_005012获得]读取的大鼠SNAP25前mRNA具有如在[(5'→3') ugg"c"ucccag┃GGUAACAAACGAUGC]的25聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”的13聚体互补重叠，其中单一错配用引号(" ")符号标记。
如下所述评估“ASO 3”在PC12细胞(目录号CRL-1721, ATCC)中诱导外显子跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理]将PC12细胞于5% CO2气氛和37℃下维持在补充有5% FBS、10%马血清、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中。在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的细胞用0 (阴性对照)、10、100或1000 zM的“ASO 3”处理。
[RNA提取和通过一步法PCR的cDNA合成]在与“ASO 3”一起温育42小时后，将细胞用100 μg/mL环己酰亚胺再处理6小时，以冻结核糖体翻译。然后根据制造商的说明书，使用“通用型RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。使用Super Script®一步法RT-PCR试剂盒和Platinum®Taq聚合酶(目录号10928-042, Invitrogen)，针对一组外显子特异性引物[外显子1_正向: (5'→3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 和外显子14_反向:AGCATCTTTGTTGCACGTTG]，根据以下循环条件：50℃ 30分钟和94℃ 2分钟，随后40个循环的94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，使200 ng RNA模板经受25 μL逆转录反应。
[巢式PCR扩增]根据以下循环条件：95℃ 2分钟，随后34个循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃ 1分钟，使1 μL cDNA针对[外显子1_正向: (5'→3') ATGGCCGAGGACGCAGACA;外显子14n_反向: (5'→3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT]的一组外显子特异性引物经受20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)。
[外显子跳跃产物的鉴定]使PCR产物在2%琼脂糖凝胶上经受电泳分离。收集目标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图15A提供PCR产物的电泳数据，其中10 zM ASO处理样品产生可指定给外显子5-7的跳跃的微弱PCR条带。即使用环己酰亚胺处理细胞以通过冻结核糖体翻译使全长mRNA不稳定，也仅微弱地检测到外显子跳跃条带。因此，与全长mRNA相比较，可指定给外显子5-7的跳跃的SNAP25 mRNA剪接变体很可能在细胞中显示出代谢稳定性差。将外显子跳跃PCR产物测序为外显子5-7的跳跃，如图15B所示。由于不管ASO浓度如何均观察到指定给外显子6的跳跃的PCR产物，因此认为外显子6的跳跃为自发发生的。
在用10zM“ASO 3”处理的细胞中，全长SNAP25 mRNA的强度降低最多。随着ASO浓度从10增加至1000 zM，全长mRNA强度逐渐增加至阴性对照(即没有ASO处理)的强度。巢式PCR数据中的反转剂量反应模式可能是由于通过在用“ASO 3”的外显子跳跃期间积累的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的转录上调造成的[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
实施例2. 用“ASO 3”处理的PC12细胞中SNAP25 mRNA的qPCR
通过SNAP25巢式qPCR，如下评估“ASO 3”在PC12细胞中诱导大鼠SNAP25 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理]将含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的PC12细胞用0(阴性对照)、10、100或1000 zM的“ASO 3”处理。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取和通过一步法RT-PCR的cDNA合成]在与“SNAP-ASO 3”一起温育42小时后，将细胞用100 μg/mL环己酰亚胺再处理6小时，以冻结核糖体翻译。然后使用“通用型RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)从细胞中提取总RNA，并使用一步法RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对[外显子1_正向: (5'→3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 和外显子14_反向: (5'→3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]的一组外显子特异性引物，根据以下循环条件：50℃ 30分钟和94℃ 2分钟，随后20个循环的94℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，使200 ng RNA模板经受25 μL逆转录反应。
[巢式qPCR扩增]针对[外显子7q_正向: (5'→3') ATGGATGAAAACCTAGAGC; 和外显子8q_反向: (5'→3') CTTCCCAGCA-TCTTTGTT]的一组外显子特异性引物，根据以下循环条件：95℃3分钟，随后40个循环的95℃ 10秒和60℃ 30秒，使1 μL稀释100X的每种cDNA溶液经受20 μL实时PCR反应。用靶向外显子7和外显子8的连接处的[(5'→3') 5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ]的Taqman探针进行qPCR反应，以特异性量化全长SNAP25 mRNA。
图16A提供qPCR数据，其中在用10 zM和100 zM的“ASO 3”处理的细胞中，全长mRNA水平分别显著降低(student t检验)约50%和20%。然而，用1000 zM“ASO 3”处理的细胞中的全长mRNA水平略高于没有ASO处理(即阴性对照)的细胞的水平。qPCR数据的反转剂量反应模式与“实施例1”中所述的外显子跳跃期间观察到的全长mRNA水平的剂量反应模式相当一致，表明转录随着ASO剂量从10增加至1000 zM而上调。
实施例3. 用“ASO 1”处理的PC12细胞中SNAP25 mRNA的qPCR
