KR20190103372A - Scn9a 안티센스 진통제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4의 3' 스플라이스 위치를 표적하는 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다. 펩타이드 핵산 유도체는 세포에서 SCN9A 엑손 4가 결여된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체(들)의 생성을 강하게 유도하며, 통증 또는 Nav1.7 활성과 관련된 질환을 안전하게 치료하는 데 유용하다.
Description
본 발명은 인간 SCN9A의 프리-mRNA를 상보적으로 표적하여 전위차 나트륨 이온 채널 Nav1.7 아형에 유관한 통증 및 장애를 치료하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이며, 그 전체가 참조 문헌으로 인용되는 것인 2017년 1월 24일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/449,738호의 우선권의 이익을 주장한다.
α와 β의 서브유닛으로 구성된 전위차 나트륨 이온 채널은 (Voltage-gated sodium channels, VGSCs) 세포막에 위치하여, 나트륨 이온이 세포막을 투과할 때에 관문 역할을 한다. 나트륨 채널의 활성은 α-서브유닛에 의해 나타나는 데, 따라서 α-서브유닛의 아형에 따라 VGSC의 아형이 결정되며 현재까지 Nav1.1, Nav1.2, …, Nav1.9, 그리고 Nax와 같이 적어도 10 개의 아형이 존재한다.
각각의 VGSC는 뚜렷이 구별되는 별개의 α-서브유닛을 갖고 있으며 어느 조직에서 발현되느냐에 따라서 특유의 생리학적 역할을 한다. 예를 들면 Nav1.2 아형은 중추 신경에서 발현되는 데 뇌전증과 (epilepsy) 유관된 것으로 알려져 있다 [Human Mol. Genet. vol 24(5), 1459-1468 (2015)]. Nav1.5 아형은 심근에서 (cardiomyocyte) 많이 발현되는 데, Nav1.5를 저해하면 QT 시간이 길어져서 갑자기 사망할 수도 있다 [Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137-168 (2014)]. Nav1.7 아형은 척수 신경절에서 (dorsal root ganglia, DRG) 많이 발현되는 데, Nav1.7 활성이 상향 조절되면 피부홍통증이 (erythromelalgia) 야기된다 [J. Med. Genet. vol 41, 171-174 (2004)]. 반면에 유전적으로 Nav1.7의 활성이 없는 사람들은 (SCN9A channelopathy, 이온통로병증) 다른 감각들은 정상인 데 비해 심한 통증을 느끼지 못한다 [Nature vol 444, 894-898 (2006)].
테트로도톡신은 (Tetrodotoxin, TTX) 독어에서 발견된 신경독으로 독성이 매우 강해서 쥐에 복강 투여 시 50%를 사망시키는 양은 (LD50) 10 μg/Kg이다 [Toxins vol 6, 693-755 (2014)]. TTX를 입으로 먹게 되면 입술과 혀가 마비되며 과다한 침 분비, 발한 (sweating), 두통, 떨림 (tremor), 마비 (paralysis), 청색증 (cyanosis), 발작 (seizures), 조화운동불능 (incoordination), 설사, 복통, 저혈압, 호흡곤란, 심장부정맥, 혼수상태 등이 일어나게 된다. TTX의 이러한 부작용들은 TTX가 VGSC 여러 아형들의 활성 부위에 비특이적으로 결합한 결과라고 알려져 있으며, 따라서 VGSC 아형을 비특이적으로 저해하는 것은 심각한 부작용을 초래한다.
리도카인은 국부 마취제로 널리 사용되고 있는 비특이적인 VGSC 저해제이다. 정맥주사로 투여하면 근육 수축, 구토, 불규칙한 심장박동, 졸음 등의 원하지 않는 부작용을 일으키는 데, 그러한 부작용은 VGSC 아형을 비특이적으로 저해하는 데에서 기인한다고 여겨진다. 그러나 리도카인으로 Nav1.5를 저해하면 심실빈맥을 (ventricular tachycardia) 치료하는 데 유용할 수 있다. 그렇지만 만성 통증을 처치하기 위하여 리도카인을 전신성으로 투여하는 것은, VGSC 아형의 비특이적 저해에서 오는 부작용을 고려해볼 때 바람직하지 않다.
SCN9A 이온통로병증: SCN9A (sodium channel subtype 9A, 나트륨 채널 아형 9A) 유전자는 VGSC 아형 Nav1.7의 α-서브유닛을 암호화한다. 다른 감각들은 정상인 데 비해 심한 통증을 느끼지 못하는 극소수의 사람들이 있는 데, 그 사람들은 SCN9A가 유전적으로 변이되어서 Nav1.7의 활성이 없으며 [Nature vol 444, 894-898 (2006)], 이러한 것을 SCN9A 이온통로병증이라고 한다. 인간 SCN9A 이온통로병증의 행동 특성은 SCN9A 유전자 결여 쥐와 거의 유사하며 [PLoS One 9(9): e105895 (2014)], 따라서 Nav1.7 아형을 선택적으로 저해하면 인간 환자의 만성 통증을 안전하게 처치하는 데 유용할 것이다.
Na v 1.7의 선택적 저분자 억제제: VGSC의 생리적 기능을 반영하듯이, VGSC 아형들의 활성 부위에 있어서의 3차원적 구조는 매우 비슷하다. 저분자 억제제로 활성 부위를 직접 표적하여 Nav1.7 아형만을 선택적으로 저해하는 것은 매우 어려울 것으로 예상되며, 리도카인과 테트로도톡신의 VGSC 아형들에 대한 비선택적 저해가 좋은 예이다 (도 1A 참고).
Nav1.8에 선택적인 억제제를 찾기 위하여 20만개의 화합물을 대용량 검색한 (high throughput screen) 결과, Nav1.5보다 Nav1.7에 대해 약 8배 선택적인 억제제를 발굴하였다 [J. Gen. Physiol. vol 131(5), 399-405 (2008)]. 1-벤즈아제핀-2-원 유도체는 전기생리학적 평가 결과 Nav1.5보다 Nav1.7을 약 8배 선택적으로 억제하였다 (도 1B 참고).
현재까지 Nav1.7에 선택적인 많은 저분자 억제제가 발견되었고 그 중 몇몇은 인간 환자에 대해 평가되었다 (도 1C 참고). 예를 들면, 푸나파이드를 (Funapide, XEN-402/TV-45070) 소수의 피부홍통증 환자에 대해 평가한 결과 [Pain vol 153, 80-85 (2012)], 진통 효과를 나타내기는 했지만 상당히 많은 환자 군에서 치료와 관련된 어지럼증이나 졸음과 같은 용량 제한 부작용을 일으켰다. 이러한 중추신경계에서의 부작용은 만성 통증을 안전하게 처치하기에 필요한 Nav1.7에 대한 선택성이 충분하지 않다는 것을 의미한다.
락사트리진은 (Raxatrigine, CNV1014802/GSK-1014802) 다른 VGSC 아형 뿐만 아니라 Nav1.7도 억제하지만, 나트륨 채널의 비활성 상태를 선택적으로 안정화 함으로서 나트륨 채널의 기능 활동을 억제한다고 알려져 있다. 락사트리진이 중추신경계에서 나트륨 채널을 억제하지만 치료 용량에서는 잘 용인되고 있다 [The Pharmaceutical J. 11 Mar. 2016. Nav1.7: a new channel for pain treatment]. 락사트리진은, 상대적으로 나쁜 Nav1.7 선택성에서 오는 심장 독성의 가능성 때문에 엄격한 심장병의 기준에 기초해 임상 환자들을 모집했지만, 삼차 신경통 환자에 대해 좋은 진통 활성을 보여주었다.
PF-05089771는 IC50가 11 nM인 Nav1.7 선택적 억제제이며, 나트륨 채널의 비활성 상태를 안정화 한다고 알려져 있다 [Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a-1574a (2015)]. 피부홍통증 환자나 사랑니를 뺀 환자에 대해서 치료 효과를 평가하였는 데, PF-05089771의 약물동태학 분석에 의하면 신경성 통증의 목표 조직에서의 낮은 약물 농도가 나쁜 진통 효과의 원인일 것이라는 설명이다 [Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875-87 (2016)]. PF-05089771가 Nav1.5에 대해 Nav1.7의 선택성이 우수하다고 주장되고 있지만, 분자량이 너무 커서 만성 신경성 통증에 대한 치료적 관심사인 CNS 조직에 도달하기 어려울 것이다.
Nav1.7에 선택적인 저분자 억제제들을 구조적인 측면에서 분석한 문헌에 따르면 [Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 24, 3690-3699 (2014)], Nav1.7에 선택적인 억제제들의 분자 크기는 리도카인과 같은 VGSC 아형들에 대해 비선택적인 억제제보다 상당히 크다. Nav1.7에 대한 선택성은 억제제들을 크게 함으로서 향상되었다. 각각의 Nav1.7에 선택적인 억제제들은 억제제의 화학 구조에 따라 Nav1.7 단백질 내의 서로 다른 부위에 결합하는 것으로 생각된다. 아이러니 하게도, Nav1.7에 선택적인 억제제들의 진통 효과는 크지 않으며 SCN9A 이온통로병증을 가진 사람들로부터 발견된 기대에 미치지 못하였다 [Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975-983 (2016)].
다른 종류의 Na v 1.7에 선택적인 억제제들: 타란툴라 (tarantula) 거미의 독 펩타이드인 ProTx-II는 다른 VGSC 아형들보다 Nav1.7을 선택적으로 억제하지만, 급성 염증성 통증의 동물 모델에서 진통 효과가 약했다 [Mol. Pharmacol. vol 74, 1476-1484 (2008)]. 독성 펩타이드의 전기생리학 평가를, VGSC 아형들을 아주 많이 발현하는 인간배아신장 세포주에서 (HEK-293) 했다는 것을 고려해 보면, ProTx-II는 일차 신경 세포에서 Nav1.7의 활성 부위에 결합하지 않았을 수도 있다. 일차 신경 세포는 α-와 β-체인으로 구성된 Nav1.7을 발현하지만, HEK-293 세포는 보통 각 VGSC 아형의 α-체인만 안정적으로 발현하도록 만들어졌다.
지네 독으로부터 분리된 46-머 펩타이드인 Ssm6a는 다른 VGSC 아형들보다 Nav1.7을 선택적으로 억제하는 데, Nav1.7를 과발현하도록 만들어진 HEK-293 세포에서 IC50가 0.3 nM로 측정되었으며 급성 염증성 통증 모델인 쥐의 포르말린 시험에서 모르핀과 유사한 진통 효과를 나타내었다. 또한 쥐의 척수 신경절 세포에서 나트륨 전류를 억제하였다. 이 펩티드는 혈청에서 안정하였지만, 진통 효과는 몇 시간 밖에 유지되지 못하였다 [Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol 110(43), 17534-17539 (2013)].
SVmab1은 각 VGSC 아형들을 과발현하는 HEK-293 세포에서 다른 VGSC 아형들보다 Nav1.7을 선택적으로 표적하는 단일클론항체다. SVmab1은 Nav1.7에 의한 나트륨 전류를 선택적으로 억제하였는 데, HEK-293 세포에서 IC50가 30 nM로 측정되었다. 이 단일클론항체는 쥐의 포르말린 시험에서 50 mg/Kg을 정맥으로 혹은 10 μg 즉 0.5 mg/Kg을 척추강 내로 투여하였을 때 현저한 진통 효과를 나타내었다. 두 가지 투여 경로에 따른 진통 효과의 차이를 고려해보면, 포르말린 시험에서 진통 효과를 나타내기 위해서는 척수나 중추신경계에서 Nav1.7을 억제하는 것이 중요하다 [Cell vol 157(6), 1393-1404 (2014)].
통각에 대한 Na v 1.7 기여도의 종간 차이: 최근에 건강한 지원자의 인간 DRG의 상대적인 VGSC 아형 발현량을 qPCR로 평가하였는 데 [Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264-017-0132-3, published online 19 April (2017)], Nav1.7 아형의 발현이 전체 VGSC 발현의 약 50%였고 Nav1.8이 약 12%였다. 인간 DRG 신경 세포를 파클리탁셀과 (paclitaxel) 24시간 배양했을 때 Nav1.8이 아닌 Nav1.7만 상향 조절되었는 데, 이는 인간에서 Nav1.8보다 Nav1.7이 신경병증에 있어서 더 중요한 아형이라는 것을 의미하며, 인간 SCN9A 이온통로병증에서 관찰된 현상과 일치한다 [Nature vol 444, 894-898 (2006)].
반면에, 쥐의 DRG에서는 Nav1.8이 전체 VGSC 발현의 48%를 차지하여 제일 큰 기여를 하였고, 8내지 10주령 CD 쥐의 DRG에서 Nav1.7의 기여도는 18%였다. 따라서 동물의 통증 데이터로부터 인간 대상자의 투여량을 추론할 때는 신중해야 한다. 마찬가지로, 표적 조직에서의 Nav1.7의 발현량으로 동물 통증 모델을 평가할 때 신중하게 해야한다.
프리-mRNA: DNA (2-deoxyribose nucleic acid) 상의 유전 정보는 전사되어 핵에서 프리-mRNA를 (pre-messenger ribonucleic acid) 생성한다. 포유동물의 프리-mRNA는 보통 엑손과 인트론으로 구성되며, 엑손과 인트론은 도 1D에 도식화된 바와 같이 서로 연결되고 번호가 붙여진다.