表1中指定的“ASO 1”为16聚体ASO，其与跨越人类SNAP25前mRNA内的内含子6和外显子7的连接处的3'剪接位点的16聚体序列完全互补。“ASO 1”与如在[(5'→3')cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]的30聚体人类前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”的16聚体靶序列互补重叠。“ASO 1”与内含子6具有6聚体重叠和与外显子7具有10聚体重叠。然而，ASO与如在[(5'→3') uggcucccag┃GGUAACAAA"C"GAUGC]的25聚体前mRNA序列中标为“粗体”和“下划线”的大鼠SNAP25前mRNA具有单一错配，其中单一错配用引号(" ")符号标记。
除非另外说明，否则如“实施例2”中所述，通过SNAP25巢式qPCR评估“ASO 1”诱导PC12细胞中大鼠SNAP25 mRNA水平变化的能力。
图16B提供qPCR数据，其中在用10 zM、100 zM和1000 zM的“SNAP-ASO 1”处理的细胞中，全长mRNA水平分别显著降低(student t检验)约50%、40%和70%。与“ASO 3”的情况一样，当剂量从10增加至100 zM时，用“ASO 1”部分地再现反转剂量反应模式。然而，鉴于全长mRNA水平随着ASO浓度增加至1000 zM而进一步降低，“ASO 1”的外显子跳跃效应似乎强于“ASO 3”的效应。
实施例4. “ASO 3”抑制PC12细胞中SNAP25蛋白的表达
如下评估“ASO 3”抑制PC12细胞中SNAP25蛋白表达的能力。
使PC12细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 zM (阴性对照)、1zM、10 zM，30 zM、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM或10 aM的“ASO 3”处理48小时。在蛋白质印迹分析期间，有4个阴性对照培养皿以补偿潜在的技术假象。
[细胞溶解]然后使细胞经受在冰上用200 μL 1X RIPA缓冲液(目录号9806, CellSignaling Tech)进行细胞溶解，缓冲液补充有1% SDS和1X蛋白酶抑制剂混合物(cOmpleteMini, Roche)。将溶解产物收集在1.5 mL e管中，与100 μL 5X样品缓冲液混合，并煮沸5分钟。
[蛋白质印迹]使溶解产物经受在4-15% TGX-PAGE梯度凝胶(目录号456-1086,Bio-Rad)上进行电泳分离，并然后转移至0.45 μm PVDF膜上。用抗SNAP25抗体(目录号S9684, Sigma)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号A3845, Sigma)探测膜。
图17A提供用PC12细胞溶解产物获得的SNAP25蛋白质印迹数据(上图)以及通过密度测定法相对于β-肌动蛋白标准化的相对SNAP25表达水平(下图)。用“ASO 3”处理的细胞中SNAP25蛋白水平降低10-60%。阴性对照(即0 zM“ASO 3”)的表达水平为4个样品的平均表达水平。
实施例5. “ASO 1”抑制PC12细胞中SNAP25蛋白的表达
除非另外说明，否则如“实施例4”中所述，评估“ASO 1”抑制PC12细胞中SNAP25蛋白表达的能力。将PC12细胞用0 (阴性对照)、100或1000 zM的“ASO 1”处理48小时或72小时。(每个ASO浓度1个培养皿)。
图17B提供48小时(左)和72小时(右) ASO处理的蛋白质印迹数据。在两个时间点，“ASO 1”显著抑制PC12细胞中SNAP25蛋白的表达。
实施例6. 在小鼠中在局部给予“ASO 1”的皮肤中抑制SNAP25蛋白的表达
“ASO 1”与小鼠SNAP25前mRNA中“外显子7”的3'剪接位点完全互补。如下所述评估“ASO1”在局部给予后抑制皮肤中SNAP25蛋白表达的能力。
[剪毛和分组]第0天，用舒泰/甲苯噻嗪麻醉8只雌性C57BL/6小鼠(5周龄)，并用剪刀剪去背部的毛(约3 cm x 4 cm)。将小鼠随机分配至4个组，即无ASO处理组(阴性对照)和1 fM、10 fM和100 fM“ASO 1”的3个处理组(每组2只动物)。
[局部给予]通过将母液水性储备溶液在补充有3% (v/v)甘油的30% (v/v)乙醇水溶液中稀释至0 (阴性对照)、1、10和100 fM“ASO 1”来制备“ASO 1”的局部溶液。在第0-4天期间，使用棉球在剪毛的背部皮肤，每天2次(早晨和傍晚)局部给予每只动物约100 μL局部溶液。
[皮肤取样]第4天的下午，用舒泰/甲苯噻嗪麻醉之后处死动物，以便对用ASO局部处理的皮肤部分进行取样。然后如下所述使皮肤样品经受针对SNAP25蛋白的免疫组织化学(IHC)分析。
[SNAP25 IHC]将皮肤样品冷冻切片并连续用以1:200稀释的一级抗SNAP25抗体(目录号ab41455, Abcam)、用以1:200稀释的二级抗IgG (目录号BA-1100, Vector)并然后用以1:200稀释的Dylight 594-链霉亲和素(目录号SA-5594, Vector, CA, USA)免疫染色，以进行红色荧光标记。抗SNAP25抗体探测SNAP25蛋白的C-末端。在Zeiss玻片扫描仪上捕获IHC图像以评估全长SANP25表达水平的变化。另外进行DAPI染色以局部化真皮微观结构。
图18按组提供一套代表性的SNAP25 IHC图像。在阴性对照组中，全长SNAP25蛋白表达在真皮下的肌肉层中高。肌肉层中的SNAP25蛋白表达认为源自嵌入肌肉层的运动神经元轴突中的SNAP25蛋白表达。在ASO处理组中，肌肉层中的全长SNAP25蛋白表达显著降低。在100 fM“ASO 1”处理组中观察到最显著的降低。皮肤中全长SNAP25蛋白表达的抑制程度远远强于PC12细胞中观察到的程度(参见“实施例5”)。
鉴于BTX已被广泛用于通过注射治疗面部皱纹(用于抗衰老)，抑制真皮下肌肉层中的SNAP25蛋白表达具有药理学和治疗重要性。BTX注射液与某一部分注射液潜在地分布到具有安全性担忧的肌肉组织的风险相关。例如，如果BTX分布到肺平滑肌组织，则受试者处于肺功能不全的高风险中。
SNAP25抑制活性取决于靶组织中的ASO浓度。在局部给予后，ASO浓度在ASO给予的真皮层远端的组织中快速降低。具有安全性担忧的目标组织暴露于足以引发安全性担忧的足够高的浓度的ASO是不可能的。因此，对于安全性以及受试者顺应性，用于局部使用的式I的PNA衍生物具有超过BTX注射液的明显优势。
实施例7. “ASO 3”抑制SiMa细胞中SNAP25蛋白的表达
如下评估“ASO 3”抑制SiMa人类成神经细胞瘤细胞中SNAP25蛋白表达的能力。
[细胞培养和ASO处理]使SiMa细胞(目录号ACC164, DSMZ)于5% CO2气氛和37℃下维持在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中。使SiMa细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 zM (阴性对照)、1 zM-100 aM的“ASO 3”处理48小时。有3个阴性对照培养皿以补偿在蛋白质印迹分析期间潜在的技术假象。