프리-mRNA 스플라이싱: 도 2A에 도식화된 바와 같이, "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거하고 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. vol 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol . Cell Biol. vol 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol . Cell Biol. vol 15(2), 108-121 (2014)].
스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 접속 인자의 초기 스플라이스오솜 복합체인 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성으로 시작된다. 작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35는 인트론 N과 엑손 (N+1) 연결 부위에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 스플라이스오솜 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 일련의 복잡한 작업이 진행된다.
리보솜의 단백질 합성: 단백질은 mRNA에 의해 암호화된다. 세포의 자극에 반응해서 혹은 저절로, DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사된다. 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 생성된 mRNA는 세포질로 이동된다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Antisense Oligonucleotide, ASO): DNA, mRNA 및 프리-mRNA 등의 핵산에 서열특이적으로 (상보적으로) 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 올리고뉴클레오타이드라고 부른다 (ASO).
예를 들면, 세포질에서 mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 리보솜의 mRNA에 따른 단백질 합성을 억제할 수 있는 데, 리보솜의 표적 단백질 합성을 억제하기 위해서는 ASO는 반드시 세포질 내에 있어야만 한다.
핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 억제하거나 조절할 수 있는 데, 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 억제하거나 조절하기 위해서는 ASO는 반드시 핵 내에 있어야만 한다. 스플라이싱의 안티센스 억제에 의해 ASO가 표적하는 엑손을 결여한 mRNA 혹은 mRNA들이 생성되는 데, 그러한 mRNA(들)은 "스플라이스 변형체(들)"이라 불리며, 전체 길이 mRNA가 암호화하는 단백질보다 작은 단백질(들)을 암호화한다.
이론적으로, "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 억제하면 스플라이싱을 막을 수 있다. 만약 ASO가 (5'→3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 "5' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면, ASO는 프리-mRNA와 인자 U1의 복합체 형성을, 따라서 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 막을 수 있다. 그와 유사하게, 만약 ASO가 (5'→3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 "3' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면, "스플라이스오솜 E 복합체"는 형성될 수 없다. "3' 스플라이스 위치"와 "5' 스플라이스 위치"는 도 2B에 도식화 된다.
비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오타이드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈 (nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 (자연에 존재하지 않는) 올리고뉴클레오타이드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)], 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오타이드 중 몇몇의 화학 구조가 도 3A에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 예측한대로 결합한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 (PTO, Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물 세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터가 (transporter) 많이 발현된 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].
생체외에서 PTO의 세포 투과성을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 세포 독성을 유발하므로 장기간의 생체내 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
지난 30여년간 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역 질환, 대사성 질환 등을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 대부분의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포 투과성 부족으로 인하여 성공하지 못하였다. PTO의 세포 투과성 부족을 극복하기 위해서는, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 보체 활성화 (complement activation), 신장 독성 (tubular nephropathy), 쿠퍼 (Kupffer) 세포 활성화, 그리고 비장 비대, 비장 림프구 증식증, 단핵세포 침윤과 같은 면역 자극 등의 다양한 독성을 유발한다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장과 관련된 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센 (Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation vol 118, 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 DNA 혹은 RNA에 대한 결합력을 증가시키기 위하여 RNA의 리보스 고리 골격을 구조적으로 제한한 핵산이다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)]. LNA 역시 세포 투과성이 매우 나쁘다.
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오타이드 (PMO, Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스 (2-deoxyribose)와 포스페이트 (phosphate)가 각각 모폴린과 (morpholine) 포스포로다이아미데이트로 (phosphodiamidate) 치환된 올리고뉴클레오타이드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 중성이다. 따라서 PMO와 mRNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 mRNA의 결합은 DNA와 mRNA 사이의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA나 RNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터 (hepatic transporter)에 의해 인식되지 않지만, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산 (PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸) 글리신을 단위 골격으로 갖는 폴리펩타이드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 도 3B에 도식화된다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 "5'-말단", 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 "3'-말단"에 해당한다.
PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 띠지 않은 중성이기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않으며, PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 갖고 있으나, PNA 역시 포유동물 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, (2003)].
변형된 핵산염기로 세포투과성과 결합력을 높인 PNA: 화학 구조가 도 3C에 예시된 바와 같이, 양이온성 지질 (cationic lipid) 혹은 그와 동등한 것이 핵산 염기에 (즉, 염기) 공유 결합으로 연결된 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 예측한대로 상보적 결합을 한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 리포펙션과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 올리고뉴클레오티드 그 자체에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 예를 들면, 상보적인 DNA와 듀플렉스 (duplex)를 형성할 때, 4~5개의 변형된 핵산 염기가 도입된 11~13머의 PNA 유도체는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC 이상 높은 Tm 값을 보인다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합에도 (mismatch) 매우 민감한 데, 변형된 PNA의 서열이나 염기의 종류에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
작은 간섭 RNA (siRNA, Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질의 상호 작용으로 형성된 “RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체 (RISC)"는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합한다. RISC와 결합한 mRNA는 잘려져서 다른 복사본 이중 나선 siRNA를 생성한다. 즉 siRNA는 표적 mRNA의 절단을 유도하는 촉매 반응을 일으켜, 결과적으로 mRNA에 의한 단백질의 발현을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 좋은 세포 투과성을 위한 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 또는 생체내 치료 활성이 잘 나타나지 않는다.
SCN9A의 siRNA: 인간 SCN9A mRNA 엑손 8에 있는 19-머 서열을 표적하는 [(5' → 3') GAUUAUGGCUACACGAGCU] siRNA를 발표한 선행 기술에서 [US8183221], 척추강 내로 투여한 siRNA가 신경성 통증과 염증성 통증의 동물 모델에서 치료 활성을 나타냈다고 주장하였다. 이 siRNA들은 쥐의 DRG 세포에서 Nav1.7의 발현을 하향 조절하는 것으로 보고되었다.
SCN9A ASO: 개체당 30 mg의 ASO를 한 번 피하 주사한 쥐의 DRG에서, 쥐의 SCN9A mRNA를 상보적으로 표적하는 2'-O-메톡시에틸 PTO ASO가 Nav1.7 단백질의 발현을 억제하는 정도를 평가하였다. 약물 투여 4주 후에 DRG에서 Nav1.7 단백질의 발현을 80% 이상 억제하였다. 이 SCN9A ASO는 Randall-Selitto 테스트에 의한 기계적 통증을 억제하였는 데, 그 효능과 DRG에서의 Nav1.7 단백질 발현량은 높은 상관 관계가 있었다 [Pain, Mohan and Fitzsimmons et al. in press].
SCN9A 프리-mRNA 스플라이싱의 안티센스 저해: 현재까지 SCN9A 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 유도한 SCN9A ASO가 보고된 바는 없다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA에서 "엑손 4"의 스키핑을 유도하여 "엑손 4"가 결여된 인간의 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, Nav1.7의 활성과 연관된 통증이나 질환을 치료하는 데 유용하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA에서 "엑손 4"의 스키핑을 유도하여 "엑손 4"가 결여된 인간의 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, Nav1.7의 활성과 연관된 통증이나 질환을 치료하는 데 유용하다.
화학식 I의 화합물을 서술하는 데 사용된 조건인 “n은 10과 25 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24 중에서 선택된다"는 것이다.
3' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물은 인간 SCN9A 유전체 DNA에서 [NCBI 참고 서열: NC_000002.12] 유래된 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인트론 3과 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합한다. 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] 14-머 서열은, 7-머는 "인트론 3"으로 그리고 7-머는 "엑손 4"로 구성되는 3' 스플라이스 위치이다. 즉 14-머 프리-mRNA는 전통적으로 [(5'→3') uguuuag┃GUACACU]로 표시되는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 "인트론 3"과 "엑손 4"의 연결 부분을 나타낸다.
프리-mRNA의 전통적인 표기 방법은 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "인트론 3"과 "엑손 4"의 연결 부위에 걸쳐있는 30-머 서열의 [(5'→3') gaaucuuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]로 더 폭 넓게 예시된다. 엑손의 번호는 SCN9A mRNA 전사물에 따라 변하기도 하기 때문에, 위의 30-머의 SCN9A 서열은 인간 SCN9A mRNA의 보고된 엑손 번호와 관계없이 화학식 I 화합물의 표적 스플라이스 위치를 분명하게 확인하기 위하여 제공되었다.
화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 (자연에 존재하는) 핵산 염기나 비천연 (자연에 존재하지 않는) 핵산 염기의 구조는 도 4에 예시되어 있다. 본 발명의 천연 또는 비천연 핵산 염기는 도 4에서 제공된 핵산 염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 천연 혹은 비천연 핵산염 기들은 단지 화학식 I의 화합물에 허용되는 핵산 염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들이 도 5A에서 도 5E에 예시된다. 치환체가 있거나 없는 알킬은 도 5A에 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실은 도 5B에 예시된다. 도 5C에는 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐이 예시된다. 도 5D에는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예들이 제공된다. 도 5E에는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐이 제공된다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 화학식 I의 화합물에 허용되는 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 PNA 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA 서열에 서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 PNA 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다. 화학식 I의 PNA 유도체와 전체 길이의 DNA나 RNA와의 듀플렉스는 너무 높은 Tm 값을 가지고 있어서 완충 수용액에서 확실하게 측정하기 어렵다. 화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 짧은 길이의 DNA와도 높은 Tm 값을 나타낸다.
화학식 I의 화합물은 인간 SCN9A 유전자에서 전사된 인간 SCN9A 프리-mRNA의 표적 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여, 화합물이 표적하는 엑손이 포함된 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 방해한다. 본 발명의 화합물이 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 입체적으로 방해하기 때문에, SCN9A "엑손 4"가 잘려져 나가서 "엑손 4"가 결여된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 결과적으로, 본 발명의 화합물은 SCN9A mRNA에서 "엑손 4"의 스키핑을 유도한다.
본 발명의 화합물이 상보적인 프리-mRNA 서열에 강하게 결합하기 때문에, 상보적인 프리-mRNA 서열과 한두 개의 부정합을 갖는 본 발명의 화합물도 강하게 결합하여 SCN9A 프리-mRNA내에 있는 표적 엑손의 스키핑을 유도한다. 예를 들면, 화학식 I의 화합물이 SCN9A 프리-mRNA와 한 개의 부정합을 갖아도 14-머 SCN9A ASO는 SCN9A mRNA에서 "엑손 4"의 스키핑을 유도한다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수해서 올리고뉴클레오티드 "그 자체"도 세포 내에 쉽게 전달된다. 즉 본 발명의 화합물을 올리고뉴클레오티드 "그 자체"로 세포에 처리하면, SCN9A 프리-mRNA에서 "엑손 4"의 스키핑을 유도하여 SCN9A "엑손 4"가 결여된 SCN9A mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 화학식 I의 화합물은 세포에서 표적 엑손의 스키핑을 강력하게 유도하기 위해 세포로 전달하기 위한 어떠한 수단이나 제제가 필요하지 않다. 본 발명의 화합물 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 펨토몰 이하의 농도로 세포에 처리하면, 화학식 I의 화합물은 SCN9A "엑손 4"의 스키핑을 잘 유도한다.
화학식 I의 화합물 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 처리한 세포는 전체 길이 SCN9A mRNA를 적게 발현하며, 따라서 화합물을 처리하지 않은 세포보다 Nav1.7의 낮은 기능 활성을 보인다. 화학식 I의 화합물 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 전신성으로 투여한 신경 세포나 조직에서는 Nav1.7의 발현이 억제된다. 따라서 본 발명의 화합물은 Nav1.7의 과도한 발현과 연관된 통증이나 질환의 치료에 유용하다.
화학식 I의 PNA 유도체는 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 전신성으로 투여하여 표적 조직에서 SCN9A "엑손 4"의 스키핑을 유도할 수 있으며, 따라서 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현을 억제한다. 화학식 I의 화합물은 원하는 치료적 혹은 생물학적 활성을 위한 표적 조직으로의 전신성 전달을 증가시키기 위해 특별한 제제가 필요하지 않다. 화학식 I의 화합물은 보통 PBS나 소금물에 녹여서, 표적 조직에서 원하는 치료적 활성을 나타내기 위해 전신성으로 투여한다. 본 발명의 화합물은 전신성 치료 활성을 나타내기 위해 강한 혹은 침습성의 제제를 할 필요가 없다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 수산화 칼륨 (potassium hydroxide), 염산 (hydrochloric acid), 메탄설폰산 (methanesulfonic acid), 구연산 (citric acid), 그리고 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 PNA 유도체나 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (tartaric acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜 (polypropyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (isopropanol), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 증류수, 그리고 방부제 (preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 1 펨토몰/Kg에서 1 나노몰/Kg 이상의 치료 용량을 전신성으로 투여를 할 수 있는데, 그 양은 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
하나의 구현예에서, S1, S2, ……, Sn -1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn은 중수소 (deuterido) 또는 수소 (hydrido)를 각자 독립적으로 나타내며; 그리고 Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 또는 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼을 나타낸다. 다른 하나의 구현예에서, S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn -1 그리고 Tn 중 적어도 하나는 치환체가 있거나 없는 알킬, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼을 각자 독립적으로 나타내며; 및/또는 Z는 치환체가 있거나 없는 알킬, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼을 나타낸다.
하나의 구현예에서 화학식 V를 설명하는 조건인 "m은 1에서 15 사이의 정수"의 의미는 문자 그대로 m은 정수 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 그리고 14 중에서 선택된다는 것이다.
본 발명의 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11과 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 하나의 구현예에서, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 다른 하나의 구현예에서, X와 Y 중 적어도 하나는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
본 발명의 특히 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 하나의 구현예에서, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 또는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 다른 하나의 구현예에서, X와 Y 중 적어도 하나는 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
본 발명의 매우 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 하나의 구현예에서, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 또는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 다른 하나의 구현예에서, X와 Y 중 적어도 하나는 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 또는 치환체가 있거나 없는 아릴아실을 각자 독립적으로 나타낸다.
본 발명의 매우 더 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 하나의 구현예에서, X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 또는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐을 각자 독립적으로 나타낸다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 다른 하나의 구현예에서, X와 Y 중 적어도 하나는 치환체가 있거나 없는 아릴아실을 각자 독립적으로 나타낸다.
본 발명의 가장 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 
3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 CH2-O-(CH2)5- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 하나의 구현예에서, Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실 또는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐을 나타낸다.
화학식 I의 PNA 올리고머 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 다른 하나의 구현예에서, Y는 치환체가 있거나 없는 아릴아실을 나타낸다.
특별히 중요한 것으로서 다음 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Benzoyl-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Benzenesulfonyl-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Methyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N→C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N→C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N→C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)- TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) N,N-Phenyl-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Propyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzoyl-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH2;
(N→C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Methylsulfonyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexanoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexanoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Benzoyl-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Propionyl-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N→C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2; 그리고,
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다;
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "n-Hexanoyl-"는 "1-(n-헥사노일)-"; " Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "n-Hexyl-"은 "1-(n-헥실)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "Benzenesulfonyl"은 "벤젠-1-설포닐-"; "Methylsulfonyl"은 "메틸-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-";"-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 약기된 PNA 모노머들에 대한 화학 구조를 총괄하여 도 6에 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 모노머로 인식된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"에 강한 결합력을 갖기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과 생산적인 염기 쌍을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 모노머로 인식된다.
본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 도 7에 분명히 제공한다.
PNA 유도체들의 약자들을 분명히 보여주기 위해, 약자로 씌여진 14-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2"의 화학 구조가 도 8에 제공된다. 또 다른 예시로서 약자로 씌여진 16-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2" 의 화학 구조가 도 9에 제공된다.
"(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2"의 14-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-AC"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 14-머 PNA는, 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "인트론 3"과 "엑손 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5'→3') uugu guuuag ┃ GUACACUU UU]의 20-머 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 14-머 상보성 오버랩을 한다.
"(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2"의 18-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3')AAG-TGT-ACC-TAA-ACA-CAA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 18-머 PNA는 [(5'→3') uuguguuuag ┃ GUACACUU UU]의 20-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 18-머 상보성 오버랩을 한다.
"(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2"의 18-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3')AAG-TCT-ACC-TAA-ACA-CTA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 18-머 PNA는, [(5'→3')u"u"guguuuag┃ GUA "C" ACUU UU]의 20-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 16-머 상보성 오버랩을 한다. 이 18-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4의 3' 스플라이스 위치와 두 개의 염기 부정합을 가지며 부정합은 인트론 3과 엑손 4에서 발견되고 인용 부호로 (" ") 표시된다.
"(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2"의 14-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3')AAG-TGT-ACC-TAA-AG "의 DNA 서열에 상응한다. 상기 14-머 PNA는, [(5'→3')uugu"g" uuuag ┃ GUACACUU UU]의 20-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 13-머 상보성 오버랩을 한다. 이 14-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4의 3' 스플라이스 위치와 한 개의 염기 부정합을 가지며 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시된 바와 같이 인트론 3에서 발견된다.
도 1A. 전위차 나트륨 이온 채널의 비선택적 저분자 억제제인 리도카인과 테트로도톡신의 화학 구조.
도 1B. Nav1.5보다 Nav1.7에대해 더 선택적인 1-벤즈아제핀-2-원 억제제.
도 1C. 전위차 나트륨 이온 채널의 선택적 저분자 억제제인 푸나파이드, 락사트리진 및 PF-05089771의 화학 구조.
도 2A. 프리-mRNA에서 인트론과 엑손의 번호 붙이기 도식화.
도 2B. 인트론 N을 제거하는 스플라이싱 과정의 도식화.
도 2C. 스플라이스오솜 E 복합체에 대한 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치의 도식화.
도 3A. DNA와 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 3B. PNA의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 3C. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기의 예.
도 4. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 5A. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 5B. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 5C. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 5D. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예.
도 5E. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐의 예.
도 6. A (아데닌), G (구아닌), T (티민), C (시토신), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 축약된 PNA 모노머의 화학 구조.
도 7. 화학식 I의 화합물에서 N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 8. "(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2"로 축약된 14-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 9. "(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2"로 축약된 16-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 10. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하는 데 사용된 Fmoc-PNA 모노머의 화학 구조.
도 11. 본 발명의 SPPS에서 전형적인 모노머 신장주기의 도식화.
도 12A. "ASO 2"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 12B. "ASO 2"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 13. HPLC로 정제한 "ASO 2"의 ES-TOF 질량 스펙트럼 데이터.
도 14A. 0 (음성 대조용), 10, 혹은 100 zM의 "ASO 7"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 14B. 엑손 4-5의 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 14C. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 15A. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터, cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성함 (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05).
도 15B. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터, cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성함 (표준 오차에 의한 에러 바; ** p < 0.05).
도 16A. 0 (음성 대조용), 1, 3, 혹은 6 pmole/Kg의 "ASO 7"을 2일마다 피하 투여한 SD 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 프레가발린 30 mpk의 폰프레이 한계치가 추가되었음. (* p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 16B. "ASO 2"를 0 (음성 대조용), 20 pmole/Kg, 100 pmole/Kg, 500 pmole/Kg를 매일, 혹은 100 pmole/Kg를 2일마다 피하 투여한 SD 쥐에서 SNL로 (L5/L6 결찰) 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 프레가발린 30 mpk의 폰프레이 한계치가 추가되었음. (* p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 17A. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 7"을 30시간 처리하고 "L5/L6 결찰"한 쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 세포 형광 강도의 평균치와 (왼쪽) "코로나 그린"을 처리한 DRG 신경 세포의 샘플 형광 이미지 (오른쪽).
도 17B. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 7"을 30시간 처리하고 "L5/L6 결찰"하지 않은 쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 세포 형광 강도의 평균치.
도 18A. 100 pmole/Kg의 "ASO 1"을 피하 투여한 쥐에서 DPNP로 유도된 이질통의 경감. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 18B. 60 pmole/Kg의 "ASO 2"를 혹은 30 pmole/Kg의 "ASO 6"을 날자 0, 2 및 4에 피하 투여한 쥐에서 DPNP로 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 DPNP가 없는 폰프레이 한계치가 추가되었음. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 19A. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 10 pmole/Kg, 30 pmole/Kg, 혹은 100 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐에서 5% 포르말린의 발바닥 주사로 유도된 통증의 억제. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 19B. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 15 pmole/Kg, 50 pmole/Kg, 혹은 150 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐에서 5% 포르말린의 발바닥 주사로 유도된 통증의 억제. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 20A. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1 pmole/Kg, 6 pmole/Kg, 혹은 30 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐의 L5 DRG에서 Nav1.7 발현에 대한 군별 대표적인 IHC 이미지.
도 20B. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1 pmole/Kg, 6 pmole/Kg, 혹은 30 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐의 L5 DRG에서 상대적인 Nav1.7 발현량. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 21A. 1 (3일 및 7일째에 30 pmole/Kg로 올림), 3, 혹은 10 pmole/Kg의 "ASO 10"을 피하 투여한 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 21B. 100 pmole/Kg의 "ASO 10"을 4일 또는 5일 마다 1회 피하 투여한, 혹은 프레가발린 30 mpk를 경구 투여한 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감.
도 22. "ASO 10"을 날자 0 및 4에 투여한 투여군 (위 이미지) 및 음성 대조군에서 (아래 이미지) 얻은 척수 샘플의 Nav1.7 발현 (적색), 신경 세포 신체 (녹색), 그리고 핵의 (청색) IHC 이미지.
도 23A. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 zM을 24시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서 Nav1.7 발현에 대한 웨스턴 블럿 데이터.
도 23B. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 10, 30, 100, 혹은 300 zM을 24시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서, 원스텝 PCR (왼쪽 그림) 혹은 무작위 헥사머를 사용하여 합성한 (오른쪽 그림) cDNA에 의한 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 23C. "ASO 10" 0 (음성 대조용), 10, 30, 혹은 100 zM을 약 6시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서 나트륨 전류 데이터의 모은 평균 (왼쪽 그림); 음성 대조군 세포 및 "ASO 10" 100 zM을 약 6시간 처리한 세포의 모은 나트륨 전류 데이터의 평균 값 (오른쪽 그림). 나트륨 전류 데이터는 세포 크기에 대해 정규화한 것과 같이 모았다. (N은 군별 데이터 분석을 위해 모은 세포의 수이다; 표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 독립 표본 T 검정).
도 24A. 0 (음성 대조용), 5, 25, 125 혹은 625 fmole/Kg의 "ASO 7"을 날자 0, 3, 및 6에 피하 투여한 SD 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도한 이질통의 경감. 프레가발린 30 mg/Kg 경구 투여군은 양성 대조군으로 포함되었다 (군당 8마리; 표준 오차에 의한 에러 바)
도 24B. 0 (음성 대조용) 혹은 100 pmole/Kg의 "ASO 2"를 날자 0 및 1에 피하투여한 쥐에서 란달-셀리토 시험에 의한 통증 한계점의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 독립 표본 T 검정).
도 1B. Nav1.5보다 Nav1.7에대해 더 선택적인 1-벤즈아제핀-2-원 억제제.
도 1C. 전위차 나트륨 이온 채널의 선택적 저분자 억제제인 푸나파이드, 락사트리진 및 PF-05089771의 화학 구조.
도 2A. 프리-mRNA에서 인트론과 엑손의 번호 붙이기 도식화.
도 2B. 인트론 N을 제거하는 스플라이싱 과정의 도식화.
도 2C. 스플라이스오솜 E 복합체에 대한 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치의 도식화.
도 3A. DNA와 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 3B. PNA의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 3C. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기의 예.
도 4. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 5A. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 5B. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 5C. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 5D. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예.
도 5E. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 중 선택된 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐의 예.
도 6. A (아데닌), G (구아닌), T (티민), C (시토신), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 축약된 PNA 모노머의 화학 구조.
도 7. 화학식 I의 화합물에서 N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 8. "(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2"로 축약된 14-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 9. "(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2"로 축약된 16-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 10. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하는 데 사용된 Fmoc-PNA 모노머의 화학 구조.
도 11. 본 발명의 SPPS에서 전형적인 모노머 신장주기의 도식화.
도 12A. "ASO 2"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 12B. "ASO 2"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 13. HPLC로 정제한 "ASO 2"의 ES-TOF 질량 스펙트럼 데이터.
도 14A. 0 (음성 대조용), 10, 혹은 100 zM의 "ASO 7"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 14B. 엑손 4-5의 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 14C. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 15A. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터, cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성함 (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05).
도 15B. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터, cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성함 (표준 오차에 의한 에러 바; ** p < 0.05).
도 16A. 0 (음성 대조용), 1, 3, 혹은 6 pmole/Kg의 "ASO 7"을 2일마다 피하 투여한 SD 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 프레가발린 30 mpk의 폰프레이 한계치가 추가되었음. (* p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 16B. "ASO 2"를 0 (음성 대조용), 20 pmole/Kg, 100 pmole/Kg, 500 pmole/Kg를 매일, 혹은 100 pmole/Kg를 2일마다 피하 투여한 SD 쥐에서 SNL로 (L5/L6 결찰) 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 프레가발린 30 mpk의 폰프레이 한계치가 추가되었음. (* p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 17A. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 7"을 30시간 처리하고 "L5/L6 결찰"한 쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 세포 형광 강도의 평균치와 (왼쪽) "코로나 그린"을 처리한 DRG 신경 세포의 샘플 형광 이미지 (오른쪽).
도 17B. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 7"을 30시간 처리하고 "L5/L6 결찰"하지 않은 쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 세포 형광 강도의 평균치.
도 18A. 100 pmole/Kg의 "ASO 1"을 피하 투여한 쥐에서 DPNP로 유도된 이질통의 경감. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 18B. 60 pmole/Kg의 "ASO 2"를 혹은 30 pmole/Kg의 "ASO 6"을 날자 0, 2 및 4에 피하 투여한 쥐에서 DPNP로 유도된 이질통의 경감. 내부의 역사적 배경을 적용하기 위하여 DPNP가 없는 폰프레이 한계치가 추가되었음. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 19A. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 10 pmole/Kg, 30 pmole/Kg, 혹은 100 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐에서 5% 포르말린의 발바닥 주사로 유도된 통증의 억제. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 19B. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 15 pmole/Kg, 50 pmole/Kg, 혹은 150 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐에서 5% 포르말린의 발바닥 주사로 유도된 통증의 억제. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정).
도 20A. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1 pmole/Kg, 6 pmole/Kg, 혹은 30 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐의 L5 DRG에서 Nav1.7 발현에 대한 군별 대표적인 IHC 이미지.