[细胞溶解]使细胞经受在冰上用200 μL 1X RIPA缓冲液(目录号9806, CellSignaling Tech)进行细胞溶解，缓冲液补充有0.1% SDS和1X蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete Mini, Roche)。然后将溶解产物收集在1.5 mL e管中，与100 μL 5X样品缓冲液混合，并煮沸5分钟。
[蛋白质印迹]使溶解产物经受在12% TGX-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移到0.2 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用抗SNAP25抗体(目录号ab41455, Sigma)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号A3845, Sigma)探测膜。
图19A提供用细胞溶解产物获得的SNAP25蛋白质印迹数据(上图)以及通过密度测定法相对于β-肌动蛋白标准化的相对SNAP25表达水平(下图)。阴性对照(即0 zM“ASO 3”)的表达水平为3个样品的平均表达水平。用“ASO 3”处理的细胞中SNAP25蛋白水平降低40-50%。
SNAP25实施例8. 用“ASO 3”处理的SiMa细胞中SNAP25 mRNA的qPCR
通过SNAP25巢式qPCR，如下评估“ASO 3”在SiMa细胞中诱导人类SNAP25 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理]使SiMa细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 zM (阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM或1 aM、10 aM或100 aM的“ASO 3”处理。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取和cDNA合成]根据制造商的说明书，使用“RNeasy Mini Kit”(目录号74106, Qiagen)从细胞中提取总RNA。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(目录号6110B, Takara)，针对随机六聚体，使200 ng RNA模板经受25 μl逆转录反应。
[qPCR扩增]针对[外显子6_正向: (5'→3') GACGAAC-GGGAGCAGATG; 和外显子8_反向(2): (5'→3') ATCTCATTGCCCATATCCAGG]的一组外显子特异性引物，用靶向外显子6和外显子7的连接处的Taqman探针[(5'→3') 56-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ]监测PCR反应。循环条件：95℃ 3分钟，随后40个循环的95℃ 15秒和60℃ 30秒。
图19B提供qPCR数据，其中在用1 zM、100 zM、1 aM和100 aM的“ASO 3”处理的细胞中，全长人类SNAP25 mRNA水平显著降低(student t检验) 20-40%。用100 aM的ASO处理的细胞显示出40%的最强抑制。

Claims (10)

1.一种由以下式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
式I
其中，
n为10-25之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前RNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基[H-C(=O)-]、氨基羰基[NH2-C(=O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或者取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自非天然核碱基，其具有共价连接于核碱基部分的取代或未取代的氨基。
2.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为10-25之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前RNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地表示氘代[D]、氢代[H]、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氢代、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基或者取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢代、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；和
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由以下式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：
式II 　　　　　　　式III 　　　　　　　式IV
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3为由以下式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接于核碱基部分：
式V
其中，
Q1和Qm为取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)和取代或未取代的氨基[-N(H)-或-N(取代基)-]；和
m为1-15之间的整数。
3.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为11-21之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补，或者与人类SNAP25前mRNA部分互补，具有1或2个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为取代或未取代的亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧和氨基；和
m为1-11之间的整数。
4.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的烷基磺酰基或者取代或未取代的芳基磺酰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢代和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基、氧和氨基；和
m为1-9之间的整数。
5.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少4个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5为氢代，和R2、R4和R6独立地表示氢代或者取代或未取代的烷基；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基团；和