도 20B. "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1 pmole/Kg, 6 pmole/Kg, 혹은 30 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐의 L5 DRG에서 상대적인 Nav1.7 발현량. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 21A. 1 (3일 및 7일째에 30 pmole/Kg로 올림), 3, 혹은 10 pmole/Kg의 "ASO 10"을 피하 투여한 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05, 독립 표본 T 검정)
도 21B. 100 pmole/Kg의 "ASO 10"을 4일 또는 5일 마다 1회 피하 투여한, 혹은 프레가발린 30 mpk를 경구 투여한 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도된 이질통의 경감.
도 22. "ASO 10"을 날자 0 및 4에 투여한 투여군 (위 이미지) 및 음성 대조군에서 (아래 이미지) 얻은 척수 샘플의 Nav1.7 발현 (적색), 신경 세포 신체 (녹색), 그리고 핵의 (청색) IHC 이미지.
도 23A. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 zM을 24시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서 Nav1.7 발현에 대한 웨스턴 블럿 데이터.
도 23B. "ASO 10"을 0 (음성 대조용), 10, 30, 100, 혹은 300 zM을 24시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서, 원스텝 PCR (왼쪽 그림) 혹은 무작위 헥사머를 사용하여 합성한 (오른쪽 그림) cDNA에 의한 전체 길이 SCN9A mRNA의 qPCR 데이터. (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 & ** p < 0.01 독립 표본 T 검정).
도 23C. "ASO 10" 0 (음성 대조용), 10, 30, 혹은 100 zM을 약 6시간 처리한 L5 DRG 신경 세포에서 나트륨 전류 데이터의 모은 평균 (왼쪽 그림); 음성 대조군 세포 및 "ASO 10" 100 zM을 약 6시간 처리한 세포의 모은 나트륨 전류 데이터의 평균 값 (오른쪽 그림). 나트륨 전류 데이터는 세포 크기에 대해 정규화한 것과 같이 모았다. (N은 군별 데이터 분석을 위해 모은 세포의 수이다; 표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 독립 표본 T 검정).
도 24A. 0 (음성 대조용), 5, 25, 125 혹은 625 fmole/Kg의 "ASO 7"을 날자 0, 3, 및 6에 피하 투여한 SD 쥐에서 L5/L6 결찰로 유도한 이질통의 경감. 프레가발린 30 mg/Kg 경구 투여군은 양성 대조군으로 포함되었다 (군당 8마리; 표준 오차에 의한 에러 바)
도 24B. 0 (음성 대조용) 혹은 100 pmole/Kg의 "ASO 2"를 날자 0 및 1에 피하투여한 쥐에서 란달-셀리토 시험에 의한 통증 한계점의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바; * p < 0.05 독립 표본 T 검정).
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
PNA 올리고머는 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법으로, 필요하면 이를 약간 변형하여 Fmoc-화학에 기반한 고체상 펩타이드 합성 (SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드로부터 (PCAS BioMatrix Inc., 캐나다 퀘백 소재) 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스 (H-Rink Amide- ChemMatrix)였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 선행 기술에 [PCT/KR 2009/001256] 따라 혹은 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머와 천연 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머를 사용하여 본 발명의 PNA 유도체를 합성하였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 도 10에 제공된다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 PNA 모노머들에 대한 보호기들의 변형을 쉽게 할 수 있을 것이다. 즉, 도 10에 제공되는 Fmoc-PNA 모노머들은 단지 예들로서 받아들여져야 하며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. PNA 올리고머는 C18-역상 HPLC로 (0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올) 정제하고 ESI/TOF/MS와 같은 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.
도 11은 본 발명의 SPPS에서의 전형적인 모노머 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. 각 반응 단계들이 하기와 같이 제공된다.
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 0.01 mmol (약 20 mg) 켐매트릭스 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드 (MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머나 Fmoc으로 보호된 아미노산과 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc 제거 (DeFmoc)] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나서, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 즉시 반응을 시킨다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링 (Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol Fmoc-PNA 모노머, 0.05 mmol HBTU [2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트], 그리고 10 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 다음, 2분 후에 그 용액을 레진의 아민에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[캡핑 (Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액 (capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 일반적인 염기성의 커플링 조건에서 "Fethoc-OSu"와 반응하여 레진의 N-말단 아민에 "Fethoc"기가 도입되는 데, "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같이 제공된다.
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액 (cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진에서 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압을 이용해서 농축한다. 잔사를 에테르로 (diethylether) 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진에서 분리된 PNA 유도체의 조생성물 (crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 구배 방법의(gradient method) C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 12A와 12B는 각각 " ASO 2"의 정제 전과 후의 HPLC 크로마토그램의 예시이다. " ASO 2"의 서열은 표 1에 제공된다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인트론 3과 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하기 위하여, 본 발명의 PNA 유도체를 위의 방법을 따라서 혹은 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 인간 SCN9A 프리-mRNA를 표적하는 PNA 유도체들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체들을 예시하기 위함이며 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "엑손 4"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터를 표 1에서 함께 제공한다. 표 1에서 SCN9A ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
| PNA 예 | PNA 서열 (N→C) | 정확한 질량, m/z | |
| theor.a | obs.b | ||
| ASO 1 | Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)-NH2 |
5398.60 | 5398.58 |
| ASO 2 | Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2 | 4282.97 | 4284.99 |
| ASO 3 | Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2 | 4182.87 | 4182.89 |
| ASO 4 | Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2 | 4282.97 | 4283.00 |
| ASO 5 | Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2 | 4281.98 | 4282.05 |
| ASO 6 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2 | 4369.06 | 4369.08 |
| ASO 7 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4620.16 | 4620.14 |
| ASO 8 | Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2 | 4345.04 | 4345.08 |
| ASO 9 | Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2 | 4676.22 | 4676.25 |
| ASO 10 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2 | 4660.16 | 4660.15 |
| ASO 11 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2 | 4895.27 | 4895.20 |
| ASO 12 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2 | 4951.27 | 4951.26 |
| ASO 13 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2 | 5146.37 | 5146.35 |
| ASO 14 | Benzoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4488.10 | 4488.06 |
| ASO 15 | Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4468.13 | 4468.04 |
| ASO 16 | Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2 | 4620.16 | 4620.14 |
| ASO 17 | p-Toluenesulfonyl-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2 | 4682.17 | 4682.15 |
| ASO 18 | n-Hexanoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2 | 4524.19 | 4524.20 |
| ASO 19 | Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2 | 4991.41 | 4991.37 |
| ASO 20 | [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4545.16 | 4545.15 |
| ASO 21 | H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4386.05 | 4386.03 |
| ASO 22 | n-Propyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4440.14 | 4440.06 |
| ASO 23 | N,N-Phenyl-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2 | 4460.10 | 4460.09 |
| ASO 24 | Benzoyl-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4474.08 | 4474.11 |
| ASO 25 | p-Toluenesulfonyl-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2 | 4238.92 | 4238.95 |
| ASO 26 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2 | 4635.16 | 4635.14 |
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
도 12A는 "ASO 2" 조생성물의 HPLC 크로마토그램이다. 조생성물은 C18-역상 대용량 HPLC로 정제하였다. 도 12B는 정제된 "ASO 2"의 HPLC 크로마토그램인 데, 대용량 HPLC 정제로 "ASO 2"의 순도가 많이 향상되었다. 도 13은 정제된 "ASO 2"의 ESI-TOF 질량 분석 스팩트럼을 제공한다. "ASO 2"의 분석 데이터를 제공하는 것은 본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체를 정제하고 특성화하는 방법을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
상보적인 DNA에 대한 PNA 유도체의 결합력 (Binding Affinity)
표 1의 PNA 유도체와 N-말단이나 C-말단을 상보적으로 표적하는 10-머 DNA의 결합력을 평가하였다. PNA와 상보적인 10-머 DNA의 듀플렉스에 대한 Tm 값으로 결합력을 평가하였다. 표 1의 PNA 유도체와 완전히 상보적인 DNA의 듀플렉스에 대한 Tm 값은 너무 높아서, Tm 값 측정 중에 완충 수용액이 끓는 경향이 있기 때문에 완충 수용액에서 확실하게 측정하기 힘들다.
Tm 값은 UV/가시광선 분광 광도계를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브 (falcon tube)에서 4 μM PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 10-머 DNA를 4 ml의 수성 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90oC에서 일 분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3 mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하고, 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 260 nm에서 Tm을 측정하였다. Tm 측정에 사용된 10-머 DNA는 (주)바이오니아 (www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 10-머 DNA의 Tm 값은 매우 높은 데, 수정되지 않은 데이터가 표 2에 제공된다. 예를 들면, "ASO 7"의 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 [(N→C) Fethoc- AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-T A(5)A-A(5)C-NH2] PNA의 N-말단 10-머를 표적하는 DNA의 [즉, (5'→3')AGG-TAC-ACT-T] 듀플렉스는 77.0oC의 Tm 값이 관찰되었다. 반면에, "ASO 7"의 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분과 [(N→C) Fethoc-TG(5)T-T A(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T -NH2] PNA의 C-말단 10-머를 표적하는 DNA의 [즉, (5'→3')GTT-TAG-GTA-C] 듀플렉스는 69.0oC의 Tm 값이 관찰되었다.
| PNA | Tm 값, oC | |
| N-말단 10-머 DNA | C-말단 10-머 DNA | |
| ASO 2 | 74.0 | 65.0 |
| ASO 4 | 77.0 | 66.0 |
| ASO 5 | 78.0 | 66.0 |
| ASO 6 | 75.0 | 72.0 |
| ASO 7 | 77.0 | 69.0 |
| ASO 8 | 78.1 | 70.0 |
| ASO 10 | 79.0 | 74.0 |
화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예
표 1에 명시된 화학식 I의 PNA 유도체에 대하여 생체외 및 생체내의 생물학적 활성들이 평가되었다. 화학식 I의 PNA 유도체의 동물에서 및 세포에서의 안티센스 활성을 예시하기 위하여 생물학적 실시예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 표 1에 실린 화합물들로 한정하기 위함이 아니다.
실시예 1. PC3 세포에서 " ASO 7"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (A).
표 1에 명시된 " ASO 7"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "인트론 3" 및 "엑손 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 ASO이다. 14-머 표적 서열 은 [(5' 
3') uugu guuuag ┃ GUACACUU UU] 3' 스플라이스 위치에 "진하게" "밑줄그어" 표시된다. "ASO 7"은 인트론 3과 6-머 그리고 엑손 4와 8-머의 상보적 결합을 각각 한다.
PC3 세포에서 (Cat. Number CRL1435, ATCC) 인간 SCN9A mRNA가 풍부하게 발현된다고 알려져 있어서 [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)], PC3 세포에서 "ASO 7"이 엑손 4의 스키핑을 유도하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL F-12K 배양액에 배양된 PC3 세포들에 대해 "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1, 10, 또는 100 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] "ASO 7"와 5 시간 동안 배양한 후에, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 2_순방향: (5' 
3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 엑손 9_역방향: (5' 
3') CGTCTG-TTGGTAAAGGTTTT]의 유전자-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트 (Super Script®) 원스텝 (One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 2n_순방향: (5' 
3') CCACCGGACTGGACCAAAAA; 및 SCN-엑손 9n_역방향: (5' 
3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 엑손 특이적인 프라이머 세트에 대해 20 μL 중첩 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95℃ 2분에 이어서, 34 주기의 95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 1분.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 2% 아가로스 젤 상에서 중첩 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 생거 서열분석으로 분석하였다.
중첩 PCR 산물에 대한 전기영동 데이터를 도 14A에 제공하는 데, "ASO 7"로 처리한 세포에서 엑손 4-5의 스키핑이라고 할 수 있는 강한 PCR 밴드가 생성되었다. 그러나, 전체 길이 SCN9A mRNA의 PCR 밴드의 강도는, 음성 대조군 샘플보다 10 zM 및 100 zM의 ASO로 처리한 샘플에서 더 강했다. 중첩 PCR의 이상한 용량 반응 패턴은 "ASO 7"에 의한 엑손 스키핑 도중에 축적된 "엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 것이다 [Nature Struc . Mol . Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]. 엑손 스키핑의 PCR 산물은 도 14B와 같이 생거 서열분석으로 엑손 4-5의 스키핑임을 확인하었다.
실시예 2. PC3 세포에서 "ASO 7"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (B).
별다른 언급이 없으면 "실시예 1"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 " ASO 7"이 "엑손 4"의 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 이 실험에서는 PC3 세포들에 대해 "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. [엑손 3/6_순방향: (5' 
3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT; 및 엑손 9n_역방향: (5' 
3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 엑손 3과 엑손 6의 연결 부위 서열을 갖는 산물을 증폭시키도록 고안된 프라이머 세트에 대해 중첩 PCR 반응을 수행하였다.
"엑손 3/6_순방향" 프라이머는 전체 길이 SCN9A mRNA에서 발견된 "엑손 3과 엑손 4의 연결 부위"보다 "엑손 3과 엑손 6의 연결 부위"를 더 선택적으로 인식한다. 프라이머의 서열은 전체 길이 SCN9A mRNA보다 엑손 4-5가 결여된 SCN9A의 스플라이스 변형체를 더 민감하게 탐지하도록 고안되었다. 그러한 엑손 스키핑 프라이머는 대사 안정성이 떨어지는 스플라이스 변형체를 탐지하는 데 유용할 것인 데, 전체 길이 SCN9A mRNA는 오랜 세월동안 진화를 통해 대사 안정성이 있을 것이다.
중첩 PCR 산물에 대한 전기영동 데이터를 도 14C에 제공하는 데, " ASO 7"로 처리한 세포에서 엑손 4-5의 스키핑이라고 할 수 있는 강한 PCR 밴드가 생성되었다. 엑손 스키핑의 PCR 산물은 생거 서열분석으로 엑손 4-5의 스키핑임을 확인하었다.
실시예 3. "ASO 7"로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가 (A).
PC3 세포에서 "ASO 7"이 인간 SCN9A mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 평가하였다.
[ASO 처리] PC3 세포에 대해 "ASO 7"을 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 또는 10 aM의 농도로 처리한 처리하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] "ASO 7"와 24 시간 동안 배양한 후에, 전체 RNA를 추출하고 "실시예 1"과 같이 원스텝 PCR 증폭을 하였다.
[중첩 qPCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 3_순방향: (5' 
3') TGACCATGAATAACCCAC; 및 엑손 4_역방향: (5' 
3') GCAAGGATTTTTACAAGT]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초. qPCR 반응은 전체 길이 SCN9A mRNA에서 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 [(5'→3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]의 택만 탐색으로 추적 관찰하였다.
도 15A에 제공된 바와 같이, "ASO 7"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 양이 약 35~45% 유의적으로 (독립표본 T 검정) 감소하였다.
실시예 4. "ASO 7"로 처리한 PC3 세포에서 SCN9A mRNA의 qPCR 평가 (B).
별다른 언급이 없으면 "실시예 3"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 " ASO 7"이 인간 SCN9A mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 평가하였다. cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성하였고 택만 탐색을 이용하여 SCN9A qPCR 반응을 수행하였다.
도 15B에 제공된 바와 같이, "ASO 7"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 양이 약 50~60%% 유의있게 (독립표본 T 검정) 감소하였다.
실시예 5. 쥐에서 L5/L6 척수신경결찰에 의한 척수 신경병증의 유도.
척수신경결찰은 (Spinal Nerve Ligation, SNL) 척수 신경절과 척수에서 신경병증을 유도하는 데, 신경성 통증의 모델로 널리 사용되고 있다 [Pain vol 50(3), 355-363 (1992)]. 척수 신경의 결찰 방법에 따라 다양한 SNL이 가능하며 척수 신경절에서 신경병증의 정도나 지속 기간도 신경의 결찰 방법에 따라 다양하다 [Pain vol 43(2), 205-218 (1990)]. 내부의 경험에 의하면, L5 척수 신경만 결찰하는 것보다 (즉, "L5 결찰") L5와 L6 척수 신경 둘 다를 결찰하는 것이 (즉, "L5/L6 결찰") 심하고 오래 지속되는 신경병증을 유도한다.
[L5/L6 결찰에 의한 SNL 수술] 졸레틸/럼푼으로 (zoletil/rompun) 마취한 수컷 SD쥐의 L5와 L6 척수 신경 다발을 (왼쪽) 단단히 묶고 적절한 무균 조건에서 근육과 피부를 봉합한다.
[신경성 통증의 유도] SNL 수술 6~7일 후에 결찰한 쪽의 발을 전자 폰프레이 지각검사계를 (von Frey anesthesiometer) [Model Number 2390, IITC Inc. Life Sciences] 이용하여 폰프레이 측정에 의해 아래에 기술한대로 자극하였다. 폰프레이 측정은 약리학적 평가를 위해 군분리를 할 때까지 매일 실시하였다.
[전자 폰프레이 측정] 플라스틱 우리 안에서 30분 정도 안정화한 후 폰프레이 측정을 위해 준비한 동물의 왼쪽 뒷 발에 대해서 몇 분 간격으로 6번 측정한다. 동물이 측정에 대해 아직 안정화되지 않았기 때문에 첫 번째 측정치는 제외하고, 나머지 다섯 번의 측정치 중에서 최고치와 최저치는 제외한다. 나머지 세 개의 측정치의 평균을 폰프레이 측정의 결과로 한다.
실시예 6. 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 7"에 의한 이질통의 경감 (1).
"ASO 7"은 쥐의 유전체 DNA에서 [NCBI 참고 서열: NC_000002.12] 유래한 쥐 SCN9A 프리-mRNA와 부분적으로 상보적인 14-머 SCN9A ASO로 표적 서열의 3'-말단에 한 개의 부정합이 있다. " ASO 7"의 13-머 표적 서열은 [(5' 
3') uuuc"c" uuuag ┃ GUACACUU UU]의 20-머 쥐 SCN9A 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시되어 있으며, 인트론 3에서 발견되는 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시된다.
L5/L6 결찰로 유도된 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 7"이 이질통을 경감하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[SNL 수술 및 군분리] 실험 10일 전에, 6주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 실험 4일전부터 폰프레이 측정에 의해 동물들을 매일 자극하였다. 날자 0에 동물 각자의 폰프레이 측정치에 기초하여 30마리를 선택하고 음성 대조군과 (즉 ASO 처리하지 않음), 1, 3, 그리고 6 pmole/Kg의 "ASO 7"을 처리한 세 개의 처리군으로 분리하였다 (군당 6 혹은 9마리).
[ASO 처리 및 폰프레이 측정] 날자 0, 2, 4, 6, 8 및 10의 오후에 0 (음성 대조군), 1, 3, 그리고 6 pmole/Kg의 "ASO 7"을 쥐에게 피하 투여하였다. 오전에, "실시예 5"에 기술한 전자 폰프레이 측정 방법으로 이질통을 측정하였다. ASO는 PBS에 녹여서 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"로 투여하였다.
[이질통의 경감] 도 16A는 폰프레이 측정의 관찰 결과를 요약한다. 음성 대조군의 동물들은 군분리후 12일 동안 약 6~7g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 (철수 한계치) 보였다. "ASO 7"은 날자 4 및 그 이후에 이질통을 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰다. 모든 투여군에서 치료 활성이 비슷했지만, 6 pmole/Kg 군에서는 첫번째 투여후 날자 2부터 치료 활성을 보이기 시작했다.
이번 평가에서는 비교 측정을 위한 양성 대조군이 없긴 했지만, 폰프레이 측정치 10~12g는 이 신경성 통증 모델에서 프레가발린 30 mg/Kg을 경구 투여한 쥐의 ("L5/L6 결찰") 내부 평가에서 흔히 관찰된 것이다. 따라서, 이 신경성 통증 모델에서는 1 내지 6 pmole/Kg의 "ASO 7"을 투여한 효능과 30 mg/Kg의 프레가발린을 투여한 효능은 유사하다.
실시예 7. 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 2"에 의한 이질통의 경감.
표 1에 명시된 "ASO 2"는 인간 SCN9A 프리-mRNA 중 [(5'→3') uugug uuuag ┃ GUACACUU UU]에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된 바와 같이 인트론 3과 엑손4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치와 완전히 상보적인 13-머 ASO다. "ASO 2"는 인트론 3과는 5-머를 그리고 엑손 4와는 8-머를 각각 오버랩한다. "ASO 2"의 표적 서열은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에서도 보존된다.
별다른 언급이 없으면 "실시예 6"과 같은 방법으로, L5/L6 결찰로 유도된 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 2"가 이질통을 경감하는 정도를 평가하였다.
[군분리 및 ASO 투여] 실험 16일 전에, 5주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) SNL 수술을 실시하였다. 날자 0에 30마리를 선택하고 음성 대조군과 (즉 ASO 처리하지 않음), 20 pmole/Kg QD (1회/일), 100 pmole/Kg QD, 500 pmole/Kg QD 및 100 pmole/Kg Q2D (1회/2일)의 "ASO 2"를 처리한 네 개의 처리군으로 분리하였다 (군당 6마리). QD와 Q2D의 투여 일정에 따라 날자 0에서 13에 "ASO 2"를 동물에게 피하 투여하였다. ASO는 PBS에 녹여서 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"로 투여하였다.
[이질통의 측정] 날자 0에서 14에, "실시예 5"에 기술한 폰프레이 측정 방법으로 이질통을 측정하였다. 날자 7에, 오른쪽 발의 (결찰하지 않은 쪽) 폰프레이 측정을 실시하였다.
[이질통의 경감] 도 16B는 폰프레이 측정의 관찰 결과를 요약한다. 음성 대조군의 동물들은 군분리후 14일 동안 약 6~8g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 보였다.
결찰한 쪽 발의 경우, 100 pmole/Kg QD 군을 제외한 20 pmole/Kg QD, 100 pmole/Kg Q2D 및 500 pmole/Kg QD 군에서 날자 1 및 그 이후에 이질통을 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰다. 그러나, 날자 14에는 100 pmole/Kg QD 군에서도 이질통이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감되었다.
결찰하지 않은 쪽 발의 경우, 날자 7에 ASO 투여군의 폰프레이 측정치가 음성 대조군의 측정치보다 높았다. 관찰된 측정치는 다음과 같다: 15.3 g (음성 대조군), 17.6 g (20 pmole/Kg QD), 19.2 g (100 pmole/Kg QD), 20.1 g (100 pmole/Kg Q2D), 그리고 19.5 g (500 pmole/Kg QD). 그러나, ASO 투여군과 음성 대조군 사이에 유의적인 차이는 없었다.
실시예 8. L5/L6 SNL로 활성화된 쥐의 L5 DRG 세포에서 "ASO 7"에 의한 나트륨 전류의 억제 평가.
세포의 나트륨 전류는 보통 패치클램프 (patch clamp)로 측정한다. 나트륨 이온이 세포 안으로 들어가면 세포내의 나트륨 이온의 양이 증가하는 데, 나트륨 이온의 양은 나트륨 이온에 반응하는 염료에 의해 탐색할 수 있다. "코로나 그린"은 (CoroNa Green) 크라운 에테르 형의 나트륨 이온 킬레이트제를 (chelator) 이용한 염료인 데, 나트륨 이온이 킬레이트화하면 "코로나 그린"은 녹색 형광을 발한다. "코로나 그린"은 세포내의 나트륨 이온의 양을 간접적으로 측정하는 데 사용되어 왔는 데, "코로나 그린"으로 측정한 나트륨의 양은 나트륨 이온 패치 클램프로 측정한 나트륨 이온 전류와 연관성이 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)].
쥐의 척수 신경절 세포에서 "ASO 7"이 나트륨 이온 전류를 하향조절하는 정도를 "코로나 그린"을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[DRG 추출] 날자 0에, 6주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) "실시예 5"와 같이 "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 4주에 걸쳐서 쥐에 대해 폰프레이 측정을 산발적으로 실시하였다. 날자 31에 낮은 폰프레이 측정치를 보이는 쥐를 희생시키고 왼쪽 (결찰한 쪽) 및 오른쪽 (결찰하지 않은 쪽) L5 DRG를 추출하였다. 추출 직후 DRG를 0.5 mL PBS에 담가 두었다.
[L5 DRG 신경 세포의 준비] DRG 세포는 문헌에 공개된 방법으로 준비하였으며 [Methods Mol Biol. vol 846, 179-187 (2012); PLOS One vol 8(4); e60558 (2013)], 다음과 같이 순서대로 간략히 기술한다: ① DRG를 0.2 mL 0.125% 콜라게나제 (콜라게나제 IV형, Cat. No. C5138-100MG, 시그마) HBSS 용액이 (Hank의 안정된 소금물, Cat. Number 14025-092, Life Technologies) 들어있는 1.5 mL e-튜브에 담그고, 가위로 가능한 잘게 자른 다음 37oC, 5% CO2, 그리고 95% RH (상대 습도) 조건의 CO2 배양기에서 20분간 배양한다; ② 50 μL 0.25% 트립신/EDTA를 e-튜브에 가하고 배양기에 10분간 배양한다; ③ e-튜브에 1 mL DMEM 배지를 넣고 600g에서 5분동안 원심침전시킨다; ④ 얻어진 펠릿을 2X B-27 (B-27® 무혈청 보충물, Cat. No. 17504-044, Gibco), 1X 페니실린- 스트렙토마이신, 그리고 1X L-글루타민이 보충된 4 mL Neurobasal-A 배양액에 (Neurobasal® 배양액, Cat. No. 21103-049, Gibco) 부유시킨 다음, 1 mL 세포 현탁액을 35 mm 배양 접시에 놓인 라미닌으로 코팅된 덮개 유리에 조심스럽게 살포하였다; ⑤ 살포 1일 후에 1 mL의 새 Neurobasal-A 배양액을 배양 접시에 가한다; ⑥ 살포 2일 후에, DRG 신경 세포 이외의 세포들의 성장을 선택적으로 억제하기 위하여 1 μM Ara-C가 (Cat. No. C1768-100MG, 시그마) 보충된 2 mL의 새 Neurobasal-A 배양액으로 배양액을 교체한다; ⑦ 살포 4일 후에, 1 μM Ara-C가 보충된 2 mL의 새 Neurobasal-A 배양액으로 배양액을 다시 교체한다; ⑧ 살포 5일 혹은 6일 후에, DRG 신경 세포를 "ASO7"로 처리한다.