m为1-8之间的整数。
6.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X和Y独立地表示氢代、取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代；
Q1和Qm为亚甲基，和Qm直接连接于碱性氨基；
Q2、Q3、......、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；和
m为1-8之间的整数。
7.权利要求1的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n为11-19之间的整数；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA内的[(5'→3') AUCCCAGGGUAACA]的14聚体前mRNA序列具有至少10聚体互补重叠；
式I的化合物与人类SNAP25前mRNA完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn为氢代；
X为氢代；
Y表示取代或未取代的烷基酰基、取代或未取代的芳基酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少5个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6为氢代；
L1表示-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-或-CH2-O-(CH2)5-，其中右端直接连接于碱性氨基；和
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右端直接连接于碱性氨基。
8.权利要求1的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述肽核酸衍生物选自以下提供的肽核酸衍生物：
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)T-Lys-NH2；
(N→C) H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH2；
(N→C)苯甲酰基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH2；
(N→C)苯甲酰基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正己酰基-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) [N-(2-苯乙基)氨基]羰基-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)正丙基-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-Arg-NH2；
(N→C) n-苯甲酰基-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) N-Me-N-苯基-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C)对甲苯磺酰基-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-Lys-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C)苯磺酰基-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C)苯基-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH2；
(N→C) Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2；
(N→C) Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2；
(N→C)苄基-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2；
(N→C) Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH2；
(N→C) Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)A-NH2；
(N→C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2；
(N→C) Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2；
(N→C) Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2；
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2；和
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2：
其中，
A、G、T和C为分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)为分别具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X表示的非天然核碱基的PNA单体；
　　式VI 　　　　　　　式VII 　　　　　　　　　式VIII
式IX 　　　　　　　　　　式X
其中，
p和q为整数；和
N-和C-末端取代基的缩写具体定义如下：“Fmoc-”为“[(9-芴基)甲氧基]羰基-”的缩写；“Fethoc-”代表“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”；“Ac-”代表“乙酰基-”；“苯甲酰基-”代表“苯羰基-”；“Piv-”代表“新戊酰-”；“正丙基-”代表“1-(正丙基)-”；“H-”代表“氢代-”基团；“对甲苯磺酰基”代表“(4-甲基苯)-1-磺酰基-”；“-Lys-”代表氨基酸残基“赖氨酸”；“-Val-”代表氨基酸残基“缬氨酸”；“-Leu-”代表氨基酸残基“亮氨酸”；“-Arg-”代表氨基酸残基“精氨酸”；“-Gly-”代表氨基酸残基“甘氨酸”；“[N-(2-苯乙基)氨基]羰基-”代表“[N-1-(2-苯乙基)氨基]羰基-”；“苄基-”代表“1-(苯基)甲基-”；“苯基-”代表“phenyl-”；“Me-”代表“甲基-”；“-HEX-”代表“6-氨基-1-己酰基-”；“FAM-”代表“5或6-荧光素-羰基-(异构体混合物)”；和“-NH2”代表未取代的“-氨基”。
9.一种通过给予人类受试者权利要求1的肽核酸衍生物治疗涉及人类SNAP25基因表达的疾病或病症的方法。
10.一种通过局部给予人类受试者权利要求1的肽核酸衍生物治疗涉及人类SNAP25基因表达的疾病或病症的方法。
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