[ASO 처리 및 코로나 분석] L5/L6 결찰을 한 혹은 L5/L6 결찰을 하지 않은 L5 DRG 신경 세포에 대해 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 7"을 처리하였다. 30 시간 후에, 세포를 2 mL의 HBSS로 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 37oC에서 세포를 5 μM "코로나 그린"으로 처리하고 30분 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 두 번 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 세포의 녹색 형광 영상을 계속 촬영하기 위하여 CCD 카메라가 구비된 형광 현미경 (모델 BX53, 올림푸스) 위에 배양접시를 올려 놓았다. 세포를 10 mM 소금물로 급속히 처리하고, 한 프레임당 즉 ASO 농도당 4~5 개의 세포가 들어간 세포의 형광 영상의 변화를 300 초간 촬영하였다. 각각 세포의 형광강도는 초 단위로 기록하였고, ImageJ 프로그램을 (버전 1.50i, NIH) 이용하여 평균을 내었으며, L5/L6 결찰을 한 혹은 L5/L6 결찰을 하지 않은 세포에 대한 평균값은 도 17A와 도 17B에 각각 제공된다. 형광강도 기록의 평균값은 0 (음성 대조용), 100, 그리고 1,000 zM의 "ASO 7"을 처리한 각 세포 내부의 나트륨 농도로 간주하였다.
[코로나 분석 결과] "L5/L6 결찰"로 (도 17A 참고) 자극이 가해진 세포에 대해 100 zM 혹은 1 aM의 "ASO 7"을 처리했을 때, 150초 후 시점에서 세포의 평균 형광강도가 (즉, 나트륨 전류) 80~85% 현저히 감소했다.
"L5/L6 결찰"이 없는 (도 17B 참고) 세포에 대해 1 aM의 "ASO 7"을 처리했을 때, 150초 후 시점에서 세포의 평균 형광강도가 약 50% 감소했지만, "L5/L6 결찰"로 자극이 가해진 세포에서와 같이 현저하지는 않았다. 더욱이, "L5/L6 결찰"이 없는 세포에 대해 100 zM의 "ASO 7"을 처리했을 때 나트륨 전류의 억제는 없었다.
신경병적인 자극이 없는 DRG 신경 세포는 Nav1.7, Nav1.8, Nav1.2 등을 포함한 다양한 아형의 VGSG를 발현한다고 알려져 있다. 자극이 없는 경우의 Nav1.7 아형은 DRG 신경 세포의 전체 나트륨 전류에서 제한된 비중만을 차지한다 [Nature Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)]. "L5/L6 결찰"이 없는 쥐의 DRG 신경 세포는 신경병증이 없는 그러한 DRG 신경 세포를 자극할 수도 있다. "L5/L6 결찰"이 없는 DRG 신경 세포에서 관찰된 나트륨 전류의 억제는 Nav1.7 아형 나트륨 전류의 제한된 비중을 반영했을 것이다.
반면에 신경 세포는 지속적인 신경병증이 있을 경우 Nav1.7 발현을 상향조절한다고 알려져 있다 [J Biol Chem. vol 279(28), 29341-29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)]. "L5/L6 결찰"한 쥐의 DRG 신경 세포는 신경병증이 있는 DRG 신경 세포를 자극할 수도 있다. "L5/L6 결찰"로 자극이 가해진 신경 세포에 대해 100 zM 혹은 1 aM의 "ASO 7"을 처리했을 때, 나트륨 전류가 80~85% 억제되었다. "L5/L6 결찰"을 한 DRG 세포에서 "ASO 7"에 의한 나트륨 전류의 강한 억제는 신경 세포에서 만성 신경병증에 의한 Nav1.7의 상향조절과 잘 상응한다.
"L5/L6 결찰"을 한/하지 않은 쥐의 DRG 신경 세포에서 관찰된 결과들을 종합해보면, "ASO 7"은 Nav1.7 아형의 발현을 선택적으로 억제한다고 결론내릴 수 있다. "ASO 7"은 신경병증이 없는 신경 세포에서보다 신경병증이 있는 신경세포에서 더 강하게 Nav1.7의 발현을 억제하는 것으로 보인다.
실시예 9. DPNP가 있는 쥐에서 "ASO 1"에 의한 이질통의 경감.
표 1에 명시된 "ASO 1"은 [(5'→3') uugug uuuag ┃ GUACACUUUUA CUGG]의 25-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된 바와 같이 인간 SCN9A 프리-mRNA 중 인트론 3과 엑손4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치와 완전히 상보적인 16-머 ASO다. "ASO 1"은 인트론 3과는 5-머를 그리고 엑손 4와는 11-머를 각각 오버랩한다. "ASO 1"은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에 대해서도 완전히 상보적이다.
쥐에서 "ASO 1"이 당뇨병성 말초 신경병성 통증으로 (DPNP) 유발된 이질통을 경감하는 정도를 평가하였다.
[DPNP 유도와 군 분리] 시트레이트 완충용액 (pH 6)에 녹인 스트렙토조신 (streptozotocin) 60 mg/Kg을 약 200g의 수컷 SD쥐에게 복강 내로 투여하였다 [J. Ethnopharmacol. vol 72(1-2), 69-76 (2000)]. 날자 10에 DPNP 쥐를 음성 대조군 (PBS만) 및 "ASO 1" 100 pmole/Kg의 두 군으로, 아래에 기술한 폰프레이 마이크로필라멘트를 이용한 각 동물들의 폰프레이 측정치를 기준으로, 무작위 분리하였다 (군당 8마리).
[업&다운 방법에 의한 폰프레이 측정] 이질통은 폰프레이 마이크로필라멘트 세트를 (Touch Test®) 이용하여 "업&다운" 방법으로 평가하였다 [J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63 (1994)].
[ASO 투여와 폰프레이 측정] PBS에 녹인 "ASO 1"을 날자 11, 13, 15, 17, 그리고 19에 쥐에게 피하 투여하였고 이질통 측정은 투여 일 투여 2시간 후에 실시하였고, 마지막 투여 후 치료 활성의 지속 기간을 평가하기 위하여 날자 21 및 23에 추가로 측정을 실시하였다.
[이질통의 경감] 관찰된 폰프레이 측정치는 도 18A에 요약된다. 음성 대조군의 동물들은 날자 10~23에 걸쳐서 약 6~7g의 안정된 평균 폰프레이 한계치를 보였다.
"ASO 1" 100 pmole/Kg을 투여한 동물들에서는, 날자 11 첫 번째 투여 2시간 후에 이질통이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 약 80% 경감되었다. 날자 19까지 ASO를 반복해서 투여함에 따라 치료 활성은 약 90%까지 증가하였다. 마지막 투여 2일 후, 즉 날자 21에 모든 치료 활성이 완전히 사라진 것을 보면, "ASO 1"의 약역학적 반감기는 2일 1회 (Q2D) 투여 일정에 대해 충분히 길지않다.
그렇지만, 날자 11의 폰프레이 측정치를 보면 이질통을 경감시키는 "ASO 1"의 반응 시간은 몇 시간 정도이다.
실시예 10. DPNP가 있는 쥐에서 "ASO 2"와 "ASO 6"에 의한 이질통의 경감.
표 1에 명시된 "ASO 6"은 [(5'→3') uugug uuuag ┃ GUACACUU UUACUGG]의 25-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된 바와 같이 인간 SCN9A 프리-mRNA 중 인트론 3과 엑손4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치와 상보적으로 결합하는 13-머 ASO다. "ASO 6"은 인트론 3과는 5-머를 그리고 엑손 4와는 8-머를 각각 오버랩한다. "ASO 2"와 "ASO 6"은 인간 SCN9A 프리-mRNA에 대해서 같은 서열을 표적하지만, 상보적인 RNA에 대해서 "ASO 6"가 "ASO 2"보다 강한 결합력을 가진 것으로 생각된다.
별다른 언급이 없으면 "실시예 9"와 같이, 쥐에서 "ASO 2"와 "ASO 6"이 당뇨병성 말초 신경병성 통증으로 (DPNP) 유발된 이질통을 경감하는 정도를 평가하였다.
실험 10일 전에 스트렙토조신 (streptozotocin) 60 mg/Kg을 6주령 수컷 SD쥐에게 (할란 랩, 이탈리아) 복강 내로 주사하여 당뇨병을 유도하였다.
[DPNP 유도와 군 분리] 날자 0에 가장 낮은 폰프레이 측정치를 보인 동물 18마리를 선택하고 음성 대조군 (PBS만), "ASO 2" 60 pmole/Kg 및 "ASO 6" 30 pmole/Kg의 세 군으로 분리하였다 (군당 6마리).
[ASO 투여와 폰프레이 측정] PBS를 혹은 PBS에 녹인 ASO를 날자 0, 2, 그리고 4에 쥐에게 피하 투여하였고 이질통 측정은 "실시예 5"와 같이 전자 폰프레이 방법으로 실시하였다.
[이질통의 경감] 관찰된 폰프레이 측정치는 도 18B에 요약된다. 음성 대조군의 동물들은 날자 0~9에 걸쳐서 약 10~12g의 안정된 평균 폰프레이 한계치를 보였다.
"ASO 2" 60 pmole/Kg을 투여한 동물들에서는, 이질통이 점점 경감되어 날자 0의 첫번째 투여 이후 날자 4에는 당뇨병성 신경병증이 없는 (즉, 내부의 한계치 기록에 의하면 완전한 회복) 단계에 도달했다. 치료 활성은 날자 4의 마지막 투여 후 3일이 지나서도 유의적으로 (독립표본 T 검정) 유지되었다.
"ASO 6" 30 pmole/Kg을 투여한 동물들에서는, 치료 활성은 날자 2에 유의적으로 (독립표본 T 검정) 최고에 달했고 날자 4의 마지막 투여 후 4일이 지나서도 유지되었다. 즉, "ASO 6"가 "ASO 2"보다 더 강력하게 이질통을 경감하였다. "실시예 9"의 "ASO 1"과 달리, "ASO 6"의 치료 활성 유지 기간은 쥐에서 주당 2회의 투여 일정에 대해 충분히 길었다.
[기타 사항] 당뇨병이 지속되는 동안, 음성 대조군의 동물들은 폰프레이 측정중 육체적으로 붕괴되는 조짐이 보였다. 투여군의 동물들은 생생했고 폰프레이 측정에 잘 반응하였는 데, 이는 ASO의 치료 활성과 잘 일치한다.
실시예 11. 쥐의 포르말린 시험에서 "ASO 7"의 진통제 활성.
20 μL의 2% 포르말린을 발바닥에 주사하여 유도된 통증은 전체적인 SCN9A KO 쥐에서는 현저하게 감소하였다. 억제 정도는 I 단계 (포르말린 주사후 0~10분) 및 II 단계에서 (포르말린 주사후 15~45분) 각각 73% 및 86%였다 [PLoS One vol 9(9), e105895 (Sep 2014)].
"ASO 7"은 쥐의 SCN9A 프리-mRNA의 5'-말단에 한 개의 부정합이 있는 데, 쥐의 포르말린 시험에서 진통제 활성을 다음과 같이 평가하였다.
[군 분리 및 ASO 투여] 실험 6일 전에 6주령 수컷 SD 쥐 (할란 랩, 이탈리아) 24마리를 음성 대조군과 (ASO 투여 없음), 10, 30 및 100 pmole/Kg의 "ASO 7" 투여군의 네 군으로 분리하였다 (군당 6마리). 실험 6일전 및 2일전에 PBS에 녹인 "ASO 7"을 각 동물들에게 피하 투여하였다.
[포르말린 시험] 날자 0에 50 μL의 5% 포르말린을 왼쪽 뒷발에 주사하여 급성 통증을 유도하였다. 포르말린 주사 직후부타 각각의 쥐에 대해 한 시간 동안 비디오 촬영을 하였다. 각 동물의 통증 반응을 눈으로 측정하기 위하여 비디오를 재생하였다.
[진통제 활성] 포르말린 주사후 여러 시간대에 관찰된 군별 통증 측정치는 도 19A에 요약된다. II 단계에서 (10~40분 사이의 AUC) 10, 30 및 100 pmole/Kg의 투여군에 대해 통증 반응이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 각각 33%, 36% 및 32% 감소하였다. 반면에, I 단계에서 (0~10분 사이의 AUC) 10, 30 및 100 pmole/Kg의 투여군에 대해 통증 반응이 통계적 유의성 없이 각각 14%, 40% 및 43% 감소하였다.
실시예 12. 쥐의 포르말린 시험에서 "ASO 10"의 진통제 활성.
표 1에 명시된 "ASO 10"은 [(5'→3') uugu"g" uuuag ┃ GUACACUU UUACU-GG]의 25-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된 바와 같이 표적 프리-mRNA의 5'-말단에 한 개의 부정합을 가진 인간 SCN9A 프리-mRNA에 부분적으로 상보적인 14-머 ASO로, 인트론 3에 위치한 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시되었다. 반면에, "ASO 10"은 [(5'→3') uuuc cuuuag ┃ GUACACUU- UU]의 20-머 쥐 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된 바와 같이 쥐 SCN9A 프리-mRNA 중 인트론 3과 엑손4의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치와 완전히 상보적으로 결합한다. "ASO 10"은 인트론 3과는 6-머를 그리고 엑손 4와는 8-머를 각각 오버랩한다.
별다른 언급이 없으면 "실시예 11"과 같이, 쥐의 포르말린 시험에서 "ASO 10"의 진통제 활성을 다음과 같이 평가하였다.
[군 분리 및 ASO 투여] 7주령 수컷 SD 쥐 (할란 랩, 이탈리아) 36마리를 음성 대조군과 (ASO 투여 없음), 15, 50 및 150 pmole/Kg의 "ASO 10" 투여군의 네 군으로 분리하였다 (군당 9마리). 실험 6일전 및 2일전에 PBS에 녹인 "ASO 10"을 각 동물들에게 피하 투여하였다.
[진통제 활성] 포르말린 주사후 여러 시간대에 관찰된 군별 통증 측정치는 도 19B에 요약된다. II 단계에서 (10~40분 사이의 AUC) 15 및 50 pmole/Kg의 투여군에 대해 통증 반응이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 각각 17% 및 41% 감소하였다. 반면에, I 단계에서 (0~10분 사이의 AUC) 15 및 50 pmole/Kg의 투여군에 대해 통증 반응이 유의적으로 각각 38% 및 50% 감소하였다.
흥미롭게도, 150 pmole/Kg의 투여군은 단계 I 및 단계 II 모두에서 치료 활성을 나타내지 못했다. "ASO 10" 150 pmole/Kg은, "ASO 10"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사상향 조절을 유도할 정도로 과용량일 것이다 [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
실시예 13. 포르말린을 발바닥에 주사한 쥐에서 "ASO 7"에 의한 L5 DRG에서의 Nav1.7 발현의 억제.
포르말린을 발바닥에 주사한 수컷 SD 쥐의 L5 DRG에서 "ASO 7"이 Nav1.7 발현을 억제하는 정도를 면역조직화학으로 (IHC, immunohistochemistry) 다음과 같이 평가하였다.
[ASO 투여 및 포르말린 주사] 실험 5일 전에 6주령 수컷 SD 쥐를 (할란 랩, 이탈리아) 음성 대조군과 (ASO 투여 없음), 1, 6 및 30 pmole/Kg의 "ASO 7" 투여군의 네 군으로 분리하였다. 실험 5일전 및 1일전에 PBS로 희석한 "ASO 7"을 각 동물들에게 피하 투여하였고, 날자 0에 50 μL의 5% 포르말린을 발바닥에 주사 하였다.
[L5 DRG 추출 및 Nav1.7 IHC] 날자 8에, 포르말린을 주사한 쪽의 L5 DRG를 샘플링하기 위해 쥐를 졸레틸/롬펀으로 마취하였다 (군당 2마리). DRG 샘플에 대해, 다음에 간략히 서술한 바와 같이 Nav1.7 IHC를 실시하였다.
DRG 샘플을 동결 절단하고 (cryosection) 빨간 형광 표지를 위해 500배 묽힌 1차 안티-Nav1.7 항체 (Cat. No. ASC-008, Alomone), 200배 묽힌 2차 안티-IgG 항체 (Cat Number BA-1100, Vector), 그리고 200배 묽힌 Dylight 594-스트렙타비딘을 (Cat Number SA-5594, Vector, CA, USA) 차례로 사용하여 면역염색하였다. IHC 이미지는 DRG에서 Nav1.7 발현을 평가하기 위하여 자이스 슬라이드 스캐너에 포착되었다.
[L5 DRG에서 Nav1.7 발현의 억제] 도 20A에서는 대표적인 군별 Nav1.7 IHC 이미지를 제공한다. ASO 투여군에서 보다 음성 대조군에서, DRG에서 Nav1.7 발현이 매우 높았다.
각 IHC 이미지의 빨간 색의 양은 NIH 이미지J 프로그램을 사용하여 디지털 측정을 하였으며, 각각의 양은 군별로 통계 분석하였다 (군당 2마리). 도 20B는 군별 디지털 정량한 Nav1.7 발현량을 요약한다. Nav1.7 발현량은 모든 ASO 투여군에서 유의적으로 (독립표본 T 검정) 약 50~60% 감소하였다.
실시예 14. 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 10"에 의한 이질통의 경감 (1).
별다른 언급이 없으면 "실시예 6"과 같이, "L5/L6 결찰"로 유도된 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 10"이 이질통을 경감하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[군분리] 실험 14일 전에, 5주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 날자 0에 동물 각자의 폰프레이 측정치에 기초하여 36마리를 선택하고 음성 대조군과 (즉 ASO 처리하지 않음), 1, 3, 그리고 10 pmole/Kg의 "ASO 10"을 처리한 세 개의 처리군으로 분리하였다 (군당 9마리).
[ASO 처리 및 폰프레이 측정] 날자 0, 3 및 7에 0 (음성 대조군), 3, 그리고 10 pmole/Kg의 "ASO 10"을 쥐에게 피하 투여하였다. 1 pmole/Kg 투여군의 경우, 날자 2 및 3에 1 pmole/Kg의 치료 활성이 없어서, 처음에는 날자 0에 1 pmole/Kg을 투여하고 날자 3 및 7에는 투여량을 30 pmole/Kg로 올렸다.
[이질통의 경감] 도 21A는 폰프레이 측정의 관찰 결과를 요약한다. 음성 대조군의 동물들은 군분리후 9일 동안 약 6~7g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 (철수 한계치) 보였다.
3~30 pmole/Kg의 "ASO 10"은 일주일에 걸쳐서 이질통을 첨차적으로 유의성있게 경감시켰다. 모든 투여군에서 치료 활성의 최고치는 폰프레이 측정치 약 13g였다.
그러나 1 pmole/Kg 투여군의 경우, 날자 3에 투여량을 1 pmole/Kg에서 30 pmole/Kg로 올린 후에 치료 활성이 올라가기 시작했다. 만약 약 18g가 "L5/L6 결찰"을 하지 않은 폰프레이 측정치의 한계치라고 하면, 이질통은 날자 6에 유의적으로 약 40% 경감되었다. 진통제 효능은 날자 8에 약 60%로 증가하였다.
3 pmole/Kg 투여군의 경우, 날자 6에 약 40~50%의 보통 수준으로 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰다. 치료 효능은 날자 8에 약 65+%로 증가하였다.
10 pmole/Kg 투여군의 경우, 날자 4에 유의적으로 (독립표본 T 검정) 약 25~30% 경감시켰다. 치료 효능은 날자 9에 약 60%로 증가하였지만, 날자 6부터는 효능이 그 수준으로 유지되고 더 증가하지 않았다.
실시예 15. 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 10"에 의한 이질통의 경감 (2).
별다른 언급이 없으면 "실시예 6"과 같이, "L5/L6 결찰"로 유도된 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 10"이 이질통을 경감하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[군분리] 실험 10일 전에, 6주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 날자 0에 동물 각자의 날자 0의 폰프레이 측정치에 기초하여 36마리를 선택하고 음성 대조군과 (즉 ASO 처리하지 않음), 4일 혹은 5일에 100 pmole/Kg ASO 한 번 투여 그리고 양성 대조군으로 30 mg/Kg의 프레가발린을 처리한 네 개의 군으로 분리하였다 (군당 9마리).
[ASO 처리 및 폰프레이 측정] 날자 0 및 4에 0 (음성 대조군) 및 100 pmole/Kg의 "ASO 10"을 그리고 날자 0 및 5에 100 pmole/Kg의 "ASO 10"을 오후에 쥐에게 피하 투여하였다. 이질통은 매일 오전에 측정하였고, 양성 대조군의 쥐에 대해서는 폰프레이 측정 한 시간 전에 30 mg/Kg의 프레가발린을 경구 투여하였다. ASO는 PBS에 녹여 투여하였다.
[이질통의 경감] 도 21B는 관찰된 폰프레이 측정치를 요약한다. 음성 대조군의 동물들은 첫 번째 ASO 투여후 7일 동안 약 6~7g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 (철수 한계치) 보였다. 30 mg/Kg의 프레가발린 투여군의 쥐는 10~11g의 평균 폰프레이 측정치를 보이며 날자 7에는 진정 효과에 의해 13g의 측정치가 관찰되었다.
4일마다 ASO를 투여한 군의 경우, 날자 3, 6 및 7에 모든 경우에서 이질통을 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰으며, 날자 3 및 6에서는 30 mg/Kg의 프레가발린 투여군보다 유의적으로 우수했다. 즉, 30 mg/Kg의 프레가발린 보다 우수한 치료 활성을 유지하기 위해서는 4일에 한 번 투여하는 주기가 적당해 보인다. 날자 8에 내부 기록상 척수 신경병증이 없는 기저 수준의 약 90%가 경감되었다.
5일마다 ASO를 투여한 군의 경우, 날자 3, 6 및 7에 모든 경우에서 이질통을 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰으며, 날자 3에서만 30 mg/Kg의 프레가발린 투여군보다 유의적으로 우수했다. 즉, 30 mg/Kg의 프레가발린 보다 우수한 치료 활성을 유지하기 위해서는 5일의 투여 주기는 길어 보인다.
[척수에서의 Nav1.7 발현] 날자 7에, 동물을 졸레틸/롬펀으로 희생시키고, 척수의 구조를 온전하게 보존하기위해 포르말린이 첨가된 PBS로 처리하여 샘플링하였다 (군당 3 샘플). 척수의 샘플로 파라핀 블록을 만들고 Nav1.7 발현을 (붉은 염색) 보기 위해 Nav1.7 항체로 (Cat. No. ASC-008, Alomone) 그리고 신경 세포체를 (녹색 염색) 보기 위해 Neu 항체로 (Cat. No. Ab104224, Abcam) 연속하여 IHC를 실시하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색하였다.
도 22는 자이스 슬라이드 스캐너로 퍼착한 IHC 이미지를 제공한다. 음성 대조군에 비해 날자 0 및 4에 ASO를 투여한 군의 척수 샘플에서 Nav1.7 발현이 현저하게 감소하였다. 즉, 피하 투여한 ASO는 척수에 쉽게 분포되어 Nav1.7 발현을 억제하는 것으로 보인다.
실시예 16. 쥐의 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"에 의한 Nav1.7 발현의 억제.
쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"이 Nav1.7 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[L5 DRG 신경 세포 준비] "실시예 5"와 같이, 7주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩, 이탈리아) 강한 "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 7일 후에, 결찰한 쪽의 L5 DRG를 추출하기 위해 4마리의 쥐를 졸레틸/럼푼으로 마취하였다. DRG 신경 세포를 준비하기 위하여 "실시예 8"과 같이 DRG를 모아서 처리하였다.
[ASO 투여] DRG 신경 세포를 "ASO 10" 0 (음성 대조군), 10, 100 혹은 1,000zM로 24시간 처리한 다음 Nav1.7 단백질의 C-말단을 탐색하는 Nav1.7 항체에대한 (Cat. No. ab85015, Abcam) 웨스턴 블럿을 위해 용해하였다. β-액틴은 참고로 탐색되었다. "ASO 10" 저장 용액은 DDW에 녹여 배양액에 가해졌다.
[Nav1.7 발현의 억제] 도 23A는 "ASO 10" 0 (음성 대조군), 10, 100 혹은 1,000zM을 처리한 DRG 신경 세포에서 얻은 웨스턴 블럿 데이터를 제공한다. 모든 용해액은 170~200K에서 강한 밴드를 생성하는 데, 이는 Nav1.7 단백질의 대사체일 것이다. 220~240K의 전체 길이 Nav1.7 단백질 밴드는 음성 대조군 및 10 zM "ASO 10"의 용해액에서만 탐지되었다. 즉, 100에서 1,000 zM "ASO 10"를 투여 후 24시간 배양한 쥐 DRG 신경 세포에서 Nav1.7 발현은 완전히 억제되었다.
"ASO 10"은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에 완전히 상보적인 14-머 ASO인 반면에, "ASO 7"은 인간 SCN9A 프리-mRNA에 완전히 상보적인 14-머 ASO다. 쥐 신경 세포에서 "ASO 10"의 SCN9A 억제 효과로부터 인간 신경 세포에서 "ASO 7"의 SCN9A 억제 효과를 예측가능하게 추론할 수 있다.
실시예 17. "ASO 10"을 처리한 쥐의 DRG 신경 세포에서 원스텝 PCR로 합성한 cDNA에 의한 qPCR 평가 .
쥐의 DRG 세포에서 "ASO 10"이 쥐 SCN9A mRNA의 발현량의 변화를 유도하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[DRG L5 신경 세포 준비] 6주령 수컷 SD 쥐를 (할란 랩, 이탈리아) L5 DRG를 추출하기 위해 졸레틸/럼푼으로 마취하였다. L5 DRG 신경 세포를 준비하기 위하여 "실시예 8"과 같이 DRG를 처리하였다.
[ASO 투여] 쥐 L5 DRG 신경 세포를 "ASO 10" 0 (음성 대조군), 10, 30, 100 혹은 300zM로 처리하였다 (ASO 농도당 1 배양 접시). "ASO 10" 저장 용액은 DDW에 녹여 배양액에 가해졌다.
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] "ASO 10"과 24 시간 동안 배양한 후에, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 2_순방향: (5' 
3') CAATCTTCCGTTTCAACGCC; 및 엑손 10_역방향: (5' 
3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT]의 유전자-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝 RT-PCR 키트를 (Invitrogen, USA) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.
[중첩 qPCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를 (ASO 농도당 2개), 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라, SCN9A 프리-mRNA의 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 택만 탐색을 (Cat. No. Rn01514993_mH, ThermoFisher) 이용하여 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95℃ 5초 및 60℃ 30초.
도 23B의 왼쪽 그림은 관찰된 qPCR 데이터를 요약하는 데, "ASO 10"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 양이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 약 50~60% 감소하였다.
실시예 18. "ASO 10"을 처리한 쥐의 DRG 신경 세포에서 무작위 헥사머로 합성한 cDNA에 의한 qPCR 평가.
쥐의 L5 DRG 세포에서 "ASO 10"이 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다. 전체 RNA를 "실시예 17"과 같이 준비한 다음, 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 100배 희석한 1 μL의 cDNA를 (ASO 농도당 2개) 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라, SCN9A 프리-mRNA의 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 택만 탐색을 이용하여 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95℃ 5초 및 60℃ 30초.
cDNA 용액은 GAPDH mRNA에 대해서도 qPCR 증폭을 하였으며, SCN9A mRNA의 Ct 값은 GAPDH mRNA의 Ct 값에 대하여 정규화하였다.
도 23B의 오른쪽 그림은 GAPDH에 대해 정규화된 SCN9A qPCR 데이터를 요약하는 데, "ASO 10"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA 발현량이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 약 45~75% 감소하였다.
실시예 19. L5 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"에 의한 나트륨 전류의 억제 평가 (1).
쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"이 나트륨 전류를 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[DRG 신경 세포의 준비] 5주령 수컷 SD 쥐에 대해 (대한 바이오링크, 한국, www.dbl.co.kr) "실시예 5"와 같이 강한 "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 결찰 10~14일 후에, 결찰한 쪽의 L5 DRG를 추출하기 위해 졸레틸/롬펀으로 쥐를 마취하였다. L5 DRG 신경 세포는 다음과 같이 준비하였다: ① 쥐에서 급속히 추출한 L5 DRG를 0.2 mL 0.125% 콜라게나제 (콜라게나제 IV형, Cat. No. C5138-100MG, 시그마) HBSS 용액이 (Hank의 안정된 소금물, Cat. Number 14025-092, Life Technologies) 들어있는 1.5 mL e-튜브에 옮기고, 가위로 가능한 잘게 자른 다음 37oC, 5% CO2, 그리고 95% RH (상대 습도) 조건의 CO2 배양기에서 20분간 배양한다; ② 50 μL 0.25% 트립신/EDTA를 e-튜브에 가하고 배양기에 10분간 배양한다; ③ e-튜브에 1 mL DMEM 배지를 넣고 600g에서 5분동안 원심침전시킨다; ④ 얻어진 펠릿을 15 mL Neurobasal-A 배양액이 있는 팔콘 튜브에 옮겨 부유시키고 밀봉한 다음; ⑤ 0.5 mL 세포 현탁액을 24-웰 플레이트 배양 접시의 한 웰에 놓인 라미닌으로 코팅된 덮개 유리에 조심스럽게 살포하였다; ⑥ 세포가 덮개 유리에 잘 부착되도록 배양 플레이트를 37℃ CO2 배양기에서 2시간 동안 배양한다.
[ASO 처리] 위와 같이 준비한 L5 DRG 신경 세포에 대해 0 (음성 대조용), 10, 30, 혹은 100 zM의 "ASO 10"을 처리하고 4시간 동안 배양하였다. ASO 저장 용액은 0.1% (v/v) 트윈80이 첨가된 DDW에 녹여 준비하였다. 각 저장 용액은 (음성 대조군의 경우 용매만) 패치클램프 분석시 트윈80이 0.0001% (v/v)가 되도록 배양액에 가해졌다.
[수동 패치클램프 분석] DRG 신경 세포에 대해 나트륨 패치클램프 기기를 (Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments) 이용하여 수동 나트륨 전류 패치클램프 분석을 실시하였다. 패치클램프 분석은 보통 4시간이 걸리므로 세포에 대해 ASO를 4~8시간 처리한 것으로 여겨진다 (즉, 평균 6시간).
[데이터 수집 및 분석] 각 ASO 투여량의 군별 통계적 유의성을 높이기 위하여 상기의 실험을 독립적으로 반복하였으며, TTX (테트로도톡신)에 저항성이 없는 세포에서 얻은 나트륨 전류 데이터만 통계 분석에 사용되었다.
도 23C는 DRG 신경 세포의 세포 크기에 대해 정규화된 모아진 나트륨 전류의 데이터를 요약한다. ASO의 농도가 10 zM에서 100 zM로 증가할수록 나트륨 전류는 점차 감소하였다. 100 zM의 "ASO 10"을 평균 약 6시간 처리한 세포에서 나트륨 전류는 유의하게 약 40% 감소하였다. DRG 신경 세포가 Nav1.7외에 다른 아형의 전위차 나트륨 이온 채널도 발현하는 것을 고려하면, 100 zM의 "ASO 10"가 나트륨 전류를 약 40% 감소시킨 것은 "ASO 10"가 Nav1.7를 매우 현저하게 제어한다고 할 수 있다.
실시예 20. L5 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"에 의한 나트륨 전류의 억제 평가 (2).
여러 공급처의 쥐를 내부에서 평가해보면 L5 DRG에서 Nav1.7 발현량은 나이와 공급처에 따라 매우 다르다. 여러 공급처의 쥐 L5 DRG 신경 세포에서 "ASO 10"이 나트륨 전류를 억제하는 정도를, 별다른 언급이 없으면 "실시예 19"와 같이 평가하였다.
[DRG 신경 세포의 준비] 5주령 수컷 SD 쥐에 대해 (할란 랩/엔비고, 덴마크) "실시예 5"와 같이 강한 "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 결찰 10~14일 후에, 결찰한 쪽의 L5 DRG를 추출하기 위해 졸레틸/롬펀으로 쥐를 마취하였다. L5 DRG 신경 세포는 다음과 같이 준비하였다.
[ASO 처리] 위와 같이 준비한 L5 DRG 신경 세포에 대해 0 (음성 대조용) 100 zM의 "ASO 10"을 처리하고 4시간 동안 배양하였다. ASO 저장 용액은 DDW에 녹여 준비하였다.
100 zM의 "ASO 10"을 평균 약 6시간 처리한 세포에서 세포 크기에 대해 정규화된 나트륨 전류는 유의하게 (p < 0.05) 약 55% 감소하였다 (음성 대조군 N=14; 100 zM의 "ASO 10" N=15). 이 실시예의 음성 대조군에 대해 정규화된 나트륨 전류는 "실시예 19"보다 37% 높다. 즉, DRG 신경 세포에서의 나트륨 전류에서 Nav1.7가 차지하는 공헌도에 대해, "실시예 19"의 대한 바이오링크에서 공급받은 쥐보다 이 실시예의 할란 랩에서 공급받은 쥐가 상당히 높을 것이다.
실시예 21. 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 7"에 의한 이질통의 경감 (2).
L5/L6 결찰로 유도된 척수 신경병증이 있는 쥐에서 "ASO 7"이 이질통을 경감하는 정도를, 별다른 언급이 없으면 "실시예 6"과 같이 평가하였다.
[SNL 수술 및 군분리] 실험 10일 전에, 5주령 수컷 SD 쥐에 대해 (대한 바이오링크, 한국, www.dbl.co.kr) "L5/L6 결찰"을 실시하였다. 날자 0에, 동물 각자의 날자 0의 가장 낮은 폰프레이 측정치에 기초하여 48마리를 선택하고 음성 대조군과 (즉 ASO 처리하지 않음), 프레가발린 30 mg/Kg, 5, 25, 125 그리고 625 fmole/Kg의 "ASO 7"을 처리한 4 개의 처리군, 총 6 군으로 분리하였다 (군당 8마리).
[ASO 처리 및 폰프레이 측정] 날자 0, 3, 6 및 9의 오후에 0 (음성 대조군), 5, 25, 125 그리고 625 fmole/Kg의 "ASO 7"을 쥐에게 피하 투여하였다. 오전에, "실시예 5"에 기술한 전자 폰프레이 측정 방법으로 이질통을 측정하였다. 프레가발린은 폰프레이 측정 한 시간 전에 경구 투여하였고, ASO는 0.1% 트윈80이 첨가된 PBS에 녹여서 투여하였다.
[이질통의 경감] 도 24A는 폰프레이 측정의 관찰 결과를 요약한다. 음성 대조군의 동물들은 날자 4~8에 약 6g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 (철수 한계치) 보였다. 반면에 프레가발린 30 mg/Kg군은 (양성 대조군) 약 10g의 안정된 평균 폰프레이 측정치를 보였다. 결찰 및 처리를 하지 않은 동물에서 관찰된 폰프레이 측정치가 21g인 것을 고려하면, 프레가발린 처리군에서 날자 2, 4 및 6에 이질통이 유의하게 20~30% 경감되었다.
"ASO 7"은 날자 2~8에 5 fmole/Kg 군에서, 날자 2, 4 및 6에 25 및 125 fmole/Kg 군에서 그리고 날자 4 및 6에 625 fmole/Kg 군에서 이질통을 유의적으로 (독립표본 T 검정) 경감시켰다. 모든 투여군에서 치료 활성이 비슷했지만, 5 fmole/Kg 군의 활성이 가장 강했다. 프레가발린 또한 날자 2~8에 유의적으로 20~30% 이질통을 경감하였다. 모든 투여군에서 치료 활성이 비슷했지만, 가장 강한 활성을 보인 5 fmole/Kg 군은 약 40% 이질통을 경감하였다. 그러나. ASO 투여군의 효능은 프레가발린 투여군의 효능과 유의적으로 다르지 않다.
실시예 22. 쥐의 아만성 염증성 통증에 대한 "ASO 2"의 진통 효과.
쥐에서 프로인드 완전 보강제를 (Freund's complete adjuvant, FCA) 족부 주사해서 야기된 아만성 염증성 통증을 "ASO 2"가 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[아만성 염증 유도] 실험 시작 17일 전에 7주령 수컷 SD 쥐의 왼쪽 뒷발에 100 μL FCA를 (Cat. No. F5881-6X10ML, Sigma) 족부 주사했다.
[염증성 통증 측정 및 군 분리] 왼쪽 뒷발의 염증성 통증은 전자 란달-셀리토 (Randall-Selitto) 기기를 (Model 2390, IITC Life sciences) 사용한 란달-셀리토 시험으로 측정하였다. 쥐들은 통증 측정 전에 해먹에서 10분 동안 적응기를 가졌다 (군당 5마리).
날자 0에, 며칠 동안 가장 낮은 통증 한계치를 안정적으로 보인 10마리를 선택하고, 음성 대조군 (ASO 처리 없음) 및 처리군의 ("ASO 2" 100 pmole/Kg)
두 군으로 분리하였다.
[ASO 투여 및 통증 측정] 투여군의 동물에게 "ASO 2" 100 pmole/Kg을 날자 0의 오후 및 날자 1의 아침에 투여하였다. ASO는 PBS에 녹여서 피하 투여하였다. 날자 1의 투여 2시간 후에 그리고 날자 4의 아침에 통증을 측정하였다.
[진통 활성] 도 24B는 관찰된 통증 측정치를 요약한다. 날자 1에 ASO 투여군의 통증 한계치가 약 27g로 날자 0에 비해 증가한 반면, 음성 대조군의 한계치는 3g로 감소하였다. 발의 부종을 유도하기 전의 통증 한계치는 약 23g였다. 즉, ASO의 투여는 염증성 통증을 발의 부종이 없는 수준으로 완전히 경감시켰다. 그러나, "ASO 2"의 진통 활성은 날자 4에 완전히 사라졌다.
Claims (24)
- 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다. - 제 2항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 및 수소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 중에서 선택된다. - 제 2항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn 중의 최소한 한 개는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고/또는
Z는 치환체가 있거나 없는 알킬 및 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11과 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다. - 제 5항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 5항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y 중의 최소한 한 개는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다. - 제 8항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 8항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y 중의 최소한 한 개는 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다. - 제 11항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 11항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y 중의 최소한 한 개는 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아실 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다. - 제 14항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 14항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
X와 Y 중의 최소한 한 개는 치환체가 있거나 없는 아릴아실 중에서 각자 독립적으로 선택된다. - 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SCN9A 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5'3') UGUUUAGGUACACU]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 선택되며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 CH2-O-(CH2)5- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다. - 제 17항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실 및 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 선택된다. - 제 17항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
Y는 치환체가 있거나 없는 아릴아실이다. - 제 1항에 있어서, 아래에 제공된 펩타이드 핵산 유도체들 중에서 선택된 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Benzoyl-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Benzenesulfonyl-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N→C) Methyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N→C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N→C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N→C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)- TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) N,N-Phenyl-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Propyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Benzoyl-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH2;
(N→C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Methylsulfonyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexanoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) n-Hexanoyl-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N→C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Benzoyl-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Propionyl-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N→C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2; 그리고,
(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다;
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; "n-Hexanoyl-"는 "n-헥사노일-"; " Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "n-Hexyl-"은 "1-(n-헥실)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "Benzenesulfonyl"은 "벤젠-1-설포닐-"; "Methylsulfonyl"은 "메틸-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-";"-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다. - 제 1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 Nav1.7 활성과 관련된 질환 또는 통증을 치료하는 방법.
- 제 1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 만성 통증을 치료하는 방법.
- 제 1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 신경성 통증을 치료하는 방법.
- 제 1항에 따른 펩타이드 핵산 유도체를 투여하여 Nav1.7 활성과 관련된 통증을 치료하는 방법.
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